BR112018000729B1 - Método de aumento de uma quantidade de nitrogênio atmosférico em uma planta de milho em um campo - Google Patents

Método de aumento de uma quantidade de nitrogênio atmosférico em uma planta de milho em um campo Download PDF

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Abstract

MÉTODO E COMPOSIÇÕES PARA O APRIMORAMENTO DE TRAÇOS DE PLANTAS. São revelados nesse relatório descritivo métodos de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não leguminosa. Os métodos podem compreender a exposição da planta a diversas bactérias. Cada membro das diversas bactérias compreende uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria, de tal forma que as bactérias sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno. As bactérias não são microorganismos intergenéricos. Adicionalmente, as bactérias, na planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Esse pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente U.S. Provisório N° 62/192.009, depositado em 13 de julho de 2015, e Pedido de Patente U.S. Provisório N° 62/213.567, depositado em 2 de setembro 2015, cada um deles inteiramente incorporado nesse relatório descritivo por referência.
DECLARAÇÃO QUANTO AO PESQUISA COM FINANCIAMENTO FEDERAL
[0002] Essa foi feita com o apoio do governo dos Estados Unidos sob a concessão SBIR 1520545 concedida pelo “National Science Foundation”. O governo possui certos direitos no tema revelado.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] As plantas estão ligadas ao microbioma por meio de um metaboloma compartilhado. Um relacionamento multidimensional entre um traço de plantio particular e o metaboloma subjacente é caracterizado por uma paisagem com diversos máximos locais. A otimização de um máximo local inferior para outro que representa um traço melhor por alteração da influência do microbioma sobre o metaboloma pode ser desejável por várias razões como, por exemplo, para otimização do plantio. É necessário que abordagens economicamente, ambientalmente e socialmente sustentáveis para a agricultura e produção de alimentos atendam às necessidades de uma população global em crescimento. Por volta de 2050 a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas projeta que a produção total de alimentos deva aumentar por 70% até atender às necessidades da população em crescimento, um desafio que é exacerbado por diversos fatores, incluindo a diminuição de fontes de água fresca, a competição crescente por terra arável, o aumento dos preços da energia, os custos crescentes de insumos e a necessidade provável de que os plantios se adaptem às pressões de um clima global mais seco, mais quente e mais extremo.
[0004] Uma área de interesse é no aprimoramento da fixação de nitrogênio. O gás nitrogênio (N2) é um componente importante da atmosfera da Terra. Além disso, o nitrogênio elementar (N) é um componente importante de muitos compostos químicos que constituem organismos vivos. No entanto, muitos organismos não conseguem usar N2 diretamente para sintetizar as substâncias químicas em processos fisiológicos, por exemplo, crescimento e reprodução. A fim de utilizar o N2, o N2 deve ser combinado com hidrogênio. A combinação de hidrogênio com N2 é denominada fixação de nitrogênio. A fixação de nitrogênio, seja ela obtida quimicamente ou biologicamente, exige um investimento de grandes quantidades de energia. Em sistemas biológicos, uma enzima conhecida como nitrogenase catalisa a reação que resulta em fixação de nitrogênio. Um objetivo importante da pesquisa em fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo às plantas não leguminosas, particularmente às gramíneas agronômicas importantes como, por exemplo, trigo, arroz e maís. Apesar do enorme progresso na compreensão do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbios e legumes, o caminho para utilizar aquele conhecimento para induzir nódulos de fixação de nitrogênio em plantios não leguminosos ainda não está claro. Enquanto isso, o desafio do fornecimento de fontes suplementares suficientes de nitrogênio, por exemplo, em fertilizante, continuará a aumentar com a necessidade crescente por uma produção aumentada de alimentos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] Em vista do exposto anteriormente, há uma necessidade pelo aprimoramento dos traços de plantas transmitidos por um microbioma associado. A presente revelação aborda essa necessidade, e também fornece vantagens adicionais. Em alguns casos, tanto as espécies que compõem o microbioma quanto sua genética subjacente são alvos para a modulação da influência microbiana sobre o metaboloma.
[0006] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta não leguminosa, o método compreendendo a exposição da planta a diversas bactérias, cada membro das diversas bactérias compreendendo uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria, de tal forma que as bactérias sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno; em que as bactérias não são microorganismos intergenéricos; e em que as bactérias, na planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado na planta.
[0007] Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta. Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.
[0008] Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas compreendem uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente aos referidos (um ou mais) genes da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em modalidades adicionais, a sequência de controle é um promotor. Em modalidades adicionais, o promotor é um promotor induzível. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no agrupamento do gene nif.
[0009] Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, excretam os produtos de fixação de nitrogênio que contêm nitrogênio. Em algumas modalidades, as diversas bactérias expostas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio exógeno não atmosférico.
[0010] Em algumas modalidades, a planta é desenvolvida em solo de um campo que recebeu a administração de cerca de 22,68 kg de fertilizante contendo nitrogênio por acre, e em que o fertilizante contendo nitrogênio compreende pelo menos 5% de nitrogênio por peso. Em modalidades adicionais, o fertilizante contendo nitrogênio compreende amônio ou uma molécula que contém amônio. Em algumas modalidades, o nitrogênio exógeno é selecionado de fertilizante que compreende um ou mais de glutamina, amônia, amônio, uréia, nitrato, nitrito, moléculas que contêm amônio, moléculas que contêm nitrato e moléculas que contêm nitrito.
[0011] Em algumas modalidades, as diversas bactérias compreendem pelo menos duas espécies diferentes de bactérias. Em algumas modalidades, as diversas bactérias compreendem pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias. Em algumas modalidades, as diversas bactérias são do gênero Enterobacter. Em algumas modalidades, as diversas bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Em algumas modalidades, as diversas bactérias colonizam a planta, de modo que as bactérias estejam presentes na planta pelo menos 105 cfu por grama de peso fresco da planta.
[0012] Em algumas modalidades, os (um ou mais) genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria são selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em (A) uma mutação por knock-out; (B) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga.
[0013] Em algumas modalidades, a planta é uma planta de cultura agrícola. Em modalidades adicionais, a planta de cultura agrícola é selecionada de sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. Em modalidades adicionais, a planta é um organismo geneticamente modificado. Em modalidades adicionais, a planta não é um organismo geneticamente modificado. Em algumas modalidades, a planta foi geneticamente modificada ou cruzada para uso de nitrogênio eficiente.
[0014] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma população bacteriana que compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria, de tal forma que as bactérias sejam capazes de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno; em que as bactérias não são microorganismos intergenéricos; e em que as bactérias, na planta, produzem 1% ou mais do nitrogênio fixado em uma planta desenvolvida na presença da população de bactérias.
[0015] Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, produzem 5% ou mais do nitrogênio fixado na planta. Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, produzem 10% ou mais do nitrogênio fixado na planta.
[0016] Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas compreendem uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente aos referidos (um ou mais) genes da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em modalidades adicionais, a sequência de controle é um promotor. Em modalidades adicionais, o promotor é um promotor induzível. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no agrupamento do gene nif.
[0017] Em algumas modalidades, as bactérias, na planta, excretam os produtos de fixação de nitrogênio que contêm nitrogênio. Em algumas modalidades, as diversas bactérias expostas à planta não estimulam um aumento na captação de nitrogênio exógeno não atmosférico. Em algumas modalidades, o nitrogênio exógeno é selecionado de fertilizante que compreende um ou mais de glutamina, amônia, amônio, uréia, nitrato, nitrito, moléculas que contêm amônio, moléculas que contêm nitrato e moléculas que contêm nitrito.
[0018] Em algumas modalidades, a população bacteriana compreende pelo menos duas espécies diferentes de bactérias. Em algumas modalidades, a população bacteriana compreende pelo menos duas cepas diferentes da mesma espécie de bactérias. Em algumas modalidades, as diversas bactérias são do gênero Enterobacter. Em algumas modalidades, as diversas bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Em algumas modalidades, as diversas bactérias colonizam a planta, de modo que as bactérias estejam presentes na planta pelo menos 105 cfu por grama de peso fresco da planta.
[0019] Em algumas modalidades, os (um ou mais) genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria são selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em (A) uma mutação por knock-out; (B) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga.
[0020] Em algumas modalidades, a planta é uma planta de cultura agrícola. Em modalidades adicionais, a planta de cultura agrícola é selecionada de sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. Em modalidades adicionais, a planta é um organismo geneticamente modificado. Em modalidades adicionais, a planta não é um organismo geneticamente modificado. Em algumas modalidades, a planta foi geneticamente modificada ou cruzada para uso de nitrogênio eficiente.
[0021] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma população bacteriana da presente revelação. Em algumas modalidades, a composição compreende a população bacteriana revestida em uma superfície de uma semente. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um líquido ou pó.
[0022] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma bactéria isolada depositada como Depósito de Acesso ATCC N° PTA-122293 ou PTA-122294.
[0023] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma bactéria não intergênica que compreende uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria, de modo que a bactéria seja capaz de fixação de nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.
[0024] Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas compreendem uma sequência de controle introduzida ligada operacionalmente aos referidos (um ou mais) genes da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em modalidades adicionais, a sequência de controle é um promotor. Em modalidades adicionais, o promotor é um promotor induzível. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio. Em algumas modalidades, as bactérias não compreendem um promotor constitutivo ligado operacionalmente a um gene no agrupamento do gene nif.
[0025] Em algumas modalidades, os (um ou mais) genes ou polinucleotídeos não codificadores da rede genética regulatória de fixação ou assimilação de nitrogênio da bactéria são selecionados do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. Em algumas modalidades, as (uma ou mais) variações genéticas consistem em (A) uma mutação por knock-out; (B) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (C) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga.
[0026] Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Enterobacter. Em algumas modalidades, a bactéria é endofítica, epifítica ou rizosférica.
[0027] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método de produção de uma ou mais bactérias. Em uma modalidade, o método compreende (a) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introdução de uma variação genética (por exemplo, uma ou mais variações genéticas) em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) exposição de diversas plantas às bactérias variantes; (d) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma das várias plantas, em que a planta da qual as bactérias são isoladas possui um traço aprimorado em relação a outras plantas nas várias plantas; e (e) repetição das etapas (b) a (d) com bactérias isoladas na etapa (d). O traço aprimorado pode ser fixação de nitrogênio aumentada na planta da qual as bactérias são isoladas, e/ou em plantas expostas às bactérias. A variação genética pode ser variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador da transcrição, anti-ativador da transcrição, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+-dinitrogênio-redutase ADP-D- ribosiltransferase. Em algumas modalidades, a variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. A variação genética pode ser uma mutação por knock-out, resultar em eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína, alterar ou abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo, e/ou compreender a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. Em algumas modalidades, a variação genética compreende a inserção de uma sequência regulatória encontrada dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano que corresponde às bactérias nas quais a variação genética é introduzida. A sequência regulatória pode opcionalmente ser selecionada com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de planta. A variação genética pode ser uma mutação aleatória em uma localização aleatória, uma mutação aleatória em um local-alvo, ou uma variação genética predeterminada especificamente introduzida em um local-alvo. A variação genética pode compreender inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ou qualquer combinação destas. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a exposição das plantas a estressores bióticos ou abióticos. Em algumas modalidades, bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes produzem 1% ou mais (por exemplo, pelo menos 2%, 5%) 10%, ou mais) de nitrogênio em uma segunda planta do mesmo tipo que a primeira planta, ou em uma planta exposta às bactérias. Essa produção pode ainda ser obtida quando a segunda planta é desenvolvida na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio. Em algumas modalidades, bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes exibem um aumento de pelo menos a 2 vezes (por exemplo, um aumento de pelo menos 5 vezes) na fixação de nitrogênio, quando comparadas com bactérias isoladas da primeira planta. A primeira planta, ou plantas nas várias plantas, pode ser uma planta de cultura agrícola, por exemplo, uma planta selecionada de cevada, arroz, maís, trigo, sorgo, milho- verde, cana de açúcar, cebolas, tomates, morangos ou aspargo. A primeira planta, ou plantas nas várias plantas, pode ser uma planta-modelo, por exemplo, uma planta selecionada de Setaria, Brachypodium ou Arabidopsis. Em algumas modalidades, a etapa (a) ainda compreende a realização de análise genética de bactérias isoladas. Em algumas modalidades, a etapa (b) ainda compreende a aplicação de uma pressão de seleção para enriquecer para bactérias que compreendem a variação genética e, opcionalmente, o isolamento de bactérias que sobrevivem à pressão de seleção. A pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas desprovidos da variação genética introduzida em um local- alvo, em que a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do local-alvo. A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease sítio-específica, por exemplo, uma nuclease selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma CRISPR nuclease, uma TALE nuclease ou uma meganuclease. Em alguns casos, uma CRISPR nuclease pode ser preferida. Bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. As bactérias podem ser isoladas de tecido de planta (por exemplo, sementes). As bactérias podem compreender diversas taxas bacterianas diferentes. Em algumas modalidades, o isolamento de bactérias na etapa (a) compreende o isolamento de bactérias de uma semente da primeira planta.
[0028] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta. Em uma modalidade, o método compreende a exposição da planta a bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais (por exemplo, pelo menos 2%, 5%, 10%, ou mais) de nitrogênio na planta. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio suplementar. Em algumas modalidades, variação genética é uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. Em algumas modalidades, a variação genética (a) é uma mutação por knock-out; (b) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (c) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. As bactérias podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Em alguns casos, as bactérias são do gênero Enterobacter ou Rahnella. As bactérias podem compreender diversas taxas bacterianas diferentes. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de cultura agrícola, por exemplo, uma planta selecionada de sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. A planta pode ser uma planta não leguminosa. A planta pode ser um organismo geneticamente modificado (um GMO; por exemplo, uma planta que possui um genoma alterado para carregar um gene heterólogo), um organismo não modificado geneticamente (não-GMO), ou que foi geneticamente modificado ou cruzado para uso de nitrogênio eficiente.
[0029] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma população bacteriana. Em uma modalidade, a população bacteriana compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais (por exemplo, pelo menos 2%, 5%, 10%, ou mais) de nitrogênio em uma planta desenvolvida na presença da população de bactérias. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio suplementar. Em algumas modalidades, a variação genética é uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão aumentada de nifA ou glutaminase; expressão diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. Em algumas modalidades, a variação genética (a) é uma mutação por knock-out; (b) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (c) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. As bactérias podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Em alguns casos, as bactérias são do gênero Enterobacter ou Rahnella. As bactérias podem compreender diversas taxas bacterianas diferentes.
[0030] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma população bacteriana, por exemplo, uma população bacteriana como descrito nesse relatório descritivo. A composição pode compreender a população bacteriana revestida em uma superfície de uma semente. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um líquido ou um pó.
[0031] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma bactéria que possui Número de Depósito ATCC PTA-122293. Em um aspecto, a presente revelação fornece uma bactéria que possui Número de Depósito ATCC PTA-122294.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0032] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0033] As novas características da invenção são descritas com particularidade nas reivindicações em anexo. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à descrição detalhada seguinte que descreve modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e nos desenhos que a acompanham, dos quais: A Figura 1A-B retrata o enriquecimento e isolamento de bactérias fixadoras de nitrogênio. (A) Placa de ágar Nfb foi usada para isolar colônias únicas de bactérias fixadoras de nitrogênio. (B) Ágar Nfb semi-sólido moldado em tubo de Balch. A seta aponta para película de bactérias fixadoras de nitrogênio enriquecidas. A Figura 2 retrata uma avaliação por PCR representativa de nifH. Bandas positivas foram observadas em aproximadamente 350 bp para duas colônias nessa avaliação. Bandas inferiores representam dímeros de iniciador. A Figura 3 retrata um exemplo de uma avaliação por PCR de colônias de mutagênese selecionada por CRISPR-Cas. Colônias de CI006 foram avaliadas com iniciadores específicos para o lócus de nifL. O produto de PCR do tipo selvagem é esperado em aproximadamente 2,2 kb, enquanto o mutante é esperado em aproximadamente 1,1 kb. Sete de dez colônias avaliadas exibem inequivocamente a deleção desejada. As Figuras 4A-D retratam fenótipos in vitro de várias cepas. As atividades do Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) de mutantes da cepa CI010 (Figura 4A) e mutantes da cepa CI006 (Figura 4B) desenvolvidos nos meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina. Atividades de ARA de cepas adicionais são mostradas na Figura 4C, e o perfil de excreção de amônio através do tempo de duas cepas é mostrado na Figura 4D. A Figura 5 retrata o perfil de expressão em cultura de 9 genes diferentes nas cepas CI006 envolvidos na fixação de nitrogênio diazotrófica. Números representam contagens de cada transcrito. Várias condições (0, 1, 10 mM de Glutamina e 0%, 10%, 20% de ar atmosférico em N2) são indicadas. A Figura 6 retrata colonização de CI006 de raízes de milho. Plântulas de milho foram inoculadas com CI006 que abriga um plasmídeo de expressão de RFP. Após duas semanas de crescimento e manutenção de plasmídeo por meio de irrigação com o antibiótico apropriado, as raízes foram colhidas e tiveram imagens obtidas por meio de microscopia de fluorescência. É observada a colonização do espaço intercelular da raiz. A Figura 7 retrata nitrogênio derivado de nível de micróbio na cepa WT (CI050) e otimizada (CM002). A Figura 8 mostra uma configuração experimental para um ensaio de massa de frutificação Micro-Tom. A Figura 9 mostra uma avaliação de 10 cepas para aumento na massa de frutos de planta por Micro-Tom. Resultados para seis réplicas são apresentados. Para a coluna 3, p = 0,07. Para a coluna 7, p = 0,05. As Figuras 10A-C retratam resultados adicionais para atividades de ARA de micróbios candidatos e mutantes candidatos de contraparte desenvolvidos nos meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina. A Figura 11 retrata um mutante duplo que exibe excreção de amônia maior do que o mutante simples do qual foi derivado. A Figura 12 retrata NDFA obtido do experimento de Captação de Gás 15N (extrapolado de volta usando dias expostos) para medir NDFA em plantas de milho em condição fertilizada. A Figura 13 retrata valor de NDFA obtido do experimento de Captação de Gás 15N (extrapolado de volta usando dias expostos) para medir NDFA em plantas Setaria em condição fertilizada. A Figura 14A retrata a taxa de incorporação de gás 15N. Plantas inoculadas com cepa desenvolvida mostraram aumento na incorporação de gás 15N, comparadas com plantas uninoculadas. A Figura 14B retrata 4 semanas após plantio, até 7% do nitrogênio em plantas inoculadas com uma cepa desenvolvida são derivados de nitrogênio fixado de forma microbiana. A Figura 14C retrata que a área da folha (e outra medição da biomassa, dados não mostrados) está aumentada em plantas inoculadas com uma cepa desenvolvida quando, comparada com plantas uninoculadas ou inoculadas do tipo selvagem. A Figura 15A retrata cepas desenvolvidas que exibem produção de nifH significantemente maior no tecido da raiz, como medida por estudo transcriptômico em plantas. A Figura 15B retrata que a taxa de nitrogênio fixado encontrada em tecido de planta está correlacionada com a taxa na qual aquela planta particular é colonizada pela cepa otimizada HoME. A Figura 16A retrata um mapa de textura do solo de vários solos de campo testados para colonização. Solos que originalmente serviram de fonte de alguns micróbios são indicados como estrelas. A Figura 16B retrata a taxa de colonização da Cepa 1 e Cepa 5 que são testadas através de quatro tipos de solo diferentes (círculos). Ambas as cepas exibiram perfil de colonização relativamente robusto através de diversos tipos de solo. A Figura 16C retrata a colonização de Cepa 1, como testada em um experimento de campo ao longo da duração de uma estação de crescimento. A Cepa 1 persiste no tecido de milho até a semana 12 após o plantio e começa a exibir declínio na colonização após aquele tempo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0034] Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucléico” e “oligonucleotídeo” são usados de forma intercambiável. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou regiões não codificadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definidos por análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucléico, e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação.
[0035] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson Crick, ligação de Hoogstein, ou qualquer outra forma sequência-específica de acordo com a complementaridade de bases. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura de duplexo, três ou mais fitas que formam um complexo de múltiplas fitas, uma única fita auto-hibridizante, ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extenso, por exemplo, a iniciação de PCR, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequência é denominada o “complemento” da primeira sequência. O termo “hibridizável”, como aplicado a um polinucleotídeo, se refere à habilidade do polinucleotídeo para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo em uma reação de hibridização.
[0036] “Complementaridade” se refere à habilidade de um ácido nucléico para formar ligação (ou ligações) hidrogênio com outra sequência de ácidos nucléicos por Watson-Crick tradicional ou por tipos não tradicionais. Um percentual de complementaridade indica a percentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucléico que pode formar ligações hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson- Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucléicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 que são 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). “Perfeitamente complementar” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucléicos terão ligação hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucléicos. O termo “substancialmente complementar”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um grau de complementaridade que é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou se refere a dois ácidos nucléicos que hibridizam sob condições rigorosas. A “identidade de sequência”, por exemplo, com o objetivo de avaliar o percentual de complementaridade, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado incluindo, sem limitação, o algoritmo de Needleman-Wunsch (veja, por exemplo, o alinhador “EMBOSS Needle” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados), o algoritmo de BLAST (veja, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com ajustes padronizados), ou o algoritmo de Smith-Waterman (veja, por exemplo, a alinhador “EMBOSS Water” disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, opcionalmente com ajustes padronizados). O alinhamento ótimo pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padronizados.
[0037] Em geral, “condições rigorosas” para hibridização se referem às condições sob as quais um ácido nucléico que possui complementaridade para uma sequência-alvo hibridiza predominantemente com uma sequência-alvo, e substancialmente não hibridiza para sequências não-alvo. Condições rigorosas são geralmente sequência-dependentes, e variam dependendo de diversos fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, maior a temperatura na qual a sequência hibridiza especificamente para sua sequência-alvo. Exemplos não limitantes de condições rigorosas são descritas em detalhe em Tijssen (1993), “Laboratory Technniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I”, Segundo Capítulo “Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assay”, Elsevier, N.Y.
[0038] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (por exemplo, em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é Subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente denominados “produto gênico”. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, “expressão” pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica.
[0039] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado, por exemplo, por formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, por exemplo, conjugação, com um componente de marcação. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido” se refere aos aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos incluindo, glicina e os isômeros ópticos tanto D quanto L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0040] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “cerca de” é usado de forma sinônima com o termo “aproximadamente.” Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de” com relação a uma quantidade indica que valores ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% até 10%.
[0041] O termo “cultura biologicamente pura” ou “cultura substancialmente pura” se refere a uma cultura de uma espécie bacteriana descrita nesse relatório descritivo que não contém nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir com a replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.
[0042] O termo “produtividade de planta” se refere geralmente a qualquer aspecto de crescimento ou desenvolvimento de uma planta que é uma razão pela qual a planta é desenvolvida. Para plantios de alimentos, por exemplo, grãos ou vegetais, “produtividade de planta” pode se referir ao rendimento de grãos ou frutos colhidos de um plantio particular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “produtividade de planta aumentada” se refere amplamente a aumentos no rendimento de grãos, frutos, flores, ou outras partes de plantas colhidas para várias finalidades, aumentos no crescimento de partes de plantas, incluindo caules, folhas e raízes, promoção de crescimento de plantas, manutenção de alto teor de clorofila em folhas, aumento dos números de frutos ou sementes, aumento do peso unitário de frutos ou sementes, redução da emissão de NO2 em função de utilização reduzida de fertilizante de nitrogênio e aumentos similares do crescimento e desenvolvimento de plantas.
[0043] Micróbios dentro e em torno de plantios de alimentos podem influenciar os traços daqueles plantios. Traços de plantas que podem ser influenciados por micróbios incluem: rendimento (por exemplo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento do fruto, florescimento); nutrição (por exemplo, aquisição de nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal, tolerância térmica); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). Estratégias para alteração de traços de plantio incluem: aumento das concentrações de metabólitos cruciais; alteração da dinâmica temporal da influência do micróbio sobre metabólitos cruciais; ligação da produção/degradação de metabólitos microbianos a novas pistas ambientais; redução de metabólitos negativos; e aumento do equilíbrio de metabólitos ou proteínas subjacentes.
[0044] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “sequência de controle” se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.
[0045] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “em plantas” se refere a na planta, e em que a planta ainda compreende folhas, raízes, caules, semente, óvulos, pólen, flores, fruto etc.
[0046] Em algumas modalidades, sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente revelação são substituídas com uma ou mais sequências de controle intragenéricas.
[0047] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “introduzido” se refere à introdução por meio de biotecnologia moderna, e não uma introdução de ocorrência natural.
[0048] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação foram modificadas de tal modo que não são bactérias de ocorrência natural.
[0049] Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 cfu, 104 cfu, 105 cfu, 106 cfu, 107 cfu, 108 cfu, 109 cfu, 1010 cfu, 1011 cfu, ou 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 cfu, cerca de 104 cfu, cerca de 105 cfu, cerca de 106 cfu, cerca de 107 cfu, cerca de 108 cfu, cerca de 109 cfu, cerca de 1010 cfu, cerca de 1011 cfu, ou cerca de 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente revelação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta.
[0050] Fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente revelação podem compreender as seguintes moléculas que contêm nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina etc. as fontes de nitrogênio da presente revelação podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, uréia, fosfato de diamônio, forma de uréia, monoamônio fosfato, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio etc.
[0051] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “nitrogênio exógeno” se refere ao nitrogênio não atmosférico facilmente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições não limitantes de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, uréia, ácido úrico, ácidos de amônio etc.
[0052] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “condições não limitantes de nitrogênio” se refere ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meios em concentrações maiores do que cerca de 4 mM de nitrogênio, como revelado por Kant e cols. (2010. J. Exp. Biol. 62 (4): 1.499-1.509), que é incorporado nesse relatório descritivo por referência.
[0053] Como usado nesse relatório descritivo, um “microorganismo intergenérico” é um microorganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos de gêneros taxonômicos diferentes. O termo “mutante intergenérico” pode ser usado de forma intercambiável com “microorganismo intergenérico”. Um “microorganismo intergenérico” exemplar inclui um microorganismo que contém um elemento genético móvel que foi primeiro identificado em um microorganismo em um gênero diferente do microorganismo receptor. Explicações adicionais podem ser encontradas, inter alia, em 40 C.F.R. § 725.3.
[0054] Como usado nesse relatório descritivo, um “microorganismo intragenérico” é um microorganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos dos mesmos gêneros taxonômicos. O termo “intragenérico mutante” pode ser usado de forma intercambiável com “microorganismo intragenérico”.
[0055] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “material genético introduzido” significa material genético que é adicionado, e permanece como um componente, do genoma do receptor.
[0056] Em algumas modalidades, a rede genética regulatória de fixação e assimilação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificadoras que dirigem, modulam e/ou regulam fixação e/ou assimilação microbiana de nitrogênio e pode compreender sequências de polinucleotídeos do agrupamento nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC, ... nifZ), polinucleotídeos que codificam proteína reguladora de nitrogênio C, polinucleotídeos que codificam proteína reguladora de nitrogênio B, sequências de polinucleotídeos do agrupamento gln (por exemplo, glnA e glnD), draT, e transportadores/permeases de amônia.
[0057] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46% 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58% 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82% 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio por peso.
[0058] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de nitrogênio por peso.
[0059] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente revelação compreende cerca de 5% até 50%, cerca de 5% até 75%, cerca de 10% até 50%, cerca de 10% até 75%, cerca de 15% até 50%, cerca de 15% até 75%, cerca de 20% até 50%, cerca de 20% até 75%, cerca de 25% até 50%, cerca de 25% até 75%, cerca de 30% até 50%, cerca de 30% até 75%, cerca de 35% até 50%, cerca de 35% até 75%, cerca de 40% até 50%, cerca de 40% até 75%, cerca de 45% até 50%, cerca de 45% até 75%, ou cerca de 50% até 75% de nitrogênio por peso.
[0060] Em algumas modalidades, o aumento de fixação de nitrogênio e/ou da produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta são medidos em relação a plantas de controle que não foram expostas às bactérias da presente revelação. Todos os aumentos ou diminuições em bactérias são medidos em relação a bactérias de controle. Todos os aumentos ou diminuições em plantas são medidos em relação a plantas de controle.
[0061] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Há várias vantagens com a utilização de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, por exemplo: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores pontuáveis, permitindo a fácil detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que é parte de um sistema regulador da transcrição; produção de compostos que exigem atividade ubíqua no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplares não limitantes incluem, promotor de CaMV 35S, promotores de opina, promotor de ubiqüitina, promotor de álcool desidrogenase etc.
[0062] Como usado nesse relatório descritivo, um “promotor não constitutivo” é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células, e/ou durante certos estágios do desenvolvimento. Por exemplo, tecido- específico, tecido-preferido, tipo de célula-específico, tipo de célula-preferido, promotores induzíveis, e promotores sob controle do desenvolvimento são promotores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos.
[0063] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor “induzível” ou “reprimível” é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certas substâncias químicas, a presença de luz, condições ácidas ou básicas etc.
[0064] Como usado nesse relatório descritivo, um promotor “tecido-específico” é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos tecidos. Diferentemente da expressão constitutiva de genes, a expressão tecido-específica é o resultado de vários níveis de interação de regulação gênica. Dessa forma, na técnica algumas vezes é preferível usar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para obter expressão eficiente e confiável de transgenes em tecidos particulares. Essa é uma das principais razões para a grande quantidade de promotores tecido-específicos isolados de tecidos particulares encontradas tanto na literatura científica quanto de patentes.
[0065] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ligado operacionalmente” se refere à associação de sequências de ácidos nucléicos em um único fragmento de ácido nucléico, de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente com uma sequência codificadora quando ele é capaz de regular a expressão daquela sequência codificadora (ou seja, que a sequência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor). Sequências codificadoras podem ser ligadas operacionalmente às sequências regulatórias em uma orientação senso ou anti-senso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da revelação podem ser ligadas operacionalmente, diretamente ou indiretamente, 5‘ para o mRNA-alvo, ou 3‘ para o mRNA-alvo, ou dentro do mRNA-alvo, ou uma primeira região complementar está 5‘ e seu complemento está 3‘ para o mRNA-alvo.
[0066] Um traço que pode ser visado para regulação pelos métodos descritos nesse relatório descritivo é a fixação de nitrogênio. O fertilizante de nitrogênio é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior condutor de rendimentos maiores em plantios em fileira como, por exemplo, milho e trigo. São descritos nesse relatório descritivo produtos microbianos que podem liberar formas renováveis de nitrogênio em plantios não leguminosos. Embora alguns endófitos tenham a genética necessária para a fixação de nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que endófitos do tipo selvagem de cereais e gramíneas interrompem a fixação de nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis residuais de nitrogênio em solos de campo sinalizam os micróbios para fechar a via bioquímica para fixação de nitrogênio.
[0067] Alterações dos níveis de transcrição e pós- tradução da rede regulatória da fixação de nitrogênio são necessárias para desenvolver um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio ao milho na presença de fertilizante. Para essa finalidade, é descrita nesse relatório descritivo a tecnologia de Evolução de Micróbio-Hospedeiro (HoME) para evoluir precisamente redes regulatórias e despertar novos fenótipos. Também são descritas nesse relatório descritivo bibliotecas proprietárias únicas de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, pareadas com dados ômicos extensos que circundam a interação de micróbios e planta hospedeira sob condições ambientais diferentes como, por exemplo, estresse e excesso de nitrogênio. Isso permite a evolução da precisão da rede genética regulatória de endófitos para produzir micróbios que fixam ativamente nitrogênio, até mesmo na presença de fertilizante no campo. Também são descritas nesse relatório descritivo avaliações do potencial técnico da evolução de micróbios que colonizam tecidos da raiz de milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas padronizadas de formulação e solos diversos para determinar a praticabilidade de integração dos micróbios em estratégias modernas de gerenciamento de nitrogênio.
[0068] A fim de utilizar nitrogênio elementar (N) para a síntese química, as formas de vida combinam gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Por causa da natureza intensiva de energia da fixação de nitrogênio biológica, diazótrofos (bactérias e arquéias que fixam gás nitrogênio atmosférico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rígida do agrupamento do gene nif em resposta ao oxigênio ambiental e nitrogênio disponível. Os genes nif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (por exemplo, o complexo de nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8 (4): 84-94) revela descrições detalhadas de genes nif e seus produtos, e é incorporado nesse relatório descritivo por referência. São descritos nesse relatório descritivo métodos de produção de uma planta com um traço aprimorado que compreendem o isolamento de bactérias de uma primeira planta, introdução de uma variação genética em um gene nif das bactérias isoladas, exposição de uma segunda planta às bactérias variantes, isolamento de bactérias da segunda planta que possui um traço aprimorado em relação à primeira planta, e repetição das etapas com bactérias isoladas da segunda planta.
[0069] Em proteobactérias, a regulação da fixação de nitrogênio é centralizada em torno da proteína de ligação ao intensificador 054-dependente NifA, o regulador da transcrição positivo do agrupamento nif. Os níveis intracelulares de NifA ativa são controlados por dois fatores cruciais: a transcrição do óperon de nifLA, e a inibição da atividade de NifA por interação proteína-proteína com NifL. Ambos esses processos são responsivos aos níveis intracelulares de glutamina por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que percebe diretamente glutamina e catalisa a uridililação ou desuridililação de duas proteínas reguladoras PII- GlnB e GlnK - em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina ligada. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB não modificada sinaliza a desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, GlnB é modificada pós-tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do óperon de nifLA. Dessa forma, a transcrição de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. No nível pós-tradução da regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA de forma dependente no nível global de GlnK livre dentro da célula.
[0070] NifA é transcrita pelo óperon de nifLA, cujo promotor é ativado por NtrC fosforilada, outro regulador 054- dependente. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que interage com GlnB desuridililada, mas não GlnB uridililada. Sob condições de excesso de nitrogênio, um nível intracelular elevado de glutamina leva à desuridililação de GlnB, que então interage com NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando em desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor de nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um nível baixo de glutamina intracelular resulta em uridililação de GlnB, o que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e a transcrição do óperon de nifLA. Dessa forma, a expressão de nifLA é rigorosamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização de proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo.
[0071] A atividade de NifA também é regulada pós-tradução em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente por meio de inibição mediada por NifL da atividade de NifA. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização de proteína PII por meio de GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significantemente entre diazótrofos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível global de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnK desuridililada interage com o transportador de amônio AmtB, que serve tanto para bloquear a captação de amônio por AmtB quanto para seqüestrar GlnK à membrana, permitindo a inibição de NifA por NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililada é necessária para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridililação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazótrofos desprovidos do gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente por interação com as formas desuridililadas tanto de GlnK quanto de GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-tradução de NifA é um regulador importante do agrupamento nif na maioria dos diazótrofos conhecidos. Adicionalmente, nifL, amtB e glnK são genes que podem ser mutados nos métodos descritos nesse relatório descritivo.
[0072] Além de regular a transcrição do agrupamento do gene nif, muitos diazótrofos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-tradução e inibição diretas da própria enzima nitrogenase, conhecido como interruptor de nitrogenase. Isso é mediado por ribosilação do ADP da proteína de Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que interrompe sua interação com o complexo de proteína MoFe (NifDK) e abole a atividade de nitrogenase. DraT catalisa a ribosilação do ADP da proteína de Fe e do interruptor de nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e reativação de nitrogenase. Como ocorre com a transcrição de nifLA e a inibição de NifA, o interruptor de nitrogenase também é regulado por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB desuridililada interage e ativa DraT, enquanto GlnK desuridililada interage tanto com DraG quanto com AmtB para formar um complexo, seqüestrando DraG à membrana. Sob condições de limitação de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, onde ela remove a ADP-ribose e ativa nitrogenase. Os métodos descritos nesse relatório descritivo também contemplam a introdução da variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.
[0073] Embora alguns endófitos possuam a habilidade para fixar nitrogênio in vitro, freqüentemente a genética é silenciada no campo por níveis elevados de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se desacoplar o sensoriamento de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo. O aumento da integral da atividade de nitrogenase através do tempo serve para aumentar ainda mais a produção de nitrogênio para utilização pelo plantio. Alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo incluem um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.
[0074] Um alvo adicional para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para a expressão de genes de fixação de nitrogênio. O aumento da produção de NifA (constitutivamente ou durante condição de amônia elevada) contorna a via de sensoriamento de amônia nativa. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um inibidor de NifA conhecido, também leva a um nível aumentado de NifA livremente ativa. Além disso, o aumento do nível de transcrição do óperon de nifAL (constitutivamente ou durante condição de amônia elevada) também leva a um nível global maior de proteínas NifA. O nível elevado da expressão de nifAL é obtido por alteração do próprio promotor ou por redução da expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no interruptor do óperon de nifAL durante condição de nitrogênio elevado). O nível elevado de NifA obtido por esses ou quaisquer outros métodos descritos nesse relatório descritivo aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.
[0075] Outro alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo é a cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível intracelular de glutamina é percebido por meio da cascata de sinalização GlnD/GlnB/GlnK PII. Mutações do sítio ativo em GlnD que abolem a atividade de remoção de uridilil de GlnD rompem a cascata de sensoriamento de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração GlnB produz um curto-circuito da cascata de sensoriamento de glutamina. Essas mutações “enganam” a células na percepção do estado de nitrogênio limitado aumentando, dessa forma, a atividade do nível de fixação de nitrogênio.
[0076] A proteína amtB também é um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. A captação de amônia do ambiente pode ser reduzida por diminuição do nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de perceber o nível alto de amônia, evitando a infra-regulação de genes de fixação de nitrogênio. Qualquer amônia que tente entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível de glutamina intracelular é o principal componente do sensoriamento de nitrogênio. A diminuição do nível de glutamina intracelular evita que as células percebam níveis elevados de amônio no ambiente. Isso pode ser feito por aumento do nível de expressão de glutaminase, uma enzima que converte glutamina em glutamato. Além disso, a glutamina intracelular também pode ser reduzida por diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte amônia em glutamina). Em diazótrofos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato para serem usados para processos celulares. Rupturas na assimilação de amônia podem permitir o desvio do nitrogênio fixado a ser exportado da célula como amônia. A amônia fixada é assimilada predominantemente em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, e Subsequentemente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. GS é regulada pós-tradução por GS adenilil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada pelo glnE que catalisa tanto a adenililação quanto a desadenililação de GS por meio da atividade de sua adenilil-transferase (AT) e domínios de remoção de adenilil (AR), respectivamente. Sob condições limitantes de nitrogênio, glnA é expressa, e o domínio de AR de GlnE causa da desadenilação GS, permitindo que ela seja ativa. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desligada, e o domínio de AT de GlnE é ativado alostericamente por glutamina, causando a adenililação e desativação de GS.
[0077] Além disso, o gene draT também pode ser um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada no campo com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo. Após as enzimas fixadoras de nitrogênio serem produzidas pela célula, o interruptor de nitrogenase representa outro nível no qual a célula infra- regula a atividade de fixação em condição de nitrogênio elevado. Esse interruptor poderia ser removido por diminuição do nível de expressão de DraT.
[0078] Métodos para a transmissão de novos fenótipos microbianos podem ser realizados nos níveis da transcrição, tradução e pós-tradução. O nível de transcrição inclui alterações no promotor (por exemplo, alteração da afinidade do fator sigma ou de sítios de ligação para fatores de transcrição, incluindo deleção de todo ou de uma porção do promotor) ou alteração dos terminadores e atenuadores da transcrição. O nível de tradução inclui alterações nos sítios de ligação ao ribossomo e alterações de sinais de degradação de mRNA. O nível pós-tradução inclui a mutação de um sítio ativo da enzima e alteração de interações proteína-proteína. Essas alterações podem ser obtidas de várias formas. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser obtida por troca do sítio ou promotor de ligação ao ribossomo (RBS) nativo com outro com potência/eficiência menor. Sítios de início ATG podem ser trocados por um códon de início GTG, TTG ou CTG, o que resulta em redução na atividade de tradução da região codificadora. A abolição completa da expressão pode ser feita por knockout (deleção) da região codificadora de um gene. O frameshifting do quadro de leitura aberta (ORF) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo do ORF criando, dessa forma, um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada in-frame também irá criar, similarmente, um produto truncado não funcional. A adição de um tag de degradação no terminal N ou C também pode ser feita para reduzir a concentração efetiva de um gene particular.
[0079] Inversamente, o nível de expressão dos genes descritos nesse relatório descritivo pode ser obtido por utilização de um promotor mais forte. Para assegurar uma atividade maior do promotor durante condição de nível elevado de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição do genoma inteiro em uma condição de nível elevado de nitrogênio poderia ser obtido, e promotores ativos com um nível desejado de transcrição podem ser escolhidos daquele conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Códons de início fracos podem ser removidos com um códon de início ATG para uma melhor eficiência de iniciação da tradução. Sítios de ligação ao ribossomo (RBS) fracos também podem ser removidos com um RBS diferente com eficiência de iniciação da tradução maior. Além disso, a mutagênese sítio- específica também pode ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.
[0080] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessária para produção de plantio e reduzir as emissões de gás em estufa (por exemplo, óxido nitroso). Passagem serial
[0081] A produção de bactérias para o aprimoramento de traços de plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser obtida por meio de passagem serial. Isso pode ser feito por seleção de plantas que possuem um traço aprimorado particular que é influenciado pela flora microbiana, além da identificação de bactérias e/ou composições que são capazes de transmitir um ou mais traços aprimorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de bactérias para aprimorar um traço de planta inclui as etapas de: (a) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introdução de uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) exposição de diversas plantas às bactérias variantes; (d) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma das várias plantas, em que a planta da qual as bactérias são isoladas possui um traço aprimorado em relação a outras plantas nas várias plantas; e (e) repetição das etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um traço aprimorado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser repetidas diversas vezes (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que o traço aprimorado em uma planta alcance um nível desejado. Além disso, as várias plantas podem ser mais do que duas plantas, por exemplo, 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1.000 ou mais plantas.
[0082] Além da obtenção de uma planta com um traço aprimorado, uma população bacteriana que compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio) é obtida. Por repetição das etapas descritas acima, pode ser obtida uma população de bactérias que incluem os membros mais apropriados da população que se correlacionam com um traço de planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, por exemplo, por análise genética e/ou fenotípica. Pode ocorrer uma análise genética de bactérias isoladas na etapa (a). A informação fenotípica e/ou genotípica pode ser obtida usando técnicas que incluem: avaliação de alto rendimento de componentes químicos da origem da planta, técnicas de Sequenciamento que incluem Sequenciamento de alto rendimento de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucléico, RNA-Seq (“Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”), e qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). A informação obtida pode ser usada para obter informação de definição do perfil da comunidade sobre a identidade e atividade de bactérias presentes, por exemplo, análise filogenética ou avaliação baseada em microarranjo de ácidos nucléicos que codificam componentes de óperons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene de rRNA 16S, gene de rRNA 23S, gene de rRNA 5S, gene de rRNA 5.8S, gene de rRNA 12S, gene de rRNA 18S, gene de rRNA 28S, gene gyrB, gene rpoB, gene fusA, gene recA, gene cox1, gene nifD. Exemplos de processos de definição taxonômica de perfil para determinar a taxa presente em uma população são descritos em US20140155283. A identificação bacteriana pode compreender a caracterização da atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinalização, por exemplo, genes associados com a via de fixação de nitrogênio. Interações sinérgicas (em que dois componentes, em virtude de sua combinação, aumenta um efeito desejado por mais de uma quantidade aditiva) entre espécies bacterianas diferentes também podem estar presentes nas populações bacterianas.
[0083] A variação genética pode ser um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador da transcrição, anti-ativador da transcrição, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+- dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. A introdução de uma variação genética pode compreender inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um local-alvo, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, ou mais nucleotídeos. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação por knock-out (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, deleção de um gene inteiro), ou ela pode ser a eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo, ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou ela pode alterar ou abolir uma sequência regulatória de um gene-alvo. Uma ou mais sequências regulatórias também podem ser inseridas, incluindo sequências regulatórias heterólogas e sequências regulatórias encontradas dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano que corresponde às bactérias nas quais a variação genética é introduzida. Além disso, sequências regulatórias podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de um tecido de planta. A variação genética pode ser uma variação genética pré-determinada que é introduzida especificamente em um local-alvo. A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do local-alvo. A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, ou mais) são introduzidas em uma ou mais das bactérias isoladas antes da exposição das bactérias às plantas para avaliação do aprimoramento do traço. As diversas variações genéticas podem ser de qualquer um dos tipos acima, do mesmo tipo ou de tipos diferentes, e em qualquer combinação. Em alguns casos, diversas variações genéticas diferentes são introduzidas serialmente, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento, e assim por diante, de modo a acumular diversas variações genéticas em bactérias, transmitindo traços progressivamente aprimorados nas plantas associadas.
[0084] Em geral, o termo “variação genética” se refere a qualquer alteração introduzida em uma sequência de polinucleotídeos em relação a um polinucleotídeo de referência, por exemplo, um genoma de referência ou porção deste, ou gene de referência ou porção deste. Uma variação genética pode ser denominada uma “mutação”, e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser denominado uma “variante genética” ou “mutante”. Variações genéticas podem ter qualquer número de efeitos, por exemplo, o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular. Variações genéticas podem ser especificamente introduzidas em um local-alvo, ou introduzidas aleatoriamente. Diversas ferramentas moleculares e métodos estão disponíveis para introdução de variação genética. Por exemplo, uma variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia de polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química, e combinações destes. Métodos químicos de introdução de variação genética incluem exposição de DNA a um mutágeno químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosouréia (EN U), N- metil-N-nitro-N‘-nitrosoguanidina, N-óxido de 4- nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda nitrogenada, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12- dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bissulfan e semelhantes. Agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação-Y, raios- X e bombardeamento rápido de nêutrons. A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucléico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. A inserção aleatória ou direcionada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento reversível, é outro método adequado para a geração de variação genética. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucléico durante amplificação em um sistema in vitro livre de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) como, por exemplo, PCR error-prone. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucléico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxons, troca de domínio e semelhantes). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um ácido nucléico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, espera-se que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante gere uma freqüência elevada de mutações (ou seja, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, sem limitação, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e os homólogos destes em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC-1 e semelhantes). Descrições exemplares de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas, por exemplo, em Stemple (2004) Nature 5: 1-7; Chiang e cols. (1993) PCR Methods Appl. 2 (3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10.747-10.751; e Patentes U.S. Nos 6.033.861 e 6.773.900.
[0085] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia de polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir mutações desejadas. A PCR é realizada por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após amplificação por PCR, seleção de DNA mutado e remoção de DNA de plasmídeo parental podem ser obtidas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante PCR, seguida por digestão com enzimas de restrição para remover apenas DNA parental não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea tanto de um gene de resistência antibiótica quanto do gene estudado, alterando o plasmídeo para resistência antibiótica diferente, a nova resistência antibiótica facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA-modelo metilado parental por enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, pela qual as cadeias mutagenizadas não metiladas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Descrição adicional de métodos exemplares pode ser encontrada, por exemplo, em US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743, e US20100267147.
[0086] A mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, também denominada mutagênese sítio-dirigida, tipicamente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA-modelo em tono do sítio de mutação, de modo que pode hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma alteração de base única (uma mutação pontual), alterações de múltiplas bases, deleção ou inserção, ou uma combinação dessas. O iniciador de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase, que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutado, e pode então ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Finalmente, mutantes podem ser selecionados por Sequenciamento de DNA para verificar que eles contêm a mutação desejada.
[0087] Variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR error-prone. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação de sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o(s) produto(s) da reação resultante contém uma ou mais alterações em sequência, quando comparado com a molécula-modelo, os produtos resultantes são mutagenizados, comparados com o modelo. Outro meio de introdução de mutações aleatórias é a exposição de células a um mutágeno químico, por exemplo, nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res., junho de 1975; 28 (3): 323-30), e o vetor contendo o gene é então isolado do hospedeiro.
[0088] A mutagênese por saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual tenta-se gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um sítio específico, ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese por saturação é composta pelo mutagênese de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) em uma sequência de polinucleotídeos definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de comprimento). Dessa forma, um grupo de mutações (por exemplo, que varia de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a serem introduzidas em um cassete pode ser diferente ou igual a um segundo agrupamento de mutações a serem introduzidas em um segundo cassete durante a aplicação de uma rodada de mutagênese por saturação. Esses agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons particulares, e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos particulares.
[0089] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também denominada embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar rapidamente mutações benéficas. Em um exemplo de um processo de embaralhamento, DNAse é usada para fragmentar um conjunto de genes parentais em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 bp de comprimento. Isso é então seguido por uma reação em cadeia de polimerase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com superposição de sequência homóloga suficiente anelarão uns aos outros e são então estendidos por DNA polimerase. Permite-se que ocorram várias rodadas dessa extensão por PCR, após algumas das moléculas de DNA alcançarem o tamanho dos genes parentais. Esses genes podem então ser amplificados com outra PCR, dessa vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter sequências adicionais acrescentadas às suas extremidades 5’, por exemplo, sequências para sítios de reconhecimento de enzima de restrição necessários à ligação em um vetor de clonagem. Exemplos adicionais de técnicas de embaralhamento são fornecidos em US20050266541.
[0090] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência de polinucleotídeos visada. Após a ocorrência de quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5’ da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão de fita que se segue, uma extremidade 3’ protuberante da molécula de DNA quebrada então “invade” uma molécula de DNA similar ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, um modelo de recombinação também é fornecido. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado, ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é projetado para servir como um modelo na recombinação homóloga, por exemplo, dentro ou perto de uma sequência-alvo cortada ou clivada por uma nuclease sítio- específica. Um polinucleotídeo-modelo pode ser de qualquer comprimento adequado, por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000, ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência-alvo. Quando otimamente alinhado, um polinucleotídeo-modelo pode se sobrepor com um ou mais nucleotídeos de uma sequências-alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência- modelo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência- alvo estão otimamente alinhados, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo-modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais nucleotídeos da sequência-alvo. Exemplos não limitantes de nucleases sítio-dirigidas úteis nos métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, CRISPR nucleases, TALE nucleases e meganuclease. Para uma descrição adicional do uso dessas nucleases, veja, por exemplo, US8795965 e US20140301990.
[0091] Sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente agrupadas)/CRISPR- associados (Cas) fornecem bactérias e arquéias com imunidade adaptiva contra vírus e plasmídeos por utilização de RNAs de CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucléicos invasores. A proteína Cas9 (ou funcional e/ou variante equivalente desta, ou seja, proteína Cas9-like) contém naturalmente atividade de DNA endonuclease que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA de ocorrência natural ou sintéticas denominadas crRNA e tracrRNA (também denominado RNAs-guia). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também denominada RNA-guia único (“sgRNA”). Dessa forma, as proteínas Cas9 ou Cas9-like se associam com um RNA de direcionamento de DNA (cujo termo engloba tanto a configuração de RNA-guia de duas moléculas quanto a configuração de RNA-guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou Cas9-like e guia a proteína para uma sequência de ácidos nucléicos-alvo. Se a proteína Cas9 ou Cas9-like retém sua função enzimática natural, ela irá clivar DNA-alvo para criar uma quebra de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição etc.) alterando, dessa forma, a expressão gênica. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes estão englobadas pelo termo Cas9-like) foram alteradas de tal forma que possuem uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, elas clivam uma única fita ao invés de ambas as fitas do DNA-alvo, enquanto, em outros casos, elas foram severamente reduzidas a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Descrições exemplares adicionais de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas, por exemplo, em US8795965.
[0092] Mutágenos que criam mutações primariamente pontuais e deleções, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo mutágenos químicos ou radiação, podem ser usados para criar variações genéticas. Mutágenos incluem, sem limitação, metanossulfonato de etila, metilmetano sulfonato, N-etil-N-nitrosuréia, trietilmelamina, N-metil- N-nitrosouréia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalan, mostarda nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N- metil-N’-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2- aminopurina, 7,12-dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano e semelhantes), dicloridrato de 2-metóxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil) aminopropilamino]acridina e formaldeído.
[0093] A introdução de variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população de bactérias tratada carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não o fazem. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias que carregam uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção para variantes genéticas bem- sucedidas envolvia a seleção por ou contra alguma funcionalidade transmitida ou abolida pela variação genética, por exemplo, no caso de inserção de gene de resistência antibiótica ou de abolição de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também é possível aplicar uma pressão de seleção com base em uma própria sequência de polinucleotídeos, de modo que somente uma variação genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem necessitar também de um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender a clivagem de genomas desprovidos da variação genética introduzida em um local- alvo, de modo que a seleção seja efetivamente dirigida contra a sequência de referência na qual a variação genética visa ser introduzida. Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do local-alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10, ou menos nucleotídeos do local-alvo, incluindo clivagem no ou dentro do local-alvo). A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease sítio-específica selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma CRISPR nuclease, uma TALE nuclease (TALEN) ou uma meganuclease. Um processo desse tipo é similar aos processos para aumento da recombinação homóloga em um local-alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, bactérias desprovidas da variação genética desejada têm maior probabilidade de passar por clivagem que, se não reparada, resulta na morte da célula. Bactérias que sobrevivem à seleção podem então ser isoladas para uso na exposição às plantas para avaliação do fornecimento de um traço aprimorado.
[0094] Uma CRISPR nuclease pode ser usada como a nuclease sítio-específica para dirigir a clivagem a um local-alvo. Uma seleção aprimorada de micróbios mutados pode ser obtida por utilização de Cas9 para matar células não mutadas. As plantas são então inoculadas com os micróbios mutados para reconfirmar a simbiose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem então ser isolados novamente de tecidos de planta. Os sistemas de CRISPR nuclease empregados para seleção contra não-variantes podem empregar elementos similares àqueles descritos acima com relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem dirigida ao local-alvo, dessa forma, aumenta a morte de células afetadas.
[0095] Outras opções para induzir especificamente clivagem em um local-alvo estão disponíveis, por exemplo, nucleases de dedo de zinco, sistemas de TALE nuclease (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. ZFNs podem ser modificadas geneticamente para visar sequências de DNA desejadas e isso permite que nucleases de dedo de zinco clivem sequências-alvo únicas. Quando introduzidas em uma célula, ZFNs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. As nucleases efetoras ativador de transcrição-like (TALENs) são DNA endonucleases artificiais geradas por fusão de um domínio de ligação efetor TAL (ativador de transcrição-like) ao DNA a um domínio de clivagem de DNA. TALENS podem ser rapidamente modificadas geneticamente para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma célula, TALENs podem ser usadas para editar DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula) por indução de quebras de fita dupla. Meganucleases (homing endonuclease) são endo-desoxirribonucleases caracterizadas por um sítio de reconhecimento grande (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. Meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente direcionada. Por modificação de sua sequência de reconhecimento por meio de modificação genética de proteínas, a sequência visada pode ser alterada. Meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam eles bacterianos, de plantas ou animais, e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY-YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. Homing endonucleases exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII.
[0096] Os métodos da presente revelação podem ser empregados para introduzir ou aprimorar um ou mais de diversos traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência no uso de água, biomassa global, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância térmica, tolerância ao sal, resistência ao estresse por nematódeo, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão do proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou broto, germinação da semente, sobrevida da plântula, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz, ou qualquer combinação destes, podem ser usados para medir o crescimento, e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços aprimorados) desenvolvidas sob condições idênticas. Um traço preferido a ser introduzido ou aprimorado é a fixação de nitrogênio, como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, uma planta que resulta dos métodos descritos nesse relatório descritivo exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais do que uma planta agrícola de referência desenvolvida sob as mesmas condições no solo.
[0097] O traço a ser aprimorado pode ser avaliado sob condições que incluem a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióticos. Exemplos de estressores incluem estresses abióticos (por exemplo, estresse pelo calor, estresse por sal, estresse por seca, estresse por frio e estresse de poucos nutrientes) e estresses bióticos (por exemplo, estresse por nematódeo, estresse por inseto herbívoro, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano e estresse por patógeno viral).
[0098] O traço aprimorado pelos métodos e composições da presente revelação pode ser fixação de nitrogênio, incluindo em uma planta que não era capaz previamente de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo produzem 1% ou mais (por exemplo, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes, ou mais), comparadas com bactérias isoladas da primeira planta antes da introdução de qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível de fixação de nitrogênio desejado pode ser obtido após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes). Em alguns casos, níveis de fixação de nitrogênio aumentados são obtidos na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliação do grau de fixação de nitrogênio são conhecidos, cujos exemplos são descritos nesse relatório descritivo.
Fixação de nitrogênio
[0099] São descritos nesse relatório descritivo métodos de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta, que compreendem a exposição da planta a bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais do nitrogênio na planta (por exemplo, 2%, 5%, 10%, ou mais), o que pode representar uma capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes, comparada com a planta na ausência das bactérias. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina ou amônia. As variações genéticas podem ser qualquer variação genética descrita nesse relatório descritivo, incluindo exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação genética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos revelados nesse relatório descritivo pode ser uma mutação por knockout ou ela pode abolir uma sequência regulatória de um gene- alvo, ou ela pode compreender a inserção de uma sequência regulatória heteróloga, por exemplo, inserção de uma sequência regulatória encontrada dentro do genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano. A sequência regulatória pode ser escolhida com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de planta. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas desenvolvidas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióticos ou abióticos.
[0100] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas nesse relatório descritivo pode ser medida de várias formas, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. Evidências de que uma bactéria particular está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta podem incluir: 1) O N total da planta aumenta significantemente após inoculação, preferivelmente com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) Os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições de limitação de N após inoculação (o que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) A fixação de N2 é documentada por meio do uso de uma abordagem de 15N (que pode consistir em experimentos de diluição de isótopo, ensaios de redução de 15N2 ou ensaios de abundância natural de 15N); 4) O N fixado é incorporado em uma proteína ou metabólito da planta; e 5) Todos esses efeitos não são observadas em plantas uninoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa do inóculo.
[0101] A cascata reguladora da fixação de nitrogênio do tipo selvagem pode ser representada como um circuito lógico digital em que as entradas de O2 e NH4+ passam através de um portão de NOR, cuja saída entra em um portão de AND em adição ao ATP. Em algumas modalidades, os métodos revelados nesse relatório descritivo rompem a influência de NH4+ sobre esse circuito, em vários pontos na cascata reguladora, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio até mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos revelados nesse relatório descritivo também prevêem a alteração do impacto de ATP ou O2 sobre o conjunto de circuitos, ou a substituição do conjunto de circuitos com outras cascatas reguladoras na célula, ou alteração dos circuitos genéticos diferentes da fixação de nitrogênio. Os agrupamentos gênicos podem ser modificados geneticamente novamente para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Por eliminação dos elementos reguladores nativos fora e dentro de sequências codificadoras de agrupamentos de genes, e substituindo-os com sistemas reguladores alternativos, os produtos funcionais de óperons genéticos complexos e outros agrupamentos de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes das espécies das quais os genes nativos foram derivados. Após a nova modificação genética, os agrupamentos de genes sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas reguladores induzíveis controlando, dessa forma, a expressão dos produtos, como desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portões lógicos, geradores de pulso, osciladores, interruptores ou dispositivos de memória. O cassete de controle de expressão pode estar ligado a um promotor, de tal forma que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, por exemplo, um sensor de oxigênio, de temperatura, de toque, de estresse osmótico, estresse de membrana ou sensor redox.
[0102] Como um exemplo, os genes nifL, nifA, nifT, e nifX podem ser eliminados do agrupamento do gene nif. Genes sintéticos podem ser projetados por randomização de códons do DNA que codifica cada sequência de aminoácidos. A seleção de códons é realizada, especificando que o uso de códons seja o mais divergente possível do uso de códons no gene nativo. As sequências propostas são escaneadas quanto a quaisquer características indesejadas, por exemplo, sítios de reconhecimento de enzima de restrição, sítios de reconhecimento de transposon, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios de ligação ao ribossomo crípticos e terminadores rho independentes. Sítios de ligação ao ribossomo sintéticos são escolhidos para combinar com a potência de cada sítio de ligação ao ribossomo nativo correspondente, por exemplo, por construção de um plasmídeo-repórter fluorescente no qual as 150 bp que circundam um códon de início do gene (de -60 a +90) estão fundidas a um gene fluorescente. Essa quimera pode ser expressa sob o controle do promotor Ptac, e a fluorescência medida por meio de citometria de fluxo. Para gerar sítios de ligação ao ribossomo sintéticos, uma biblioteca de plasmídeos repórteres usando 150 bp (-60 a +90) de um cassete de expressão sintético é gerada. Resumidamente, um cassete de expressão sintético pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca de RBS, e a sequência codificadora para cada gene sintético. Múltiplos clones são avaliados para identificar o sítio de ligação ao ribossomo sintético que melhor combina com o sítio de ligação ao ribossomo nativo. Óperons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os óperons nativos são, dessa forma, construídos e testados para complementação funcional. Uma descrição exemplar adicional de óperons sintéticos é fornecida em US20140329326.
Espécies bacterianas
[0103] Micróbios úteis nos métodos e composições revelados nesse relatório descritivo podem ser obtidos por extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; trituração de sementes para isolar micróbios; plantio de sementes em amostras de solo diversas e recuperação de micróbios de tecidos; ou inoculação de plantas com micróbios exógenos e determinação de quais micróbios aparecem em tecidos de planta. Exemplos não limitantes de tecidos de planta incluem uma semente, plântula, folha, muda, planta, bulbo ou tubérculo. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, tais como rizosféricos, epífitos ou endófitos. As bactérias também podem ser originadas de um repositório, por exemplo, coleções de cepas ambientais, ao invés de isolar inicialmente uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, por meio de Sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; a definição do perfil da composição de comunidades em plantas; caracterização da funcionalidade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou avaliação das características microbianas usando meios seletivos ou fenotípicos (por exemplo, fenótipos de fixação de nitrogênio ou de solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas por meio de dados de sequências; dados de fenótipo; dados de plantas (por exemplo, genoma, dados de fenótipo e/ou de rendimento); dados do solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K, e/ou comunidades bióticas do solo a granel); ou qualquer combinação destes.
[0104] As bactérias e métodos de produção de bactérias descritos nesse relatório descritivo podem ser aplicar às bactérias capazes de se autopropagar eficientemente na superfície da folha, na superfície da raiz ou dentro de tecidos de plantas, sem indução de uma reação de defesa que danifique a planta, ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa da planta. As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser isoladas por cultivo de um extrato de tecido de planta ou de lavagem da superfície da folha em um meio sem nitrogênio adicionado. No entanto, as bactérias podem ser não cultiváveis, ou seja, não conhecidas por seres cultiváveis ou de cultivo difícil usando métodos- padrão conhecidos na técnica. As bactérias descritas nesse relatório descritivo podem ser um endófito ou um epífito ou uma bactéria que habita a rizosfera da planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetição das etapas de introdução de variação genética, exposição a diversas plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Endófitos são organismos que penetram no interior de plantas sem causar sintomas de doença ou despertar a formação de estruturas simbióticas, e são de interesse agronômico, pois podem aumentar o crescimento de plantas e aprimorar a nutrição de plantas (por exemplo, por meio da fixação de nitrogênio). As bactérias podem ser um endófito transmitido por semente. Endófitos transmitidos por semente incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma gramínea ou planta, por exemplo, como um endófito bacteriano transmitido por semente encontrado em sementes maduras, secas, não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fúngica visível, ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido por semente pode estar associado ou ser derivado da superfície da semente; alternativamente, ou em adição, ele pode estar associado ou ser derivado do compartimento interno da semente (por exemplo, de uma semente com superfície esterilizada). Em alguns casos, um endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de replicar dentro do tecido de planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de sobreviver à dessecação.
[0105] O isolado bacteriano de acordo com métodos da revelação pode compreender diversas taxas bacterianas diferentes em combinação. Apenas como exemplo, as bactérias podem incluir proteobactérias (por exemplo, Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobium, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (por exemplo, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium) e Actinobacteria (por exemplo, Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias que podem ser produzidas pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. e Sinorhizobium sp. As bactérias podem ser selecionadas do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae e Sinorhizobium meliloti. As bactérias podem ser do gênero Enterobacter e Rahnella.
[0106] As bactérias podem ser obtidas de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; o ambiente marinho, sua biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); da geosfera terrestre e marinha (regolito e pedra, por exemplo, pedras subterrâneas trituradas, areia e argilas); da criosfera e suas águas de degelo; da atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, gotículas de nuvens e chuva); de ambientes urbanos, industriais e outros ambientes feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada no concreto, canais da beira de estradas, superfícies de telhados e superfícies de estradas).
[0107] As plantas das quais as bactérias são obtidas podem ser uma planta que possui um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que naturalmente cresce em um ambiente particular ou sob certas condições de interesse. Apenas como exemplo, certa planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de salinidade elevada, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou ela pode ser resistente a certas pragas ou doenças presentes no ambiente, e pode ser desejável que um plantio comercial cresça nessas condições, particularmente caso sejam, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica particular. Como exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de plantios comerciais desenvolvidos nesses ambientes ou, mais especificamente, de plantas de plantio individuais que melhor exibem um traço de interesse dentro de um plantio desenvolvido em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas que crescem mais rápido dentro de um plantio desenvolvido em solos com limitação salina, ou as plantas manos danificadas em plantios expostos a danos severos por insetos ou doença epidêmica, ou plantas que possuem quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibras, teor de óleo e semelhantes, ou plantas que exibem cores, sabor ou aroma desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outra biota animal e de plantas, solo, água, sedimentos, e outros elementos do ambiente, como citado previamente.
[0108] As bactérias podem ser isoladas de tecido de planta. Esse isolamento pode ocorrer de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo por exemplo, raiz, caule e folhas, e tecidos reprodutivos da planta. Apenas como exemplo, métodos convencionais para o isolamento de plantas tipicamente incluem a excisão estéril do material de planta de interesse (por exemplo, comprimentos da raiz ou caule, folhas), esterilização de superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio 2%), e depois o material de planta é colocado em meio nutriente para crescimento microbiano. Alternativamente, o material de planta com a superfície esterilizada pode ser triturado em um líquido estéril (normalmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material de planta triturado, espalhada sobre a superfície de um meio ágar sólido adequado, ou meios, que pode ou não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser retiradas individualmente para separar as placas de meio nutriente, e adicionalmente purificadas até uma única espécie por métodos bem conhecidos. Alternativamente, a raiz da planta ou amostras de folhagem podem não ser esterilizadas na superfície, mas apenas lavadas gentilmente incluindo, dessa forma, microorganismos epifíticos que habitam a superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, por impressão e retirada de pedaços de raízes, caule ou folhas da planta sobre a superfície de um meio ágar e depois o isolamento de colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem a retirada por lavagem de pequenas quantidades de solo anexado às raízes incluindo, dessa forma, micróbios que colonizam a rizosfera da planta. Caso contrário, o solo aderido às raízes pode ser removido, diluído e espalhado sobre ágar de meios seletivos e não seletivos adequados para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas.
[0109] Culturas biologicamente puras de Rahnella aquatilis e Enterobacter sacchari foram depositadas em 14 de julho de 2015 com a “American Type Culture Collection” (ATCC; uma Autoridade Depositária Internacional), Manassas, VA, EUA, e receberam os números de Designação de Depósito de Patente na ATCC PTA-122293 e PTA-122294, respectivamente. Esses depósitos foram feitos ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste no “International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations” (Tratado de Budapeste).
Composições
[0110] Composições que compreendem bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos nesse relatório descritivo e/ou que possuem características como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas para o aprimoramento de traços de plantas. As composições que compreendem populações bacterianas podem ser revestidas em uma superfície de uma semente, e podem estar em forma líquida. As composições incluem revestimentos de semente para culturas agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. As composições também podem ser pulverizadas sobre as partes aéreas da planta, ou aplicadas às raízes por inserção em sulcos de arados nos quais as sementes de plantas são plantadas, por irrigação ao solo, ou por imersão das raízes em uma suspensão da composição. As composições podem ser desidratadas de uma forma adequada que mantenha a viabilidade da célula e a habilidade para inocular e colonizar artificialmente as plantas hospedeiras. A espécie bacteriana pode estar presente nas composições em uma concentração entre 108 a 1010 CFU/ml. As composições podem ser suplementadas com íons de metal-traço, por exemplo, íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês, ou combinações desses íons. A concentração de íons nas composições descritas nesse relatório descritivo pode estar entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM. As composições também podem ser formuladas com um carreador, por exemplo, beta-glucano, carboxilmetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açúcar, leite animal, ou outros carreadores adequados. Alternativamente, turfa ou materiais de plantio podem ser usados como um carreador, ou biopolímeros nos quais a composição é capturada no biopolímero, podem ser usados como um carreador. As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem aprimorar traços de plantas, por exemplo, a promoção do crescimento de plantas, a manutenção de um teor elevado de clorofila nas folhas, o aumento dos números de frutos ou sementes, e o aumento do peso unitário de frutos ou sementes.
[0111] As composições que compreendem as populações bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser revestidas na superfície de uma semente. Dessa forma, as composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias descritas nesse relatório descritivo também são contempladas. O revestimento de semente pode ser formado por misturação da população bacteriana com um carreador granular poroso, quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos de arados nos quais a semente é plantada ou pulverizada sobre as folhas da planta ou aplicadas por imersão das raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para popular a região abaixo do solo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável, ou popular as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com traços aprimorados (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).
[0112] As composições bacterianas descritas nesse relatório descritivo podem ser formuladas usando um carreador agricolamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante e um nutriente. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas nesse relatório descritivo pode incluir um carreador agricolamente aceitável (por exemplo, um ou mais de um fertilizante como, por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão como, por exemplo, um agente de adesão de ocorrência não natural, e um pesticida como, por exemplo, um pesticida de ocorrência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes revestidas, plântulas ou plantas descritas nesse relatório descritivo pode conter um carreador agricolamente aceitável desse tipo no revestimento de semente. Em qualquer uma das composições ou métodos descritos nesse relatório descritivo, um carreador agricolamente aceitável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural como, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética, ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitantes de carreadores agricolamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis são conhecidos na técnica.
[0113] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador agricolamente aceitável. O carreador pode ser um carreador sólido ou um carreador líquido, e em várias formas incluindo microesferas, pós, emulsões e semelhantes. O carreador pode ser qualquer um ou mais de diversos carreadores que conferem diversas propriedades, tais como estabilidade aumentada, umectabilidade ou dispersibilidade. Agentes umidificantes como, por exemplo, tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação destes, podem ser incluídos na composição. Emulsões água-em-óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.485.451). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, fitas ou péletes de ágar, espessantes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, líquidos como, por exemplo, compósitos aquosos de baixa viscosidade, suspensões aquosas, emulsões água-em-óleo etc. A formulação pode incluir grão ou produtos de legumes, por exemplo, grão ou feijões triturados, caldo ou farinha derivada de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.
[0114] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de plantas. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes, ou combinações destes. Alternativamente, o carreador agrícola pode ser um sólido, por exemplo, terra diatomácea, greda, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, cascas de sementes, outros produtos de plantas e animais, ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes mencionados anteriormente também são contempladas como carreadores como, por exemplo, sem limitação, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou péletes à base de farinha em greda, areia ou argila etc. As formulações podem incluir fontes de alimentos para as bactérias, por exemplo, cevada, arroz, ou outros materiais biológicos como, por exemplo, sementes, partes de plantas, bagaço de cana de açúcar, cascas ou talos do processamento de grãos, material de planta moído ou madeira de restos de locais de construção, serragem ou pequenas fibras da reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[0115] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes a uma semente, plântula ou planta. Exemplos não limitantes de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal destes). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido lático, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartrato de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente de pegajosidade ou aderente (denominado um agente adesivo) para ajudar a ligar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, uma superfície de uma semente). Esses agentes são úteis para combinação das bactérias com carreadores que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para gerar uma composição de revestimento. Essas composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte de planta. Em uma modalidade, adesivos são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, carragenana, PGA, outros biopolímeros, óleo mineral, polietileno glicol (PEG), polivinil pirrolidona (PVP), arabinogalactana, metil celulose, PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilonitrila, glicerol, trietileno glicol, acetato de vinila, goma gelana, poliestireno, polivinil, carboximetil celulose, goma Gatti e copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno.
[0116] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera como, por exemplo, cera de carnaúba, cera de abelhas, cera chinesa, cera de goma-laca, cera de espermaceti, cera de coroa, cera de mamona, cera de ouricuri e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), uma gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeínas), gomas arábicas e goma-lacas. Agentes adesivos podem ser compostos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitantes de polímeros que podem ser usados como um agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, copolímeros de etileno-acetato de vinila (EVA), álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, celuloses (por exemplo, etilceluloses, metilceluloses, hidróxi-metilceluloses, hidroxipropilceluloses, e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolímeros de cloreto vinilideno, cálcio lignossulfonatos, copolímeros acrílicos, polivinil-acrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, poliidroxietil acrilato, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.
[0117] Em alguns exemplos, um ou mais dos agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S-630), tensoativos, aglutinantes e agentes de enchimento.
[0118] A formulação também pode conter a tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem mesclas de nitrogênio-tensoativo como, por exemplo, Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos esterificados de sementes incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração de entre 0,01% v/v até 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração de entre 0,1% v/v até 1% v/v.
[0119] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiano. Um agente desse tipo pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que possa ser classificado como um dessecante, independentemente se o composto ou compostos são usados em concentrações tais que, na verdade, possuam um efeito dessecante sobre o inoculante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada, e devem promover a habilidade da população microbiana para sobreviver à aplicação nas sementes e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trehalose, sacarose, glicerol e metileno glicol. Outros dessecantes adequados incluem, sem limitação, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% até cerca de 50% por peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% até cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35%, ou entre cerca de 20% e cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como, por exemplo, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um rodenticida ou um nutriente. Exemplos não limitantes de reguladores do crescimento incluem brassinosteróide, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxinas (por exemplo, ácido indolilacético e indolilacetil aspartato), flavonóides e isoflavonóides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoalexinas (por exemplo, gliceolina), e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (por exemplo, pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacturônico e ácido óligo-galacturônico) e giberelinas. Esses agentes são idealmente compatíveis com a semente agrícola ou plântula sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, eles não devem ser deletérios para o crescimento ou saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente aquele que causa preocupações de segurança para uso em humanos, animais ou industriais (por exemplo, nenhuma questão de segurança, ou o composto é suficientemente lábil de modo que o produto derivado de plantas comercializável da planta contenha quantidades desprezíveis do composto).
[0120] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo, ou outros carreadores líquidos.
[0121] Composições sólidas podem ser preparadas por dispersão das populações bacterianas em e sobre um carreador sólido adequadamente dividido, por exemplo, turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e semelhantes. Quando essas formulações são usadas como pós molháveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis como, por exemplo, agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos, podem ser usados.
[0122] Os carreadores sólidos usados mediante formulação incluem, por exemplo, carreadores minerais como, por exemplo, argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita e perlita, e sais inorgânicos como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, pós orgânicos finos como, por exemplo, farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz, podem ser usados. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais como, por exemplo, óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, polipropileno glicol etc.
Espécies de plantas
[0123] Os métodos e bactérias descritos nesse relatório descritivo são adequados para qualquer uma de diversas plantas, por exemplo, plantas nos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitantes de plantas adequadas incluem musgos, liquens e algas. Em alguns casos, as plantas possuem valor econômico, social e/ou ambiental, por exemplo, plantios de alimentos, plantios de fibras, plantios de óleos, plantas na floresta ou indústrias de polpa e papel, matéria-prima para a produção de biocombustível e/ou plantas ornamentais. Exemplos não limitantes de plantas de plantio incluem maís, arroz, trigo, cevada, sorgo, mileto, aveia, centeio, triticale, trigo sarraceno, milho-verde, cana de açúcar, cebolas, tomates, morangos e aspargo.
[0124] Plantas que podem ser obtidas ou aprimoradas com o uso dos métodos e composição revelados nesse relatório descritivo também incluem abacaxi, banana, coco, lírio e grama; e plantas dicotiledôneas como, por exemplo, ervilha, alfafa, tomate de cáscara, melão, grão-de-bico , chicória, cravo-da-índia, couve crespa, lentilhas, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieiras, uvas, algodão, girassol, Arabidopsis, canola, cítricos (incluindo laranja, tangerina, kumquat, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão e alface.
[0125] Em alguns casos, a planta a ser aprimorada não é facilmente receptiva às condições experimentais. Por exemplo, uma planta de plantio pode demorar muita a crescer o bastante para avaliar praticamente um traço aprimorado serialmente ao longo de várias repetições. Conseqüentemente, uma primeira planta da qual as bactérias são inicialmente isoladas, e/ou as várias plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas podem ser uma planta-modelo, por exemplo, uma planta mais passível à avaliação sob condições desejadas. Exemplos não limitantes de plantas-modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A habilidade de bactérias isoladas de acordo com um método da revelação usando uma planta-modelo pode então ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de plantio) para confirmar a conferência do traço aprimorado.
[0126] Traços que podem ser aprimorados pelos métodos revelados nesse relatório descritivo incluem qualquer característica observável da planta incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, cheiro, alterações na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos, e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base em informação genotípica também é prevista (por exemplo, incluindo o padrão de expressão gênica da planta em resposta às bactérias, ou identificação da presença de marcadores genéticos, por exemplo, aqueles associados com fixação de nitrogênio aumentada). As plantas também podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço indesejável), ao contrário da presença de certa característica ou traço (por exemplo, uma característica ou traço desejável).
EXEMPLOS
[0127] Os exemplos fornecidos nesse relatório descritivo descrevem métodos de isolamento bacteriano, análise bacteriana e de planta e aprimoramento de traço de planta. Os exemplos são apenas para fins ilustrativos, e não devem ser de modo algum considerados como limitantes. Exemplo 1: Isolamento de micróbios de tecido de planta
[0128] A camada superficial do solo foi obtida de várias áreas agrícolas da região central da Califórnia. Vinte solos com características de textura diversas foram coletados, incluindo argila pesada, greda de argila de turfa, argila lodosa e greda arenosa. Sementes de vários milhos de campo, milho-verde, milho crioulo e tomate foram plantadas em cada solo, como mostrado na Tabela 1.
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Tabela 1: Tipo e variedades de plantio plantados em solo com características diversas.
[0129] As plantas foram arrancadas pela raiz após 2-4 semanas de crescimento e solo em excesso nas superfícies da raiz foi removido com água deionizada. Após remoção de solo, as plantas foram esterilizadas na superfície com água sanitária e enxaguadas vigorosamente em água estéril. Um corte de 1 cm de raiz, limpo, foi retirado da planta e colocado em uma solução salina tamponada com fosfato contendo microesferas de aço de 3 mm. Uma lama foi gerada por agitação vigorosa da solução com um TissueLyser II de Qiagen.
[0130] A raiz e a lama salina foram diluídas e inoculadas em vários tipos de meios de crescimento para isolar micróbios rizosféricos, endofíticos, epifítico e outros micróbios associados às plantas. Meios de ágar R2A e Nfb foram usados para obter colônias únicas, e rampas de meios Nfb semi- sólidos foram usadas para obter populações de bactérias fixadoras de nitrogênio. Após incubação de 2-4 semanas em rampas de meios Nfb semi-sólidos, as populações microbianas foram coletadas e semeadas para obter colônias únicas em ágar R2A, como mostrado na Figura 1A-B. colônias únicas foram ressuspensas em uma mistura de R2A e glicerol, submetidas à análise por PCR, e congeladas a -80°C para análise posterior. Aproximadamente 1.000 colônias únicas foram obtidas e designadas “micróbios isolados”.
[0131] Os isolados foram então submetidos a uma avaliação por PCR da colônia para detectar a presença do gene nifH a fim de identificar diazótrofos. O conjunto de iniciadores descrito previamente Ueda 19F/388R, que demonstrou que detecta mais de 90% de diazótrofos em avaliações, foi usado para sondar a presença do agrupamento nif em cada isolado (Ueda e cols. 1995; J. Bacteriol. 177: 1.414-1.417) . Colônias únicas de isolados purificados foram selecionadas, ressuspensas em PBS e usadas como um modelo para PCR da colônia, como mostrado na Figura 2. Colônias de isolados que geraram bandas de PCR positivas foram semeadas novamente, e o processo de PCR da colônia e nova semeadura foi repetido duas vezes para evitar a identificação falso-positiva de diazótrofos. Isolados purificados foram então designados “micróbios candidatos”. Exemplo 2: Caracterização de micróbios isolados Sequenciamento, análise e caracterização filogenética
[0132] Sequenciamento de rDNA 16S com o conjunto de iniciadores 515f-806r foi usado para gerar identidades filogenéticas preliminares para micróbios isolados e candidatos (veja, por exemplo, Vernon e cols.; BMC Microbiol., 23 de dezembro de 2002; 2: 39.). Os micróbios compreendem diversos gêneros incluindo: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pantoea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium e Paenibacillus, como mostrado na Tabela 2.
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Tabela 2: Diversidade de micróbios isolados de plantas de tomate como determinada por Sequenciamento profundo de rDNA 16S.
[0133] Subsequentemente, os genomas de 39 micróbios candidatos foram seqüenciados usando a plataforma Illumina Miseq. DNA genômico de culturas puras foi extraído usando o mini kit de DNA QIAmp (QIAGEN), e bibliotecas de DNA total para Sequenciamento foram preparadas por meio de um vendedor terceirizado (SeqMatic, Hayward). A montagem do genoma foi então realizada por meio do pacote A5 (Tritt e cols. 2012; PLoS One 7 (9): e42304). Os genes foram identificados e anotados, e aqueles relacionados à regulação e expressão de fixação de nitrogênio foram observados como alvos para mutagênese. Definição do perfil transcriptômico de micróbios candidatos
[0134] A definição do perfil transcriptômico da cepa CI010 foi realizado para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A Cepa CI010 foi cultivada em meios definidos livres de nitrogênio suplementados com 10 mM de glutamina. RNA total foi extraído dessas culturas (kit RNeasy de QIAGEN) e submetido ao Sequenciamento RNAseq por meio de HiSeq de Illumina (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de Sequenciamento foram mapeadas para os dados de genoma de CI010 usando Geneious, e os genes altamente expressos sob o controle de promotores da transcrição proximais foram identificados. As Tabelas 3A- C listam genes e seu nível de expressão relativo, como medido por meio de Sequenciamento RNASeq de RNA total. Sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese de vias de nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio, ou outros genes com um nível de expressão desejado. Avaliação da tratabilidade genética
[0135] Micróbios candidatos foram caracterizados com base na capacidade de transformação e tratabilidade genéticas. Primeiro, a utilização ótima da fonte de carbono foi determinada por crescimento em um pequeno painel de meios relevantes, bem como em uma curva de crescimento tanto em meios livres de nitrogênio quanto em meios ricos em nitrogênio. Segundo, a resistência antibiótica natural de cada cepa foi determinada por meio de plaqueamento de spot e crescimento em cultura líquida contendo um painel de antibióticos usados como marcadores seletivos para mutagênese. Terceiro, cada cepa foi testada quanto à sua capacidade de transformação por meio de eletroporação de uma coleção de plasmídeos. A coleção de plasmídeos compreende a expansão combinatória de sete origens de replicação, ou seja, p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 e pRO1600 e quatro marcadores de resistência antibiótica, ou seja, CmR, KmR, SpecR e TetR. Essa avaliação sistemática de compatibilidade de origem e marcador de resistência foi usada para identificar vetores para mutagênese à base de plasmídeo em micróbios candidatos. Exemplo 3: Mutagênese de micróbios candidatos Knockouts mediados por Lambda-Red
[0136] Vários mutantes de micróbios candidatos foram gerados usando o plasmídeo pKD46 ou um derivado contendo um marcador de resistência à canamicina (Datsenko e cols. 2000; PNAS 97 (12): 6.640-6.645). Foram projetados cassetes de knockout com homologia de 250 bp flanqueando o gene-alvo e gerados por meio de PCR de extensão superposta. Micróbios candidatos foram transformados com pKD46, cultivados na presença de arabinose para induzir a expressão do maquinário Lambda-Red, preparados para eletroporação, e transformados com os cassetes de knockout para produzir cepas candidatas mutantes. Quatro micróbios candidatos e uma cepa de laboratório, Klebsiella oxytoca M5A1, foram usados para gerar treze mutantes candidatos dos genes reguladores da fixação de nitrogênio nifL, glnB e amtB, como mostrado na Tabela 4.
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Tabela 4: Lista de mutantes por knockout únicos criados por meio de mutagênese Lambda-Red. Mutagênese óligo-dirigida com seleção de Cas9
[0137] Mutagênese óligo-dirigida foi usada para visar alterações genômicas ao gene rpoB em E. coli DH10B e mutantes foram selecionados com um sistema CRISPR-Cas. Um óligo mutagênico (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACC GTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”, em que * representa ligação fosforotioato) foi projetado para conferir resistência à rifampicina por meio de uma mutação de 4 bp ao gene rpoB. Células contendo um plasmídeo que codifica Cas9 foram induzidas para expressão de Cas9, preparadas para eletroporação, e depois eletroporadas tanto com o óligo mutagênico quanto com um plasmídeo que codifica a expressão constitutiva de um RNA-guia (gRNA) que visa a clivagem de Cas9 da sequência de rpoB WT. As células eletroporadas foram recuperadas em meios não seletivos de um dia para o outro para permitir segregação suficiente dos cromossomos mutantes resultantes. Após plaqueamento na seleção para o plasmídeo que codifica gRNA, duas de dez colônias avaliadas demonstraram que contêm a mutação desejada, enquanto o resto demonstrou ser composto por mutantes de escape gerados por meio de mutação do protoespaçador no plasmídeo de gRNA ou perda do plasmídeo de Cas9. Mutagênese Lambda-Red com seleção de Cas9
[0138] Mutantes de micróbios candidatos CI006 e CI010 foram gerados por meio de mutagênese Lambda-Red com seleção por CRISPR-Cas. Os cassetes de knockout continham um promotor endógeno identificado por meio da definição do perfil de transcrição (como descrito no Exemplo 2 e retratado na Tabela 3) e regiões de homologia de aproximadamente 250 bp que flanqueiam o alvo da deleção. CI006 e CI010 foram transformadas com plasmídeos que codificam o sistema de recombinação Lambda-Red (genes exo, beta, gam) sob o controle de um promotor induzível por arabinose e Cas9 sob o controle um promotor induzível por IPTG. Os sistemas de recombinação Red e Cas9 foram induzidos em transformantes resultantes, e as cepas foram preparadas para eletroporação. Os cassetes de knockout e um gRNA de seleção codificado por plasmídeo foram subsequentemente transformados nas células competentes. Após plaqueamento em antibióticos seletivos tanto para o plasmídeo de Cas9 quanto par ao plasmídeo de gRNA, 7 das 10 colônias avaliadas exibiam a mutação por knockout desejada, como mostrado na Figura 3. Exemplo 4: Fenotipagem in vitro de moléculas candidatas
[0139] O impacto do nitrogênio exógeno sobre a biossíntese e atividade de nitrogenase em vários mutantes foi avaliado. O Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) (Temme e cols. 2012; 109 (18): 7.085-7.090) foi usado para medir a atividade de nitrogenase em condições de cultura pura. As cepas foram desenvolvidas em tubos de ensaio hermeticamente fechados, e a redução de acetileno em etileno foi quantificada com um cromatógrafo a gás Agilent 6890. As atividades de ARA de micróbios candidatos e mutantes candidatos de contraparte desenvolvidos nos meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina são mostradas nas Figuras 4A-B e Figuras 10A-C.
[0140] Sob condições de cultura anaeróbicas, uma gama de concentrações de glutamina e amônia foi testada para quantificar o impacto sobre a atividade de fixação de nitrogênio. Em células do tipo selvagem, a atividade diminuiu rapidamente à medida que as concentrações de glutamina aumentavam. No entanto, em uma série de mutações por knockout iniciais, foi validada uma classe de mutação que permite a expressão de genes de fixação de nitrogênio sob concentrações de glutamina que, de outro modo, cessariam a atividade no tipo selvagem. Esse perfil foi gerado em quatro espécies diferentes de diazótrofos, como observado na Figura 4C. Além disso, por reconstrução da rede regulatória usando partes genéticas que foram identificadas, o nível de atividade de fixação de nitrogênio foi ajustado previsivelmente. Isso é observado na Figura 4B, que ilustra cepas CM023, CM021, CM015 e CI006. A Cepa CM023 é uma cepa pouco desenvolvida; a cepa CM021 é uma cepa bem desenvolvida; a cepa CM015 é uma cepa com desenvolvimento médio; a cepa CI006 é do tipo selvagem (cepa 2). A amônia excretada nos sobrenadantes da cultura foi testada usando um ensaio de base enzimática (MEGAZYME). O ensaio mede a quantidade de NADPH consumido na absorbância de 340 nm. O ensaio foi realizado em culturas bacterianas desenvolvidas em um ambiente anaeróbico livre de nitrogênio, com uma densidade de partida de 1E9 CFU/ml. Através de um painel de seis cepas desenvolvidas, uma cepa excretou até 100 μM de amônia ao longo de um período de 48 horas, como observado na Figura 4D. Além disso, um mutante duplo exibiu excreção de amônia maior do que o mutante simples do qual foi derivado, como observado na Figura 11. Isso demonstra uma capacidade microbiana para produzir amônia além de suas necessidades fisiológicas. Definição do perfil de transcrição de culturas puras
[0141] A atividade transcricional de CI006 foi medida usando a plataforma Nanostring Elements. As células foram desenvolvidas em meios livres de nitrogênio e 10E8 células foram coletadas após incubação de 4 horas. RNA total foi extraído usando o kit RNeasy de Qiagen. RNA purificado foi submetido a Core Diagnostics em Palo Alto, CA, para hibridização de sonda e análise por “Digital Analyzer”, como mostrado na Figura 5. Exemplo 5: Fenotipagem em plantas de micróbios candidatos Colonização de plantas por micróbios candidatos
[0142] A colonização de plantas hospedeiras desejadas por um micróbio candidato foi quantificada por meio de experimentos de crescimento de plantas de curto prazo. Plantas de milho foram inoculadas com cepas que expressam RFP por um plasmídeo ou por um cassete de expressão de RFP Tn5-integrado. As plantas foram desenvolvidas tanto em areia esterilizada quanto em meio de turfa não estéril, e a inoculação foi realizada por pipetagem de 1 ml de cultura de células diretamente sobre o coleoptilo da planta emergente três dias pós-germinação. Os plasmídeos foram mantidos por irrigação das plantas com uma solução contendo o antibiótico apropriado. Após três semanas, as raízes da planta foram coletadas, enxaguadas três vezes em água estéril para remover solo visível, e divididas em duas amostras. Uma amostra de raiz foi analisada por meio de microscopia de fluorescência para identificar os padrões de localização de micróbios candidatos. A microscopia foi realizada em comprimentos de 10 mm das raízes da planta intactas mais finas, como mostrado na Figura 6.
[0143] Um segundo método quantitativo para avaliação de colonização foi desenvolvido. Um ensaio de PCR quantitativo foi realizado em preparações de DNA inteiro das raízes de plantas inoculadas com os endófitos. As sementes de milho (Dekalb DKC-66-40) foram germinadas em areia previamente autoclavada em um pote de 6,35 centímetros por 6,35 centímetros por 25,4 centímetros. Um dia após o plantio, 1 ml de cultura de endófito de um dia para o outro (meios SOB) foi banhado exatamente no local onde a semente estava localizada. Um ml dessa cultura de um dia para o outro equivale aproximadamente a cerca de 10-9 cfu, variando dentro de 3 vezes um do outro, dependendo de qual cepa está sendo usada. Cada plântula foi fertilizada 3x por semana com 50 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 2,5 mM ou 0,25 mM de nitrato de amônio. Em quatro semanas após o plantio, amostras de raiz foram coletadas para extração de DNA. Os restos de solo foram removidos por lavagem usando spray pressurizado de água. Essas amostras de tecido foram então homogeneizadas usando Tissuelyzer de QIAGEN e o DNA foi então extraído usando o Mini Kit de DNA QIAmp (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi realizado usando RT-PCR Mx3005P de Stratagene nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram projetados (usando “NCBI’s Primer BLAST”) para serem específicos para loci no genoma de cada um dos endófitos. A presença das cópias do genoma dos endófitos foi quantificada. Para confirmar adicionalmente a identidade dos endófitos, os produtos de amplificação por PCR foram seqüenciados e foram confirmados como tendo a sequência correta. Os resumos do perfil de colonização da cepa CI006 e CI008 de micróbios candidatos são apresentados na Tabela 5. Uma taxa de colonização de até 10-7 x cfu / g de peso fresco de raiz foi demonstrada na cepa CI008.
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Tabela 5: Colonização de milho como medida por q-PCR.
Definição do perfil RNA em plantas
[0144] A biossíntese de componentes da via nif em plantas foi estimada por medição da transcrição de genes nif. RNA total foi obtido de tecido da raiz de planta de plantas inoculadas com CI006 (métodos de plantio como descritos previamente). A extração de RNA foi realizada usando o Mini Kit RNEasy de acordo com o protocolo recomendado (QIAGEN). RNA total desses tecidos de planta foi então testado usando os kits Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) usando sondas que eram específicas para os genes nif no genoma da cepa CI006. Os dados da expressão do gene nif em plantas estão resumidos na Tabela 6. A expressão de genes nifH foi detectada em plantas inoculadas por cepas CM013, enquanto a expressão de nifH não era detectável em plantas inoculadas com CI006. A cepa CM013 é um derivado da cepa CI006 no qual o gene nifL foi submetido a knockout.
[0145] Os genes de CM011 altamente expressos, classificados por transcritos por milhão de quilobases (TPM), foram medidos em plantas sob condição fertilizada. Os promotores que controlam a expressão de alguns desses genes altamente expressos foram usados como modelos para recombinação homóloga em loci de fixação e assimilação de nitrogênio visados. Amostras de RNA da planta desenvolvida em estufa inoculada com CM011 foram extraídas, o rRNA removido usando o kit Ribo-Zero, seqüenciado usando a plataforma Truseq de Illumina e mapeado de volta ao genoma de CM011. Os genes altamente expressos de CM011 estão listados na Tabela 7.
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Tabela 6: Ex; ressão de nifH em plantas.
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Tabela 7
Ensaio de 15N
[0146] O método primário para demonstração de fixação usa o isótopo de nitrogênio 15N, que é encontrado na atmosfera em uma taxa definida em relação ao 14N. Por suplementação de fertilizante ou atmosfera com níveis enriquecidos de 15N, pode-se observar a fixação diretamente, em quantidades de 15N acentuadas fixadas de uma atmosfera suplementada com gás 15N2 (Yoshida 1980) ou, inversamente, por meio de diluição de fertilizante enriquecido por gás N2 atmosférico em tecidos de planta (Iniguez 2004). O método de diluição permite a observação de nitrogênio fixado cumulativo ao longo do período de crescimento de plantas, enquanto o método de gás 15N2 se restringe à medição da fixação que ocorre ao longo do intervalo curto no qual uma planta pode ser desenvolvida em uma atmosfera contida (medição de taxa). Portanto, o método de gás é superior em termos de especificidade (na medida em que quaisquer níveis de 15N2 elevados na planta acima da taxa atmosférica podem ser atribuídos inequivocamente à fixação), mas não pode exibir atividade cumulativa.
[0147] Ambos os tipos de ensaio foram realizados para medir a atividade de fixação de cepas aprimoradas em relação às plantas de milho do tipo selvagem e uninoculadas, e taxas de fixação elevadas foram observadas em plantas para várias das cepas aprimoradas (Figura 12, Figura 14A e Figura 14B). Esses ensaios são instrumentais na demonstração de que a atividade das cepas observada in vitro se traduz nos resultados in vivo. Além disso, esses ensaios permitem a medição do impacto do fertilizante sobre a atividade da cepa, sugerindo funcionalidade adequada em um ambiente agrícola. Resultados similares foram observados quando plantas setárias foram inoculadas com cepas do tipo selvagem e aprimoradas (Figura 13). A atividade de fixação em plantas mostrada nas Figuras 14A-14C é ainda apoiada por dados transcriptômicos. Cepas evoluídas exibiram nível de transcrito de nifH aumentado em relação às contrapartes do tipo selvagem. Além disso, o nível de nitrogênio derivado de micróbio em plantas também está correlacionado com o nível de colonização em uma planta. Esses resultados (Figura 12, Figura 13, Figuras 14A-14C, Figura 15A e Figura 15B) apóiam a hipótese de que o micróbio, por meio da regulação aprimorada do agrupamento do gene nif, é a razão provável para o aumento no nitrogênio derivado da atmosfera observado no tecido de planta. Além de medir a fixação diretamente, o impacto da inoculação de plantas com as cepas aprimoradas em um ensaio de biomassa de planta com estresse por nitrogênio foi medido. Embora a biomassa de planta possa estar relacionada com muitas interações de micróbios possíveis com a planta, seria de se esperar que a adição de nitrogênio fixado impactasse no fenótipo da planta quando o nitrogênio é limitado. Plantas inoculadas foram desenvolvidas na ausência completa de nitrogênio, e foram observados aumentos significantes na área da folha, peso fresco e seco do broto, e peso fresco e seco da raiz em plantas inoculadas em relação aos controles não tratados (Figura 14C). Embora essas diferenças não possam ser atribuídas à fixação de nitrogênio exclusivamente, elas apóiam a conclusão de que as cepas aprimoradas fornecem ativamente nitrogênio à planta. Plantas de milho e setárias foram desenvolvidas e inoculadas como descrito acima. Fertilizante que compreende 15N 1,2% foi regularmente fornecido às plantas por meio de irrigação. A fixação de nitrogênio por micróbios foi quantificada por medição do nível de 15N no tecido de planta. Tecido da quarta folha foi coletado e seco em 4 semanas após o plantio. Amostras de folha seca foram homogeneizadas usando microesferas (QIAGEN Tissuelyzer) e divididas em alíquotas em cápsulas de estanho para IRMS (“MBL Stable Isotope Laboratory at The Ecosystems Center”, Woods Hole, MA). O nitrogênio derivado da atmosfera (NDFA) foi calculado, e as produções de nitrogênio por CI050 e CM002 são mostradas na Figura 7. Ensaio de produção de fitormônio
[0148] O cultivar de tomate-anão (Solanum lycopersicum) ‘Micro-Tom’ foi usado previamente para estudar a influência do ácido indol-3-acético sobre a maturação do fruto por meio de um ensaio in vitro (Cohen 1996; J. Am. Soc. Hortic. Sci. 121: 520-524) . Para avaliar a produção e secreção de fitormônio por micróbios candidatos, um ensaio de avaliação baseada em placa usando fruto de Micro-Tom imaturo foi desenvolvido. Placas de teste de cultura de tecido de doze poços foram preparadas por enchimento dos poços com meio ágar, permitindo que ele solidifique, e semeando 10 μl de culturas microbianas de um dia para o outro sobre a superfície de ágar, como mostrado na Figura 8. Os poços com ágar contendo quantidades crescentes de ácido giberélico (GA), mas sem cultura bacteriana, foram usados como um controle positivo e padrões. Flores um dia pós-antese removidas de plantas Micro-Tom em crescimento foram inseridas, com o caule primeiro, no ágar no ponto da cultura da semeadura bacteriana. Essas flores foram monitoradas por 2-3 semanas, e depois os frutos foram colhidos e pesados. Um aumento na massa de frutos de planta através de várias réplicas indica produção de hormônio de planta pelo micróbio inoculante, como mostrado na Figura 9. Exemplo 6: Evolução cíclica de micróbio-hospedeiro
[0149] Plantas de milho foram inoculadas com CM013 e desenvolvidas por 4 semanas até aproximadamente o estágio de crescimento V5. Aquelas que demonstram acúmulo de nitrogênio aumentado de fontes microbianas por meio da análise de 15N foram arrancadas pela raiz, e as raízes foram lavadas usando água pressurizada para remover solo grosseiro. Um corte de 0,25 g de raiz foi feito e enxaguado em solução de PBS para remover partículas finas de solo e micróbios não aderentes. As amostras de tecido foram homogeneizadas usando microesferas de aço de 3 mm no TissueLyser II de QIAGEN. O homogeneizado foi diluído e plaqueado em meio ágar SOB. Colônias únicas foram ressuspensas em meios líquidos e submetidas à análise por PCR de rDNA 16S e mutações únicas à cepa inoculante. O processo de isolamento de micróbio, mutagênese, inoculação e novo isolamento pode ser repetido várias vezes para aprimorar os traços microbianos, traços de plantas e a capacidade de colonização do micróbio. Exemplo 7: Compatibilidade através da geografia
[0150] A habilidade dos micróbios aprimorados para colonizar uma planta inoculada é crucial para o sucesso da planta sob condições de campo. Embora os métodos de isolamento descritos sejam projetados para selecionar micróbios do solo que possam ter relacionamento próximo com plantas de plantio como, por exemplo, milho, muitas cepas podem não colonizar eficazmente através de uma gama de genótipos de plantas, ambientes, tipos de solo ou condições de inoculação. Na medida em que a colonização é um processo complexo que exige uma gama de interações entre uma cepa microbiana e a planta hospedeira, a avaliação da competência colonização se tornou um método central para a seleção de cepas prioritárias para desenvolvimento posterior. Os esforços iniciais para avaliar a colonização usavam a marcação fluorescente de cepas, que era eficaz, mas era demorada e não escalonável em termos de cepas. Como a atividade de colonização não é passível de aprimoramento direto, é imperativo que os candidatos a produto potenciais sejam selecionados de cepas que sejam colonizadoras naturais.
[0151] Foi projetado um ensaio para testar a colonização robusta das cepas do tipo selvagem em certa planta hospedeira usando qPCR e iniciadores projetados para serem cepa- específicos em uma amostra da comunidade. Esse ensaio visa medir rapidamente a taxa de colonização dos micróbios de amostras de tecido de milho. Os testes iniciais usando cepas avaliadas quanto às colonizadoras prováveis usando microscopia de fluorescência e técnicas baseadas em placas indicaram que uma abordagem de qPCR seria tanto quantitativa quanto escalonável.
[0152] Um ensaio típico é realizado da seguinte forma: plantas, principalmente de variedades de maís e trigo, são desenvolvidas em uma mistura de envasamento de turfa na estufa em réplicas de seis por cepa. Em quatro ou cinco dias após o plantio, um banho de 1 ml de culturas de bactérias em fase estacionária inicial diluída até uma OD590 de 0,6-1,0 (aproximadamente 5E+08 CFU/ml) é pipetado sobre o coleoptilo emergente. As plantas são irrigadas apenas com água corrente e é permitido o crescimento por quatro semanas antes da coleta de amostras, quando então as plantas são arrancadas pela raiz e as raízes lavadas cuidadosamente para remover a maioria dos resíduos de turfa. Amostras de raiz limpa são retiradas e homogeneizadas para criar uma lama de restos de células de planta e células bacterianas associadas. Desenvolvemos um protocolo de extração de DNA de alto rendimento que efetivamente produzia uma mistura de DNA de planta e bacteriano para usar como modelo para qPCR. Com base em experimentos de semeadura de célula bacteriana, esse processo de extração de DNA fornece uma amostra quantitativa de DNA bacteriano em relação ao peso fresco das raízes. Cada cepa é avaliada usando iniciadores cepa-específicos projetados usando Primer BLAST (Ye 2012) e comparada com a amplificação de fundo de plantas uninoculadas. Como alguns iniciadores exibem amplificação foram do alvo em plantas uninoculadas, a colonização é determinada pela presença de amplificação ou de amplificação elevada do produto correto comparado com o nível de fundo.
[0153] Esse ensaio foi usado para medir a compatibilidade do produto microbiano através de diferentes geografias do solo. As qualidades do solo de campo e as condições de campo podem ter grande influência sobre o efeito de um produto microbiano. O pH, a capacidade retenção de água e micróbios competitivos do solo são apenas alguns exemplos de fatores no solo que podem afetar a habilidade de sobrevida e colonização do inóculo. Um ensaio de colonização foi realizado usando amostras retiradas de três tipos diversos de solos de campos agrícolas na Califórnia como o meio de crescimento de plantas (Figura 16A). Uma densidade de inoculação intermediária foi usada para se aproximar das condições agrícolas realísticas. Dentro de 3 semanas, a Cepa 5 colonizou todas as plantas a 1E+06 a 1E+07 CFU/g de peso fresco. Após 7 semanas de crescimento de plantas, uma versão evoluída da Cepa 1 exibiu taxas de colonização elevadas (1E+06 CFU/g FW) em todos os tipos de solo. (Figura 16B).
[0154] Adicionalmente, a avaliação da colonização na complexidade de condições de campo, um experimento de campo de 1 acre em San Luis Obispo em junho de 2015 foi iniciado para avaliar os impactos e a colonização de sete das cepas do tipo selvagem nas duas variedades de milho de campo. O design agronômico e a execução do experimento foram realizados por contrato com uma organização de pesquisa de campo, Pacific Ag Research. Para inoculação, a mesma técnica de revestimento de sementes de cultura de turfa testada no experimento dos métodos de inoculação foi empregada. Durante o período da estação de crescimento, amostras de planta foram coletadas para avaliar a colonização na raiz e no interior do caule. Amostras foram coletadas de três lotes replicados de cada tratamento de quatro e oito semanas após o plantio, e de todas as seis réplicas de cada tratamento imediatamente antes da colheita em 16 semanas. Amostras adicionais foram coletadas de todos os seis lotes replicados de tratamentos inoculados com a Cepa 1 e Cepa 2, bem como controles não tratados, em 12 semanas. Os números de células por grama de peso fresco de raízes lavadas foram avaliados como com outros ensaios de colonização com qPCR e iniciadores cepa- específicos. Duas cepas, Cepa 1 e Cepa 2, mostraram colonização da raiz consistente e disseminada que alcançou um pico em 12 semanas e depois declinou abruptamente (Figura 16C). Embora a Cepa 2 pareceu estar presente em números em uma ordem de magnitude menor do que a Cepa 1, ela foi encontrada em números mais consistentes de planta para planta. Nenhuma cepa pareceu colonizar eficazmente o interior do caule. Em apoio aos dados de colonização por qPCR, ambas as cepas foram reisoladas com sucesso das amostras de raiz usando plaqueamento e Sequenciamento de 16S para identificar isolados de sequência compatível.
[0155] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “uma” e “pelo menos um” e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser considerado como englobando tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “que compreendem”, “que possuem”, “que incluem” e “que contêm” devem ser considerados como termos em aberto (ou seja, significando “que incluem, sem limitação”), a menos que observado de forma diferente. A citação de faixas de valores nesse relatório descritivo visa simplesmente servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente nesse relatório descritivo. Por exemplo, se a faixa 10-15 é revelada, então 11, 12, 13 e 14 também são revelados. Todos os métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma nesse relatório descritivo ou de algum outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tais como”) fornecidos nesse relatório descritivo, visa simplesmente melhor iluminar a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da invenção, a menos que reivindicado de forma diferente. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
[0156] Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas nesse relatório descritivo, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser subentendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática da invenção. Deseja-se que as reivindicações seguintes definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam por elas englobados.
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Apesar das reivindicações em anexo, a revelação descrita nesse relatório descritivo também é definia pelas seguintes cláusulas: 1. Um método de produção de uma ou mais bactérias, que compreende: (a) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introdução da variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) exposição de diversas plantas às bactérias variantes; (d) isolamento de bactérias de tecido ou solo de uma das várias plantas, em que a planta da qual as bactérias são isoladas possui um traço aprimorado em relação a outras plantas nas várias plantas; e (e) repetição das etapas (b) a (d) com bactérias isoladas na etapa (d). 2. O método de cláusula 1, em que o traço aprimorado é fixação de nitrogênio aumentada na planta da qual as bactérias são isoladas. 3. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. 4. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador da transcrição, anti-ativador da transcrição, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+-dinitrogênio-redutase ADP-D- ribosiltransferase. 5. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. 6. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma mutação por knock-out. 7. O método de cláusula 1, em que a variação genética resulta na eliminação ou abolição da atividade de um domínio de proteína. 8. O método de cláusula 1, em que a variação genética altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo. 9. O método de cláusula 1, em que a variação genética compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. 10. O método de cláusula 1, em que a variação genética compreende a inserção de uma sequência regulatória encontrada dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano que corresponde às bactérias nas quais a variação genética é introduzida. 11. O método de cláusula 0, em que a sequência regulatória é selecionada com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de tecido de planta. 12. O método de cláusula 1, em que a variação genética é produzida por mutagênese química. 13. O método de cláusula 1, em que a etapa (c) ainda compreende a exposição das plantas a estressores bióticos ou abióticos. 14. O método de cláusula 0, em que bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes produzem 1% ou mais de nitrogênio em uma segunda planta do mesmo tipo que a primeira planta. 15. O método de cláusula 0, em que bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes exibem um aumento de pelo menos a 2 vezes na fixação de nitrogênio, quando comparadas com bactérias isoladas da primeira planta. 16. O método de cláusula 0, em que a segunda planta é desenvolvida na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio. 17. O método de cláusula 1, em que a primeira planta é uma planta de cultura agrícola. 18. O método de cláusula 0, em que a planta de cultura agrícola é selecionada de cevada, arroz, maís, trigo, sorgo, milho-verde, cana de açúcar, cebolas, tomates, morangos ou aspargo. 19. O método de cláusula 1, em que a primeira ou segunda planta nas várias plantas são uma planta-modelo. 20. O método de cláusula 0, em que a planta-modelo é selecionada de Setaria, Brachypodium ou Arabidopsis. 21. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma variação genética pré-determinada que é introduzida especificamente em um local-alvo. 22. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma mutação aleatória dentro do local-alvo. 23. O método de cláusula 1, em que a etapa (a) ainda compreende a realização de análise genética de bactérias isoladas. 24. O método de cláusula 1, em que a etapa (b) ainda compreende a aplicação de uma pressão de seleção para enriquecer para bactérias que compreendem a variação genética. 25. O método de cláusula 0, em que a pressão de seleção compreende a clivagem de genomas desprovidos da variação genética introduzida em um local-alvo, em que a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do local-alvo. 26. O método de cláusula 0, que compreende ainda o isolamento de bactérias que sobrevivem à pressão de seleção. 27. O método de cláusula 0, em que a clivagem é dirigida por uma nuclease sítio-específica selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma CRISPR nuclease, uma TALE nuclease ou uma meganuclease. 28. O método de cláusula 0, em que a nuclease sítio- específica é uma CRISPR nuclease. 29. O método de cláusula 1, em que a variação genética é uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. 30. O método de cláusula 1, em que bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. 31. O método de cláusula 1, em que bactérias isoladas após repetição das etapas (b) a (d) uma ou mais vezes compreendem diversas taxas bacterianas diferentes. 32. O método de cláusula 1, em que as bactérias são isoladas de tecido de planta. 33. O método de cláusula 1, em que o isolamento de bactérias na etapa (a) compreende o isolamento de bactérias de uma semente da primeira planta. 34. Um método de aumento da fixação de nitrogênio em uma planta, que compreende exposição da planta a bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta. 35. O método de cláusula 0, em que as bactérias produzem 5% ou mais de nitrogênio na planta. 36. O método de cláusula 0, em que as bactérias produzem 10% ou mais de nitrogênio na planta. 37. O método de cláusula 0, em que as bactérias produzem o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio suplementar. 38. O método de cláusula 0, em que a variação genética é uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. 39. O método de cláusula 0, em que a variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. 40. O método de cláusula 0, em que a variação genética (a) é uma mutação por knock-out; (b) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (c) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. 41. O método de cláusula 0, em que as bactérias são do gênero Enterobacter. 42. O método de cláusula 34, em que as bactérias são do gênero Rahnella. 43. Método da reivindicação 0, em que as bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. 44. O método de cláusula 0, em que as bactérias compreendem diversas taxas bacterianas diferentes. 45. O método de cláusula 0, em que a planta é uma planta de cultura agrícola. 46. O método de qualquer uma das cláusulas 0-45, em que a planta é uma planta não leguminosa. 47. O método de cláusula 0, em que a planta de cultura agrícola é selecionada de sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. 48. O método de cláusula 0, em que a planta é um organismo geneticamente modificado (GMO). 49. O método de cláusula 0, em que a planta não é um organismo geneticamente modificado (GMO). 50. O método de cláusula 0, em que a planta foi geneticamente modificada ou cruzada para uso de nitrogênio eficiente. 51. Uma população bacteriana que compreende bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio em uma planta desenvolvida na presença da população de bactérias. 52. A população bacteriana da cláusula 0, em que as bactérias produzem o nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia, ou outra fonte química de nitrogênio suplementar. 53. A população bacteriana da cláusula 0, em que a variação genética é uma variação em um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. 54. A população bacteriana da cláusula 0, em que a variação genética é uma mutação que resulta em um ou mais de: expressão aumentada de nifA ou glutaminase; expressão diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; atividade de remoção de adenilil diminuída de GlnE; ou atividade de remoção de uridilil diminuída de GlnD. 55. A população bacteriana da cláusula 51, em que a variação genética (a) é uma mutação por knock-out; (b) altera ou abole uma sequência regulatória de um gene-alvo; ou (c) compreende a inserção de uma sequência regulatória heteróloga. 56. A população bacteriana da cláusula 0, em que as bactérias são Enterobacter. 57. A população bacteriana da cláusula 51, em que as bactérias são Rahnella. 58. A população bacteriana da cláusula 51, em que as bactérias são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. 59. A população bacteriana da cláusula 51, em que as bactérias compreendem diversas taxas bacterianas diferentes. 60. Uma composição que compreende a população bacteriana de qualquer uma das cláusulas 0-0. 61. A composição da cláusula 60, em que a composição compreende a população bacteriana revestida em uma superfície de uma semente. 62. A composição da cláusula 60, em que a composição é formulada como um líquido ou pó. 63. Uma bactéria que possui um Número de Depósito ATCC de PTA-122293 ou PTA-122294.

Claims (17)

1. Método de aumento de uma quantidade de nitrogênio atmosférico em uma planta de milho em um campo, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: exposição de uma planta de milho em um campo a diversos diazótrofos modificados compreendendo pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio que aumenta a expressão ou atividade de nifH, em que a pelo menos uma variação genética introduzida compreende material genético originalmente de pelo menos um organismo do mesmo gênero que os referidos diversos diazótrofos modificados, através do qual a planta de milho exposta aos diazótrofos modificados compreende uma quantidade aumentada de nitrogênio atmosférico relativa a uma planta de milho exposta à mesma quantidade de diazótrofos não modificados da mesma espécie que os diazótrofos modificados.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que a pelo menos uma variação genética introduzida compreende uma inserção de material genético de um diazótrofo da mesma espécie que os diazótrofos modificados.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que o referido material genético originalmente de diazótrofos do mesmo gênero que os referidos diversos diazótrofos modificados compreende um elemento regulatório.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARAC TERI ZADO pelo fato de que o referido elemento regulatório é um elemento regulatório heterólogo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARAC TERIZADO pelo fato de que o referido elemento regulatório é um promotor.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARAC TERIZADO pelo fato de que o referido promotor é um promotor que é ativo na presença de nitrogênio do ambiente.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que os referidos diversos diazótrofos modificados compreendem ainda uma modificação na via genética regulatória de assimilação de nitrogênio.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARAC TERI ZADO pelo fato de que os referidos diversos diazótrofos modificados compreendem uma modificação que altera a atividade ou expressão de um gene selecionado do grupo que consiste em: GlnE, AmtB, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, polinucleotídeo que codifica glutaminase, e glnD.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERIZADO pelo fato de que pelo menos uma variação genética introduzida em uma rede genética regulatória de fixação de nitrogênio que aumenta expressão ou atividade de nifH aumenta a expressão ou atividade de nifH sob condições não limitantes de nitrogênio.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERIZADO pelo fato de que os referidos diversos diazótrofos modificados têm expressão ou atividade de nifH aumentada no campo comparado a uma diversidade de diazótrofos modificados da mesma espécie no mesmo campo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido campo compreende pelo menos 0,01 mM de nitrogênio fixado.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido campo compreende pelo menos 0,1 mM de nitrogênio fixado.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido campo compreende pelo menos 0,5 mM de nitrogênio fixado.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que os diversos diazótrofos modificados compreendem epifíticas.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que os diversos diazótrofos modificados compreendem endofíticas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que os diversos diazótrofos modificados compreendem rizosféricas.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que o material genético dos diversos diazótrofos modificados consiste essencialmente em material genético originalmente de diazótrofos da mesma espécie que os referidos diversos diazótrofos modificados.
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