CN101328477A

CN101328477A - 一种双向筛选系统及其应用

Info

Publication number: CN101328477A
Application number: CNA2008101170822A
Authority: CN
Inventors: 李山虎; 陈伟; 周建光
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2008-12-24

Abstract

本发明公开了一种双向筛选系统。该双向筛选系统包括大肠杆菌素释放基因、抗生素抗性基因、CI857阻遏物编码基因及PL启动子序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的双向筛选系统可以广泛应用于各种宿主菌，培养及筛选只需使用LB培养基而不需添加任何特殊试剂，克隆的筛选、分离和鉴定简单方便，42℃时细菌生长快，实验周期短。本发明的双向筛选系统很少发生突变，筛选效率高，极大地减少了同源重组过程中筛选阳性克隆的工作量，测序结果表明，获得的重组子没有发生任何序列突变，而且没有留下任何抗生素或标签等痕迹。

Description

一种双向筛选系统及其应用

技术领域

本发明涉及一种双向筛选系统及其应用。

背景技术

重组工程(Recombineering)是近年来兴起的一种基于λ噬菌体Red重组酶和体内同源重组反应的新型遗传工程技术，使用该技术不需要限制性内切酶和连接酶，仅需PCR扩增35-40bp短同源臂的线性DNA打靶片段即可在大肠杆菌体内对染色体DNA、细菌人工染色体(BAC)或普通质粒DNA进行高效精确的敲除、敲入、克隆和突变等修饰。Red重组系统包括Exo、Beta和Gam三种蛋白质，在可调控启动子控制下表达。Gam蛋白能抑制核酸酶RecBCD对线性双链DNA分子的降解；Exo是一种双链DNA依赖的核酸外切酶，能从5’端向3’端方向降解DNA，从而留下带3’突出的双链DNA；Beta是一种单链DNA结合蛋白，能结合在由Exo消化产生的3’端突出，防止DNA被核酸酶降解，同时介导互补单链DNA的退火和体内重组。

λ噬菌体Red重组酶介导的体内同源重组效率约为万分之一，需要进行大量克隆筛选才能获得重组子，通常利用抗菌素抗性基因作为筛选标记通过耐药性筛选，或者将loxP或Frt位点加在耐药性基因的两端，通过激活cre或flp重组酶的表达去除耐药性基因，但仍然会留下一个loxP或Frt位点。基因的单碱基点突变、阅读框架内基因的拼接融合等修饰要求不能留下任何筛选标记和多余的序列，因此，需要利用双向筛选标记精确地修饰基因而不会留下任何多余的DNA序列。

目前通常使用的双向筛选标记是利用一个抗生素耐药性基因(如新霉素)和sacB基因(neo-sacB)作为双向筛选标记，通过两步筛选来修饰DNA：第一步是将neo-sacB双向筛选标记敲入目的位点，进行抗生素耐药性筛选；第二步是将目的DNA敲入，用以替换neo-sacB，利用敲除neo-sacB基因的细菌在含7％蔗糖的M63培养基上能生长、而带有sacB基因的细菌在含7％蔗糖的M63培养基上不能生长来反向筛选阳性克隆。该方法的缺陷在于：sacB蛋白易于自发产生点突变，在反向筛选中会产生大量假阳性克隆，需进行大量筛选才能获得重组子。Nefedov等使用四环素抗性基因(tetracycline resistance gene，tet^R)作为反向筛选标记只能得到1％的阳性克隆(M.Nefedov，R.Williamson，P.A.loannou，Insertion of disease-causing mutations inBACs by homologous recombination in Escherechia coli，Nucleic AcidsRes，2000，28(17)：E79.)。Jamsai等使用EcoRI作为筛选标记，筛选效率为4％(D.Jamsai，et al.Insertion of common mutation into the human β-globin locus using GETRecombination and an EcoRI endonuclease counterselectioncassette.J.Biotechnol.2003，101：1-5)。Jamsai建立的新型I-SceI筛选标记会产生大于70％的假阳性背景(D.Jamsai，et al.Targeted modification of a humanβ-globin locusBAC colne using GET Recombination and anI-SceI counterselectioncassette.Genomics.2003，82：68-77.)。2005年，galK和thyA基因被报道用于双向筛选，具有较高的筛选效率(thyA基因的筛选效率大于90％)，但是只能在特殊构建的缺陷型宿主菌(ΔgalK、ΔthyA)中进行重组，需要使用添加脱氧葡萄糖或胸腺嘧啶的基本培养基(M9)筛选，细菌生长缓慢导致实验周期较长(Soren Warming，NinaCostantino，Donald L. Court，Nancy A.Jenkins，Neal G.Copeland.Simple and highlyefficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.4 e36.Queenie N.Y.Wong，Vivian C.W.Ng，Marie C.M.Lin，Hsiang-fu Kung，Danny Chan，Jian-Dong Huang.Efficient and seamless DNA recombineering using athymidylate synthase A selection system in Escherichia coli.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.6 e59.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种双向筛选系统。

本发明所提供的双向筛选系统，是包括大肠杆菌素释放基因(kil)、抗生素抗性基因、CI857阻遏物编码基因及PL启动子的DNA片段。

所述PL启动子启动所述大肠杆菌素释放基因、抗生素抗性基因和CI857阻遏物编码基因的转录。

所述双向筛选系统还可以包括另一个启动子，该启动子启动所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因的转录，所述PL启动子只启动大肠杆菌素释放基因的转录。

所述PL启动子除了可以启动大肠杆菌素释放基因的转录外，还可以启动所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因中任一基因的转录；所述双向筛选系统还包括一个启动子，该启动子启动大肠杆菌素释放基因、所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因三个基因中除PL启动子启动的两个基因外的第三个基因的转录。

所述双向筛选系统除了含有PL启动子外，还包括两个启动子；所述PL启动子只启动大肠杆菌素释放基因的转录；所述两个启动子分别启动所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因的转录。

上述大肠杆菌素释放基因、抗生素抗性基因和CI857阻遏物编码基因的转录方向可以相同，也可以不同。

上述抗生素抗性基因可为现有的抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因和四环素抗性基因等。

当所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因时，所述双向筛选系统的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。

含有上述双向筛选系统的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

上述双向筛选系统可以用于目的转化子的筛选。

为了使λ噬菌体Red重组酶的重组工程技术更加有效地用于基因功能研究，本发明利用温度敏感缺陷型λ噬菌体PL启动子及大肠杆菌素释放基因作为反向筛选标记和抗生素抗性基因结合，构建了一个双向筛选系统(如kan/kil双向筛选系统)。其中，kil基因的表达受PL启动子和温度敏感的CI857阻遏物控制，在30℃时，CI857阻遏物结合在PL启动子区，阻止从PL起始的基因转录；当温度达到42℃时，CI857阻遏蛋白失活，PL启动子启动kil基因表达，产生的细胞毒素在45分钟内可杀死宿主细胞。利用kil基因作为反向筛选标记，仅需使用普通LB培养基在42℃条件下培养即可快速筛选到阳性克隆。且kil基因大小为144bp，易于PCR扩增，不易产生突变，有效地降低了假阳性背景的干扰。

为了检测kan/kil双向筛选系统的功能，本发明在质粒pKD46携带的阿拉伯糖诱导表达Red重组酶的作用下，使用kan/kil双向筛选系统，成功地将南美锥虫69bp的P4序列敲入大肠杆菌染色体外膜蛋白lamB基因上。随机挑选在42℃条件下生长的12个克隆进行检测，结果表明这12个克隆均为阳性。实验结果表明，本发明建立的kan/kil双向筛选系统筛选效率可达100％，筛选效率高于目前已报道的双向筛选系统。

本发明构建的kan/kil双向筛选系统可以广泛应用于各种宿主菌，培养及筛选只需使用LB培养基而不需添加任何特殊试剂，克隆的筛选、分离和鉴定简单方便，42℃时细菌生长快，实验周期短。本发明的kan/kil双向筛选系统很少发生突变，筛选效率高，极大地减少了同源重组过程中筛选阳性克隆的工作量，测序结果表明，获得的重组子没有发生任何序列突变，而且没有留下任何抗生素或标签等痕迹，为染色体、BAC/PAC、质粒DNA的无痕迹修饰提供了更加高效实用的有力工具，为重组工程技术的广泛应用和基因功能的研究提供新工具和方法。

附图说明

图1为带有kan/kil双向筛选系统的菌株CWP3的构建过程

图2为阳性克隆PCR鉴定结果

图3为带有kan/kil双向筛选系统的菌株CWP3在不同温度下的生长状况

图4为利用kan/kil双向筛选系统将P4序列敲入大肠杆菌染色体外膜蛋白lamB基因的过程

图5为阳性克隆的PCR鉴定结果

图6为转入P4序列的大肠杆菌染色体PCR扩增产物序列分析

具体实施方式

下面以卡那霉素基因作为抗生素筛选标记基因为例，阐述双向筛选系统的构建过程及其效果。

实施例1、kan/kil双向筛选系统的构建

本发明中所涉及的菌株和质粒的基因型见表1。

表1菌株和质粒的基因型

大肠杆菌DY330是将带有Red重组酶基因(Exo、Beta和Gam)的缺陷型λ噬菌体左向操纵子整合到大肠杆菌W3110的染色体上得到的重组大肠杆菌(构建方法见文献Yu D，Ellis HM，Lee EC，et al.An efficient recombination system for chromosomeengineering in Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(11)：5978-5983.军事医学院生物工程研究所)；菌株CWP3为本发明构建的染色体上带有kan/kil双向筛选系统的重组菌(具体构建方法如图1所示)；菌株CWP5为验证kan/kil双向筛选系统的功能所构建的重组菌(具体构建方法如图4所示)；质粒pKD46是携带Red重组酶基因的低拷贝质粒，Red重组酶基因在阿拉伯糖诱导的ParaB启动子下调控表达，具有温度敏感型复制子，在温度高于37℃时质粒自动丢失(构建方法见文献Kirill A.Datsenko and Barry L.Wanner.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci.2000，97：6640-6645.军事医学院生物工程研究所)；质粒pUC-KS提供kan/sacB双向筛选标记，具体构建方法如下：

提取野生型枯草芽孢杆菌DB104(中国药品生物制品检定所菌种编号63529)的基因组DNA并以其为模板，PCR扩增sacB基因。PCR扩增产物经NdeI酶切后与经NdeI和PvuII双酶切的质粒pUC19的DNA片段进行连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，小提质粒进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pUC19-sacB。以质粒pET28a为模板，PCR扩增卡那霉素基因。PCR扩增产物经NdeI和XmnI双酶切后与经相同双酶切的重组质粒pUC19-sacB的DNA片段进行连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，小提质粒进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pUC-KS。

LB培养基组成：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、Nacl 10g/l、琼脂15g/l，pH值7.0。

sacB反向筛选培养基组成：M63基本培养基、琼脂15g/l、0.2％甘油、1mg/L生物素、7％蔗糖，pH值7.0。

各种抗性筛选培养基中抗生素的浓度为：氨苄青霉素(Amp^R)50ug/ml、卡那霉素(Km^R)25ug/ml，均为sigma公司产品。质粒提取及PCR产物回收试剂盒均购自Promega公司，引物合成及DNA测序由上海英俊生物技术公司完成。

一、同源臂及引物设计

同源臂决定了目的基因插入的位置和体内亚克隆目的基因的大小和区域。按照引物设计原则，GC分布均匀、含量约为50％，长度约为40bp。扩增引物按照常规方法设计。引物序列中小写字母代表与打靶区同源的序列，大写字母代表扩增引物序列，斜体大写下划线字母代表重叠引物序列。实验中所用引物及序列见表2。

表2引物及序列

二、带有kan/kil双向筛选系统的菌株CWP3的构建

以下PCR扩增均采用the GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)，高保真SuperTaq酶购自上海申能博彩生物科技有限公司。

以质粒pUC-KS为模板，以kansacB-kilN1和kansacB-kilN2为引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到3100bp的kan/sacB双向筛选标记的双链DNA，将其命名为kansacB。将扩增得到的kansacB电击转化至大肠杆菌DY330中，利用大肠杆菌DY330所提供的Red重组系统，通过体内同源重组替换DY330染色体上缺陷型λ噬菌体PL操纵子中的cIII ssb ral sieB N基因。将得到的重组大肠杆菌涂布于含有卡那霉素(kan)的LB平板上，30℃过夜培养，利用kan基因筛选重组子，将得到的阳性重组大肠杆菌命名为DY330-1。

由于cIII ssb ralsieB N基因的缺失，导致大肠杆菌DY330-1丧失了重组功能，将质粒pKD46通过电击转化法转入大肠杆菌DY330-1中，然后将ΔkansacB1和ΔkansacB2也通过电击转化法转入上述含有质粒pKD46的大肠杆菌中，使ΔkansacB1和ΔkansacB2单链DNA片段进行互搭。将得到的重组大肠杆菌涂布于sacB反向筛选培养基上培养，30℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.2，加终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖继续培养至OD₆₀₀＝04-0.6，利用带有sacB基因的细菌在含有蔗糖的培养基中不能生长的特性，将得到的重组大肠杆菌涂布于含有7％蔗糖的sacB反向筛选培养基上培养，通过sacB基因反向筛选kan/sacB双向筛选标记被敲除的重组子，将得到的阳性重组大肠杆菌命名为DY330-2。该方法是利用质粒pKD46提供的Red重组系统，将ΔkansacB1和ΔkansacB2单链DNA片段互搭，以敲除大肠杆菌DY330-1中的kan/sacB双向筛选标记。

以质粒pUC-KS为模板，以kan-rexAB1和kan-rexAB2为引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到950bp的kan基因双链DNA，将其命名为KS-kan，KS-kan的的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。将扩增得到的KS-kan电击转化至大肠杆菌DY330-2中，利用质粒pKD46提供的Red重组系统，替换DY330-2染色体上缺陷型λ噬菌体PL操纵子中的rexA、rexB基因，将得到的重组大肠杆菌涂布于含有卡那霉素(kan)的LB平板上，30℃过夜培养，利用kan基因筛选重组子，将得到的阳性重组大肠杆菌命名为CWP3。带有kan/kil双向筛选系统的菌株CWP3的具体构建过程如图1所示。

提取CWP3的DNA并以其为模板，以kankil-T1和kankil-T2为引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到2484bp的kan/kil双向筛选标记的DNA，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1中自5′末端第1-144位为大肠杆菌素释放基因、第145-608位为PL启动子序列，第609-1558位为卡那霉素抗性基因，第1559-2484位为CI857阻遏物编码基因。具体的检测结果如图2所示。其中，泳道1-4为带有kan/kil双向筛选系统的菌株CWP3的2484bp PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道5为对照菌株DY330的4852bp PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M为DL15000的DNA分子量标准。

三、kan/kil双向筛选

由于重组大肠杆菌CWP3的染色体上带有kan/kil双向筛选系统，耐药基因kan提供正向筛选标记，带有kan/kil双向筛选系统的菌株可以在含有卡那霉素(25ug/ml)的LB培养基上生长；kil基因提供反向筛选标记，42℃时，CI857阻遏蛋白失活，PL启动子启动kil基因表达，产生的细胞毒素在45分钟内可杀死宿主细胞。

取200μl重组大肠杆菌CWP3涂布于无抗性的平板上，42℃过夜培养，同时取梯度稀释的重组大肠杆菌CWP3(10μl-10^-4μl)涂布于相同的无抗性的平板上，30℃条件下培养作为对照，以检测kil基因的功能。重组大肠杆菌CWP3在不同温度下的生长状况如图3所示。其中A为CWP3在30℃条件下的生长状况，B为CWP3在42℃条件下的生长状况。结果表明，带有带有kan/kil双向筛选系统的重组大肠杆菌CWP3在42℃条件下CI857解除对PL启动子的抑制，kil基因表达产生细胞毒素杀死宿主细胞；而在30℃条件下培养的对照组重组大肠杆菌CWP3生长正常。表明kil基因适合作为反向选择标记基因。

实施例2、运用kan/kil双向筛选系统构建重组菌CWP5

为了验证kan/kil双向筛选系统的功能，在pKD46质粒携带的Red重组酶的介导下，利用上述实施例1构建的kan/kil双向筛选系统，在大肠杆菌W3110体内通过两步同源重组无痕迹地将南美锥虫69bp的P4序列插入大肠杆菌W3110染色体上外膜蛋白lamB基因中，具体过程如图4所示：

第一步，在阿拉伯糖的诱导下，质粒pKD46的Red重组酶表达。提取上述实施例1构建的重组大肠杆菌CWP3的DNA并以其为模板，以kankil-lamB1和kankil-lamB2为引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，也得到2484bp的kan/kil双向筛选标记的DNA(两侧各带有40bp与lamB基因插入位点同源的序列)。将上述PCR扩增得到的两侧各带有40bp与lamB基因插入位点同源的kan/kil双向筛选标记的DNA通过电击转化导入大肠杆菌中，与大肠杆菌W3110染色体在lamB基因的插入位点发生同源重组。挑取转入2484bpkan/kil双向筛选标记DNA的重组菌的单克隆，37℃条件下培养在含有卡那霉素(25ug/ml)的LB平板上，挑选在含有卡那霉素的LB平板上生长正常的单克隆，转入42℃条件下培养，结果均不能生长。结果表明，带有kan/kil双向筛选标记的DNA片段已经重组到大肠杆菌W3110的染色体中，将得到的重组菌命名为W3110-1。

第二步，将P4-lamB1和P4-lamB2通过电击转化法转入大肠杆菌W3110-1中，使P4-lamB1和P4-lamB2单链DNA片段互搭，利用两侧带有lamB同源序列的P4片段，通过体内同源重组替换大肠杆菌W3110-1染色体上lamB基因中的kan/kil双向筛选标记的DNA。

利用kil基因反向筛选阳性克隆，将转入P4片段的重组菌于LB平板上42℃过夜培养，随机挑取12个在42℃条件下能生长的转入P4片段的重组菌的单克隆，利用位于染色体DNA lamB基因插入位点两侧的lamBT1和lamBT2为引物PCR鉴定，PCR扩增结果如图5所示。其中，泳道1-12为转入P4片段的重组菌的391bp PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道13为对照菌株W3110的322bp PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M为DL2000的DNA分子量标准，将得到重组菌命名CWP5。结果表明，12个阳性克隆的PCR扩增产物均为391bp的条带，阳性克隆率为100％。对PCR产物进行测序，结果如图6所示。结果表明，P4序列完整插入lamB基因，没有留下任何筛选标记。

序列表

<160>2

<210>1

<211>950

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat 60

accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg 120

ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa 180

tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac 240

gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc 300

gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt 360

acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag 420

cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg 480

agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc 540

agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 600

cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac 660

cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 720

tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 780

atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct 840

gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac 900

cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata 950

<210>2

<211>2484

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttagtgaatg cttttgcttg atctcagttt cagtattaat atccattttt tataagcgtc 60

gacggcttca cgaaacatct tttcatcgcc aataaaagtg gcgatagtga atttagtctg 120

gatagccata agtgtttgat ccatctggat tatcctgtca gttagctttg gtggtgtgtg 180

gcagttgtag tcctgaacga aaaccccccg cgattggcac attggcagct aatccggaat 240

cgcacttacg gccaatgctt cgtttcgtat cacacacccc aaagccttct gctttgaatg 300

ctgcccttct tcagggctta atttttaaga gcgtcacctt catggtggtc agtgcgtcct 360

gctgatgtgc tcagtatcac cgccagtggt atttatgtca acaccgccag agataattta 420

tcaccgcaga tggttatctg tatgtttttt atatgaattt attttttgca ggggggcatt 480

gtttggtagg tgagagatct gaattgctat gtttagtgag ttgtatctat ttatttttca 540

ataaatacaa ttggttatgt gttttggggg cgatcgtgag gcaaagaaaa cccggcgctg 600

aggccgggtc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga 660

gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca 720

atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag 780

tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca 840

tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg 900

gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc 960

atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc 1020

ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga 1080

gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt 1140

cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac 1200

gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca 1260

aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt 1320

gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg 1380

tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt 1440

gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc 1500

ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa 1560

ttcaatccat ttactatgtt atgttctgag gggagtgaaa attcccctaa ttcgatgaag 1620

attcttgctc aattgttatc agctatgcgc cgaccagaac accttgccga tcagccaaac 1680

gtctcttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggaacaact ctcattgcat 1740

gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct atccctgatc 1800

agtttcttga aggtaaactc atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc acctggctca 1860

acagcctgct cagggtcaac gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg cttggagcct 1920

gttggtgcgg tcatggaatt accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc actggctttt 1980

ttggttgtgc ttacccatct ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag ctcaggtgag 2040

aacatccctg cctgaacatg agaaaaaaca gggtactcat actcacttct aagtgacggc 2100

tgcatactaa ccgcttcata catctcgtag atttctctgg cgattgaagg gctaaattct 2160

tcaacgctaa ctttgagaat ttttgcaagc aatgcggcgt tataagcatt taatgcattg 2220

atgccattaa ataaagcacc aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc tgcgacagat 2280

tcctgggata agccaagttc atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag gcgacgtgcg 2340

tcctcaagct gctcttgtgt taatggtttc ttttttgtgc tcatacgtta aatctatcac 2400

cgcaagggat aaatatctaa caccgtgcgt gttgactatt ttacctctgg cggtgataat 2460

ggttgcatgt actaaggagg ttgt 2484

Claims

1、一种双向筛选系统，是包括大肠杆菌素释放基因、抗生素抗性基因、CI857阻遏物编码基因及PL启动子的DNA片段。

2、根据权利要求1所述的双向筛选系统，其特征在于：所述PL启动子启动所述大肠杆菌素释放基因、抗生素抗性基因和CI857阻遏物编码基因的转录。

3、根据权利要求1所述的双向筛选系统，其特征在于：所述PL启动子只启动大肠杆菌素释放基因的转录：所述双向筛选系统还包括一个启动子，该启动子启动所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因的转录。

4、根据权利要求1所述的双向筛选系统，其特征在于：所述PL启动子启动大肠杆菌素释放基因和下述两个基因中任一个基因的转录：所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因；所述双向筛选系统还包括一个启动子，该启动子启动如下三个基因中除PL启动子启动的两个基因外的第三个基因的转录：所述大肠杆菌素释放基因、所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因。

5、根据权利要求1所述的双向筛选系统，其特征在于：所述PL启动子只启动大肠杆菌素释放基因的转录；所述双向筛选系统还包括两个启动子，所述两个启动子分别启动所述抗生素抗性基因和所述CI857阻遏物编码基因的转录。

6、根据权利要求1-5中任一所述的双向筛选系统，其特征在于：所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因。

7、根据权利要求6所述的双向筛选系统，其特征在于：所述双向筛选系统的脱氧核糖核苷酸序列是序列表中的序列1。

8、含有权利要求1-7中任一所述双向筛选系统的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

9、权利要求1-7中任一所述双向筛选系统在筛选目的转化子中的应用。