CN105505974B - 一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌基因无痕同源重组的方法，该方法基于Lac阻遏系统和抗性筛选实现；通过构建包含lac操纵序列控制的抗性操纵子的大肠杆菌重组菌和包含正负筛选标记的无痕重组工具基因串，建立了一种大肠杆菌无痕同源重组的方法，可实现目的基因对大肠杆菌染色体上的靶位点进行无痕重组的目标，对大肠杆菌染色体进行基因编辑研究工作具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种基于Lac阻遏系统和抗性筛选实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法。
背景技术
大肠杆菌具有基因操作相对简单、生长快、发酵成本低等优点，是目前基因工程中最常用的模式菌株之一。对大肠杆菌基因组进行基因的突变、删除、插入或替换等操作是大肠杆菌代谢工程的核心技术。Red同源重组技术是一种可在染色体水平上进行遗传操作的基因打靶技术，具有同源序列短、使用范围广和操作策略灵活等特点，是目前在大肠杆菌中最常用到的同源重组技术。但利用传统的Red同源重组技术对大肠杆菌的基因组进行编辑后会留下抗性筛选基因序列，即使此序列中的抗性基因可以利用质粒pCP20所表达的FLP重组酶来消除，但最终还是会在基因组上残留FRT位点序列。此类同源重组后残留的位点序列会对后续的基因同源重组操作的准确性和重组效率产生严重的负面影响。
Lac操纵子是大肠杆菌中参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。Lac操纵序列包含了lac P启动子序列和紧随的操纵序列lac O，当菌体中含有lacI阻遏物基因所表达的阻遏物时，该阻遏物会结合到lac O上从而关闭lac P启动子。本专利首先将构建的由lac操纵序列启动的抗性基因A操纵子，将其同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子，再用正筛选标记抗性基因B与负筛选标记lacI阻遏物基因反向连接构成的无痕重组工具基因串同源替换基因组上的靶位点序列，利用此工具基因串上lacI基因所表达的阻遏物抑制抗性基因A的表达，最后用目标DNA片段同源替换此工具基因串以激活抗性基因A的表达，实现利用抗性I筛选得到重组成功的无痕同源重组子的目标。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种基于Lac阻遏系统和抗性筛选实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法，包括以下步骤：
（1）将抗性基因A与lac操纵序列相连，得到操纵子，所述抗性基因A为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；
（2）将操纵子同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子；
（3）用无痕重组工具基因串对步骤2同源重组替换后的大肠杆菌的靶位点序列进行同源替换；所述无痕重组工具基因串由正筛选标记抗性基因B与负筛选标记lacI阻遏物基因反向连接而成，抗性基因B为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；负筛选标记lacI阻遏物基因包含placIq启动子；
（4）利用抗性对步骤3同源替换后的大肠杆菌进行筛选，获得重组成功的重组子；
（5）用目标DNA片段同源替换步骤4所得到的阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，利用抗性对目标DNA片段同源替换后的大肠杆菌进行筛选，得到重组成功的无痕同源重组子。
进一步地，所述抗性和抗性均选自抗氨苄青霉素、抗氯霉素、抗卡那霉素、抗四环素等，且抗性不同于抗性。
本发明的有益效果是：本发明所公开的方法中无痕重组工具基因串和目标DNA片段的两步同源重组所产生的阳性重组子均可以用抗生素进行快速而有效的筛选，并能够达到用目标基因对大肠杆菌靶位点进行无痕重组的效果。此方法的建立对大肠杆菌染色体进行基因编辑研究工作具有重要的意义。
附图说明
图1：Plac-lacO-kan操纵子替换野生型lacI基因及其启动子的过程示意图
图2：含无痕重组工具基因串cat-PlacIq-lacI的重组载体pUC19-cat-PlacIq-lacI的结构示意图
图3：含无痕重组工具基因串tet-PlacIq-lacI的重组载体pUC19-tet- PlacIq-lacI的结构示意图
图4：利用cat-PlacIq-lacI工具基因串将天然talB基因启动子替换为trc启动子的过程示意图
图5：利用tet-PlacIq-lacI工具基因串将天然talB基因启动子替换为trc启动子的过程示意图。
具体实施方式
本发明采用了具有抗性、且具有lac阻遏作用的工具基因串，实现对基因重组的筛选；首先，采用操纵子（包含抗性基因A）同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子；然后用无痕重组工具基因串（包含抗性基因B和lacI阻遏物基因）对同源重组替换后的大肠杆菌的靶位点序列进行同源替换，使得抗性基因A的表达被抑制，而抗性基因B能有效表达，从而能利用抗性筛选出成功重组替换的大肠杆菌；最后用目标DNA片段进一步同源替换阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，使得抗性消失，而抗性基因A有效表达，从而能利用抗性I筛选出成功重组了目标DNA片段的大肠杆菌。
目标DNA片段为根据需要设计的基因片段，目标DNA片段的设计为本领域的常用技术手段，靶位点序列为目标DNA片段需要替换的序列，靶位点序列的挑选为本领域的公知常识。
本发明中，基因的同源重组为本领域的常用技术手段，例如使用电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将外源片段或质粒载体导入大肠杆菌细胞。包含靶位点基因两端同源臂的外源片段可以利用Red同源重组技术和染色体上的靶位点基因发生同源重组。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，本实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 构建由lac操纵序列启动的卡那霉素抗性基因kan操纵子，并同源重组替换大肠杆菌DH5α的野生型lacI基因及其启动子，构建包含由氯霉素抗性基因cat与lacI阻遏物基因反向连接组成的无痕重组工具基因串的重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI，利用cat-PlacIq-lacI工具基因串，将大肠杆菌DH5α中talB基因的天然启动子替换为trc启动子，步骤如下：
1.1.将质粒pKD46电转入大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素平板筛选获得成功导入该质粒的菌株。
1.2. 用上下游引物lacI-Plac-kan-F和lacI-kan-R（DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示）从质粒pKD4上pcr扩增得到Plac-lacO-kan操纵子基因，将其同源重组替换野生型lacI基因及其启动子，用卡那霉素平板筛选获得正确重组的阳性菌株。Plac-lacO-kan操纵子基因结构如图1所示，此操纵子基因包括Lac启动子(Plac)，lacI阻遏物结合位点(lacO)和卡那霉素抗性基因（kan）三个部分，序列如SEQ ID NO. 3所示。
1.3 用上下游引物Bgl II-lacI-F和Kpn I-lacI-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示）从质粒pTrc99a上pcr扩增得到包含lacI结构基因及其突变型启动子的基因片段PlacIq-lacI。
1.4用上下游引物BamH I-cat-F和Hind III-cat-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示）从质粒pKD3上pcr扩增得到氯霉素抗性基因片段cat。
1.5将步骤4所得的cat基因和质粒pUC19分别用限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切后，回收cat基因和质粒pUC19大片段，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat。将重组质粒pUC19-cat和步骤3所得PlacIq-lacI基因分别用限制性内切酶BamH I、Kpn I双酶切后，回收质粒pUC19-cat大片段和PlacIq-lacI基因，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI（质粒结构如图2所示），此质粒中包含的无痕重组工具基因串cat- PlacIq-lacI的序列如SEQ ID NO. 8所示；
1.6 用上下游引物cat-lacI-talB-F和cat-lacI-talB-R（DNA序列分别如SEQ IDNO. 12和SEQ ID NO. 13所示）从步骤5所得的质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI上pcr扩增得到工具基因串cat-PlacIq-lacI，所得基因的两侧序列与talB基因的天然启动子两侧序列同源。将扩增所得基因导入步骤2所得的重组大肠杆菌，同源重组替换该大肠杆菌基因talB的启动子，用氯霉素平板筛选，得到重组菌株DH5α PtalB:: cat-PlacIq-lacI。
1.7 trc启动子基因片段（DNA序列如SEQ ID NO. 14所示）由公司合成，将其导入步骤6所得的重组菌株DH5α PtalB:: cat-PlacIq-lacI，同源重组替换菌株基因组上的cat-PlacIq-lacI片段，用卡那霉素平板筛选，得到同源重组成功的阳性重组菌株DH5αPtalB::Ptrc。替换过程如图4所示。
实施例2 构建由lac操纵序列启动的卡那霉素抗性基因kan操纵子，并同源重组替换大肠杆菌BL21（DE3）的野生型lacI基因及其启动子，构建包含由氯霉素抗性基因cat与lacI阻遏物基因反向连接组成的无痕重组工具基因串的重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI，利用cat-PlacIq-lacI工具基因串，将大肠杆菌BL21（DE3）中talB基因的天然启动子替换为trc启动子，步骤如下：
2.1.将质粒pKD46电转入大肠杆菌BL21（DE3），用氨苄青霉素平板筛选获得成功导入该质粒的菌株。
2.2. 用上下游引物lacI-Plac-kan-F和lacI-kan-R（DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示）从质粒pKD4上pcr扩增得到Plac-lacO-kan操纵子基因，将其同源重组替换野生型lacI基因及其启动子，用卡那霉素平板筛选获得正确重组的阳性菌株。Plac-lacO-kan操纵子基因结构如图1所示，此操纵子基因包括Lac启动子(Plac)，lacI阻遏物结合位点(lacO)和卡那霉素抗性基因（kan）三个部分，序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.3 用上下游引物Bgl II-lacI-F和Kpn I-lacI-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示）从质粒pTrc99a上pcr扩增得到包含lacI结构基因及其突变型启动子的基因片段PlacIq-lacI。
2.4用上下游引物BamH I-cat-F和Hind III-cat-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示）从质粒pKD3上pcr扩增得到氯霉素抗性基因片段cat。
2.5将步骤4所得的cat基因和质粒pUC19分别用限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切后，回收cat基因和质粒pUC19大片段，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat。将重组质粒pUC19-cat和步骤3所得PlacIq-lacI基因分别用限制性内切酶BamH I、Kpn I双酶切后，回收质粒pUC19-cat大片段和PlacIq-lacI基因，将两者连接获得重组质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI（质粒结构如图2所示），此质粒中包含的无痕重组工具基因串cat- PlacIq-lacI的序列如SEQ ID NO. 8所示；
2.6 用上下游引物cat-lacI-talB-F和cat-lacI-talB-R（DNA序列分别如SEQ IDNO. 12和SEQ ID NO. 13所示）从步骤5所得的质粒pUC19-cat-PlacIq-lacI上pcr扩增得到工具基因串cat-PlacIq-lacI，所得基因的两侧序列与talB基因的天然启动子两侧序列同源。将扩增所得基因导入步骤2所得的重组大肠杆菌，同源重组替换该大肠杆菌基因talB的启动子，用氯霉素平板筛选，得到重组菌株BL21（DE3） PtalB:: cat-PlacIq-lacI。
2.7 trc启动子基因片段（DNA序列如SEQ ID NO. 14所示）由公司合成，将其导入步骤6所得的重组菌株BL21（DE3） PtalB:: cat-PlacIq-lacI，同源重组替换菌株基因组上的cat-PlacIq-lacI片段，用卡那霉素平板筛选，得到同源重组成功的阳性重组菌株BL21（DE3） PtalB::Ptrc。替换过程如图4所示。
实施例3 构建由lac操纵序列启动的卡那霉素抗性基因kan操纵子，并同源重组替换大肠杆菌JM109的野生型lacI基因及其启动子，构建包含由四环素抗性基因tet与lacI阻遏物基因反向连接组成的无痕重组工具基因串的重组质粒pUC19-tet-PlacIq-lacI，利用tet-PlacIq-lacI工具基因串，将大肠杆菌JM109中talB基因的天然启动子替换为trc启动子，步骤如下：
3.1.将质粒pKD46电转入大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素平板筛选获得成功导入该质粒的菌株。
3.2. 用上下游引物lacI-Plac-kan-F和lacI-kan-R（DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示）从质粒pKD4上pcr扩增得到Plac-lacO-kan操纵子基因，将其同源重组替换野生型lacI基因及其启动子，用卡那霉素平板筛选获得正确重组的阳性菌株。Plac-lacO-kan操纵子基因结构如图1所示，此操纵子基因包括Lac启动子(Plac)，lacI阻遏物结合位点(lacO)和卡那霉素抗性基因（kan）三个部分，序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.3用上下游引物Bgl II-lacI-F和Kpn I-lacI-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示）从质粒pTrc99a上pcr扩增得到包含lacI结构基因及其突变型启动子的基因片段PlacIq-lacI。
3.4用上下游引物BamH I-tet-F和Hind III-tet-R（DNA序列分别如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示）从质粒pBR322上pcr扩增得到四环素抗性基因片段tet。
3.5将步骤4所得的tet基因和质粒pUC19分别用限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切后，回收tet基因和质粒pUC19大片段，将两者连接获得重组质粒pUC19-tet。将质粒pUC19-tet和步骤3所得PlacIq-lacI基因分别用限制性内切酶BamH I、Kpn I双酶切后，回收质粒pUC19-tet大片段和PlacIq-lacI基因，将两者连接获得重组质粒pUC19-tet-PlacIq-lacI（质粒结构如图3所示），此质粒中包含的无痕重组工具基因串tet- PlacIq-lacI的序列如SEQ ID NO. 11所示；
3.6用上下游引物tet-lacI-talB-F和tet-lacI-talB-R（DNA序列分别如SEQ IDNO. 15和SEQ ID NO. 16所示）从步骤5所得的质粒pUC19-tet-PlacIq-lacI上pcr扩增得到工具基因串tet-PlacIq-lacI，所得基因的两侧序列与talB基因的天然启动子两侧序列同源。将扩增所得基因导入步骤2所得的重组大肠杆菌，同源重组替换该大肠杆菌基因talB的启动子，用四环素平板筛选，得到重组菌株JM109 PtalB:: tet-PlacIq-lacI。
3.7 trc启动子基因片段（DNA序列如SEQ ID NO. 14所示）由公司合成，将其导入步骤6所得的重组菌株JM109 PtalB:: tet-PlacIq-lacI，同源重组替换菌株基因组上的tet-PlacIq-lacI片段，用卡那霉素平板筛选，得到同源重组成功的阳性重组菌株JM109PtalB::Ptrc。替换过程如图5所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种大肠杆菌基因无痕同源重组的方法
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ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg 240
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cgcgaacgcc agcaagacgt agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg 360
cttctcgccg aaacgtttgg tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa 420
gattccgaat accgcaagcg acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc 480
gccgaaaatg acccagagcg ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac 540
agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt 600
gaaggctctc aagggcatcg gtcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca 660
gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga 720
gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 780
gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc 840
gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat 900
ccacaggacg ggtgtggtcg ccatgatcgc gtagtcgata gtggctccaa gtagcgaagc 960
gagcaggact gggcggcggc caaagcggtc ggacagtgct ccgagaacgg gtgcgcatag 1020
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atggacgata tcccgcaaga ggcccggcag taccggcata accaagccta tgcctacagc 1140
atccagggtg acggtgccga ggatgacgat gagcgcattg ttagatttca tacacggtgc 1200
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gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc 1440
tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg 1500
cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct 1560
ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg 1620
tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt 1680
gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca 1740
ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc 1800
tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt 1860
ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc 1920
tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca 1980
gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca 2040
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agtctcgcct ggcgataacc gtcttgtcgg cggttgcgct gacgttgcgt cgtgttacgc 60
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tgatagtatt tctctttaaa cagcttgtta gggggatgta accggtctgc tcactgcccg 60
ctttccagtc 70
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
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<400> 16
tgatagtatt tctctttaaa cagcttgtta gggggatgta accggtctgc tcactgcccg 60
ctttccagtc 70
Claims (2)
1.一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将抗性基因A与lac操纵序列相连，得到操纵子，所述抗性基因A为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；
（2）将操纵子同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子；
（3）用无痕重组工具基因串对步骤2同源重组替换后的大肠杆菌的靶位点序列进行同源替换；所述无痕重组工具基因串由正筛选标记抗性基因B与负筛选标记lacI阻遏物基因反向连接而成，抗性基因B为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；负筛选标记lacI阻遏物基因包含placIq启动子；
（4）利用抗性对步骤3同源替换后的大肠杆菌进行筛选，获得重组成功的重组子；
（5）用目标DNA片段同源替换步骤4所得到的阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，利用抗性对目标DNA片段同源替换后的大肠杆菌进行筛选，得到重组成功的无痕同源重组子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性和抗性均选自抗氨苄青霉素、抗氯霉素、抗卡那霉素、抗四环素，且抗性不同于抗性。
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Non-Patent Citations (4)
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| "大肠杆菌无痕重组的策略与应用";刘陆罡等;《中国生物工程杂志》;20140814;第34卷(第8期);第88-96页 |
| 用red重组系统快速敲除大肠杆菌arol和aroK基因;王莉等;《军事医学科学院院刊》;20070831;第31卷(第4期);摘要 |
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