CN105238816B - 一种表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种表达载体，其含苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus AcMNPV)立即早期1启动子(AcIE1启动子)和同源区域5(homologous region 5)增强子(hr5增强子)及核多角体病病毒(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virus，OpMNPV)立即早期2启动子(Opie2启动子)的昆虫表达载体，含此表达载体的昆虫宿主细胞以及用该表达载体制备重组蛋白的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种表达载体。
背景技术
一些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等，2007；Imasaki等人，2011；Rasmussen等人，2007；White等人，2012)，(Metz和Pijlman，2011；Shrestha等人，2007；Treanor等人，2011；Treanor等人，2011年)。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅目的细胞系。(Berger等人，2004；Jarvis，2009；Kost等人，2005；Summers，2006)。最常用的宿主是来自于Spodoptera frugiperda的Sf21和Sf9以及来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称High Five或Tn-5)。这些细胞能在悬浮培养下生长到很高的细胞密度，并且能够执行翻译后的蛋白质修饰，包括N-和O-端糖基化(Kost等人，2005；贾维斯，2009)。当使用BEVS用于基因递送时，Tn-5细胞是生产分泌蛋白质的优选宿主(Drugmand等人，2012；Granados等人，1994)。
尽管BEVS的运用非常成功，其还是存在几个缺点。杆状病毒载体的生成将可能需要长达3个星期(Jarvis，2014年)。因为病毒引起的细胞裂解，蛋白生产阶段的持续时间被限制在约3-4天以内。分泌蛋白和细胞表面蛋白的通常产量往往小于10μg/mL，而细胞内蛋白质的产量已经有报道达到了100μg/mL(Harrison和Jarvis，2007；Jarvis，2009)。可以通过稳定转染昆虫细胞系来替代使用BEVS瞬时生产蛋白质的方法。但是，这种方法不仅费时，而且蛋白产量通常很低(Harrison和Jarvis，2007；Drugmand等人，2012)。
通常使用BEVS来构建表达载体是将目的基因人工连接于杆状病毒的晚期(late)和/或非常晚期(very late)启动子之后，利用其强力启动子，以期能表达较大量的目标蛋白。但该方法存在非常明显的缺陷，即通常在晚期(late)或非常晚期(very late)启动子开始表达之后，宿主细胞将在两三天内快速死亡，无法达到长期表达的目的。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种能长时间稳定大量表达目的基因的表达载体。
本发明目的之二在于提供含上述表达载体的宿主细胞。
本发明目的之三在于提供一种利用上述载体制备重组蛋白的方法及其获得的蛋白。
发明通过以下技术方案实现：
首先，发明提供了一种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有：
a.hrx增强子或其功能片段或序列变体；
b.AcIEx启动子或其功能片段或序列变体；和
c.Opiex启动子或其功能片段或序列变体。
所述的hrx增强子为AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子,AcMNPV中的hr3增强子；优选地，为AcMNPV的hr5增强子。
所述的AcIEx启动子为AcMNPV中的AcIE1启动子。
所述的Opiex启动子为OpMNPV中的Opie2启动子、Opie1启动子；优选地，为OpMNPV中的Opie2启动子。
优选地所述hrx增强子、AcIEx启动子功能片段和Opiex启动子依次连接。
AcIEx启动子：
优选地，所述AcIEx启动子功能片段为AcIEx启动子序列的01为到352位；优选01为到188位；更优选01为到119位。
在本发明的一个优选的实施方案中，采用了AcIE1启动子。作为可选的方案，可采用如SEQ NO ID.7所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。在本发明的一个优选的实施例中，采用了如SEQ NO ID.7所示序列。
Opiex启动子：
可选地，所述Opiex启动子可采用如SEQ NO ID.6第614-1161所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。在本发明的一个优选的实施例中，采用了如SEQ NO ID.6第614-1161所示序列。
hrx增强子：
作为可选的方案，可采用如SEQ NO ID.6第1-482所示序列或与其具有70％以上同源，优选80％以上同源，更优选90％以上同源，更优选95％以上同源，最优选98％以上同源的序列。
在本发明的一个优选的实施例中，采用了如SEQ NO ID.6第1-482所示序列。
含优选的调控单元的载体示例：
作为一种优选的方案，本发明通过提供一种操作性连接于编码所需重组蛋白的异源基因序列的含有AcMNPV中的AcIE1启动子片段和hr5增强子，以及OpMNPV的Opie2启动子的昆虫细胞表达载体而得到解决。所述hr5增强子加位于hr5增强子下游的AcIE1启动子片段和Opie2启动子构成了驱动下游编码序列表达的调控单元。本发明的昆虫细胞表达载体是由AcMNPV的立即早期启动子AcIE1启动子片段和OpMNPV的立即早期启动子Opie2启动子控制，从而能在宿主细胞中保持长期的表达，而不会造成宿主细胞的死亡。令人惊喜的是，本发明载体的表达盒中包含的与AcIE1启动子片段和hr5增强子组合的Opie2启动子驱动的异源蛋白产物表达水平高于只含有AcIE1启动子和hr5增强子的载体所见水平。发明人认为Opie2启动子的存在明显促进了从相应的mRNA有效合成蛋白。
在本发明的一个特别优选的实施例中，本发明载体的序列如SEQ NO ID.6所示。
除了编码重组或异源基因产物的DNA序列外，该表达载体还包含在宿主细胞中能有效转录编码序列的mRNA和有效翻译所述mRNA所必需的调控DNA序列。具体说，本发明的表达载体包含至少一个调控单元，其包含操作性连接于重组蛋白编码序列的与AcIE1启动子片段和hr5增强子联合的至少一个Opie2启动子序列，并驱动编码蛋白的表达。包含AcIE1启动子片段和hr5增强子及Opie2启动子的所述调控单元与异源基因的编码序列直连，或通过间插的DNA(例如：通过异源基因的5’非翻译区或其一部分)而与异源基因的编码序列分隔。
“启动子”定义为一种通过引导RNA聚合酶连接到DNA并启动RNA合成来介导转录起始的DNA序列。
本发明优选采用的AcIE1启动子也可以是AcIE1启动子的功能性片段或其功能性序列变体。因此，具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动重组或异源产物基因表达的AcIE1启动子的任何序列变体或片段均可用作AcIE1启动子。AcIE1启动子的“功能性变体”包括含有碱基插入、删除或点突变的天然AcIE1序列，可用本领域熟知方法产生，如引物-定向PCR、‘易错PCR’、重叠DNA片段的被称为‘基因重组’的PCR-重装，或先在体内随机诱变细胞克隆，再经文库转染和在Tn-5细胞中进行功能性选择来产生。例如，随机诱变或通过烷化化学试剂或UV辐射来实现。任选地，可以采用宿主菌的天然突变菌株。优选地，此类变体序列的DNA与天然AcIE1启动子对应部分至少65％同源、更优选地，75％同源、最优选地90％同源。IE1启动子功能性序列变体的例子是含有转录起始位点的经基因工程改造而设置了合适的限制性位点用于插入重组产物基因的启动子序列。
本发明所用的Opie2启动子也可以是Opie2启动子的功能性片段或其功能性序列变体。因此，具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动重组或异源产物基因表达的Opie2启动子的任何序列变体或片段均可用作Opie2启动子。Opie2启动子的“功能性变体”包括含有碱基插入、删除或点突变的天然Opie2序列，可用本领域熟知方法产生，如引物-定向PCR、‘易错PCR’、重叠DNA片段的被称为‘基因重组’的PCR-重装，或先在体内随机诱变细胞克隆，再经文库转染和在Tn-5细胞中进行功能性选择来产生。例如，随机诱变或通过烷化化学试剂或UV辐射来实现。任选地，可以采用宿主菌的天然突变菌株。优选地，此类变体序列的DNA与天然Opie2启动子对应部分至少65％同源、更优选地，75％同源、最优选地90％同源。Opie2启动子功能性序列变体的例子是含有转录起始位点的经基因工程改造而设置了合适的限制性位点用于插入重组产物基因的启动子序列。
本发明优选采用的hr5增强子也可以是其功能性片段或功能性序列变体。因此，具有AcIE1启动子和Opie2启动子转录活性功能或能增强AcIE1启动子和Opie2启动子转录活性的hr5增强子的任何序列变体或片段均可用作hr5增强子。Hr5增强子的“功能性变体”包括含有碱基插入、删除或点突变的天然hr5序列。
本发明内容中，术语“异源编码序列”、“异源基因序列”、“异源基因”、“重组基因”、“感兴趣的基因”和“转基因”可互换使用。这些术语用于DNA序列时指编码重组或异源基因产物的DNA序列。所述异源基因序列在宿主细胞中天然不存在而且来自不同种的生物。可使本发明的重组或异源基因产物在昆虫细胞中表达和大量收集。所述基因产物也可以是肽或多肽，可以是任何感兴趣的蛋白质，如治疗蛋白质(如白介素)或酶或多聚蛋白质的亚单元(如抗体或其片段)。所述重组产物的基因可包含信号序列，其编码的信号肽可使宿主生产细胞表达的多肽分泌出来。因此，在本发明的进一步优选实施方式中，产物蛋白是为分泌蛋白质。更优选地，所述产物蛋白是抗体或工程改造的抗体或其片段，最优选是人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)或免疫球蛋白G(IgG)。
优选地，本发明的表达载体的启动子是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus AcMNPV)立即早期1启动子(AcIE1启动子)片段和核多角体病病毒(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosisvirus，OpMNPV)立即早期2启动子(Opie2启动子)。
发明提供了包含苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)立即早期1启动子(AcIE1启动子)片段，核多角体病病毒(Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhedrosis virus，OpMNPV)立即早期2启动子(Opie2启动子)和苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus AcMNPV)同源区域5(homologousregion 5)增强子(hr5增强子)的昆虫细胞表达载体。
优选本发明的表达载体还含有有限数目的有用的限制性位点，用于插入含有在AcIE1启动子加hr5增强子和Opie2启动子序列控制下的重组基因的表达盒。这些限制性位点优选为NotI和BamHI位点。本发明的表达载体可以是，例如但不限于：线性DNA片段、含核靶向序列的DNA片段，或可经特异性优化而能与转染试剂反应的载体、动物病毒或能向细胞中穿梭和产生的合适的质粒。
优选本发明的表达载体还包含至少一种在动物细胞中可选择的可表达标记。可采用任何常用的选择标记，如胸苷激酶(tK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。在一优选的实施方式中，采用可表达GS的选择标记。GS系统是制备治疗性蛋白质特别重要的唯一的两种系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比，由于常可从原始转染子创建高产细胞系而无需在高浓度选择试剂存在下进行多轮选择即可实现基因扩增，因此所述GS系统开发过程中有巨大的时间优势。不用说与表达标记基因的第二转录单元相同，产物基因和标记基因的表达单元均可通过采用本领域常规采用的内部核糖体进入位点，而使用单顺反子表达盒。
更进一步地，所述的表达载体为昆虫细胞表达载体。本发明内容中“昆虫细胞表达载体”优选是为分离和纯化的DNA分子，将其转染入适当的昆虫宿主细胞中可提供该宿主细胞高水平表达重组基因产物。优选地，所述昆虫细胞为鳞翅目细胞。
尤其适合地，本发明所提供的表达载体所适用的宿主细胞是来自Trichoplusiani的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称High Five或Tn-5)，或来自于Spodoptera frugiperda的Sf21、Sf9细胞。在特别优选的实施方式中所述昆虫宿主细胞是Tn-5细胞(也指其细胞系)。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含AcIE1启动子片段，Opie2启动子和hr5增强子的表达载体，优选地，所述细胞为鳞翅目细胞；更优选地，所述细胞是来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞，或来自于Spodoptera frugiperda的Sf21,Sf9细胞。
在本发明的另一优选实施方式中，昆虫细胞表达载体包含至少一个产物基因的转录单元，在宿主细胞中表达产生该产物蛋白质，此转录单元受本发明调控单元(即AcIE1启动子片段和hr5增强子加Opie2启动子)的控制，并且还包含含有标记基因，优选谷氨酰胺合成酶(GS)标记基因的第二转录单元。所述产物基因或感兴趣的基因(GOI)可以是例如免疫球蛋白编码序列。谷氨酰胺合成酶标记基因是任何具有酶活性的GS编码序列，可以是天然基因序列或其变体。这里应用的上述“功能性变体”具有上述定义，同样包括优选范围的序列同源性。此类表达载体在Tn-5细胞中的转染效率比含有在AcIE1启动子和hr5增强子控制下感兴趣的基因的转录单元的表达载体高得多。
本发明的另一方面涉及一种包含AcIE1启动子和OpIE2启动子加位于两者之间的hr5增强子的调控单元。当本发明的调控单元操作性连接于某基因序列时，在昆虫细胞环境中，它可介导此基因序列转录的起始和稳定RNA转录物并促进相应的mRNA有效合成蛋白质。优选本发明的调控单元侧接一个或多个合适的限制位点而能将该调控单元插入载体和异源基因产物编码序列的上游和/或使它能从载体中释放。本发明的一优选实施方式中，所述调控单元下游侧接了一个NotI限制位点和一个BamHI限制位点。因此，本发明的调控单元可用于构建表达载体，具体是昆虫表达载体。
本发明另一方面还涉及一种包含本发明调控单元和转录单元，即编码重组或异源蛋白产物的DNA序列的表达盒。所述调控单元位于所述转录单元的上游并与其操作性相连。本发明的调控单元可直接与转录单元(即异源基因的编码序列)相连或被间插的DNA如异源基因的5’非翻译区所隔开。优选该表达盒侧接于一个或多个合适的限制位点使得能将该表达盒插入载体中和/或从载体中切除。因此，本发明的表达盒可用于构建表达载体，具体是昆虫细胞表达载体。
为了将表达载体诱导入本发明的昆虫宿主细胞中，如果对给定的宿主细胞类型合适，可采用任何转染技术，例如本领域熟知的技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAS-葡萄糖转染、脂转染、应该注意，可用本发明载体转染的昆虫宿主细胞应是可瞬时或稳定转染的细胞系。因此，本发明的昆虫表达载体可维持于游离体形式或可稳定地整合进昆虫宿主细胞的染色体组中。
瞬时转染的特征是对含有选择标记的载体不施加任何选择压力。来源于瞬时转染的细胞群或一批细胞包括插入了外来DNA并表达的细胞和没有插入外来DNA的细胞的混合细胞群。在转染后通常持续20-50小时的瞬时表达实验中，转染的载体维持为游离型元件尚未整合入染色体中，即转染的DNA，经常没有整合入宿主细胞染色体中。宿主细胞倾向于丢失转染的DNA。培养瞬时转染细胞群时细胞群中的转染细胞过度生长。因此在紧接转染后的时间内表达最强而随时间推移减弱。优选理解本发明的瞬时转染子是能在转染后在没有选择压力的细胞培养中维持表达120个小时的细胞。
在本发明一优选实施方式中，用本发明的昆虫细胞表达载体稳定转染昆虫宿主细胞，如Tn-5宿主细胞。稳定转染指新引入的外来DNA(例如载体DNA)，通常通过随机非同源重组而掺入染色体DNA中。可通过选择扩增载体序列已整合入宿主细胞DNA中的细胞系来提高载体DNA的拷贝数目和伴随的基因产物数量。因此，这种稳定整合有可能在接触基因扩增进一步选择压力时在昆虫细胞中加倍产生微小染色体。而且，就载体序列而言，稳定转染会导致丢失与重组基因产物表达不直接相关的载体序列部分，如，细胞拷贝数目控制区在染色体整合时可产生过剩。因此，转染宿主细胞染色体中已整合了至少一部分或不同部分的表达载体。同样，此种转染宿主细胞的定义包括用至少在体内能产生与本发明昆虫细胞表达载体所必需元件同等功能的两个或多个DNA片段(称为AcIE1启动子片段和hr5增强子及Opie2启动子调控下的异源基因产物)转染的Tn-5细胞。
本发明还涉及一种制备重组蛋白的方法，以及其所获得的蛋白。所述方法包括以下步骤：
S1.用如权利要求1-7任一所述的表达载体转染昆虫宿主细胞；
S2.在合适条件下培养所述宿主细胞以使细胞使细胞生长和/或增殖并表达/产生该重组蛋白；和
S3.收获产生的重组蛋白。
用载体转染昆虫宿主细胞或昆虫宿主细胞系的方法是本领域熟知的。在本发明的方法中，可采用适合于给定类型宿主细胞的任何转染技术，例如本领域熟知的技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂转染。本发明的宿主细胞可用此表达载体稳定或瞬时转染。
术语“宿主细胞”或“宿主细胞系”指能够培养生长并表达所需蛋白质重组产物的任何细胞，具体指昆虫细胞。本发明方法中所采用昆虫宿主细胞可以是Tn-5细胞或其它昆虫细胞。在一优选实施方式中，用于转染的昆虫宿主细胞系可以是Tn-5细胞系。合适的细胞系包括如来自于Spodoptera frugiperda的Sf21和Sf9，以及来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称High Five或Tn-5)。
昆虫细胞系的合适培养液和培养方法是本领域熟知的。可采用实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需要的标准细胞培养液。
在本发明一优选实施方式中，所采用的细胞培养液不含胎小牛血清(FCS或FBS)，因此称为“无血清”。
在涉及表达和收集重组产物蛋白质的方法中，可采用常规的方法例如在工业化反应器中培养昆虫宿主细胞。然后进行常规的下游加工。
收集方法，即从细胞、细胞培养物或细胞培养液中分离和/或纯化给定蛋白质的方法是为本领域熟知的。例如，可通过用盐或有机溶剂进行分级沉淀、离子交换层析、凝胶层析、HPLC、亲合层析等，分离和/或纯化生物材料中的蛋白质。
本发明另一个方面涉及利用Opie2启动子来提高昆虫宿主细胞表达重组或异源基因产物的AcIE1启动子片段和hr5增强子活性的方法。本发明的此方法是，用分子克隆方法将Opie2启动子插入现有载体分子中AcIE1启动子片段和hr5增强子序列与编码所需蛋白的基因序列之间，使AcIE1启动子片段和hr5增强子及Opie2启动子操作性连接于异源基因序列而显著增强AcIE1启动子片段和hr5增强子驱动所需异源基因产物的表达。分子克隆方法是本领域熟知的。然后，用如此构建的在AcIE1启动子片段和hr5增强子与位于下游编码所需蛋白质的异源DNA序列之间含有Opie2启动子的载体转染昆虫宿主细胞如Tn-5细胞。然后，在适当条件下培养转染子使细胞生长和/或增殖并表达/产生重组蛋白。最后，收集即分离和纯化产生的重组蛋白。通过在本发明的方法中利用所述Opie2启动子，可以显著增强AcIE1启动子片段和hr5增强子驱动重组蛋白的表达效率而获得高水平表达的重组蛋白。因此，本发明可能改进现有的重组基因表达的表达载体的表达效率。
因此，本发明还涉及利用Opie2启动子来改进AcIE1启动子片段和hr5增强子的活性。
附图说明
图1市售商用pIEx-10质粒(SEQ ID No.1)载体结构图，其含有hr5增强子，AcIE1启动子(简称IE1)和相应的限制性位点。
图2从图1的载体优化而来的用于构建图4和图6的载体pIEx-X质粒(SEQ ID No.2)结构图，其留有hr5增强子，IE1启动子和所需的NotI和BamHI限制性位点。
图3含有Opie1启动子和NotI、BamHI限制性位点的载体pOPIE1质粒(SEQ ID No.3)结构图。
图4由图2和图3构建而成的含hr5增强子，Opie1启动子的载体phrOPIE1质粒(SEQID No.4)结构图。标明了相关的限制性位点NotI和BamHI。
图5用于构建图6的含有Opie2启动子和相关的限制性位点NotI、BamHI的载体pOPIE2(SEQ ID No.5)质粒结构图。
图6由图2和图5构建而来的含有hr5增强子，IE1启动子片段和Opie2启动子的载体phrOPIE2(SEQ ID No.6)质粒结构图，标明了相关的NotI和BamHI限制性位点。
图7显示了转染不同质粒后EGFP阳性细胞比率。
图8显示了转染不同质粒后EGFP表达量。
图9显示了转染不同质粒后TNFR-Fc表达量。
图10显示了转染并持续不同时间后的TNFR-Fc表达量。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
关于简称的解释：
以下AcMNPV ie1也即本发明所述AcIE1，为了便于表示在图中以ie1表示；
OpMNPV ie1也即Opie1，为了便于表示在图中以op1表示；
OpMNPV ie2也即Opie2，为了便于表示在图中以op2表示；
hr5在图中以hr简便表示。
实施例1.宿主细胞
Tn-5细胞系：来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞系(又称High Five或Tn-5)，已适应悬浮培养和无蛋白质培养液。
Tn-5细胞的增殖：
Tn-5细胞通过商业渠道(Life Technologies公司，巴塞尔，瑞士)获得，并在SF900II SFM培养基中(Life Technologies公司)进行悬浮培养。细胞在TubeSpin生物反应器50(TS50)或在TubeSpin生物反应器600(TS600)(TPP，Trasadingen，瑞士)中培养，其各自培养基的量分别为10mL或300mL。细胞每周传代3次，传代细胞密度为1-5x 105细胞/mL。所有培养物在ISF1-X振荡培养器(KühnerAG，Birsfelden的，瑞士)中保持在28℃温度下，摇晃速度为180rpm，摇动直径5厘米。细胞密度和活性通过台盼蓝排除法使用Neubauer血细胞计数器测定。
实施例2.质粒准备
PIEx-XEGFP和PIEx-TNFR-Fc(表1)分别携带绿色荧光蛋白和人TNFR-Fc的基因，并且受Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)同源区5(hr5)增强子以及立早1(ie1)启动子的控制，这些已经在之前的文章中描述过(Shen等人，2014年)。使用PIB/V5-His(Life Technologies公司)为模板，Orgyia pseudotsugatamulticapsid nuclear polyhedrosis virus(OpMNPV)立早1(Opie1)和2(Opie2)的启动子通过使用特异性寡核苷酸引物(表2)的PCR进行放大。单独的聚合酶链反应产物可被XmaⅠ和NotⅠ消化，并且被亚克隆至被同样两种限制性内切酶消化后的PIEx–XEGFP，，分别产生pOPIE1-EGFP和pOPIE2-EGFP(表2)。对于这两个质粒，AcMNPV hr5增强子以及PIEx-XEGFP的iel启动子可分别由Opie1或Opie2启动子取代。金属硫蛋白(MT)启动子可被添加到培养物中的铜(II)诱导，此启动子在使用了特异性寡核苷酸引物(表1)的聚合酶链反应中从pMT/V5-His(Life Technologies公司)中得到放大。聚合酶链反应产物分别被SAPI和NotI消化，并被亚克隆进被同样两种限制性内切酶消化后的PIEx-XEGFP用以产生pMT-EGFP，因此AcMNPV hr5增强子和PIEx-XEGFP的ie1启动子被MT启动子替代(表1)。特异性寡核苷酸引物(表1)被用来放大来自pIB/V5-His的Opie1和Opie2，并且在用NheI和NotI来进行限制性酶切以后，聚合酶链反应产物被亚克隆进PIEx–XEGFP用以分别构造phrOPIE1-EGFP和phrOPIE2-EGFP。对于这两个载体来说，AcMNPV hr5增强子被保留，而AcMNPV ie1启动子被Opie1或是Opie2的任意一个替换。TNFR-Fc基因通过NotI和BamHI对PIEx-XTNFR-Fc进行限制性酶切获得，并且TNFR-Fc基因用于取代经过NotI和BamHI消化的上述两个质粒中的EGFP基因。其所得的质粒分别命名为pOPIE1-TNFR-Fc，pOPIE2-TNFR-Fc，pMT-TNFR-Fc，phrOPIE1-TNFR-Fc和phrOPIE2-TNFR-Fc(表1)。先前已经发表过的pMYKEF1-EGFP-puro(表1)含有EGFP基因，此基因受人巨细胞病毒(HCMV)立早启动子控制(Derouazi等人，2006)。带有EGFP基因的pUC-actEGFP(表1)受果蝇肌动蛋白5C启动子控制，这由Bruno Lemaitre博士提供(EPFL，洛桑，瑞士)提供。A S.frugiperda密码子优化的TNFR-Fc的基因(TNFR-Fcin)被合成((Eurofins MWG Operon，Ebersberg，德国)并且被亚克隆到经NotI和BamHI酶切后的PIEx-TNFR-Fc用以生成PIEx-TNFR-Fcin(表1)。利用市售试剂盒(Qiagen GmbH，希尔登，德国)并按厂家使用说明进行质粒提纯。
实施例3.载体构建
在Tn-5细胞的初始转染中，我们使用携带AcMNPV ie1启动子和hr5增强子的表达载体。为了研究其他启动子，我们分别构建了带有Opie1，Opie2，和MT启动子的表达载体。此外，携带Opie1启动子与AcMNPV hr5增强子的载体，以及携带Opie2启动子与AcMNPV hr5增强子的载体也被构建。载体携带EGFP基因或TNFR-Fc的基因的任何一个基因，并由相同的起始载体PIEx-X(Shen等人，2014)构建。我们也测试了其他两个载体：pUC-actEGFP，其中的EGFP基因受果蝇肌动蛋白5C启动子控制，以及pMYKEF1-EGFP-puro，它是一个携带EGFP基因(受hCMV立早期表达载体启动子/增强子控制)的哺乳动物表达载体。据报道，pMYKEF1-EGFP-puro载体在果蝇细胞中能有效表达(Qin等，2010)。
开始时，细胞在5×105细胞/mL的密度下转染各种EGFP表达载体。每一个转染通过加入预先形成的PEI和DNA多聚物进行。观察到的最高转染效率为含有AcMNPV HR5增强子的质粒(PIEx-XEGFP，phrOPIE1-EGFP，以及phrOPIE2-EGFP)进行的转染(图7)。同样地，在通过这三个质粒的转染以后，EGFP特异性荧光也达到最高水平(图8)。在第二个实验中，细胞被生产TNFR-Fc的各种载体转染。在使用PIEx-XTNFR-Fc(即图中的“hr+ie1”，表示现有技术中含有hr5、AcIE1的载体)和pOPIE2-TNFR-Fc(即图中的“hr+ie1+op2”，表示含有hr5、AcIE1+Opie2的载体)的转染后TNFR-Fc达到最高产量(图9)。因此，进一步的优化实验采用含有AcMNPV hr5增强子和ie1启动子的质粒来执行。
表1.载体构建步骤所用的质粒列表
表2.载体构建步骤所用的引物序列列表
载体pIEx-XEGFP和PIEx-XTNFR-Fc的产生
PIEx-XEGFP和PIEx-XTNFR-Fc(表1)分别携带绿色荧光蛋白和人TNFR-Fc的基因，并且受Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)同源区5(hr5)增强子以及立早1(ie1)启动子的控制。
该两个质粒分别为在SEQ ID NO.2的NotI和BamHI限制位点之间插入EGFP基因和TNFR-Fc基因。
载体pOPIE1-EGFP和pOPIE2-EGFP的产生
使用PIB/V5-His(Life Technologies公司)为模板，Orgyia pseudotsugatamulticapsid nuclear polyhedrosis virus(OpMNPV)立早1(Opie1)和2(Opie2)的启动子通过使用特异性寡核苷酸引物(表2)的PCR进行放大。单独的聚合酶链反应产物可被XmaⅠ和NotⅠ消化，并且被亚克隆至被同样两种限制性内切酶消化后的PIEx–XEGFP，，分别产生pOPIE1-EGFP和pOPIE2-EGFP(表2)。
该两个质粒分别为在SEQ ID NO.3的NotI和BamHI限制位点之间插入EGFP基因和TNFR-Fc基因。
载体phrOPIE1-EGFP和phrOPIE2-EGFP的产生
特异性寡核苷酸引物(表1)被用来放大来自pIB/V5-His的Opie1和Opie2，并且在用NheI和NotI来进行限制性酶切以后，聚合酶链反应产物被亚克隆进PIEx–XEGFP用以分别构造phrOPIE1-EGFP和phrOPIE2-EGFP。对于这两个载体来说，AcMNPV hr5增强子被保留，而AcMNPV ie1启动子被Opie1或是Opie2的任意一个替换。
该两个质粒分别为在SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的NotI和BamHI限制位点之间插入EGFP基因。
载体pOPIE1-TNFR-Fc，pOPIE2-TNFR-Fc，phrOPIE1-TNFR-Fc和phrOPIE2-TNFR-Fc的产生：
TNFR-Fc基因通过NotI和BamHI对PIEx-XTNFR-Fc进行限制性酶切获得，并且TNFR-Fc基因用于取代经过NotI和BamHI消化的上述两个质粒中的EGFP基因。其所得的质粒分别命名为pOPIE1-TNFR-Fc，pOPIE2-TNFR-Fc，phrOPIE1-TNFR-Fc和phrOPIE2-TNFR-Fc(表1)。
这四个质粒SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的NotI和BamHI限制位点之间插入TNFR-Fc基因。
实施例4.转染
在转染前一天，用新鲜SF900II SFM培养基将指数生长期的细胞稀释至5×105cells/mL。转染当天将细胞离心，并按各种不同的细胞密度将其重悬浮在预热好的SF900II SFM中。对于在TS50s中的小规模转染，不同量的PEI和质粒DNA被直接添加到培养物中。另外，细胞也由预混合的PEI和质粒DNA(在水中进行10分钟以内的混合)转染。对于300mL规模的转染，细胞被离心，并且在预热好的培养基中重悬浮成2×106个细胞/mL的密度。DNA(2μg/mL)和PEI(8μg/mL)被依次直接加入到培养物中。所有转染的培养物在28℃以及180rpm的转速条件下进行培养。
实施例5.蛋白质定量：
EGFP阳性细胞的百分比由Guava easyCyte流式细胞仪(Merck-Millipore，Damstadt，德国)检测，其激发和发射波长分别为488和532nm。分析前，将细胞在PBS中稀释至2-5×105细胞/mL。对于EGFP特异性荧光的测定，在PBS中加入1体积的1％Trition X-100，对100μL转染的培养物进行细胞裂解。在37℃环境下搅拌培养1小时后，通过TECANSaphire II读板荧光计(TECAN，Maennedorf，瑞士)对荧光进行测量，其激发和发射波长分别为485和515nm。培养基中的TNFR-Fc浓度通过所述的夹心酶联免疫分析(sandwichELISA)测定(Matasci等2011)。
实施例6.蛋白质表达研究
在Tn-5细胞的初始转染中，我们使用携带AcMNPV ie1启动子和hr5增强子的表达载体。为了研究其他启动子，我们分别构建了带有Opie1，Opie2，和MT启动子的表达载体。此外，携带Opie1启动子与AcMNPV hr5增强子的载体，以及携带Opie2启动子与AcMNPV hr5增强子的载体也被构建。载体携带EGFP基因或TNFR-Fc的基因的任何一个基因，并由相同的起始载体PIEx-X(Shen等人，2014)构建。我们也测试了其他两个载体：pUC-actEGFP，其中的EGFP基因受果蝇肌动蛋白5C启动子控制，以及pMYKEF1-EGFP-puro，它是一个携带EGFP基因(受hCMV立早期表达载体启动子/增强子控制)的哺乳动物表达载体。据报道，pMYKEF1-EGFP-puro载体在果蝇细胞中能有效表达(Qin等，2010)。
EGFP阳性细胞的百分比由Guava easyCyte流式细胞仪(Merck-Millipore，Damstadt，德国)检测，其激发和发射波长分别为488和532nm。分析前，将细胞在PBS中稀释至2-5×105细胞/mL。对于EGFP特异性荧光的测定，在PBS中加入1体积的1％Trition X-100，对100μL转染的培养物进行细胞裂解。在37℃环境下搅拌培养1小时后，通过TECANSaphire II读板荧光计(TECAN，Maennedorf，瑞士)对荧光进行测量，其激发和发射波长分别为485和515nm。培养基中的TNFR-Fc浓度通过所述的夹心酶联免疫分析(sandwichELISA)测定(Matasci等2011)。
开始时，细胞在5×105细胞/mL的密度下转染各种EGFP表达载体。每一个转染如前所述，通过加入预先形成的多聚物进行。观察到的最高转染效率为含有AcMNPV HR5增强子的质粒(PIEx-XEGFP，phrOPIE1-EGFP，以及phrOPIE2-EGFP)进行的转染(图7)。同样地，在通过这三个质粒的转染以后，EGFP特异性荧光也达到最高水平(图8)。在第二个实验中，细胞被生产TNFR-Fc的各种载体转染。在使用PIEx-XTNFR-Fc(即图中的“hr+ie1”，表示现有技术中含有hr5、AcIE1的载体)和phrOPIE2-TNFR-Fc(即图中的“hr+ie1+op2”，表示含有hr5、AcIE1+Opie2的载体，序列如SEQ NO ID.6所示)的转染后TNFR-Fc达到较高产量，尤其是phrOPIE2-TNFR-Fc(hr+ie1+op2)转染后TNFR-Fc产量最高，超过200mg/L(图9)。可见，在含有hr5增强子和AcIE1启动子的基础上，进一步导入Opie2启动子，可以大大增强载体表达目的蛋白的效能。相较之下，用Opie1来取代Opie2(hr+ie1+op1)，则无法获得同样的增强作用，相反，其目的蛋白表达效能反而低于现有技术含hr5增强子和AcIE1启动子的载体(hr+ie1)。
在转染质粒后，持续表达目的蛋白5天以上，并间隔一天检测目的蛋白表达量，结果如图10所示。phrOPIE2-TNFR-Fc(hr+ie1+op2)转染后的TNFR-Fc产量及时间相比PIEx-XTNFR-Fc(hr+ie1)转染后的细胞都有明显的提升(图10)。“hr+ie1+op2”对比“hr+ie1”更能长期稳定地大量表达目的蛋白。
Claims (12)
1.一种表达载体，其特征在于包含至少一个调控单元，所述调控单元含有：
a.Hr5增强子或其功能片段；
b.AcIE1启动子或其功能片段；和
c.Opie2启动子或其功能片段；
其中，Hr5增强子为AcMNPV中的同源区域5增强子，Hr5增强子功能性片段为SEQ NOID.6第1-482所示序列；
AcIE1启动子为AcMNPV中的立即早期1启动子，AcIE1功能片段为SEQ NO ID.7所示序列；
Opie2启动子OpMNPV中的立即早期2启动子，Opie2启动子功能片段为SEQ NO ID.6第614-1161所示序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述hr5增强子、AcIE1启动子功能片段和Opie2启动子依次连接。
3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于还含有异源编码序列，所述调控单元与异源编码序列直接连接，或者通过间插的DNA与异源编码序列分隔连接。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述载体还含有编码可选择标记的第二转录单元。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述可选择标记为谷氨酰胺合成酶标记。
6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为昆虫细胞表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述昆虫细胞为鳞翅目细胞。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述细胞是来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞，或来自于Spodoptera frugiperda的Sf21或Sf9细胞。
9.一种宿主细胞，含有如权利要求1-8任一所述的表达载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于所述细胞为鳞翅目细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于所述细胞是来自Trichoplusia ni的BTI-TN-5B1-4细胞，或来自于Spodoptera frugiperda的Sf21或Sf9细胞。
12.一种制备重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
S1.用如权利要求1-8任一所述的表达载体转染昆虫宿主细胞；
S2.在合适条件下培养所述宿主细胞以使细胞生长和/或增殖并表达/产生该重组蛋白；和
S3.收获产生的重组蛋白。
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