CN104178514B - 一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒为载体，构建了表达E25融合绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒。利用草地贪夜蛾细胞(Sf‑9细胞)作为重组杆状病毒的宿主，将表达重组蛋白的病毒感染Sf‑9细胞。重组病毒感染细胞96小时后收集多角体，荧光显微镜检测表明产生的多角体晶体能将重组蛋白包埋其中，随后Western blot检测表明多角体内部重组蛋白的包埋水平远高于对照。该技术有利于提高外源蛋白包埋入多角体内部的水平，为深度开发利用杆状病毒‑昆虫表达系统提供了条件。
Description
技术领域
本发明涉及PCR、基因重组及蛋白质分析领域，特别涉及一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。
背景技术
杆状病毒多角体基因和p10基因是杆状病毒在感染宿主后的晚期产生的高水平表达蛋白。p10和多角体基因都是杆状病毒复制过程中的非必须基因，缺失这两个基因后病毒粒子仍可以完成复制和组织侵染。多角体启动子是杆状病毒极晚期超强表达启动子，现已成功应用于杆状病毒表达系统，用于外源基因的高水平表达。多角体蛋白聚合后可形成超大分子蛋白质结晶多角体。目前的研究表明多角体可保护包埋在多角体内部的病毒粒子和蛋白，使之长时间保存活性。
E25蛋白是杆状病毒的一种囊膜蛋白，其位于杆状病毒病毒粒子的囊膜。E25蛋白存在核定位信号，融合外源蛋白后可以将外源蛋白引导入细胞核并固定入病毒粒子囊膜。过量表达E25后，可提高多角体中E25的蛋白水平。
本发明利用杆状病毒这些特性，构建在多角体启动子下表达外源蛋白的重组病毒。为了不影响多角体基因的表达，通过同源重组方法将体外构建的多角体启动子外源蛋白基因替代杆状病毒自身p10基因。为了提高多角体的内部外源蛋白含量，将E25和外源蛋白融合表达。这样提高外源蛋白在多角体中的含量，为进一步开发利用杆状病毒表达创造了条件。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。利用基因重组技术，构建在多角体启动子下E25与EGFP融合表达的重组病毒。重组病毒感染草地贪夜蛾培养细胞，使融合蛋白固定于多角体内部，并且使固定于多角体内部重组蛋白的含量上升。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
(1)按以下方法克隆e25基因：
以AcMNPV基因组为模板，利用PCR技术得到e25基因，e25基因的序列见以下网址
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/510708？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝2&RID＝Z40W2AX3013)；PCR所用的引物分别为e25-F(5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTACT-3’，下划线为BamHI酶切位点)和e25-R(5’-GCTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTG-3’，下划线为XbaI酶切位点)；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
(2)按以下方法克隆egfp基因：
以egfp基因为模板，egfp基因序列见以下网址
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/595644660？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝5&RID＝Z40WRB21016)
利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F(5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，)；所述PCR扩增反应同e25基因扩增反应方法一致。
(3)构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp：
通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化，随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp，随后e25基因经BamHI和XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp，获得pFastBacI-e25-egfp；利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确性进行验证；
(4)构建重组病毒
以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板，利用引物P10-F(5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCGTTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和P10-R(5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸1.5分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
以pFastBacI-e25-egfp为模板，利用引物P10-F(5’-CAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTTACAATCTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和P10-R(5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-e25-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳对pPH-egfp和pPH-e25-egfpPCR产物进行分析和纯化。随后在聚苯乙烯锥形管中以加入野生型AcMNPV基因组DNA、脂质体和PCR产物(pPH-egfp或pPH-e25-egfp)各10μg，加入270μL无血清TC-100培养并混匀；将所述混合物在27℃孵育30分钟后共转染Sf-9培养细胞；转染后的培养细胞加入无血清TC-100培养基培养12小时；随后，吸出培养基后在细胞上覆盖低熔点琼脂糖，并在其实添加含有10％胎牛血清的TC-100培养基；在27℃条件下培养5天，通过荧光显微镜标记进行空斑筛选重组病毒，；重组病毒通过五轮筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液，病毒分别命名为vAc-egfp和vAc-e25-egfp。
(5)使用Sf-9培养细胞，接种vAc-egfp和vAc-e25-egfp，27℃感染5天，后通过离心收集培养细胞。
(6)收集多角体及重组蛋白鉴定分析：将所收集的细胞样品进行超声波破碎，使用蔗糖密度梯度离心纯化多角体，随后将多角体裂解，利用Western blot技术，对多角体内的重组蛋白进行鉴定。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过外源蛋白与E25蛋白融合表达的方法，提高固定入多角体内部外源蛋白的含量。为实现重组蛋白的高水平表达，在杆状病毒高效强力启动子—多角体启动子下表达该重组基因。由于杆状病毒P10蛋白为杆状病毒复制过程中的非必须基因，通过同源重组的方法将融合基因连同多角体启动子替换p10基因，实现不影响多角体的形成和融合蛋白高水平表达的目的。通过对多角体内部融合蛋白含量分析表明，融合E25蛋白后，外源蛋白固定入多角体内部的含量提高25％，明显提高了外源蛋白的固定水平。该技术为进一步开发利用杆状病毒-昆虫表达系统，提高其表达利用效率创造了条件。
附图说明
图1.杆状病毒转移载体pFastBacI的图谱；
图2.2a重组病毒感染培养细胞，图2b分离纯化多角体荧光显微镜照片；
图3.3aWestern blot检测重组蛋白，3b为分析多角体内重组蛋白含量。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述，
以下实施例涉及的相关材料及其来源如下：
(1)苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV和egfp基因：由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供。
(2)DNA处理和PCR扩增试剂盒：购于日本Takara。
(3)杆状病毒转移载体pFastBacI和lipofectin：购自美国Invitrogen。
(4)DNA测序试剂盒：购于PEAppliedBiosystems。
(5)EGFP抗体、胎牛血清FCS和昆虫细胞培养基TC-100：购于美国Gibco。
以下以具体实施例详细说明本发明一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法，它包括如下部分：
(1)按以下方法克隆e25基因：
以AcMNPV基因组为模板，利用PCR技术得到e25基因；PCR所用的引物分别为e25-F(5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTACT-3’)和e25-R(5’-GCTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTG-3’)；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
(2)按以下方法克隆egfp基因：
以egfp基因为模板，利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F(5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)；所述PCR扩增反应同e25基因扩增反应方法一致。
(3)构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp：
通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化，随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI载体如图1所示，得到pFastBacI-egfp，随后将e25基因经BamHI和XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp，获得pFastBacI-e25-egfp；利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确性进行验证；
(4)构建重组病毒
以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板，利用引物P10-F(5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCGTTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和P10-R(5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸1.5分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
以pFastBacI-e25-egfp为模板，利用引物P10-F(5’-CAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTTACAATCTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’)和P10-R(5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)PCR扩增多角体启动子(pPH)及egfp基因片段pPH-e25-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳对pPH-egfp和pPH-e25-egfpPCR产物进行分析和纯化。随后在聚苯乙烯锥形管中以加入野生型AcMNPV基因组DNA、脂质体和PCR产物(pPH-egfp或pPH-e25-egfp)各10μg，加入270μL无血清TC-100培养并混匀；将所述混合物在27℃孵育30分钟后共转染Sf-9培养细胞；转染后的培养细胞加入无血清TC-100培养基培养12小时；随后，吸出培养基后在细胞上覆盖低熔点琼脂糖，并在其实添加含有10％胎牛血清的TC-100培养基；在27℃条件下培养5天，通过荧光显微镜标记进行空斑筛选重组病毒，；重组病毒通过五轮筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液，病毒分别命名为vAc-egfp和vAc-e25-egfp。
(5)使用Sf-9培养细胞，接种vAc-egfp和vAc-e25-egfp，27℃感染5天，后通过离心收集培养细胞。
(6)收集多角体及重组蛋白鉴定分析：将所收集的细胞样品进行超声波破碎，在4℃条件下，使用45％-60％的蔗糖梯度5000转/分钟，离心30分钟，纯化多角体。所得的多角体重悬于无菌水中，并用血细胞计数板统计多角体的数目。重组病毒感染细胞与纯化多角体在荧光显微镜下检测结果参见图2a及图2b；随后取5×108多角体，将多角体用多角体裂解液(0.1mol/L Na2CO3,0.15mol/L NaCl pH 11)冰上裂解30分钟，以充分裂解多角体。利用从华安生物公司所购买的EGFP抗体，通过Western blot技术，对多角体内的重组蛋白进行鉴定，Western blot分析如图3a所示，在vAc-egfp和vAc-e25-egfp的多角体分别检测到26KDa和50KDa蛋白条带，与预测的蛋白分子量大小一致。利用ImageJ软件对其浓度分析，经三次独立重复实验验证，表明重组蛋白的浓度为对照的2.5倍(图3b)，由于重组蛋白的分子量为对照的2倍，实际固定入多角体内部重组蛋白比对照提高25％。这一结果表明利用E25融合外源蛋白可显著提高多角体内部外源蛋白的水平。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法，其特征在于，利用PCR方法对e25基因和egfp基因进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp，随后将e25基因经BamHI和XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp，获得pFastBacI-e25-egfp，以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板，扩增多角体启动子pPH及egfp基因片段pPH-egfp；然后将egfp基因片段克隆入杆状病毒转移载体得到重组的转移载体；将重组载体转染入细胞，使用Sf-9培养细胞，通过离心收集培养；之后收集多角体及重组蛋白鉴定分析；
所述方法具体包括如下步骤：
步骤一、按以下方法克隆e25基因：
以AcMNPV基因组为模板，利用PCR技术得到e25基因；PCR所用的引物分别为e25-F：5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTACT-3’和e25-R：5’-GCTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTG-3’；
步骤二、按以下方法克隆egfp基因：
以egfp基因为模板，利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F：5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’和egfp-R：5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’；
步骤三、构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp：
通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化，随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp，随后将e25基因经BamHI和XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp，获得pFastBacI-e25-egfp；利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确性进行验证；
步骤四、构建重组病毒：
以pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp为模板，利用引物P10-F：5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCGTTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’和P10-R：5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3 PCR扩增多角体启动子pPH及egfp基因片段pPH-egfp；然后将egfp基因片段克隆入杆状病毒转移载体得到重组的转移载体；
以pFastBacI-e25-egfp为模板，同样利用引物P10-F：5’-ATGTCAAAGCCTAACGTTTTGACGCAAATTTTAGACGCCGTTACGGAAACTAACACAAAGGTTGGTTGGCTACGTATACTCC-3’和P10-R：5’-CTTGGAACTGCGTTTACCACGACGAGCGTCTGAATCGAGTTCAAAAGCTTGGGTTTTCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’PCR扩增多角体启动子pPH、e25及egfp基因片段pPH-e25-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环；
通过琼脂糖凝胶电泳对pPH-egfp和pPH-e25-egfpPCR产物进行分析和纯化；随后在聚苯乙烯锥形管中以质量比1:1:1加入野生型AcMNPV基因组DNA、脂质体和pPH-egfp或pPH-e25-egfp的PCR产物，加入9倍体积无血清TC-100培养基培养并混匀；将所述混合物在27℃孵育30分钟后共转染Sf-9培养细胞；转染后的培养细胞在无血清TC-100培养基培养12小时；随后，吸出培养基后在细胞上覆盖一层低熔点琼脂糖，并在其中添加含有10％胎牛血清的TC-100培养基；在27℃条件下培养5天，通过荧光显微镜标记进行空斑筛选重组病毒，筛选的病毒分别命名为vAc-egfp和vAc-e25-egfp；
步骤五、使用Sf-9培养细胞，接种vAc-egfp和vAc-e25-egfp，27℃感染5天，后通过离心收集培养细胞；
步骤六、收集多角体及重组蛋白鉴定分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一、二中，所述PCR扩增反应条件为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，所述PCR扩增反应条件为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸1.5分钟；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。
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