CN108192923B - 一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法 - Google Patents

一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，包括以下步骤：(1)构建含有多角体基因的pFast‑PH质粒；(2)构建含有egfp与ac12基因的重组pFast‑PH‑pPH‑ac12‑egfp质粒；(3)构建ac12基因过量表达bacmid‑bAcac12OE；(4)转染细胞，获得重组病毒：(5)将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。本发明在多角体基因之后插入重组外源基因片段，既不影响多角体的形成，又能使外源蛋白包埋入多角体；通过杆状病毒高效强力启动子多角体启动子与AC12蛋白融合表达的方法，实现重组蛋白的高水平表达，降低了多角体内部包涵病毒粒子的水平；为进一步开发利用杆状病毒‑昆虫表达系统，为多角体开发成为新型医疗载体和纳米材料创造了条件。

Description

一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生 产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法。
背景技术
杆状病毒多角体基因是杆状病毒在感染宿主后的晚期产生的高水平表达蛋白。多角体启动子是杆状病毒极晚期超强表达启动子，现已成功应用于杆状病毒表达系统，用于外源基因的高水平表达。多角体蛋白聚合后可形成超大分子蛋白质结晶多角体。目前的研究表明多角体可保护包埋在多角体内部的病毒粒子和蛋白，使之长时间保存活性。但是多角体内部的病毒粒子的存在使多角体作为医用纳米材料的安全性受到影响，降低多角体包涵的病毒粒子是医学化工工作者的夙愿。
Ac12基因位于AcMNPV基因组nt8958-nt9611之间，基因全长654bp，编码217个氨基酸，分子量25.4kDa。氨基酸序列分析发现Ac12基因含有一个F-box基序。F-box蛋白是一类含有F-box基序(motif)，在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族。通常，F-box蛋白通过自身的F-box基序与Skp1结合，连接到SCF(Skp1-Cdc53-F-boxprotein complex)复合体上。这类蛋白质在细胞时相转换、信号传导、发育等多种生理过程中都具有重要功能。AC12同源体只存在于三个鳞翅目昆虫NPV，包括PlxyNPV，RoMNPV和LdMNPV。有报道表明ac12基因对出芽型病毒粒子(BV)的产生是非必需的。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术存在的问题，提供了一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，包括以下步骤：
(1)构建含有多角体基因的pFast-PH质粒；
(2)构建含有egfp与ac12基因的重组pFast-PH-pPH-ac12-egfp质粒；
(3)构建ac12基因过量表达bacmid-bAcac12OE；
(4)转染细胞，获得重组病毒：
(5)将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。
本发明利用杆状病毒的特性，构建了多角体启动子控制下ac12融合外源基因的重组病毒。为了不影响多角体基因的表达，通过同源重组方法将体外构建的多角体启动子外源蛋白基因插入多角体基因之后。本发明的技术路线不影响杆状病毒的水平传播(BV生成)，适用于市场化大规模生产该多角体。这样既降低了多角体中病毒粒子的包涵量，又不影响外源蛋白在多角体中的含量，为进一步利用杆状病毒开发新型纳米材料创造了条件。
作为优选，步骤(1)为：克隆多角体基因，酶切后连接入pFastBacI载体，得到pFast-PH重组载体。
作为优选，步骤(2)为：克隆egfp与基因ac12，酶切后依次连接入pFastBacI载体，得到pFast-egfp和pFast-ac12-egfp重组载体；以pFast-ac12-egfp为模板，扩增pPH-ac12-egfp序列并克隆入pFast-PH载体，得到pFast-PH-pPH-ac12-egfp。
作为优选，步骤(2)为：
A).以egfp基因为模板，利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F(5’-TCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)；以AcMNPV基因为模板，利用PCR技术扩增polyhedrin和ac12基因；polyhedrin所用的引物分别为PH-F(5’-AGATCTATGCCGGATTATTCATACC-3’)和PH-R(5’-AGATCTTTAATACGCCGGACCAGTG-3’)；Ac12所用的引物为Ac12-F(5’-GGATCCATGTACAGGCACGCGTGCT-3’)和Ac12-R(5’-TCTAGATGTATTTATTTCGTATAAATAATATATAAAGTTTGATTGTAC-3’)；
B).通过琼脂糖凝胶电泳将polyhedrin基因PCR产物回收，经BglII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH；
C).随后将egfp基因经XbaI和SphI酶切后克隆入pFastBacI，获得pFastBacI-egfp；随后将Ac12扩增，经BamHI和XbaI酶切后克隆入pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp；
D).以获得的pFastBacI-Ac12-egfp为模板，用引物pPH-F(5’-GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；
E).以pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp为模板，用引物pPH-F(5’-GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；
F).将重组质粒pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp转化入含有helper质粒及AcMNPV修饰基因组bacmid的DH10Ac；经转座获得重组杆状病毒bacmid，bAcac12OE。
作为优选，步骤(3)为：将构建pFast-PH-pPH-ac12-egfp质粒分别转化入DH10Ac中，得到ac12基因过量表达大质粒bacmid-bAcac12OE。
作为优选，步骤(4)为：bAcac12OEbacmid转染sf9培养细胞，培养120h后，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒。
作为优选，步骤(4)为：提取5μL bacmid DNA在1μL脂质体介导下转染sf9培养细胞，27℃条件下培养120h，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒；用预冷的PBS清洗细胞多次，收集细胞。
作为优选，步骤(5)为：将重组病毒感染sf9细胞，120h收集细胞，超声波破碎后，离心收集多角体；使用蔗糖密度梯度离心纯化多角体；用PBS洗涤2次得到最终纯化的多角体。
作为优选，步骤(5)中：所述重组病毒为vAcac12OE重组病毒；超声波破碎之前，先将收集的细胞用10mL PBS悬浮；所述蔗糖密度梯度为将Percoll与PBS按9:1的体积比混合，调pH至7.2；用PBS洗涤纯化的多角体之前，先将纯化的多角体悬浮于含0.1％SDS的PBS缓冲液中，室温放置5min。
作为优选，步骤(5)中：离心收集多角体的工艺条件为：转速为15000r/min，离心时间为10min；离心收集纯化多角体的工艺条件为：转速为12000r/min，离心时间为20min。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)在多角体基因之后插入重组外源基因片段，既不影响多角体的形成，又能使外源蛋白包埋入多角体；
(2)通过杆状病毒高效强力启动子多角体启动子与AC12蛋白融合表达的方法，既实现重组蛋白的高水平表达，又降低了多角体内部包涵病毒粒子的水平；
(3)由于杆状病毒ac12基因为杆状病毒复制过程中的非必须基因，本发明不影响杆状病毒出芽型病毒的生成；
(4)该技术为进一步开发利用杆状病毒-昆虫表达系统，为多角体开发成为新型医疗载体和纳米材料创造了条件。
附图说明
图1是本发明重组杆状病毒构建图谱。
图2是本发明病毒DNA复制分析图。
图3是本发明重组病毒感染细胞及多角体的透射电镜分析图：vAc(A)和vAcac12OE(C)bacmid转染sf9细胞电镜切片图；vAc(B)和vAcac12OE(D)多角体图片。
图4是本发明多角体荧光分析图：vAc(A)和vAcac12OE(C)纯化后的多角体普通灯光下的照片；vAc(B)和vAcac12OE(D)多角体的荧光分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，以下实施例涉及的相关材料及其来源如下：
(1)egfp基因：由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供；
(2)DNA处理和PCR扩增试剂盒：购于天根生物公司；
(3)苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV、杆状病毒转移载体pFastBacI和lipofectin：购自美国Invitrogen；
(4)DNA测序试剂盒：购于PE Applied Biosystems；
(5)胎牛血清FCS和昆虫细胞培养基TC-100：购于美国Gibco。
一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，包括以下步骤：
(1)构建含有多角体基因的pFast-PH质粒，构建技术路线如图1所示：
克隆多角体基因，酶切后连接入pFastBacI载体，得到pFast-PH重组载体；
(2)构建含有egfp与ac12基因的重组pFast-PH-pPH-ac12-egfp质粒：
A).以egfp基因为模板，egfp基因序列见以下网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/595644660？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝5&RID＝Z40WRB21016)；利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F(5’-TCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)；首先，94℃，预变性3分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸31秒；最后，72℃延伸5分钟，1个循环；
以AcMNPV基因为模板，利用PCR技术扩增polyhedrin和ac12基因；polyhedrin所用的引物分别为PH-F(5’-AGATCTATGCCGGATTATTCATACC-3’)和PH-R(5’-AGATCTTTAATACGCCGGACCAGTG-3’)；Ac12所用的引物为Ac12-F(5’-GGATCCATGTACAGGCACGCGTGCT-3’)和Ac12-R(5’-TCTAGATGTATTTATTTCGTATAAATAATATATAAAGTTTGATTGTAC-3’)；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性10分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性25秒，55℃退火25秒，72℃延伸25秒；最后，72℃延伸10分钟，1个循环；
B).通过琼脂糖凝胶电泳将polyhedrin基因PCR产物回收，经BglII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH；
C).随后将egfp基因经XbaI和SphI酶切后克隆入pFastBacI，获得pFastBacI-egfp；随后将Ac12扩增，经BamHI和XbaI酶切后克隆入pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp；
D).以获得的pFastBacI-ac12-egfp为模板，用引物pPH-F(5’-GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；
E).以pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp为模板，用引物pPH-F(5’-GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3’)和egfp-R(5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸65秒；最后，72℃延伸7分钟，1个循环；
F).将重组质粒pFastBacI-PH-pPH-AC12-EGFP转化入含有helper质粒及AcMNPV修饰基因组bacmid的DH10Ac；经转座获得重组杆状病毒bacmid，bAcac12OE；
(3)构建ac12基因过量表达bacmid-bAcac12OE：
将构建pFast-PH-pPH-ac12-egfp质粒分别转化入DH10Ac中，得到ac12基因过量表达大质粒bacmid-bAcac12OE；
(4)转染细胞，获得重组病毒：
提取5μL bacmid DNA在1μL脂质体介导下转染sf9培养细胞，27℃条件下培养120h，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒；用预冷的PBS清洗细胞多次，收集细胞；
(5)将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体：
将vAcac12OE重组病毒感染sf9细胞，120h收集感染细胞，用10mL PBS悬浮后超声波破碎，15000r/min离心10min收集多角体；将Percoll与PBS按9:1的体积比混合，调pH至7.2，12000r/min离心20min收集纯化的多角体；最后将纯化的多角体悬浮于含0.1％SDS的PBS缓冲液中，室温放置5min，然后用PBS洗涤2次得到最终纯化的多角体。
对本发明做以下检测，结果如下：
(1)病毒DNA复制分析
利用引物gp41F(5’-CGTAGTGGTAGTAATCGCCGC-3’)and gp41R(5’-AGTCGAGTCGCGTCGCTTT-3’)扩增101bp的gp41分析病毒DNA复制情况。vAc、vAcac12OEbacmid转染sf9细胞，规定时间点收集细胞。抽提DNA，用7300Real-Time PCR system(ABI)进行qPCR鉴定，反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃31s，45个循环。结果如图2所示。图2表明vAc、vAcac12OE转染细胞的病毒DNA复制相差不明显。这表明本发明重组技术不影响杆状病毒出芽型病毒(BV)的生成。
(2)透射电子显微镜分析：
vAc和vAcac12OE感染sf9细胞，感染后60h收细胞进行透射电镜分析。10μg的vAc、vAcac12OEbacmid转染sf9细胞(5×106cells)。转染后72h，收集细胞，5000r离心5min。细胞固定、脱水，嵌入，切片和染色。在120kV加速电压下，用Model JEM-1230透射电子显微镜观察样品。结果如图3所示。图3-A、C显示vAc,vAcac12OE bacmid转染细胞均产生多角体，且细胞中多角体数量差别不明显。图3-B显示正常杆状病毒的多角体中包涵较多数量的病毒粒子(ODV)，而图3-D显示vAcac12OE bacmid转染细胞产生的多角体包涵少量的病毒粒子。这表明本发明的重组病毒所产生的多角体包含极少量的病毒粒子(ODV)。
(3)多角体荧光分析：
纯化后的多角体悬浮于50mM碳酸盐溶液中，30min室温孵育，通过在395nm的激发和发射波长为510nm的使用F-4600型荧光分光光度计测定EGFP荧光。每个样品重复3次。结果如图4所示。图4-B、D显示纯化后多角体均发出荧光，这表明重组病毒产生的多角体能正常包埋外源蛋白(EGFP)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建含有多角体基因的pFastBacI-PH质粒；所述多角体基因来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV；
（2）构建含有多角体启动子、egfp与ac12基因的重组pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp质粒；所述ac12基因来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV；
（3）构建ac12基因过量表达质粒bacmid-bAcac12OE；
（4）转染细胞，获得重组病毒；
（5）将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。
2.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（1）为：克隆多角体基因，酶切后连接入pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH重组载体。
3.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（2）为：克隆egfp与基因ac12，酶切后依次连接入pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp和pFastBacI-ac12-egfp重组载体；以pFastBacI-ac12-egfp为模板，扩增pPH-ac12-egfp序列并克隆入pFastBacI-PH载体，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp。
4.根据权利要求3所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（3）为：
A）以egfp基因为模板，利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F：5’-TCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3和egfp-R：5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’；以AcMNPV基因为模板，利用PCR技术扩增多角体和ac12基因；多角体所用的引物分别为PH-F：5’-AGATCTATGCCGGATTATTCATACC-3’和PH-R：5’-AGATCTTTAATACGCCGGACCAGTG-3’；Ac12所用的引物为Ac12-F：5’-GGATCCATGTACAGGCACGCGTGCT-3’和Ac12-R：5’-TCTAGATGTATTTATTTCGTATAAATAATATATAAAGTTTGATTGTAC-3’；
B）通过琼脂糖凝胶电泳将多角体基因PCR产物回收，经BglII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH；
C）随后将egfp基因经XbaI和SphI酶切后克隆入pFastBacI，获得pFastBacI-egfp；随后将Ac12扩增，经BamHI和XbaI酶切后克隆入pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp；
D）以获得的pFastBacI-Ac12-egfp为模板，用引物pPH-F：5’- GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3和egfp-R：5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；
E）将重组质粒pFastBacI-PH-pPH-AC12-EGFP转化入含有helper质粒及AcMNPV修饰基因组bacmid的DH10Ac；经转座获得重组杆状病毒质粒bacmid-bAcac12OE。
5.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（3）为：将构建pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp质粒分别转化入DH10Ac中，得到ac12基因过量表达大质粒bacmid-bAcac12OE。
6.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（4）为：bacmid-bAcac12OE转染sf9培养细胞，培养120h后，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒。
7.根据权利要求6所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（4）为：提取5μL bacmid DNA在1μL脂质体介导下转染sf9培养细胞，27℃条件下培养120h，收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒；用预冷的PBS清洗细胞多次，收集细胞。
8.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（5）为：将重组病毒感染sf9细胞，120h收集细胞，超声波破碎后，离心收集多角体；使用蔗糖密度梯度离心纯化多角体；用PBS洗涤2次得到最终纯化的多角体。
9.根据权利要求8所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（5）中：所述重组病毒为vAcac12OE重组病毒；超声波破碎之前，先将收集的细胞用10mL PBS悬浮；所述蔗糖密度梯度为将Percoll与PBS按9:1的体积比混合，调pH至7.2；用PBS洗涤纯化的多角体之前，先将纯化的多角体悬浮于含0.1%SDS的PBS缓冲液中，室温放置5min。
10.根据权利要求9所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（5）中：离心收集多角体的工艺条件为：转速为15000r/min，离心时间为10min；离心收集纯化多角体的工艺条件为：转速为12000r/min，离心时间为20min。
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