CN106520788B - 一种重组表达pcv2的方法 - Google Patents

一种重组表达pcv2的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106520788B
CN106520788B CN201611202427.5A CN201611202427A CN106520788B CN 106520788 B CN106520788 B CN 106520788B CN 201611202427 A CN201611202427 A CN 201611202427A CN 106520788 B CN106520788 B CN 106520788B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcv2
recombinant
cells
protein
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611202427.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106520788A (zh
Inventor
王峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Baiaode Biological Science Co ltd
Original Assignee
Biortus Biosciences Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biortus Biosciences Co ltd filed Critical Biortus Biosciences Co ltd
Priority to CN201611202427.5A priority Critical patent/CN106520788B/zh
Publication of CN106520788A publication Critical patent/CN106520788A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106520788B publication Critical patent/CN106520788B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高效重组表达PCV2的方法，属于生物技术领域。本发明在PCV2的loop区插入His亲和标签，再通过bac to bac杆状病毒表达系统用Sf9细胞在无血清培养基表达纯化重组蛋白PCV2的。本发明方法通过His FF的纯化一步就得到了可溶性的PCV2蛋白，免除了之前传统繁复的CsCl2密度梯度离心的纯化方法，且得率比之前提到了3倍之多，为之后PCV2亚单位疫苗的研制打下了基础。

Description

一种重组表达PCV2的方法
技术领域
本发明涉及一种高效重组表达PCV2的方法，尤其是一种基于三维结构设计并构建重组表达PCV2的真核表达系统的方法，属于生物技术领域。
背景技术
PCV2(猪圆环病毒2型)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大猪群中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。近年来，我国猪群也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。
目前，疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段，2010年我国研制出全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增值能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量的PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。
昆虫杆状病毒表达系统(insect baculovirus expression vector system,IBEVS)基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立起来的表达体系，是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中可表达外源蛋白的一种真核表达系统。是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统之后建立起来的，现已成为基因工程四大表达系统之一。利用该系统获得的重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。但由于表达出来的 PCV2蛋白通过传统的CsCl2密度梯度离心的纯化方法过程比较复杂，并且得率较低，大概只有5mg/L。
发明内容
本发明根据PCV2已有结构，在PCV2蛋白的第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，再通过杆状病毒表达系统构建用Sf9细胞在无血清培养基表达重组蛋白PCV2，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白PCV2。
PCV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分别在第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白序列。
在本发明的一种实施方式中，本将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25～27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组PCV2蛋白。
在本发明的一种实施方式中，本将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h；所得细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。
杆状病毒表达系统是一个成熟、高效的真核表达系统，其表达产物的生物学活性、结构与功能特点、抗原性和免疫原性等与天然外源基因产物极其相似，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，病毒的增殖和病毒蛋白的表达仅发生在昆虫细胞中，对脊椎动物无感染性，其表达的产物具有较高的生物安全性。
本发明在PCV2结构的合适的loop区插入His标签，通过bac to bac杆状病毒表达系统用Sf9细胞在无血清培养基实现表达，并且通过His FF的一步分离富集轻松获得了较多的目的蛋白，得率为15mg/L，比传统的CsCl2、蔗糖密度梯度离心方法得到的蛋白产量提高了3 倍之多。本发明制备得到的P3代重组杆状病毒通过蚀斑实验测得其病毒滴度为1.035×109pfu/ml。总的来说，本发明与传统的CsCl2、蔗糖密度梯度离心方法相比，减少了反复高速超速离心所需要的高端离心机，同时也缩短了至少一天的实验时间，提高了蛋白提取效率，降低了由于反复离心过程中蛋白的损耗，为之后PCV2亚单位疫苗的研制打下了基础。
附图说明
图1重组BacmidPCR检测电泳结果；其中，Lane M＝DNA Marker，Lane 1＝Bacmid(PCV2(V62-K63ins His))PCR产物，Lane2＝Bacmid(PCV2(V62-K63ins His))PCR 产物，Lane3＝未重组杆状病毒DNA PCR产物。
图2转染后细胞状态对比；其中(A)正常sf9细胞(B)转染的sf9细胞。
图3PCV2(V62-K63ins His)重组病毒表达优化全细胞检测电泳结果；其中Lane M＝标准蛋白Marker；Lane 1＝普通细胞对照；Lane 2-10＝重组病毒感染24h、48h、60h、72h、84h、 96h、108h、120h、132h时的细胞。
图4PCV2(T112-Q113ins His)重组病毒表达优化全细胞检测电泳结果；其中LaneM＝标准蛋白Marker；Lane 1＝普通细胞对照；Lane 2-10＝重组病毒感染24h，48h，60h，72h，84h， 96h，108h，120h，132h时的细胞。
图5PCV2(V62-K63ins His)SDS-PAGE及WB检测结果；其中，Lane M＝蛋白Marker，Lane 2＝His FF洗脱液，Lane 2＝细胞培养上清液，Lane 3＝全细胞沉淀物。
图6PCV2(T112-Q113ins His)SDS-PAGE及WB检测结果；其中，Lane M＝蛋白Marker， Lane 2＝His FF洗脱液，Lane 2＝细胞培养上清液，Lane 3＝全细胞沉淀物。
具体实施方式
质粒、菌种和细胞：昆虫细胞草地夜蛾(Spodoptera frugierda)卵巢组织细胞购自Invitrogen 生物公司。转染所用重组杆状病毒pFastBac1_PCV2(V62-K63ins His)，pfastBac1_PCV2(T112-Q113ins His)由金斯瑞公司合成。
培养基及试剂：Sf9无血清培养基、Grace’s Insect Medium培养基、Sf-900ⅡSFM无血清培养基、转染试剂Cell Fectin、Bac PAK qPCR Titration Kit、Bac PAKBaculovirus Rapid Titer Kit、Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit购自Invitrogen公司。
仪器：NBS Innova 4300恒温摇床，生物反应器为无锡汇森5L搅拌式生物反应器，细胞计数仪为罗氏医用细胞计数仪，AKTA FPLC快速蛋白纯化液相，安捷伦LC-MS质谱分析仪。
实施例1
主要步骤包括：合成插入His亲和标签的携带重组PCV2的重组质粒，重组质粒转化至 DH10Bac大肠杆菌感受态细胞、经抗性及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒DNA(重组Bacmid)，提取的重组杆状病毒DNA转染至Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
(1)重组杆状病毒穿梭载体的构建与筛选
原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，将GQGSSHHHHHHSSGQG序列插入到62-63氨基酸中间，最终得到的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。将编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因序列连接到pFast Bac1载体4102-4103bp多克隆位点上，得到重组杆状病毒穿梭载体。
重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，进行卡那霉素、庆大霉素、四环素和IPTG、X-gal平板蓝白斑筛选，经过48h避光生长，挑取平板上的白色单菌落接入5ml LB培养基中培养过夜，提取重组Bacmid质粒，PCR鉴定目的片段，以蓝斑菌落作为阴性对照。如图1所示，提取的重组Bacmid质粒为重组成功的Bacmid。
(2)高滴度重组杆状病毒的获得
利用Cellfectin转染试剂将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h，待细胞出现明显病变后，收集细胞上清，3500rpm/min，离心5min，4℃避光保存，即为P1代病毒。取P1代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％～70％之间，则收集上清，此为P2代病毒。取P2代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为 P3代病毒。通过蚀斑实验纯化得到高效的病毒，于4℃避光保存。如图2所示，为P3代病毒转染Sf9昆虫细胞，约96h后，细胞出现明显的病变状态，细胞核变大，细胞膨胀甚至破裂死亡，贴壁状态明显变少。制备得到的P3代重组杆状病毒通过蚀斑实验测得其病毒滴度为 1.035×109pfu/ml。
(3)重组病毒蛋白的表达优化
用P3病毒感染对数期SF9细胞，MOI＝10，在24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时分别取样跑胶，检测PCV的最适及最佳表达量的生长时间。根据如图3所示的 SDS-PAGE结果，PCV2cap蛋白在感染60h后在SDS-PAGE上出现一条明显的条带(≈27kD)，与目的蛋白大小一致，通过蛋白条带的粗细可以初步判断，目的蛋白的表达量在感染 84h～108h时达到最高点，120h之后开始有减弱的趋势，可能由细胞衰老和蛋白降解导致。
(4)重组病毒蛋白的大量表达及纯化
根据步骤(3)得到的最适时间，用P3病毒感染对数期Sf9细胞，MOI＝10，96h后收细胞。细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取细胞破碎液上清过His FF柱，用 PBS洗柱子约200ml后，先用含10mM咪唑的PBS溶液洗杂约100ml，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到的样品中PCV2的浓度为15mg/L，样品跑胶并做Western检测，如图5所示，在27kD处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。
实施例2
(1)重组杆状病毒穿梭载体的构建
原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，将GQGSSHHHHHHSSGQG序列插入到112-113氨基酸中间，最终得到的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。将编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因序列连接到pFast Bac1载体上，得到重组杆状病毒穿梭载体。
重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，进行卡那霉素、庆大霉素、四环素和IPTG、X-gal平板蓝白斑筛选，经过48h避光生长，挑取平板上的白色单菌落接入5ml LB培养基中培养过夜，提取重组Bacmid质粒，PCR鉴定目的片段，以蓝斑菌落作为阴性对照。如图1所示，提取的重组Bacmid质粒为重组成功的Bacmid。
(2)高滴度重组杆状病毒的获得
利用Cellfectin转染试剂将重组质粒转染的Sf9昆虫细胞，活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h，待细胞出现明显病变后，收集细胞上清，3500rpm/min，离心5min，4℃避光保存，即为P1代病毒。取P1代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％～70％之间，则收集上清，此为P2代病毒。取P2代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48～52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为P3代病毒。通过蚀斑实验纯化得到高效的病毒，于4℃避光保存。病毒滴度为1.035×109pfu/ml。
(3)重组病毒蛋白的表达优化
用P3病毒感染对数期SF9细胞，MOI＝10，在24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时分别取样跑胶，检测PCV的最适及最佳表达量的生长时间。根据图4所示的SDS-PAGE结果，PCV2cap蛋白在感染60h后在SDS-PAGE上出现一条明显的条带(≈27kD)，与目的蛋白大小一致，通过蛋白条带的粗细可以初步判断，目的蛋白的表达量在感染84h～108h时达到最高点，120h之后开始有减弱的趋势，可能由细胞衰老和蛋白降解导致。
(4)重组病毒蛋白的大量表达及纯化
根据之前小试得到的最适时间，用P3病毒感染对数期Sf9细胞，MOI＝10，96h后收细胞以及上清。细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用PBS 洗柱子约200ml后，先用含10mM咪唑的PBS溶液洗杂约100ml，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到的样品跑胶并做Western检测。如图6所示，在27kD处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡佰翱得生物科学有限公司
<120> 一种高效重组表达PCV2的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 猪
<400> 1
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Ser Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Gly Gln
50 55 60
Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Gln Gly Lys Thr
65 70 75 80
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
85 90 95
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
100 105 110
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
115 120 125
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
130 135 140
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
165 170 175
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
180 185 190
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
195 200 205
Val Asp His Val Gly Leu Ser Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
210 215 220
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
225 230 235 240
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
245
<210> 3
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gly Gln Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Gln Gly
115 120 125
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
130 135 140
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
165 170 175
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
180 185 190
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
195 200 205
Val Asp His Val Gly Leu Ser Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
210 215 220
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
225 230 235 240
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
245
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Gln Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Gln Gly
1 5 10 15

Claims (6)

1.一种重组表达PCV2的方法，其特征在于，在PCV2蛋白的第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白PCV2，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白PCV2；
PCV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
在第62-63个氨基酸之间或者第112-113个氨基酸之间插入His亲和标签，得到氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的重组蛋白序列。
2.根据权利要求1所述的一种重组表达PCV2的方法，其特征在于，将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25~27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组PCV2蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种重组表达PCV2的方法，其特征在于，将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h。
4.根据权利要求2所述的一种重组表达PCV2的方法，其特征在于，所得培养结束后所得细胞用PBS重悬，细胞经超声破碎后离心取上清过His FF 柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM 咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM 咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。
5.应用权利要求1~4任一项所述方法制备得到的重组PCV2。
6.权利要求5所述重组PCV2在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。
CN201611202427.5A 2016-12-23 2016-12-23 一种重组表达pcv2的方法 Active CN106520788B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611202427.5A CN106520788B (zh) 2016-12-23 2016-12-23 一种重组表达pcv2的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611202427.5A CN106520788B (zh) 2016-12-23 2016-12-23 一种重组表达pcv2的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106520788A CN106520788A (zh) 2017-03-22
CN106520788B true CN106520788B (zh) 2021-05-28

Family

ID=58337482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611202427.5A Active CN106520788B (zh) 2016-12-23 2016-12-23 一种重组表达pcv2的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106520788B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108727477A (zh) * 2017-04-19 2018-11-02 南阳师范学院 一种高效重组表达纯化ev71 vp1蛋白的方法
CN108728489A (zh) * 2017-04-19 2018-11-02 南阳师范学院 一种重组表达制备ev71衣壳蛋白的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459317A (zh) * 2009-06-25 2012-05-16 大型界面系统校际研究中心 用于crm197及其衍生物的生产的人工基因的细菌表达
CN102839195A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV 2 Cap蛋白的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459317A (zh) * 2009-06-25 2012-05-16 大型界面系统校际研究中心 用于crm197及其衍生物的生产的人工基因的细菌表达
CN102839195A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV 2 Cap蛋白的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
cap protein [Porcine circovirus 2]，GenBank: AAS90298.1;Yu.,L. et al.;《genbank》;20040419;第1页 *
In silico analysis of surface structure variation of PCV2 capsid resulting from loop mutations of its capsid protein (Cap);Naidong Wang et al.;《Journal of General Virology》;20161215;第97卷(第12期);图1、图2、表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106520788A (zh) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11236307B2 (en) Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
JP7266306B2 (ja) トリコプルシア・ニの蛹における組み換えタンパク質の発現
Wu et al. High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (Bombyx mori L.) using recombinant baculovirus
EP2928290A1 (en) Baculovirus system for expressing proteins forming virus-like particles
WO2016086576A1 (zh) 一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法
CN106520788B (zh) 一种重组表达pcv2的方法
CN110981968B (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
WO2022160512A1 (zh) 一种基于诱导型昆虫细胞生产aav基因药物的方法
CN112851825A (zh) 表达新型冠状病毒rbd的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法
CN112831523A (zh) 一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途
WO2014086973A1 (en) Enhanced production of the porcine circovirus capsid protein by a baculovirus vector expression system
CN101429524A (zh) 一种提高载体转导和基因表达效率的病毒载体及其应用
CN111349621B (zh) 一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用
CN110592139B (zh) 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用
CN109295014B (zh) 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN104761624A (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品
CN108192923B (zh) 一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法
CN114480439A (zh) 一种猪细小病毒vp2蛋白基因及其应用
CN111778221A (zh) 嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位猪细小病毒样颗粒的组装方法及用途
Sandro et al. Baculovirus: A Powerful Tool for Various Biotechnological Applications
CN118086399A (zh) 一种杆状病毒表达载体及其构建方法、应用
CN108728489A (zh) 一种重组表达制备ev71衣壳蛋白的方法
CN116121303A (zh) 猪脑心肌炎病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN117065012A (zh) 猪圆环病毒疫苗及其制备方法与应用
CN111549067A (zh) Pcv2/pcv3二价重组病毒样颗粒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 214437 A5, 6 Dongsheng West Road, Chengdong street, Jiangyin City, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee after: Wuxi Baiaode Biological Science Co.,Ltd.

Address before: 214437 A5, 6 Dongsheng West Road, Chengdong street, Jiangyin City, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee before: BIORTUS BIOSCIENCES Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder