CN108727477A - 一种高效重组表达纯化ev71 vp1蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法，在EV71的VP1蛋白第112‑113个氨基酸之间插入His‑FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71衣壳蛋白VP1。本发明方法通过His FF的纯化一步就得到了可溶性的EV71蛋白，免除了之前传统繁复的CsCl2密度梯度离心的纯化方法，且得率比之前提到了3倍，为之后EV71亚单位疫苗的研制打下了基础。

Description

一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法。
背景技术
肠道病毒71型手足口病是由肠道病毒71型(简称EV71)感染所引起的一种急性传染病。好发于儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高，多数患者病情经过良好，少数重症患儿可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等并发症，极少数病情危重，可致死亡。存活者可留有后遗症，严重危害儿童身体健康和生命安全，被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。对其预防和治疗是当前医学界的热点之一。
昆虫杆状病毒表达系统(insect baculovirus expression vector system，IBEVS)基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立起来的表达体系，是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中可表达外源蛋白的一种真核表达系统。是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统之后建立起来的，现已成为基因工程四大表达系统之一。利用该系统获得的重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。但由于表达出来的EV71蛋白通过传统的CsCl2密度梯度离心的纯化方法过程比较复杂，并且得率较低。
发明内容
为了提供一种更方便高效的获得重组蛋白EV71的方法，做出本发明。
本发明根据EV71已有结构，切除N末端部分不稳定的结构，构建重组蛋白，且在EV71蛋白的的loop区域氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统构建用Sf9细胞在无血清培养基表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71。
本发明提供一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法，在EV71的VP1蛋白第112-113个氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71衣壳蛋白VP1；
将表达重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25-27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组EV71衣壳蛋白；
将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h；
所得培养结束后所得细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过HisFF柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。
在本发明的一种实施方式中，将表达loop区域氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25-27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组EV71蛋白。
本发明通过研究已有EV71结构在合适的loop区插入His标签，通过bac to bac杆状病毒表达系统用Sf9细胞在无血清培养基实现表达，并且通过His FF的一步分离富集轻松获得了较多的目的蛋白，具体得率为5mg/L，比传统的CsCl2、蔗糖密度梯度离心方法得到的蛋白产量提高了3倍。本发明制备得到的P3代重组杆状病毒通过蚀斑实验测得其病毒滴度为1.035×109pfu/ml。总的来说，本发明与传统的CsCl2、蔗糖密度梯度离心方法相比减少了反复高速超速离心所需要的高端离心机，同时也缩短了至少一天的实验时间，提高了蛋白提取效率，降低了由于反复离心过程中蛋白的损耗，为之后EV71亚单位疫苗的研制打下了基础。
具体实施方式
本发明涉及一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法尤其是一种基于三维结构设计并构建重组表达EV71 VP1蛋白的真核表达系统的方法，既保证了该蛋白的正确折叠，以增加用于重组疫苗应用的免疫原性，又避免了复杂的纯化以及体外包装的过程。
质粒、菌种和细胞：
昆虫细胞草地夜蛾(Spodoptera frugierda)卵巢组织细胞购自Invitrogen生物公司。转染所用重组杆状病毒pFastBac1_EV71(V62-K63ins His)，pfastBac1_EV71(T112-Q113ins His)由金斯瑞公司合成。
培养基及试剂：
Sf9无血清培养基、Grace’s Insect Medium培养基、Sf-900II SFM无血清培养基、转染试剂Cell Fectin、Bac PAK qPCR Titration Kit、Bac PAK Baculovirus RapidTiter Kit、Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit购自Invitrogen公司。
仪器：
NBS Innova 4300恒温摇床，生物反应器为无锡汇森5L搅拌式生物反应器，细胞计数仪为罗氏医用细胞计数仪，AKTA FPLC快速蛋白纯化液相，安捷伦LC-MS质谱分析仪。
实施例1
主要步骤包括：合成插入His亲和标签的携带重组EV71的重组质粒，重组质粒转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞、经抗性及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒DNA(重组Bacmid)，提取的重组杆状病毒DNA转染至Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
(1)重组杆状病毒穿梭载体的构建
将GQGSSHHHHHHSSGQG序列插入到EV71衣壳蛋白112-113氨基酸中间，并将编码该蛋白的基因序列连接到pFast Bac1载体上，得到重组杆状病毒穿梭载体。
重组杆状病毒穿梭载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid质粒发生定点转座，进行卡那霉素、庆大霉素、四环素和IPTG、X-gal平板蓝白斑筛选，经过48h避光生长，挑取平板上的白色单菌落接入5ml LB培养基中培养过夜，提取重组Bacmid质粒，PCR鉴定目的片段，以蓝斑菌落作为阴性对照。
(2)高滴度重组杆状病毒的获得
利用Cellfectin转染试剂将重组质粒转染的Sf9昆虫细胞，活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h，待细胞出现明显病变后，收集细胞上清，3500rpm/min，离心5min，4℃避光保存，即为P1代病毒。取P1代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48-52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为P2代病毒。取P2代感染对数生长期的昆虫细胞，经过48-52h，细胞活性在60％-70％之间，则收集上清，此为P3代病毒。通过蚀斑实验纯化得到高效的病毒，于4℃避光保存。病毒滴度为1.035×109pfu/ml。
(3)重组病毒蛋白的表达优化
用P3病毒感染对数期SF9细胞，MOI＝10，在24h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时分别取样跑胶，检测PCV的最适及最佳表达量的生长时间。EV71cap蛋白在感染60h后在SDS-PAGE上出现一条明显的条带(≈27kD)，与目的蛋白大小一致，通过蛋白条带的粗细可以初步判断，目的蛋白的表达量在感染84h-108h时达到最高点，120h之后开始有减弱的趋势，可能由细胞衰老和蛋白降解导致。
(4)重组病毒蛋白的大量表达及纯化
根据之前小试得到的最适时间，用P3病毒感染对数期Sf9细胞，MOI＝10，96h后收细胞以及上清。细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用PBS洗柱子约200ml后，先用含10mM咪唑的PBS溶液洗杂约100ml，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到的样品跑胶并做Western检测。在27kD处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种高效重组表达纯化EV71 VP1蛋白的方法，其特征在于，在EV71的VP1蛋白第112-113个氨基酸之间插入His-FLAG双亲和标签，再通过杆状病毒表达系统、Sf9细胞在无血清培养基中表达重组蛋白EV71，并利用亲和柱层析纯化得到重组蛋白EV71衣壳蛋白VP1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将表达重组蛋白的基因，与pFastBac1载体连接，将所得重组杆状病毒穿梭载体与Bacmid质粒发生定点转座，收集重组成功的Bacmid质粒；将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，在25-27℃培养72h-96h；所得细胞经破碎后，取上清过His FF柱，分离纯化得到重组EV71衣壳蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，Sf9的活细胞浓度为0.45×106cell/ml，放入恒温培养箱，27℃培养72h-96h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所得培养结束后所得细胞用PBS重悬，超声破碎后20000rpm离心1h，取上清过His FF柱，用200ml PBS洗柱子后，先用100ml含10mM咪唑的PBS溶液洗杂，之后再用含300mM咪唑的PBS溶液洗脱，洗脱得到重组蛋白。
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