CN102459317A

CN102459317A - 用于crm197及其衍生物的生产的人工基因的细菌表达

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Publication number: CN102459317A
Application number: CN2010800282296A
Authority: CN
Inventors: P·巴格里昂尼; 亚历杭德罗·霍克埃普勒; 亚历山德拉·斯蒂芬
Original assignee: Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi Grande Interfase Csg
Current assignee: Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi Grande Interfase Csg
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2012-05-16
Also published as: IT1398927B1; MX2011013476A; KR20120095837A; EP2445930A1; AU2010264044A1; US20120128727A1; ITFI20090137A1; WO2010150230A8; CA2766349A1; NZ597774A; JP2012531198A; WO2010150230A1

Abstract

本发明涉及包括编码CRM197并为其在大肠杆菌中表达而优化的SEQ ID N°1的多核苷酸序列。因此本发明涉及用于经由融合蛋白CRM197-标签在大肠杆菌中生产CRM197的方法。

Description

用于CRM197及其衍生物的生产的人工基因的细菌表达

发明领域

本发明涉及借助于人工基因序列生产目的药物蛋白的领域，所述序列被插入表达载体，相应蛋白在转化了所述表达载体的微生物中的过量表达，和用于分离所表达的蛋白的方法；具体地，涉及编码完整CRM197及其衍生物的人工基因的构建，涉及CRM197及其衍生物在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达，和涉及用于蛋白CRM197的分离和纯化的方法。

背景技术

蛋白CRM197(交叉反应物质197，58kDa)是白喉毒素(DTx)的变体，以减少其毒性的单突变(即，核苷酸变化在位置52产生甘氨酸-谷氨酸取代)为特征(Uchida T.等人，1973；Giannini G.等人，1984)。然而蛋白CRM197维持了与白喉毒素相同的炎性和免疫刺激特性并且广泛用于针对百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、B型肝炎病毒和B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B)的偶联疫苗的制备(WO 93/24148和WO 97/00697、WO 02/055105)。像野生型白喉毒素一样，CRM197包括两个结构域，A和B，通过二硫键结合在一起。A结构域(21kDa)为催化结构域，而B结构域(37kDa)包括一个用于结合细胞受体的亚结构域和另一个用于易位的亚结构域(Gill D.M.等人，1971；Uchida T.等人，1973)。和DTx一样，蛋白CRM197能够结合(借助B结构域)细胞受体HB-EGF(肝素结合性表皮生长因子)，使得其能够通过内吞易位到细胞内。暴露于内体中的低pH引发对于B结构域插入膜和随后A结构域易位到胞质必不可少的构象变化(Papini E.等人，1993；Cabiaux V.等人，1997)。易位的必要条件是由蛋白酶导致的两个结构域A和B之间的肽键的断裂。结合二硫键的还原，这种消化释放了A结构域，使其活化，而作为一个单独的多肽被合成的完整蛋白是失活的(Gill D.M.等人，1971)。

白喉毒素的A结构域具有ADP-核糖基化活性并且催化ADP-核糖基团从NAD到参与蛋白质合成的延长因子2(EF-2)的转移。所形成的复合物是无活性的且因此引发真核蛋白质合成的中断(Honjio T.等人，1971)。该蛋白的细胞毒性效应还归因于A结构域的另一活性，其能够非特异地降解DNA(Giannini G.等人，1984)。这种核酸内切酶活性依赖于二价阳离子并且也被保留在CRM197中(Bruce C.等人，1990；Lee J.W.等人，2005)。

CRM197和其他无毒性变体一直使用感染了基因组含有突变形式的编码白喉毒素(DTx)的tox基因的特殊β噬菌体的白喉棒状杆菌的溶源性培养物生产。这种白喉毒素和其他变体在特定的生长条件下被分泌到培养基中，然后通过过滤或者沉淀回收，并且随后使用层析方法纯化(CoxJ.，1975)。然而，起初用于DTx及其衍生物(CRM)的生产的方法不能保证高的产率，因此从棒状杆菌属(Corynebacterium)的单溶源性菌株产生CRM197对于其在疫苗中用作偶联物不是经济上有优势的。为把CRM197的生产增加到工业规模，随后分离到双溶源性和三溶源性突变体，其包括整合到染色体内的两个或三个tox基因(Rappuoli R.等人，1983；RappuoliR.，1983)。1990年，Rappuoli描述了一种用于生产衍生自DTx的蛋白的方法，其使用了染色体上整合有两个拷贝的tox突变基因的棒状杆菌属的菌株。还建立了生长条件(培养基、铁离子浓度、生长温度、氧百分率等)以增加产率(美国专利4925792，1990)。在整个对数生长期，直到稳定期开始，CRM197积聚于培养基中，发酵开始大约20小时后达到峰值。然而，随后出现产率大幅下降的明显迹象，可能归因于蛋白酶解(美国专利4925792，1990)。

值得注意的是为增加表达效率的双溶源性和三溶源性菌株的构建是一个需要费力筛选阶段的长期过程。获得高水平的CRM197的替代方式使用一种特殊的质粒pPX3511，其通过将编码CRM197的噬菌体基因与质粒pNG-22融合获得(美国专利5614382，1995)。这使得增加基因拷贝数(达每个细胞5-10个)成为可能而不需要筛选多溶源性的细菌菌株。再有，就被噬菌体β197^tox-感染的棒状杆菌菌株来讲，CRM197表达在含有低铁含量的特殊培养基中。尽管遗传操作细菌菌株所需的时间量减少了，CRM197蛋白的产量与使用双溶源性基因相比并没有明显增加。生产DTx或各种其他CRM的发酵方法，最近被描述在若干专利中，都包括了白喉棒状杆菌培养物的使用。一般来讲，生长发生在控制温度、搅拌和通气的条件下，且毒素和/或其衍生物的最大产生发生于培养20小时后(Dehottay P.M.H.等人，美国2008/0193475；Wolfe H.等人，美国2008/0153750)。

另一方面，关于使用细菌宿主代替棒状杆菌的研究是有限的。已在大肠杆菌中进行了关于A结构域和B结构域的表达测试，和关于某些DTx的中间形式(A结构域与B结构域的部分一起)的测试。所做的这些研究通常被用来详细测定结构域A和B(及其部分)在毒性、与受体的结合、蛋白折叠和稳定性方面的作用(Bishai WR等人，1987a；Bishai WR等人，1987b)。这些片段，其中有些以融合蛋白产生，已通过使用不同的启动子和不同的表达条件表达在大肠杆菌中以评价它们的溶解性和最终产率(其在0.4-10mg/L之间变化，相当于约7％的总蛋白)。平行地，克隆了1875bp的片段，包括原始的tox启动子、信号序列和编码CRM的完整基因。作为蛋白质免疫印迹实验的对照，在周质水平表达时该克隆表现为比多个片段更加稳定，而在高温下表达于胞质中时该蛋白的溶解性急剧下降(BishaiWR等人，1987b)。

尽管使用天然的tox启动子表达整个A结构域是可能的(Leong D.等人，1983)，已证明在大肠杆菌中单独表达B结构域是更加复杂的因为该结构域极不稳定且仅在与标签融合时才表达(Spilsberg B.等人，2005)。

明显地，毒素及其衍生物的异源生产受到与最佳蛋白构象的采用、潜在的降解和低最终产率相关的很多问题的限制。避免对于理想蛋白构象至关重要的两个分子内二硫键的形成的一种策略包括构建多个修饰的肽衍生物，且尤其是肽DTa(由CRM197序列的前185个氨基酸组成)、肽DTb(255个氨基酸，缺失了与细胞受体结合的结构域和N端8个氨基酸)，和由前两个肽融合获得的肽DTaDTb(440个氨基酸)。这些片段以白喉棒状杆菌基因组作为模板通过PCR合成，并且随后通过采用色氨酸诱导系统表达在大肠杆菌中(Corvaia N.等人，FR 2827606A1 2003)。

最近对CRM197的兴趣不断增加由于与其能和可溶形式的HB-EGF结合有关的潜在的抗肿瘤作用(Mekada等人，美国2006/0270600A1)。这种抗肿瘤功能不仅可归因于CRM197，还可归因于DT毒素的其他无毒性衍生物(例如，双突变体DT52E148K、或融合蛋白GST-DT)。这些突变体已通过PCR构建，起始于编码CRM197的基因。然而，在所述研究中通过使用白喉棒状杆菌的培养物，在35℃生长16-17小时生产完整的CRM197。CRM197从上清液中被纯化：通过用硫酸铵最初沉淀，随后三次连续的离子交换和疏水层析步骤(Mekada等人，美国2006/0270600A1)。

因此，在文献中没有描述完整白喉毒素或CRM197在大肠杆菌中的表达的可以利用的研究。

因此明显需要解决一种在短时间内具有成本效益的产率的生产CRM197(及其衍生物)的替代方法和，优选地，借助于使用替代性的细菌宿主代替棒状杆菌。

定义和缩写

CRM197：交叉反应物质

DTx：白喉毒素

DTA：白喉毒素A结构域

DTB：白喉毒素B结构域

EF-2：延长因子-2

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

发明概述

本发明借助于特异地用于在大肠杆菌中过表达蛋白CRM197的人工多核苷酸序列(SEQ ID N°1)解决了上述问题。该基因可与标签序列相连并且因此使得融合蛋白CRM197-标签能够在大肠杆菌中表达。本发明还涉及包含序列SEQ ID N°1的质粒和由上述质粒的引入而遗传修饰的大肠杆菌菌株。一方面，本发明涉及由上述提及的遗传修饰的大肠杆菌生产的重组融合蛋白CRM197-标签。

本发明还涉及借助于在上面阐释的遗传修饰的大肠杆菌中表达的具有N端标签的重组蛋白CRM197(结构域A和B)的生产，和其随后的纯化的方法。该方法还包括去除标签以获得天然形式的蛋白CRM197。

该发明提供了生产蛋白CRM197和相似蛋白的一种新方法，作为使用微生物白喉棒状杆菌的替代方法。根据本发明所描述的方案，目标蛋白能够被大量获得以用于药物-治疗领域的基础研究和应用。本发明提供了下列优点：i)它使用了微生物大肠杆菌，其被广泛用于工业和药物应用中的异源蛋白的表达；ii)大肠杆菌的遗传学已被知悉数年且很多可选择系统(载体和菌株)可用于其表达；iii)它是一种非致病性微生物；iv)大肠杆菌的使用使得能够缩短生产时间因为其以高生物量产量快速生长。

附图简要说明

图1表示电泳(SDS-PAGE 10％)从中可以看到对应于从不同大肠杆菌，即BL21AI(泳道1、2、3、4)和BL21(DE3)(泳道5、6、7、8)的细菌培养物的总蛋白提取物中获得的具有SEQ ID N°6的蛋白(CRM197-标签，61kDa)的条带。培养物被置于不同的诱导时间(1小时、3小时和过夜)。泳道M：标准分子量参照物；泳道1和5：未诱导的样品；泳道2和6：诱导1小时的样品；泳道3和7：诱导3小时的样品；泳道4和8：诱导过夜的样品。

图2表明对从不溶性部分得到的蛋白CRM197-标签所做的溶解测试。

所有的测试都使用含有6-7M尿素的溶液来进行。泳道1和2：从未诱导的(1)和诱导的(2)培养物获得的可溶部分；泳道3：标准分子量参照物；泳道4：20℃的溶解溶液和吐温20；泳道5：20℃的溶解溶液和TritonX-100；泳道6：20℃的溶解溶液和还原剂(β-巯基乙醇20mM)；泳道7：20℃的溶解溶液和SDS；泳道8：30℃的溶解溶液和Triton X-100；泳道9：30℃的溶解溶液和还原剂。

图3表示在亲和层析后获得的一些部分的电泳。泳道1：过柱前的用6-7M尿素溶解的样品；泳道2：柱中未结合的流通液；泳道3和4：用梯度咪唑洗脱的初始部分；泳道5-10：对应于洗脱峰的中心区域的部分。

图4表示10％的SDS-PAGE凝胶：其中纯化步骤是可见的。泳道M：标准分子量参照物；泳道1：可溶部分；泳道2：用尿素溶解的总提取物；泳道3：亲和层析后的样品；泳道4：凝胶过滤层析后的样品。

图5表示CRM197样品在用肠激酶消化前后的电泳。M：标准分子量参照物；泳道1：未被肠激酶处理的CRM197-标签；泳道2：在24℃被消化20小时的CRM197-标签。样品在还原剂存在下被煮沸。可见条带对应于B结构域、A结构域和A-标签结构域(分别是a、b、c)。

发明详述

对应于Giannini G.等人(1984)描述的完整CRM197、不含用于运出细胞外的天然信号序列的序列，被用于获得为在大肠杆菌中表达而借助于Leto软件(Entelechon GmbH Regensburg，德国)优化的多核苷酸序列SEQID N°1。

基因序列SEQ ID N°1也可以在其5’和3’端连接编码标签多肽的寡核苷酸序列以有利于其胞质稳定性和/或随后使用与多种标签肽具有高亲和力的基质或树脂的纯化。有很多已知的编码标签多肽的核苷酸序列。在这些标签中，有编码6、8、10个组氨酸(H)(组氨酸-标签)、编码标签MASMTGGQQMG(T7-标签)、编码NDYKDDDDKC(FLAG-标签)、编码WSHPQFEK(Strep-tag)、编码YPYDVPDYA(HAT-标签)、编码KETAAAKFERQHMDS(S-标签)、和编码NEQKLISEEDLC(Myc-标签)的核苷酸序列。

基因SEQ ID N°1也可以与其他标签序列连接，例如那些编码硫氧还蛋白(Trx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合蛋白(CBD)和几丁质结合蛋白(CBP)的标签序列。

标签序列能合适地连接于特定的剪切序列以被能随后去除该标签的合适的酶识别。肠激酶、凝血酶、因子Xa或者弗林蛋白酶被优选地用于去除标签，其最为熟知的和最为常用的剪切肽序列分别是DDDDK、LVPRGS、IE/DGR和RXXR。

在一个优选的实施方案中，基因SEQ ID N°1与编码多组氨酸标签的寡核苷酸连接。该组氨酸标签序列能被添加在5’末端和3’末端。

以下是组氨酸标签肽序列的实例：MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR、MGSSHHHHHHSSG、MGSSHHHHHHSSGL、MGSGHHHHHH、MGHHHHHHHHHHSSG、MHHHHHHSSG、ALEHHHHHH、AALEHHHHHH。

一个特别优选的实施方案是SEQ ID N°2，其中84个核苷酸的序列在5’末端被添加到SEQ ID N°1序列上，编码含有6个组氨酸的序列MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR和用于肠激酶的剪切序列DDDDK。

当然，优选包含SEQ ID N°1的序列适合具有起始和终止密码子，和具有编码用于克隆目的的限制性内切酶的识别位点的合适序列。

包含SEQ ID N°1的基因可以通过化学合成制备且然后被克隆到合适的表达载体中。在一个优选的实施方案中，人工序列SEQ ID N°1和2通过组装步骤被合成地制备，分别获得SEQ ID N°3和5，分别编码具有序列SEQ ID N°4和6的蛋白。

本发明还涉及包含序列SEQ ID N°1和优选地带有标签和限制性内切酶和/或蛋白酶的特异识别位点的其衍生物的表达载体(质粒)。

来源于pET系列的质粒被优选地用于克隆包含SEQ ID N°1的人工基因。优选地，载体pET9a包含特异性用于噬菌体T7的RNA聚合酶的启动子T7。该聚合酶非常有效(优于细菌的RNA聚合酶)和特异(不识别细菌启动子)。除了质粒pET9a，pET系列(Novagen)中的适合该方法的其他载体包括：pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、pET12a、pET12b、pET12c、pET17b和通常地，具有强噬菌体T7启动子的所有载体(例如pRSETA、B和C[Invitrogen]和pTYB1、pTYB2、pTYB3和pTYB4[New England Biolabs])。

为了克隆目的，优选使用NdeI和BamHI作为限制性内切酶。

所得的构建体能用于转化大肠杆菌菌株。所述大肠杆菌菌株可以采用不同的诱导剂，例如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或阿拉伯糖的替代的基因表达调控系统为特征。

就所使用的pET-型质粒来讲，其包含特异用于噬菌体T7的RNA聚合酶的T7启动子，那么适合用含有SEQ ID N°1的pET构建体转化的大肠杆菌菌株可以是那些能够提供T7 RNA聚合酶的任何一种，但优选为：B型大肠杆菌，例如ER2566、ER2833、ER3011、ER3012、BL21AI^TM、BL21(DE3)、BL21Star^TM(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21(DE3)pLys、C41(DE3)、C43(DE3)、BLR(DE3)、B834(DE3 Tuner^TM(DE3)；或来源于K-12的大肠杆菌，例如HMS174(DE3)、AD494(DE3)、Origami^TM(DE3)、NovaBlue(DE3)、Rosetta^TM(DE3)。优选通过电穿孔转化细菌菌株，但其他已知的方法也是一样适合的。

在优选的实施方案中，具有SEQ ID N°3和5的基因，分别包括序列SEQ ID N°1和2，被化学合成并且随后被克隆到pET系列的特定质粒中。所使用的克隆和表达载体是pET9a(Novagen，Darmstadt，德国)，其特征是具有复制起点pBR322，其确保：每个细胞的大量拷贝数；维持质粒处于细菌宿主内的选择性标志(用于卡那霉素抗性的kan基因)；包含很多个适合克隆的限制性内切酶位点的多聚接头区域；和调控CRM197的过表达的可诱导的特异性启动子。

NdeI和BamHI被用作将人工基因克隆到质粒内(在多聚接头内)的限制性内切酶且使用测序以验证其合适的方向和位置。所得到的构建体通过电穿孔转化到多种大肠杆菌菌株中，在培养皿(包含添加卡那霉素的固体LB)上选择转化的菌落。在适合克隆到载体pET9a中的CRM197表达的细菌菌株中，两种B型大肠杆菌的衍生菌株被选择，即BL21AI和BL21(DE3)。两者都含有整合到染色体中的一个拷贝的编码噬菌体T7 RNA聚合酶的基因，由可诱导的启动子控制。到达细胞内后，这种酶能够激活克隆到启动子pT7下游的人工基因CRM197或CRM197-标签的转录。菌株BL21AI具有由启动子p_BAD控制的编码T7 RNA聚合酶的基因，因此诱导发生归因于在培养基中阿拉伯糖的添加。而菌株BL21(DE3)被获得归因于含有受控于lac启动子的T7 RNA聚合酶基因的原噬菌体λ(DE3)在细菌基因组中的整合。就后一种情况来讲，表达系统的级联诱导被IPTG，一种乳糖类似物激活。适合用pET9a-CRM197构建体转化和目标蛋白表达的其他大肠杆菌菌株是BL21(DE3)的衍生菌株，例如BL21Star^TM(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21(DE3)pLys、ER2566的衍生菌株，和所有在其基因组中含有一个拷贝的编码T7 RNA聚合酶的基因的经修饰的B或K-12菌株。

转化的大肠杆菌菌株被选择后，将在不同的培养和诱导条件下进行表达测试。预备测试的目的是找出使得与细菌蛋白相比蛋白CRM197能够高水平表达的方法(优选达到约30-40％)。考虑的因素是培养基、生长温度、(30℃和37℃)、诱导剂的浓度和诱导时间。所用的培养基是经典的LB，但也可使用促使高生物量产量的其他丰富型培养基。当重组蛋白过表达时，产物能被分泌到培养基中(如果其具有特异的信号序列)或者能够在胞质中以可溶形式或以不可溶的包涵体形式积聚。蛋白的定位影响随后的纯化过程。就特定的从SEQ ID N°5(带有组氨酸-标签)代表的人工基因的转录获得的具有SEQ ID N°6的融合蛋白CRM197-标签来讲，发现蛋白被菌体以不可溶形式(包涵体)表达并且以非常方便的方式积聚以用于工业生产目的。本发明述及的表达方案包括CRM197蛋白以所述不可溶形式的积聚和描述了包括将其以可溶形式回收和复性以获得有生物活性形式的蛋白的步骤。此外，本发明包括两个层析纯化步骤和一个去除标签的最终步骤。最适合的层析方法的选择依赖于CRM197-标签的化学物理特征，例如pI(等电点)、氨基酸组成和尺寸。与标签的融合使得蛋白能够使用对该标签具有高亲和力的特定树脂(在柱中和分批地)纯化。标签的存在对于增加蛋白在胞质中的稳定性和随后的纯化都是有用的。

因此，一方面，本发明涉及由包含SEQ ID N°1和编码多肽标签的简短序列的多核苷酸编码的重组融合蛋白CRM197-标签。

特别优选的是序列SEQ ID N°6的重组融合蛋白，由包含SEQ ID N°2的核苷酸编码。

上述的重组融合蛋白CRM197-标签对于医疗目的，对于肿瘤治疗例如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌，或对于动脉粥样硬化斑块的减少是潜在有用的。前面所述的融合蛋白也可以用作例如那些针对肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌(Meningococcus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和其他致病菌的疫苗的偶联载体。

本发明进一步涉及用于生产CRM197-标签蛋白的方法，所述方法包括上面阐释的经修饰的大肠杆菌菌株的使用。所述方法优选包括：

(i).借助于上述大肠杆菌培养物的蛋白的合适诱导表达；

(ii).通过下述步骤提取：

a.在包含Tris-HCl 20-50mM pH 7.5-8.5、NaCl 100-150mM、去垢剂0.5-1.5％、蛋白酶抑制剂0.5-1.5％的缓冲溶液中裂解，在0-5℃持续1.5-2.5小时，伴随搅拌；

b.上清液与固体残留物(沉淀)的分离；

c.用pH 7.5-8.5的包含Tris-HCl 20-50mM、NaCl 100-150mM、去垢剂0.5-1.5％和尿素5-7M的溶解缓冲液处理上步得到的固体残留物，在20-30℃持续1.5-2.5小时，伴随搅拌；

d.上清液与固体残留物的分离，上清液中含有溶解的CRM197-标签蛋白；

(iii).步骤(ii)得到的蛋白的纯化与复性，通过：

a.亲和层析或透析；

b.分子排阻层析(凝胶过滤)或阴离子交换层析。

在大肠杆菌经包含有SEQ ID N°2，例如SEQ ID N°5的质粒修饰的实施方案中，重组蛋白CRM197-标签以与包含促使其表达和有利于其随后通过亲和层析纯化的6个组氨酸的标签序列融合形式生产。通过该方法获得的CRM197和相似蛋白的量可以通过调整控制表达水平的参数(培养基、生长温度、诱导时间等)来改变。就转化了所使用的合适质粒的大肠杆菌菌株BL21AI或BL21(DE3)来讲，最佳表达条件在37℃诱导3小时后获得(图1)并且优选转化菌株BL21AI。在这些条件下，表达产率高达40％且CRM197-标签相当于裂解和去除可溶部分后获得的不可溶部分的大约80％。认为在采用最佳生长、裂解和回收条件的生产方法中，CRM197-标签的表达产率可以高达0.5-1g/L是可行的。

在使用SEQ ID N°5的特定情形下，表达SEQ ID N°6的重组CRM197-标签具有包含对二价金属离子(铜，镍等)有高亲和力的6个组氨酸的28个氨基酸的标签；利用该特征有助于以不可溶形式表达的融合蛋白的纯化。亲和层析也能用于去除从不可溶部分回收CRM197-标签所需的变性剂。这种情况下，去除过程逐步发生(以两个逆梯度阶段)以有利于采纳正确的蛋白构象(折叠)。

保持与目的蛋白结合的污染蛋白在彼此的分子量差异相当大的情况下可随后通过凝胶过滤层析被去除。或者，利用CRM197的pI值(5.8-5.9)，可使用离子交换层析进行第二纯化阶段。因此本发明包括在亲和层析之后酌情使用的两个不同的纯化方法。无论使用哪种方法，重组蛋白的最终产率和纯度水平是相当的。蛋白通过Bradford测试被定量且在10％的丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中可见。

根据本发明描述的方案获得的CRM197-标签蛋白的表达产率是250±50mg/L培养基(在装有LB培养基的量瓶中)。如前面提及的，在发酵罐中进行的工业方法中，使用合适的生长介质和条件，产率进一步增加。值得强调的是本发明所述的裂解和提取方法是简单的和经济的；另外，方法的各个阶段是为达到适合工业方法的方案而设计以避免对特殊缓冲液/试剂或特殊的实验设备(例如用于细胞裂解的超声仪)的需要。

最后，本发明涉及用于去除具有双重目的，即使得CRM197能够表达，增加其稳定性和有助于其纯化的标签的方法。

因此本发明还涉及CRM197的制备方法，所述方法的特征是如上阐释的经修饰的大肠杆菌菌株的使用。

上面所述的用于CRM197的生产的方法优选包括上述融合蛋白CRM197-标签的表达和随后通过合适的酶消化的标签的去除。

就具有序列SEQ ID N°6的CRM197-标签来讲，用于去除标签的合适的酶是肠激酶且其消化优选在含有Tris-HCl 10-20mM、pH 7.5-8.5、NaCl40-60mM、CaCl2 1.5-2.5mM和浓度在0.01％-0.03％重量百分比(w/w)范围内的酶的缓冲液中进行，在20-25℃持续18-24小时。

在去除标签后，没有标签的蛋白优选通过亲和层析纯化。

通过根据本发明的方法获得的CRM197重组蛋白SEQ ID N°7在结构和功能上与使用已知方法生产的CRM197相同；其以天然形式获得且因此是有活性的，并且因此可用于已知应用中。

借助于下面的实施方案的实例，本发明将更易理解。

序列

SEQ ID N°1-为在大肠杆菌中表达而优化的编码CRM197的人工序列

GGTGCCGAT GACGTGGTTG ACTCTTCCAA AAGCTTCGTC ATGGAAAACT

TCAGCTCCTA TCACGGCACT AAACCGGGTT ATGTCGACAG CATCCAGAAA

GGCATCCAGA AACCGAAATC TGGCACTCAG GGTAACTATG ACGACGACTG

GAAAGAGTTC TACTCTACCG ACAACAAATA CGACGCGGCT GGTTATTCTG

TGGACAACGA AAACCCGCTG TCTGGTAAAG CTGGTGGTGT TGTTAAAGTG

ACCTACCCGG GTCTGACCAA AGTTCTGGCT CTGAAAGTGG ACAACGCCGA

AACCATCAAA AAAGAACTGG GTCTGTCTCT GACCGAACCG CTGATGGAAC

AGGTAGGTAC CGAGGAATTC ATCAAACGTT TTGGTGATGG TGCGTCCCGT

GTTGTACTGT CTCTGCCATT TGCCGAAGGT TCTAGCTCTG TCGAGTACAT

CAACAACTGG GAGCAGGCCA AAGCTCTGTC TGTGGAACTG GAAATCAACT

TCGAGACCCG TGGTAAACGT GGTCAGGACG CAATGTATGA ATACATGGCA

CAGGCTTGCG CGGGTAACCG TGTACGTCGT TCTGTAGGTT CTTCCCTGTC

TTGCATCAAC CTGGACTGGG ATGTCATCCG TGACAAAACC AAAACCAAAA

TCGAGTCCCT GAAAGAGCAC GGTCCGATCA AAAACAAAAT GAGCGAATCT

CCGAACAAAA CGGTCTCTGA GGAAAAAGCG AAACAGTACC TGGAAGAATT

CCATCAGACC GCCCTGGAAC ACCCGGAACT GTCTGAACTG AAAACCGTTA

CCGGTACTAA CCCGGTTTTC GCAGGTGCTA ACTACGCAGC GTGGGCGGTT

AACGTAGCCC AGGTAATCGA TTCCGAAACC GCAGACAACC TGGAAAAAAC

GACTGCGGCT CTGTCTATTC TGCCGGGTAT TGGTAGCGTG ATGGGTATTG

CAGATGGTGC AGTTCACCAC AACACGGAAG AAATCGTTGC GCAGTCTATC

GCTCTGTCTT CTCTGATGGT AGCACAGGCG ATCCCGCTGG TTGGTGAACT

GGTTGACATT GGCTTCGCGG CCTACAACTT CGTTGAATCC ATCATCAACC

TGTTCCAGGT TGTGCACAAC TCTTACAACC GTCCAGCTTA CTCTCCGGGT

CACAAAACCC AGCCGTTCCT GCACGACGGT TATGCGGTTT CTTGGAACAC

CGTTGAAGAC AGCATCATCC GTACTGGTTT CCAGGGTGAA TCTGGCCACG

ACATCAAAAT CACTGCTGAA AACACCCCGC TGCCGATCGC AGGTGTTCTC

CTGCCAACTA TTCCGGGTAA ACTGGACGTG AACAAATCCA AAACGCACAT

CTCCGTGAAC GGTCGTAAAA TCCGCATGCG TTGTCGTGCG ATTGATGGTG

ACGTTACTTT CTGTCGTCCG AAATCTCCGG TCTACGTAGG TAACGGTGTA

CATGCTAACC TCCATGTAGC GTTCCACCGT TCTTCTTCCG AGAAAATCCA

CTCCAACGAG ATCTCTAGCG ACTCTATCGG TGTTCTGGGT TACCAGAAAA

CCGTTGACCA CACCAAAGTG AACTCCAAAC TCAGCCTGTT CTTCGAAATC

AAATCT

SEQ ID N°2-编码在大肠杆菌中的CRM197-组氨酸标签的人工序列

GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC

TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT

GGT

GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG

CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA

TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA

GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA

CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT

ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC

ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT

AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG

TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC

AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA

GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG

CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC

ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA

GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA

ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT

CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG

TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG

TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT

GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA

TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC

TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT

GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT

CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA

AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT

GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT

CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC

CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC

GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT

TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG

CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC

AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT

TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT

CT

加下划线的：编码含有6个组氨酸的标签肽的序列

编码能被肠激酶识别的5个氨基酸(DDDDK)的15个核苷酸

SEQ ID N°3-用于大肠杆菌中的CRM197蛋白表达的人工序列

GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG

AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC

CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA

CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT

ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT

AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA

CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA

TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG

TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA

GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA

TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC

ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC

CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA

CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC

GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA

AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA

CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG

GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA

AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG

GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG

TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG

TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA

TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT

CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG

GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG

GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT

GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC

GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG

ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC

GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA

AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC

AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC

GAAATCAAAT CTTAATGA

型的：NdeI

和BamHI

限制性酶切位点

加下划线的：起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA TGA)

SEQ ID N°4-来自SEQ ID N°3的CRM197蛋白序列

GADDVVDSS KSFVMENFSS YHGTKPGYVD SIQKGIQKPK SGTQGNYDDD

WKEFYSTDNK YDAAGYSVDN ENPLSGKAGG VVKVTYPGLT KVLALKVDNA

ETIKKELGLS LTEPLMEQVG TEEFIKRFGD GASRVVLSLP FAEGSSSVEY

INNWEQAKAL SVELEINFET RGKRGQDAMY EYMAQACAGN RVRRSVGSSL

SCINLDWDVI RDKTKTKIES LKEHGPIKNK MSESPNKTVS EEKAKQYLEE

FHQTALEHPE LSELKTVTGT NPVFAGANYA AWAVNVAQVI DSETADNLEK

TTAALSILPG IGSVMGIADG AVHHNTEEIV AQSIALSSLM VAQAIPLVGE

LVDIGFAAYN FVESIINLFQ VVHNSYNRPA YSPGHKTQPF LHDGYAVSWN

TVEDSIIRTG FQGESGHDIK ITAENTPLPI AGVLLPTIPG KLDVNKSKTH

ISVNGRKIRM RCRAIDGDVT FCRPKSPVYV GNGVHANLHV AFHRSSSEKI

HSNEISSDSI GVLGYQKTVD HTKVNSKLSL FFEIKS

SEQ ID N°5-用于大肠杆菌中的融合蛋白CRM197-组氨酸标签的表达的人工序列

GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC

TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT

GGT GCCGATGACG

TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC

GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC

GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT

CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC

CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT

GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG

AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG

GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT

GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC

AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT

AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG

TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG

ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA

GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT

CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC

TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG

GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT

AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT

CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT

CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT

GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT

TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG

CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC

GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA

TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT

GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC

GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC

GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT

CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA

TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT

CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC

AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGA

型的：NdeI

和BamHI

限制性酶切位点

加下划线的：编码含有6个组氨酸的标签肽的84个核苷酸

GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC

TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT

编码被肠激酶识别的5个氨基酸(DDDDK)的15个核苷酸

起始密码子：ATG

终止密码子：TAA TGA

SEQ ID N°6-来自SEQ ID N°5的CRM197-组氨酸标签的蛋白序列

GADDVVDSSK SFVMENFSSY

HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE

NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT

EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR

GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL

KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN

PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA

VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV

VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI

TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF

CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH

TKVNSKLSLF FEIKS

型的：包含6个组氨酸(H)和肠激酶剪切位点(DDDDK)的标签序列(28个氨基酸)

SEQ ID N°7-从SEQ ID N°6去除标签之后的CRM197蛋白序列

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW

KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE

TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI

NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS

CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF

HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT

TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL

VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT

VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI

SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH

SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS

实验部分

实施例1-基因SEQ ID N°3和SEQ ID N°4的合成和构建体 pET9a-CRM197-标签的制备

合成基因通过把多个约27-43bp(有10-15bp的重叠区域)的寡核苷酸连接在一起而获得。这一步骤叫做“组装”。具体地，多个合成的寡核苷酸在末端被磷酸化以使得能够进行连接反应并且然后在Taq DNA连接酶存在下等摩尔量混合。所述酶在高温(45-65℃)下有活性且催化一个寡核苷酸的5’端位置的磷酸和另一个寡核苷酸的3’端位置的羟基基团之间的磷酸二酯键的形成。连接产物随后通过PCR扩增并且利用NdeI和BamHI酶被克隆到pET9a载体上。所使用的用于扩增的引物如下：

CRM197正向：5′ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3′

CRM197反向：5′cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3′

CRM197-His正向：5′ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3′

CRM197-His反向：5′cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3′

根据标准操作指南使用下面的量进行PCR(30个循环)：

3μl连接产物

5μl dNTP(4mM)

5μl 1ThermoPol反应缓冲液10×(New England Biolabs)

2μl正向引物(50pmol)

2μl反向引物(50pmol)

0.5μl Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)

并且添加32.5μl水到50μl体积。

含有SEQ ID N°1和SEQ ID N°2的PCR产物被纯化以去除引物、dNTP和酶，然后用NdeI和BamHI消化，因而获得序列为SEQ ID N°3和SEQ ID N°5的基因。平行地，1μg的质粒pET9a在同样条件下(37℃持续2小时)被相同的酶消化。最后，通过使用插入片段与载体比例为1∶1和3∶1在16℃持续12-16小时进行连接反应。该反应体系中的一等份被用于转化受体细菌细胞。

实施例2-细菌菌株和培养基

BL21AI(Invitrogen)和BL21(DE3)大肠杆菌菌株(Novagen)被用作CRM197-标签(SEQ ID N°5)表达的宿主。通常所使用的液体和固体培养基是经典的LB(Luria-Bertani；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：a Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY)。使用10ng的pET9a-CRM197-标签构建体(从实施例1获得)转化经合适处理的宿主菌株；使用合适的1mm杯和1.8kv的脉冲(GenePulser II，Bio-Rad)根据标准操作指南进行电穿孔。经电穿孔的细胞在SOC培养基(Sambrook等人，1989)中在37℃伴有振荡地生长45分钟，然后转移到添加了卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的固体LB培养基上以选择转化子。培养通常在有氧条件下在37℃伴有振荡(180rpm)地进行。

实施例3-表达

添加阿拉伯糖13mM(对于BL21AI菌株)和IPTG 1mM(对于BL21[DE3]菌株)到培养基中以诱导CRM197-标签SEQ ID N°5的表达。挑选转化的菌株后，用小体积(10mL)进行表达测试。单菌落生长于1mL的LB培养基中(含有卡那霉素)且合适地转移到新鲜培养基中，直到到达指数生长期(通过以分光光度计测量在600nm处的吸光度确定)。在吸光度值约为0.5-0.6OD时加入诱导剂且以不同的时间(1小时、3小时和15小时)诱导培养物。通过离心(4000g，15分钟)收集细胞并裂解所得的细胞沉淀以释放总蛋白。起初，在样品缓冲溶液(Bio-Rad)存在下持续煮沸样品5分钟进行简单地裂解并在SDS-PAGE电泳(10％丙烯酰胺)中分离20μL的每个样品。用考马斯亮蓝溶液对凝胶染色以看到蛋白条带且对应于CRM197-标签的过表达条带(约61kDa；图1)是可识别的。所述条带相当于丙烯酰胺凝胶中可见总蛋白的约40％。

在验证了目的蛋白的表达之后，随后使用大量培养物(500mL)和在最佳条件下(用阿拉伯糖13mM诱导3小时)进行测试。

实施例4-提取

为不借助于超声仪的使用而裂解细胞，制备已知组成的不同裂解溶液还改变溶液体积与样品体积的比值，并评价它们的效力。裂解缓冲液的组分是：Tris-HCl pH8(浓度在20-50mM范围内)、NaCl(浓度在100-150mM范围内)、浓度在0.5-1.5％范围内的去垢剂(Triton X-100、SDS、吐温20)和蛋白酶抑制剂(例如PMSF 1mM)。我们也评价了还原剂例如β-巯基乙醇或DTT(10-50mM)的作用。细胞沉淀在冰上伴随搅拌下裂解2小时。上清液(对应于可溶性的蛋白部分)通过离心(10,000g，30分钟)被分离并在SDS-PAGE凝胶中分析(图2)。重组蛋白在这部分是不可见的，因为其以包涵体形式积聚并聚集于裂解后获得的沉淀中。因此本发明包括溶解溶液的使用以从不可溶部分回收CRM197-标签(图2)。溶解溶液的组分是：Tris-HCl pH8(浓度在20-50mM范围内)、NaCl(浓度在100-150mM范围内)、0.5-1.5％的去垢剂(Triton X-100、SDS、吐温20)和6-7M尿素。含有包涵体的沉淀在温度为20-30℃的范围伴随搅拌下溶解2小时。通过离心回收上清液并在SDS-PAGE凝胶中分析，其中对应于CRM197-标签的条带是可见的(图2)。在用尿素溶解的样品中，与CRM197-标签有关的条带相当于凝胶中所包含的蛋白的约50％。

实施例5-纯化

用尿素溶解的样品(4℃贮存)经过亲和层析(HiTrap Chelating，GEHealthcare)以达到初步纯化和去除尿素以在柱中使蛋白复性的双重目的。

另一种合适的复性方法是透析，使用浓度递减的尿素溶液(从6-7M到0M)。根据制造商的说明调节和处理层析柱。就带有6个组氨酸标签的CRM197蛋白来讲，层析柱用镍离子(NiSO₄ 0.1M)复合。该方法包括三个阶段：1)去垢剂的去除；2)通过二阶段逆梯度去除尿素；3)用咪唑梯度洗脱(0-500mM)。样品在慢流速条件(0.5mL/分钟)下上样和复性，而其他阶段在流速为1mL/分钟下完成。获得的最终部分包含溶于Tris-HClpH 8、NaCl、咪唑的溶液中的CRM197蛋白(与标签融合)(图3表示一些层析部分)。

本发明包括后来通过凝胶过滤层析(Superdex 200柱，GE Healthcare)的纯化。在该步骤完成前，样品通过超滤(Amicon，Millipore)被浓缩并被脱盐以去除咪唑(HiTrap脱盐柱，GE Healthcare)。Superdex柱用含有Tris-HCl 50mM pH8、NaCl 150mM的缓冲液调节。在SDS-PAGE凝胶中分析部分并且那些含有纯的CRM197-标签的部分被汇集和冷冻。图4表示CRM197-标签纯化的各个阶段。

作为分子排阻层析的替代方法，CRM197-标签可通过离子交换层析纯化。在这种情况下，优选使用pH8的合适缓冲液调节的阴离子交换树脂。

实施例6-标签去除

除了纯化所需的6个组氨酸以外，标签序列(MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK)还包含能被特异性蛋白酶肠激酶(New England BioLabs)识别的剪切位点DDDDK。为获得没有标签(SEQ ID N°6)的纯的重组蛋白，CRM197-标签(SEQ ID N°5)与肠激酶一起孵育。消化反应在Tris-HCl 20mM pH 8、NaCl 50mM、CaCl22mM缓冲液中，使用相当于0.02％(w/w)的量的酶在22-24℃下持续进行18-24小时。图5表示SDS-PAGE凝胶：其中被消化的CRM197是可见的(位于泳道2)被分为两个结构域A和B(样品在破坏两个结构域之间的二硫键桥的还原剂存在下煮沸)。该操作方案包含随后通过亲和层析(在与上述用于CRM197-标签纯化的相同的柱中和使用相同的树脂)将CRM197(没有标签，SEQ ID N°6)与单独标签分离的步骤。

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