ITFI20090137A1 - Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. - Google Patents
Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. Download PDFInfo
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Description
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO: Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di CRM197 e derivati
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo della produzione di proteine d’interesse farmacologico mediante sequenze geniche artificiali, dette sequenze inserite in vettori d’espressione, sovraespressione delle corrispondenti proteine in microorganismi trasformati con detti vettori d’espressione e metodo di isolamento delle proteine espresse; in particolare si riferisce alla costruzione di un gene artificiale codificante il CRM197 intero e i suoi derivati, all’ espressione di CRM197 e dei suoi derivati in Escherichia coli e ad un metodo di isolamento e purificazione della proteina CRM197.
STATO DELL’ARTE
La proteina CRM197 (cross-reacting material 197, 58 kDa) à ̈ una variante della tossina difterica (DTx) caratterizzata da una singola mutazione che ne riduce la tossicità (ia variazione nucieotidica produce la sostituzione glicina-acido glutammico in posizione 52) (Uchida T. et al, 1973; Giannini G. et al, 1984). La proteina CRM197 mantiene tuttavia le stesse proprietà infiammatorie e immunostimolanti della tossina difterica e viene largamente impiegata nella preparazione di vaccini coniugati contro Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Hepatitis B virus and Haemophilus influenzae tipo b (WO 93/24148 and WO 97/00697, WO 02/055105). Il CRM197, come la tossina difterica wild-type, à ̈ costituito da due domini, A e B, legati insieme da un ponte disolfuro. Il dominio A (21 kDa) à ̈ quello catalitico mentre il dominio B (37 kDa) contiene un sottodominio per il legame al recettore cellulare ed un sottodominio per la traslocazione (Gill D.M. et al, 1971; Uchida T. et al, 1973). Analogamente a DTx, la proteina CRM197 à ̈ in grado di legare (tramite il dominio B) il recettore cellulare HB-EGF (heparin binding epidermal growth factor) che ne consente la traslocazione all’interno della cellula mediante endocitosi. L'esposizione al basso pH presente nell’endosoma provoca una cambiamento conformazionale essenziale per l’inserimento del dominio B nella membrana e per la successiva traslocazione del dominio A nel citosol (Papini E. et al, 1993; Cabiaux V. et al, 1997). Un evento essenziale per la traslocazione à ̈ la rottura di un legame peptidico tra i due domini A e B ad opera di una proteasi; questa digestione, insieme alla riduzione del ponte disolfuro, libera il dominio A rendendolo attivo. La proteina intera, sintetizzata come un unico polipeptide, à ̈, invece, inattiva (Gill D.M. et al, 1971).
Il dominio A della tossina difterica ha attività ADP-ribosilante e catalizza il trasferimento del gruppo ADP-ribosio dal NAD al fattore di elongazione 2 (EF-2) che interviene nella sintesi proteica. Il Complesso che si forma à ̈ inattivo e provoca, di conseguenza, un blocco della sintesi proteica eucariotica (Honjio T. et al, 1971). L’effetto citotossico della proteina à ̈ dovuto anche ad un’altra attività del dominio A capace di degradare in maniera aspecifica il DNA (Giannini G. et al, 1984). Questa attività endonucleasica, dipendente da cationi divalenti, viene mantenuta anche nel CRM197 (Bruce C. et al, 1990; Lee J.W. et al, 2005). La mutazione G52E modifica profondamente la struttura proteica del CRM197 e questo provoca da un lato la riduzione dell’attività ADP-ribosilante, dall’altro l’aumento dell’attività DNasica.
La produzione di CRM197, e di altre varianti non tossiche, à ̈ stata ed à ̈ tuttora effettuata utilizzando colture lisogeniche di Corynebacterium diphteriae infettate con particolari fagi β che presentano nel loro genoma il gene tox, codificante la tossina difterica (DTx), mutato. In particolari condizioni di crescita, la tossina difterica e le altre varianti vengono secrete nel terreno di coltura, recuperate attraverso filtrazione o precipitazione e, successivamente, purificate mediante tecniche cromatografiche (Cox J., 1975). Tuttavia, le procedure inizialmente utilizzate per la produzione sia di DTx che dei suoi derivati (CRMs) non garantiscono rese elevate. La produzione di CRM197 da utilizzare come coniugato nei vaccini non à ̈ economicamente vantaggiosa se si usano ceppi di Corynebacterium singoli lisogeni. Allo scopo di aumentare la produzione di CRM197 su scala industriale, sono stati successivamente isolati doppi e tripli mutanti lisogenici che contengono due o tre geni tox integrati nel cromosoma (Rappuoli R. et al, 1983; Rappuoli R., 1983). Nel 1990 Rappuoli descrive un processo per la produzione di proteine derivate da DTx che utilizza un ceppo di Corynebacterium che presenta due copie del gene tox mutato integrate nel cromosoma. Inoltre vengono definite le condizioni di crescita (terreno di coltura, concentrazione degli ioni ferro, temperatura di crescita, % di ossigeno, ecc) per aumentare le rese produttive (US patent 4925792, 1990). L’ accumulo di CRM197 nel terreno di coltura si verifica durante tutta la fase logaritmica di crescita fino all'inizio della fase stazionaria, raggiungendo un massimo intorno alle 20 ore dall’inizio della fermentazione. Successivamente, tuttavia, si osserva un calo drastico dovuto probabilmente a proteolisi.
La costruzione di ceppi lisogenici doppi o tripli per aumentare le rese di espressione à ̈ lunga e richiede una fase laboriosa di screening. Un’alternativa per ottenere elevati livelli di CRM197 utilizza uno specifico plasmide, pPX3511, ottenuto dalla fusione del gene fagico codificante il CRM197 con il plasmide pNG-22 (US Patent 5614382, 1995). In tal modo à ̈ possibile aumentare il numero di copie del gene (fino a 5-10/ cellula) senza dovere selezionare ceppi batterici plurilisogeni. L’espressione di CRM197, come nel caso dei ceppi di Corynebacterium infettati dal fago β 197<tox->, avviene in particolari terreni di coltura a basso contenuto di ferro. Nonostante si riducano i tempi della minipolazione genetica del ceppo batterico, le rese produttive di CRM197 non aumentano drasticamente rispetto all’uso di doppi lisogeni. Studi successivi sono stati effettuati nel tentativo di ottimizzare il terreno di coltura e le condizioni di crescita per aumentare le rese di espressione utlizzando i classici ceppi lisogenici di C. diphtheriae (WO/2005/056773; WO/2006/100108).
Gli studi riguardanti l’utilizzo di ospiti batterici alternativi a Corynebacterium sono, invece, limitati. In Escherichia coli sono state effettuate prove di espressione del dominio A, del dominio B e di alcune forme intermedie di DTx (dominio A insieme a porzioni di B). Mentre à ̈ stato possibile esprimere l’intero dominio A utilizzando il promotore tox naturale (Leong D. et al, 1983), i tentativi di ottenere una forma tronca di DTx deleta per una porzione al C-terminale di circa 50 amminoacidi sono stati inizialmente deludenti (Bishai W.R. et al, 1987). Si à ̈ osservato, infatti, che la presenza di porzioni del dominio B rendono instabile la proteina e ne favoriscono la proteolisi. Soltanto variando le condizioni di crescita, il ceppo ospite ed il tipo di promotore à ̈ stato possibile esprimere anche alcune forme tronche. Infine, l’espressione in Escherichia coli del solo dominio B à ̈ risultata ancora più complicata dal momento che tale dominio à ̈ altamente instabile e non viene espresso se non in fusione con un tag (Spilsberg B. et al, 2005). In letteratura non sono, perciò, reperibili lavori in cui venga descritta l’espressione in E. coli della tossina difterica intera o del CRM197.
Risulta pertanto evidente la necessità di disporre di metodi alternativi per la produzione di CRM197 (e suoi derivati) con rese economicamente vantaggiose in tempi brevi e se possibile mediante l’utilizzo di ospiti batterici alternativi a Corynebacterìum.
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI CRM197: cross reacting material
DTx: diphtheria toxin
DTA: diphtheria toxin A domain
DTB: diphtheria toxin B domain
EF-2: elongation factor-2
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
IPTG: isopropil-β-D-tiogalattopiranoside
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante una sequenza polinucleotidica artificiale (SEQ ID N° 1) specifica per la sovraespressione in Escherichia coli della proteina CRM197. Il gene può essere associato ad una sequenza tag e quindi consentire l’espressione in E. coli di una proteina di fusione CRM197-tag. L’invenzione riguarda inoltre plasmidi contenenti la sequenza SEQ ID N° 1 e ceppi di Escherichia coli geneticamente modificati mediante introduzione di detti plasmidi. Per un aspetto l’invenzione riguarda la proteina di fusione ricombinante CRM197-tag prodotta da E. coli geneticamente modificati di cui sopra.
L’invenzione riguarda inoltre il processo per la produzione della proteina ricombinante CRM197 (dominio A e B) con un tag N-terminale mediante espressione in E. coli geneticamente modificato come descritto sopra e la sua successiva purificazione. Il processo prevede anche la rimozione del tag allo scopo di ottenere la proteina CRM197 in forma nativa.
L' invenzione fornisce una nuova metodica per la produzione della proteina CRM197, e di proteine simili, in alternativa allutilizzo del microrganismo Corynebacterium diphteriae. Seguendo la procedura descritta dall’invenzione à ̈ possibile ottenere la proteina di interesse in quantità elevate sia per la ricerca di base che per applicazioni in campo medico-terapico. L’ invenzione presenta i seguenti vantaggi: i) utilizza un microrganismo, Escherichia coli, che à ̈ ampiamente usato per l’espressione di proteine eterologhe per applicazioni industriali e farmacologiche; ii) la genetica di E. coli à ̈ nota da anni e sono disponibili numerosi sistemi alternativi (vettori e ceppi) per l’espressione; iii) si tratta di un microrganismo non patogeno; iiii) l’utilizzo di E. coli permette di ridurre i tempi di produzione dal momento che cresce velocemente con elevate rese di biomassa.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1 rappresenta una corsa elettroforetica (SDS-PAGE 10%) in cui à ̈ visibile la banda corrispondente alla proteina avente SEQ ID N° 6 (CRM197-tag, 61 kDa) ottenuto da estratti proteici totali di diverse colture batteriche di E.coli: BL21AI (corsie 1, 2, 3, 4) e BL21(DE3) (corsie 5, 6, 7, 8). Le colture sono state sottoposte a vari tempi di induzione (1 h, 3h e overnight). Corsia M: marcatori di massa molecolare standard; corsie 1 e 5: campioni non indotti; corsie 2 e 6: campioni indotti 1 h; corsie 3 e 7: campioni indotti 3 h; corsie 4 e 8: campioni indotti overnight.
Figura 2 descrive le prove di solubilizzazione della proteina CRM197-tag dalla frazione insolubile. Tutte le prove utilizzano una soluzione contenente urea 6M. Corsia 1 e 2: frazione solubile ottenuta da colture non indotte (1) e indotte (2); corsia 3: marcatori di massa molecolare standard; corsia 4: soluzione di solubilizzazione e Tween 20 a 20 °C; corsia 5: soluzione di solubilizzazione e Triton X-100 a 20 °C; corsia 6: soluzione di solubilizzazione e riducente (βmercaptoetanolo 20 mM) a 20 °C; corsia 7: soluzione di solubilizzazione e SDS a 20 °C; corsia 8: soluzione di solubilizzazione e Triton X-100 a 30 °C; corsia 9: soluzione di solubilizzazione e riducente a 30 °C.
Figura 3 rappresenta una corsa elettroforetica di alcune frazioni ottenute dopo la cromatografia di affinità . Corsia 1: campione solubilizzato con urea 6M pre colonna; corsia 2: flow through non legato in colonna; corsie 3 e 4: prime frazioni eluite con il gradiente di imidazolo; corsie 5-10: frazioni corrispondenti alla porzione centrale del picco di eluizione.
Figura 4 rappresenta un gel SDS-PAGE (10%) in cui sono visibili i passaggi di purificazione. Corsia M: marcatori di massa molecolare standard; corsia 1: frazione solubile; corsia 2: estratto totale solubilizzato con urea; corsia 3: campione dopo la cromatografia di affinità ; corsia 4: campione dopo la cromatografia a gel-filtrazione.
Figura 5 rappresenta la corsa elettroforetica di un campione di CRM197 pre e post digestione con enterochinasi. M: marcatori di massa molecolare standard; corsia 1: CRM197-tag non trattato con enterochinasi; corsia 2: CRM197-tag digerito a 24 °C per 20 h. I campioni sono stati bolliti in presenza di riducente. Sono visibile le bande corrispondenti al dominio B, al dominio A e al dominio A-tag (rispettivamente a, b, c).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La sequenza corrispondente al CRM197 intero descritta da Giannini G. et al (1984), priva della sequenza segnale naturale per l’esporto fuori dalla cellula, à ̈ stata utilizzata per ricavare, tramite il software Leto (Entelechon GmbH Regensburg, Germany), una sequenza polinucleotidica SEQ ID N° 1 ottimizzata per l’espressione in E. coli.
La sequenza genica SEQ ID N° 1 può essere inoltre associata, sia all’estremità 5’ che 3’, ad una sequenza oligonucleotidica che codifichi per un polipeptide tag per favorirne la stabilità citoplasmatica e/o la successiva purificazione usando matrici e resine con elevata affinità per i vari peptidi tag. Sono note numerose sequenze nucleotidiche che codificano per polipeptidi tag. Tra queste, sono incluse le sequenze nucleotidiche codificanti per 6, 8, 10 istidine (H) (His-tag), per il tag MASMTGGQQMG (T7-tag), per NDYKDDDDKC (FLAG-tag), per WSHPQFEK (Strep-tag), per YPYDVPDYA (HAT-tag), per KETAAAKFERQHMDS (S-tag), per NEQKLISEEDLC (Myc-tag).
II gene SEQ ID N° 1 può essere anche associato ad altre sequenze tag quali ad esempio quelle codificanti per la tioredoxina (Trx), la glutatione-S-transferasi (GST), la maliose binding protein (MBP), la cellulose binding protein (CBD) e la chitin binding protein (CBP).
Le sequenze tag possono essere opportunamente associate a specifiche sequenze di taglio per il riconoscimento da parte di opportuni enzimi capaci successivamente di rimuovere il tag. Preferibilmente per la rimozione del tag si impiegano enterochinasi, trombina, Fattore Xa o furina le cui sequenze peptidiche di taglio riconosciute e più utilizzate sono rispettivamente DDDDK, LVPRGS, IE/DGR, RXXR.
In una forma di realizzazione preferita il gene SEQ ID N° 1 à ̈ associato ad un polinucleotide che codifica per un tag polistidinico. La sequenza his-tag può essere aggiunta sia all’estremità 5’-terminale che 3’-terminale.
Esempi di sequenze di . peptidi his-tag sono le seguenti: MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR, MGSSHHHHHHSSG, MGSSHHHHHHSSGL, MGSGHHHHHH, MGHHHHHHHHHHSSG, MHHHHHHSSG, ALEHHHHHH, AALEHHHHHH.
Una forma di realizzazione particolarmente preferita à ̈ la SEQ ID N° 2 in cui alla sequenza SEQ ID N° 1 à ̈ stata aggiunta all’estremità 5’-terminale una sequenza di 84 nucleotidi, codificante per la sequenza contenente 6 istidine MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR e la sequenza di taglio per l’enterochinasi DDDDK.
Preferibilmente, ed ovviamente, sequenze comprendenti la SEQ ID N° 1 possono essere completate con codoni d’inizio e di stop e con opportune sequenze che codifichino per i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione impiegati per il clonaggio.
Geni comprendenti la SEQ ID N° 1 possono essere preparati mediante sintesi chimica e poi clonati in opportuni vettori d’espressione. In una particolare forma di realizzazione le sequenze artificiali SEQ ID N° 1 e 2 sono state sinteticamente preparate mediante procedura di assemblaggio ( assembly ) per ottenere le SEQ ID N° 3 e 5 rispettivamente che codificano rispettivamente per le proteine aventi sequenze SEQ ID N° 4 e 6.
La presente invenzione riguarda inoltre vettori d’espressione (plasmidi) comprendenti la sequenza SEQ ID N° 1 e preferibilmente suoi derivati con tag e siti di riconoscimento specifici per enzimi di restrizione e/o proteasi.
Preferibilmente per il clonaggio del gene artificiale comprendente la SEQ ID N° 1 si utilizza un plasmide della serie pET. In particolare, il vettore pET9a contiene il promotore T7 specifico per l’enzima RNA polimerasi del fago T 7. Tale polimerasi à ̈ altamente efficiente (più dell’ RNA polimerasi batterica) e specifica (non riconosce promotori batterici). Oltre al plasmide pET9a, risultano adatti al processo anche altri vettori della serie pET (Novagen) come pET3a, pET3b, pET3c, pET5a, pET5b, pET5c, pET9b, pET9c, pET12a, pET12b, pET12c, pET17b e, in generale, tutti i vettori che presentano il promotore forte del fago T7 (ad esempio pRSETA, B e C, Invitrogen e pTYB1, pTYB2, pTYB3 e pTYB4, New England Biolabs).
Per il clonaggio à ̈ preferibile impiegare A/del e BamH\ come enzimi di restrizione. Il costrutto così ottenuto può essere utilizzato per trasformare ceppi di Escherìchia coli. Detti ceppi di E. coli possono essere caratterizzati da alternativi sistemi di regolazione dell’espressione genica che sfruttano diversi induttori come, ad esempio, l IPTG (isopropil-β-D-tiogalattopiranoside) o l arabinosio.
Nel caso si impieghino plasmidi del tipo pET che contengano il promotore T7 specifico per l’enzima RNA polimerasi del fago T7 allora i ceppi di E. coli adatti ad essere trasformati con un costrutto pET contenente la SEQ ID N° 1 possono essere tutti quelli in grado di fornire l’enzima RNA polimerasi di T7. Preferibilmente Escherichia coli tipo B come ad esempio ER2566, ER2833, ER3011, ER3012, BL21AIâ„¢, BL21(DE3), BL21Starâ„¢(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21(DE3)pLys, C41(DE3), C43(DE3), BLR(DE3), B834(DE3 Tunerâ„¢(DE3), o Escherìchia coli derivati da K-12 come HMS174(DE3), AD494(DE3), Origamiâ„¢(DE3), NovaBlue(DE3), Rosettaâ„¢(DE3). La trasformazione dei ceppi batterici à ̈ preferibilmente fatta per elettroporazione ma anche altre tecniche note possono essere altrettanto adatte.
In particolare forma realizzativa i geni aventi SEQ ID N° 3 e 5, comprendenti la SEQ ID N° 1 e 2 rispettivamente, sono stati sintetizzati chimicamente e poi clonati in un particolare plasmide della serie pET. Il vettore per il clonaggio e l’espressione utilizzato à ̈ il pET9a (Novagen, Darmstadt, Germany) caratterizzato da un’origine di replicazione pBR322 che garantisce alto numero di copie per cellula; un marker di selezione per mantenere il plasmide all’interno dell’ospite batterico (gene kan per la resistenza alla kanamicina); una regione polylinker contenente numerosi siti di restrizione adatti al clonaggio; un promotore specifico inducibile per regolare la sovraespressione di CRM197.
Per clonare il gene artificiale all’interno del plasmide (nel polylinker) sono stati utilizzati Nde I e BamH\ come enzimi di restrizione ed il corretto orientamento e posizione à ̈ stato verificato tramite sequenziamento. Il costrutto così ottenuto à ̈ stato utilizzato per trasformare tramite elettroporazione alcuni ceppi di E. coli, selezionando su piastre Petri (contenenti LB solido addizionato di kanamicina) le colonie trasformate. Tra i ceppi batterici adatti all’espressione del CRM197 clonato nel vettore pET9a, sono stati scelti due derivati di Escherichia coli tipo B: BL21AI e BL21(DE3). Entrambi contengono integrata nel cromosoma una copia del gene codificante l’RNA polimerasi del fago T7, sotto il controllo di un promotore inducibile. Tale enzima, una volta presente nella cellula, à ̈ in grado di attivare la trascrizione del gene artificiale CRM197 o CRM197-tag clonato a valle del promotore pT7. Il ceppo BL21AI presenta il gene codificante l’RNA polimerasi di T7 posto sotto il controllo del promotore PBAD, di conseguenza l’induzione avviene grazie all’aggiunta di arabinosio nel terreno di coltura. Il ceppo BL21(DE3), invece, à ̈ stato ottenuto grazie all’integrazione nel genoma batterico di un profago λ(DΕ3) contenente il gene per l’RNA polimerasi di T7 sotto il controllo del promotore lac. In quest’ultimo caso l’induzione a cascata del sistema di espressione viene attivata dall’IPTG, analogo del lattosio. Altri ceppi di E. coli adatti per la trasformazione con il costrutto pET9a-CRM197 e per l’espressione della proteina di interesse sono i derivati di BL21(DE3), come BL21Starâ„¢(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21(DE3)pLys, i derivati di ER2566 e tutti i ceppi modificati, B o K-12, contenenti nel genoma una copia del gene codificante l’RNA polimerasi di T7.
Avvenuta la selezione dei ceppi di E. coli trasformati, sono state effettuate le prove di espressione considerando diverse condizioni di crescita e di induzione. Obiettivo delle prove preliminari à ̈ individuare la metodica che ha consentito di ottenere elevati livelli della proteina CRM197 rispetto alle proteine batteriche (possibilmente fino a circa il 30%). I fattori considerati sono il terreno di coltura, la temperatura di crescita (30 °C e 37 °C), la concentrazione di induttori ed il tempo di induzione. Il terreno di coltura utilizzato à ̈ il classico LB, ma possono essere usati anche altri terreni ricchi che consentano elevata produzione di biomassa. Quando si sovraesprime una proteina ricombinante, il prodotto può essere secreto nel terreno (se dotato di una specifica sequenza segnale) oppure si accumula nel citoplasma in forma solubile o sotto forma di corpi di inclusione insolubili. La localizzazione proteica influenza il successivo processo di purificazione. Nel caso specifico della proteina di fusione CRM197-tag avente SEQ ID N° 6, ottenuta da trascrizione del gene sintetico rappresentato da SEQ ID N° 5 (con his-tag), à ̈ stato osservato che la proteina viene espressa dallorganismo in forma insolubile (corpi di inclusione) e si accumula in maniera molto conveniente ai fini di una produzione industriale. Il protocollo di espressione descritto dall’invenzione prevede l’accumulo del CRM197-tag in tale forma insolubile e descrive i passaggi necessari per recuperarlo in forma solubile e rinaturarlo in modo da ottenere la proteina nella forma biologicamente attiva. Inoltre l’invenzione prevede due passaggi di purificazione tramite cromatografia e uno stadio finale di rimozione del tag. La scelta della tecnica cromatografica più adatta viene effettuata in base alle caratteristiche chimico-fisiche del CRM197-tag, quali il pI (punto isoelettrico), la composizione amminoacidica e le dimensioni. La fusione con un tag permette di purificare la proteina utilizzando una particolare resina (sia in colonna che in bach) ad alta affinità per il tag stesso. La presenza del tag à ̈ utile sia per aumentare la stabilità della proteina nel citoplasma che per la sua successiva purificazione.
Per un aspetto quindi l’invenzione riguarda la proteina ricombinante di fusione CRM197-tag codificata da un polinucleotide comprendente la SEQ ID N° 1 ed una breve sequenza codificante per un polipeptide tag.
Particolarmente preferita à ̈ una proteina ricombinante di fusione di sequenza SEQ ID N° 6, codificata da un nucleotide comprendente la SEQ ID N° 2.
La proteina ricombinante di fusione CRM197-tag di cui sopra à ̈ potenzialmente utile per impiego medico per il trattamento di tumori, quali ad esempio tumore al seno, alle ovaie e alla prostata, o per la riduzione di placche aterosclerotiche; altresì la suddetta proteina di fusione può essere utile come carrier coniugato per vaccini quali quelli contro Pneumococco Haemophilus influenzae, Meningococco, Streptococcus Pneumoniae ed altri batteri patogeni.
L’invenzione riguarda inoltre un processo per la produzione di una proteina CRM197-tag, detto processo comprendente l’impiego di ceppi di E. coli modificati come descritti sopra.
Preferibilmente detto processo comprende:
(i). espressione opportunamente indotta della proteina mediante colture di E.
coli come descritto sopra;
(ii). estrazione mediante
a. lisi in tampone Tris-HCI 20-50 mM pH 7.5-8.5, NaCI 100-150 mM, detergente 0.5-1.5 % e inibitore di proteasi 0.5-1.5% per 1.5-2.5 ore a 0-5 °C in agitazione;
b. separazione del surnatante dal residuo solido (pellet);
c. trattamento del residuo solido ottenuto dal passaggio precedente con un tampone solubilizzante a pH 7.5-8.5 contenente Tris-HCI 20-50 mM, NaCI 100-150 mM, detergente 0.5-1.5 % e urea 5-7 M per 1.5-2.5 ore a 20-30°C in agitazione;
d. separazione del surnatante dal residuo solido, il surnatante contiene la proteina CRM197-tag solubilizzata;
(iii). purificazione e rinaturazione della proteina ottenuta dal passaggio (ìi) mediante
a. cromatografia di affinità o dialisi;
b. cromatografia a gel filtrazione.
Nella forma di realizzazione in cui E. coli à ̈ stato modificato con un plasmide comprendente la SEQ ID N° 2, come ad esempio la SEQ ID N° 5, la proteina CRM197-tag ricombinante viene prodotta in fusione con una sequenza tag contenente 6 istidine che ne consente l’espressione e favorisce la successiva purificazione mediante cromatografia di affinità . E’ possibile variare la quantità di CRM197 e di proteine simili che si ottengono seguendo tale procedura modulando i parametri che regolano i livelli di espressione (terreno di coltura, temperatura di crescita, tempo di induzione, ecc). Nel caso in cui si usino ceppi di E. coli BL21AI o BL21(DE3) trasformati con l’opportuno plasmide, le migliori condizioni di espressione si ottengono dopo 3 ore di induzione (Fig. 1) e il ceppo BL21AI trasformato à ̈ preferito.
Nel caso specifico in cui à ̈ stata impiegata la SEQ ID N° 5, il CRM197-tag ricombinante avente SEQ ID N° 6 espresso presenta un tag di 28 amminoacidi contenente 6 istidine con elevata affinità per ioni di metalli divalenti (rame, nichel, ecc); questa caratteristica viene sfruttata per favorire la purificazione della proteina di fusione che viene espressa in forma insolubile. La successiva rimozione di proteine contaminanti che sono rimaste associate alla proteina di interesse può essere eseguita tramite cromatografia a gel-filtrazione nel caso in cui le masse molecolare siano molto diverse tra loro.
La resa di espressione della proteina CRM197-tag che si ottiene seguendo il protocollo descritto dall’invenzione à ̈ 260 ± 50 mg/L di coltura (in terreno LB). Utilizzando opportuni terreni arricchiti e modificati la resa può essere anche superiore. E’ importante ricordare, inoltre, che la metodica di lisi ed estrazione descritta dall’invenzione à ̈ semplice ed economica e non richiede tamponi particolari nà ̈ la fase classica di sonicazione. Tutto questo à ̈ stato pensato per avere un protocollo adatto ad un processo industriale (scale-up).
Infine, l’invenzione descrive la procedura di rimozione del tag che ha avuto un duplice effetto: consentire l’espressione del CRM197 aumentandone la stabilità e favorirne la purificazione.
L’invenzione quindi riguarda inoltre un processo per la preparazione di CRM197, detto processo caratterizzato dall’impiego di ceppi di E. coli modificati come descritto sopra.
Preferibilmente il processo per la produzione di CRM197 di cui sopra prevede l’espressione della proteina di fusione CRM197-tag come descritta sopra e successiva rimozione del tag mediante digestione con un opportuno enzima.
Nel caso di CRM197-tag di sequenza SEQ ID N° 6 l’opportuno enzima per la rimozione del tag à ̈ l enterochinasi e la digestione à ̈ preferibilmente eseguita a 2025°C per 18-24 ore in tampone Tris-HCI 10-20 mM pH 7.5-8.5, NaCI 40-60 mM, CaC 1.5-2.5 mM ed enzima ad una concentrazione variabile tra 0.01-0.03 % in peso (w/w).
Dopo rimozione del tag la proteina senza tag à ̈ preferibilmente purificata tramite cromatografia di affinità .
La proteina ricombinante CRM197 SEQ ID N° 7 ottenuta mediante il metodo della presente invenzione à ̈ identica in struttura e funzione a CRM197 prodotto con metodologie note, à ̈ ottenuta in forma nativa e quindi attiva e può essere impiegata quindi per gli usi noti.
La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.
SEQUENZE SEQ ID N° 1 - Sequenza artificiale codificante per CRM197 ottimizzato per espressione in E.coli
GGTGCCGAT GACGTGGTTG ACTCTTCCAA AAGCTTCGTC ATGGAAAACT TCAGCTCCTA TCACGGCACT AAACCGGGTT ATGTCGACAG CATCCAGAAA GGCATCCAGA AACCGAAATC TGGCACTCAG GGTAACTATG ACGACGACTG GAAAGAGTTC TACTCTACCG ACAACAAATA CGACGCGGCT GGTTATTCTG TGGACAACGA AAACCCGCTG TCTGGTAAAG CTGGTGGTGT TGTTAAAGTG ACCTACCCGG GTCTGACCAA AGTTCTGGCT CTGAAAGTGG ACAACGCCGA AACCATCAAA AAAGAACTGG GTCTGTCTCT GACCGAACCG CTGATGGAAC AGGTAGGTAC CGAGGAATTC ATCAAACGTT TTGGTGATGG TGCGTCCCGT GTTGTACTGT CTCTGCCATT TGCCGAAGGT TCTAGCTCTG TCGAGTACAT CAACAACTGG GAGCAGGCCA AAGCTCTGTC TGTGGAACTG GAAATCAACT TCGAGACCCG TGGTAAACGT GGTCAGGACG CAATGTATGA ATACATGGCA CAGGCTTGCG CGGGTAACCG TGTACGTCGT TCTGTAGGTT CTTCCCTGTC TTGCATCAAC CTGGACTGGG ATGTCATCCG TGACAAAACC AAAACCAAAA TCGAGTCCCT GAAAGAGCAC GGTCCGATCA AAAACAAAAT GAGCGAATCT CCGAACAAAA CGGTCTCTGA GGAAAAAGCG AAACAGTACC TGGAAGAATT CCATCAGACC GCCCTGGAAC ACCCGGAACT GTCTGAACTG AAAACCGTTA CCGGTACTAA CCCGGTTTTC GCAGGTGCTA ACTACGCAGC GTGGGCGGTT AACGTAGCCC AGGTAATCGA TTCCGAAACC GCAGACAACC TGGAAAAAAC GACTGCGGCT CTGTCTATTC TGCCGGGTAT TGGTAGCGTG ATGGGTATTG CAGATGGTGC AGTTCACCAC AACACGGAAG AAATCGTTGC GCAGTCTATC GCTCTGTCTT CTCTGATGGT AGCACAGGCG ATCCCGCTGG TTGGTGAACT GGTTGACATT GGCTTCGCGG CCTACAACTT CGTTGAATCC ATCATCAACC TGTTCCAGGT TGTGCACAAC TCTTACAACC GTCCAGCTTA CTCTCCGGGT CACAAAACCC AGCCGTTCCT GCACGACGGT TATGCGGTTT CTTGGAACAC CGTTGAAGAC AGCATCATCC GTACTGGTTT CCAGGGTGAA TCTGGCCACG ACATCAAAAT CACTGCTGAA AACACCCCGC TGCCGATCGC AGGTGTTCTC CTGCCAACTA TTCCGGGTAA ACTGGACGTG AACAAATCCA AAACGCACAT CTCCGTGAAC GGTCGTAAAA TCCGCATGCG TTGTCGTGCG ATTGATGGTG ACGTTACTTT CTGTCGTCCG AAATCTCCGG TCTACGTAGG TAACGGTGTA CATGCTAACC TCCATGTAGC GTTCCACCGT TCTTCTTCCG AGAAAATCCA CTCCAACGAG ATCTCTAGCG ACTCTATCGG TGTTCTGGGT TACCAGAAAA CCGTTGACCA CACCAAAGTG AACTCCAAAC TCAGCCTGTT CTTCGAAATC AAATCT
SEQ ID N° 2 - Sequenza artificiale codificante per CRM197-HisTag in E.coli
ATGGGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACG GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CT
Sottolineato: sequenza codificante il peptide tag contenente 6 istidine
Corsivo sottolineato : 15 nucleotidi che codificano per i 5 aa riconosciuti dallenterochinasi (DDDDK)
SEQ ID N° 3 - Sequenza sintetica per l espressione della proteina CRM197 in E. coli
CATATGGGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGAGG ATCC
In grassetto i siti di restrizione NdeI (CATATG) e BamHI (GGATCC).
Sottolineati i codoni start (ATG) e stop (TAA TGA).
SEQ ID N° 4 - Sequenza proteica CRM197 da SEQ ID N° 3
MGADDVVDSS KSFVMENFSS YHGTKPGYVD SIQKGIQKPK SGTQGNYDDD WKEFYSTDNK YDAAGYSVDN ENPLSGKAGG WKVTYPGLT KVLALKVDNA ETIKKELGLS LTEPLMEQVG TEEFIKRFGD GASRWLS.LP FAEGSSSVEY INNWEQAKAL SVELEINFET RGKRGQDAMY EYMAQACAGN RVRRSVGSSL SCINLDWDVI RDKTKTKIES LKEHGPIKNK MSESPNKTVS EEKAKQYLEE FHQTALEHPE LSELKTVTGT NPVFAGANYA AWAVNVAQVI DSETADNLEK TTAALSILPG IGSVMGIADG AVHHNTEEIV AQSIALSSLM VAQAIPLVGE LVDIGFAAYN FVESIINLFQ WHNSYNRPA YSPGHKTQPF LHDGYAVSWN TVEDSIIRTG FQGESGHDIK ITAENTPLPI AGVLLPTIPG KLDVNKSKTH ISVNGRKIRM RCRAIDGDVT FCRPKSPVYV GNGVHANLHV AFHRSSSEKI HSNEISSDSI GVLGYQKTVD HTKVNSKLSL FFEIKS
SEQ ID N° 5 - Sequenza sintetica per l'espressione della proteina di fusione CRM197-HisTag in E. coli
CATATGGGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAAGGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGA GG ATCC
In grassetto i siti di restrizione NdeI (CATATG) e BamHI (GGATCC).
Sottolineati gli 84 nucleotidi che codificano per il peptide tag contenente 6 istidine: ATGGGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA
Corsivo sotolineato : 15 nucleotidi che codificano per i 5 aa riconosciuti dall'enterochinasi (DDDDK)
Codone di inizio: ATG
Codoni di stop: TAA TGA
SEQ ID N° 6 - Sequenza proteica CRM197-HisTag da SEQ ID N° 5
MGGSHHHHHH GMASMTGGQQ MGRDDDDK GADDWDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRWLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS
In grassetto la sequenza tag (28 amminoacidi) contenente le 6 istidine (H) e il sito di taglio per l’enterochinasi (DDDDK).
SEQ ID N° 7 - Sequenza proteica CRM197 dopo rimozione del tag da SEQ ID N° 6
GADDWDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRWLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS
PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1 - Sintesi dei geni SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4 e preparazione del costrutto pET9a-CRM197-tag
I geni sintetici sono stati ottenuti legando insieme multipli oligonucleotidi di circa 27-43 bp (con regioni overlapping di 10-15 bp). Questa procedura à ̈ detta “assembly†. In particolare, i vari oligonucleotidi sintetici sono stati fosforilati alle estremità per consentire la reazione di ligazione e sono stati mescolati in quantità equimolari in presenza dellenzima Taq DNA Ligasi. Tale enzima à ̈ attivo ad elevate temperature (45 -65 °C) e catalizza la formazione di legami fosfodiestere tra il fosfato al 5’ di un oligonucleotide ed il gruppo ossidrilico in posizione 3’ di un altro oligonucleotide. Il prodotto di ligazione à ̈ stato quindi amplificato mediante PCR e clonato nel vettore pET9a utilizzando gli enzimi NdeI e BamHI. I primers utilizzati per l'amplificazione sono i seguenti:
CRM 197 fwd : 5' ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3' CRM197 rev: 5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3'
CRM197-HiS fwd: 5' ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3'
CRM197-HiS rev: 5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3 ’
La reazione di PCR (30 cicli) Ã ̈ stata eseguita secondo i protocolli standard
utilizzando le seguenti quantità :
3 Î1⁄4l prodotto di ligazione
5 Î1⁄4l dNTPs (4 mM)
5 Î1⁄4l IThermoPol Reaction Buffer 10X (New England Biolabs)
2 Î1⁄4l fwd_primer (50 pmol)
2 Î1⁄4l rev_primer (50 pmol)
0.5 Î1⁄4l Vent DNA Polymerase (New England Biolabs)
aggiunti 32.5 pi di acqua fino ad un volume di 50 Î1⁄4l
I prodotti di PCR comprendenti le SEQ ID N° 1 e 2 sono stati purificati per eliminare i primers, i dNTPs e l’enzima, quindi digeriti con NdeI e BamHI, ottenendo così i geni di sequenze SEQ ID N° 3 e 5. In parallelo, 1 Î1⁄4g del plasmide pET9a à ̈ stato digerito con gli stessi enzimi nelle medesime condizioni (37 °C per 2 ore). E’ stata infine effettuata la reazione di ligazione a 16 °C per 12-16 ore utilizzando il rapporto inserto:vettore uguale a 1:1 e 3:1. Un'aliquota di tale reazione à ̈ stata utilizzata per trasformare le cellule batteriche recipienti.
ESEMPIO 2 - Ceppi batterici e terreni
I ceppi di E. coli BL21AI (invitrogen) e BL21(DE3) (Novagen) sono stati utilizzati come ospiti per l’espressione di CRM197-tag (SEQ ID N° 5). Il terreno di coltura liquido e solido (addizionato di agar) usato generalmente à ̈ il classico LB (Luria-Bertani; Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). I ceppi ospiti, opportunamente trattati, sono stati trasformati utilizzando 10 ng del costrutto pET9a-CRM197-tag (ottenuto nell’ esempio 1); l’elettroporazione à ̈ stata eseguita secondo protocollo standard usando apposite cuvette da 1 mm ed un impulso di 1,8 kV (Gene Pulser II, Bio-Rad). Le cellule elettroporate sono state cresciute per 45 min in terreno SOC (Sambrook et al, 1989) a 37 °C in agitazione, quindi trasferite su terreno solido LB addizionato di kanamicina (concentrazione finale 50 Î1⁄4g/mL) per selezionare i trasformanti. Le crescite sono state generalmente effettuate in condizioni di aerobiosi, a 37 °C in agitazione (180 rpm).
ESEMPIO 3 - Espressione
Per indurre l’espressione di CRM197-tag SEQ ID N° 5 à ̈ stato addizionato al terreno di coltura arabinosio 13 mM (nel caso del ceppo BL21AI) e IPTG 1 mM, nel caso di BL21(DE3). Avvenuta la selezione dei ceppi trasformati, sono state effettuate le prove di espressione in piccoli volumi di coltura (10 mL ). Singole colonie sono state cresciute in 1 mL di terreno LB (e kanamicina) e rilanciate opportunamente in terreno fresco fino al raggiungimento della fase esponenziale di crescita (confermata mediante misura dell’assorbanza a 600 nm allo spettrofotometro). Gli induttori sono stati aggiunti a valori di assorbenza di circa 0,5-0, 6 OD e le colture sono state indotte per diversi tempi (1h, 3h e 15h). Le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione (4000g per 15 min) ed i pellets cellulari ottenuti sono stati lisati per rilasciare le proteine totali. Inizialmente la lisi à ̈ stata effettuata semplicemente bollendo per 5 min i campioni in presenza di “sample buffer solution†(Bio-Rad) e 20 Î1⁄4Î ̄ di ciascun campione sono stati separati in elettroforesi SDS-PAGE (10% di acrilammide). I gel sono stati colorati con una soluzione di comassie brilliant blu per visualizzare le bande proteiche ed à ̈ stato possibile evidenziare una banda di sovraespressione corrispondente al CRM197-tag (circa 61 kDa; Fig.1). Una volta verificata l’avvenuta espressione della proteina di interesse, sono state eseguite le prove successive con quantitativi maggiori di coltura (500 mL) e nelle condizioni ottimali (induzione per 3h con arabinosio 13 mM).
ESEMPIO 4 - Estrazione
Per lisare le cellule evitando l’uso del sonicatore sono state preparate diverse soluzioni di lisi a composizione nota ed à ̈ stata valutata la loro efficacia, variando anche il rapporto tra volume di soluzione e volume di campione. I componenti del tampone di lisi sono: Tris-HCI pH 8 (concentrazione variabile tra 20 e 50 mM), NaCI (concentrazione tra 100 e 150 mM), un detergente alla concentrazione tra 0,5-1 ,5% (Triton X-100, SDS, Tween 20) e un inibitore di proteasi (ad esempio PMSF 1 mM). E’ stato valutato anche l’effetto di un agente riducente come il βmercaptoetanolo o il DTT (10-50 mM). I pellets cellulari vengono lisati in agitazione per 2 ore in ghiaccio. Il surnatante (corrispondente alla frazione proteica solubile) viene separato tramite centrifugazione (10.000 g per 30 min) ed analizzato in gel SDS-PAGE (Fig. 2). La proteina ricombinante non à ̈ visibile in tale frazione perchà ̈ si accumula sotto forma di corpi di inclusione e aggrega nel pellet ottenuto dopo la lisi. L’invenzione prevede, di conseguenza, l’utilizzo di una soluzione di solubilizzazione per recuperare il CRM197-tag (Fig. 2). I componenti di tale soluzione sono: Tris-HCI pH 8 (concentrazione variabile tra 20 e 50 mM), NaCI (concentrazione tra 100 e 150 mM), un detergente 0,5-1 ,5% (Triton X-100, SDS, Tween 20) e urea 6 M. I pellets contenenti i corpi di inclusione vengono solubilizzati per 2 ore in agitazione a temperatura tra i 20-30 °C. Il surnatante viene recuperato tramite centrifugazione e analizzato in gel SDS-PAGE, dove à ̈ visibile la banda corrispondente al CRM197-tag (Fig. 2)
ESEMPIO 5 - Purificazione
Il campione solubilizzato con urea (conservato a 4 °C) viene sottoposto a cromatografia di affinità (HiTrap Chelating, GE Healthcare) con il duplice scopo di effettuare una prima purificazione e di eliminare l'urea per rinaturare in colonna la proteina. Un altro metodo di rinaturazione adatto à ̈ la dialisi, utilizzando una soluzione a concentrazione decrescente di urea (da 6 M a 0 M). La colonna cromatografica à ̈ stata condizionata e trattata secondo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. Nel caso della proteina CRM197 dotata del tag esaistidinico, la colonna à ̈ stata complessata a ioni nichel (NiSO40,1M). La procedura prevede 3 fasi: 1) eliminazione del detergente; 2) eliminazione dell'urea mediante gradiente inverso a due step (6 M-2 M e 2 M-0 M); 3) eluizione con un gradiente di imidazolo (0-500 mM). Il caricamento del campione e la rinaturazione vengono effettuate a flusso lento (0,5 mL/min), mentre le altre fasi vengono effettuate a flusso di 1 mL/min. Le frazioni finali ottenute contengono la proteina CRM197 (fusa con il tag) in una soluzione di Tris-HCI pH 8, NaCI, imidazolo (Fig. 3 rappresenta alcune frazioni cromatografiche).
L’invenzione prevede una successiva purificazione tramite cromatografia a gel filtrazione (colonna Superdex 200, GE Healthcare). Prima di effettuare tale passaggio, il campione viene concentrato per ultrafiltrazione (Amicon, Millipore) e desalato per eliminare l’imidazolo (colonna HiTrap Desalting, GE Healthcare). La colonna Superdex viene condizionata con tampone Tris-HCI 50 mM pH 8, NaCI 150 mM. Le frazioni vengono analizzate in gel SDS-PAGE e quelle contenenti il CRM197-tag puro vengono unite e congelate. In Fig. 4 sono descritte le varie fasi di purificazione del CRM197-tag.
ESEMPIO 6 - Rimozione del tao
La sequenza tag (MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK) contiene, oltre alle 6 istidine necessarie per la purificazione, anche un sito di taglio riconosciuto da una specifica proteasi, l’enterochinasi (New England BioLabs): DDDDK. Per ottenere la proteina ricombinante pura priva di tag (SEQ ID N° 6), si procede incubando il CRM197-tag (SEQ ID N° 5) con l’enterochinasi. La reazione di digestione viene eseguita a 22-24°C per 18-24 h in tampone Tris-HCI 20 mM pH 8, NaCI 50 mM, CaCÃŒ2 2 mM utilizzando una quantità di enzima pari allo 0,02 % (w/w). La Fig. 5 rappresenta un gel SDS-PAGE in cui à ̈ visibile (in corsia 2) il CRM197 digerito separato nei due domini A e B (il campione à ̈ stato bollito in presenza di un riducente che rompe il ponte disolfuro tra i domini). Il protocollo prevede un passaggio successivo di separazione del CRM197 (senza tag, SEQ ID N° 6) dal solo tag tramite cromatografia di affinità (stessa colonna e stessa resina utilizzata per la purificazione sopra descritta per CRM197-tag).
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Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Polinucleotide, comprendente la sequenza SEQ ID N° 1.
- 2. Polinucleotide secondo la rivendicazione 1 comprendente inoltre almeno una sequenza nucleotidica codificante per un polipeptide tag.
- 3. Polinucleotide secondo secondo la rivendicazione 2 in cui la sequenza tag à ̈ associata ad un’opportuna sequenza di taglio per il riconoscimento da parte di opportuni enzimi capaci successivamente di rimuovere il tag.
- 4. Vettore di espressione comprendente il polinucleotide secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3.
- 5. Microorganismo geneticamente modificato appartenente alla specie Escherichia coli e comprendente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 4.
- 6. Proteina ricombinante di fusione CRM197-tag codificata da un polinucleotide secondo una qualunque delle rivendicazioni 2-3.
- 7. Metodo per la produzione di una proteina CRM197-tag secondo la rivendicazione 6, detto metodo comprendente l'espressione mediante coltura in Escherichia coli geneticamente modificato come descritto in rivendicazione 5.
- 8. Metodo di produzione della proteina CRM197 mediante espressione in Escherichia coli geneticamente modificato come descritto in rivendicazione 5.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8 che comprende come intermedio una proteina secondo la rivendicazione 6.
- 10. Proteina ricombinante di fusione secondo la rivendicazione 6 per uso medico o per uso come carrier in composizioni farmaceutiche.
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