KR102124346B1 - 항균 펩타이드를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

항균 펩타이드를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로모터; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열, 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열; SSP DnaB 인테인 코딩 서열; 및 항균 펩타이드 코딩 서열이 순서대로 연결된 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 항균 펩타이드를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

Description

항균 펩타이드를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vector for antimicrobial peptide expression and uses thereof}
본 발명은 항균 펩타이드를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 사용되어 왔으나, 근래에 들어서 항생제 내성을 가지는 균주들이 증가하고 있다. 미국 질병통제센터(CDC)의 AMR(antimicrobial resistance) 병원 항생제 보고서에 따르면, 항생제의 오남용으로 인해 2006년 한해 동안 약 10만명이 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 감염되었고 그 중 사망자는 약 2만명이었다. 2010년에는 국내에서도 슈퍼박테리아라 일컬어지는 NDM-1(New Delhi metalo-beta-lactamase) 유전자를 함유한 카바페넴 내성 장내균(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)이 발견되는 등 내성균에 의한 위험성이 증가하고 있다. 현재 전 세계적으로 이루어지는 감염성 질환에 대한 연구의 대부분은 병원균의 대사나 생합성 경로를 선택적으로 억제·제어하는 항생 물질의 개발과 약독화 병원균의 배양에 의한 백신 개발에 초점이 맞추어져 있는데 기존의 항생 물질의 경우 숙주의 대사 및 생합성 경로를 조절하는 효소도 동시에 억제하여 부작용과 독성을 나타내는 경우가 많고 내성 문제로 사용이 제한되고 있으며, 백신 개발만으로는 신종 병원균에 신속하게 대처할 수 없는 문제점이 있다. 따라서 감염성 질환을 초기에 효과적으로 제어할 수 있는 새로운 패러다임의 감염 치료제의 개발이 시급한 실정이며, 최근 들어 국내외 연구진들은 기존의 문제점을 해결할 수 있는 방안으로 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)에 주목하고 있다.
항균펩타이드는 선천면역체계(innate defense system)의 일원으로 모든 생물체가 가지고 있는 10-50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로, 생물체가 병원균에 감염되었을 때 1차 방어 물질로 작용한다. 이들은 주로 양전하(+2~+9)를 띠고 있으며, 30% 이상의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 항균 펩타이드가 음전하를 띤 세균 세포막과 접촉하게 되면 양극성 α-나선구조(amphipathic α-helix) 혹은 β-병풍구조(β-sheet)를 형성하여 세포막 속으로 들어갈 수 있다. 항균 펩타이드가 표적 세균의 세포막에 들어가게 되면 양전하를 갖는 항균 펩타이드가 음전하를 띠는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이의 지질막과 결합하여 지질막의 불안정화를 일으키고, 세포막의 전위를 소실시켜 세균을 죽이는 것으로 알려져 있다. 천연에 존재하는 항균성 펩타이드는 새로운 항생제의 후보물질로서 대두되었고, 이는 기존에 사용되고 있는 화합물성 항생제와 다른 작용기작을 통하여 항균 활성을 나타내기 때문에 항생제 내성 균주에 대한 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
인간 락토페린(Human lactoferrin, hLf)은 주로 눈과 호흡기 주변에서 생성되는 점막 분비물과 초유에서 발견되는 트랜스페린(transferrin) 계열의 다중 기능성 단백질(multifunctional protein)로, N-로브(N-lobe)와 C-로브로 구성되어 있다. 이 두 개의 로브는 철 결합 도메인(iron binding domain)을 가지고 있어 철 이온과 결합할 수 있다. 락토페린은 철의 항상성을 유지하는데 관여하고 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등에 강한 항균 능력을 갖는다. 또한 락토페린은 항균 활성 외에도 세균 감염에 대한 숙주방어(host defense)와 항염 활성을 갖고 있으며, 암 발생과 전이(metastasis)를 억제하는 것에도 관여한다. 초기에는 락토페린의 항균활성이 철 이온을 고갈시켜 미생물 생장을 억제하는 철 킬레이트화(iron chelation)에 의한 것으로 알려져 있었지만, 현재는 숙주세포 안에서의 응집(aggregation)과 내포작용(endocytosis) 등과 같은 철-비의존적 메커니즘에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
인간 락토페리신(Human lactoferricin, hLfcin)은 락토페린을 펩신(pepsin)으로 분해시켜 만들어진 항균 펩타이드 중 하나로, 락토페린의 N-말단부터 아미노산 1-49번째 잔기로 구성되어 있다. 락토페린의 주된 항균활성 능력은 락토페리신의 이황화 결합에 의해 형성된 루프 구조에 의한 것으로 알려져 있다. 특히 락토페리신의 20-31번째 잔기는 락토페린의 첫 번째 α-나선구조에 해당하며, 기존의 천연 펩타이드 보다 더 우수한 항균활성 갖는다고 알려져 있다.
한편, 한국공개특허 제2018-0053459호에는 '융합 항균펩타이드 파제인 또는 이를 합성하는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0054587호에는 '융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법'이 개시되어 있으나 본 발명의 항균 펩타이드를 발현하기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열, 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열; SSP DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 코딩 서열; 및 인간 락토페리신 유래 항균 펩타이드 HLSA 코딩 서열이 순차적으로 연결된 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 재조합 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰을 형질전환하여 발현시킨 결과, 최종적으로 분리·정제된 항균 펩타이드 HLSA의 항균 활성이 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 순서대로 프로모터; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열, 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열; SSP DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 코딩 서열; 및 서열번호 4의 아미노산 서열에서 5번째 아미노산이 라이신(lysine, K)으로 치환되고, 7번째 및 8번째 아미노산이 알라닌(alanine, A)으로 치환된 항균 펩타이드 코딩 서열이 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 cg1514 단백질 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드, 인테인 및 항균 펩타이드를 코딩하는 서열을 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 항균 펩타이드의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 분비 신호 펩타이드; 인테인; 및 항균 펩타이드 코딩 서열이 삽입된 재조합 벡터는 항균 펩타이드의 분리 및 정제 과정을 단일 스텝으로 수행할 수 있어 매우 간단하고 경제적이며, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 생산한 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하므로, 백신, 사료첨가제, 또는 의약 조성물 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 재조합 발현 벡터 제작에 관한 것으로, A는 항균 펩타이드 HLSA의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타낸 그림이고, B는 키틴 결합 도메인(chitin binding domain, CBD) 및 인테인이 포함되어 있는 pENR1 벡터의 개열지도이고, C는 상기 pENR1 벡터의 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA를 pGEM-T easy 벡터로 TA 클로닝하여 제작된 pENR2 벡터의 개열지도이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래 CG1514 프로모터-CG1514 신호 펩타이드가 삽입된 재조합 벡터 제작에 관한 것으로, A는 CG514 프로모터와 CG1514 신호 펩타이드가 삽입된 pENR3 벡터의 개열지도이고, B는 pENR2 벡터의 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA가 상기 pENR3 벡터로 삽입되어 제작된 pENR4 벡터의 개열지도이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 항균 펩타이드 HSLA 발현을 위한 벡터의 제작에 관한 것으로, pENR4 벡터의 CG1514 프로모터-CG1514 신호 펩타이드-CBD-Ssp DnaB intein-HLSA가 pCES208 벡터에 삽입되어 제작된 pCNR5 벡터의 개열지도이다.
도 4는 pCNR5 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 파쇄액(cell lysate) 및 상등액(supernatant)에서 CBD-SSP DnaB intein-HLSA의 발현을 확인한 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블랏(B) 결과이다. SM; 단백질 크기 마커, self; pCES208 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰, HLSA; pCNR5 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰.
도 5는 porin B 단백질 유래 신호 펩타이드가 삽입된 재조합 벡터 제작에 관한 것으로, pENR2의 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA가 pCXE50-SP-Trx Amp4 벡터에 삽입되어 제작된 pCNR6 벡터의 개열지도이다.
도 6은 pCNR6 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 파쇄액 및 상등액에서 CBD-SSP DnaB intein-HLSA 발현을 확인한 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블랏(B) 결과이다. SM; 단백질 크기 마커, cg; 코리네박테리움 글루타미쿰, HLSA; pCNR6 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰.
도 7은 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리·정제된 항균 펩타이드 HLSA의 항균 활성을 측정한 결과이다. 세로축; 지시균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 생존율, NC(음성대조군); 무처리, PC(양성대조군); 암피실린 처리, CG1514-HLSA; cg1514 신호 펩타이드가 포함된 벡터를 이용하여 생산된 HLSA, Porin-HLSA; porin B 신호 펩타이드가 포함된 벡터를 이용하여 생산된 HLSA.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 순서대로 프로모터; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열, 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열; 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 SSP DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 코딩 서열; 및 서열번호 4의 아미노산 서열에서 5번째 아미노산이 라이신(lysine, K)으로 치환되고, 7번째 및 8번째 아미노산이 알라닌(alanine, A)으로 치환된 항균 펩타이드 코딩 서열이 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰의 cg1514 단백질 유래 cg 프로모터 또는 Tuf 프로모터일 수 있으나, 숙주세포에 도입된 외래 유전자의 전사 개시를 돕거나 전사된 mRNA의 안정성 증가 또는 유전자 해독 효율을 높임으로서 목적 유전자의 발현을 현저히 증가시킬 수 있는 것이라면 그 종류에 제한이 없다.
용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
상기 cg1514 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 분비체(secretome) 중 하나의 단백질로, 재조합 단백질의 분비 생산을 위한 시스템에서 cg1514 단백질 유래 신호 펩타이드 및 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, porin B 단백질 유래 신호 펩타이드는 이종 단백질(heterologous protein)의 분비 생산에 유용하게 활용되고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 분비 생산 시스템에 사용되고 있다.
또한, 상기 porin B 단백질은 코리네박테리움의 세포벽 채널 단백질로, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 porin B 단백질은 보호적인 비극성 장벽(protective nonpolar barrier)인 마이콜산 층(mycolic acid layer)에서 물질교환이 이루어지도록 도와주는 역할을 한다.
따라서, 상기 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 및 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드는 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포외로 목적 단백질의 분비가 용이하도록 하기 위해 결합시킨 것이다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 cg1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 및 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 인테인 코딩 서열이 항균 펩타이드 코딩 서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 결합될 수 있고, 상기 인테인은 Ssp DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 또는 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 Ssp DnaB 인테인이 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
인테인(intein)은 단백질이 완성된 형태의 모습으로 접히기(folding) 전에, 단백질 전구체의 일부가 제거되는 번역 후 과정인 단백질 스플라이싱(splicing) 과정에서 잘려져 나가는 영역으로, 일부 단백질에서는 번역 후 전구체 단백질이 자가촉매반응에 의해 일부가 잘려나가고 나머지 부분은 재결합하여 성숙 단백질이 되는 것으로 알려져 있다. 이때 잘려진 영역을 인테인(intein), 성숙 단백질로 남는 영역을 엑스테인(extein)이라고 한다.
본 발명에서와 같이 항균성 펩타이드 대량 생산을 위해 대장균 발현 시스템을 사용하는데 있어 인테인과 항균성 펩타이드를 융합하여 발현시킬 경우, 항균 펩타이드 자체의 세포 독성 때문에 대장균이 제대로 성장하지 못하거나 스스로를 지키기 위해 항균 펩타이드를 분해시켜 항균 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 대장균 내에서 발현된 펩타이드의 분리 및 정제 과정에서 pH 변화(shitf), 강한 환원조건(25 mM 이상의 DTT) 또는 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 처리를 통해 자가분해 활성을 띠는 인테인의 특성을 이용한 IMPACT 시스템(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system)을 이용하면 매우 간단한 과정을 통해 순도 높은 펩타이드를 분리 및 정제할 수 있다는 장점이 있다.
상기 IMPACT 시스템은 인테인에 키틴 결합 도메인(chitin binding domain, CBD)이 포함되어 있어, 키틴 레진(chitin resin)이 충진된 컬럼에 인테인과 결합된 목적 단백질을 흘려보내면 목적 단백질의 인테인이 키틴 비드에 결합하게 되어 목적 단백질을 효과적으로 분리할 수 있다. 더욱이, 일반적으로 컬럼 내 목적 단백질을 회수(또는 용출)할 때 해당 태그(tag)에 붙을 수 있는 리간드를 과량으로 흘려내는 것이 보통이지만, IMPACT 시스템에서는 목적 단백질을 회수할 때 매우 강한 환원조건(25mM 이상의 dithiothreitol(DTT))에서 인테인이 자가분해 활성을 띠는 특성을 이용한다는 점에서 큰 장점을 갖는다. 즉, 워싱이 끝난 후에 DTT가 함유된 버퍼로 교체해 준 후 일정시간 이상 인큐베이션(incubation)만 시켜주면 인테인의 자가분해 활성에 의해서 목적 단백질과 분리되고, 목적 단백질은 비드에 더 이상 붙어있지 않으므로 레진(resin)에서 나오는 목적 단백질을 회수하기만 하면 되므로 별도의 프로테아제(protease)를 이용한 절단(cleavage) 과정 및 절단 후 목적 단백질만 용출시키는 정제의 과정이 필요없는 매우 간단한 단백질 정제 시스템이다. 산출물 또한 높은 순도를 갖는 장점이 있다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 인간 락토페린(human lactoferrin, hLf; UniProt_Q5EK51)이 펩신(pepsin)에 의해 분해되어 락토페린의 1~47번째 잔기로 구성된 인간 락토페리신(human lactoferricin, hLfcin)의 항균 활성이 더욱 증가되도록 인간 락토페리신의 20~31번째 잔기 중 일부 아미노산을 변형시킨 것이다. 구체적으로, 본 발명의 항균 펩타이드는 서열번호 4(인간 락토페리신의 20~31번째)의 아미노산 서열에서 5번째 아미노산인 글루타민(glutamine, Q)이 라이신(lysine, K)으로 치환되고, 7번째 및 8번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine, N) 및 메티오닌(metionine, M)이 각각 알라닌(alannie, A)으로 치환된 항균 펩타이드(서열번호 5)이다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 제오신(블레오마이신), 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 코리네박테리움 속(Corynebacterium)에 속하는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(C. ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스(C. efficiens) 등 일 수 있고, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질 감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 cg1514 단백질 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드, 인테인 및 항균 펩타이드를 코딩하는 서열을 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 항균 펩타이드의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 항균 펩타이드의 생산 방법은, 항균 펩타이드가 발현된 숙주세포로부터 항균 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만 이에 제한되는 것이다. 더 나아가 분리된 펩타이드는 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 투석, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있으나, 본 발명의 항균 펩타이드는 인테인을 사용한 IMPACT 시스템(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system) 과정을 통해 정제되었다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 그람 양성균에 대한 항균용 조성물을 제공한다. 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 당업계에 공지된 모든 그람 양성균일 수 있고, 바람직하게는 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 더욱 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "의약외품 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생 용품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 의약외품 조성물은 항균 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.00001 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제를 제공한다. 본 발명의 사료첨가제는 항균성 펩타이드를 포함하고 있는 사료첨가제로, 가축에게 급여함으로써 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 배양
재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 배양을 위해 시드 배지(seed medium; KH2PO4 1 g, Urea 4 g, SBH 55 ㎖, Thiamine-HCl(1 g/L) 200 ㎕, Biotin (50 mg/L) 1 ㎖, MgSO4·7H2O(50 g/L) 8 ㎖, FeSO4·7H2O(50 g/L) 200 ㎕, MnSO4·5H2O(50 g/L) 200 ㎕, Glucose 40 g per 1 liter of distilled water, pH 7.0)와 생산 배지((NH4)2SO4 30 g, KH2PO4 1 g, SBH 15 g, CaCO3 50 g, Thiamine-HCl(1 g/L) 200 ㎕, Biotin(50 mg/L) 40 ㎕, MgSO4·7H2O(50 g/L) 8 ㎖, FeSO4·7H2O(50 g/L) 200 ㎕, MnSO4·5H2O(50 g/L) 200 ㎕, Glucose 70 g per 1 liter of distilled water, pH 7.5)를 사용하였으며 시드배지에서 O.D610=8~10까지 배양 후 생산 배지로 1% 접종하여 30℃에서 250 rpm으로 96시간 동안 배양하였다.
실시예 2. 대장균에서 항균 펩타이드 HLSA 발현을 위한 벡터 제작
IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 시스템을 이용하여 HLSA-mLFampinH의 발현을 유도하기 위해 pTWIN1 벡터(invitrogen, 미국)를 사용하였다. pTWIN1 벡터는 목적 단백질을 Ssp DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 혹은 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)이 결합된 상태로 발현 가능하도록 제작된 벡터로, 제한효소 SapI과 PstI로 절단 후 목적 단백질의 유전자를 삽입하면 목적 단백질의 N-말단에 Ssp DnaB 인테인이 결합된 상태로 발현하게 되며, 제한효소 NdeI과 SapI 위치에 목적 단백질의 유전자를 삽입하면 목적 단백질의 C-말단에 Mxe gyrA 인테인이 융합된 상태로 발현하게 된다. 목적 단백질의 분리 과정에서 Ssp DnaB 인테인-융합 단백질은 pH 변화에 의해 목적 단백질의 절단이 가능하고, Mxe gyrA 인테인-융합 단백질은 DTT(1,4-dithio-DL-threito)나 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)과 같은 티올계 시약(thiol reagent)을 처리함으로써 목적 단백질의 절단이 이루어진다.
합성된 항균 펩타이드 HLSA(도 1A)를 제한효소 PstI과 SapI로 절단한 후 pTWIN1 벡터에 삽입시켰고, 제조된 벡터는 pENR1으로 명명하였다(도 1B). 프라이머 NdeI-CBD(F)와 KpnI-HLSA(B)로 PCR을 수행하여 pENR1의 NdeI-CBD-Ssp DNAB INTEIN-HLSA-KpnI를 증폭시킨 후 pGEM-T Easy 벡터를 이용하여 TA 클로닝하였으며, 제조된 벡터는 pENR2로 명명하였다(도 1C). DNA 시퀀싱을 통해 HLSA 유전자가 성공적으로 삽입되어 있음을 확인하였고, PCR에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1과 같다.
재조합 벡터 제작에 사용된 프라이머 정보
프라이머 명칭 서열정보(5'→3') (서열번호)
NdeI-CBD(F) GGCGGCCATATGAAAATCGAAGAAGG (6)
KpnI-HLSA(B) GGTACCTTAACGCACTTTACGGGCG (7)
pcg1514-cg1514ss(F) CTGCAGAGCCTGACTAGCGGTGTT (8)
Ssp DnaB intein HLSA(B) GGTACCTTAACGCACTTTACGGGCG (9)
GABA-T(F) GGCGTTAAACTCCTGTCA (10)
GABA-T(B) TTAGCCCACCTTCTGGTG (11)
pCES208 MCS(F) GCCGACATGATCCAACTGATA (12)
pCES208 MCS(B) CGACGCCGCAGTACTGATC (13)
PstI-CBD(F) GGTGGTCTGCAGACAAATCCTGGTGTATC (14)
HLSA-Hind lll(B) GGTGGTAAGCTTTTAACGCACTTTACGGG (15)
pCXE50(F) GGGAATAAGGGCGACACGGA (16)
pCXE50(B) CTGCCGCCAGGCAAATTCTG (17)
그 다음, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래 CG1514 프로모터-CG1514 신호 펩타이드 코딩 서열을 PCR로 증폭하여 pGEM-T Easy 벡터의 PstI과 NdeI자리로 삽입하였고, 제작된 벡터를 pENR3로 명명하였다(도 2A). 또한, pENR2의 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA의 NdeI 위치를 절단하여 PCR로 증폭시킨 후 pENR3의 NdeI 위치로 삽입하였으며, 제작된 벡터를 pENR4로 명명하였다(도 2B). DNA 시퀀싱 결과 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA이 성공적으로 삽입되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 코리네박테리움 글루타미쿰의 cg1514 단백질 유래 신호 펩타이드를 이용한 발현 벡터 제작
3-1. CG1514 프로모터- CG1514SS - CBD - Ssp DnaB intein - HLSA 가 삽입된 발현 벡터 제작
제한효소 PstI 및 KpnI로 pENR4의 CG1514 프로모터-CG1514SS-CBD-Ssp DnaB intein-HLSA 유전자 부분을 절단하고 코리네박테리움 글루타미쿰 발현 벡터인 pCES208 벡터의 동일한 자리에 삽입하였으며 제작된 벡터를 pCNR5로 명명하였다(도 3). DNA 시퀀싱 결과 발현 벡터가 성공적으로 제작되었음을 알 수 있었다.
3-2. 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에서 CBD - SSP DnaB intein -HLSA 발현 확인
pCNR5 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA의 발현 여부를 확인하기 위해 플라스크-스케일 배양(flask-scale culture)을 수행하였다. 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰을 시드 배지에서 O.D610=8~10까지 배양 후 생산 배지로 1% 접종하여 30℃에서 250 rpm으로 96시간 동안 배양하였다. 96시간 배양 후 세포를 회수하여 PBS에 현탁하고 글라스 비드(glass bead)로 파쇄하여 세포 파쇄액을 획득하였으며, 상등액은 10K centricon을 사용하여 농축하였다. SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석법(western blot analysis)을 통해 CBD-SSP DnaB intein-HLSA의 발현을 확인하였다.
SDS-PAGE 결과, pCES208 벡터(self) 또는 pCNR5 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰(HLSA)에서 26 kDa의 CBD-SSP DnaB intein-HLSA 단백질이 발현된 것을 확인하였고, anti-CBD 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과, pCNR5 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에서 26 kDa의 CBD-SSP DnaB intein-HLSA 단백질이 발현되었으며, 특히 세포 파쇄액(cell lysate)에 비해 상등액(supernatant)에서 발현량이 현저하게 증가된 것을 확인하였다(도 4).
실시예 4. porin B 단백질 유래 신호 펩타이드를 이용한 발현 벡터 제작
4-1. Tuf 프로모터- porin SS- CBD - SSP DnaB intein - HLSA 가 삽입된 발현 벡터 제작
프라이머 PstI-CBD(F)와 HLSA-HindIII로 pENR2의 PstI-CBD-Ssp DnaB itein-HLSA-HindIII를 증폭시킨 후 제한효소 PstI 및 HindIII로 절단하여 porin 신호 서열을 포함하고 있는 pCXE50-SP-Trx Amp4 벡터(경성대 이진호 교수님)에 삽입하였고, 최종적으로 Tuf 프로모터-porin ss-CBD-Ssp DnaB intein-HLSA가 포함된 벡터를 pCNR6로 명명하였다(도 5). DNA 시퀀싱을 통해 발현 벡터가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다.
4-2. 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에서 CBD - Ssp DnaB intein -HLSA 발현 확인
pCNR6 벡터가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 CBD-Ssp DnaB intein-HLSA의 발현 여부를 확인하기 위해 플라스크 스케일 배양(flask-scale culture)을 수행하였다. 균주의 배양 방법과 세포 파쇄액 및 세포 배양액을 수득하기 위한 방법은 상기 실시예 3-2와 동일하며, SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 통해 CBD-SSP DnaB intein-HLSA의 발현을 확인하였다.
SDS-PAGE 결과, 형질전환되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰(cg)과 pCNR6 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰(HLSA)에서 26 kDa 크기의 CBD-SSP DnaB intein-HLSA 단백질이 발현된 것을 확인하였고(도 6A), anti-CBD 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과, pCNR6 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 파쇄액(lysate)과 상등액(supernatant)에서 26 kDa의 CBD-SSP DnaB intein-HLSA 단백질이 발현되었으며, 특히 세포 파쇄액(lysate)에 비해 상등액(supernatant)에서 발현량이 현저하게 증가된 것을 확인하였다(도 6B).
실시예 5. 정제된 항균 펩타이드 HLSA 의 항균 활성 확인
형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양액에서 융합 형태의 intein-HLSA 단백질로부터 항균 펩타이드 HLSA만을 분리하기 위해 키틴 레진(chitin resin)을 이용한 정제 과정을 수행하였다. B1 버퍼(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.5)로 레진을 세척한 후 농축한 배양액을 키틴 레진에 로딩하여 intein-HLSA 단백질을 결합시켰다. 단백질을 결합시킨 후 B2 버퍼(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 6.5)로 레진을 채운 후 밤새 on-column cleavage reaction을 수행하였다. 분리·정제된 HLSA의 항균 활성은 지시균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 대상으로 하여 측정하였다. 음성 대조군은 HLSA의 농도를 0 ㎍/㎖으로 설정한 것이고, 용출 분획물(elution fraction)과 지시균을 각각 100 ㎕씩 처리한 후 반응시켰다.
그 결과, 음성 대조군에 비해, CG1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 또는 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드가 삽입된 pCNR5 또는 pCNR6 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에서 분리·정제된 항균 펩타이드 HLSA의 항균 활성이 우수함을 알 수 있었다(도 7).
<110> KANG, Seong Woo <120> Recombinant vector for antimicrobial peptide expression and uses thereof <130> PN18283 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Leu Leu Asn Arg Val Ser Arg Ile Ala Gly Ala Ser Ala Ile Thr Leu 1 5 10 15 Cys Ile Gly Leu Thr Thr Ile Leu Ser Pro Thr Ser Thr Ala Gln Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Lys Leu Ser His Arg Ile Ala Ala Met Ala Ala Thr Ala Gly Ile 1 5 10 15 Thr Val Ala Ala Phe Ala Ala Pro Ala Ser Ala 20 25 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synechocystis <400> 3 Ala Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg 1 5 10 15 Val Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala 20 25 30 Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg Val 35 40 45 Phe Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu Gly 50 55 60 Arg Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly 65 70 75 80 Trp Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu Lys Glu His Ile Ala Leu Pro 85 90 95 Arg Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu Gln Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys 100 105 110 Leu Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu 115 120 125 Thr Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn 130 135 140 Phe Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His Asn 145 150 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLSA <400> 5 Cys Phe Gln Trp Lys Arg Ala Ala Arg Lys Val Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcggccata tgaaaatcga agaagg 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtaccttaa cgcactttac gggcg 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgcagagcc tgactagcgg tgtt 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggtaccttaa cgcactttac gggcg 25 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggcgttaaac tcctgtca 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttagcccacc ttctggtg 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gccgacatga tccaactgat a 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgacgccgca gtactgatc 19 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtggtctgc agacaaatcc tggtgtatc 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggtggtaagc ttttaacgca ctttacggg 29 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gggaataagg gcgacacgga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctgccgccag gcaaattctg 20

Claims (6)

  1. 5'에서 3' 방향으로 순서대로 프로모터; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 CG1514 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드 코딩 서열; Ssp DnaB 인테인(natural intein in DnaB protein of Synechocystis sp. PCC6803) 코딩 서열; 및 서열번호 4의 아미노산 서열에서 5번째 아미노산이 라이신(lysine, K)으로 치환되고, 7번째 및 8번째 아미노산이 알라닌(alanine, A)으로 치환된 항균 펩타이드 코딩 서열;이 연결된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 목적 단백질의 세포 외 분비를 증가시키는 재조합 벡터.
  2. 삭제
  3. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum).
  4. 삭제
  5. 제1항의 재조합 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 형질전환시켜 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CG1514 단백질 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 porin B 단백질 유래 분비 신호 펩타이드, 인테인 및 항균 펩타이드를 코딩하는 서열을 과발현시키는 단계를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 항균 펩타이드의 생산방법.
  6. 삭제
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