KR20130138397A

KR20130138397A - 항균활성을 갖는 락토페린 펩타이드 및 그 생산방법

Info

Publication number: KR20130138397A
Application number: KR1020120061920A
Authority: KR
Inventors: 이현환; 신혜라; 송가은; 조재형
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2013-12-19

Abstract

융합단백질 유전자, 락토페린 코딩 유전자 및 이들 상부에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 락토페린의 미생물 발현용 플라스미드, 이를 포함하는 균주, 이를 사용한 미생물에서 락토페린을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본원의 플라스미드 및 이를 이용한 락토페린 생산 방법은 숙주세포를 사멸시키지 않고도, 활성있는 락토페린, 특히 락토페린 펩타이드를 미생물에서 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

항균활성을 갖는 락토페린 펩타이드 및 그 생산방법 {Peptide having antibacterial activity derived from lactoferrin and method for producing the same}

본원은 항균 펩타이드를 미생물에서 발현하는 분야에 관한 것이다.

다수의 재조합으로 생산된 단백질 및 펩티드가 미국 식품 의약 안정청 (FDA)에 의해 생물공학 약물 및 백신 용도에 대해 승인되었고, 다른 많은 종류가 임상 시험 중이다. 펩티드는 화학 합성을 통해 생산될 수도 있으나 단백질 및 펩티드는 살아 있는 세포에서 가장 효율적으로 생산되고 또 그 활성의 유지를 위해 세포내 생산이 선호되고 있다.

하지만 유전자 재조합 기술을 이용한 펩타이드의 제조시 펩타이드가 세포내에서 분해되는 문제점이 있으며, 발현되는 펩타이드의 성질에 따라 호스트를 사멸시키며, 특히 미생물을 사용시, 발현된 단백질이 불용성 및/또는 비활성의 봉입체를 형성하는 문제점도 있다. 미생물에 발현되는 인체 유래의 단백질은 시스테인 아미노산끼리 이중 설파이드(disulfide) 결합을 이루는데, 미생물의 세포질은 인체 세포에 비하여 환원성이 높은 상태이기 때문에 설파이드결합이 제대로 형성되지 못하고 그로 인해 정상적인 3차 구조를 이루지 못한다. 따라서, 침전물을 유레아나 구아니딘에 녹인 후 정상적인 3차 구조를 유도하는 방법을 쓰기도 하지만, 이러한 방법은 공정이 복잡하고 수율이 낮은 문제가 있다.

대한민국 등록특허공보 제0614020호는 “폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 향상된 방법”에 관한 것으로 봉입체로부터 향상된 수율로 폴리펩티드를 회수하는 방법을 개시한다.

대한민국 등록특허 제0331981호는 곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린 및 그 제조방법에 관한 것으로, 진핵세포를 이용한 락토페린의 생산방법을 개시하나, 진핵세포의 사용으로 인해 수율이 낮고 단가가 높은 문제점이 있다.

또한 락토페리신의 항 감염성 활성으로 인해 미생물 내에서 발현을 유도할 경우 세포의 내독소 쇼크를 유도하여 사멸에 이르는 문제점 있다.

사람 락토페린은 출산한 여성의 경우 1주 내의 짧은 기간 동안 만들어내는 초유에 다량 함유되어 있는 항 감염성 능력을 갖는 단백질로 영아가 섭취할 시 락토페린 고유의 항 감염성 능력에 의해 영아의 면역력을 증가시켜 이에 대한 수요가 매우 많은 것이 사실이다. 현재 사람 유래 락토페리신 유전자를 유전공학 재조합 기술에 의해 대장균 및 기타 미생물에서 정상적으로 발현을 시킨 사례는 보고되고 있지 않다.

영·유아들의 분유, 이유식 및 기타 기능성 식품들에 포함되어 시장에 납품되고 있는 제품들의 락토페린은 모두 소, 염소, 기타 다른 포유류로부터 얻은 락토페린을 이용하고 있는 실정이다. 따라서 저단가, 고부가가치의 항감염성 물질을 이용한 의약품 개발 및 식품 첨가물 등 산업분야에 널리 사용되는 락토페리신의 경제적이며 안정적 공급을 위해 세포를 이용한 활성있는 락토페린의 생산 기술 개발에 대한 요구가 있다.

락토페린 특히 락토페린 유래 펩타이드를 미생물에서 생산하고자 한다.

한 양태에서 본원은 CFQWKRAARKVR (서열번호 2)의 서열을 갖는 락토페린 유래 펩타이드를 제공한다.

또한 본원은 상기 펩타이드를 코딩하는 핵산, 예를 들면 서열번호 3의 핵산을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 락토페린 유래 펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드의 항균 활성능을 중성화 시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 핵산 및 상기 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 플라스미드를 제공한다. 특히 상기 플라스미드를 미생물, 즉 원핵세포 또는 단세포세포 발현용으로, 이를 위한 적절한 프로모터, 복제개시점, 종결서열 등을 포함하며, 한 구현예에서 상기 플라스미드는 도 1a의 개열지도를 갖는다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 플라스미드로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물은 본원에 따른 락토페린을 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 대장균, 고초균, 코리네박테리움, 또는 유산균이 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 플라스미드를 미생물에 형질전환 하는 단계; 및 상기 단계의 형질전환된 미생물을 배양하여 락토페린을 미생물 숙주세포에서 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린의 미생물 발현 방법에 관한 것이다. 본원의 방법은 또한 본원의 플라스미드로 형질전환된 미생물을 직접 사용하는 것일 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 락토페린 유래 펩타이드를 포함하는 면역 증강 또는 항균 조성물을 제공한다. 상기 항균조성물은 화장품의 성분, 여드름치료제, 건강보조식품, 항균제제, 가축 사료 첨가제 등 다양한 형태로 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 락토페린의 미생물 발현 플라스미드 및 이를 이용한 발현 방법은 락토페린의 항균활성에도 불구하고 숙주세포의 사멸을 유도하지 않고, 안정적으로 활성인 락토페린을 미생물에서 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1a는 본원의 일실시예에 따른 미생물 발현용 락토페린 펩타이드를 포함하는 플라스미드의 개열지도이다.
도 1b는 본원의 일실시예에 따른 융합단백질과 결합된 락토페린 펩타이드의 모식도이다. 화살표는 융합단백질이 잘리는 부위를 나타낸다.
도 2a 및 b는 각각 본원의 일실시예에 따른 플라스미드를 이용하여 대장균에서 발현된 락토페린 펩타이드의 정제 전 및 후의 SDS-PAGE 전기영동 사진 및 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 3은 융합단백질과 결합되어 있는 락토페린 펩타이드를 융합단백질로부터 분리 정제한 결과이다.
도 4는 본원의 일실시예에 따른 미생물에서 생산 분리된 락토페린 펩타이드의 항균 활성능을 테스트한 결과이다.

상기 목적달성을 위해 한 양태에서 본원은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 락토페린 유래 펩타이드에 관한 것으로, 본원에 따른 펩타이드는 미생물에서의 효과적인 발현 및 항균활성을 높이기 위해 야생형 (서열번호 1 참조)의 서열의 일부가 치환된 것이다.

본원은 또한 상기 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것으로, 상기 핵산은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈이 최적화된 것일 수 있다. 한 구현예에서 상기 핵산은 서열번호 3의 서열을 가진다.

다른 양태에서 본원은 또한 융합단백질 코딩 유전자, 락토페린 코딩 유전자 및 이들 상부에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 락토페린 발현용 플라스미드에 관한 것이다.

락토페린은 출산한 여성의 경우 1주 내의 짧은 기간 동안 만들어내는 초유에 다량 함유되어 있는 항 감염성 능력을 갖는 단백질이다. 이를 영아가 섭취할 시 락토페린 고유의 항 감염성 능력에 의해 영아의 면역력을 증가시킨다. 또한 위의 소화효소에 의해 락토페린은 짧은 펩티드 형태로 절단되게 되게 되는데 이러한 짧은 펩티드 중 49개의 아미노산으로 구성된 사람 락토페리신 펩타이드는 지금까지 알려진 다른 동물 유래 락토페리신에 비해 항균 및 항바이러스 활성이매우 높은 것으로 보고 되어져 있다. 항 감염성 사람 락토페리신은 기존에 보고된 항 감염성 펩티드와 동일하게 양이온의 성질을 갖으며 음이온을 띄고 있는 세균의 LPS (lipopolysaccharide)를 인식하고 세포 외막 안으로 끼어들어 가게 된다. 외막안으로 들어간 펩타이드는 세포질막을 자유롭게 이동할 수 있게 되어 결국 세포의 내독소쇼크를 유도하여 사멸에 이르는 작용 기작을 갖고 있다.

본원에서 발현하고자 하는 락토페린 또는 락토페린 유래 펩타이드는 포유류, 특히 사람 유래의 것으로 전장 또는 락토페리신과 같은 그 일부를 모두 포함하는 것이다. 락토페린 서열을 공지된 것으로 공지된 모든 서열이 본원에 포함된다. 미생물 발현에 유리하도록 염기서열의 일부가 인위적으로 변형된 유전자 및 자연적으로 발견되는, 염기서열 일부가 변형된 유전자 또는 이들의 모두의 단편을 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다.

본원의 플라스미드에 포함되는 락토페린 코딩 유전자는 전체 또는 일부 또는 이들이 두 번 이상 반복된 것일 수 있으며, 반복되는 경우 이들은 동일하거나 상이한 것일 수 있다.

한 구현예에서 본원의 락토페린은 인간유래의 서열로 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열도 본원의 범위에 포함된다.

다른 구현예에서 본원의 락토페린은 그 일부로, 서열번호 1의 제 20 내지 31번째 펩타이드이다. 또 다른 구현예에서 락토페린의 활성 증가를 위해, 서열번호 1의 제 20 내지 31번째 펩타이드에서 24번째, 26번째, 27번째 서열이 다른 아미노산으로 치환된 것이다. 한 구현예에서 상기 24번째 아미노산의 경우 Gln (글루타민)에서 Lys(라이신)으로, 상기 26번째 아미노산의 경우 Asn (아스파라진)에서 Ala(알라닌)으로, 상기 27번째 Met(메타이오닌)에서 Ala으로 치환된다. 27번째 아미노산 치환의 경우, 융합단백질 제거를 위해 CNBr 처리 시 잘리게 되는 것을 방지하기 위한 변형이다. 또 다른 구현예에서 본원의 락토페린은 그 일부로, 예를 들면 락토페리신으로, 서열번호 2로 표시되는, CFQWKRAARKVR의 서열을 가진다.

또한 본원의 플라스미드에 포함된 락토페린 코딩 유전자는 유전자 수준에서 다른 단백질과 융합되어 융합 단백질로 발현된다. 항균활성을 나타내는 단백질을 미생물에서 발현시키는 경우 숙주세포가 사멸하는 문제가 있어, 이를 다른 단백질과 융합하여 발현함으로서 그 3차원적 구조를 변형하여 발현과정에서 항균활성이 나타나지 않게 한다. 이후 정제과정을 거쳐 융합된 단백질을 분리해내어 항균활성 단백질은 3차원구조를 다시 갖게 되어 항균력을 회복하는 원리이다. 따라서 이러한 목적을 달성하는 한 다양한 단백질, 즉 항균활성능을 중성화 시킬 수 있는 다양한 단백질이 융합 단백질로 사용될 수 있다. 예를 들면 KSI(Ketosteroid Isomerase), MMIS (Modified Magainin Intervening Sequence), GFP (Green Fluorescence Protein), GST (Glutathion S Transferase) 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

이들은 임의의 조합으로 융합될 수 있으며, 융합단백질의 N-말단 (아미노 말단) 또는 C-말단 (카르복시 말단)부위에 융합되어 발현될 수 있다. 본원의 한 구현예에서 락토페리신은 융합단백질의 C-말단에 융합된다.

상기 플라스미드에 포함되는 프로모터는 미생물에서의 단백질 발현에 적합한 것으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 락토페린 유전자 자체의 프로모터, 미생물에서의 단백질 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터, 예를 들면, T7, lac, trc, trp, P_L, ara BAD, tetA 등 (Strategies for achieving high level expression of gene in Escherichia coli, 1996, Microbiological reviews, p 512-538 )의 프로모터 등을 사용할 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 한 구현예에서는, T7 프로모터가 사용되며, 당업자라면, 본 명세서의 기재 및 당업계의 상식으로부터, 발현되는 구체적 락토페리신 및 숙주세포를 고려하여 적절한 프로모터를 선택할 수 있음이 자명하다.

본원의 플라스미드는 그 외 발현 플라스미드에 일반적으로 포함되는 전사종결인자, 약물저항성 및 복제원점을 또한 포함한다. 이러한 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본 발명의 효과달성을 위해 본 명세서의 기재 및 당업계의 상식으로부터 적절한 서열을 선택할 수 있음이 자명하다.

즉, 상기 플라스미드에 포함되는 복제원점은 당업계에서 미생물에서의 플라스미드 증식 및 유지에 통상적으로 사용되는 다양한 복제원점이 예를 들면 ori가 사용될 수 있다.

또한, 상기 플라스미드에 포함되는 전사종결인자는 단백질 코딩 유전자의 하류에 존재하는 염기서열로서, 유전자의 mRNA로의 적절한 전사종결에 필요한 것으로 미생물 시스템에서 작동되는 공지의 것이 사용될 수 있다.

플라스미드의 증폭 및 선별을 위한 약물저항성 유전자는 박테리아에서의 플라스미드의 증식 및 선별을 위한 것으로, 예를 들면 카나마이신, 암피실린에 대한 저항성을 부여하는 유전자 등이 있으며, 상기 특성을 갖는 한 어느 것이나 본 발명에 사용될 수 있으며, 본 발명의 한 구현예에서는 암피실린 저항성 유전자가 사용되었다.

본원의 플라스미드는 또한 발현된 락토페린의 정제를 위해 정제를 위해 필요한 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 구현예에서는 락토페린의 C-말단에 히스티딘 유전자 6개 융합되어 발현되나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 목적하는 분리방법에 따라 적절한 분리용 유전자를 선택할 수 있을 것이다.

본원은 또한 본원에 따른 플라스미드로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 본원의 플라스미드가 형질전환될 수 있는 미생물은 락토페리신을 발현할 수 있는 것이라면 특히 제한되지 않으며 예를 들면 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 (Corynebacterium spp), 고초균 (Bacillus subtilis), 유산균 (Lactic acic bacterium) 을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

이러한 미생물은 공지된 형질전환 방법 예를 들면 칼슘클로라이드 (CaCl₂), 리튬클로라이드(LiCl₂), 전기충격을 이용한 물리화학적 방법 등을 이용하여 수행될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 (a) 본원의 플라스미드를 미생물에 형질전환하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 형질전환된 미생물을 배양하여 락토페린을 미생물 숙주세포의 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린의 미생물 발현 방법을 제공한다.

상기 단계 (a)에서, 본 발명의 플라스미드, 락토페린, 형질전환 방법 및 미생물 숙주세포는 상술한 바와 같다. 형질전환 방법은 사용하는 구체적인 숙주세포, 효율 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 발현 방법에 의해 최종적으로 발현된 단백질의 존재 및 이의 활성은 공지의 다양한 방법을 사용하여 증명할 수 있다. 예를 들면 실시예에 기재된 바와 같이 락토페린의 항균활성을 측정하거나 또는 발현된 단백질을 특이적으로 인식하는 일차항체를 부착하고, 형광물질 등으로 표지된 일차항체를 인식할 수 있는 이차 항체를 이에 결합시켜 발현 여부를 결정할 수 있으며, 당업자라면, 당업계의 공지된 적절한 방법을 선택하여 측정할 수 있을 것이다.

상기 단계 (b) 이후에 융합단백질을 락토페린으로부터 분리하고, 락토페린을 정제하는 방법을 추가로 포함한다. 융합단백질의 제거는 융합단백질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 특정 아미노산 서열을 제거하는 프로테아제 또는 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들면 실시예에 기재된 것과 같은 방법이 사용될 수 있다.

본원은 또한 본원에 따른 락토페린 유래 펩타이드를 포함하는 면역 증강 또는 항균 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 락토페린 펩타이드는 야생형과 비교하여 그 활성이 향상되었으며, 또한 미생물에서의 발현을 통해 용이하게 분리 정제할 수 있다. 락토페린 펩타이드는 동물세포에 안정성이 입증된 것으로서 예를 들면 항균의 활성이 필요한 곳이면, 식품, 가정, 환경, 의료를 포함하는 다양한 산업 분야에 걸쳐 폭넓게 사용될 수 있다.

항균효과를 위해 본원의 락토페린 펩타이드는 항균에 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 효과적인 양은 처리하고자 하는 대상 박테리아의 종류, 처리 시점 등을 포함하는 조건에 맞추어 결정될 수 있으며, 당업자라면 본원의 기재 및 표적 박테리아의 생물화학적 특성에 관한 지식을 근거로 적절한 농도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 실시예에 기재된 항균 효과 측정 시 처리 전과 비교하여 목적에 따라, 향균효과가 약 100%, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 50% 이상, 약 45% 이상, 약 40% 이상, 약35% 이상, 약 30% 이상, 약 25% 이상, 약 20% 이상의 감소에 필요한 양을 일컫는 것일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 항균제로 사용시 예를 들면 약 0.1ng/ml 내지 약 1㎍/ml 농도로 하루에 일회 내지 수회 및/또는 수일에 걸쳐 처리될 수 있으며, 초기에 처리하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면 스테필로코커스 아루레스의 경우 약 0.5ng/ml 내지 약 1000ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.

락토페린 펩타이드는 동물세포에 안정성이 입증된 것으로서 예를 들면 항균의 활성이 필요한 곳이면, 식품, 가정, 환경, 의료를 포함하는 다양한 산업 분야에 걸쳐 폭넓게 사용될 수 있다. 예를 들면 본원의 조성물은 화장품의 성분, 여드름치료제, 건강보조/증진식품, 식품첨가제, 항균제제, 가축사료 첨가제로 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 락토페린 유전자의 치환

인간 락토페린 아미노산 서열 (서열번호 1 참조)의 20 내지 31 잔기에 해당하는 CFQWQRNMRKVR 서열의 활성을 증가시키기 위하여, 상기 서열을 CFQW K R AA RKVR (밑줄친 굵게 표시된 부분, HLSA로 명명, 서열번호 2)로 치환하였다. Met은 분리 정제시 펩타이드가 CNBr(Cyanogen bromide) 처리로 인해 잘리게 되는 것을 방지하기 위한 것이다. HLSA의 합성을 위한 올리고 서열은 Forward : 5’ TGCTTCCAATGGAAACGTGCCGCCCGTAAAGTGCGTATG 3’ ; Reverse 5’ ACGCACTTTACGGGCGGCACGTTTCCATTGGAAGCACAT 3’ 이며, 상기 올리고 서열에서 대장균 코돈 사용빈도에 맞춰 원활한 발현을 위해 AGG를 CGT로 치환하였다.

이어 상기 올리고 서열을 상보적으로, 단일 올리고 서열을 동량으로 혼합 한 후 95℃에서 4℃까지 1℃/1분의 속도로 온도가 떨어지도록 반응하여 서로 상보적으로 결합하도록 하여 HLSA 단편을 수득하였다.

실시예 2 락토페린 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조

이어 실시예 1에서 제조한 HLSA 단편을 KIS를 포함하는 pET31b(+) (Novagen 사, USA)에 클로닝하여 pHLSA를 수득하였다. 즉 HLSA 단편은 양 말단이 스티키 구조이고, pET31b(+)를 AlwNI으로 자른 후 클로닝을 위한 라이게이션을 수행하였다. 이어 상기 라이게이션 산물을, LB (Luria-Bertani) 배지에서 배양된 OD₆₀₀에서 0.6~0.8 값의 E.coli BL21(DE3)pLys에 CaCl₂ 를 사용하여 형질전환한 후, 34㎍/ml의 클로르암페니콜과 50㎍/ml의 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에 도말한 후 37℃에서 배양하여 플라스미드를 포함하는 균주를 선별하였다.

실시예 3 락토페린 펩타이드 발현 및 분리정제

실시예 2에서 제작된 pHLSA 플라스미드는 T7 프로모터를 갖고 있으며 이는 HLSA의 발현을 위한 프로모터로서 작용하며, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 을 이용한 유도 발현이 가능하다. 따라서 실시예 2에서 선별된 플라스미드를 포함하는 대장균을 LB 배지에 접종한 후 37℃, 250rpm 에서 16시간 배양 한 후, 100ml의 LB 배지에 1%의 농도로 새로 접종한 후 OD₆₀₀에서 0.6~0.8이 될 때까지 배양한 후 1mM IPTG(Sigma Aldrich, USA) 를 첨가하여 융합된 락토페린 펩타이드의 발현을 유도하였다. 이후 5시간 경과 후 1ml의 배양물을 취하고, 이를 원심분리하여 세포를 회수한 후, 0.1 mm 글라스비드(glass bead, BioSpec Products, USA)를 0.05g 첨가하여 1분씩 5회 볼텍스를 수행하여 세포를 파쇄하였다. 이어 이를 15 % SDS-PAGE 및 웨스턴블롯으로 발현 여부를 분석하였다. 웨스턴블롯은 1차 항체로서 항-인간 락토페린 항체 (Sigma Aldrich, USA)를 사용하고, Alkaline Phosphatase (AP) Chemiluminescent 키트 (Biorad, USA)를 제조사의 사용법대로 사용하여 검출하였다. 결과는 도 2a에 있다. 16,000Da의 융합단백질이 대장균에서 성공적으로 발현되었음을 나타낸다.

이어 발현된 KSI.HLSA.6Xhis 융합펩타이드의 정제를 다음과 같이 수행하였다. C-말단에 태깅된 his-tag을 이용한 분리를 위하여, Ni-NTA (Nickel-nitrilotriacetic acid) His-Bind 레진을 이용한 친화크로마토그래피를 수행하였다. 유도발현을 마친 발현 배지 100ml을 분리하여 회수한 후 5ml의 결합 완충액 (5mM Imidazole, 500mM NaCl, 40mM Tris-HCl pH 7.9, 8M Urea)를 넣고 초음파 처리를 하여 세포를 파쇄한 후 상층액을 새로운 시험관에 옮긴 후 1ml의 Ni-NTA agarose (QIGEN, USA)와 함께 4℃, 1hr 동안 결합하도록 두었다. 이후 이를 컬럼에 채우고, 세척 완충액 (10mM Imidazole, 500mM NaCl, 40mM Tris-HCl pH 7.9, 8M Urea)로 3회 세척한 후 용출 완충액 (300mM Imidazole, 500mM NaCl, 40mM Tris-HCl pH 7.9, 8M Urea) 25ml로 용출한 후 15% SDS-PAGE 분석과 웨스턴블롯으로 발현 여부를 분석하였다. 웨스턴블롯은 1차 항체로서 항-인간 락토페린 항체 (Sigma Aldrich USA)를 사용하고, Alkaline Phosphatase (AP) Chemiluminescent 키트 (Biorad, USA)를 제조사의 사용법대로 사용하여 검출하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2b의 왼쪽은 SDS-PAGE 분석결과이고 오른쪽은 웨스턴블롯의 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이 16,000Da의 융합단백질을 발현 정제할 수 있었다.

이어 CNBr을 이용하여 융합단백질을 제거하고 HLSA 펩타이드를 순수 분리하였다. 상술한 바와 같이 정제된 (KSI-HLSA-6xhis) 융합펩타이드에서 KSI를 HLSA와 분리하기 위하여 CNBr로 절단을 수행하고, 70% 포름산 및 CNBr을 제거하기 위하여 투석을 수행하였다. 구체적으로 변성 (Denaturation) 조건으로 정제된 (KSI-HLSA-6xhis) 융합 펩타이드는 1L PBS (Phophate Buffered Saline)를 이용해 12시간 씩 3회 투석하였다. KSI의 불용성 성질에 의해 하얀 침전이 발생하였으며, 이를 원심분리로 회수하였다 (침전물 약 50mg). 이어 상층액은 제거 한 후, KSI-HLSA-6xhis 를 70% 포름산 30ml에 용해한 후 20mg의 CNBr(Sigma Aldrich, USA)을 첨가하여 빛이 없는 곳에서 18~22 시간 동안 반응시켰다.

이후 PBS로 투석을 실시하였으며, 투석에 사용된 막 (membrane pore size : 1kDa cut off) 밖으로 6xhis는 빠지게 되며 막안에는 PBS 완충액에 녹지 않는 KSI 가 하얗게 침전되며 용액 내에는 HLSA peptide가 존재하였다. 이어 15 % SDS-PAGE 전기영동을 한 후 염색용액 (0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol)에서 1시간 염색 후 탈색용액 (200 ml methanol, 100 ml glacial acetic acid ,700 ml ddH₂O)에 30분이상 탈색하여 가시화 하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 3에 나타난 바와 같이 CNBr을 처리하여 KSI와 HLSA가 분리됐음을 확인하였다 (화살표 참조).

실시예 4 락토페린 펩타이드의 항균 활성능 평가

실시예 3에서 분리된 락토페린 펩타이드의 항균 활성능을 콜로니 카운팅 방법으로 조사하였다. 테스트 균주로서 스테필로코커스 아루레스 (Staphylococcus aureus)를 사용하였다. 스테필로코커스 아루레스(ATCC 6538P)를 37℃, 250rpm LB 배지에서 하룻밤 배양한 후, LB 배지에서 1% 새 배양액 (50ml culture)으로 접종 한 후 OD₆₀₀에서 0.6까지 키운 후 10^-4으로 희석한 후, 정제된 HLSA 펩타이드 100㎍ 을 첨가하여 37℃, 250rpm조건에서 2시간 동안 배양하였다. 이어 1% 펩톤 1.5% 아가로 제작된 고체 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 콜로니 수를 세었다. 음성 대조군으로는 항균제를 첨가하지 않은 것, 양성대조군으로는 암피실린을 사용하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 항균제 혹은 HLSA 를 첨가하지 않은 음성대조군을 도말한 플레이트의 콜로니 수를 100으로 하고, 나머지 양성대조군(암피실린 첨가)과 실험군(HLSA 첨가) 플레이트에서 나온 콜로니 개수를 비교하여 생존률%로 환산하여 그래프로 나타내었다. 도 4에 기재된 바와 같이, 본원의 락토페린 펩타이드는 암피실린에 필적하는 항균활성을 가지고 있음을 나타낸다.

<110> Hankuk University of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> Peptide having antibacterial activity derived from lactoferrin and method for producing the same <130> DP201206003 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(692) <223> lactoferrin <400> 1 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 355 360 365 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 530 535 540 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 565 570 575 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 580 585 590 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 595 600 605 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 610 615 620 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 625 630 635 640 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 645 650 655 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 660 665 670 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 675 680 685 Ala Ala Ala Ala 690 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human lactoferrin <400> 2 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Nucleotide Sequence encoding lactoferrin peptide of SEQ ID NO:2 <400> 3 tgcttccaat ggaaacgtgc cgcccgtaaa gtgcgt 36

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 락토페린 유래 펩타이드.
제 1 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산.
제 2 항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3의 서열을 갖는 것인, 핵산.
제 2 항 또는 제 3 항에 따른 핵산, 상기 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드의 항균 활성능을 중성화 시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 핵산 및 상기 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 플라스미드.
제 4 항에 있어서, 상기 펩타이드의 항균 활성능을 중성화 시킬 수 있는 단백질은 KIS. MMIS, GFP 또는 GST인, 플라스미드.
제 4 항에 있어서, 상기 프로모터는 미생물 발현용 프로모터인, 플라스미드.
제 6 항에 있어서, 상기 프로모터는 T7, lac, trc, trp, P_L, ara BAD, 또는 tetA 인, 플라스미드.
제 6 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도 1a의 개열지도로 표시되는, 플라스미드.
제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 플라스미드로 형질전환된 미생물.
제 9 항에 있어서, 미생물은 대장균, 고초균, 코리네박테리움, 또는 유산균인, 플라스미드.
(a) 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 플라스미드를 미생물에 형질전환 하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 형질전환된 미생물을 배양하여 락토페린을 미생물 숙주세포에서 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린의 미생물 발현 방법.
제 1 항에 따른 펩타이드를 포함하는 면역 증강 또는 항균 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 항균조성물은 화장품의 성분, 여드름치료제, 건강보조식품, 항균제제, 가축 사료 첨가제로 사용되는 것인, 조성물.