CN114344450B - 一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用 - Google Patents

一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的应用。牙鲆补体C3a为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。本发明的牙鲆补体C3a蛋白能够与多种细菌结合，且能显著抑制牙鲆体内迟缓爱德华氏菌数量的增加。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。

Description

一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的应用。
背景技术
补体系统大约由30多种，包括固有成分、调节因子和补体受体在内的蛋白质组成。这个复杂而精密的防御系统在机体的固有免疫与适应性免疫反应中发挥着重要的作用。补体系统可以由多种途径激活发挥作用，其中经典途径，旁路途径和凝集素途径是补体激活的3种途径。补体系统通过三条途径激活后均生成C3转移酶，进一步切割C3，生成C3a和C3b等具有重要生物学活性的小片段。C3a是一种重要的免疫小分子，C3a可以诱导嗜酸性粒细胞和肥大细胞的趋化反应，并促进免疫反应中的炎症反应。补体成分C3a已在多种鱼类中发现，但是，在牙鲆中其功能和应用性研究尚十分缺乏。
发明内容
本发明目的在于提供一种牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种补体成分C3a的应用，牙鲆补体成分C3a(PoC3a)在制备抑菌剂中的应用。
所述补体成分C3a在制备迟缓爱德华氏菌抑菌剂中的应用。
所述补体成分C3a(PoC3a)为序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示。
所述补体成分C3a的构建为以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得到重组质粒，将其转化至BL21(DE3)，而后纯化即得含序列表SEQ IDNo.1所示的补体成分C3a蛋白；
所述引物F1和R1分别为：
F1，5’-GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC-3；
R1，5’-CTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCTTTGTAATCGCGAGCCAAGTCGAGCTGAT-3’。
进一步的说：
1)表达载体pEtPoC3a-sumo的构建
以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple进行连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素的LB培养基上培养8-12h，筛选转化子提取质粒，得重组质粒；将重组质粒用BamH1和Xho1酶切，回收目的片段，连接于pET28a-sumo，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为表达载体pEtPoC3a-sumo；
2)补体成分C3a的制备
将上述步骤1)的质粒pEtPoC3a-sumo转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pEtPoC3a-sumo；经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，并用Sumo蛋白酶去除Sumo标签后，即为含序列表SEQ IDNo.1所示的补体成分C3a蛋白。
一种构建补体成分C3a的引物对，构建牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的引物对为所述引物F1和R1分别为：
F1，5’-GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC-3；
R1，5’-CTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCTTTGTAATCGCGAGCCAAGTCGAGCTGAT-3’。
本发明具有如下优点：
本发明采用的补体成分C3a是来自于牙鲆补体系统的一种多肽，含有一个ANATO结构域。本发明的补体成分C3a能够与多种细菌结合，且能显著抑制鱼类常见病原菌迟缓爱德华氏菌在鱼体内数量的增加。
本发明的补体C3a蛋白可制备为抑菌剂，其制备过程简单，对环境和鱼体均无安全隐患，具有结合多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力以及抑制能力，同时对鱼类常见病原菌迟缓爱德华氏菌具有显著的抑制其在鱼体内数量增加的能力，进而进一步证明所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的牙鲆补体成分C3a重组蛋白(rPoC3a)结合多种细菌的能力效果图。
图2为本发明实施例提供的牙鲆补体成分C3a重组蛋白(rPoC3a)抑制迟缓爱德华氏菌在鱼体内数量增加的能力效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
牙鲆补体成分C3a重组蛋白的制备
(1)补体成分C3a表达质粒pEtPoC3a-sumo的构建
本发明的牙鲆补体成分C3a通过原核蛋白表达系统获得，其序列为序列表SEQ IDNo.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
ATTVMNVTTTLVNKYKNELQRECCSEGMKETILSYTCEVRSEYILDGASCVDAFLHCCKEMENLRGEMKQDQLDLAR
(a)序列特征：
●长度：77
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：牙鲆
以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple进行连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素的LB培养基上培养8-12h，筛选转化子提取质粒，得到重组质粒；将重组质粒用BamH1和Xho1酶切，回收目的片段，连接于pET28a-sumo载体，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为表达载体pEtPoC3a-sumo。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。所述引物F1和R1分别为：
F1，5’-GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC-3；
R1，5’-CTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCTTTGTAATCGCGAGCCAAGTCGAGCTGAT-3’。
PCR扩增条件：
94℃-4min，(94℃-30s，65℃-30s，72℃-1min)-35循环，72℃-8min，4℃-5min。
PCR反应体系：10×Easy Taq buffer 1μl；DNTPs 0.5μl；F引物(10μM)0.2μl；R引物(10μM)0.2μl；EasyTaq DNA Polymerase 0.2μl；cDNA模板1μl；ddH2O 16.9μl。
(2)表达补体成分C3a的重组蛋白的诱导表达和纯化
将上述的质粒pEtPoC3a-sumo用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“全式金生物科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子，将其命名为BL21/pEtPoC3a-sumo。将BL21/pEtPoC3a-sumo于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取5ml过夜后的培养液，加入500ml新鲜的含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃继续以转速120rpm摇动培养12小时，而后以8000g，4℃离心10min，收集菌体，然后加入10ml裂解缓冲液重悬菌体，并进行超声破碎。将破碎后的菌液以12000g，4℃离心60min，回收上清。将上清中的重组蛋白用亲和层析柱His Trap HPColumns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化。
所述裂解缓冲液为终浓度的50mM NaH2PO4、300mM NaCl和10mM咪唑，pH 8.0。
实施例2
含牙鲆补体成分C3a的重组蛋白(rPoC3a)结合多种细菌能力的检测：
将不同细菌分别接种于5ml液体LB培养基中培养至OD600约为0.8，其中，迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、荧光假单胞杆菌于28℃培养；大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌于37℃培养；
将海豚链球菌接种于TSB培养基28℃培养，至OD600约为0.8。
将上述各细菌分别用包被液稀释到108CFU/ml，作为细菌稀释液，将上述实施例1中纯化的蛋白在PBS中梯度稀释至0.3125μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml，即为rPoC3a的稀释液。
将上述细菌稀释液与不同浓度的补体成分C3a重组蛋白rPoC3a的稀释液或标签蛋白rSumo(对照组)混合，孵育2h，依次加入小鼠抗Flag抗体(针对补体成分C3a重组蛋白rPoC3a)或小鼠抗His抗体(针对标签蛋白rSumo)和羊抗小鼠IgG抗体，用TMB显色，在450nm测定吸光值。结果表明，补体成分C3a重组蛋白rPoC3a具有结合多种革兰氏阳性菌和多种革兰氏阴性菌的能力，且结合能力随蛋白浓度的升高而升高(图1)。
上述包被液成分为：15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，PH 9.6。
实施例3
补体成分C3a重组蛋白rPoC3a抑制鱼体内迟缓爱德华氏菌数量增加的能力
步骤1)重组蛋白rPoC3a的注射
将45条牙鲆(每条重约24.3g)随机分为3组，每组15条。将这3组分别命名为A、B和C组。将A组的每条牙鲆分别腹腔注射100μl PBS，将B组的每条牙鲆分别腹腔注射100μl重组蛋白rPoC3a的稀释液(包含20μg重组蛋白rPoC3a)，将C组的每条牙鲆分别腹腔注射100μl标签蛋白rSumo(包含20μg标签蛋白rSumo)。
步骤2)细菌的培养
将迟缓爱德华氏菌接种于5ml液体LB，培养至OD600约为0.8，然后离心(10000g)2分钟。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为106CFU/ml。
步骤3)攻毒感染
在步骤1)重组蛋白rPoC3a注射后6小时，用上述步骤2)的迟缓爱德华氏菌悬液肌肉注射步骤1)中的3组鱼，每条鱼的注射量100μl。在感染后的12、24和48小时这3个时间点，每个时间点取牙鲆血、脾脏和肾脏组织，在1ml PBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，B组鱼血、脾脏和肾脏的细菌数显著(P<0.05)低于C组鱼，但C组鱼血、脾脏和肾脏的细菌数与A组鱼无显著差异(图2)。这些结果表明，重组蛋白rPoC3a能够显著增强牙鲆抵抗细菌的侵染,可以作为一种抑菌剂应用于细菌性疾病的防控。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Thr Thr Val Met Asn Val Thr Thr Thr Leu Val Asn Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Asn Glu Leu Gln Arg Glu Cys Cys Ser Glu Gly Met Lys Glu Thr Ile
20 25 30
Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Val Arg Ser Glu Tyr Ile Leu Asp Gly Ala
35 40 45
Ser Cys Val Asp Ala Phe Leu His Cys Cys Lys Glu Met Glu Asn Leu
50 55 60
Arg Gly Glu Met Lys Gln Asp Gln Leu Asp Leu Ala Arg
65 70 75
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccatgg ctaccactgt aatgaacgtc 30
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagtcac ttgtcatcat cgtctttgta atcgcgagcc aagtcgagct gat 53

Claims (4)

1.一种牙鲆补体成分C3a的应用，其特征在于：牙鲆补体成分C3a在制备迟缓爱德华氏菌抑菌剂中的应用。
2. 按权利要求1所述牙鲆补体成分C3a的应用，其特征在于：所述牙鲆补体成分C3a氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1所示。
3. 按权利要求1所述牙鲆补体成分C3a的应用，其特征在于：所述补体成分C3a的构建为以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得到重组质粒，将其转化至BL21(DE3)，而后纯化即得含序列表SEQ ID No.1所示的补体成分C3a蛋白；
所述引物F1和R1分别为：
F1，5’-GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC-3；
R1，5’-CTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCTTTGTAATCGCGAGCCAAGTCGAGCTGAT-3’。
4. 按权利要求3所述牙鲆补体成分C3a的应用，其特征在于：
1) 表达载体pEtPoC3a-sumo的构建
以牙鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple进行连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素的LB培养基上培养8-12 h，筛选转化子提取质粒，得重组质粒；将重组质粒用BamH1和Xho1酶切，回收目的片段，连接于pET28a-sumo，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为表达载体pEtPoC3a-sumo；
2) 补体成分C3a的制备
将上述步骤1)的质粒pEtPoC3a-sumo转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pEtPoC3a-sumo；经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，并用Sumo蛋白酶去除Sumo标签后，即为含序列表SEQ ID No.1所示的补体成分C3a蛋白。
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