CN107365372B - 一种凡纳滨对虾l型凝集素及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾L型凝集素及其编码基因和应用。本发明首次从凡纳滨对虾鳃组织中克隆出凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第18‑1007位碱基所示。凡纳滨对虾L型凝集素LecV，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的凡纳滨对虾L型凝集素LecV具有凝集细菌和在对虾体内快速清除细菌的功能，说明了凡纳滨对虾L型凝集素LecV参与了对虾类免疫调控机制，促进了对虾类免疫调控机制的研究，为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供了可靠的遗传标记，同时也可以对虾遗传改良提供新的靶位点。

Description

一种凡纳滨对虾L型凝集素及其编码基因和应用
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾L型凝集素及其编码基因和应用。
背景技术：
L型凝集素(L-type Lectin)首先是在豆科植物种子中被发现并命名。植物源L型凝集素为可溶性分子，而在动物中L型凝集素是膜结合蛋白。目前在人类和其他哺乳动物中已发现4种L型凝集素：ERGIC-53、类ERGIC-53型凝集素、VIP36和类VIP36型凝集素。这些凝集素都含有一个大的胞外结构域和一个短的参与早期蛋白分泌途径的细胞溶质结构域。L型凝集素与其它凝集素主要区别在于其三级结构上，其单体或者更复杂的凝集素的糖类识别结构域都是由β-弯曲或者反平行的β-折叠短环连接的，不含α-螺旋结构。这些片层形成屋顶一样的结构，糖类结合位点一般位于“屋顶”样结构的顶端。
在植物中报道了许多凝集素参与的免疫反应，而在动物中，有关L型凝集素参与免疫反应的报道较少。在斑点叉尾鮰的L型凝集素的研究中克隆到三种L型凝集素，分别属于VIP36型、类VIP36型和ERGIC-53型。进化分析显示三种凝集素与其它物种中的L型凝集素属直系同源关系。通过qRT-PCR分析它们的组织分布，发现这三个基因存在于所有被检测组织中，不同的是，VIP36型在头肾中表达较多，类VIP36型在脑中表达较多，而ERGIC-53型在肝脏中表达较多。通过爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)感染斑点叉尾鮰后发现三种凝集素在头肾中均表达上调，但三者的表达模式存在差异：ERGIC-53型在感染细菌后的第七天在头肾中表达量达到最大值；VIP36型在感染细菌后第三天在脑和头肾中表达上调；类VIP36型在感染细菌后的不同时间和组织表现出不同程度的上调。这些证据初步说明L型凝集素参与了由爱德华氏菌感染引起的免疫反应。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，俗称南美白对虾，是广温广盐性热带虾类。目前已成为全世界最主要的养殖对虾种，我国凡纳滨对虾养殖产量占养殖对虾总产量的80％以上，凡纳滨对虾养殖产业已成为我国水产养殖的支柱性产业。然而近年来频繁暴发的各类疾病给养殖户带来了巨大的损失。同时抗生素等药物的广泛使用也带来了药物残留，环境污染，产生抗药性菌株等负面影响。从各种途径提高对虾机体的抗病力，一直是对虾种业和养殖业发展的追求目标，选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种，成为近十年来对虾种业发展的关键。在其中，探索阐述虾类免疫防御机制是非常重要的基础工作，探查免疫功能基因及其功能也可以加快从遗传工程或遗传选育途径进行的育种工作。L型凝集素作为免疫防御因子，其基因特征及功能在凡纳滨对虾中还没有任何报道。因此获取L型凝集素基因及氨基酸序列特征，并研究其功能可促进对虾类免疫调控机制的研究，为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供遗传标记，同时也可为对虾遗传改良提供新的靶位点。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凡纳滨对虾L型凝集素及其编码基因和应用。
本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾L型凝集素LecV，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
优选，所述的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第18-1007位碱基所示。
本发明根据凡纳滨对虾转录组数据中的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV部分基因序列，设计了特异性引物。提取凡纳滨对虾鳃组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用上述特异性引物进行5’RACE和3’RACE扩增出lecV基因片段，分别连接到pMD19-T载体上，获得重组载体pMD19-lecV1和pMD19-lecV2，获得的序列与原有转录组基因中间序列进行拼接，获得lecV全基因序列及部分非编码区序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。该序列包含一个开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第18-1007位碱基所示，为990个碱基，将该基因命名为凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，其编码蛋白具有329个氨基酸残基(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，将该蛋白命名为凡纳滨对虾L型凝集素LecV。
将凡纳滨对虾L型凝集素LecV氨基酸序列进行Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，发现凡纳滨对虾L型凝集素LecV仅与Marsupenaeus japonicus的L型凝集素氨基酸序列存在97％的一致性(如图2所示)，二者存在11个氨基酸位点差异，说明凡纳滨对虾L型凝集素LecV是一个新发现的蛋白，因此其编码基因也是一个新的基因。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的重组表达载体。
所述的重组表达载体中的表达载体优选为原核表达载体pET28b。考虑到表达载体的多样性，对表达载体更换，但表达基因的核心为lecV基因，也属于本发明的保护范围。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述的重组表达载体的细菌。
所述的细菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供上述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV在制备细菌凝集制剂中的应用。
所述的细菌优选为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibrio vμlnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)或哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
本发明的第六个目的是提供上述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV在制备清除动物体内细菌药物中的应用。所述的动物优选为凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)。所述的细菌优选为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
本发明首次从凡纳滨对虾鳃组织中克隆出凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，并通过实验证明其编码蛋白(凡纳滨对虾L型凝集素LecV)具有凝集细菌和在对虾体内快速清除细菌的功能。因此本发明证实了凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的功能，促进了对虾类免疫调控机制的研究，为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供了可靠的遗传标记，同时也可以对虾遗传改良提供新的靶位点。
附图说明：
图1是凡纳滨对虾鳃组织RNA电泳图，其中1-4均为提取的凡纳滨对虾鳃组织RNA；
图2是凡纳滨对虾L型凝集素LecV与最相近蛋白的Blastp对比结果图；
图3是凡纳滨对虾L型凝集素LecV的SDS-PAGE电泳分析结果；其中，M为ProteinMarker；1为诱导前菌液总蛋白；2为诱导后菌液总蛋白；3为纯化的目的蛋白；
图4是凡纳滨对虾L型凝集素LecV引起哈氏弧菌的凝集图；其中，“-”表示不添加，“+”表示添加；
图5是凡纳滨对虾L型凝集素LecV促进凡纳滨对虾体内清除细菌结果；其中，*表示p<0.05。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实施例中所用的引物，其序列见表1，所有引物均由上海生物工程有限公司合成，除非特别说明，所有引物的浓度为10mM。
表1引物序列表
Figure BDA0001391320190000051
Figure BDA0001391320190000061
实施例中所涉及的主要材料来源如下：
大肠杆菌JM109感受态细胞(上海唯地生物)、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(北京天根生化)、pMD19-T载体(TaKaRa，中国)、原核表达载体pET28b(上海玉博)。
实施例1：凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的克隆、测序及序列分析
(1)引物设计
根据本实验室的凡纳滨对虾转录组数据获得部分L型凝集素基因序列，根据此部分序列设计5’/3’RACE用引物(见表1)。
(2)RNA的提取
以凡纳滨对虾鳃组织为材料，使用Trizol法提取总RNA。操作步骤：将适量大小的超低温冻结的鳃组织块迅速放入1.5mL的离心管中加500μL的Trizol提取液(invitrogen)，按照Trizol提取液的说明书进行RNA的提取。RNA电泳结果如图1所示。
(3)cDNA的合成，扩增基因lecV的cDNA并克隆、测序
1)3’RACE
以提取的凡纳滨对虾鳃组织RNA为模板，采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNASyntheis Kit(TaKaRa，中国)进行反转录。具体步骤为：模板RNA1μL(约3μg)、引物3’CDS(50μM)1μL、dNTP Mixture(10mM each)1μL，RNase free dH2O补足至总体积至10μL；65℃保温5min，冰上迅速度冷却。上述变性后反应液10μL、5×PrimerScript II Buffer 4μL、RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL、PrimeScript II RTase(200U/μL)1μL，RNase free dH2O补足总体积至20μL；缓慢混匀，42℃处理60min，然后70℃处理15min，获得cDNA。
以cDNA为模板，分别使用特异性引物3’RACE-1和通用引物UPMA(UPMA为UPMA-L与UPMA-S的混合引物)进行PCR，扩增基因lecV的3’端片段。PCR反应体系总体积共50μL：cDNA模板2μL、引物3’RACE-1 1μL、引物UPMA1μL、2×HiFi Taq PCR StarMix(Genstar)25μL，加ddH2O补足至50μL。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。将上述PCR产物稀释100倍，以稀释后的PCR产物为DNA模板，采用3’RACE-2和通用引物NUPA进行巢式PCR扩增基因lecV的3’端片段。PCR反应体系总体积共50μL：DNA模板2μL、引物3’RACE-2 1μL、引物NUPA1μL、2×HiFiTaq PCR StarMix(Genstar)25μL、加ddH2O补足至50μL。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。采用Biomiga公司的EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit对巢式PCR产物进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。
2)5’RACE
以提取的凡纳滨对虾鳃组织RNA为模板，采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNASyntheis Kit(TaKaRa，中国)进行反转录。具体步骤为：模板RNA1μL(约3μg)、特异引物5’RACE-11μL、dNTP Mixture(10mM each)1μL，RNase free dH2O补足至总体积至10μL；65℃保温5min，冰上迅速度冷却。上述变性后反应液10μL、5×PrimerScript II Buffer 4μL、RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL、PrimeScript II RTase(200U/μL)1μL，RNase free dH2O补足总体积至20μL；缓慢混匀，42℃处理60min，然后70℃处理15min，获得cDNA。将获得的反转录产物采用Biomiga公司的EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。采用Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TaKaRa，中国)对上述纯化产物DNA末端加C，操作步骤参照说明书。
以上述加C后产物为模板，分别使用通用引物UPMA和特异引物5’RACE-1进行PCR扩增基因lecV的5’端片段。PCR反应体系总体积共50μL：cDNA模板2μL、引物UPMA 1μL、引物5’RACE-1 1μL、2×HiFiTaq PCR StarMix(Genstar)25μL，加ddH2O补足至50μL。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。将上述PCR产物稀释100倍，以稀释后的PCR产物为模板，进行巢式PCR扩增基因lecV的5’端片段，采用通用引物NUPA和特异引物5’RACE-2进行巢式PCR，PCR反应体系总体积共50μL：cDNA模板2μL、引物NUPA 1μL、引物5’RACE-2 1μL、2×HiFiTaq PCR StarMix(Genstar)25μL，加ddH2O补足至50μL。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。采用Biomiga公司的EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit对巢式PCR产物进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。
采用pMD19-T Vector Kit对基因lecV的5’和3’端片段分别进行TA克隆。具体操作步骤：向200μL的PCR反应管中加入T-Vector pMD19 1μL、步骤1)纯化后的巢式PCR产物或步骤2)纯化后的巢式PCR产物4μL、Ligation Solution I 5μL，置于金属浴中16℃连接30min。
将上述连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。操作步骤见JM109感受态细胞说明书。取100μL转化并恢复培养的菌液涂布带有Amp抗性的LB平板。
挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，采用上游引物M13F和下游引物M13R进行菌液PCR检测，得到含有5’RACE PCR产物纯化后DNA的重组载体pMD19-lecV1和含有3’RACE PCR产物纯化后DNA的重组载体pMD19-lecV2的阳性克隆。将阳性克隆递交测序(上海生工)，获得的序列与原有转录组基因中间序列进行拼接，获得lecV全基因序列及部分非编码区序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。经分析表明，该序列含有一个开放阅读框(ORF)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第18位-1007位碱基所示，ORF全长为990bp，该ORF编码基因命名为凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV编码蛋白具有329个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为凡纳滨对虾L型凝集素LecV。
将凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV与NCBI数据库进行比对，发现该基因与Marsupenaeus japonicus的L型凝集素基因序列的同源性为90％。采用Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将凡纳滨对虾L型凝集素LecV与NCBI数据库进行比对，发现该蛋白和Marsupenaeus japonicus的L型凝集素蛋白序列的覆盖度为99％，一致度为97％(如图2所示)，LecV具有L型凝集素的保守结构域，说明LecV具有L型凝集素蛋白的结构特征。经Blastp比对，凡纳滨对虾L型凝集素LecV序列不与任何先前已公布的蛋白序列一致，说明其是一个新发现的蛋白，其编码基因lecV也是一个新发现的基因。
通过在线程序SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)分析发现，凡纳滨对虾L型凝集素LecV具有一个由24个氨基酸组成的信号肽、一个由226个氨基酸组成的LecV结构域和一个由23个氨基酸组成的跨膜结构域。其分子量为37313.36Da，理论等电点为5.92。通过NetNGlyc 1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析发现凡纳滨对虾L型凝集素LecV具有一个糖基结合位点(NGT)，说明凡纳滨对虾L型凝集素LecV具有与糖基结合的特性，为阐明凡纳滨对虾L型凝集素LecV与细菌表面糖蛋白结合从而使细菌发生凝集现象提供理论依据。
实施例2：构建原核重组表达载体pET28b-lecV
采用引物pET28b-F和引物pET28b-R扩增原核表达载体pET28b。操作步骤：PCR反应体系总体积共50μL：原核表达载体pET28b 2μL、引物pET28b-F 1μL、引物pET28b-R 1μL、Primestar DNA聚合酶预混液(TaKaRa，中国)25μL、加ddH2O补足至50μL。反应条件为：98℃2.5min；98℃变性10sec，56℃退火25sec，72℃延伸5min，35个循环；72℃反应10min。采用PCR产物纯化试剂盒对上述PCR产物进行纯化(TaKaRa，中国)，获得线性化的pET28b载体。
采用引物LectinEx-F和LectinEx-R扩增凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV。具体操作步骤：PCR反应体系总体积共50μL：cDNA模板2μL、引物LectinEx-F 1μL、引物LectinEx-R1μL、Primestar DNA聚合酶预混液(TaKaRa，中国)25μL，加ddH2O补足至50μL。反应条件为：98℃2.5min；98℃变性10sec，56℃退火25sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。采用PCR产物纯化试剂盒对上述PCR产物进行纯化(TaKaRa，中国)，获得纯化的并且两端具有pET28b同源序列的lecV基因片段。
Figure BDA0001391320190000101
II One Step Cloning Kit(Vazyme，中国)对线性化载体pET28b与lecV基因片段进行体外重组。具体操作步骤：向200μL的PCR反应管中加5×CE II Buffer 4μL、
Figure BDA0001391320190000102
II、线性化原核表达载体pET28b 100ng、两端具有pET28b同源序列的lecV基因片段200ng、加水补足至总体积20μL。将上述反应管放置在37℃的水浴锅中水浴60min，待反应完成后冰水浴5min。
将上述连接产物采用热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，操作步骤见其说明书。取200μL培养后的菌液涂布在含有Kan的LB培养基平板上，37℃过夜培养。
挑取菌落接种于带有Kan抗性的LB液体培养基中37℃、200rpm摇床12h。采用引物LectinEx-TF和引物LectinEx-TR进行菌液PCR检测重组情况。得到的含有原核表达重组载体pET28b-lecV的阳性克隆，阳性克隆进一步测序验证，证实为具有正确序列的含重组载体pET28b-lecV的阳性克隆，命名为E.coli BL21(pET28b-lecV)。
实施例3：E.coli BL21(pET28b-lecV)诱导表达和LecV蛋白的纯化
取100μL培养好的E.coli BL21(pET28b-lecV)于4mL液体LB培养基中，37℃摇床培养，至OD600达到0.6，分别加IPTG诱导，以未加IPTG的菌液作为对照。IPTG的工作浓度为0.2mM，诱导时间6h。
各取1mL未经IPTG诱导的样品、经IPTG诱导的样品用于总蛋白分析。具体步骤为：取1mL菌液12000rpm离心3min，弃上清，加入200μL的ddH2O重悬菌液，取15μL菌液并加入4μL的5×protein loading buffer于沸水中加热4min，-20℃保存。
蛋白样品SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤：制备分离胶和浓缩胶，2种样品上样20μL，电泳后取出分离胶，考马斯亮蓝染色1h，脱色过夜，SDS-PAGE电泳结果见图3(泳道1和2)。由图3可见，经IPTG诱导后，预期位置出现明显且量大的蛋白条带，而对照组预期位置没有明显的高含量蛋白出现，表明lecV重组表达菌构建成功，由此得到凡纳滨对虾L型凝集素LecV重组蛋白。凡纳滨对虾L型凝集素LecV重组蛋白纯化委托上海生工生物工程股份有限公司进行，采用常规Ni柱纯化纯度90％，过滤除菌，纯化结果如图3(泳道3)所示。
实施例4：凡纳滨对虾L型凝集素LecV的细菌凝集实验
收集对数生长期的病原细菌，细菌种类包括：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovμlnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。6000rpm，离心5min，弃上清，然后用TBS-Ca(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,10mM CaCl2,pH7.5)缓冲液重悬，重复3次离心，用TBS-Ca调整细菌的浓度使其在OD600值为0.6。为了检测LecV是否为Ca+依赖型凝集素，采用TBS-EDTA(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,4mM EDTA,pH7.5)缓冲液离心、重悬细菌，并调整各菌液OD600值至0.6。重组蛋白LecV的初始浓度为0.75mg/mL，对其进行梯度稀释后，与不同的细菌于200μL PCR反应管混合，其中LecV蛋白的工作浓度为100μg/mL，孵育1h，然后显微镜镜检。使用牛血清蛋白BSA和小家鼠(Musmusculus)的C-type lectin(CTL)做为对照。结果发现，在Ca+存在和缺失两种情况下，LecV都可促使各类细菌发生凝集；CTL蛋白在Ca+存在情况下，细菌发生凝集，在缺失Ca+情况下无凝集现象发生；而BSA对照组则无凝集现象发生。图4是以哈氏弧菌为例的细菌凝集结果显示。本结果表明LecV具有强烈的细菌凝集作用，因此也证实了LecV属于一种凝集素且为钙离子不依赖型。上述Blast搜索表明凡纳滨对虾L型凝集素LecV与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)报道的凝集素lectin(Wang et al,2013.)具有97％的一致度，但二者在99％的覆盖范围内仍有10个氨基酸位点的差异。不仅如此，二者最明显的区别在于，日本囊对虾凝集素lectin(Wang et al,2013.)具有明显的Ca2+依赖性，但本发明中的凡纳滨对虾L型凝集素LecV，不具有Ca2+依赖性，因此本发明中的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的表达产物为新颖的蛋白，且因为不具有钙依赖性，且用途更为广泛。
实施例5：凡纳滨对虾L型凝集素LecV在凡纳滨对虾体内协助清除弧菌实验
收集哈氏弧菌菌液(4×108CFU)750μL，用PBS重悬，离心3次，最终重悬在500μLPBS中。实验组为凡纳滨对虾L型凝集素LecV重组蛋白lecV(工作浓度50μg/mL)与哈氏弧菌(2×108CFU/mL)混合，在30℃孵育0.5h，以BSA和PBS做为对照组。孵育后，100μL孵育液注射到虾体中。在注射后的2min、5min、30min、1h时分别抽取血淋巴200μL，稀释10倍，取100μL稀释液涂布LB平板，30℃培养12h。统计细菌菌落数量，每个组设三个重复。菌落计数统计结果如图5所示。由图5可见，注射2min后实验组和对照组对虾清除弧菌的能力就表现出差异，在5分钟时，实验组对虾体内的弧菌数量明显少于对照组。这一结果表明凡纳滨对虾L型凝集素LecV确实能够帮助凡纳滨对虾快速清除体内的细菌。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种凡纳滨对虾L型凝集素及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1184
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
ggtcagtgtt ggtcgcgatg gagacgatgg cagctgcctt cctcatccca tttctcctgc 60
ttttatcctt ctccccgacc atctccccgc aggaatggaa cacccaggat tacatgaagc 120
gagagcactc cctcgtgaag ccctaccaag gaatgggtac ttctatacca tactgggact 180
tcctgggtaa cactatggtt accaacaatt atattcgttt gacgggagat gtccagagtg 240
tgcgaggagc tgtttggaat aaggttccgt gtttcgtgca aaattgggag atgcagattc 300
agttcaaagt ccacggtcgg gggaaggatt tgtttggtga cggatttgcc ttttggtatg 360
tgaaagatcc catggctgaa ggtgatgttt tcggcagcaa ggatttcttc actggattgg 420
gggttattgc cgacacctac agcaaccaca atggcccaca taatcacggt cacccataca 480
tttctgcgat ggtgaacaat ggtactctcc actacgacca tgaccgagac ggaactcata 540
cgcagctctc tggatgtgtg gcgaagttca ggaatttgga ttatgacact tacctgtcaa 600
tcagatacaa gcatgacaca ttaacagttt ctatagacat cgacaacaag agagcgttta 660
aggagtgctt tacggtgggc ggagtcatat tacccaccgg atactacttt ggcgtatcgg 720
ctgccactgg ggatcttagc gatgcccacg acctaatatc aatgaaatta tatgatattt 780
ccaccccgga tgatgatatc cttcaagacc gagccaatgt aatgccgtct gcctcatttt 840
ttgagccacc aagagaccac gttgacgatc caaaaccctc cgagttgtcg acttggaaaa 900
agattcttct cctcattttt ggagtgattg caatctgcgg ctgtgtcttc attgggggcc 960
tgttctacgt taaacagaaa gagcagcagc gaaagcggtt ctactagaag tttgatgttt 1020
cctttcgaat aggggaaaat atttttagtg agagtgagag tgactgcaaa agtgtttttt 1080
aaccaatgtt attcatggaa gtcttttagt tgatttttag cattttttct ttttctttcc 1140
atcctttatg ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1184
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 2
Met Glu Thr Met Ala Ala Ala Phe Leu Ile Pro Phe Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Ser Pro Thr Ile Ser Pro Gln Glu Trp Asn Thr Gln Asp Tyr
20 25 30
Met Lys Arg Glu His Ser Leu Val Lys Pro Tyr Gln Gly Met Gly Thr
35 40 45
Ser Ile Pro Tyr Trp Asp Phe Leu Gly Asn Thr Met Val Thr Asn Asn
50 55 60
Tyr Ile Arg Leu Thr Gly Asp Val Gln Ser Val Arg Gly Ala Val Trp
65 70 75 80
Asn Lys Val Pro Cys Phe Val Gln Asn Trp Glu Met Gln Ile Gln Phe
85 90 95
Lys Val His Gly Arg Gly Lys Asp Leu Phe Gly Asp Gly Phe Ala Phe
100 105 110
Trp Tyr Val Lys Asp Pro Met Ala Glu Gly Asp Val Phe Gly Ser Lys
115 120 125
Asp Phe Phe Thr Gly Leu Gly Val Ile Ala Asp Thr Tyr Ser Asn His
130 135 140
Asn Gly Pro His Asn His Gly His Pro Tyr Ile Ser Ala Met Val Asn
145 150 155 160
Asn Gly Thr Leu His Tyr Asp His Asp Arg Asp Gly Thr His Thr Gln
165 170 175
Leu Ser Gly Cys Val Ala Lys Phe Arg Asn Leu Asp Tyr Asp Thr Tyr
180 185 190
Leu Ser Ile Arg Tyr Lys His Asp Thr Leu Thr Val Ser Ile Asp Ile
195 200 205
Asp Asn Lys Arg Ala Phe Lys Glu Cys Phe Thr Val Gly Gly Val Ile
210 215 220
Leu Pro Thr Gly Tyr Tyr Phe Gly Val Ser Ala Ala Thr Gly Asp Leu
225 230 235 240
Ser Asp Ala His Asp Leu Ile Ser Met Lys Leu Tyr Asp Ile Ser Thr
245 250 255
Pro Asp Asp Asp Ile Leu Gln Asp Arg Ala Asn Val Met Pro Ser Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Glu Pro Pro Arg Asp His Val Asp Asp Pro Lys Pro Ser
275 280 285
Glu Leu Ser Thr Trp Lys Lys Ile Leu Leu Leu Ile Phe Gly Val Ile
290 295 300
Ala Ile Cys Gly Cys Val Phe Ile Gly Gly Leu Phe Tyr Val Lys Gln
305 310 315 320
Lys Glu Gln Gln Arg Lys Arg Phe Tyr
325

Claims (10)

1.一种凡纳滨对虾L型凝集素LecV，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV。
3. 根据权利要求2所述的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第18-1007位碱基所示。
4.一种含有权利要求2所述的凡纳滨对虾L型凝集素基因lecV的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中的表达载体为原核表达载体pET28b。
6.一种含有权利要求4所述的重组表达载体的细菌。
7. 根据权利要求6所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21(DE3) 。
8.权利要求1所述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV在制备细菌凝集制剂中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细菌为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、创伤弧菌（Vibrio vμlnificus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。
10. 权利要求1所述的凡纳滨对虾L型凝集素LecV在制备清除凡纳滨对虾体内细菌药物中的应用；所述的细菌为哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。
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