CN113209126B

CN113209126B - 一种基于rna干扰技术的对虾免疫增强剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113209126B
Application number: CN202110598646.4A
Authority: CN
Inventors: 左洪亮; 徐晓鹏; 翁可佳; 何建国; 翁少萍; 朱志明
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN113209126A

Abstract

本发明公开了一种基于RNA干扰技术的对虾免疫增强剂及其制备方法与应用，其通过dsRNA特异性干扰凡纳滨对虾LvFtz‑F1β2基因的表达，激活对虾JAK/STAT信号通路，增强对虾免疫力，提高对虾对病原的抗性。该对虾免疫增强剂被对虾取食后，随着饲料的被消化，dsRNA随即被肠道吸收，进入肠道的dsRNA会在肠道中发挥功能，并随着对虾的开放式循环系统运输至其它组织器官，最终造成全身性的RNA干扰。而且，其制备成本低，易在工厂化养殖体系中大规模使用，特异性强，安全性高，对推动对虾养殖业的发展有重要意义。

Description

一种基于RNA干扰技术的对虾免疫增强剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种基于RNA干扰技术的对虾免疫增强剂及其制备方法与应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)俗称南美白对虾，隶属于节肢动物门，甲壳纲，十足目，对虾科，滨对虾属，由于其生长速度快，含肉率高，蛋白质丰富，抗病抗逆能力强等特点，是世界范围内对虾养殖的主要品种。随着全球经济水平上涨，人们生活水平和消费能力随之升级，市场对对虾需求量日益增长。从野生环境捕捞对虾已经满足不了市场对健康对虾的需求，在庞大的市场需求的推动下，对虾养殖业得到了蓬勃发展。然而，伴随着对虾养殖规模的扩大和养殖密度的提高，对虾病害日益严重，高密度养殖模式下，病害一旦发生便会迅速蔓延，造成巨大的经济损失。主要危害全球对虾养殖业的病原主要有病毒、细菌、真菌和寄生虫等，其中危害最大的是病毒和细菌。对虾病毒性病原最主要的是白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，其能够通过水体传播，一旦感染便会迅速传播，如不进行人工干预，短时间内可造成对虾死率亡达100％。对虾细菌性病原主要是弧菌，如：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和创伤弧菌(Vibrio vunificus)，同样传播迅速，能够造成对虾出现急性肝胰腺坏死综合症，进而出现大规模死亡。不仅如此，已知病原物的突变、新病原物的出现以及环境恶化所带来的巨大影响等都会对对虾养殖业带来巨大的压力和挑战，因此，如何利用现代生物学技术，开展对虾免疫机制和病原研究，开发新型对虾抗病制剂，对于提高对虾养殖经济收益，推动对虾养殖业的发展有重要意义。

相关技术中，还未出现消灭对虾病原微生物行之有效的药物。常规用于控制对虾病害的主要为抗生素，但抗生素会在虾体内残留，严重威胁到人类的健康，因此抗生素在在对虾养殖过程中的使用受到严格控制。而对虾免疫增强剂主要是通过提高对虾非特异免疫能力，增强其抗病性，根据其成份可分为化学合成物、多糖、微生物、中草药制剂、细菌提取物、维生素和多肽等。但这些制剂都存在着很多实际应用上的问题，如对于微生态制剂，其需要在对虾养殖养前进行水环境微生物培养，且培养时间较长，无法及时改变水环境中病原与微生物的相互关系。而对于化学合成物、多糖、多肽和细菌提取物，其往往成本高，且其在使用过程中会受到不同分子结构、不同添加剂量、不同饲喂方式以及环境条件等影响，可能产生免疫增强效果低或过度免疫造成免疫疲劳等现象。中草药制剂则存在成份复杂，每种成份在病原和宿主之间的作用机制不清楚的问题，尤其是对于复方中草药，其具体含量配比、提取工艺、药代动力学情况都需要花费大量人力物力。常规的免疫增强剂，如维生素，通常采用注射法、浸泡法和口服法施用，注射法容易造成对虾的应激及死亡，操作耗时长，操作难度大；浸泡法对于药剂吸收率要求高，虾的体表接触不如肌肉和血液吸收快，从而对于药物吸收不理想；口服法虽然方便，但药剂添加到饲料中，投放至水中容易扩散，造成药剂的浪费，也容易污染水体。而且，即便采用包膜技术对饲料进行包膜，其也会存在适口性问题，容易导致动物对饲料的摄入量减少。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。其具有操作简单、特异性强和干扰效率高等优点，被广泛用于疾病治疗以及基因功能研究等领域。RNAi技术在应用过程中，干扰用RNA通常有长双链RNA和小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)两种，而获得dsRNA或siRNA主要通过化学合成和生物合成两种方法。其中，对于化学合成法，其合成成本高，效率低，难以满足大剂量的干扰应用；而生物合成法又可分为真核细胞水平合成和原核细胞水平合成，两者都是借助dsRNA或siRNA表达载体在宿主细胞内表达应用所需的干扰RNA，区别在于宿主细胞一个是真核生物细胞，而另一个则是细菌，但相关技术中，生物合成法因其技术限制仅仅只停留在抑制昆虫生长繁殖的层面上，而在其他更加复杂的生物中的应用尚未得到有效开发。

因此，开发一种基于RNA干扰技术、针对于水产动物的免疫增强制剂，对于降低水产动物病害率，提高水产动物经济效益，推动对虾养殖业的发展有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于RNA干扰技术的对虾免疫增强剂，该免疫增强剂能够通过dsRNA特异性干扰凡纳滨对虾LvFtz-F1β2基因的表达，激活对虾JAK/STAT信号通路，增强对虾免疫力，提高对虾对病原的抗性。

本发明的第一个方面，提供LvFtz-F1β2的抑制剂在制备治疗和/或预防水产动物病原微生物感染的药物中的应用。

核受体超家族(Nucler Receptor Superfamily)根据其配体类型可分为类固醇激素受体、非类固醇激素受体和孤核受体三大类，其中，孤核受体是一类没有或尚未发现配体的核受体类型，主要包括Ftz-F1(Fushitarazu-factor 1)、类维生素A相关孤核受体(RORs)、神经生长因子诱导基因B、受激素受体基因Nr1d1(Rev-Erbα)。发明人发现，孤核受体虽未发现明确的配体，但其能直接与顺式作用元件以单体形式结合，激活下游基因转录，在细胞生殖、生长、分化和代谢等过程中发挥要调节作用。

Janus激酶/信号转导与转录激活子(The Janus kinase/signal transducer andactivator of transcriptions，JAK/STAT)信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，广泛参与细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和免疫调节等多种生物学过程。JAK/STAT信号通路在细胞抗病毒免疫过程中发挥着至关重要的作用，在病毒入侵后，宿主的干扰素(IFN)通路被激活，分泌的IFN通过与其细胞受体结合，激活JAK/STAT信号通路，调控一系列IFN刺激基因(ISGs)的表达进而启动宿主的抗病毒状态。激活态STAT抑制因子(Protein inhibitor of activated STAT，PIAS)是JAK/STAT通路的重要抑制因子，能够与磷酸化后的STAT结合，抑制其入核转运。当PIAS被抑制后，STAT磷酸化水平和入核水平均显著升高，JAK/STAT通路下游调控基因的转录也显著增强。

发明人基于其研究，在凡纳滨对虾中鉴定出了一种新的Ftz-F1的β亚型同源蛋白(LvFtz-F1β2)，根据对其进行功能性研究，发现LvFtz-F1β2能够激活JAK/STAT信号通路抑制因子PIAS的转录，抑制STAT入核，进而抑制对虾JAK/STAT通路的信号传导，降低对虾免疫力。在对对虾活体水平敲降该基因后，能够有效激活对虾免疫因子的转录，促进对虾血淋巴细胞的吞噬能力，增强对虾对WSSV和副溶血弧菌的抵抗能力。

LvFtz-F1β2调控PIAS抑制STAT的分子机制如说明书附图图1所示。

根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些优选实施方式中，所述LvFtz-F1β2基因的核苷酸片段如SEQ IDNO.2所示。

根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2基因的核苷酸片段如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5所示的核苷酸片段为LvFtz-F1β2基因的核心功能区，通过干扰该核苷酸片段能够抑制PIAS的表达，促进STAT的转录调控功能，激活JAK-STAT信号通路活性，最终增强对虾的免疫能力。

根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2的抑制剂为抑制LvFtz-F1β2蛋白活性的物质、或降解LvFtz-F1β2的物质、或降低LvFtz-F1β2表达水平的基因工具。

在本发明的一些优选实施方式中，所述基因工具为：

(1)靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA，

(2)含有靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA的载体或病毒。

(3)含有靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA的重组菌或转基因细胞。

本发明使用大肠杆菌表达dsRNA的方式，大量获得能够特异性干扰LvFtz-F1β2正常表达的dsRNA，便用在对虾养殖过程中方便、快捷和高效的获得足够量的dsRNA。

根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述病原微生物包括细菌和病毒。

在本发明的一些优选实施方式中，所述细菌为溶血弧菌，所述病毒为WSSV。

根据本发明第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述水产动物为对虾。

在本发明的一些优选实施方式中，所述对虾为凡纳滨对虾。

本发明的第二个方面，提供LvFtz-F1β2的抑制剂在制备水产动物免疫增强剂中的应用。

本发明以LvFtz-F1β2为靶标基因，构建一种能够表达特异性干扰LvFtz-F1β2基因的dsRNA表达质粒L4440-LvFtz-F1β2，并将该质粒导入至dsRNA表达大肠杆菌(Escherichiacoli)HT115(DE3)中，经IPTG诱导大肠杆菌表达能够特异性抑制LvFtz-F1β2的dsRNA。通过将表达了LvFtz-F1β2-dsRNA的大肠杆菌与对虾饲料均匀混合，并使用海藻酸钠将大肠杆菌包被于对虾饲料表面，最后使用这种含有LvFtz-F1β2-dsRNA表达大肠杆菌的饲料饲喂凡纳滨对虾。通过对饲喂的对虾进行副溶血弧菌或WSSV攻毒试验，可以发现凡纳滨对虾食用含LvFtz-F1β2-dsRNA表达大肠杆菌的饲料后，其抵抗副溶血弧菌和WSSV的能力均显著增强。说明通过大肠杆菌表达的LvFtz-F1β2-dsRNA能够过饲喂的方式进入凡纳滨对虾体内，特异性抑制LvFtz-F1β2基因的表达，进而激活凡纳滨对虾的免疫系统，增强其对弧菌和WSSV的抵御能力，从而可进一步开发作为一种新型对虾免疫增强剂，应用于对虾养殖产业中，增强对虾抗病能力，提高对虾养殖产量。

根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2基因的核苷酸片段如SEQ ID NO.5所示。

根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2的抑制剂为抑制LvFtz-F1β2蛋白活性的物质、或降解LvFtz-F1β2的物质、或降低LvFtz-F1β2表达水平的基因工具。

在本发明的一些优选实施方式中，所述基因工具为：

(1)靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA，

根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述水产动物为对虾。

在本发明的一些优选实施方式中，所述对虾为凡纳滨对虾。

本发明选择对虾LvFtz-F1β2基因作为干扰靶标，LvFtz-F1β2基因在对虾体内通过激活JAK-STAT免疫信号通路抑制因子PIAS的转录，阻断JAK-STAT通路的信号传导，从而作为一种抑制因子，抑制对虾的免疫系统活性，因此，抑制LvFtz-F1β2的表达能够激活对虾JAK-STAT通路活性，进而促进对虾的抗病能力。

本发明的第三个方面，提供一种LvFtz-F1β2的抑制剂，该LvFtz-F1β2的抑制剂中含有dsRNA。

根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA为由SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列和其反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA。

根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述LvFtz-F1β2的抑制剂中还含有包被剂。

在本发明的一些优选实施方式中，所述包被剂为甘露糖类包被剂。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述包被剂为海藻酸钠。

本发明将dsRNA表达菌作为一种可添加在对虾饲料中的免疫增强制剂，通过饲喂的方式使对虾大量摄入表达了dsRNA的大肠杆菌，方便高效的将dsRNA输入至对虾体内。而且，本发明还使用海藻酸钠作为包被剂，利用海藻酸钠在Ca²⁺的作用下形成难溶于水的凝胶的特点，将dsRNA表达菌包被于对虾饲料表面，阻止饲料撒入水中后，饲料表面的大肠杆菌在扩散致水中，从而降低了对虾对dsRNA表达的菌的摄入率。此外，海藻酸钠作为一种甘露糖，能够有效增强对虾的氨氮应激能力、抗低氧能力和免疫能力，Ca²⁺也能有效增强对虾的甲壳形成及硬化，促进对虾生长的作用。

而且，由于LvFtz-F1β2来源于凡纳滨以虾，具有高度特异性，目前在其它生物中暂未发现同源DNA序列，根据RNA干扰原理，LvFtz-F1β2的dsRNA不会对其他生物的非靶标基因产生干扰效果；其次，大肠杆菌广泛存在于各种生物的肠道中，其同样是对虾肠道的组成菌，因此饲喂大肠杆菌不会对对虾肠道功能产生不利影响，相反，大肠杆菌细胞壁表达的脂多糖能够激活对虾的免疫系统，增强对虾的抗病能力；用于包被的海藻酸钠作为一种多糖也能增强对虾的免疫力，而CaCl₂则能促进对虾甲壳硬化，帮助对虾蜕壳，提升对虾甲壳防御力。因此，本发明的使用不会对对虾生长产生不利影响，具有极高的安全性。

根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA的体外扩增引物对为：

B2-dsSacI-F：5’-AGAGAGCTCCACTCACCCACACACCTTTAC-3’(SEQ ID NO.3)；

B2-dsKpnI-R：5’-ACTGGTACCCAGTCGCTCATCCTCCTTG-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种对虾免疫增强制剂，其通过β2-dsRNA特异性干扰凡纳滨对虾LvFtz-F1β2基因的表达，从而激活对虾JAK/STAT信号通路，增强对虾免疫力。

2.本发明提供了一种能够表达LvFtz-F1β2-dsRNA的重组大肠杆菌，其可以通过发酵的方式大量培养表达细菌，并诱导使其表达dsRNA，培养成本低，生长迅速，培养条件简单，dsRNA产出成本低，易在工厂化养殖体系中大规模使用。

3.本发明中的对虾免疫增强制剂被对虾取食后，随着饲料的被消化，dsRNA随即被肠道吸收，进入肠道的dsRNA会在肠道中发挥功能，并随着对虾的开放式循环系统运输至其它组织器官，最终造成全身性的RNA干扰，当对虾LvFtz-F1β2基因被干扰后，PIAS的转录立即受到抑制，JAK/STAT通路也会随之被激活，对虾免疫力最终得到迅速提升。

4.本发明中的对虾免疫增强制剂对对虾无害，由于LvFtz-F1β2来源于凡纳滨以虾，具有高度特异性，目前在其它生物中暂未发现同源DNA序列，根据RNA干扰原理，LvFtz-F1β2的dsRNA不会对其他生物的非靶标基因产生干扰效果，而且，大肠杆菌广泛存在于各种生物的肠道中，其同样是对虾肠道的组成菌，因此饲喂大肠杆菌不会对对虾肠道功能产生不利影响，因此，本发明中的对虾免疫增强制剂具有较高的生物安全性。

附图说明

图1为LvFtz-F1β2调控PIAS抑制STAT的分子机制图；

图2为LvFtz-F1β2表达菌株构建原理流程图；

图3为本发明实施例中的L4440质粒载体图谱；

图4为本发明实施例中的L4440-Ftz-F1β2质粒载体图谱；

图5为本发明实施例中的大肠杆菌诱导表达后dsRNA的电泳检测；

图6为饲喂dsRNA表达菌后，对虾Ftz-F1β2干扰效率检测结果对比图；

图7为饲喂dsRNA表达菌后，对虾溶血弧菌和WSSV攻毒死亡率及相对细菌含量/病拷数对比图，其中，A：副溶血弧菌攻毒死亡率；B：副溶血弧菌攻毒后，对虾鳃中的弧菌相对含量；C：WSSV攻毒死亡率；D：WSSV攻毒后，对虾肌肉中WSSV相对拷贝数。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

靶标蛋白的发现

发明人通过研究发现，在对虾体内存在一种孤核受体同源蛋白LvFtz-F1β，其氨基酸序列为：

MWSEEPSTSDLMCDIMLSRGHGGQGRFSLQNLILGQHITSKLEEQMRVDAEEPMSPMSPMSQGSDHDHDKPTVRQVKVEESGSEEQTVFSSQPASQTDSPVPPRSDSGCEVHPGPYTPSQSPLLPRLHPHTHSPTHLYSPTQSPGPSRHVSGFSSPYSHTPSTGLSRNNSDASQYGGSYNSYSSAPSPISPTHYSPSQSPIQQRHITYQMPPHQSPNLGRVPSHTSHPSQYPGAGGLYSAPLDLRESHNLGGHPDSSKEVKEDERLAADLSQHSVIAAQSGITRQQLINSPCPICGDKISGFHYGIFSCESCKGFFKRTVQNKKNYVCMRGSSCPITISTRKKCPGCRFEKCLCMGMKLEAIREDRTRGGRSTYQCAPYPLPPSLVTPQPSTHHLDQQRLPDASAVKAEPSDSEEIKPSPPPEKPPIPLLLQQIHDVEHLWHCSESEMAQLRQSEQAAREAMENNSPNFLNNLCTIADHRLYKIVKWCKSLPLFRHITIDDQICLLINSWCELLLLSCCFRSMESPGEIRVSSGRTMTLEQAEVMGIGPCIERMLNLTQQLRRLQVDKYEYMAMKVIVLLYSDVSGLEDGEKVRYSQEKVVQALQEYTLSHYPHLPPKFGELLLRIPELQRTCQASKEMLSMKKKEGDVPSFNFLFELLRGDH(SEQ ID NO.1).

其ORF区域的核苷酸序列如下所示：

5’-atgtggagtgaagagccaagcaccagcgaccttatgtgtgacatcatgttgtccagaggccatggagggcaaggaaggttcagccttcagaacctcattctcggacaacacattacctccaaactggaggaacagatgagggtggacgccgaggaacccatgtccccgatgtctcccatgtcccagggctccgaccacgaccacgacaaacccaccgtcagacaggtaaaagtcgaagagagtggcagcgaagagcagaccgtcttctcgtcccagcctgcttctcagactgactccccggtgcctccaaggagtgactctgggtgtgaggttcacccagggccttataccccctcccagagccccctcctccctcgcctccacccgcacacccactcacccacacacctttactctcccacgcagtcacccgggcccagcaggcatgtgtcgggattctcgtctccatacagccacacaccatcaacaggactcagtcgcaataacagtgatgcgtcccagtatggcggctcttacaatagttactcttctgctccatcacccatttctcctacacactactctccttcacagtcgcccatccagcaacgccatatcacctaccaaatgccacctcatcagtcccccaacctgggccgcgttccaagccacactagccatcccagccagtacccaggagctggaggtctttacagcgcgcctttagatctacgagagtcccacaatcttggaggtcacccagattcttcgaaggaagtcaaggaggatgagcgactggcagctgacctatcacaacattcagtgattgctgcccagtctggcataacaaggcaacagctcatcaacagcccatgtcccatctgtggagataaaatctcaggcttccactatggcatcttttcatgtgaatcatgtaaaggatttttcaagcggacagtacagaacaagaagaactacgtttgcatgcgcggttcctcttgtccaatcactatcagtacaaggaagaaatgtcctggctgtagatttgaaaagtgtctttgcatgggcatgaaactggaagccatccgtgaagaccgaacacgaggtgggcgtagtacatatcagtgtgcaccatatcctcttccaccatccttggtcacacctcaaccatctacccaccatctagaccaacaaaggcttccagatgcttctgctgtcaaagctgaaccatcagacagcgaagagattaaaccatcaccacctccagagaagccccccatccctctgctcttacagcaaatccatgatgttgaacacctatggcactgcagtgagagtgaaatggcacaacttcgtcagtctgagcaagccgcaagggaagccatggaaaacaactctcccaacttcctgaataatctgtgcaccattgctgaccacagactgtataagattgttaaatggtgcaagtctctaccattgttcaggcacattacaattgatgatcagatctgcctgctgatcaactcctggtgtgagctcctcctcctgtcctgttgcttccgttccatggagtccccaggcgagatccgggtcagttcgggtcgtactatgaccttagagcaggctgaggtcatgggcatcggaccctgtattgaacgcatgctcaacttgacccaacagctgcgtcggctccaggtcgacaaatatgagtatatggccatgaaggtcattgttcttttatactcagacgtgtctgggcttgaggatggtgagaaagtgcgttactctcaagagaaagtggtccaagcgctgcaagagtatacactctcacactacccacacctgccgcctaagtttggggaacttctcctccgcatccctgaactccaacgcacgtgtcaggcgagtaaggaaatgctctctatgaagaagaaggagggagatgtgccaagtttcaattttctctttgagctgttaagaggggaccattag-3’(SEQ ID NO.2)。

发明人发现，该蛋白能够激活JAK-STAT通路转录因子STAT的抑制因子PIAS的转录，促进PIAS的表达，进而抑制STAT入核，阻断JAK-STAT通路的信号传导以及STAT下游一系列免疫因子的转录，最终造成对虾抗病能力减弱。

构建LvFtz-F1β2dsRNA表达菌

基于上述实施例中的LvFtz-F1β2蛋白，构建LvFtz-F1β2dsRNA表达菌，以得到能够稳定表达LvFtz-F1β2-dsRNA的稳定载体。

具体构建方法如下：

(1)构建LvFtz-F1β2dsRNA表达质粒：

采集凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)鳃组织样品，使用RNA提取试剂盒

Plus Mini Handbook(QIAGEN)提取总RNA，经cDNA合成试剂盒PrimeScript^TMⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA，使用高成功率PCR酶KOD FX(Takara)，经引物组从对虾cDNA中克隆LvFtz-F1β2编码框片段，其中，该引物组的核苷酸序列为：

上游引物β2-dsSacI F：5’-AGAGAGCTCCACTCACCCACACACCTTTAC-3’(SEQ IDNO.3)；

下游引物β2-dsKpnI R：5’-ACTGGTACCCAGTCGCTCATCCTCCTTG-3’(SEQ ID NO.4)。

反应体系如表1所示：

表1LvFtz-F1β2扩增体系

成分	含量
		2×PCR buffer for KOD FX	25μL
2mMdNTPs	10μL
		10mM上游引物β2-dsSacI F	2μL
10mM下游引物β2-dsKpnI R	2μL
		凡纳滨对虾cDNA	1μL
KOD FX(1.0U/μL)	1μL
		超纯水补至	50μL

扩增程序为：94℃2min；98℃10s、68℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

扩增得到的LvFtz-F1β2编码框片段的全长为405bp，核苷酸序列如下所示：

5’-cactcacccacacacctttactctcccacgcagtcacccgggcccagcaggcatgtgtcgggattctcgtctccatacagccacacaccatcaacaggactcagtcgcaataacagtgatgcgtcccagtatggcggctcttacaatagttactcttctgctccatcacccatttctcctacacactactctccttcacagtcgcccatccagcaacgccatatcacctaccaaatgccacctcatcagtcccccaacctgggccgcgttccaagccacactagccatcccagccagtacccaggagctggaggtctttacagcgcgcctttagatctacgagagtcccacaatcttggaggtcacccagattcttcgaaggaagtcaaggaggatgagcgactg-3’(SEQ ID NO.5)。

将SEQ ID NO.5所示序列连接至L4440 dsRNA表达载体(购自广州市鹏辰生物科技有限公司)中，质粒图谱见图3(L4440质粒载体)，连接方式采用本领域常规操作。

得到的LvFtz-F1β2dsRNA表达质粒(L4440-Ftz-F1β2质粒载体)如图4所示。

(2)将步骤(1)得到的LvFtz-F1β2dsRNA表达质粒通过本领域常规手段导入HT115大肠杆菌中，获得能够表达LvFtz-F1β2-dsRNA的重组大肠杆菌。

对获得的重组大肠杆菌进行检测，验证LvFtz-F1β2-dsRNA是否能够温度表达，具体步骤如下：

将含步骤(2)中获得的重组大肠杆菌进行扩大培养，至菌液OD₆₀₀值为0.6～0.8时，分别加入终浓度为0.1、0.5、1、2和5mg/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并分别在诱导0、1、2、4和8h后，使用Trizol法提取重组大肠杆菌总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测总RNA及dsRNA，验证LvFtz-F1β2的dsRNA是否成功表达。

检测结果如图5所示。

结果发现，在0.5mg/L的IPTG浓度下，诱导2h后，转染了L4440-FtzF1β2质粒大肠杆菌总RNA中出现了明显的(7、8、9、10和11泳道)，大小约为400bp的dsRNA电泳条带，并在8h时条带亮度达到最大，表达dsRNA表达量最高，而转了L4440空质粒的对照组则没有dsRNA条带(1、2、3、4和5泳道)。

经测定，得到的dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本实施例中构建LvFtz-F1β2dsRNA表达菌的步骤流程图如图2所示。

对虾免疫增强剂的制备

将上述实施例构建得到的LvFtz-F1β2dsRNA表达菌进行扩大培养，在0.5mg/L的IPTG浓度下，诱导8h获得大量的LvFtz-F1β2dsRNA表达菌液。将LvFtz-F1β2dsRNA表达菌液经5000×g离心10min，去除上去，获得LvFtz-F1β2dsRNA表达菌菌体。按1:1重量比加入无菌水重悬，获得菌悬液，即得对虾免疫增强剂。

对于本实施例中的对虾免疫增强剂，可采用海藻酸钠包被法将其包被于常规对虾饲料表面进行使用，当然，本实施例并不表示该对虾免疫增强剂的使用方法仅限于海藻酸钠包被法，也可以采用其他方式进行使用，如可以不使用包被剂，将dsRNA表达菌直接添加到饲料中进行混合，或者使用其它包被剂如淀粉或FeSO₄·7H₂O等。

海藻酸钠包被法包被上述实施例中的对虾免疫增强剂的具体步骤为：

(1)按对虾免疫增强剂：对虾饲料的重量比为1:100的比例，均匀混合对虾免疫增强剂和对虾饲料，使对虾饲料充分吸收对虾免疫增强剂。

(2)按每公斤(1000g)饲料加15g海藻酸钠干粉的量，向混有对虾免疫增强剂的对虾饲料中加入海藻酸钠干粉，充分搅拌，使海藻酸钠均匀吸附于饲料表面。

(3)向每公斤(1000g)步骤(2)得到的饲料混合物中加入200mL的0.4mol/L CaCl₂溶液，搅拌均匀，使吸附于饲料表面的海藻酸钠与CaCl₂反应产生凝胶状包膜，将对虾免疫增强剂包被于饲料表面。

其中，本实施例中的对虾饲料为常规对虾饲料，购自广东海大集团，含有鱼粉、酵母粉、豆粕、花生粕、虾壳粉、大豆磷脂、小麦粉和植物油等物质。

对虾免疫增强剂的LvFtz-F1β2 dsRNA效果测试

按照上述实施例中的海藻酸钠包被法将对虾免疫增强剂包被在饲料表面，用于本实施例中的效果检测实验中。

具体测试步骤如下：

按上述流程制备好包被有对虾免疫增强剂的对虾饲料后，按每尾虾每天3％体重的饲料量饲喂对虾，以未包被对虾免疫增强剂的饲料为对照。连续饲喂5d后，每组随机选择9尾对虾，采集对虾血淋巴细胞、鳃、胃和肠，提取总RNA并合成cDNA，采用qRT-PCR检测这些组织中LvFtz-F1β2dsRNA含量及LvFtz-F1β2的转录水平，并检测饲喂对虾免疫增强剂后，LvFtz-F1β2dsRNA在对虾体内释放量及对靶标基因的敲降水平。

其中，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测所用的引物组核苷酸序列为，使用定量PCR试剂

Premix Ex Taq^TMⅡ(Perfect Real Time，购自Takara)进行qRT-PCR检测：

β12-qRT F：5’-TCTACCATTGTTCAGGCACATTAC-3’(SEQ ID NO.6)；

β12-qRT R：5’-GAAGCAACAGGACAGGAGGAG-3’(SEQ ID NO.7)；

设计得到的β12-qRT F的Tm值为55.6，β12-qRT R的Tm值为56.8。

反应体系如表2所示：

表2 qRT-PCR扩增体系

扩增程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环，采集荧光信号。

其中，cDNA模板的核苷酸序列为：

5’-tctaccattgttcaggcacattacaattgatgatcagatctgcctgctgatcaactcctggtgtgagctcctcctcctgtcctgttgcttc-3’(SEQ ID NO.8)

结果如图6所示，在连续饲喂对虾dsRNA表达菌5天后，对虾血淋巴细胞、鳃、胃和肠中LvFtz-F1β2的表达水平显著降低，分别相对于对照组降低了53.3％、45.4％、76.5％和45.7％，表明对虾食用表达了LvFtz-F1β2dsRNA的大肠杆菌后，LvFtz-F1β2基因表达水平受到显著抑制。

对虾免疫增强剂的抗病效果

其中，在本实施例中，分别采用两种不同类型的病原作为检测对象(病毒样品为WSSV，细菌样品为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(NCBI：ASM400651v1，Strain：VPE61)，以全面的体现出本发明实施例中的对虾免疫增强剂的抗病效果。

具体测试步骤如下：

(1)培养病毒和细菌样品，按每尾虾注射1×10⁵病毒拷贝数或1×10⁶CFU副溶血弧菌(重悬于50μL的生理盐水中)的量对对虾进行攻毒。

(2)按上述实施例中的流程制备好包被有对虾免疫增强剂的对虾饲料后，按每尾虾每天3％体重的饲料量饲喂对虾，以未包被对虾免疫增强剂的饲料为对照，连续饲喂5d，记录对虾累计死亡率，并于WSSV攻毒后的第3d和5d或副溶血弧菌注射后第12h和24h时，随机选择9尾对虾，分离对虾的肌肉或鳃，提取总DNA，采用qRT-PCR检测对虾肌肉或鳃中WSSV或副溶血弧菌含量，验证通过饲喂对虾免疫增强剂对对虾抗WSSV和抗副溶血弧菌能力的影响。

其中，本发明实施例中的用于检测WSSV或副溶血弧菌的引物的核苷酸序列为：

WSSV-IE1-qRTF：5’-GCCATGAAATGGATGGCTAGG-3’(SEQ ID NO.9)；

WSSV-IE1-qRTR：5’-ACCTTTGCACCAATTGCTAGTAG-3’(SEQ ID NO.10)；

Vpa16s-qRTF：5’-GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG-3’(SEQ ID NO.11)；

Vpa16s-qRTR：5’-CCACAACCTCCAAGTAGACATCG-3’(SEQ ID NO.12)。

结果如图7所示，副溶血弧菌攻毒结果显示，饲喂表达LvFtz-F1β2dsRNA的大肠杆菌后，对虾副溶血弧菌攻毒累计死亡率显著降低，相对于对照组降低了42.0％(图7A)，且攻毒12h和24h后，对虾鳃中的副溶血弧菌相对含量相对于对照组分别降低了65.2％和90.1％(图7B)，表明取食了表达LvFtz-F1β2dsRNA的大肠杆菌后，对虾对弧菌的抵抗能力显著增强。此外，WSSV攻毒结果显示，饲喂表达LvFtz-F1β2dsRNA的大肠杆菌后，对虾WSSV攻毒累计死亡率显著降低，相对于对照降低了44.2％(图7C)，攻毒3d和5d后，对虾肌肉中的WSSV相对拷贝数相对于对照组分别降低了79.4％和86.2％，表明取食了表达LvFtz-F1β2dsRNA的大肠杆菌后，对虾对WSSV的抵抗能力也显著增强(图7D)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种基于RNA干扰技术的对虾免疫增强剂及其制备方法与应用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 663

<212> PRT

<213> LvFtz-F1β

<400> 1

Met Trp Ser Glu Glu Pro Ser Thr Ser Asp Leu Met Cys Asp Ile Met

1 5 10 15

Leu Ser Arg Gly His Gly Gly Gln Gly Arg Phe Ser Leu Gln Asn Leu

20 25 30

Ile Leu Gly Gln His Ile Thr Ser Lys Leu Glu Glu Gln Met Arg Val

35 40 45

Asp Ala Glu Glu Pro Met Ser Pro Met Ser Pro Met Ser Gln Gly Ser

50 55 60

Asp His Asp His Asp Lys Pro Thr Val Arg Gln Val Lys Val Glu Glu

65 70 75 80

Ser Gly Ser Glu Glu Gln Thr Val Phe Ser Ser Gln Pro Ala Ser Gln

85 90 95

Thr Asp Ser Pro Val Pro Pro Arg Ser Asp Ser Gly Cys Glu Val His

100 105 110

Pro Gly Pro Tyr Thr Pro Ser Gln Ser Pro Leu Leu Pro Arg Leu His

115 120 125

Pro His Thr His Ser Pro Thr His Leu Tyr Ser Pro Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Gly Pro Ser Arg His Val Ser Gly Phe Ser Ser Pro Tyr Ser His Thr

145 150 155 160

Pro Ser Thr Gly Leu Ser Arg Asn Asn Ser Asp Ala Ser Gln Tyr Gly

165 170 175

Gly Ser Tyr Asn Ser Tyr Ser Ser Ala Pro Ser Pro Ile Ser Pro Thr

180 185 190

His Tyr Ser Pro Ser Gln Ser Pro Ile Gln Gln Arg His Ile Thr Tyr

195 200 205

Gln Met Pro Pro His Gln Ser Pro Asn Leu Gly Arg Val Pro Ser His

210 215 220

Thr Ser His Pro Ser Gln Tyr Pro Gly Ala Gly Gly Leu Tyr Ser Ala

225 230 235 240

Pro Leu Asp Leu Arg Glu Ser His Asn Leu Gly Gly His Pro Asp Ser

245 250 255

Ser Lys Glu Val Lys Glu Asp Glu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ser Gln

260 265 270

His Ser Val Ile Ala Ala Gln Ser Gly Ile Thr Arg Gln Gln Leu Ile

275 280 285

Asn Ser Pro Cys Pro Ile Cys Gly Asp Lys Ile Ser Gly Phe His Tyr

290 295 300

Gly Ile Phe Ser Cys Glu Ser Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val

305 310 315 320

Gln Asn Lys Lys Asn Tyr Val Cys Met Arg Gly Ser Ser Cys Pro Ile

325 330 335

Thr Ile Ser Thr Arg Lys Lys Cys Pro Gly Cys Arg Phe Glu Lys Cys

340 345 350

Leu Cys Met Gly Met Lys Leu Glu Ala Ile Arg Glu Asp Arg Thr Arg

355 360 365

Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Gln Cys Ala Pro Tyr Pro Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Leu Val Thr Pro Gln Pro Ser Thr His His Leu Asp Gln Gln Arg Leu

385 390 395 400

Pro Asp Ala Ser Ala Val Lys Ala Glu Pro Ser Asp Ser Glu Glu Ile

405 410 415

Lys Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Pro Pro Ile Pro Leu Leu Leu Gln

420 425 430

Gln Ile His Asp Val Glu His Leu Trp His Cys Ser Glu Ser Glu Met

435 440 445

Ala Gln Leu Arg Gln Ser Glu Gln Ala Ala Arg Glu Ala Met Glu Asn

450 455 460

Asn Ser Pro Asn Phe Leu Asn Asn Leu Cys Thr Ile Ala Asp His Arg

465 470 475 480

Leu Tyr Lys Ile Val Lys Trp Cys Lys Ser Leu Pro Leu Phe Arg His

485 490 495

Ile Thr Ile Asp Asp Gln Ile Cys Leu Leu Ile Asn Ser Trp Cys Glu

500 505 510

Leu Leu Leu Leu Ser Cys Cys Phe Arg Ser Met Glu Ser Pro Gly Glu

515 520 525

Ile Arg Val Ser Ser Gly Arg Thr Met Thr Leu Glu Gln Ala Glu Val

530 535 540

Met Gly Ile Gly Pro Cys Ile Glu Arg Met Leu Asn Leu Thr Gln Gln

545 550 555 560

Leu Arg Arg Leu Gln Val Asp Lys Tyr Glu Tyr Met Ala Met Lys Val

565 570 575

Ile Val Leu Leu Tyr Ser Asp Val Ser Gly Leu Glu Asp Gly Glu Lys

580 585 590

Val Arg Tyr Ser Gln Glu Lys Val Val Gln Ala Leu Gln Glu Tyr Thr

595 600 605

Leu Ser His Tyr Pro His Leu Pro Pro Lys Phe Gly Glu Leu Leu Leu

610 615 620

Arg Ile Pro Glu Leu Gln Arg Thr Cys Gln Ala Ser Lys Glu Met Leu

625 630 635 640

Ser Met Lys Lys Lys Glu Gly Asp Val Pro Ser Phe Asn Phe Leu Phe

645 650 655

Glu Leu Leu Arg Gly Asp His

660

<210> 2

<211> 1992

<212> DNA

<213> LvFtz-F1β

<400> 2

atgtggagtg aagagccaag caccagcgac cttatgtgtg acatcatgtt gtccagaggc 60

catggagggc aaggaaggtt cagccttcag aacctcattc tcggacaaca cattacctcc 120

aaactggagg aacagatgag ggtggacgcc gaggaaccca tgtccccgat gtctcccatg 180

tcccagggct ccgaccacga ccacgacaaa cccaccgtca gacaggtaaa agtcgaagag 240

agtggcagcg aagagcagac cgtcttctcg tcccagcctg cttctcagac tgactccccg 300

gtgcctccaa ggagtgactc tgggtgtgag gttcacccag ggccttatac cccctcccag 360

agccccctcc tccctcgcct ccacccgcac acccactcac ccacacacct ttactctccc 420

acgcagtcac ccgggcccag caggcatgtg tcgggattct cgtctccata cagccacaca 480

ccatcaacag gactcagtcg caataacagt gatgcgtccc agtatggcgg ctcttacaat 540

agttactctt ctgctccatc acccatttct cctacacact actctccttc acagtcgccc 600

atccagcaac gccatatcac ctaccaaatg ccacctcatc agtcccccaa cctgggccgc 660

gttccaagcc acactagcca tcccagccag tacccaggag ctggaggtct ttacagcgcg 720

cctttagatc tacgagagtc ccacaatctt ggaggtcacc cagattcttc gaaggaagtc 780

aaggaggatg agcgactggc agctgaccta tcacaacatt cagtgattgc tgcccagtct 840

ggcataacaa ggcaacagct catcaacagc ccatgtccca tctgtggaga taaaatctca 900

ggcttccact atggcatctt ttcatgtgaa tcatgtaaag gatttttcaa gcggacagta 960

cagaacaaga agaactacgt ttgcatgcgc ggttcctctt gtccaatcac tatcagtaca 1020

aggaagaaat gtcctggctg tagatttgaa aagtgtcttt gcatgggcat gaaactggaa 1080

gccatccgtg aagaccgaac acgaggtggg cgtagtacat atcagtgtgc accatatcct 1140

cttccaccat ccttggtcac acctcaacca tctacccacc atctagacca acaaaggctt 1200

ccagatgctt ctgctgtcaa agctgaacca tcagacagcg aagagattaa accatcacca 1260

cctccagaga agccccccat ccctctgctc ttacagcaaa tccatgatgt tgaacaccta 1320

tggcactgca gtgagagtga aatggcacaa cttcgtcagt ctgagcaagc cgcaagggaa 1380

gccatggaaa acaactctcc caacttcctg aataatctgt gcaccattgc tgaccacaga 1440

ctgtataaga ttgttaaatg gtgcaagtct ctaccattgt tcaggcacat tacaattgat 1500

gatcagatct gcctgctgat caactcctgg tgtgagctcc tcctcctgtc ctgttgcttc 1560

cgttccatgg agtccccagg cgagatccgg gtcagttcgg gtcgtactat gaccttagag 1620

caggctgagg tcatgggcat cggaccctgt attgaacgca tgctcaactt gacccaacag 1680

ctgcgtcggc tccaggtcga caaatatgag tatatggcca tgaaggtcat tgttctttta 1740

tactcagacg tgtctgggct tgaggatggt gagaaagtgc gttactctca agagaaagtg 1800

gtccaagcgc tgcaagagta tacactctca cactacccac acctgccgcc taagtttggg 1860

gaacttctcc tccgcatccc tgaactccaa cgcacgtgtc aggcgagtaa ggaaatgctc 1920

tctatgaaga agaaggaggg agatgtgcca agtttcaatt ttctctttga gctgttaaga 1980

ggggaccatt ag 1992

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagagctcc actcacccac acacctttac 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actggtaccc agtcgctcat cctccttg 28

<210> 5

<211> 405

<212> DNA

<213> LvFtz-F1β2

<400> 5

cactcaccca cacaccttta ctctcccacg cagtcacccg ggcccagcag gcatgtgtcg 60

ggattctcgt ctccatacag ccacacacca tcaacaggac tcagtcgcaa taacagtgat 120

gcgtcccagt atggcggctc ttacaatagt tactcttctg ctccatcacc catttctcct 180

acacactact ctccttcaca gtcgcccatc cagcaacgcc atatcaccta ccaaatgcca 240

cctcatcagt cccccaacct gggccgcgtt ccaagccaca ctagccatcc cagccagtac 300

ccaggagctg gaggtcttta cagcgcgcct ttagatctac gagagtccca caatcttgga 360

ggtcacccag attcttcgaa ggaagtcaag gaggatgagc gactg 405

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctaccattg ttcaggcaca ttac 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagcaacag gacaggagga g 21

<210> 8

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctaccattg ttcaggcaca ttacaattga tgatcagatc tgcctgctga tcaactcctg 60

gtgtgagctc ctcctcctgt cctgttgctt c 91

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccatgaaat ggatggctag g 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acctttgcac caattgctag tag 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtgtagcgg tgaaatgcgt ag 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccacaacctc caagtagaca tcg 23

Claims

1.LvFtz-F1β2的抑制剂在制备治疗和/或预防凡纳滨对虾副溶血弧菌和WSSV病毒感染的药物中的应用；所述LvFtz-F1β2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.LvFtz-F1β2的抑制剂在制备凡纳滨对虾免疫增强剂中的应用；所述LvFtz-F1β2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述LvFtz-F1β2的抑制剂为抑制LvFtz-F1β2蛋白活性的物质、或降解LvFtz-F1β2的物质、或降低LvFtz-F1β2表达水平的基因工具。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工具为（1）～（3）中任一种：

（1）靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA，

（2）含有靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA的载体或病毒，

（3）含有靶向LvFtz-F1β2的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA的重组菌或转基因细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述dsRNA为由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列和其反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的体外扩增引物对为：

B2-dsSacI-F：5’-AGAGAGCTCCACTCACCCACACACCTTTAC-3’；

B2-dsKpnI-R：5’-ACTGGTACCCAGTCGCTCATCCTCCTTG-3’。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述LvFtz-F1β2的抑制剂中还含有包被剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述包被剂为甘露糖类包被剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述包被剂为海藻酸钠。