CN108396030B

CN108396030B - 凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用

Info

Publication number: CN108396030B
Application number: CN201810444721.XA
Authority: CN
Inventors: 李朝政; 肖邦; 何建国; 翁少萍
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN108396030A

Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv‑BigPEN及其重组蛋白和应用。所述Lv‑BigPEN为凡纳滨对虾Penaeidin（PEN）抗菌肽家族基因，其核酸序列长810 bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2 kDa。本发明利用表达载体Pet32a(+)和表达菌株大肠杆菌Transetta（DE3）进行原核重组表达，获得了具有生物活性的重组蛋白，所述重组蛋白具有广谱的抗微生物活性，能够对多种细菌和WSSV病毒产生抑制作用。该重组蛋白可以用于生产畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有较大的应用前景。

Description

凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN及其重组蛋白和应用。

背景技术

凡纳滨对虾作为我国主要的对虾养殖品种，具有很高的经济价值。近年来由于养殖环境恶化及养殖密度过大，导致疾病频发，已经严重威胁到了南美白对虾产业的健康发展，造成了巨大的经济损失，因此，开展对虾疾病防控显得尤为重要。凡纳滨对虾的病害呈现多样化，其中以白斑综合症（WSS）、肠孢虫病（EPH）,急性肝胰腺坏死综合征（APHNS）这三种最为严重。近年来，抗生素在水产养殖上的滥用，虽然对病害控制起到了一定的作用，却造成了水体环境恶化、微生物赖药性增加变异出致病性更强、危害更大的治病微生物等问题，使得开发能替代抗生素的抗菌肽变得尤为迫切。

抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）为一类小分子肽类活性物质，是先天免疫的重要效应分子，直接参与杀死和清除感染的病原微生物，在先天免疫中起到了重要作用。同时，与传统的抗生素相比抗菌肽作为多肽抗生素具有针对性强、无污染、不易产生耐药性等问题。此外，抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不会导致抗菌肽活性失活，在抗病饲料添加剂研发方面具有重要的应用前景，对抗菌肽的研究是目前学术研究活跃的领域之一。

对虾中三类有代表性的抗菌肽为：Penaeidin 家族、Crustin 家族和抗脂多糖因子（anti-LPS factor, ALF）家族，它们对于革兰氏菌、病毒和许多原生动物有广泛的抗菌活性。Penaeidin 家族氨基酸末端富含半胱氨酸和脯氨酸，能够直接杀死病原，在先天免疫中起着至关重要的作用。在生产上使用化学方法合成小肽的成本高、产量低，但是利用生物工程的手段，通过工程菌株，则能够规模化生产具有活性的抗菌肽。

在凡纳滨对虾或者其他甲壳类动物，已经有许多抗菌肽基因被研究报导，但是本发明在研究过程中发现了新型的 PEN 家族的抗菌肽，目前还尚没有关于其核酸序列、重组蛋白的研究以及应用的相关报道。

发明内容

本发明本发明的主要目的在于提供一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因及其重组蛋白的制备和应用，以解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和水产食品药物残留等问题。

本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因。

本发明的第二个目的是提供一种凡纳滨对虾抗菌肽 Lv-BigPEN。

本发明的第三个目的是提供所述凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因的应用。

本发明的第四个目的是提供所述凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因重组蛋白的制备方法。

本发明的第五个目的是提供所述纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN基因重组蛋白的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示。

Lv-BigPEN基因编码的凡纳滨对虾抗菌肽，其氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

本发明首次发现并命名了凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其核酸序列长810bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2 kDa，与对虾Penaeidin 家族抗菌肽基因序列具有较高的相似性，均含有保守的 PEN 结构域，且该抗菌肽含有269个氨基酸，不同于一般的抗菌肽，为一种新型的 PEN 家族的抗菌肽，具有一定的抗菌活性和较强的抗 WSSV 活性。

因此，本发明还保护所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN和/或Lv-BigPEN基因编码的凡纳滨对虾抗菌肽在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

本发明请求保护所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN在制备凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白中的应用。

一种含有上述 SEQ ID NO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体为原核表达载体。

更优选地，所述原核表达载体为 pET32a (+)；具体为将 SEQ ID NO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到原核表达载体 pET32a (+) 的 EcoR I 位点和 Xho I位点之间，获得重组载体 pET32a (+)-Lv-BigPEN。

一种含有上述任一所述表达载体的宿主菌。

优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株 Transetta（DE3）。

上述任一重组表达载体和/或任一宿主菌在制备凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白中的应用也在本发明保护范围内。

一种凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白的制备方法，将 SEQ ID NO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到表达载体上，获得重组载体；将构建好的重组载体转化到宿主菌中间进行表达，阳性克隆，并进行诱导表达，收集表达上清，再纯化蛋白，得到凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。

优选地，所述表达载体为原核表达载体。

更优选地，所述原核表达载体为 pET32a (+)；具体为将 SEQ ID NO：1所示凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到原核表达载体 pET32a (+) 的 EcoR I 位点和 Xho I位点之间，获得重组载体 pET32a(+)-Lv-BigPEN。

优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

优选地，所述诱导表达为用 IPTG 进行诱导表达；IPTG 终浓度为0.1 mM~0.5 mM。

优选地，所述纯化蛋白为用 Ni-NTA 基质进行纯化。

本发明还请求保护上述制备方法制备得到的凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。

所述的抗菌肽 Lv-BigPEN 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等多种细菌的生长均有抑制作用；将所述的抗菌肽抗菌肽 Lv-BigPEN 与 WSSV 病毒孵育后，能显著降低 WSSV病毒的感染活性。

所述革兰氏阴性菌为副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa），大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；革兰氏阳性菌为粪链球菌（Enterococcus faecalis），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），黄色微球菌（Micrococcus luteus）

同时，所述凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用亦在本发明保护范围内。

具体地，所述抗菌药物为鱼类和虾类抗菌药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现并命名了凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，所述Lv-BigPEN基因为凡纳滨对虾Penaeidin （PEN）抗菌肽家族，其核酸序列长810 bp，开放阅读框编码269个氨基酸，推测蛋白分子量为29.2 kDa。通过利用表达载体 Pet32a(+) 和表达菌株大肠杆菌Transetta（DE3）进行原核重组表达，获得了具有生物活性的重组蛋白。并在体外验证了其生物学功能，鉴定该重组蛋白具有广谱的抗微生物活性，能够对多种细菌和 WSSV 病毒产生抑制作用。该重组蛋白可以用于生产畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明经多重序列比对Lv-BigPEN基因的 PEN 结构域与Lv-PEN2，Lv-PEN3，Lv-PEN4 基因的相似性。

图2为本发明从预测的功能结构上比较Lv-BigPEN基因与Lv-PEN2，Lv-PEN3，Lv- PEN4 基因的差异。

图3为本发明用 PCR 方法检测重组载体 pET32a-Lv-BigPEN。

图4为本发明 Lv-BigPEN 重组蛋白小量表达的 SDS-PAGE 检测，Lane M ：Protein Marker ；Lane 1：未诱导6 h；Lane 2：0.1 mM IPTG诱导6 h；Lane 3：0.3 mM IPTG诱导6 h；Lane 4：0.5 mM IPTG诱导6 h。

图5为本发明 Lv-BigPEN 重组蛋白大量表达及纯化的 SDS-PAGE 检测。

图6为本发明 Western-blot 验证 Lv-BigPEN 表达。

图7为本发明在体外验证重组蛋白 Lv-BigPEN 抗 WSSV 活性，1~8为实验组和对照组各8个样品用于WSSV拷贝数的测定。

图8为本发明在体外统计重组蛋白 Lv-BigPEN 与 WSSV 病毒孵育后对虾存活率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 扩增Lv-BigPEN基因片段

1、方法

提取凡纳滨对虾总 RNA，经 mRNA 纯化及反转录得 cDNA；设计引物：正向引物为GGGAATTCGAGGGGCCGCCTGGAGTGCTGCGTCCTC；反向引物为GGCTCGAGACAGCAGGAGTTCCAGCGCTTGCAG。PCR 反应液使用 Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase，反应液组分为2 ulPhanta® Super-Fidelity DNA Polymerase (5U/ul), 50 ul 2×PCR Buffer, 正反向引物各4 ul (10μM), 2 μl dNTP Mixture, cDNA 模板100 ng，用无菌蒸馏水补足到100 ul。PCR 反应扩增程序为：94 ℃预变性3 min，35个循环：94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并回收产物。PCR扩增产物回收按照OMEGA的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收。回收产物用核酸浓度测定仪检测浓度。

获得Lv-BigPEN基因后，将该基因连接到 PMD19T 载体中。经生物信息学分析，Lv- BigPEN基因含有 RPT（internal repeat）结构域和 PEN（Penaeidin）结构域（图2），Lv- BigPEN基因的PEN结构域和凡纳滨对虾抗菌肽PEN家族抗菌肽基因Lv-PEN2、Lv-PEN3、Lv- PEN4具有一定的相似性（图1）。通过软件预测Lv-BigPEN基因功能结构域与凡纳滨对虾抗菌肽PEN家族抗菌肽基因Lv-PEN2、Lv-PEN3、Lv-PEN4等基因功能结构域之间的相似性和差异。分析结果如图1和2所示，Lv-BigPEN基因的PEN结构域同Lv-PEN2、Lv-PEN3、Lv-PEN4的序列Smilarity分别为40%、38%、36%，Lv-BigPEN基因的PEN结构域同Lv-PEN2、Lv-PEN3、Lv-PEN4的序列Identity分别为29%、29%、26%。

实施例2 凡纳滨对虾Lv-BigPEN基因重组蛋白表达

1、构建表达载体

用EcoR I和Xho I内切酶，双酶切含有目的基因的 PMD19T 载体，并利用 T4 连接酶（Thermo），将该片段连接原核表达载体 pET32a(+)，将其转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，过夜培养，挑选单克隆菌进行 PCR 检测，并送英潍捷基公司测序，筛选阳性克隆。

2、转化表达菌株

使用 Omega 质粒提取试剂盒，提取重组质粒，热激法转化到表达菌株Transetta（DE3），过夜培养，挑选阳性克隆，进行 PCR 检测并送测序，筛选到阳性菌株；PCR 检测结果如图3所示，Lane 1、2、4、5、6、7为 pET32a-Lv-BigPEN阳性克隆条带, Lane 3为非阳性条带。

3、IPTG 诱导小量表达

取3个阳性克隆菌株，按照1:100的比例将过夜菌接入1 ml的 LA 培养液中，接4管。在37 ℃摇床，200 rpm培养3 h至OD 600为0.8后，按照 IPTG终浓度为 0.1 mM，0.3 mM，0.5 mM的梯度接入3个管中，另外3管作为未诱导对照。摇菌6 h后，12000 g 离心3 min，弃净上清，加入40 μL 1 x loading（+β-巯基乙醇），开水煮样10~20 min，跑 SDS-PAGE 电泳，电泳完成后用考马斯蓝染色液染色30 min，再用脱色液脱色至背景干净，然后观察蛋白带型，确定诱导条件。诱导结果如图4所示，确定 IPTG 终浓度为 0.1 mM。

4、大量表达及蛋白纯化

取阳性克隆菌株，按照1:100的比例将过夜菌接入1 L的 LA 培养液中，在37 ℃摇床，200 rpm培养3 h至OD600为0.8后，按照最适IPTG浓度（IPTG终浓度0.1 mmol/L）加入，诱导6 h。菌液用 Backman 离心机，5000 g离心8 min，弃净上清，加入30 ml Lysise Buffer重悬，转移至50 ml离心管中，加入终浓度为1 mM 的 PMSF，用高压破碎仪破碎菌悬液，12000 g离心10 min。预先重悬1 ml镍柱，将镍柱和菌液上清混匀，4 ℃垂直旋转仪缓慢孵育结合2 h；800 g离心，弃上清，加入20 ml Wash Buffer颠倒混匀7～8次，洗三次；加入Elution Buffer 5 ml，4 ℃垂直旋转仪缓慢孵育洗脱15 min，800 g离心收取蛋白。将收集到的蛋白加入透析袋中，用 PBS（PH = 7.4）过夜透析，并用12% SDS-PAGE 电泳分析。电泳结果如图5所示，Lane 1为 Lv-BigPEN 基因表达的重组蛋白，Lane 2为对照蛋白 Trx。

5、Western-blot 检测

将上述蛋白样品制样后进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，电泳完成后，切割与蛋白胶大小一致的三层滤纸和硝酸纤维素膜，打开蛋白转移槽，从负极到正极的放置顺序为：海绵，三层滤纸，蛋白胶，硝酸纤维素膜，三层滤纸，海绵。均要用转膜缓冲液浸湿后放入，每次加入要用玻璃棒赶走气泡。合上胶板，放入转膜槽中，加入转膜缓冲液，转膜槽置于冰盒中，200 mA电流转膜2 h；封闭：将膜从电泳槽取出，置于一洁净小盒中，用5% 的脱脂牛奶封闭膜，在摇床上轻摇2 h；加一抗（6 × His tag单克隆抗体）：用 TBST 缓冲液洗膜2次，每次5min，一抗工作浓度按1：3000加入，摇床上孵育2 h；加二抗（兔抗鼠 IgG-HRP 抗体）：用TBST 缓冲液洗膜3次，每次5 min，二抗工作浓度按1：5000加入，摇床上孵育2 h；HRP显色：用 TBST 缓冲液洗膜3次，每次5 min,加入显色液，于ECL 显色仪上显色，保存照片。检测结果如图6所示，箭头指示带为用6 × His tag单克隆抗体杂出的 Lv-BigPEN 蛋白条带。

实施例3 抑菌实验

1、最小抑菌浓度(MIC)的测定：利用最小抑菌浓度的测定方法来测定革兰氏阴性菌：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa），大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；革兰氏阳性菌：粪链球菌（Enterococcus faecalis），金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus），黄色微球菌（Micrococcus luteus）。

2、在 LB 培养基中过夜培养，用 Poor Broth（1%（w/v）的蛋白胨，0.5％氯化钠，PH=7.5）稀释菌悬液至10⁵CFU/ml，分别取90 μL 上述菌悬液加入到无菌的96孔板中。连续2倍稀释的 Lv-BigPEN 抗菌肽，使其浓度分别为50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM、1.562 μM、0.781 μM、0.391 μM、0.195 μM。分别取10 μL上述抗菌肽加入到96孔板中，30 ℃培养箱培养24 h，在酶标仪中测定各孔中溶液的OD 600。

3、结果表明重组蛋白 Lv-BigPEN 对副溶血性弧菌有抑菌活性，MIC 为12.5 μM~25 μM；对嗜水气单胞菌有抑菌活性，MIC 为25 μM~50 μM；对铜绿假单胞杆菌有抑菌活性，MIC 为25 μM~50 μM；对大肠埃希氏菌有抑菌活性，MIC为25 μM~50 μM；对粪链球菌有抑菌活性，MIC 为25 μM~50 μM；对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，MIC 为25 μM~50 μM；对黄色微球菌有抑菌活性，MIC 为25 μM~50 μM，具体结果见表1。

表1 重组蛋白 Lv-BigPEN 的最小抑菌浓度MIC测定

实施例4 抗WSSV病毒活性测定

1、为验证重组蛋白 Lv-BigPEN 抗WSSV病毒的活性，在活体上进行实验，实验组分为两组分别为 dsRNA-GFP+rTrx+WSSV 和dsRNA-Lv-BigPEN+rLv-BigPEN+WSSV，在攻毒WSSV后每组均每隔4小时统计死亡率。在第一次注射（即注射dsRNA）48 h后，将10μg对照蛋白Trx 和10 μg重组蛋白 rLv-BigPEN 分别与用 PBS 稀释的 WSSV 粗提液（10⁶ copies/μl）在常温下孵育1 h，每只虾注射50 μL。在注射48 h后取样，提取病虾肌肉 DNA，采用荧光定量 PCR的方法检测对虾肌肉中的病毒拷贝数，分别取样24尾虾，每3尾虾的肌肉混合在一起作为一个样品，各有8个样品用于 WSSV 拷贝数的测定。实验用到的凡纳滨对虾的体重为5.0 g ± 0.2 g。

2、结果如图7所示，注射重组蛋白 rLv-BigPEN 孵育 WSSV 的对虾，在48 h后其体内 WSSV 病毒的拷贝数明显低于对照组，表明 rLv-BigPEN 对 WSSV 的感染活性有抑制作用。

注射重组蛋白 rLv-BigPEN 孵育 WSSV 的对虾，在168 h内，对虾存活率明显高于对照组，表明 rLv-BigPEN 对 WSSV 的感染活性有抑制作用（图8）。

可见，所述凡纳滨对虾Lv-BigPEN基因及其重组蛋白在鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂的生产上有重要应用前景。

序列表

<110> 中山大学

<120> 凡纳滨对虾抗菌肽基因 Lv-BigPEN 及其重组蛋白和应用

<141> 2018-05-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

atgaagggtc ttttcgtctt ggccttcgtc gccgcgctgt gcgtcgctcc cttccgagct 60

gaggggccgc ctggagtgct gcgtcctctg ccccgccctg gctatggggg agtgcagact 120

ctgccggcgc ctttgcccgc tcccttgggg tcctcgttta agcagaccag gccttcttat 180

cgacctcaga tccagccctc gctcatacag accaaacccc tgcctcgccc tgtaactctc 240

ccggcgaaac tgccagagga cctcaggcag acgaggccta ttgctcgccc tcagactcag 300

cccctgccag tagtgctccc tgccgacctt agctcctcgg gcaagcaaac caaacccctg 360

cctcgccctg tgaccctccc agcgaaacta ccagaggact tcaagcagac gagacccgtt 420

gttcgcccgc aagtccagcc cgcgcatccc tctggcggcg tccggcccct gccagcagtg 480

ctcccagccg acctcagggg atcggggaag caaaccaagc ccctaccccg ccctgtgccc 540

cttccagcag tggacctcaa gcagacaaga cccgtcgcgc gtccctcgta ccacagaccc 600

caagtcctac ctgcttaccc ttcaggagga agacagaccc ttcccgccgc acttcccgca 660

gacctccagg gaccgaggaa gcagacaaga cctgtactcc gaccttcgcc gtacagccct 720

ctgagggaaa ccgaaatctg ccggaactgc gcccagctgt ccttcgtccg tcgcggcgcc 780

tgctgcaagc gctggaactc ctgctgttga 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

Met Lys Gly Leu Phe Val Leu Ala Phe Val Ala Ala Leu Cys Val Ala

1 5 10 15

Pro Phe Arg Ala Glu Gly Pro Pro Gly Val Leu Arg Pro Leu Pro Arg

20 25 30

Pro Gly Tyr Gly Gly Val Gln Thr Leu Pro Ala Pro Leu Pro Ala Pro

35 40 45

Leu Gly Ser Ser Phe Lys Gln Thr Arg Pro Ser Tyr Arg Pro Gln Ile

50 55 60

Gln Pro Ser Leu Ile Gln Thr Lys Pro Leu Pro Arg Pro Val Thr Leu

65 70 75 80

Pro Ala Lys Leu Pro Glu Asp Leu Arg Gln Thr Arg Pro Ile Ala Arg

85 90 95

Pro Gln Thr Gln Pro Leu Pro Val Val Leu Pro Ala Asp Leu Ser Ser

100 105 110

Ser Gly Lys Gln Thr Lys Pro Leu Pro Arg Pro Val Thr Leu Pro Ala

115 120 125

Lys Leu Pro Glu Asp Phe Lys Gln Thr Arg Pro Val Val Arg Pro Gln

130 135 140

Val Gln Pro Ala His Pro Ser Gly Gly Val Arg Pro Leu Pro Ala Val

145 150 155 160

Leu Pro Ala Asp Leu Arg Gly Ser Gly Lys Gln Thr Lys Pro Leu Pro

165 170 175

Arg Pro Val Pro Leu Pro Ala Val Asp Leu Lys Gln Thr Arg Pro Val

180 185 190

Ala Arg Pro Ser Tyr His Arg Pro Gln Val Leu Pro Ala Tyr Pro Ser

195 200 205

Gly Gly Arg Gln Thr Leu Pro Ala Ala Leu Pro Ala Asp Leu Gln Gly

210 215 220

Pro Arg Lys Gln Thr Arg Pro Val Leu Arg Pro Ser Pro Tyr Ser Pro

225 230 235 240

Leu Arg Glu Thr Glu Ile Cys Arg Asn Cys Ala Gln Leu Ser Phe Val

245 250 255

Arg Arg Gly Ala Cys Cys Lys Arg Trp Asn Ser Cys Cys

260 265

Claims

1.一种凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种凡纳滨对虾抗菌肽Lv-BigPEN，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET32a(+)。

5.一种含有权利要求3或4所述表达载体的宿主菌。

6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。

7.权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN在制备凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白中的应用。

8.一种凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN连接到原核表达载体，获得重组载体；将构建好的重组载体转化至大肠杆菌中，筛选阳性克隆，并进行诱导表达，收集表达上清，再纯化蛋白，得到凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。

9.权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽基因Lv-BigPEN和/或权利要求2所述凡纳滨对虾抗菌肽在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

10.权利要求8制备得到的凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。