CN105859863A - 凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可应用于鱼虾饲料添加剂或抗病药物开发的凡纳滨对虾新型抗菌肽基因CrustinB的核酸序列、重组蛋白表达载体、菌株的制备方法及其应用。所述CrustinB的核酸序列长178bp，开放阅读框架编码197个氨基酸，推测蛋白分子量大小为19.3KDa，重组蛋白表达载体pYE‑GAPα‑CrustinB转化到毕赤酵母GS115可以获得稳定的表达CrustinB重组蛋白的菌株。采用本发明制备的表达菌株以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果，可应用于生产鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。

Description

凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用。

背景技术

渔业是现代农业重要组成部分，是人类蛋白食品重要来源。当前渔业生产过程中面临最大问题就是病害问题：各种细菌或者病毒病经常引起起鱼、虾大量死亡，从而给养殖业带来巨大经济损失。为了预防和控制鱼、虾病害发生，养殖户不得不大量使用化学药物进行池塘消毒或者在饲料中添加抗生素类药物。但是大量使用化学药物或者抗生素类药物会带来严重的生态破坏以及食品安全问题，因此，亟待开发可应用于现代渔业的无污染、无残留、安全有效的新型渔药，减少化学药物或者抗生素类药物的使用。

抗菌肽(Antimicrobial peptides)又叫抗微生物多肽或肽抗生素，是生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。抗菌肽在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的重要组成部分，具有分子量小、热稳定、广谱抗菌及无免疫原性等特点。抗菌肽作为传统抗生素的替代物正越来越受到人们的关注，是目前国际学术研究的活跃领域之一。

与抗生素比较，抗菌肽有以下特点：不但可以抗革兰氏阳性菌和阴性菌，甚至对寄生虫、真菌、病毒也具有抵抗作用；分子量小，容易被吸收，杀菌作用迅速，不易产生耐药性；抗菌浓度小，浓度单位一般在μmol/L水平。抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题，部分抗菌肽具有抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力，因此在抗病饲料添加剂研发方面具有重要的应用前景。

抗菌肽普遍存在于脊椎动物或者无脊椎动物。与脊椎动物不同，无脊椎动物没有抗体为重要特征的特异性免疫系统，抵御病原入侵主要依赖非特异性免疫系统，抗菌肽作为非特异性免疫系统重要组分在抵御病原入侵过程中扮演重要角色。凡纳滨对虾作为一种重要的经济养殖动物，在亚洲和美洲都有大量的养殖。凡纳滨对虾属于无脊椎动物，其基因组含有大量抗病相关基因，比如凝集素、抗菌肽、溶菌酶、过氧化物酶等基因。在凡纳滨对虾已有不少抗病相关的基因或者分子被发现，某些基因的重组蛋白已经被应用于鱼虾抗病药物开发并获取了相关专利。

在凡纳滨对虾或者其他甲壳类动物，已经有许多抗菌肽基因已经被发现并且公布在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上，但是本发明涉及到的抗菌肽基因CrustinB为本发明人首次发现且命名，在NCBI或者相关文献尚没有关于其核酸序列、重组蛋白的研究以及应用报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备方法与应用，解决当前渔业病害问题严重，化学药物或者抗生素类渔药引起的生态破坏以及食品药物残留问题。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种凡纳滨对虾抗菌肽，包含具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。

上述凡纳滨对虾抗菌肽的基因CrustinB，包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。

一种表达载体，为将上所述的基因CrustinB核酸表达序列连接到酵母表达载体pYE-GAPα的EcoR I位点和Xba I位点之间，而得到的表达载体pYE-GAPα-CrustinB。

一种上述凡纳滨对虾抗菌肽的制备方法，包括将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB重组蛋白。

一种上述的CrustinB编码基因及其变体的检测及制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取凡纳滨对虾总RNA，经mRNA纯化及反转录得cDNA；2)设计引物，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述CrustinB的编码基因或其变体；所述引物包括如SEQ ID NO：3所示上游引物和如SEQ ID NO：4所示下游引物。

一种上述凡纳滨对虾抗菌肽在制备鱼虾抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

一种上述表达载体在制备鱼虾抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

相比于现有技术，本发明的优势在于：

本发明提供了一种可应用于鱼虾饲料添加剂或抗病药物开发的凡纳滨对虾新型抗菌肽基因CrustinB的核酸序列、重组蛋白表达载体、菌株的制备方法及其应用。本发明所述CrustinB的核酸序列长178bp，开放阅读框架编码197个氨基酸，推测蛋白分子量大小为19.3KDa，重组蛋白表达载体pYE-GAPα-CrustinB转化到毕赤酵母GS115可以获得稳定的表达CrustinB重组蛋白的菌株。采用本发明制备的表达菌株以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果，可应用于生产鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。

附图说明

图1是本发明采用的酵母表达载体pYE-GAPα质粒图谱。

图2是本发明pYE-GAPα-crustin B质粒酶切鉴定。

图3是本发明将pYE-GAPα-crustin B电转酵母细胞GS115结果。

图4是本发明PCR鉴定阳性克隆菌。

图5是本发明小试表达SDS-PAGE电泳图。

图6是本发明crustin-B蛋白WB鉴定结果。

图7是本发明crustin-B蛋白的葡萄球菌抑菌效果检验。

图8是本发明crustin-B蛋白的副溶血弧菌抑菌效果检验。

具体实施方式

一、凡纳滨对虾抗菌肽：包含具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。

二、凡纳滨对虾抗菌肽的基因CrustinB：包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。

三、表达载体pYE-GAPα-CrustinB：基因CrustinB核酸表达序列连接到酵母表达载体pYE-GAPα的EcoR I位点和Xba I位点之间获得。

四、凡纳滨对虾抗菌肽的制备方法：将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB重组蛋白。

五、本发明CrustinB编码基因及其变体的检测及制备方法：包括以下步骤：1)提取凡纳滨对虾总RNA，经mRNA纯化及反转录得cDNA；2)设计引物，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述CrustinB的编码基因或其变体；所述引物包括如SEQ ID NO：3所示上游引物和如SEQ ID NO：4所示下游引物。

六、本发明的目的是通过以下技术手段实现的：

(1)总RNA提取：分别从凡纳滨对虾取眼柄、腮、肝胰腺、心脏、胃、肠、后盲囊、肌肉、神经、表皮组织，混合后使用RNA提取试剂盒提取总RNA。

(2)转录组测序：将上述总RNA交由测序公司(华大基因)进行转录组测序，从而获得对虾上述组织的转录组信息，同时获得相关序列标签信息(ESTs)。

(3)CrustinB部分核苷酸序列(EST)的获得：使用生物软件DNAStar中的EditSeq程序查找上述序列的PolyA尾、特异引物序列及重叠区，用SeqMan程序去除序列之间的重叠部分，并拼接得到全长cDNA序列。拼接后序列再用BlastX(http：//www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/)进行同源性搜索、比对分析。通过同源搜索以及比对筛选出了具有抗菌肽特征的核酸序列，将其中一个命名为CrustinB。

(4)基因完整核苷酸序列的获得：根据凡滨对虾CrustinB的EST序列，设计5’-RACE和3’-RACE引物，通过RACE扩增以及测序分别获得CrustinB5’端和3’端未知信息，通过对5’端和3’端序列进行拼接获取完整CrustinB基因序列信息。

(5)编码序列的获得：使用EditSeq查找拼接后序列的开放读码框(ORF)，将开放读码区翻译成氨基酸序列，同时计算蛋白的分子量和理论等电点。用Signa lP预测翻译后氨基酸序列的信号肽及可能的切割位点。

(6)根据CrustinB序列，设计CrustinB蛋白编码区扩增引物，在引物的两端各设计了保护性碱基，通过克隆位点EcoR I和Xba I连入酵母表达载体pYE-GAPα，转入Top10克隆菌株。经酶切及测序验证无误后，并抽提质粒10ug以上。利用AVr II线性化重组质粒pYE-GAPα，电转化毕赤酵母GS115，挑选5-10株阳性克隆，并通过PCR验证，选择1-2株阳性菌株进行表达验证。按照实验预期：细胞培养过程中，CrustinB蛋白将会分泌表达至培养基中，通过SDS-PAGE电泳检测及WB验证目的蛋白的表达情况，经分析有检测到目标蛋白的表达。

(7)CrustinB蛋白的纯化以及抗菌分析。将已证实可表达CrustinB蛋白的毕赤酵母菌种接种到YPD培养基(含胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2％)，按设定的培养条件培养96小时后，将菌液10000rpm离心2min取上清液备用。将上清液样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况，用5倍Ni-NTA体积的NTA-0Buffer冲洗无法吸附到Ni-NTA的杂质，再用5倍Ni-NTA体积洗脱液过柱，收集含有目的蛋白的洗脱液。SDS-PAGE电泳检测洗脱液是否含有目的蛋白或者杂蛋白，利用冷冻干燥机将获取的蛋白溶液进行浓缩，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

(8)CrustinB蛋白的抗菌效果分析。取30uL对数生长期细菌，加入到固体培养基平板，混匀涂布到平板上；用灭菌纸片充分浸泡到浓度为(0.03mg/ml)的CrustinB蛋白溶液，然后取出贴至平板上，培养12-20h。设立灭菌生理盐水作为阴性对照，操作方法同CrustinB蛋白实验组，设立设立氨苄青霉素及链霉素药敏纸片作为阳性对照，直接取药敏纸片贴至已经涂布有细菌的平板上。

以下结合实施例及其附图对本发明技术方案作进一步非限制性的详细说明。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，ColdSpring Harbor)。所用引物及DNA序列均由华大基因(深圳)科技有限公司合成。

本发明采用的pYE-GAPα载体、赤酵母GS115购自南京钟鼎生物技术有限公司，pYE-GAPα载体的质粒图谱分别如图所示；oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自OMEGA公司，质粒大量抽提试剂盒购自Nucleo Bond公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂Magetran购自Origene公司；倒置显微镜为Olympus产品，荧光倒置显微镜为Nikon公司产品。SPF南美白对虾(体重10.2±0.33g)，取自广西水产研究所南美白对虾国家良种场。pYE-GAPα质粒(钟鼎实验保存)，TOP10菌株(钟鼎生物保种)，GS115(购自life公司，钟鼎实验保存)，Protein Marker(钟鼎生物自制)，PVDF膜(购自美国Millipore公司)，X光片(购自美国柯达公司)，ECL显色液(购自中国普利莱公司)，鼠抗His单抗(钟鼎生物实验室自制)，兔抗鼠HRP二抗(钟鼎生物实验室自制)，Acr、Bis、Tris等(购自Sigma公司)，SDS(购自Amresco公司)，Tyrptone、Yeast Extract(购自OXOID公司)，PCR反应管(购自Fisher公司)，0.22μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司)，Ni2+IDA亲和层析胶(zoonbio公司)Agarose(购自上海基因公司)，DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司)，SACI(购自宝生物)，常规生化试剂为国产分析纯。若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。

本发明通过以下步骤获得：

(1)对虾组织取样：凡纳滨对虾，平均体重约为12克。取样时，除了血淋巴外，还分别取眼柄、腮、肝胰腺、心脏、胃、肠、后盲囊、肌肉、神经、表皮，置于RNAlater液(美国ANBIN公司)中-80℃保存备用。

(2)总RNA提取：使用TRIzol reagent提取总RNA，参照根据NanoDrop 1000spectrophotometer和Agilent 2100Bioanalyzer检测提取总RNA的质量以及完整性，具体方法参照说明书。

(3)转录组文库构建：用DnaseI消化总RNA样品中存在的DNA片段，参照试剂盒(mRNA Isolation Systems)说明，将mRNA从总RNA中纯化出来。将mRNA随机打断后反转录成cDNA：将mRNA与打断试剂混匀，在加热的条件下，并作用一定时间后乙醇沉淀法回收打断产物，配置第一链合成反应体系并合成cDNA。将cDNA末端修复为平末端，3’添加(A)碱基，在平末端cDNA 5’及3’加接头，胶回收一定片段大小的连接产物。使用PCR技术扩增带有接头的DNA片段。反应结束后，对PCR产物进行鉴定电泳，用胶回收试剂盒纯化和回收对目的片段，回收产物溶于适量Elution Buffer中，做好标记，至此文库制备完成。

(4)转录组测序及基因识别：将建好的凡纳滨对虾文库，根据测序操作流程在454GS-FLX系统(Roche)上进行测序。经测序后获取相应的EST序列，使用组装软件iAssembler(http：//bioinfo，bti，cornell.edu/tool/iAssembler)对EST序列进行组装。使用GO(Gene Ontology)、KEGG数据库对全部组装序列进行功能归类。归类结果，其中一条核酸序列CrustinB具有抗菌肽特征，经NCBI数据库搜索、比对，数据库中没有与之高度同源的核酸序列，因此可认定为新发现的核酸序列。

(5)CrustinB基因全长扩增：根据获得凡滨对虾CrustinB EST序列，设计RACE引物，以CrustinB的3’及5’-RACE-Ready cDNA为模板，配制PCR体系分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，增产物交由华大基因科技有限公司进行测序；利用DNAstar软件对测序结果进行分析以及拼接，从而获得包含完整开放阅读框架(ORF)的CrustinB基因。

(6)pYE-GAPα-crustinB：本发明实例采用的载体pYE-GAPα质粒图谱如图1所示，该质粒为环状双螺旋质粒，空载质粒含3080个碱基，喊含有一个博莱霉素筛选基因Zeocin，多克隆位点可以插入外源基因，多克隆位点上游含有6个组氨酸编码序列，因此所表达的蛋白含有6个组氨酸组成的蛋白标签。

pYE-GAPα-crustinB质粒构建如SEQ ID NO：6所示，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因crustinB，双酶切连接至pYE-GAPα载体的EcoR I和Xba I之间；挑取阳性克隆子测序。

(7)pYE-GAPα-crustin-B质粒酶切鉴定：如图2所示，图中：M为核酸分子量标尺Marker，由下至上每条条带的大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp；1为酶切后质粒；2为酶切前质粒。

(8)质粒提取及线性化：将10uL线性化质粒pYE-GAPa-crustin-B加入到装有80uL毕赤酵母感受态酵母细胞的1.5mLEP管内，混匀后加入到直径为0.2cm电转化杯中。电击条件为：电压1700V、时间8mS、电击2次。

(9)电转酵母细胞GS115：分别吸取50ul、100uL和200uL线性化质粒pYE-Lvcrustin-B-capsid的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上，30度恒温培养48小时，待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有10ml YPD液体培养基试管中(抗生素Zeocin浓度100ug/ml)，30度，180rpm过夜培养，结果如图3所示。

(10)PCR鉴定阳性克隆菌株：挑选6株阳性克隆，分别提取基因组DNA(编号为123456)，使用5’pGAP priming和3’AOX1priming引物对目的基因进行PCR鉴定，结果显示均为阳性。PCR鉴定阳性克隆子，预期条带大小约1.0K.。如图4所示，图中：M为DNA Marker，从下到上各条带分别为100，250，500，750，1000，2000bp；1-6为阳性克隆子PCR条带。

(11)小试表达：crustin-B蛋白大小19.3KD，翻译后氨基酸序如SEQ ID NO：5所示。取上述鉴定阳性的表达菌株(3号菌株)接入装有9ml YPD(抗生素Zeocin200ug/mL)的试管中，30度、220rpm培养24h后，取500uL接入到50ml YPD(抗生素Zeocin 200ug/mL)液体培养基中，30度、220rpm培养，每0h，24h，48h，72h，96h时从培养基中取样，10000rpm、2min离心收集上清液，使用SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示。图中：Lane M：protein marker；Lane 1：pGAPZaA--capsid转化GS115菌株培养0小时；Lane 2：pGAPZaA--capsid转化GS115菌株培养24小时；Lane 3：pGAPZaA--capsid转化GS115菌株培养48小时；Lane 4：pGAPZaA--capsid转化GS115菌株培养72小时；Lane 5：pGAPZaA--capsid转化GS115菌株培养96小时。经分析结果显示24h，48h，72h，96h菌株均有阳性，选择一株进行菌株放大培养，目的蛋白条带如箭头所示。

(12)WB(Western blot)鉴定：取步骤(11)上清液样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将凝胶剪裁至合适大小，用转膜缓冲液平衡20min。按凝胶大小剪裁滤纸数块及PVDF膜一块，浸入转膜缓冲液中10min。在转膜装置中由正极到负极按顺序叠放24层滤纸、PVDF膜、凝胶、24层滤纸并精确对齐，玻璃棒小心排除气泡。放置完成后接通电源，恒流20V恒压或30mA恒流转印1-2h。转移结束后，将PVDF膜取出，观察预染marker是否转移良好。用镊子取出PVDF膜，浸泡于PBS-T液中漂洗3次，每次5min。取出PVDF膜放到封闭液中，室温平稳摇动2h。然后用PBST清洗PVDF膜三次，每次5min。将膜放入塑胶袋中，对膜的正面做好标记，然后向袋内滴加稀释好的一抗，加入6-Histag单克隆抗体，37℃孵育1h。将膜取出，用PBS-T清洗三次，每次5min。以同样的方法将PVDF膜用羊抗鼠IgG-HRP抗体孵育1-2h。二抗作用后，取出膜以PBS-T清洗三次，每次3-5min。然后将膜放入塑胶袋中，滴加适量DAB显色液避光显色至有清晰的目标蛋白带出现，用ddH2O终止反应，把膜置于滤纸上，待膜干透后拍照或封存。

crustin-B蛋白WB鉴定结果如图6所示，经Western blot验证，纯化的蛋白被抗his抗体识别，条带大小与预期相符，证明crustin-B表达以及纯化成功。图中：Lane M：protein marker；Lane 1空白对照；Lane 2-5不同浓度的crustin-B蛋白样品。

(13)CrustinB重组蛋白纯化：将步骤(11)菌液5000rpm×10min离心，取上清液进行蛋白纯化。具体方法：将层析柱固定在支架上，关闭层析柱的帽子；轻微混匀Ni-NTA树脂填料(填料中含有等体积的30％乙醇)，取4-5ml装入层析柱中，静置待填料全部自然沉降至底部后，松开帽子让30％乙醇流出，然后以8倍柱体积的buffer B平衡柱子一次；往平衡好的柱子加入约8倍柱体积的蛋白溶液，调整帽子控制流速，在重力作用下自然过柱；用8倍柱体积用bufferC冲洗柱子2次，收集流出液。用1倍柱体积的用buffer D洗脱柱子4次，收集流出液；用1倍柱体积的buffer E洗脱柱子4次，收集流出液；取穿透液以及各梯度流出液进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白质在各管中分布情况。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度。

(14)CrustinB重组蛋白抑菌实验：取30uL对数生长期细菌，加入到LB培养基，混匀涂布到平板上；用灭菌纸片充分浸泡到浓度为(0.03mg/ml)的CrustinB蛋白溶液，然后取出贴至平板上，培养20h。设立灭菌生理盐水作为阴性对照，操作方法同CrustinB蛋白实验组，设立设立氨苄青霉素及链霉素药敏纸片作为阳性对照，直接取药敏纸片贴至已经涂布有细菌的平板上。

分别用葡萄球和溶藻弧菌作为实验菌株，通过抑菌圈实验鉴定抑菌效果，结果分别如图7和8所示，图中：B：crustin-B；NC：生理盐水对照。与阴性对照相比，crustin-B对葡萄球菌以及副溶血弧菌明显具有抑菌作用。

应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种凡纳滨对虾抗菌肽，其特征在于：包含具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。

2.一种权利1所述凡纳滨对虾抗菌肽的基因CrustinB，其特征在于：包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体为将权利要求2所述的基因CrustinB核酸表达序列连接到酵母表达载体pYE-GAP α的EcoR I位点和XbaI位点之间，而得到的表达载体pYE-GAP α-CrustinB。

4.一种权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB重组蛋白。

5.一种权利要求2所述的CrustinB编码基因及其变体的检测及制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取凡纳滨对虾总RNA，经mRNA纯化及反转录得cDNA；2)设计引物，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述CrustinB的编码基因或其变体；所述引物包括如SEQ ID NO：3所示上游引物和如SEQ ID NO：4所示下游引物。

6.一种权利要求1所述凡纳滨对虾抗菌肽在制备鱼虾抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。

7.一种权利要求3所述表达载体在制备鱼虾抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。