CN109868277A - 曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能，Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，包括如下步骤：1）将提取的总RNA反转录合成cDNA模板，扩增TLR基因片段；2）采用RACE技术以提取的总RNA模板进行目的基因第一链cDNA的合成，然后进行第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，测序；3）将所得的基因序列拼接验证，即得Toll样受体基因。并提供一种该Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途。本发明Toll样受体基因的氨基酸残基中有高度保守的结构域；该Toll样受体基因参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，尤其是涉及曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能。
技术背景
曼氏无针乌贼（Sepiella japonica），隶属于动物界（Animal）、软体动物门（Mollusca）、头足纲（Cephalopoda）、乌贼目（Sepioidea）、乌贼科（Sepiidae）、无针乌贼属（Sepiella），主要分布于西北太平洋、北印度洋等沿岸海域，其养殖产业在中国浙江、福建沿海地带较为常见，是世界重要头足类经济种。
在海水养殖环境中存在的致病菌主要为革兰氏阴性菌（Gram-PositiveBacteria，G-），常见的有假单胞菌属，弧菌属，芽孢杆菌属等。随着经济与养殖业的迅速发展，海洋污染日益加剧，致使海水中的生物难以负荷其中大量存在的致病菌的感染，水生生物面临更严重的病害胁迫，甚至造成大面积的死亡。这一现象尤其凸显于无获得性免疫系统的无脊椎动物中，而曼氏无针乌贼亦深受其害。目前曼氏无针乌贼作为东海四大海产之一，作为经济及药用物种已经兴起人工养殖，并得到大力的发展。随之而来的则是各种致病菌引起的病害，造成经济损失，给其养殖业带来不定性的养殖效益，因此研究曼氏无针乌贼的天然免疫反应对预防革兰氏阴性菌引起的病害死亡提供理论基础，检测这些基因在病原感染情况下的表达调控，弄清病原与机体免疫分子的相互作用机制，探讨如何提高机体的抗逆能力，进而提升曼氏无针乌贼人工养殖工程的全面合理，健康养殖的的效率。
病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）是细菌和病毒等病原微生物都具有保守结构域，而生物体识别病原体可依靠模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)。PRRs是由胚系基因编码而成的主要表达于固有免疫细胞表面、功能上可识别PAMPs、进化上十分保守的受体分子，因此，PRRs对生物体的生存极为重要。当前对PRRs研究最多的是TLRs（Toll-like receptors），该受体是PRRs研究中发现最早且作用机制较为清楚的受体分子之一。TLRs主要分布在于生物体的免疫细胞和免疫器官中，如TLR1在肝脏与脾脏等免疫器官有较高的表达，TLR2则在脾脏，肺和外周血细胞中，TLR4在肝肺中有高表达等。TLRs激活需要不同的配体，外源性配体主要为病原微生物，TLRs的分布亦与病原体所在位置有关。因此研究TLR分子及其相关免疫功能对进一步阐明曼氏无针乌贼等软体动物的固有免疫系统调控机制，掌握TLR对头足类免疫代谢的影响奠定基础。同时，为预防病原菌引起的疾病提供理论基础，也为揭示曼氏无针乌贼等海洋头足类健康养殖提供理论指导。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过克隆获得曼氏无针乌贼的Toll样受体基因，该Toll样受体基因cDNA序列包含1193个氨基酸残基，其结构中有高度保守的结构域。
本发明的目的之二在于提供一种Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途，参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，包括如下步骤：
1）将提取的总RNA反转录合成cDNA，以此cDNA为模板扩增TLR基因片段；
2）采用RACE技术以提取的总RNA模板进行目的基因第一链cDNA的合成，然后进行第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，测序；
3）将步骤1和步骤2所得的基因序列信息，用Lasergene软件进行拼接验证，即可得TLR目的基因cDNA全长信息，即为Toll样受体基因。Toll样受体家族（TLRs）是重要的PRRs，介导病原体特异性识别病源微生物的保守的病原相关分子模式（PAMPs），并引发炎症反应产生诸多免疫因子，在肝脏中的最高表达，而最低的是胃，本发明首次克隆获得曼氏无针乌贼的Toll样受体基因cDNA序列，包含1193个氨基酸残基，含有两个N-糖基化位点，此外，Toll样受体基因结构中有高度保守的结构域：串联重复的LRR-N/CT，具有与PAMP结合或识别的功能，胞内段的TIR域起细胞内信号转导的作用，且Toll样受体基因具有信号肽结构，但在已有的无脊椎动物TLR研究中，不论定位在细胞膜还是内质网上，信号肽都不是必备结构。
作为优选，基因片段克隆用引物为：
TLR–F：5'-GTCCCAAACAGTGCGAAT -3'；
TLR–R：5'-GCGACAAGTCCAATACCG -3'。
作为优选，cDNA全长克隆用引物为：
TLR5’-1：5'-GGACAGTGGTGTAACG-3'；
TLR5’-2：5'-GCGAGAAGACGCTGAAGTTG-3'；
TLR5’-3：5'-GAGCCATGCTGTCGTTGA-3'；
TLR3’ -1：5'-TGGAAGCAGATCAACTTGAGTCAGGT-3'。
作为优选，Toll样受体基因cDNA序列全长3914bp。
作为优选，Toll样受体基因cDNA序列包括185bp的5’UTR、137bp的3’UTR及3582bp的开放阅读框。
作为优选，Toll样受体基因cDNA序列编码1193个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号（AATAAA）下游13bp出现终止密码子（TAA），理论分子量为137.87K，等电点为6.69。
进一步优选，Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸的N末端含有信号肽序列，位于1-26aa处。
进一步优选，Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸在989-1026氨基酸处含有1个跨膜区，氨基酸序列中包含11个亮氨酸重复序列、1个C端亮氨酸富集区和1个N端亮氨酸富集区。根据以上的氨基酸结构所包含的跨膜区、11个亮氨酸重复序列、C端亮氨酸富集区和N端亮氨酸富集区结构域等结构特征推测，曼氏无针乌贼TLR属于TLR家族。
本发明还公开了曼氏无针乌贼Toll样受体基因的接头分子，接头分子为MyD88，MyD88采用同源克隆法与RACE技术克隆获得， MyD88基因cDNA序列全长1912bp，其ORF框包含1017bp，编码338个氨基酸的小分子蛋白。曼氏无针乌贼存在依赖MyD88的TLR-NF-κB信号通路，曼氏无针乌贼MyD88有与其他物种一致的两个保守结构域，N端的死亡结构域（DD）和C端的TIR结构域，MyD88作为IL-1R/TLR信号转导接头蛋白，G-感染生物体后，TLRs通过MyD88传递信号激活NF-κB通路，同时MyD88是细胞内通用免疫调节因子，参与多种信号通路传递，TLR或其他信号通路激活可致使MyD88蛋白或mRNA表达增加。
本发明还公开了曼氏无针乌贼Toll样受体基因的用途，Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途。在G-（LPS）刺激下，TLR、MyD88以及下游基因都会上调表达，曼氏无针乌贼TLR亚细胞定位在细胞膜，曼氏无针乌贼MyD88定位在细胞质，参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明通过克隆获得曼氏无针乌贼的Toll样受体基因，该Toll样受体基因cDNA序列包含1193个氨基酸残基，其结构中有高度保守的结构域；2）本发明Toll样受体基因编码的氨基酸结果包含的跨膜区、11个亮氨酸重复序列、C端亮氨酸富集区和N端亮氨酸富集区结构域等结构特征推测，曼氏无针乌贼TLR属于TLR家族；3）本发明Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途，在G-（LPS）刺激下，TLR、MyD88以及下游基因都会上调表达，曼氏无针乌贼TLR亚细胞定位在细胞膜，曼氏无针乌贼MyD88定位在细胞质，参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。
说明书附图
图1为本发明实施例1中曼氏无针乌贼肝组织总RNA提取电泳图；
图2为本发明实施例1中Toll样受体基因片段PCR产物电泳结果；
图3为本发明实施例1中Toll样受体基因的cDNA的核苷酸序列；
图4为本发明实施例1中Toll样受体基因与其他22个TLRs的氨基酸序列构建进化树；
图5为本发明实施例1中Toll样受体基因的氨基酸序列与其他软体物种的TLR多序列比对；
图6为本发明实施例3中Toll样受体基因在鳃和肝两个组织的相对表达水平；
图7为本发明实施例4中MyD88基因片段PCR产物电泳结果；
图8为本发明实施例4中MyD88基因的核苷酸序列及氨基酸序列；
图9为本发明实施例4中MyD88基因的模型比对；
图10为本发明实施例4中MyD88与其他25个MyD88的氨基酸序列构建系统进化树；
图11为本发明实施例4中多序列比对分析曼氏无针乌贼MyD88蛋白；
图12为本发明实施例5中MyD88在PBS/LPS刺激下的相对表达量；
图13为本发明实施例6中蛋白载体质粒TIR-pmCherry双酶切电泳结果；
图14为本发明实施例6中融合蛋白的荧光分布；
图15为本发明实施例7中MyD88/NFKB在肝组织的相对表达水平；
图16为本发明实施例7中MyD88/NFKB在鳃组织的相对表达水平。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
曼氏无针乌贼Toll样受体基因，Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，Toll样受体基因cDNA序列全长3914bp。Toll样受体家族（TLRs）是重要的PRRs，介导病原体特异性识别病源微生物的保守的病原相关分子模式（PAMPs），并引发炎症反应产生诸多免疫因子，在肝脏中的最高表达，而最低的是胃，该实施例首次克隆曼氏无针乌贼的Toll样受体基因cDNA序列，包含1193个氨基酸残基，含有两个N-糖基化位点，此外，Toll样受体基因结构中有高度保守的结构域：串联重复的LRR-N/CT，具有与PAMP结合或识别的功能，胞内段的TIR域起细胞内信号转导的作用，且Toll样受体基因具有信号肽结构，但在已有的无脊椎动物TLR研究中，不论定位在细胞膜还是内质网上，信号肽都不是必备结构。
Toll样基因克隆包括如下步骤：
1）总RNA提取及检测：
用到的剪刀、枪头、镊子、离心管、匀浆器等均需去RNA酶处理，
a)于1.5ml离心管加入600μl Trizol，取约20mg新鲜的肝组织浸入其中，冰上研磨完全再补加400μl Trizol；冰上静置10分钟；
b)加200μl氯仿，剧烈震荡混匀后静置5分钟，离心15min（4℃、12000rpm）；
c)取上清液于新离心管中，加等倍体积异丙醇溶液，涡旋振荡混匀，静置10分钟后离心10min（4℃、12000rpm），去除上清；
d)加1ml的75%的乙醇洗涤，离心10min（4℃、12000rpm），弃上清；
e)重复步骤4；
f)超净条件下风干至RNA呈半透明状态，加30ulDEPC水溶解后备用。
g)以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的完整性；
h)用Nanodrop2000检测OD值及浓度，确保RNA的质量，曼氏无针乌贼提取的总RNA电泳结果如图1所示，显示为3条带：28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA，证明RNA提取较完整，A260/A280约为1.85，说明RNA质量符合要求，可以进行后续实验；
2）cDNA第一条链的合成：
使用TaKara反转录试剂盒反转录合成cDNA模板，为克隆核心片段、荧光定量PCR等的模板，合成体系及步骤如下：
a)RNA的变性：
总RNA 1-5.0μg
Oligo dT 1.0μl
于PCR仪中，70℃热变性，15min，立即冰浴2min。
b)在以上所得反应液1中加入
5×M-MLV Buffer 2.0μl
dNTP（10mM） 0.5μl
RRI 0.25μl
RTase（M-MLV） 0.25μl
以DEPC水补足10体系反应液混匀，42℃反转录1h，70℃灭活逆转录酶15min后，冰上15min。获得的产物cDNA第一条链于-20℃保存；
3）TLR基因片段及cDNA全长克隆与生物信息学分析：
a)TLR基因片段的克隆
从转录组下载曼氏无针乌贼TLR基因的部分序列，使用软件Primer Premier5设计基因特异性引物扩增TLR基因片段，模板为曼氏无针乌贼肝或鳃的cDNA，向0.2ml PCR管中加入：
10×PCR Buffer 2.5μl
TLR-F 0.8μl
TLR-R 0.8μl
cDNA 0.6μl
dNTP（2.5mM） 0.4μl
rTaq酶 0.4μl
加DD水补足20体系混匀，
反应条件：94°C变性3min；94°C变性30s，56°C 退火30s，72°C延伸1min，30个循环；72°C延伸10min；12°C降温。所得PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，经过凝胶成像系统（UVP）观察确定目的条带，如图2所示，所得目的片段约700bp，符合预期大小，送至上海生工测序验证结果与转录组序列及NCBI数据库比对显示为目标序列；
b)RACE技术
采用Invitrogen公司的5´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0 试剂盒获得该基因的5’端序列：
A.使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物5’-1，以总RNA为模板进行目的基因第一链cDNA的合成；
B.使用RNase Mix 对合成的cDNA进行去RNA处理，并使用DNA Purification System:GLASSMAX DNA isolation spin cartridges进行纯化处理；
C.使用TdT酶和dCTP对以上cDNA末端加多聚C；
D.使用引物5’-2与桥连铆钉引物AAP（试剂盒里面自带）对已上所得cDNA进行第一轮PCR扩增；
E.以5’-3和桥连通用扩增引物AUAP（试剂盒里面自带）为引物，使用巢式PCR方法进行第二轮扩增；
F.将上述PCR产物检测凝胶电泳，鉴定目的条带并送至上海生工进行测序；
各实验操作及具体实验步骤、反应体系详见5´ RACE试剂盒说明书；
Clontech 公司的SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得该基因的3’端序列：
A.使用逆转录酶SMARTScribe™ Reverse Transcriptase和引物3’ CDS primer A对总RNA进行逆转录合成cDNA；
B.使用引物3’ -1和UPM，以上述cDNA为模板进行第一轮的PCR扩增；
C.将上述产物稀释，以3’ -2和UPM为引物进行第二轮PCR扩增；
D.将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并送至上海生工直接测序；
各实验操作及具体实验步骤、反应体系详见3´ RACE试剂盒说明书；
将以上所得的基因序列信息，用Lasergene软件进行拼接验证，即可得TLR目的基因cDNA全长信息，如图3所示，图中预测编码的氨基酸序列显示在核苷酸序列下面，起始密码子和终止密码子分别以□和*标记，N-糖基化位点以标记，可发现，经RACE技术扩增获得曼氏无针乌贼TLR分子全长3914bp的cDNA序列，该序列包括185bp的5’UTR、137bp的3’UTR及3582bp的开放阅读框，编码1193个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号（AATAAA）下游13bp出现终止密码子（TAA），理论分子量为137.87K，预测等电点为3.69，此外，在胞外段存在12个潜在的糖基化位点，这可能会影响蛋白质的转运、呈现与配体识别的功能；
c)生物信息学分析
应用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找开放阅读框(ORF)；Signal Pv4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)对TLR氨基酸序列进行信号肽预测；SSPro4.0(http://download.igb.uci.edu/sspro4.html)预测蛋白二级结构；ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)进行多序列分析；SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测其结构域；NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)进行Blastn分析；NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测糖基化位点，ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白的理化性质及等电点，TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测蛋白跨膜结构域；MEGA6.0软件以邻位法(Neighbor Joining)构建系统进化树，bootstraps=1000，其他参数均使用默认值；
利用Mega 6程序对不同物种的TLRs基因以邻位连接法，设定Bootstrap值1000，构建系统进化树，结果显示曼氏无针乌贼TLR的氨基酸序列显示了与软体动物的同源序列相似性，尤其是头足类动物，与夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）形成一个共同的分支，其亲缘关系最近，如图4所示，其次是章鱼（bimaculoides）等，并与其他扇贝等双壳类软体动物亲缘性较近，与其他无脊椎动物具有进化同源性，但与已有的脊椎动物分类TLR并不相同；
将曼氏无针乌贼、夏威夷短尾乌贼、章鱼、栉孔扇贝（Azumapecten farreri）及虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的TLRs氨基酸序列用ClustalW进行多序列对比，结果显示出他们在进化上高同源性和保守性，尤其在TIR、TM和一些关键结构及发挥生物学功能的区域高度保守，如图5所示，其中深色代表100%的相似度，次之为80%，再次之为60%。
上述基因片段克隆用引物为：
TLR–F：5'-GTCCCAAACAGTGCGAAT -3'；
TLR–R：5'-GCGACAAGTCCAATACCG -3'。
上述cDNA全长克隆用引物为：
TLR5’-1：5'- GGACAGTGGTGTAACG-3'；
TLR5’-2：5'-GCGAGAAGACGCTGAAGTTG-3'；
TLR5’-3：5'-GAGCCATGCTGTCGTTGA-3'；
TLR3’-1：5'-TGGAAGCAGATCAACTTGAGTCAGGT-3'。
Toll样受体基因cDNA序列包括185bp的5’UTR、137bp的3’UTR及3582bp的开放阅读框。
Toll样受体基因cDNA序列编码1193个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号（AATAAA）下游13bp出现终止密码子（TAA），理论分子量为137.87K，等电点为6.69。
Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸的N末端含有信号肽序列，位于1-26aa处。
Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸在989-1026氨基酸处含有1个跨膜区，氨基酸序列中包含11个亮氨酸重复序列、1个C端亮氨酸富集区和1个N端亮氨酸富集区。根据以上的氨基酸结构所包含的跨膜区、11个亮氨酸重复序列、C端亮氨酸富集区和N端亮氨酸富集区结构域等结构特征推测，曼氏无针乌贼TLR属于TLR家族。
曼氏无针乌贼Toll样受体基因的接头分子，接头分子为MyD88，MyD88采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，MyD88基因cDNA序列全长1912bp，其ORF框包含1017bp，编码338个氨基酸的小分子蛋白。曼氏无针乌贼存在依赖MyD88的TLR-NF-κB信号通路，曼氏无针乌贼MyD88有与其他物种一致的两个保守结构域，N端的死亡结构域（DD）和C端的TIR结构域，MyD88作为IL-1R/TLR信号转导接头蛋白，G-感染生物体后，TLRs通过MyD88传递信号激活NF-κB通路，同时MyD88是细胞内通用免疫调节因子，参与多种信号通路传递，TLR或其他信号通路激活可致使MyD88蛋白或mRNA表达增加。
曼氏无针乌贼Toll样受体基因的用途，Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途。在G-（LPS）刺激下，TLR、MyD88以及下游基因都会上调表达，曼氏无针乌贼TLR亚细胞定位在细胞膜，曼氏无针乌贼MyD88定位在细胞质，参与曼氏无针乌贼的天然免疫应答，在其抵御水产病原菌的侵染过程中发挥重要作用。
实施例2：
曼氏无针乌贼Toll样受体基因，Toll样基因克隆的进一步优化方案为：
总RNA提取采用Trizol Regent、磷酸胍和硫脲进行提取，Trizol Regent中含有0.03%磷酸胍和0.01%硫脲。Trizol Regent、磷酸胍和硫脲能够发挥增益作用，一方面可迅速渗入组织，灭活内源RNA酶，不会引起RNA的降解，便于RNA的后续提取，并且具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，能够使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的RNA酶活性，有效抑制样本中RNA的降解，保持RNA的完整性；另一方面协助变性的蛋白质等物质溶解于后续加入的氯仿，使得RNA能快速分布在上层水相中，提高总RNA的得率和纯度。
实施例3：
曼氏无针乌贼Toll样受体基因免疫刺激
取浙江苍南养殖基地的健康曼氏无针乌贼，饥饿饲养三日，每天换新鲜水一次，至外界环境物质对样品的影响降至最小值。随机分为3组，每组设3个重复，每组40只，分别向每组乌贼皮下注射PBS重悬的副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila，pH 7.4，1×107 cfu/mL），剂量为0.1mL／只，对照组等体积注射PBS（pH7.4），于注射后0，2，4，8，12，24，48h后分别取3只存活个体的肝与鳃组织，-80℃分别冷冻保存。
提取样品RNA并反转录成模板cDNA。
使用特异性引物曼氏无针乌贼TLR-F/R，以β-actin、GAPDH、TUBA3个基因为内参基因作内参基因进行qRT-PCR，测定曼氏无针乌贼TLR基因在G-刺激下的相对表达量。
经活体注射副溶血弧菌和嗜水气单胞菌，Toll样受体基因相对表达量从0到48小时的变化如图6所示，图中在A和B分别代表在鳃和肝组织的相对表达水平，可发现，与对照组相比，在副溶血弧菌的刺激下Toll样受体基因最高的表达在12 h，鳃组织中比对照组升高7倍，在肝组织为12.4倍；对嗜水气单胞菌感染的亦出现明显变化，Toll样受体基因最高表达在8h，在肝脏和鳃组织中分别是8.3倍的5.4倍，其后随着时间的增长其表达量也在缓慢降低。
实施例4：
MyD88基因片段及全长的克隆与分析
1）MyD88基因核心片段克隆：
从转录组下载曼氏无针乌贼MyD88基因序列，使用软件Primer Premier5设计基因特异性引物扩增MyD88基因片段，所得扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，经过凝胶成像系统观察确定目的条带，如图7所示，所得目的片段约430bp，电泳检测结果相符，送测结果与转录组比对显示正确；
2）RACE技术：
根据已测序验证的MyD88序列，设计RACE引物，进行5’及3’端序列的合成，结果如图8所示，图中起始密码子和终止密码子是分别由＊和□标记，N-糖基化位点标有灰影，死亡域（DD）和TIR域分别标有黑色下划线和双黑色下划线，可得经RACE扩增获得曼氏无针乌贼MyD88全长为1912bp的cDNA序列，该序列包括190bp的5’UTR、705bp的3’UTR和1017bp的开放阅读框，编码338个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号（AATAAA）下游509bp出现终止密码子（TAA），理论分子量为38.95KDa，预测等电点为5.57，此外，两个潜在的N-连接糖基化位点是在死亡序列的中间域，可以维持MyD88的结构和功能稳定；
3）生物信息学分析：
将送测所得的序列信息拼接处MyD88完整的mRNA序列，并进行分子结构及生物信息学分析；
Smart软件分析显示曼氏无针乌贼MyD88氨基酸序列包含N端死亡结构域（DD）、一个短的中间结构域和C端的TIR结构域，与高度保守的MyD88家族结构相同。根据预测的结构域DD和TIR，可将所克隆的曼氏无针乌贼MyD88归为MyD88的家族。序列比对表明曼氏无针乌贼MyD88死亡结构域与人类有48%的同源性，而TIR结构域则有40%的同源性。以此为依据用Swiss-model进行模型比对，分别以DD和TIR两个功能域建模并合成完整结构，如图9所示，图中A代表曼氏无针乌贼myd88的DD区，B代表曼氏无针乌贼myd88的TIR结构域以人类MyD88的TIR结构域建模，C代表曼氏无针乌贼myd88三维结构模型，可发现曼氏无针乌贼MyD88与人MyD88分子构型基本一致；
利用Mega 6程序对来自不同脊椎动物和无脊椎动物的MyD88基因以邻位连接法，设定Bootstrap值1000，构建系统进化树，如图10所示，结果显示曼氏无针乌贼MyD88氨基酸与传统生物进化发育的进程一致，与软体动物相似性较高（约41%-64%），尤其是头足类动物，如曼氏无针乌贼MyD88与章鱼具有最高相似（64%）。在系统发育树二者已位于共同的分支，但不与其他软体动物聚集，亦说明头足类特殊的进化地位；
将曼氏无针乌贼、章鱼、栉孔扇贝（Chlamys farreri）及长牡蛎（Crassostrea gigas）的MyD88氨基酸序列用ClustalW进行多序列对比，如图11所示，结果显示曼氏无针乌贼MyD88其他软体动物一致在进化上具有高同源性和保守性，特别是在一些重要的区域内尤其在TIR和DD区域等一些关键结构部分，及发挥生物学功能的区域，通过TIR域进一步比对发现，3个Box结构的进化高度保守。
实施例5：
MyD88基因在LPS刺激下的诱导表达
取浙江苍南养殖基地的健康曼氏无针乌贼，饥饿饲养三日，每天换新鲜水一次，至外界环境物质对样品的影响降至最小值。随机分为3组，每组设3个重复，每组40只，分别向每组乌贼皮下注射LPS（1.0ug/ml），剂量为0.1mL/只，对照组等体积注射PBS（pH7.4），于注射后0、3、6、12、24、48h后分别取3只存活个体的肝组织，-80℃冷冻保存。
提取样品RNA并反转录成模板cDNA。
使用特异性引物MyD88-F/R，以β-actin、GAPDH、TUBA3个基因为内参基因作内参基因进行qRT-PCR，测定曼氏无针乌贼MyD88基因在LPS刺激下的相对表达量，如图12所示，与对照组相比，在LPS的刺激下曼氏无针乌贼MyD88最高的表达在24h，在肝组织表达量升高约为对照组10.4倍；而后随着时间的延长其基因表达量缓慢降低。
实施例6：
TIR与MyD88蛋白互作
1）构建TIR质粒
取曼氏无针乌贼同源TLR序列的胞内段TIR序列信息，构建与MyD88同源的TIR-pmCherry红色荧光蛋白载体质粒。分析TIR基因序列和pmCherry表达载体的特征，构建含双酶切位点EcoRΙ，BamHΙ的TIR-pmCherry-F/R的引物，构建红色荧光蛋白载体质粒TIR-pmCherry经双酶切验证（如图13所示）及基因序列测序验证，TIR-pmCherry与曼氏无针乌贼TLR的TIR功能域的氨基酸序列完全相同，即所构建质粒符合实验要求。
2）细胞培养与共转染：将1μg以绿色荧光pEGFP-N1表达载体构建出曼氏无针乌贼MyD88-EGFP的融合蛋白和TIR-pmCherry质粒分别加入到含50μlopti-MEM、2μl X-treme均匀的混离心管中，室温放置15 min。将混合液轻柔的加入六孔板中，前后摇晃混匀，培养24h后进行以下相关实验检测。
3）荧光观察：细荧光显微镜在Leica DMI3000B，使用蓝色和绿色激发光在40×倍镜观察荧光分布（如图14所示），图中a代表TIR-pmCherry融合蛋白在HEK293细胞中表达，b代表TIR-pmCherry，c代表曼氏无针乌贼MyD88-EGFP，d代表共转染HEK293细胞实现共定位融合图片，可知曼氏无针乌贼MyD88-EGFP和TIR-pmCherry经共转染进入细胞并成功表达目的蛋白。TIR-pmCherry荧光蛋白表达在除细胞核以外的区域，结合其作为TLR胞内段部分，推测其主要表达在细胞质。共定位图像可以显示两者实现部分重合，即两蛋白分子之间可能存在相互作用。
实施例7：
TLR-MyD88/NF-κB信号通路的天然免疫
取浙江苍南养殖基地的健康曼氏无针乌贼，饥饿饲养三日，每天换新鲜水一次，至外界环境物质对样品的影响降至最小值。随机分为3组，每组设3个重复，每组40只，分别向每组乌贼皮下注射PBS重悬的副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila，pH 7.4，1×107 cfu/mL），剂量为0.1mL／只，对照组等体积注射PBS（pH7.4），于注射后0、2、4、8、12、24、48h后分别取3只存活个体的肝和鳃组织，-80℃冷冻保存。
提取样品RNA并反转录成模板cDNA。
使用MyD88/NF-κB信号通路中MyD88，TRAF6，TAK1，和TOLLIP等特异性引物，以β-actin、GAPDH、TUBA3个基因为内参基因作内参基因进行qRT-PCR，测定曼氏无针乌贼MyD88/NF-κB信号通路基因在G-刺激下的相对表达量，如图15所示，结果显示，经外源刺激后，所检测的NF-κB通路基因mRNA水平均发生明显上调，其中在嗜水气单胞菌的刺激下，肝组织中TAB的mRNA水平在8h较高，TLR下游通路中其他的基因都是在4h时表达量最高。然而在副溶血性弧菌刺激下，TOLLIP和MyD88基因的mRNA水平均逐渐增加，至8h达到最高值，而其他基因受刺激表达程度不尽相同。在鳃组织中除Tollip、TAK1、和IKKβ等基因表达量最高出现在12h外，其他如IRAK和IKKβ均在24h均达到峰值（如图16）。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcccaaaca gtgcgaat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgacaagtc caataccg 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacagtggt gtaacg 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgagaagac gctgaagttg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 5
gagccatgct gtcgttga 18
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Artificial Sequence)
<400> 6
tggaagcaga tcaacttgag tcaggt 26
Claims (10)
1.曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，包括如下步骤：
1）将提取的总RNA反转录合成cDNA，以所述cDNA为模板扩增TLR基因片段；
2）采用RACE技术以提取的总RNA模板进行目的基因第一链cDNA的合成，然后进行第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，测序；
3）将步骤1和步骤2所得的基因序列信息，用Lasergene软件进行拼接验证，即可得TLR目的基因cDNA全长信息，即为Toll样受体基因。
2.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述TLR基因片段克隆用引物为：
TLR–F：5'-GTCCCAAACAGTGCGAAT -3'；
TLR–R：5'-GCGACAAGTCCAATACCG -3'。
3.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述cDNA全长克隆用引物为：
TLR5’-1：5'- GGACAGTGGTGTAACG-3'；
TLR5’-2：5'-GCGAGAAGACGCTGAAGTTG-3'；
TLR5’-3：5'-GAGCCATGCTGTCGTTGA-3'；
TLR3’ -1：5'-TGGAAGCAGATCAACTTGAGTCAGGT-3'。
4.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列全长3914bp。
5.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列包括185bp的5’UTR、137bp的3’UTR及3582bp的开放阅读框。
6.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码1193个氨基酸，在多聚腺苷酸化信号下游13bp出现终止密码子，理论分子量为137.87K，等电点为6.69。
7.根据权利要求6所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸的N末端含有信号肽序列，位于1-26aa处。
8.根据权利要求6所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因，其特征在于：所述Toll样受体基因cDNA序列编码的氨基酸在989-1026氨基酸处含有1个跨膜区，所述氨基酸序列中包含11个亮氨酸重复序列、1个C端亮氨酸富集区和1个N端亮氨酸富集区。
9.权利要求1-8任一项所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因的接头分子，其特征在于：所述接头分子为MyD88，所述MyD88采用同源克隆法与RACE技术克隆获得，所述MyD88基因cDNA序列全长1912bp，其ORF框包含1017bp，编码338个氨基酸的小分子蛋白。
10.权利要求1-8任一项所述的曼氏无针乌贼Toll样受体基因的用途，其特征在于：所述Toll样受体基因在曼氏无针乌贼免疫防御功能中的用途；所述免疫防御功能包括调节先天免疫维护机体的健康与进化。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438130A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-12 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼tnf基因及其用途 |
| CN113501885A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-15 | 中国农业大学 | 嵌合抗病基因及其相关生物材料与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2013136874A (ru) * | 2013-08-07 | 2015-02-20 | Силезиа Груп Пте. Лтд. | Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном |
| CN107805277A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-03-16 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼精子表面蛋白及制备方法和用途 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2013136874A (ru) * | 2013-08-07 | 2015-02-20 | Силезиа Груп Пте. Лтд. | Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном |
| CN107805277A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-03-16 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼精子表面蛋白及制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| LIPING HUO等: "Identification, functional characterization and expression pattern of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) in Sepiella japonica", 《FISH AND SHELLFISH IMMUNOLOGY》, 1 May 2018 (2018-05-01), pages 112 - 119 * |
| NCBI: "Sepiella japonica myeloid differentiation factor 88 mRNA, complete cds", 《NCBI GENBANK》 * |
| NCBI: "Sepiella japonica myeloid differentiation factor 88 mRNA, complete cds", 《NCBI GENBANK》, 3 April 2017 (2017-04-03), pages 1 * |
| NCBI: "Sepiella japonica Toll-like receptor mRNA, complete cds", 《NCBI GENBANK》 * |
| NCBI: "Sepiella japonica Toll-like receptor mRNA, complete cds", 《NCBI GENBANK》, 3 April 2017 (2017-04-03), pages 1 - 2 * |
| 柳志强: "《分子微生物学实验指导》", vol. 1, 北京：中国轻工业出版社, pages: 25 - 27 * |
| 霍利平等: "曼氏无针乌贼TLR基因的克隆与病原菌胁迫下的表达", 《2016年全国海水养殖学术研讨会会议论文集》 * |
| 霍利平等: "曼氏无针乌贼TLR基因的克隆与病原菌胁迫下的表达", 《2016年全国海水养殖学术研讨会会议论文集》, 17 November 2016 (2016-11-17), pages 149 - 157 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438130A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-12 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼tnf基因及其用途 |
| CN110438130B (zh) * | 2019-08-15 | 2023-01-03 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼tnf基因及其用途 |
| CN113501885A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-15 | 中国农业大学 | 嵌合抗病基因及其相关生物材料与应用 |
| CN113501885B (zh) * | 2021-07-20 | 2023-02-24 | 中国农业大学 | 嵌合抗病基因及其相关生物材料与应用 |
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