CN110438130B

CN110438130B - 曼氏无针乌贼tnf基因及其用途

Info

Publication number: CN110438130B
Application number: CN201910753116.5A
Authority: CN
Inventors: 刘慧慧; 霍利平; 葛德隆
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110438130A

Abstract

本发明提供一种曼氏无针乌贼TNF基因及其用途，属于基因工程技术领域，曼氏无针乌贼TNF基因具有SEQ ID NO:1的碱基序列，该基因编码的TNF蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。本发明曼氏无针乌贼TNF基因在曼氏无针乌贼脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠等8种组织中的都有表达，其在肝脏中的表达量最高；该基因对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌感染后的识别较为敏感且反应迅速；该基因的表达载体和编码的蛋白质为曼氏无针乌贼用免疫增强剂，能够提高曼氏无针乌贼的免疫力，尤其是提高曼氏无针乌贼对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的免疫力。

Description

曼氏无针乌贼TNF基因及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼TNF基因及其用途。

背景技术

曼氏无针乌贼（Sepiella japonica），隶属于动物界（Animal）、软体动物门（Mollusca）、头足纲（Cephalopoda）、乌贼目（Sepioidea）、乌贼科（Sepiidae）、无针乌贼属（Sepiella），主要分布于西北太平洋、北印度洋等沿岸海域，其养殖产业在中国浙江、福建沿海地带较为常见，是世界重要头足类经济种。曼氏无针乌贼作为东海海域沿海地带最重要的头足类经济物种之一，人工养殖已经逐步兴起，但养殖过程中出现的因传染性疾病造成的损失非常大，而疾病的防治主要依靠药物。经常性的使用药物，可能使病原体产生对某些药物的抗性，且药物会在曼氏无针乌贼体内及水中积累，既会造成药物残留同时也会污染水体、破坏生态平衡。因此，从养殖品种本身的免疫防御功能人手，筛选并克隆一些与免疫防御密切相关的基因，采用免疫学方法来增强养殖品种的抗病力，并开发新型水产药物，既可提高曼氏无针乌贼的防御病害能力，又可提高水产品的安全性。

曼氏无针乌贼的天然和特异性免疫的效应期大都是由激素样蛋白质-细胞因子来介导的，所以对曼氏无针乌贼细胞因子的研究能够为养殖曼氏无针乌贼提供相关的依据。肿瘤坏死因子 ( Tumo r N ecrosis factor , TNF ) 是重要的细胞因子，在参与动物的免疫调控、信号转导等方面具有广泛的生物学活性。因此，研究TNF及其相关免疫功能对进一步阐明曼氏无针乌贼等软体动物的固有免疫系统调控机制，对头足类免疫代谢的影响奠定基础。同时，也为揭示曼氏无针乌贼等海洋头足类健康养殖提供理论指导。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种在曼氏无针乌贼脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠等 8 种组织中的都有表达，其中在TNF基因在肝脏中的表达量最高的曼氏无针乌贼TNF基因，该TNF基因在嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的感染下，基因表达量上调。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

曼氏无针乌贼TNF基因，具有SEQ ID NO:1的碱基序列。TNF基因在曼氏无针乌贼脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠等 8 种组织中的都有表达，其中，在脾脏、胰腺、腮、心脏、视叶、肝脏6种组织中的表达量较高，在脑和肠 2 种组织中的表达量较低，但是TNF基因在肝脏中的表达量最高。

优选的，TNF基因在嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的感染下，基因表达量上调。曼氏无针乌贼TNF基因对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌感染后的识别较为敏感且反应迅速。在肝脏中，TNF基因最高表达是在感染嗜水气单胞菌后24h，感染副溶血性弧菌后8h。在腮中，TNF基因最高表达是在感染嗜水气单胞菌后4h，感染副溶血性弧菌后4h。

一种曼氏无针乌贼TNF基因的检测方法，检测曼氏无针乌贼脾脏和/或胰腺和/或腮和/或心脏和/或脑和/或视叶和/或肝脏和/或肠中上述TNF基因的表达量的方法。

优选的，检测方法通过PCR扩增引物来扩增曼氏无针乌贼脾脏和/或胰腺和/或腮和/或心脏和/或脑和/或视叶和/或肝脏和/或肠中的RNA。更优选的，检测方法通过PCR扩增引物来扩增曼氏无针乌贼肝脏中的RNA。

一种表达载体，包含上述TNF基因。

一种转化体，通过用上述表达载体转化宿主细胞获得。

一种制备表达TNF的重组转化体的方法，制备上述表达载体，用表达载体转化宿主细胞。

一种TNF蛋白，由上述TNF基因所编码。

优选的，TNF蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

一种用于提高曼氏无针乌贼免疫力的药物组合物，含有包括上述TNF基因的表达载体和/或TNF蛋白。该药物组合物为曼氏无针乌贼用免疫增强剂，能够提高曼氏无针乌贼的免疫力，尤其是提高曼氏无针乌贼对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的免疫力，这是因为TNF蛋白具有显著的抑嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌活性，为曼氏无针乌贼抗嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌机理研究的研制提供基因序列和方法。本发明的技术方法也可在其它头足类上进行推广应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明曼氏无针乌贼TNF基因在曼氏无针乌贼脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠等 8 种组织中的都有表达，其中，在脾脏、胰腺、腮、心脏、视叶、肝脏6种组织中的表达量较高，在脑和肠 2 种组织中的表达量较低，但是TNF基因在肝脏中的表达量最高；本发明曼氏无针乌贼TNF基因对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌感染后的识别较为敏感且反应迅速；本发明曼氏无针乌贼TNF基因的表达载体和编码的蛋白质为曼氏无针乌贼用免疫增强剂，能够提高曼氏无针乌贼的免疫力，尤其是提高曼氏无针乌贼对嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的免疫力。

可用于筛选/检测曼氏无针乌贼抗哈维弧菌个体，尤其可以应用于曼氏无针乌贼亲鱼抗哈维弧菌力的检测和/或抗哈维弧菌良种的选育；本发明曼氏无针乌贼TNF基因编码的曼氏无针乌贼清道夫受体蛋白的重组表达蛋白具有显著的抑哈维弧菌活性，为曼氏无针乌贼抗哈维弧菌机理研究和抗哈维弧菌饲料添加剂的研制提供基因序列和方法。本发明的技术方法也可在其它鱼类上进行推广应用。

本发明采用了上述技术方案提供一种曼氏无针乌贼TNF基因及其用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是本发明实施例1中曼氏无针乌贼TNF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列；

图2是本发明实施例1中曼氏无针乌贼TNF基因的系统进化树；

图3是本发明实施例2中曼氏无针乌贼TNF基因的组织特异性分布表达；

图4是本发明实施例3中曼氏无针乌贼TNF基因在不同发育阶段中的表达；

图5是本发明实施例4中曼氏无针乌贼TNF基因在嗜水气单胞菌感染后各组织中的表达；

图6是本发明实施例4中曼氏无针乌贼TNF基因在副溶血弧菌染后各组织中的表达；

图7是本发明实施例5中曼氏无针乌贼TNF基因分布在嗜水气单胞菌和副溶血弧菌感染后各组织中的表达；

图8是本发明实施例6中曼氏无针乌贼TNF基因的亚细胞定位；

图9是本发明实施例3中曼氏无针乌贼TNF基因的Western Blot；

图10是本发明实施例3中曼氏无针乌贼TNF基因的ELISA。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

实施例1：

曼氏无针乌贼TNF基因完整ORF通过如下方法获得：

S1：将收集得到的脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠等 8 种组织样品分别进行总RNA提取；

（1）取30 mg的组织样品于1.5mL的离心管中；

（2）在离心管中加入200μL Trizol Regent；

（3）用电研磨棒进行快速充分研磨后加入800μL Trizol Regent；

（4）用移液枪反复吹吸沉淀，使其重悬，室温放置5min；

（5）加入200μL氯仿，盖紧离心管，用手震荡剧烈混匀15s，室温放置10min；

（6）在4℃环境下，12000×g离心15min，使溶液分为上、中、下三层；

（7）小心吸取上层水相溶液至另一离心管中，加入500μL异丙醇，轻轻混匀；

（8）将混合后的溶液置于-20℃环境下30 min；

（9）在4℃环境下，12000×g离心10min；

（10）弃去溶液，加入750μL 4℃预冷的75%乙醇进行洗涤；

（11）在4℃环境下，12000×g离心10 min；

（12）重复步骤10和11；

（13）弃溶液后短暂离心，吸尽残余液体，置室温中数分钟，彻底晾干；

（14）向上述RNA沉淀中加入30μL RNase free dd H₂O，轻微混匀使其溶解；

（15）将获得的总RNA以1.5%非变形琼脂糖凝胶电泳检测，并检测其浓度及A260/A280值，符合要求，可以进行后续实验。

S2：对S1提取的RNA 进行反转录，获得相应的cDNA第一条链的合成；

反转反应体系为：5.0μL模板RNA、1.0μL Oligo(dT)，混匀离心后置于PCR仪上，扩增条件为70℃ 10min后0℃ 10min，取出短暂离心后，按下述体系加入：

模板/引物混合液（上步产物）	6.0μL
		5×M-MLV buffer	2.0μL
dNTP Mixture（10mM）	0.5μL
		RNase Inhibitor（40μ/μL）	0.25μL
RaTase M-MLV（200μ/μL）	0.25μL
		RNase free ddH<sub>2</sub>O	1.0μL

混匀离心后置于PCR仪上40℃ 1h、70℃ 15min、0℃ 5min，即可获得cDNA第一链，同时反转3份，完成后置于-80℃超低温冰箱保存。

S3：以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增曼氏无针乌贼TNF基因，纯化；

根据曼氏无针乌贼基因组数据库，通过Primer 5.0软件设计扩增完整清道夫受体家族基因ORF的引物（TNF-F：5'-ACGCTCGCTGCTACTCGTATGT-3'；TNF-R：5'-GTAACATAGACAGGTGGCTATAG-3'），以cDNA为模板，扩增TNF基因，20 μL扩增反应体系如下：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTPs	0.4μL
TNF-F	0.8μL
		TNF-R	0.8μL
Template cDNA	0.6μL
		Taq DNA polymerase（TaKaRa）	0.4μL
RNase free dd H<sub>2</sub>O	14.5μL

混匀离心后置于PCR仪上，扩增条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸2 min，循环35次；最后72℃延伸10min。反应完成后PCR产物通过1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，以DL2000 DNA marker作为标准的分子量标记，经PCR反应获得的DNA溶液用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，具体步骤如下：

（1）柱平衡：向吸附柱CA2（吸附柱放入收集管中）中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称取重量；

（3）向胶中加入3倍体积（0.1g视为100μL）溶胶液PN，50℃水浴放置约10 min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

（4）将上步所得溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min。超过800μL可分次加入，倒去收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

（5）加入600μL漂白液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

（6）重复步骤5；

（7）将吸附柱放回管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

（8）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min

（9）12000rpm离心2min，收集DNA溶液，置于-20℃低温冰箱保存；

（10）纯化完成后PCR产物通过1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，以DL2000 DNAmarker作为标准的分子量标记，应与纯化前产物的分子量相当。

S4：将S3纯化后产物进行T-A克隆，检测PCR产物，将含有合适片段大小的重组子进行DNA序列测序；

首先利用连接反应试剂盒TaKaRa pMD18-T Vector（TaKaRa，Japan）进行重组载体的构建，连接体系（总体积10μL）为：

Solution I	5.0μL
		PCR产物	4.2μL
TaKaRa pMD18-T Vector	0.8μL

在冰上按体系中顺序逐一加入各物质，轻轻混匀后16℃连接过夜，连接完成后进行热激转化，具体步骤为：

（1）取感受态细胞DH5α，冰下融解5min，其间将100μL的枪头在冰箱里冰冻（-20℃）预冷，最后将100μL DH5α加入10μL连接产物中；

（2）打开水浴锅，42℃热激90s，然后迅速置于冰上静置3min；

（3）将PCR管中的液体（连接产物+DH5α）加入不含氨苄青霉素（Amp^-）的LB液体培养基中，然后在37℃以180rpm振荡培养1-2h；

（4）在培养过程中，将40μL（20mg/ml）X-Gal和7μL（200mg/ml）IPTG均匀涂布在Amp⁺LB固体平板上，使其充分吸收；

（5）震荡培养结束后，将菌液以4000rpm离心5min，去除大部分上清液，吸取130μL菌液于步骤4准备好的Amp⁺ LB固体平板上，均匀涂布，并标记；

（6）置于37℃培养过夜。（以上所有操作在超净工作台中进行）

将平板放于37℃恒温培养箱中培养过夜后即可出现菌落，培养后的平板再置于4℃下1h，用无菌牙签在每个平板中挑取白色单菌落（具体数量根据平板上实际菌落确定），置于装有800μL Amp⁺的LB液体培养基的EP管中，编号，然后在37℃摇床以180rpm振荡培养约6h。以18T质粒载体通用引物M13R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'和M13F：5'-AGCGGATAACAATTTCA CACAGGA-3'作为PCR反应的引物进行菌液PCR扩增，10μL反应体系为：

ExTaq（TaKaRa）	5.0μL
		菌液	1.0μL
M13F	0.3μL
		M13R	0.3μL
ddH<sub>2</sub>O	3.4μL

混匀离心后置于PCR仪上。扩增条件为95℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2 min，循环35次；最后72℃延伸7min。反应完成后以DL2000 DNA marker作为标准的分子量标记，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将含有合适片段大小的重组子进行DNA序列测序，其完整ORF包含1206个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO:1或图1（*-终止信号）所示。

利用Mega 6程序对不同物种的TNFs基因以邻位连接法，设定Bootstrap值1000，构建系统进化树（如图2），各种基因分聚一支，最终汇聚于同一树根，可能是由于它们在起源上具有相同的祖先，由同一的基因进化而来。TNF与香港巨牡蛎聚成一支，这可能与进化起源有关。

实施例2：

曼氏无针乌贼TNF基因的组织特异性分布表达

首先取了健康曼氏无针乌贼的脾脏、胰腺、腮、心脏、脑、视叶、肝脏和肠8个组织，提取总RNA，反转录合成cDNA，备用；

根据TNF基因的测序结果，设计荧光定量PCR引物（如表1），采用 qRT-PCR 法，以GAPDH基因为内参，按照SYBR Premix Ex Taq M Ⅱ使用说明，使用SYBR Green嵌合荧光法进行实时定量PCR扩增反应（qRT-PCR），分析TNF基因在各组织中的组织差异表达分布。

20 μL扩增反应体系如下：

primer-F	0.8μL
		primer-R	0.8μL
2×SYBR® Premix Ex Taq TMⅡ（Ta Ka Ra）	10μL
		cDNA sample（100 ng/μL）	0.8μL
ROX II	0.4μL
		RNase free dd H<sub>2</sub>O	7.2μL

采用两步法进行扩增：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃延伸45s，循环40次，最后72℃延伸10min。每个样品均重复３次。Ct值、扩增曲线、熔解曲线由 LightCycler480 荧光定量PCR 仪分析软件自动生成，采用2^-ΔΔCT的计量法作该基因的相对表达量，利用SPSS20.0进行显著性差异分析（ANOVA），所有数据采用X±SD表示，P<0.05认定为有显著性差异。并使用Origin 8.1软件生成柱状图，结果如图3所示。从图中我们发现虽然曼氏无针乌贼TNF基因在各个组织中广泛表达，但是又存在一定的组织特异性，在所选组织中，曼氏无针乌贼TNF基因在在脾脏、胰腺、腮、心脏、视叶、肝脏6种组织中表达量较高，脑和肠2 种组织中表达量较低，且TNF基因在肝脏中的表达量最高。

表1曼氏无针乌贼TNF基因荧光定量PCR引物序列

Primer	Sequences
		SjTNF-F	5'-TCGCACTACGCTGTCGTGACTAT-3'
SjTNF-R	5'-AGTTACAGAGCAGTGTATCAGAG-3'
		GAPDH-F	5'-ACCTCACACGACTCACGCAG-3'
GAPDH-R	5'-CATCTCGCTGACTGTACAAGC-3'

实施例3：

曼氏无针乌贼TNF基因在不同发育阶段中的表达

选取幼体期、产卵前期、产卵期曼氏无针乌贼，分别取腮、肝脏、视叶，按照实施例2方法分析TNF基因在不同发育阶段中的表达。结果如图4，可以看出，对于幼体期曼氏无针乌贼，TNF基因在肝脏中的表达量最高；对于产卵前期期曼氏无针乌贼，TNF基因在视叶中的表达量最高；对于产卵期曼氏无针乌贼，TNF基因在肝脏中的表达量最高。

实施例4：

曼氏无针乌贼TNF基因在G-的感染下的表达

选取健康曼氏无针乌贼，饥饿饲养三日，每天换新鲜海水。随后将曼氏无针乌贼随机分为2组，每组30条，至外界环境物质对样品的影响降至最小值。随机分为3组，每组设3个重复，每组40只，分别向每组乌贼皮下注射PBS重悬的嗜水气单胞菌（A.hydrophila，pH7.4，1×10⁷ cfu/mL）和副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus），剂量为0.1mL／只，对照组等体积注射PBS（pH7.4），于注射后0，2，4，8，12，24，48h后分别取3只存活个体的肝脏与鳃组织。提取样品RNA并反转录成模板cDNA，然后使用特异性引物SjTNF-F/R，以GAPDH基因为内参基因作内参基因进行qRT-PCR，测定曼氏无针乌贼TNF基因在G-刺激下的相对表达量（方法参见实施例2）。结果如图5和6，与对照组相比，在嗜水气单胞菌感染的刺激下，肝脏中SjTNF最高表达在24h，鳃中SjTNF最高表达在4h，其后随着时间的增长其表达量也在缓慢降低；在副溶血弧菌的刺激下，肝脏中SjTNF最高表达在8h，鳃中SjTNF最高表达在4h，其后随着时间的增长其表达量也在缓慢降低。

实施例5：

为了提高曼氏无针乌贼肝脏中TNF基因对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的敏感性，重悬用PBS中含有0.1-3mg/mL油茶蒲醇提物。曼氏无针乌贼体内的TNFα介导的核因子-κB（NF-κB）与胞内结合而呈非活性状态，而油茶蒲醇提物能够促进抑制性蛋白(IκB) 磷酸化，然后使NF-κB由结合态转变为游离态，激活NF-κB，激活的 NF-κB与 IκB 解离后转位入核，进而诱导TNFα的表达，从而提高曼氏无针乌贼肝脏中TNF基因对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的敏感性。曼氏无针乌贼肝脏中TNF基因在G-刺激下的相对表达量如图7，可以看出，曼氏无针乌贼肝脏中TNF基因对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的识别敏感和反应速度均好于实施例4。与对照组相比，在嗜水气单胞菌感染的刺激下，肝脏中SjTNF最高表达在12h，其后随着时间的增长其表达量也在缓慢降低；在副溶血弧菌的刺激下，肝脏中SjTNF最高表达在4h，鳃中SjTNF最高表达在4h，其后随着时间的增长其表达量也在缓慢降低。

上述油茶蒲醇提物的制备方法为：将油茶蒲粉按料液比为1:8-15加入40-50%乙醇溶液，混合均匀，在40-60℃下超声波提取10-30min，过滤，滤液减压浓缩，真空冷冻干燥，得油茶蒲醇提物。

实施例6：

曼氏无针乌贼TNF基因亚细胞定位

1.构建EGFP真核表达质粒

分析TNF基因序列和pEGFP-N1表达载体的特征，构建含双酶切位点Hind Ⅲ，EcoRI的SjTNF-EGFP-F/R的引物。以SjTNF-EGFP-F/R为引物进行PCR扩增（方法参见实施例1）。将PCR产物进行割胶回收纯化处理和TA克隆连接，并将阳性克隆送公司测序，将正确的带有酶切位点的重组质粒于-20℃冰箱保存备用。

用限制性核酸内切酶Hind III和EcoR I双酶切带有酶切位点的上述重组质粒及pEGFP-N1载体。双酶切反应体系如下：

质粒 20μL

EcoR I 5μL

Hind Ⅲ 5μL

10*K Buffer 10μL

加DD水补足50体系，于37℃水浴双酶切3h，双酶切产物割胶回收纯化。

用T4DNA连接酶连接粘性末端的目的基因与载体的反应体系：

双酶切后pET-28a（+） 2μL

粘性末端目的片段 5μL

T4 DNA Ligase (350 U/μl) 1μL

10 × T4 DNA Ligase Buffer 2μL

16°C过夜，连接具体操作详见T4连接酶（TaKara）说明书。

将反应液进行转化涂板，蓝白斑筛选，挑取白色的单菌落，菌液扩繁后以通用引物PCR验证及测序确认目的基因序列的正确性，再将含有正确SjTNF-EGFP质粒的菌液扩繁，使用去内毒素质粒提取试剂盒中提质粒，-20℃冰箱保存备用。

2.细胞培养与转染

实验选用HEK293细胞，生长于在5%CO₂、37℃、湿度恒定的培养箱中，细胞培养基为DMEM高糖完全培养基。细胞长到一定（约80%）密度后，将HEK293细胞接种于6孔板中，过夜后转染。将2μgSjTNF-EGFP质粒、100μl opti-MEM、4μl X-treme均匀的混离心管中，室温放置15 min。将混合液轻柔的加入六孔板中，前后摇晃混匀，培养48h后进行以下相关实验检测。

3.染膜和染核

瞬时转染SjTNF-EGFP质粒的细胞培养48h后，HEK293细胞用胰酶消化，于含盖玻片（多聚赖氨酸处理）12孔板中爬片，培养过夜。

除去DMEM高糖完全培养基，加无血清培养基饥饿细胞2h

DiI溶液孵育30min后，用冰PBS缓冲液充分洗涤2次

用4%多聚甲醛室温暗盒固定15 min后，用PBS缓冲液充分洗涤2次

DAPI室温避光染色10 min，PBS缓冲液充分洗涤两次

取盖玻片倒置在滴有约5μl抗荧光淬灭封片液的载玻片上，封片保存以备观察细胞荧光分布情况。

4.激光共聚焦

细胞荧光观察使用Leica TCS SP5II共聚焦显微镜，在油镜63×1.4倍数下的HCXPLAPO激发光（蓝、红、绿）扫描。

以绿色荧光pEGFP-N1表达载体构建出SjTNF-EGFP的融合蛋白表达在HEK293细胞，通过DiI染膜和DAPI染核后，用激光共聚焦显微镜所观察的荧光分布状况，结果如图8，可知绿色荧光主要定位在细胞质上，表明SjTNF-EGFP的融合蛋白表达在细胞质上，即验证了SjTNF与家族一样属于膜受体。

实施例7：

曼氏无针乌贼TNF基因Western Blot和ELISA

1. 曼氏无针乌贼TNF基因Western Blot

转染质粒SjTNF-EGFP24 h后，HEK293细胞接种于24孔板内，待细胞贴壁生长完全后饥饿2h，再以LPS（0.5,1和2ng/ml）分别刺激5min。

总蛋白的提取：样品总蛋白含量用Bradford法进行量化，等比例使用RIPA LysisBuffer提取细胞总蛋白，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸变性备用。

核蛋白的提取：核蛋白使用通用核提取试剂盒提取，具体实验操作详见solarbio说明说书。加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸变性备用。

SDS-PAGE电泳：取每个样品的20μg通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

转膜及封闭：根据Marker的位置，将目的片段区域的凝胶切下并转移至PVDF膜，在转膜缓冲液中（230V,1h）后，用TBST洗涤两次，加5%脱脂奶粉室温封闭1h，淡化杂带。

一抗：弃封闭液，用TBST洗涤3次后，在相应分子量大小蛋白的PVDF膜上加入1:400和1:500鼠源性单克隆IKBɑ，NF-κB，NF-κB p65和GAPDH抗体，室温孵育2h。以TBST为洗涤液，洗涤PVDF膜5次，每次10min。

二抗：加入m-IgGκ BP-HRP（1:2000），室温孵育1.5h后TBST洗涤3次，TBS洗2次，每次约5min。

信号检测：以GAPDH为为内参，在暗室使用ECL超灵敏发光液暴光于X射线胶片，以检测IKBɑ，NF-κB，NF-κB p65表达趋势，及在LPS刺激NF-κB信号通路的免疫印迹检测（如图9）。LPS作为PAMPs的一种，可被SjTNF识别并产生一系列的天然免疫反应。随着LPS的浓度升高，细胞质中NF-κB变化不明显，而入核了的pNF-κB蛋白表达量升高，这与NF-κB存在的状态受信号通路中各个分子的不同调控有关。由NF-κB信号通路可知，当IκB磷酸化后可从与NF-κB结合态转变为游离态，并释放NF-κB进入细胞核内并诱导转录使其基因表达，促进细胞因子IL-6、TNFα等的转录表达与释放。由于HEK293细胞不能单独完成NF-κB信号通路的激活，因此，我们可以认为当LPS刺激SjTNF可激活NF-κB信号通路。

2. 曼氏无针乌贼TNF基因ELISA

转染质粒SjTNF-EGFP 24 h后，HEK293细胞接种在24孔板内，待细胞贴壁生长完全后饥饿2h，再以LPS（0.5,1和2ng/ml）分别刺激24h，取细胞上清液，低速离心去除颗粒物，收集样本使用ELISA试剂盒测定IL-6细胞因子的浓度。

将微孔板平衡至室温，并按要求准备试剂与标准品；将样本及不同浓度的标准品（100μL）加至相应孔中，室温孵育2h；洗板：弃孔内液体，加洗涤液400μL，然后去除洗涤液，重复操作4次；加200μL酶标检测抗体至微孔，室温孵育2h；洗板；加200μL显色底物，室温避光孵育20min；加50μL终止液，轻拍微孔混匀；使用酶标仪测量450nm的吸光值，设定540nm为校正波长（加终止液30min内完成测定）。计算结果：样品及标准品均取OD450/540nm的平均值，减去标准曲线0处的OD值。实验重复3次。结果如图10，可以看出：LPS和TNFα的刺激可促使IL-6细胞因子合成和释放，进一步说明曼氏无针乌贼TNF基因可激活MyD88/NF-κB信号通路。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<120> 曼氏无针乌贼TNF基因及其用途

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)

<400> 1

tctggccggg ggaggcgtgt gaggggccgc ggggggggac tctctcggtt tccggagagt 60

gggtgtagaa cgcttgagcc agcaaactca cccgtacgac aaaacgaagg gtctcgcgag 120

taaaaaccgc tgcacgtcgc acgacagaaa cgaattcgga acaggaatga tgtctgatct 180

accagactcc ggaaagacct taattccaga taacattgtt ccaaatgtcg actccaaatc 240

cgaccagcaa tcgctcttga tggaagaatt agctcgttta aaacgatgga tatatgcact 300

ggcctgtgtg gtcggcatcg gcacggtcat tttaatcata gttatatctg ttttatacgg 360

aaacctaagt taccaattgg agcaccattc ccatgcccct aaggtggggg aacagatatc 420

taaaatgctg aaccgagaaa acgaggaatt gtgtgtaacc tgtgacagcc tccgactcgg 480

tcctagcatc gaagaggaca agttactgga caagtttaca cgaaaggatg acccggaagg 540

cgaacaatgc tgcgtggaga gccccaaaca attactatct atgttaaatt tgtttatcga 600

gaggagatat cgtgaagaaa tggcaaaagg gaatatcaaa ctatcaaatg aggaagattc 660

catcgacaaa gaatattcac cagctgctca tctcatggga aatgtagaga aagacatgca 720

agctacagtg cccggcaagc aattactaat cagcaagtgg atttacaatg cagaccttgg 780

atttacccaa aaggttggtt atcgtcacgg tcgattagtc attccttcta ctggactcta 840

tttcatctac agccaggtgt ctttcttaga aatgctcgac ctcgccaatc agggcgagag 900

taagcagcag tcgactgctt cgtcgagcct ctcccattat ctctaccgat ataacatcat 960

ctatccgcgc ggaggcgagg agacgctcat acaaaactct atcaccaagt gctggggaca 1020

caagaaagca ttcggggaat acactagtta tctgggggca gttttcaagt tgcggcaagg 1080

tgacgaaata tttgtgaagg tttcaaacct gacattgtta accaaagatc acaaatcaaa 1140

ttattttgga atgtttaaaa taaactgaaa atgcgaagga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaa 1206

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)

<400> 2

Met Ser Asp Leu Pro Asp Ser Gly Lys Thr Leu Ile Pro Asp Asn Ile

1 5 10 15

Val Pro Asn Val Asp Ser Lys Ser Asp Gln Gln Ser Leu Leu Met Glu

20 25 30

Glu Leu Ala Arg Leu Lys Arg Trp Ile Tyr Ala Leu Ala Cys Val Val

35 40 45

Gly Ile Gly Thr Val Ile Leu Ile Ile Val Ile Ser Val Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Leu Ser Tyr Gln Leu Glu His His Ser Asx Ala Pro Lys Val Gly

65 70 75 80

Glu Gln Ile Ser Lys Met Leu Asn Arg Glu Asn Glu Glu Leu Cys Val

85 90 95

Thr Cys Asp Ser Leu Arg Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Lys Leu

100 105 110

Leu Asp Lys Phe Thr Arg Lys Asp Asp Pro Glu Gly Glu Gln Cys Cys

115 120 125

Val Glu Ser Pro Lys Gln Leu Leu Ser Met Leu Asn Leu Phe Ile Glu

130 135 140

Arg Arg Tyr Arg Glu Glu Met Ala Lys Gly Asn Ile Lys Leu Ser Asn

145 150 155 160

Glu Glu Asp Ser Ile Asp Lys Glu Tyr Ser Pro Ala Ala His Leu Met

165 170 175

Gly Asn Val Glu Lys Asp Met Gln Ala Thr Val Pro Gly Lys Gln Leu

180 185 190

Leu Ile Ser Lys Trp Ile Tyr Asn Ala Asp Leu Gly Phe Thr Gln Lys

195 200 205

Val Gly Tyr Arg His Gly Arg Leu Val Ile Pro Ser Thr Gly Leu Tyr

210 215 220

Phe Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Leu Glu Met Leu Asp Leu Ala Asn

225 230 235 240

Gln Gly Glu Ser Lys Gln Gln Ser Thr Ala Ser Ser Ser Leu Ser His

245 250 255

Tyr Leu Tyr Arg Tyr Asn Ile Ile Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Glu Thr

260 265 270

Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Lys Cys Trp Gly His Lys Lys Ala Phe

275 280 285

Gly Glu Tyr Thr Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Lys Leu Arg Gln Gly

290 295 300

Asp Glu Ile Phe Val Lys Val Ser Asn Leu Thr Leu Leu Thr Lys Asp

305 310 315 320

His Lys Ser Asn Tyr Phe Gly Met Phe Lys Ile Asn

325 330

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgctcgctg ctactcgtat gt 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaacataga caggtggcta tag 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgcactacg ctgtcgtgac tat 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agttacagag cagtgtatca gag 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acctcacacg actcacgcag 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catctcgctg actgtacaag c 21

Claims

1.曼氏无针乌贼TNF基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼TNF基因，其特征在于：所述的TNF基因在嗜水气单胞菌或副溶血性弧菌的感染下，基因表达量上调。

3.一种曼氏无针乌贼TNF基因的检测方法，其特征在于：检测曼氏无针乌贼脾脏和/或胰腺和/或腮和/或心脏和/或脑和/或视叶和/或肝脏和/或肠中权利要求1或2所述的基因的表达量的方法。

4.根据权利要求3所述的一种曼氏无针乌贼TNF基因的检测方法，其特征在于：所述检测方法通过检测曼氏无针乌贼脾脏和/或胰腺和/或腮和/或心脏和/或脑和/或视叶和/或肝脏和/或肠中的RNA。

5.一种表达载体，其特征在于：包含根据权利要求1或2所述的TNF基因。

6.一种转化体，其特征在于：通过用根据权利要求5所述的表达载体转化宿主细胞获得。

7.一种制备表达TNF的重组转化体的方法，其特征在于：制备权利要求5所述的表达载体，用所述的表达载体转化宿主细胞。

8.一种TNF蛋白，其特征在于：由根据权利要求1或2所述的TNF基因所编码。

9.根据权利要求8所述的一种TNF蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。