CN102816815A - 重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

一种重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法，其特征在于包括如下步骤①种子培养；②发酵罐培养；③发酵液中重组抗菌肽rCrustinI纯化制备。与现有技术相比，本发明的优点在于：整个生产工艺操作简单，成本较低，得到重组抗菌肽rCrustinI可用于制作饲料添加剂、化妆品、保鲜剂和医药产品，具有广泛用途和良好的经济效益。

Description

重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法

技术领域

本发明涉及一种重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法，属于生物技术领域。

背景技术

中国是全球最大的水产养殖大国，水产品总产量(捕捞+养殖)占全球35％，其中水产品养殖产量约占全球的70％，2005年水产品产量达5181万吨。其中海水产品2854万吨，占总产量的55％，捕捞约1022万吨，人工养殖产品约1888万吨。随着全球对水产品的消费逐年增加，国内消费增长势头迅猛，另一方面全球海洋捕捞资源衰退，供给逐步转向以养殖水产品为主，中国水产养殖业在全球消费中越来越重要。人工养殖比例逐年提高，1978年人工养殖比例占26％，2005年人工养殖比例达61％。随着水产养殖业的蓬勃发展，由于高密度养殖、养殖水域富营养化、生态环境恶化等原因使得水产养殖品种频频发生各种疾病，经济损失严重，已成为21世纪水产养殖业发展的重要制约因素。据初步统计，目前危害水产养殖生物的病害已达400～500种，大多数病害是由病毒、细菌、真菌等微生物所引起的。而传统的抗微生物药物及饲料添加剂——抗生素，由于耐药性病原菌的形成，以及食品安全性等公共卫生上问题的提出，目前在世界各国养殖业中的使用都受到严格限制，如欧盟自2006年1月1日起，全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂，因此寻找安全的抗生素替代物、开发安全高效的新型抗微生物免疫增强剂或能增强养殖品种机体免疫力的饲料添加剂成为研究的热点，也是我国养殖业、饲料行业健康、持续发展首要解决的课题之一。

近年来，随着对养殖动物的自身免疫机制的深入研究，发现动物体液中富含多种体液免疫因子如凝集素、防御素、抗菌肽及多种行使调控作用的蛋白因子等。养殖品种自身来源的体液免疫因子由于其特殊的作用机制，不存在食品安全问题与环境问题，并对养殖品种具有促生长、增强免疫力的功能，还可通过基因工程技术大量发酵生产，不存在药源问题，成为替代传统抗生素作为绿色饲料添加剂及抗感染药剂的理想选择，是当前饲料添加剂领域的研究热点。

抗菌肽Crustins最早由Relf等在青蟹(Carcinus maenas)中分离鉴定，后续研究表明Crustins普遍存在于甲壳类(蟹、对虾、龙虾、螯虾等)中，主要由甲壳类血淋巴细胞合成，分子量7～14kDa，等电点pI 7.0～8.7。现有研究表明Crustins一般均有较好的抗菌活性。例如Relf等报道滨蟹Carcinin对龙虾致病菌A.viridans var homari、两株海洋菌Planococcus spp.和一株耐盐菌M.luteus均具有抗菌活性；Supungul P等(2008)报道重组斑节对虾Crustin(D766060)对S.aureus、S.iniae有很强的抑菌活性而对A.viridans、M.luteus无效，但重组斑节对虾II型Crustins(EF654658)对G⁺菌和G-菌均有很强的抗菌活性，包括A.viridans var homari以及另两种致病G-菌E.coli 363、V.harveyi；Haug等(2006)报道蜘蛛蟹Crustins对谷氨酸棒杆菌C.glutamicum的半致死浓度为3mM；Zhang(2007)等报道中国对虾重组Crustins对S.aureus、M.luteus及三种Bacillus的半致死浓度为2～8mM。

在前期研究中，我们从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞克隆了一个I型Crustin基因，并构建了真核表达载体pVT102U/α-rCrustinI，转化酿酒酵母S18菌株得到表达重组抗菌肽rCrustinI的基因工程酵母菌[见申望，叶茂，石戈，王日昕，2010，三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)I型Crustin抗菌肽的基因克隆与真核重组表达，海洋与湖沼，41(3)：371-377]，但目前还没就三疣梭子蟹I型Crustin抗菌肽基因转化酿酒酵母发酵生产重组抗菌肽rCrustinI的方法及重组抗菌肽rCrustinI纯化制备技术有公开文献出版。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种操作简单、成本经济的重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法，其特征在于包括如下步骤

①种子培养：

冻存的含重组真核表达载体pVT102U/α-crustin的酿酒酵母工程菌菌种划YSD选择培养基平板，挑取单菌落转接于YSD液体培养基中，25℃，250rpm培养24h得到一级种子，再将一级种子继续在YSD培养液中，25℃，250rpm扩大培养48h，得到二级种子；

②发酵罐培养：

按1％的接种量将二级种子液接种于发酵罐的YPD培养液中，初始发酵参数：搅拌转速300rpm，通气量为1V/V·min，罐压0.05MPa，温度25℃，pH 6.5，通过调节搅拌速度、通气量及罐压，使发酵过程中DO值维持在20～35％，培养3天，收集发酵液；

③发酵液中重组抗菌肽rCrustinI纯化制备：

发酵液离心后收集上清液，30％饱和度硫酸铵室温静置30min，再次离心，沉淀得rCrustinI粗品。

作为优选，步骤③中第一次离心速率为4000rpm，离心时间为10min，再次离心速率为10000rpm，离心时间为10min。

进一步，步骤③还包括：得到的rCrustinI粗品先经724弱酸性阳离子树脂层析富集，再经C18反向高效液相层析得重组抗菌肽rCrustinI纯品。

进一步，所述的724弱酸性阳离子树脂层析富集如下：

724弱酸性阳离子树脂的预处理：(1)先用清水浸泡并用浮选法除去细小颗粒，漂洗干净，滤干；(2)重量百分比为80％～90％工业乙醇浸泡24h，洗去树脂内的醇溶性有机物，滤干；(3)40～45℃的水浸泡2h，洗涤，洗去树脂内的水溶性杂质和乙醇，滤干；(4)用4倍树脂量的2mol/L盐酸溶液浸泡2h，搅拌，洗去酸溶性杂质，水洗至中性，滤干；(5)用4倍树脂量的2mol/L氢氧化钠溶液浸泡2h，搅拌，洗去碱溶性杂质；(6)用4倍树脂量的0.02mol/L pH 6.5PBS缓冲液浸泡24h平衡树脂，滤干待用；

724弱酸性阳离子树脂层析富集rCrustinI：(1)吸附：将经过预处理的724弱酸性阳离子树脂加入rCrustinI粗品PBS溶液中，树脂加入量为低于液面，完全被溶液浸泡，搅拌，4℃过夜吸附，抽滤，PBS缓冲液洗涤2次；(2)装柱：在滤干的树脂中加入1倍体积的PBS缓冲液，边搅拌边倒入层析柱内，让树脂自然沉降；(3)淋洗：0.02mol/LpH 6.5PBS缓冲液充分淋洗柱内树脂，并使检测仪基线平稳，彻底除去不被吸附的杂质；(4)洗脱：先以含0.1M NaCl的PBS缓冲液洗脱杂质，再以含0.5M NaCl的PBS洗脱进行洗脱，收集洗脱峰；(5)冻干：将洗脱峰冻干，冻干后的样品重溶于蒸馏水中。

进一步，所述的C18反向高效液相层析如下：

GraceSmart RP 18色谱柱按照柱子所标示方向将色谱柱与色谱仪连接，用含5％乙腈的去离子水冲洗色谱柱30min至压力平衡，将重组抗菌肽rCrustinI溶液上样，5％-95％乙腈梯度洗脱，收集洗脱峰，冻干、水溶，保留有抑菌活性峰样品。

抗菌谱的测定与最小抑菌浓度的测定：

本发明从酿酒酵母工程菌发酵液中纯化出有抑菌活性的重组抗菌肽rCrustinI。抗菌谱测定采用琼脂孔穴扩散法，受试菌种有3种革兰氏阳性菌(G⁺)：藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌；6种革兰氏阴性菌(G^-)：大肠杆菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、哈维式弧菌、溶藻弧菌、绿脓杆菌。重组抗菌肽rCrustinI抑菌实验表明：rCrustinI对受试的3种G⁺菌均有抑菌活性；在G^-菌中，对副溶血弧菌、哈维式弧菌、鳗弧菌有抑菌活性，而对绿脓杆菌、大肠杆菌、溶藻弧菌则未检测到抑菌活性。结论：重组抗菌肽rCrustinI具有广谱抗菌活性。

采用液体生长抑制实验测定rCrustinI对以上6种敏感菌最小抑菌浓度。结果表明重组rCrustinI对枯草芽孢杆菌活性最强，最小抑菌浓度(MIC)为0.36uM，对其它5种菌：藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、哈维式弧菌、鳗弧菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.74uM、0.74uM、1.48uM、2.96uM、2.96uM。

与现有技术相比，本发明的优点在于：整个生产工艺操作简单，成本较低，得到重组抗菌肽rCrustinI可用于制作饲料添加剂、化妆品、保鲜剂和医药产品，具有广泛用途和良好的经济效益。

附图说明

图1为重组抗菌肽rCrustinI非还原性SDS-PAGE电泳。

图2为重组抗菌肽rCrustinI对藤黄微球菌的抑制活性试验。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1.工程菌发酵培养：

1.1 种子培养：

将保存的含重组真核表达载体pVT102U/α-crustin的酿酒酵母工程菌菌种划YSD选择培养基(YSD培养基：Yeast Nitrogen Base 6.7g，Glucose 20g，Leucine 200mg，Adenine100mg，Inositol 200mg，溶解于1L ddH₂O中，NaOH调pH值为6.5)平板，25℃恒温培养72h，挑取单克隆菌落转接于5mlYSD液体培养基中，25℃，250rpm培养24h，制成一级种子。再将一级种子接种于1LYSD培养液中，25℃，250rpm培养48h，每隔1h取样检测A600值，并绘制生长曲线，以对数生长期的中后期作为二级种子的培养时间。

1.2 发酵罐培养

按1％的接种量将二级种子液接种于灭菌的盛有5L YPD发酵培养液(YPD液体培养基：Yeast extract 10g，Peptone 20g，Glucose 20g，溶解于1L ddH₂O中，NaOH调pH值为6.5)的10L发酵罐中，设定初始发酵参数：搅拌转速为300rpm，通气量为1(V/V·min)，罐压为0.05MPa，温度为25℃，控制恒定pH6.5，通过调节搅拌速度、通气量及罐压使DO值维持在20～35％，培养3天，基因工程酵母表达重组抗菌肽rCrustinI并将rCrustinI分泌到发酵液中。在发酵过程中，每隔6h取少量发酵液上清液，采用琼脂孔穴扩散法，以藤黄微球菌为指示菌，监测发酵液中rCrustinI的表达量。

2.发酵液中重组抗菌肽rCrustinI纯化

2.1 硫酸铵沉淀

发酵液4000rpm离心10min收集上清液，在上清液中加入固体硫酸铵粉末至30％饱和度，搅拌、室温静置30min，10000rpm离心10min收集沉淀，该沉淀为rCrustinI粗品。30％硫酸铵饱和度对发酵液中rCrustinI的沉淀效率经检验可达100％，rCrustinI粗品重溶于0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。

2.2 724弱酸性阳离子树脂层析富集rCrustinI

724弱酸性阳离子树脂的预处理：(1)先用清水浸泡并用浮选法除去细小颗粒，漂洗干净，滤干；(2)工业乙醇(80％～90％)浸泡24h，洗去树脂内的醇溶性有机物，滤干；(3)热水(40～45℃)浸泡2h，洗涤数次，洗去树脂内的水溶性杂质和乙醇，滤干；(4)用4倍树脂量的2mol/L盐酸溶液浸泡2h，不时搅拌，洗去酸溶性杂质，水洗至中性，滤干；(5)用4倍树脂量的2mol/L氢氧化钠溶液，同上处理，洗去碱溶性杂质；(6)用4倍树脂量的0.02mol/L pH 6.5PBS缓冲液浸泡24h平衡树脂，滤干即可使用。

弱酸性阳离子树脂层析富集rCrustinI：(1)吸附：将经过预处理的724弱酸性阳离子树脂加入2.1的rCrustinI粗品PBS溶液中，树脂加入量为稍低于液面，完全被溶液浸泡为宜，搅拌，4℃过夜吸附，抽滤，少量PBS缓冲液洗涤2次，合并滤液经2.1回收未吸附的rCrustinI，减低损耗；(2)装柱：在滤干的树脂中加入1倍体积的PBS缓冲液，边搅拌边倒入层析柱内，让树脂自然沉降；(3)淋洗：0.02mol/L pH 6.5PBS缓冲液充分淋洗柱内树脂，并使检测仪基线平稳，彻底除去不被吸附的杂质；(4)洗脱：先以含0.1M NaCl的PBS缓冲液洗脱杂质，再以含0.5M NaCl的PBS洗脱进行洗脱，收集洗脱峰；(5)冻干：将洗脱峰冻干，冻干后的样品重溶于蒸馏水中；(6)活性监测：以藤黄微球菌为指示菌检测洗脱峰的抑菌活性。

2.3 C18反相层析纯化重组抗菌肽rCrustinI

色谱柱的预处理：GraceSmart RP 18色谱柱按照柱子所标示方向将其与色谱仪连接，用含5％乙腈的去离子水冲洗色谱柱30min至压力平衡，将2.2富集的重组抗菌肽rCrustinI溶液上样，5％-95％乙腈梯度洗脱，收集洗脱峰，冻干、水溶，以藤黄微球菌为指示菌检测每个洗脱峰的抑菌活性，保留有抑菌活性峰样品。有抑菌活性峰经12.5％的SDS-PAGE非还原电泳检测结果见附图1，为单一条带。

3.发酵液中rCrustinI含量与纯化效率的计算

在rCrustinI纯化过程中，30％饱和度硫酸铵沉淀与C18反相层析2步没有检测到抗菌活性成份丢失，而724弱酸性阳离子树脂层析富集rCrustinI过程中有rCrustinI吸附不完全现象，故发酵液中rCrustinI含量的推算以30％饱和度硫酸铵沉淀后直接C18反相层析纯化的rCrustinI量为准；纯化效率则以经30％饱和度硫酸铵沉淀、724弱酸性阳离子树脂富集、C18反相层析纯化出rCrustinI量除以发酵液中rCrustinI总量计算。蛋白质溶液浓度的测定使用Bradford法，最终推算出发酵液中rCrustinI含量为1.087mg/L，纯化效率为92％。

4.抗菌谱的测定与最小抑菌浓度的测定

4.1 抗菌谱测定采用琼脂孔穴扩散法：将待测菌悬液20ul加入到15ml 45℃左右的固体LB培养基中，混匀，倒平板，凝固后在平板上打直径为6mm的小孔，加入待测的重组表达产物样品液4℃放置2h，37℃培养过夜(见图2所示)。

4.2 最小抑菌浓度测定：

采用液体生长抑制实验测定最小抑菌浓度。将重组抗菌肽rCrustinI纯品用无菌水进行连续倍比稀释，然后各浓度稀释后的rCrustinI样品取20uL置于96孔板中，加入到150uL培养基，再加入20uL对数生长期的受试菌液，混匀。对照组设2组，空白对照组：150uL的培养基+20uL rCrustinI+20uL水；阳性对照组：150uL的培养基+20uL菌液+20uL水。菌液37℃150rpm培养12h，自动酶标仪测定OD600，与空白对照组比较，以含rCrustinI最高稀释倍数培养孔中不生长细菌者为最小抑菌浓度(MIC)。以上实验重复三次，计算重组抗菌肽rCrustinI对应敏感菌的MIC。

rCrustinI酵母重组表达工程菌的制备

1.提取三疣梭子蟹血细胞总RNA

健康三疣梭子蟹断肢采血10ml，加入10ml抗凝剂(抗凝剂：NaCl 8.2g，葡萄糖19.8g，柠檬酸6.3g，柠檬酸钠7.6g，EDTA 3.7g，加蒸留水定容至1L，pH 7.4，121℃灭菌15min)，3000rpm离心5min，弃上清，用marine saline洗涤沉淀一次(marine saline：NaCl 33.9g，CaCl₂ 2.95g，KCl 0.90g，Na₂HPO₄ 0.2g，Tris-碱6.05g，加水定容至1L，pH7.4，121℃灭菌15min)，加入0.5ml Trizol，按上海生工Trizol试剂盒操作说明提取三疣梭子蟹总RNA，提取的总RNA用1％琼脂糖电泳检测。

2.克隆三疣梭子蟹I型Crustin成熟肽cDNA

带接头的RT-PCR引物：上游引物Xba I crustin：5’-GCTCTAGACAAAAGATCCCTAGTACTTCCATACCCAG-3’；下游引物HindIIIcrustin：5’-CGAAGCTTAAAATCATTAGTAGAAATCAGGAGTCTTGC-3’。RT-PCR实验步骤按上海捷瑞生物技术公司AMV一步法RT-PCR试剂盒操作说明进行：40℃合成cDNA 30min，94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物，目的片段割胶回收。

3.构建分泌型重组表达载体pVT102U/α-crustinI

割胶回收的目的基因和分泌型表达载体质粒pVT102U/α分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切，割胶回收酶切片段。T₄ DNA Ligase连接酶切后的载体和目的基因，连接产物70％乙醇沉淀后干燥，重溶于无菌去离子水，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑转化成功单克隆，过夜培养后提取质粒。DNA测序检验重组表达载体pVT102U/α-crustinI插入序列的正确性，测序引物位于pVT102U/α载体多克隆位点上游MFαL区，Pvt102F1：5’-TAAATACTACTATTGCCAGC-3’。

4.制备分泌表达重组抗菌肽rCrustinI的酵母工程菌

制备酵母感受态细胞：划酿酒酵母S-78 YPD平板，30℃培养2-3天，挑单克隆于3mL YPD溶液中，30℃250转/min扩大培养12h，以1∶25的比例将培养液转入50mLYPD溶液中扩大培养，测OD600在0.4～0.6之间，停止培养，4000转/min离心5min收集酵母细胞，收集的酵母重悬于20mL灭菌ddH₂O中，4000转/min离心5min弃上清，酵母重悬浮于1.5mL混合溶液中(10×TE，1M LiAC，ddH₂O，以1∶1∶8的体积比混合)，此为酵母感受态细胞，备用。

重组表达载体pVT102U/α-crustinI的转化酵母感受态细胞：pVT102U/α-crustinI质粒DNA 1.0μg，carrierDNA 10μg (鲑鱼鱼精DNA)，酿酒酵母S-78感受态细胞悬液20μL，混匀，加PEG溶液(10×TE，1M LiAC，50％PEG4000，以1∶1∶8的体积比混合)1.5mL，混匀，30℃200转/min培养30min，42℃热击15min后，5000转/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用200μL 1×TE洗涤，5000转/min离心5min，弃上清，酵母细胞重悬浮于200μL 1×TE溶液中，细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天。平板上生长的菌落即为重组抗菌肽rCrustinI的酵母工程菌pVT102U/α。

pVT102U/α的制作方法还可参看文献，Vernet，T.D.Dignard，and D.Y.Thomas.1987.A family of yeast expression vectors containing the phage f1 intergenic region.Gene52：225-233。

Claims (5)

1.一种重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法，其特征在于包括如下步骤

①种子培养：

冻存的含重组真核表达载体pVT102U/α-crustin的酿酒酵母工程菌菌种划YSD选择培养基平板，挑取单菌落转接于YSD液体培养基中，25℃，250rpm培养24h得到一级种子，再将一级种子继续在YSD培养液中，25℃，250rpm扩大培养48h，得到二级种子；

②发酵罐培养：

按1％的接种量将二级种子液接种于发酵罐的YPD培养液中，初始发酵参数：搅拌转速300rpm，通气量为1V/V·min，罐压0.05MPa，温度25℃，pH 6.5，使发酵过程中DO值维持在20～35％，培养3天，收集发酵液；

③发酵液中重组抗菌肽rCrustinI纯化制备：

发酵液离心后收集上清液，30％饱和度硫酸铵室温静置30min，再次离心，沉淀得rCrustinI粗品。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤③中第一次离心速率为4000rpm，离心时间为10min，再次离心速率为10000rpm，离心时间为10min。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤③还包括：得到的rCrustinI粗品先经724弱酸性阳离子树脂层析富集，再经C18反向高效液相层析得重组抗菌肽rCrustinI纯品。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于所述的724弱酸性阳离子树脂层析富集如下：

724弱酸性阳离子树脂的预处理：(1)先用清水浸泡并用浮选法除去细小颗粒，漂洗干净，滤干；(2)重量百分比为80％～90％工业乙醇浸泡24h，洗去树脂内的醇溶性有机物，滤干；(3)40～45℃的水浸泡2h，洗涤，洗去树脂内的水溶性杂质和乙醇，滤干；(4)用4倍树脂量的2mol/L盐酸溶液浸泡2h，搅拌，洗去酸溶性杂质，水洗至中性，滤干；(5)用4倍树脂量的2mol/L氢氧化钠溶液浸泡2h，搅拌，洗去碱溶性杂质；(6)用4倍树脂量的0.02mol/L pH 6.5PBS缓冲液浸泡24h平衡树脂，滤干待用；

724弱酸性阳离子树脂层析富集rCrustinI：(1)吸附：将经过预处理的724弱酸性阳离子树脂加入rCrustinI粗品PBS溶液中，树脂加入量为低于液面，完全被溶液浸泡，搅拌，4℃过夜吸附，抽滤，PBS缓冲液洗涤2次；(2)装柱：在滤干的树脂中加入1倍体积的PBS缓冲液，边搅拌边倒入层析柱内，让树脂自然沉降；(3)淋洗：0.02mol/LpH 6.5PBS缓冲液充分淋洗柱内树脂，并使检测仪基线平稳，彻底除去不被吸附的杂质；(4)洗脱：先以含0.1M NaCl的PBS缓冲液洗脱杂质，再以含0.5M NaCl的PBS洗脱进行洗脱，收集洗脱峰；(5)冻干：将洗脱峰冻干，冻干后的样品重溶于蒸馏水中。

5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于所述的C18反向高效液相层析如下：

GraceSmart RP 18色谱柱按照柱子所标示方向将色谱柱与色谱仪连接，用含5％乙腈的去离子水冲洗色谱柱30min至压力平衡，将重组抗菌肽rCrustinI溶液上样，5％-95％乙腈梯度洗脱，收集洗脱峰，冻干、水溶，保留有抑菌活性峰样品。

Images