CN109021088A - 一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，公开了一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法,斑节对虾ALFpm10抗菌肽由132个氨基酸组成，分子量为15.3kDa，信号肽由27个氨基酸组成；ALFpm10抗菌肽的cDNA全长517个碱基，可由斑节对虾血细胞的总RNA中通过RT‑PCR克隆获得；ALFpm10抗菌肽可通过原核表达系统，与SUMO蛋白融合表达获得，由固相化学合成的方法获得。本发明的ALFpm10抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌等具有抑菌、杀菌作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点，显示其在水产养殖行业具有广阔的应用前景。

Description

一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法
技术领域
本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，尤其涉及一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
近年来，我国渔业中的养殖和捕捞产量都跃居到了世界的前列，渔业经济发展十分迅速，水产养殖占到了全球养殖的70％。但是，随着我国水产养殖业精养、半精养等养殖模式的发展，集约化程度的日益提高，残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，加之水源的污染和池塘自净与调节能力的降低，导致养殖水体中化学需氧量、生物耗氧量、氨氮、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生。
目前，针对集约化养殖导致养殖动物病害频发的主要防治方法是使用抗生素和化学药物，尤其是抗生素的大量使用给食品安全及出口贸易带来了巨大安全隐患，同时导致耐药病原增多、环境污染加剧、生态风险升高等一系列问题。抗生素滥用问题在水产养殖业尤其严重，我国已成为世界上滥用抗生素最严重的国家之一，2015年我国抗生素总使用量估计约18.2万吨，其中约52％用于农业、养殖业。因此，为了保障人民群众的饮食健康，提高产品品质出口创汇，增加养殖户的经济效益，急需寻找一种解决病害频发的方法，开发出绿色、环保、无害、高效的抗生素替代品，实现科学养殖、生产绿色产品。抗菌肽(Antimicmbia1peptides，AMPs)是生物体合成的一类小分子防御多肽，在抗生素替代和绿色养殖中具有重要意义，它是动物免疫防御体系在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，能提高生物非特异免疫活性，杀死入侵的微生物，具有活性高、特异性强等特点。研究表明抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，在快速杀菌的同时，不会导致脓毒症，同时具有中和内毒素、调节增加机体免疫力等特性，使其最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。
直到1988年，年Takao和Shimonishi在鲎(Tachypleus tridentatus)血细胞里首次发现海洋生物抗菌肽—鲎素(tachyplesin)。近年来在海洋鱼类中发现了更多的抗菌肽，有的抗菌肽具有极强的抗菌活性，如Nakamura等(1996)从豹鳎(Pardachirus marmoratus)体内分离到的Pardaxin具有比蜂毒素更强的抗菌活性；Silphaduang和Noga等(2001)从杂交条纹鲈(Morone saxatilis♂×M.chrysops♀)中分离出的Piscidin对多种鱼类致病菌包括多重耐药菌株格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)均有较强抑杀作用,随后人们发现该家族的抗菌肽对病毒、真菌乃至寄生虫也均有抑制作用。
综上所述，现有技术存在的问题是：
至今仍未获得能快速杀灭病毒、弧菌等高危病害菌的对虾抗菌肽。对虾属于非脊椎动物，关于它的基础研究比较薄弱，免疫机理尚不完全清楚，抗菌肽的种类及作用机理都在研究之中。虽然，对于对虾养殖技术、饲料等应用研究比较成熟，国内也形成了大规模的养殖产量，但是基础研究的欠缺导致对虾病害频繁发生且没有获得科学的理论指导，至今未获得具有高效杀菌活性且可应用于对虾病害防治的对虾抗菌肽。
解决上述技术问题的难度和意义：
对虾养殖业也是近年发展非常快，高密度养殖和水质恶化引发了大规模的虾病爆发,使海产养殖业遭受严重损失，虽然，国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作,并取得进展,但如何防治虾病仍然是对虾养殖业的难题。研究发现对虾血细胞可以产生多种抗菌肽，是对虾防御病害的第一道防线。1997年Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，其中3种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰氏阳性菌的活性，随后从中克隆得到一条虾抗菌肽，并证明该抗菌肽的主要合成部位是其血细胞。对虾的防御机制主要依赖血细胞的活动，可以通过吞噬外来物或合成抗菌物质来防御病害入侵。
因此，源于对虾的抗菌肽具有以下优势：①生物安全性好，源于对虾自身的抗菌肽不会对对虾养殖以及水体环境造成危害；②效率高，能针对性抑杀危害对虾养殖的病菌；③可抑杀源于海洋的病菌，许多海洋细菌均能耐受高盐等胁迫，导致其他来源的抗菌肽对其抑杀效果不佳。本发明通过副溶血弧菌处理斑节对虾，刺激其血细胞合成抗菌肽，通过反复筛选获得具有抗菌活性的抗菌肽cDNA，通过原核表达或化学合成技术获得抗菌肽的蛋白分子，对金黄色葡萄球菌等致病菌起到抑杀作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点，将来可应用于水产养殖病害的防治，具有重要的经济价值和发展潜力。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa，氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。(本发明抗菌肽序列与现有对虾抗菌肽只有75％的同源性)。
进一步，所述斑节对虾ALFpm10基因的cDNA序列SEQ ID NO：4共有517个碱基，1-28及427-517为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQ ID NO：2，共27个氨基酸。
进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法包括：
通过原核表达系统获得，将ALFpm10的基因序列连接到pET-28a、pCold IV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm10融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm10抗菌肽。
进一步，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法进一步包括：
通过固相化学法合成。
进一步，ALFpm10的基因获得方法包括：
斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；
根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，获得约517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。
进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，具体包括：
1)斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：
血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取；
总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×107个细胞，5000rpm离心5min，去上清；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；
2)抗菌肽cDNA序列的克隆：
根据斑节对虾ALFpm10抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，采用RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15min，获得斑节对虾的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约517bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取517bp的目的片段，采用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到T-vector上，进行基因测序，得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。
进一步，步骤1)，斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取中，
先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂(柠檬酸钠0.1M、蔗糖0.25M、0.01M Tris-HCl、pH 7.6)插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟。
进一步，抗菌肽cDNA序列的克隆后，还需进行抗菌肽基因的表达及纯化：
抗菌肽序列通过限制性内切酶NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV上，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21中；含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600＝0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm诱导6-24h；将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用含20mM Tris，pH8.0，200mM NaCl，25mM咪唑的Lysis buffe重新悬浮菌块并转移至50mL离心管中，按1g菌体加入10mL的Lysis buffer的比例；使用60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000rpm离心30min，获得的上清为总蛋白样品，含有抗菌肽；
将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用含200mMNaCl,50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Blance Buffer去除未结合的杂蛋白，然后用含200mMNaCl,60mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1的WanshingBuffer洗脱弱结合蛋白，最后用含200mMNaCl,500mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Elution Buffer洗脱并收集目的蛋白，在150mM NaCl,25mM Tris,1mM DTT,pH调至8.0-8.1的透析液中透析除盐，然后制成冻干粉，-80℃保存；
透析蛋白的冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解处理后进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽。
进一步，抗菌肽基因的表达及纯化后，还需进行抗菌活性的分析：
培养待测菌株，进行抑菌实验；菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌，在20mL培养基中培养者至对数中期；具体包括：
取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD600在02-0.3；取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾ALFpm10抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm10抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。
其中，斑节对虾抗菌肽-ALFpm10，氨基酸序列如下：
MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSAQEMEEQENHVSDIVSKIYNFLVRNGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCPGWTLVYGSAKGNSSVSSSLQDAIVNFVQKAYQEDVISEEDAKPWLQGRK，共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa；
信号肽序列SEQ ID NO：2为MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSA，共27个氨基酸。
斑节对虾抗菌肽全长cDNA序列：
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
斑节对虾ALFpm10抗菌肽由132个氨基酸组成，分子量为15.3kDa，信号肽由27个氨基酸组成；ALFpm10抗菌肽的cDNA全长517个碱基，可由斑节对虾血细胞的总RNA中通过RT-PCR克隆获得；ALFpm10抗菌肽可通过原核表达系统，与SUMO蛋白融合表达获得，也可以由固相化学合成的方法获得。本发明的ALFpm10抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌等具有抑菌、杀菌作用，与氨苄青霉素相当，显示出广阔的应用前景。ALFpm10抗菌肽在16μM即可以对金黄色葡萄球菌(52.8％)、海岸微小杆菌(68％)、藻居芽孢杆菌(79.5％)具有较高的抑菌率，且抑菌时间可达到24小时，ALFpm10-LBD甚至在2μM就可以对海岸微小杆菌产生高达84％的抑菌率。其中，海岸微小杆菌和藻居芽孢杆菌为海水细菌，与斑节对虾养殖环境相似，也预示该抗菌肽在水产养殖中具有重要的发展潜力，总的来说，ALFpm10具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的pCold IV表达载体图。
图2是本发明实施例提供的斑节对虾ALFpm10抗菌肽的表达及纯化图。
图3是本发明实施例提供的ALFpm10对金黄色葡萄球菌的抑菌实验图。
图4是本发明实施例提供的ALFpm10对藻居芽孢杆菌的抑菌实验图。
图5是本发明实施例提供的ALFpm10对海岸微小杆菌的抑菌实验图。
图6是本发明实施例提供的ALFpm10-LBD对海岸微小杆菌的抑菌实验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的从斑节对虾血细胞中克隆得到的抗菌肽ALFpm10，共含有132个氨基酸，分子量约为15.3KDa，其N-末端27个氨基酸序列为“信号肽”。
其中，抗菌肽ALFpm10，共含有132个氨基酸：
SEQ ID NO：1：
MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSAQEMEEQENHVSDIVSKIYNFLVRNGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCPGWTLVYGSAKGNSSVSSSLQDAIVNFVQKAYQEDVISEEDAKPWLQGRK
信号肽SEQ ID NO：2：
MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSA。
本发明所说的斑节对虾抗菌肽ALFpm10基因的cDNA序列有517nt，1-28及427-517为非编码区(，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA其序列如下：
SEQ ID NO：4
1
GGAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAGTCATGACGAATCAGAGAACATCATGGGCGCACTG
61
GCTGGCACTGTTCCTGTTGACGGCGACCAGCGTAAAGCTACTGTCAGCCCAGGAGATGGA
121
AGAGCAAGAAAATCACGTTTCCGATATCGTGTCCAAAATTTACAATTTTCTGGTCAGAAA
181
TGGCGAGATCGAGCTTCTGGGTCACTACTGTTCTTATTCCACGCGTCCATACTTTCTTCG
241
ATGGCAGCTGAAGTTCAAGACTAAAATCTGGTGCCCGGGCTGGACGCTTGTCTATGGCAG
301
CGCCAAGGGCAACTCCAGTGTGTCCAGTAGCTTGCAAGATGCCATCGTCAACTTCGTCCA
361
GAAAGCTTACCAAGAAGACGTCATAAGCGAGGAGGATGCCAAGCCATGGTTGCAGGGACG
421
AAAATGACTGGTTCCAAGGTCGTCCGCGCTGCAATGACTATCGCGTAGCATCTTCCATTC
作为本发明的优选实施例,斑节对虾ALFpm10抗菌肽cDNA基因的获得如下：
(1)斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；
(2)根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，
上游引物SEQ ID NO：5为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物SEQID NO：6为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，获得约517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因，在NCBI网站上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因。斑节对虾ALFpm10抗菌肽的氨基酸序列为：
SEQ ID NO：1
MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSAQEMEEQENHVSDIVSKIYNFLVRNGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCPGWTLVYGSAKGNSSVSSSLQDAIVNFVQKAYQEDVISEEDAKPWLQGRK，共132个氨基酸，分子量为15.3kDa；
(3)通过结构分析发现斑节对虾ALFpm10抗菌肽的活性结构区(ALFpm10-LBD)，采用化学合成的方法获得该肽段，通过抑菌实验证明该肽段具有抑菌活性，
(4)该肽段SEQ ID NO：3为：YCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCP-NH2
(5)斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因连接到原核表达载体pET-28a、pCold IV等质粒上，抗菌肽基因片段与SUMO蛋白融合表达，经IPTG诱导获得SUMO-ALFpm10融合蛋白；
(6)该融合蛋白含有组氨酸标签，利用镍柱通过亲和层析获得SUMO-ALFpm10融合蛋白；
(7)该融合蛋白经过SUMO蛋白酶的酶切，获得具有活性的ALFpm10抗菌肽，分子量为15.3kDa，经过质谱鉴定为完整的ALFpm10抗菌肽；
(8)ALFpm10抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌具有抑菌、杀菌作用，与氨苄青霉素(50μg/mL)相当。
下面结合具体分析对本发明作进一步描述。
本发明所涉及的原核表达载体pET-28a、pCold IV，菌株E.coli BL21(DE3)均购自通用生物系统有限公司(安徽)。
本发明所涉及的菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(市购，见遗传资源信息披露表)、海岸微小杆菌(Exiguobacterium aestuarii)(市购，见遗传资源信息披露表)、藻居芽孢杆菌(Bacillus algicola)(市购，见遗传资源信息披露表)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(市购，见遗传资源信息披露表)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(http://www.cgmcc.net/index.html)，金黄色葡萄球菌CGMCC NO为1.363、海岸微小杆菌CGMCC NO为1.6140、藻居芽孢杆菌CGMCC NO为1.15890、副溶血弧菌CGMCC NO为1.1997。
下面结合具体实施例及分析对本发明作进一步描述。
本发明实施例提供的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，包括：
1.斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：
血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂(柠檬酸钠0.1M、蔗糖0.25M、0.01M Tris-HCl、pH 7.6)，插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟(4℃)，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取。
总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Cat No./ID:74104)提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×107个细胞，5000rpm离心5min(25℃)，去上清；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min(25℃)；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min(25℃)；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min(25℃)；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min(25℃)，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱。
2.抗菌肽cDNA序列的克隆：
根据斑节对虾ALFpm10抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Cat No./ID:74104)提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,Japan)试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15min，获得斑节对虾的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约517bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取517bp的目的片段，采用胶回收试剂盒(Takara,Japan)回收目的片段，然后克隆到T-vector(Takara,Japan)上，送华大基因进行测序，得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因。
3.序列的分析与抗菌肽序列的确定：
同源性比对和相似性搜索用NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,BLAST在线软件进行，多序列比较用DNAssist2.0软件，以BLASTZ软件辅助进行序列拼接，结果显示斑节对虾ALFpm10抗菌肽的cDNA序列共有517nt，1-28及427-517为非编码区，斑节对虾抗菌肽全长cDNA序列：
信号肽预测用SIGNALP:http://www.cbs.dtu.dk/aervices/SignalP在线查找，经分析斑节对虾ALFpm10抗菌肽的氨基酸序列为：MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSAQEMEEQENHVSDIVSKIYNFLVRNGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCPGWTLVYGSAKGNSSVSSSLQDAIVNFVQKAYQEDVISEEDAKPWLQGRK，共132个氨基酸，分子量为15.3kDa，其中它的信号肽为MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSA，共27个氨基酸。
4.抗菌肽基因的表达及纯化：
抗菌肽序列通过限制性内切酶NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV(通用生物系统有限公司，安徽)上，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒(见图1)，然后转化到大肠杆菌BL21(通用生物系统有限公司，安徽)中。含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600＝0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm(16℃)诱导6-24h。将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用适量的Lysis buffer(20mM Tris，pH8.0，200mM NaCl，25mM咪唑，1g加入10mL)重新悬浮菌种并转移至50mL离心管中。使用60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，具体的条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000rpm离心30min，获得的上清即为总蛋白样品，含有抗菌肽。
将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用BlanceBuffer(200mM NaCl,50mM Tris,pH调至8.0-8.1)去除未结合的杂蛋白，然后用含60mM咪唑的Wanshing Buffer(200mMNaCl,60mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1)洗脱弱结合蛋白，最后用含500mM咪唑的Elution Buffer(200mMNaCl,500mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1)洗脱并收集目的蛋白(斑节对虾ALFpm10抗菌肽)，在透析液(150mM NaCl,25mM Tris,1mM DTT,pH调至8.0-8.1)中透析除盐，然后制成冻干粉，-80℃保存(见图2)。
透析蛋白的冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶(通用生物系统有限公司，安徽)进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解等处理后可进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽，证实为目的抗菌肽(100％比对上)，氨基酸序列为：MTNQRTSWAHWLALFLLTATSVKLLSAQEMEEQENHVSDIVSKIYNFLVRNGEIELLGHYCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCPGWTLVYGSAKGNSSVSSSLQDAIVNFVQKAYQEDVISEEDAKPWLQGRK。
5.抗菌活性的分析
培养待测菌株，分别进行抑菌实验。菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌，在20mL培养基中培养者至对数中期。
取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD600在02-0.3左右。取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾ALFpm10抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm10抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。结果显示，斑节对虾ALFpm10抗菌肽具有显著的抑菌效果，与氨苄青霉素(50μg/mL)的抑菌效果相当(见图3,4,5)。ALFpm10在16μM时对金黄色葡萄球菌的抑制率为43.6％，而氨苄青霉素(50μg/mL)的抑制率为60％；24小时后，二者的抑菌率均超过70％，表明ALFpm10可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，且持续时间超过24小时(见图3)。ALFpm10在16μM时对枯草芽孢杆菌的抑制率为53.3％，而氨苄青霉素(50μg/mL)的抑制率为44.4％,；24小时后，二者的抑菌率均分别为68％和85.2％，表明ALFpm10可以有效抑制藻居芽孢杆菌的生长，且持续时间超过24小时，在12h时的抑菌效果优于氨苄青霉素(见图4)。ALFpm10在16μM时对海岸微小杆菌的抑制率为76％，而氨苄青霉素(50μg/mL)的抑制率为86.2％；24小时后，二者的抑菌率均超过80％，表明ALFpm10可以有效抑制海岸微小杆菌的生长，且持续时间超过24小时，海岸微小杆菌为海水细菌，ALFpm10的有效抑杀对水产养殖具有重要意义(见图5)。
ALFpm10-LBD抗菌活性分析：ALFpm10-LBD为抗菌肽ALFpm10的杀菌活性结构，通过固相化学法合成该肽段，肽段序列为：YCSYSTRPYFLRWQLKFKTKIWCP-NH2，该肽段在2μM即可有效抑杀海岸微小杆菌，12h抑菌率达到82％，24h仍达到83.8％，表明ALFpm10-LBD可以有效抑杀海岸微小杆菌，该肽段仅仅24个氨基酸，合成成本低、抑菌率高，在水产养殖中具有重要的应用价值(见图6)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Asn Gln Arg Thr Ser Trp Ala His Trp Leu Ala Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Thr Ala Thr Ser Val Lys Leu Leu Ser Ala Gln Glu Met Glu Glu
20 25 30
Gln Glu Asn His Val Ser Asp Ile Val Ser Lys Ile Tyr Asn Phe Leu
35 40 45
Val Arg Asn Gly Glu Ile Glu Leu Leu Gly His Tyr Cys Ser Tyr Ser
50 55 60
Thr Arg Pro Tyr Phe Leu Arg Trp Gln Leu Lys Phe Lys Thr Lys Ile
65 70 75 80
Trp Cys Pro Gly Trp Thr Leu Val Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Asn Ser
85 90 95
Ser Val Ser Ser Ser Leu Gln Asp Ala Ile Val Asn Phe Val Gln Lys
100 105 110
Ala Tyr Gln Glu Asp Val Ile Ser Glu Glu Asp Ala Lys Pro Trp Leu
115 120 125
Gln Gly Arg Lys
130
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Asn Gln Arg Thr Ser Trp Ala His Trp Leu Ala Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Thr Ala Thr Ser Val Lys Leu Leu Ser Ala
20 25
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Cys Ser Tyr Ser Thr Arg Pro Tyr Phe Leu Arg Trp Gln Leu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Thr Lys Ile Trp Cys Pro
20
<210> 4
<211> 517
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaggctata agatttacga gtgaagtcat gacgaatcag agaacatcat gggcgcactg 60
gctggcactg ttcctgttga cggcgaccag cgtaaagcta ctgtcagccc aggagatgga 120
agagcaagaa aatcacgttt ccgatatcgt gtccaaaatt tacaattttc tggtcagaaa 180
tggcgagatc gagcttctgg gtcactactg ttcttattcc acgcgtccat actttcttcg 240
atggcagctg aagttcaaga ctaaaatctg gtgcccgggc tggacgcttg tctatggcag 300
cgccaagggc aactccagtg tgtccagtag cttgcaagat gccatcgtca acttcgtcca 360
gaaagcttac caagaagacg tcataagcga ggaggatgcc aagccatggt tgcagggacg 420
aaaatgactg gttccaaggt cgtccgcgct gcaatgacta tcgcgtagca tcttccattc 480
agagggattt atgtgcgaga tttactcttc gggttaa 517
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggctataa gatttacgag tgaag 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagagtaaat ctcgcacata aatcc 25

Claims (10)

1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa，氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾ALFpm10基因的cDNA序列SEQ ID NO：4共有517个碱基，1-28及427-517为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQ ID NO：2，共27个氨基酸。
3.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。
4.一种如权利要求1所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法包括：
通过原核表达系统获得，将ALFpm10的基因序列连接到pET-28a、pCold IV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm10融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm10抗菌肽。
5.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法进一步包括：
通过固相化学法合成。
6.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，ALFpm10的基因获得方法包括：
斑节对虾先用溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；
根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，获得约517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。
7.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，具体包括：
1)斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：
血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取；
总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×107个细胞，5000rpm离心5min，去上清；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；
2)抗菌肽cDNA序列的克隆：
根据斑节对虾ALFpm10抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，采用RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15min，获得斑节对虾的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约517bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取517bp的目的片段，采用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到T-vector上，进行基因测序，得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。
8.如权利要求7所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，步骤1)，斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取中，
先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟。
9.如权利要求7所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，抗菌肽cDNA序列克隆后，还需进行抗菌肽基因的表达及纯化：
抗菌肽序列通过限制性内切酶NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV上，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21中；含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600＝0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm诱导6-24h；将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用含20mM Tris，pH8.0，200mM NaCl，25mM咪唑的Lysis buffe重新悬浮菌块并转移至50mL离心管中，按1g菌体加入10mL的Lysis buffer的比例；使用60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000rpm离心30min，获得的上清为总蛋白样品，含有抗菌肽；
将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用含200mMNaCl,50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Blance Buffer去除未结合的杂蛋白，然后用含200mMNaCl,60mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Wanshing Buffer洗脱弱结合蛋白，最后用含200mMNaCl,500mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Elution Buffer洗脱并收集目的蛋白，在150mM NaCl,25mM Tris,1mM DTT,pH调至8.0-8.1的透析液中透析除盐，然后制成冻干粉，-80℃保存；
透析蛋白的冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解处理后进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽。
10.如权利要求7所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，抗菌肽基因的表达及纯化后，还需进行抗菌活性的分析：
培养待测菌株，进行抑菌实验；菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌，在20mL培养基中培养者至对数中期；具体包括：
取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD600在0.2-0.3；取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾ALFpm10抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm10抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。
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