CN106479987B - 一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用。其制备方法包括以下步骤：1）构建mdproPO1/pET‑30a重组表达载体；2）筛选高表达MdproPO1重组蛋白的表达菌株mdproPO1/pET‑30a/Rosetta；3）表达菌株的发酵培养与诱导表达；4）MdproPO1包涵体的变性与复性。该法用大肠杆菌表达系统生产出的家蝇酚氧化酶原（MdproPO1）表达量高，通过原核菌体回收、破碎，可以获得大量的MdproPO1包涵体，通过MdproPO1包涵体的变性与复性，可以获得可溶的有酶活性的MdproPO1重组蛋白。MdproPO1重组蛋白可以发展为灭蝇剂、氧化剂、黑化剂以及免疫剂，应用到卫生、保健、生物与化工等多个领域。

Description

一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

家蝇是广布全球的卫生害虫，可以传播细菌、病毒和寄生虫等上百种病原体，但其自身却能够良好的生存，这完全得益于家蝇有一个强大的先天免疫系统。

昆虫缺乏获得性免疫，对入侵病原的防御完全依靠先天免疫。昆虫的先天免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分。细胞免疫主要指血细胞对病原的包被、吞噬等作用；体液免疫指抗菌因子如抗菌肽的产生和黑化作用等。其中的黑化作用是由酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase-activated system，proPO系统）完成。proPO系统是昆虫免疫体系的重要成员，对病原入侵能做出最快速的免疫应答，不仅影响黑色素合成，还影响昆虫的发育与寿命，并与抗菌肽产生有关，在识别与防御病原中起关键作用。

通过几个昆虫proPO系统的研究，发现proPO系统的激活是一个丝氨酸蛋白酶级联反应：上游的丝氨酸蛋白酶水解下游酶的酶原，活化的酶再去激活下一个酶的酶原，最终将酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）激活为酚氧化酶（phenoloxidases，PO）。PO是proPO系统中最后的也是最重要的功能组分，能将酚氧化成苯醌，进而形成不溶性的黑色素。一般，PO以无活性的proPO存在于血细胞里。proPO基因在昆虫中广泛存在，如埃及按蚊有10个，果蝇有3个，家蚕与烟草天娥各有2个，而蜜蜂只有1个。昆虫proPO基因的多样与其参与机体黑化、伤口愈合、血细胞聚集和表皮鞣化等多种功能有关。但是，目前对家蝇有几个proPO基因以及这些proPO基因重组的蛋白具有什么样的功能还不清楚。

通过转录组分析，发现家蝇有2个proPO基因，称其为mdproPO1与mdproPO2，具体见论文[Dianxiang Li，Yongli Liang, Xianwei Wang, Lei Wang, Mei Qi, Yang Yu,Yuanyuan Luan. Transcriptomic analysis of Musca domestica to reveal key genesof the prophenoloxidase-activating system. G3 (Bethesda). 2015;5(9):1827-1841.(SCI)]。mdproPO1基因含有一个开放阅读框（ORF），编码的MdproPO1蛋白无信号肽，有典型的保守区：一个酪氨酸酶保守区，一个硫酯基序保守区，一个酚氧化酶原激活酶（proPO-activating enzyme，PAP）裂解位点，两个结合铜离子的保守区（每个保守区都有三个组氨酸残基，可与铜离子以共价键结合，两个铜离子与氧原子结合）。但是，并不清楚MdproPO1蛋白是否具备被蛋白酶水解为活性MdPO1的功能，更不知道其具体的功效。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种利用原核表达系统生产的可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白，同时，提供了其应用。

本发明的技术方案为：扩增mdproPO1基因的开放阅读框（ORF）cDNA片段，构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体，表达MdproPO1重组蛋白，进行开发应用。

表达载体的构建：依据家蝇mdproPO1基因ORF的两端序列和载体pET-30a的多克隆位点，设计一对上下游引物mdproPO1 ExF与mdproPO1 ExR，并在引物的5’端引入Kpn I与Sal I酶切位点，用大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）混合液诱导的家蝇幼虫的cDNA为模板，PCR钓取mdproPO1片段，利用Kpn I与Sal I两个酶切位点，与pET-30a载体定向连接，构建mdproPO1/pET-30a表达载体，经测序证明该表达载体中的mdproPO1序列正确。

家蝇MdproPO1完整的核苷酸和推断的氨基酸序列：

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以上为mdproPO1/pET-30a表达载体表达的MdproPO1重组蛋白的核苷酸序列(SEQID N0.1)与推断的氨基酸序列(SEQ ID N0.2)。其中，核苷酸序列总长2169 bp，包括2055bp的MdproPO1的ORF、N端114 bp来自载体的带组氨酸His的标签（，终止密码子用星号*表示，Kpn I酶切位点。推断的MdproPO1氨基酸序列中的保守序列有Hemocyanin_N 22-140、Hemocyanin_M 146-412、Hemocyanin_C 421-675三个血蓝蛋白保守区；一个酪氨酸酶（tyrosinase）保守区 201-418；一个保守的硫酯基序582-589；一个酚氧化酶原激活酶（proPO-activating enzyme，PAP）裂解位点^*R⁵¹-^*F⁵²；两个铜离子结合位点：196-245和357-412。

转化子筛选、发酵培养与MdproPO1诱导表达：将构建好的mdproPO1/pET-30a表达载体转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，经卡那霉素筛选出阳性转化子，经过最佳IPTG诱导浓度、诱导时间与温度等一系列条件的摸索，获得MdproPO1重组蛋白高表达的mdproPO1/pET-30a/Rosetta菌株与最佳的诱导表达条件。

MdproPO1包涵体的纯化：将高表达MdproPO1的菌株接种到含卡那霉素的液体LB培养基里，按最佳诱导表达条件，用IPTG诱导MdproPO1表达。将诱导后的发酵液离心，回收菌体细胞，冰浴中超声破碎细胞，再离心，表达的MdproPO1重组蛋白全在沉淀里，为包涵体，将其收集。

MdproPO1多克隆抗体的制备：将MdproPO1包涵体进行SDS-PAGE蛋白电泳，切出KCl显色的MdproPO1目标带，用生理盐水研磨成糊，再加等量的完全弗氏佐剂研磨至油包水的乳液，给家兔背部皮下分点注射。三周后，用不完全弗氏佐剂与MdproPO1蛋白胶同样研磨成乳液，给兔子进行第二次注射。隔两周，把MdproPO1蛋白胶研磨成乳液，给兔子进行肌肉注射。三天后，用免疫双扩散法检测到抗体含量稳定时，取兔子全血制备抗血清。每次给兔子注射的MdproPO1蛋白量约为200 µg/kg。

MdproPO1包涵体的变性与复性：用Buffer A与B洗净MdproPO1包涵体，去除杂蛋白。再用Buffer C充分变性并溶解包涵体，离心收上清、弃沉淀。上清与辅助Buffer混合后，先后用Buffer D与Buffer E分别透析两次，充分复性目的蛋白。

MdproPO1复性蛋白的纯化与鉴定：离心复性后的MdproPO1蛋白，留上清，过微孔滤膜后上His-Bind亲和柱纯化，获得MdproPO1复性蛋白。用MdproPO1多克隆抗体进行Westernblot鉴定MdproPO1复性蛋白。

MdproPO1复性蛋白的活性检测：将MdproPO1复性蛋白用家蝇血淋巴或Ca²⁺离子等激活剂激活，激活的MdproPO1复性蛋白转为了活性的MdPO1,能够催化L-多巴底物形成黑色素，黑色素越多，样品的A490越大，MdproPO1复性蛋白的活性越高。

MdproPO1复性蛋白的应用：MdproPO1复性蛋白可以受加热或受乙醇等化学试剂的激活转为氧化酚类物质的MdPO1氧化剂；也可以通过MdPO1催化黑色素形成作为黑化剂使用；还可以通过抗体封闭作为灭蝇剂使用；还可以作为抑制或杀灭病原体、提高个体免疫力的免疫剂使用。

本发明的有益效果是：（1）构建了mdproPO1/pET-30a原核表达载体。利用家蝇 mdproPO1基因ORF的两端序列和pET-30a载体多克隆位点中的Kpn I与Sal I酶切位点，使MdproPO1酶蛋白序列的N末端连接了表达载体上的组氨酸标签（His-tagged）。（2）高量表达了MdproPO1重组蛋白包涵体。将重组质粒mdproPO1/pET-30a转化大肠杆菌Rosetta，筛选出了高表达MdproPO1的mdproPO1/pET-30a/Rosetta菌株，表达的MdproPO1重组蛋白占菌体总蛋白的22%，且带组氨酸标签，便于亲和纯化。（3）制备了MdproPO1多克隆抗体。利用MdproPO1重组蛋白制备了兔多克隆抗体，该抗体可以用于MdproPO1酶蛋白产品的鉴定，还可以用于灭蝇剂的开发。（4）建立了MdproPO1包涵体变性与复性的有效方法，获得了有活性的可溶性MdproPO1重组蛋白，可以通过MdproPO1重组蛋白上的His标签进行亲和层析纯化，获得更纯的产品作氧化剂、黑化剂和免疫剂等开发应用。

该法生产的可溶性MdproPO1重组蛋白具有简单方便、高效、易重复的优点。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测的表达菌株mdproPO1/pET-30a/Rosetta大量表达MdproPO1蛋白的结果。随着IPTG诱导时间的增加，MdproPO1蛋白表达量在诱导1-5小时内不断增加，到5小时达到最大，约占菌体蛋白的22%。

图2为用SDS-PAGE与Western blot检测的MdproPO1包涵体变性与复性的结果。用MdproPO1重组蛋白制备的兔多克隆抗体检测，MdproPO1包涵体经变性与复性转变成了可溶性蛋白，其大小同家蝇的MdproPO1天然蛋白。

图3 是酶标仪检测MdproPO1复性蛋白活性的结果。经检测，MdproPO1复性蛋白可以为家蝇血淋巴激活，其MdPO1活性大大增加。

图4是用酶标仪检测的MdproPO1抗体封闭家蝇的MdPO1酶活性与家蝇死亡数的统计结果。结果显示，MdproPO1抗体封闭后，家蝇内源MdPO1酶活性下降、死亡率增加。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

MdproPO1重组酶的表达

主要步骤包括：

用1 mL的无菌注射器针头蘸取等量混合的大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）活菌液（浓度约3 * 10⁸ cfu/mL），轻刺家蝇三龄幼虫后腹部，每虫一针，转入新鲜培养基中饲养4 h，提取刺激家蝇的总RNA反转录成cDNA为模板，合成含Kpn I与Sal I内切酶位点的正反向引物，引物序列为：

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mdproPO1 ExR：5‘—TAG GTCGAC GCTGGCTGGAGAAAACTTAT—3’ (SEQ ID NO.4)；

经聚合酶链式反应(PCR)，扩增出2055 bp的mdproPO1基因的ORF，将其克隆入pET-30a质粒(Invitrogen)，构建mdproPO1/pET-30a表达载体，转化大肠杆菌Rosetta，挑取阳性单菌落接种于含75 µg/mL卡那霉素的液体LB培养基里，37℃ 200 rpm振荡培养过夜。次日，按1/100的比例转接过夜培养菌至新的含卡那霉素的液体LB培养基里，30℃ 200 rpm振荡培养2.5 h，加入IPTG至终浓度0.5 mM，继续30℃振荡培养5 h，MdproPO1重组酶的表达量最大，见图1。

实施例2

MdproPO1包涵体的纯化、变性与复性

主要步骤包括：

ⅰ.包涵体的纯化：将MdproPO1表达量达最大的诱导菌液经7000 rpm 离心10 min，收菌体，用l × PBS（140 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na₂HPO₄,1.8 Mm KH₂PO₄,pH7.4）重悬，冰浴中超声波破碎后, 4℃ 12000 rpm离心10 min，分开收集上清与沉淀，表达的MdproPO1重组蛋白全在沉淀里，为包涵体，大小与预计的83.5 kDa相符，包括mdproPO1基因2055 bp的ORF的编码蛋白，79.3 kDa，和载体上的His标签，约4.2 kDa（图2）。

ⅱ.包涵体的变性：将离心收集到的MdproPO1包涵体，用Buffer A（50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA，pH 8.0）悬起，4℃ 10000 rpm 离心20 min，弃上清，重复一次，去除可溶性杂蛋白。再用Buffer B（50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、2 M脲，pH 8.0）将MdproPO1包涵体悬起，4℃ 10000 rpm 离心20 min，弃上清，重复一次。沉淀再用Buffer C（0.1 M Tris-HCl、10 mM DTT、8 M脲加水溶解，pH 8.0）悬起，37℃快速震荡1 h，充分变性并溶解包涵体蛋白，4℃ 12000 rpm 离心20 min，弃沉淀，保留上清，为变性的包涵体蛋白。

ⅲ.包涵体的复性：将MdproPO1包涵体变性蛋白与辅助Buffer（0.5 mM Arg、5 mMGly、50μM CuCl₂、0.5 mM NaCl、5%甘油）按7:13混合，用Buffer D（0.1 M Tris-HCl、5 mMEDTA、5 mM Cysteine、1 M脲，pH 8.0）4℃透析两次，再用不含脲的Buffer E（0.1 M Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM Cysteine，pH 8.0）4℃透析两次，每次透析16 h，充分复性目的蛋白。

ⅳ.MdproPO1复性蛋白的纯化：MdproPO1复性蛋白经4℃ 12000 rpm 离心20 min，留上清，过0.4 µm微孔滤膜，上His-Bind亲和柱纯化，当可溶的MdproPO1复性蛋白流经Ni²⁺琼脂糖亲和层析柱时，被Ni²⁺吸附，后用咪唑洗脱，获得了纯MdproPO1酶蛋白。用MdproPO1多克隆抗体对MdproPO1复性蛋白进行Western blot检测，有阳性带，大小与预期的一致（图2）。

ⅴ.MdproPO1复性蛋白的活性检测：用无菌品准备三组检测样品：

（1）组为30μl菌刺家蝇的血淋巴。制备方法：用1 mL注射器针头蘸取等量混合的大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）菌液（浓度约3 × 10⁸ cfu/mL），刺激家蝇三龄幼虫后腹部，每虫一针，刺激幼虫转入新鲜培养基中饲养4 h，冰浴下断头吸取血淋巴于170 µL抗凝剂中，取混合液30μl为测试样品；

（2）组为菌刺家蝇的血淋巴与MdproPO1复性蛋白的混合液，各15μl；（3）组为30μlMdproPO1复性蛋白。

把三组样品按表1配制反应液，先将不含L-多巴溶液的反应液加入96孔板中，30℃孵育5 min，再加30μL的L-多巴溶液，用酶标仪检测反应10 min内的样品的吸光度A490。结果显示：三组样品都有A490，其中，加了MdproPO1复性蛋白的家蝇血淋巴样品较其他两组样品的A490明显增高，证明MdproPO1复性蛋白能够被家蝇proPO系统特异性丝氨酸蛋白酶级联反应强烈激活，转为了高活性的MdPO1,催化L-多巴底物形成了更多的黑色素，而MdproPO1复性蛋白的A490也较高，说明MdproPO1复性蛋白可能为反应液里的Ca²⁺离子激活了，但激活力度不如家蝇血淋巴（图3）。

表1. 180μL反应液

实施例3

MdproPO1复性蛋白的应用

主要包括：

ⅰ.氧化剂：MdproPO1复性蛋白受加热或用乙醇等化学试剂激活转为MdPO1，MdPO1是氧化酚类物质的氧化剂，因此，MdproPO1复性蛋白可以开发为氧化剂。

ⅱ.黑化剂：MdproPO1复性蛋白受加热或Ca²⁺离子等激活形成MdPO1，MdPO1催化黑色素形成，因此，MdproPO1复性蛋白可以开发为黑化剂。

ⅲ.灭蝇剂与免疫剂：把家蝇幼虫分成四组，分别做以下处理：1组，不注射；2组，注射0.4μl （3×10⁸ CFU/mL）大肠杆菌；3组，先注射0.4μl MdproPO1抗血清，30 min后再注射0.4μl大肠杆菌（3×10⁸ CFU/mL）；4组，先注射0.4μl前血清，30 min后再注射0.4μl大肠杆菌（3×10⁸ CFU/mL）。每组3个重复，20 h后，计算各组家蝇的死亡率。结果显示，第3组家蝇的死亡数最高（图4），证明MdproPO1多克隆抗体封闭了家蝇体内的MdproPO1蛋白，减弱了家蝇对病原菌的免疫力，引起家蝇死亡数相比菌刺组的明显增加，因此，MdproPO1多克隆抗体可以开发为灭蝇剂，而MdproPO1重组蛋白可以开发为抑制或杀灭病原体的免疫剂。

<110>济南大学

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<212> DNA

<213>家蝇（Musca domestica）

<221>重组酚氧化酶原1

<222> (1)...(2169)

<400>1

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<210> 2

<211> 722

<212> A A

<213>家蝇（Musca domestica）

<221>重组酚氧化酶原1

<222> (1)...(722)

<400>2

1 MHHHHHHSSG LVPRGSGMKE TAAAKFERQH MDSPDLGTMT DKKNLLLLFD RPTEPVFMGK

61 GKTSTVFDVP DKYLTKRYER LGNEIQSRFG EKAEQRVPVR GISLPDLRIP MSLGRDEQFS

121 LFVPRHRRIA GRLIDIFVGM RTVDDLLSVA VYARDRVNPY LFNYALSVAL LHREDTKGLD

181 LPSFAQNFPD KFVDSQVFRQ VREEATVVPD GSRMPIVVPR DYTASDLDPE HRLWYFREDM

241 GINLHHWHWH LVYPFEAGDR RIVEKDRRGE LFYYMHQQVI ARYNMERFSS NLARVTRFNN

301 FREPIAEGYF PKMDSLVASR AWPPRFDNTP IKDLNRELDQ INLDISDLER WRDRIFEAIH

361 QGFVVDASGN RIPLDERRGI DILGNMLEAS IISPNQSVYG DFHNMGHVFI SYAHDPDHRH

421 LESFGVMGDS ATAMRDPVFY RWHAYIDDIF QEHKTRLTPY TLPQLQYDGI SISGLQVSSE

481 GGQPNVLSTF WQQSDVDLSR GMGFVPRGNV FARFTHLQHT PFTYTINVNN DSGAQRFGTV

541 RIFIAPKTDE RGQPWLFRDQ RLMMVELDKF VVQLNPGQNT IRRRSTDSSV TIPFERTFRN

601 LEVNRPAQGS PEELEFNFCG CGWPQHMLIP KGLPGGMRCE LFVMVSNYED DRVDQTLVGA

661 CSDAASYCGV RDRLYPDRRA MGYPFDRLPR QGVDRLVQFL TPNMSIVDVS IRHDANRVVM

721 RQ

<160>2

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<400>3

1 TAG atc GGT ACC ATG ACT GAC AAA AAG AAT

31 CTC C

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<400>4

1 TAG GTC GAC GCT GGC TGG AGA AAA CTT AT

Claims (4)

1.一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体：用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合液诱导的家蝇幼虫的cDNA为模板，依据家蝇酚氧化酶原基因的核苷酸序列，合成一对扩增该基因ORF的原核表达特异引物，引物序列为：

mdproPO1 ExF：5’—TAGatcGGTACCATGACTGACAAAAAGAATCTCC—3’

mdproPO1 ExR：5’—TAGGTCGACGCTGGCTGGAGAAAACTTAT—3’

该引物包含Kpn I与Sal I内切酶位点，所述Kpn I内切酶位点对应碱基序列为GGTACC；所述Sal I对应碱基序列为GTCGAC；

经聚合酶链式反应，扩增出2071bp的MdproPO1的ORF片段，通过两个内切酶酶切位点Kpn I与Sal I，将其克隆入pET-30a质粒，构建mdproPO1/pET-30a重组表达载体，

所述MdproPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2）获得mdproPO1/pET-30a/Rosetta高表达MdproPO1蛋白的表达菌株：将构建好的mdproPO1/pET-30a表达载体转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta感受态细胞，通过筛选，获得高表达MdproPO1重组蛋白的菌株mdproPO1/pET-30a/Rosetta；

3）表达菌株的发酵培养，加入IPTG至终浓度0.5 mM诱导表达5 h，获得MdproPO1包涵体；

4）MdproPO1包涵体的变性与复性，获得可溶的有活性的MdproPO1重组蛋白：用缓冲液A与B洗净MdproPO1包涵体；再用缓冲液 C充分变性并溶解包涵体，离心收上清、弃沉淀；上清与辅助缓冲液混合后，先后用缓冲液 D与缓冲液 E分别透析两次，充分复性目的蛋白；其中，

缓冲液 A成分为：50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA，pH 8.0；

缓冲液 B成分为：50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、2 M脲，pH 8.0；

缓冲液 C成分为：0.1 M Tris-HCl、10 mM DTT、8 M脲加水溶解，pH 8.0；

缓冲液 D成分为：0.1 M Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM半胱氨酸、1 M脲，pH 8.0；

缓冲液 E成分为：0.1 M Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM半胱氨酸，pH 8.0；

辅助缓冲液成分为：0.5 mM精氨酸、5 mM 甘氨酸、50μM CuCl₂、0.5 mM NaCl、5%甘油；

MdproPO1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种权利要求1中制备的家蝇MdproPO1重组蛋白在制备灭蝇剂中的应用。

3.一种权利要求1中制备的家蝇MdproPO1重组蛋白在制备氧化剂中的应用。

4.一种权利要求1中制备的家蝇MdproPO1重组蛋白在制备黑化剂中的应用。

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