CN108409850A - 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108409850A
CN108409850A CN201810089975.4A CN201810089975A CN108409850A CN 108409850 A CN108409850 A CN 108409850A CN 201810089975 A CN201810089975 A CN 201810089975A CN 108409850 A CN108409850 A CN 108409850A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cagal
recombinant proteins
fish
pet
source
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810089975.4A
Other languages
English (en)
Inventor
孔祥会
王莉
张�杰
赵贤亮
裴超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Normal University
Original Assignee
Henan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Normal University filed Critical Henan Normal University
Priority to CN201810089975.4A priority Critical patent/CN108409850A/zh
Publication of CN108409850A publication Critical patent/CN108409850A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，属于水产动物分子生物学领域。本发明的技术方案要点为：以淇河鲫cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物CaGal与载体pET‑32a连接，构建pET‑32a‑CaGal重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET‑32a‑CaGal‑BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。本发明制备的CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌等病原菌，抑菌效果明显，并且制备方法简单，可作为一种新型的鱼类免疫添加剂或抗菌药物。

Description

一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于水产动物分子生物学技术领域，具体涉及一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
淇河鲫（Qihe crucian carp，Carassius auratus），又称“双背鲫”，为天然三倍体鱼类，产于豫北淇河，生长迅速、肉味鲜美且营养价值高，为“淇河三珍”之首，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随淇河鲫养殖范围扩大，养殖密度增加，鱼类免疫力下降，导致病害逐渐增多。其中危害较大的是嗜水气单胞菌引起的淡水鱼类细菌性出血病。该病传播迅速、死亡率极高，严重影响了淇河鲫养殖业的经济与生态效益。因此，深入了解淇河鲫先天免疫，系统研究其感染嗜水气单胞菌后的免疫应答机制，有助于通过多途径联合运用最大限度地提高鱼类免疫力，促进淇河鲫养殖业的可持续发展。
半乳糖凝集素（galectin）是进化上较为保守的凝集素家族成员。具有以下典型特征：具有保守的糖识别结构域（CRD），能够特异性结合β-半乳糖苷，没有信号肽，活性发挥不依赖Ca2+，广泛分布于动物、植物及微生物。半乳糖结合凝集素是一类多功能分子，参与RNA转录后加工、肿瘤转化、细胞凋亡、细胞间粘附及细胞生长调节等；并且半乳糖凝集素还作为模式识别受体识别细菌、病毒、真菌及寄生虫的表面糖基，启动先天免疫，在机体的天然免疫防御中发挥重要作用。但是，目前从鱼类中鉴定到的半乳糖凝集素较少。本发明所述半乳糖凝集素CaGal为淇河鲫首例报道的半乳糖凝集素，并且发现该凝集素具有效果明显的抑菌作用。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，该方法制得的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等病原菌且抑菌效果明显。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步优选，所述pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：
（1）CaGal基因的PCR扩增
提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：
正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点；
反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点；
以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列，反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃终延伸10min；
（2）将得到的PCR产物CaGal与原核表达载体pET-32a分别进行Kpn I和Hind III双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接；
（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃ 180rpm振荡培养过夜，提取质粒，Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组表达载体构建成功。
进一步优选，所述大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21的具体制备过程为：
（1）将鉴定正确的重组表达载体pET-32a-CaGal 5μL加入到预冷的25μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min，加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；
（2）挑取单菌落接种到含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子，获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21。
进一步优选，所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的具体制备过程为：
（1）大肠杆菌表达菌株的培养与诱导表达
将筛选得到的阳性转化子pET-32a-CaGal-BL21接种于含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，按1:100接种于新的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌至OD600＝0.6，然后加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm诱导表达6h，6000rpm，15min收集菌体，20mL PBS重悬后，在冰浴中超声破碎，超声3s、间歇3s，全程55min，破碎后的菌液4℃，10000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，CaGal重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；
（2）包涵体变性及复性
20mL Buffer A将沉淀重悬，Buffer A：50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH 7.9，4℃10000rpm离心25min，弃上清，保留沉淀；20mL Buffer B重悬沉淀，Buffer B：50mM Tris-HCl、5mM EDTA、2M脲、pH 7.9，离心后将上清保留以备检测，并重复该步骤一次；沉淀用20mLBuffer C重悬，Buffer C：8M脲、0.1M Tris-HCl、10mM DTT、pH 7.9，置于37℃恒温摇床上220rpm震荡1-2h，4℃、10000rpm离心10min后留上清；将上清置入透析袋，放入1L透析液中，透析液：0.1M Tris-HCl、5mM L-Cysteins、pH 7.9，4℃透析15h以上，并重复一次，透析结束后，蛋白复性液4℃、10000rpm离心15min，留上清；
（3）重组蛋白的亲和纯化
Ni-IDA柱准备：将Ni-IDA琼脂糖振荡均匀，取2mL加入空柱，静置3min，待Ni-IDA琼脂糖沉降均匀；Ni-IDA柱的预处理：3倍柱体积的结合缓冲液冲洗，缓冲液：20mM Tris-HCl、5mM咪唑、0.5M NaCl、pH 7.9；将透析后的重组蛋白，逐滴加入柱中，每次加1mL，待蛋白液流出后再加入1mL，直至所有样品加完，加入10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白；用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液各5mL分别收集洗脱液；通过SDS-PAGE检测洗脱液的蛋白纯度以及浓度，获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。
本发明所述的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白作为鱼类免疫添加剂或抗菌药物的应用。
进一步优选，所述的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白在制备抑制嗜水气单胞菌抗菌药物中的应用。
本发明具有如下优点：本发明的凝集素与以往鱼类发现的凝集素序列不同，且重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够抑制嗜水气单胞菌，并且制备方法简单，为研制新型鱼类免疫添加剂和抗菌药物提供了一种新的途径。
附图说明
图1为本发明实施例提供的淇河鲫半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的诱导表达及纯化，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为未加IPTG诱导的总蛋白，泳道2为IPTG诱导的总蛋白，泳道3为纯化及透析后的CaGal重组蛋白。
图2为本发明实施例提供的淇河鲫半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的抑菌活性检测，其中Kana为阳性对照卡那霉素，rTrx和TBS为阴性对照。
图3为本发明实施例提供的淇河鲫半乳糖凝集素CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌的清除能力，表现为淇河鲫感染嗜水气单胞菌12h、24h及48h后，不同处理组肾脏、肝脏和脾脏中的细菌含量。
图4为本发明实施例提供的淇河鲫半乳糖凝集素CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌感染后淇河鲫存活率的影响。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
CaGal重组蛋白的表达及纯化
1、构建pET-32a-CaGal重组表达载体
（1）CaGal基因的PCR扩增
提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据本实验室获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：
正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT（划线部分为Kpn I酶切位点）；
反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC（划线部分为Hind III酶切位点）；
以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列。
反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃终延伸10min。
（2）将得到的CaGal PCR产物与原核表达载体pET-32a分别进行Kpn I和Hind III双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接。
（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃ 180rpm振荡培养过夜，提取质粒。Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组质粒构建成功。
2、获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21
（1）将鉴定正确的重组质粒pET-32a-CaGal约5μL加入到预冷的25μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min；加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基（37℃预热）复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；
（2）挑取单菌落接种到含有氨苄青霉素（100µg/mL）的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子，获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21。
3、大肠杆菌表达菌株的培养与诱导表达
将筛选得到的阳性转化子pET-32a-CaGal-BL21接种于含有氨苄青霉素（100µg/mL）的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，按1:100接种于新的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌至OD600＝0.6，然后加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm诱导表达6h。6000rpm，15min收集菌体。20mL PBS重悬后，在冰浴中超声破碎（超声3s、间歇3s，全程55min）。破碎后的菌液4℃，10000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀（CaGal重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中）。
4、包涵体变性及复性
（1）20mL Buffer A （50mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH 7.9）将沉淀重悬，4℃，10000rpm离心25min，弃上清，保留沉淀。
（2）20mL Buffer B（50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M脲，pH 7.9）重悬沉淀，离心后将上清保留以备检测，并重复该步骤一次。
（3）沉淀用20mL Buffer C（8M脲，0.1M Tris-HCl，10mM DTT，pH 7.9）重悬，置于37℃恒温摇床上220rpm震荡1-2h，4℃、10000rpm离心10min后留上清。
（4）将上清置入透析袋，放入1L透析液（0.1M Tris-HCl，5mM L-Cysteins，pH 7.9）中，4℃透析15h以上，并重复一次，透析结束后，蛋白复性液4℃、10000rpm离心15min，留上清。
5、重组蛋白的亲和纯化
（1）Ni-IDA柱准备：将Ni-IDA琼脂糖振荡均匀，取2mL加入空柱，静置3min，待Ni-IDA琼脂糖沉降均匀。
（2）Ni-IDA柱的预处理：3倍柱体积的结合缓冲液（20mM Tris-HCl，5mM 咪唑，0.5MNaCl，pH 7.9）冲洗。
（3）将透析后的重组蛋白，逐滴加入柱中，每次加1mL，待蛋白液流出后再加入1mL，直至所有样品加完。
（4）加入10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白。
（5）用含不同浓度咪唑（20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、500mM）的洗脱缓冲液（含不同咪唑浓度的结合缓冲液即为洗脱缓冲液）各5mL，分别收集洗脱液。
（6）通过SDS-PAGE检测洗脱液的蛋白纯度以及浓度，获得重组蛋白CaGal（图1）。
实施例2
CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌的抑制及清除能力
1、CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌的抑制作用
使用管碟法检测CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌的抑制作用，具体步骤如下：
（1）从LB平板上挑取细菌单克隆，接入3mL LB液体培养基中过夜培养；
（2）次日，将过夜培养的细菌，按照1:100接种于新鲜LB液体培养基中，培养至对数生长期；
（3）在LB平板上均匀涂布100μL处于对数生长期的菌液；
（4）在LB平板上设计放置4个灭菌的牛津小杯，在平板的底面做好标记，向牛津小杯内加入50μL CaGal重组蛋白（0.5mg/mL），阳性对照用50μL卡那霉素（Kana，0.5mg/mL）代替重组蛋白，而用rTrx蛋白（50μL，0.5mg/mL）和TBS（50μL）作阴性对照；
（5）28℃过夜，倒置培养，加入CaGal蛋白和卡那霉素的牛津小杯处均出现透明圈，说明CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌具有抑制作用（图2）。
2、CaGal重组蛋白对嗜水气单胞菌的清除能力
（1）淇河鲫感染与嗜水气单胞菌的清除实验：使用LB液体培养基过夜振荡培养，嗜水气单胞菌达到对数生长期。5000rpm离心5min，0.65wt% NaCl洗涤菌体两次后重悬，使菌液的浓度达到1×106CFU/mL。将淇河鲫随机（15-20g）分为3组，每组20尾。分别经腹腔注射：第1组（生理盐水组），100μL嗜水气单胞菌菌液+100μL 0.65wt% NaCl；第2组（rTrx蛋白组），100μL嗜水气单胞菌菌液+10μg rTrx蛋白；第3组（CaGal蛋白组），100μL嗜水气单胞菌菌液+10μg CaGal重组蛋白。各组均为先注射100μL嗜水气单胞菌菌液，1h后再分别注射0.65wt%NaCl、rTrx蛋白和CaGal重组蛋白。注射完成后12h、24h和48h取样，每组随机选取5尾淇河鲫，取其肾脏、肝脏和脾脏置于0.65wt% NaCl。组织匀浆后，进行平板培养计数法计算各组织中的细菌含量（CFU/mg）。
（2）CaGal重组蛋白能显著清除淇河鲫组织中的嗜水气单胞菌
统计结果显示，嗜水气单胞菌感染24h后，生理盐水组肝脏中细菌量为342CFU/mg，rTrx蛋白组中细菌量为329CFU/mg，两者之间无显著性差异；而CaGal蛋白组中细菌量仅为158CFU/mg，肝组织内细菌量有较大程度的降低，与生理盐水组相比，呈现极显著差异。嗜水气单胞菌感染48h后，CaGal蛋白组中细菌量仅为192CFU/mg，与生理盐水组的细菌量（440CFU/mg）相比，呈现极显著差异。嗜水气单胞菌感染淇河鲫48h后，CaGal蛋白清除嗜水气单胞菌的效率与生理盐水相比，提高约2倍。在肾脏和脾脏中，也呈现出类似的结果（图3）。由此表明，CaGal重组蛋白能显著清除淇河鲫组织中的嗜水气单胞菌。
实施例3
CaGal重组蛋白提高嗜水气单胞菌感染后淇河鲫的存活率
（1）使用LB液体培养基过夜震荡培养，嗜水气单胞菌达到对数生长期。5000rpm离心5min，0.65wt% NaCl洗涤菌体两次后重悬，使菌液的浓度达到6.25×106CFU/mL。将淇河鲫随机（15-20g）分为3组，每组20尾。分别经腹腔注射：第1组（生理盐水组），100μL嗜水气单胞菌菌液+100μL 0.65wt% NaCl；第2组（rTrx蛋白组），100μL嗜水气单胞菌菌液+20μg rTrx蛋白；第3组（CaGal蛋白组），100μL嗜水气单胞菌菌液+20μg CaGal重组蛋白。各组均为先注射100μL嗜水气单胞菌菌液，1h后再分别注射0.65wt% NaCl、rTrx蛋白和CaGal重组蛋白，每隔12h统计一次存活率直至48h。
（2）实验结果显示，当注射剂量为100μL6.25×106 CFU/mL嗜水气单胞菌时，生理盐水组和rTrx蛋白组中，淇河鲫的存活率仅为20%和10%，而CaGal蛋白组中，淇河鲫的存活率提高至60%。由此表明，CaGal重组蛋白可显著提高嗜水气单胞菌感染后淇河鲫的存活率（图4）。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用
<130> 2018
<141> 2018-01-30
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 320
<212> PRT
<213> Protein galectin
<400> 1
Met Ala Phe Tyr Gln Gln Gln Pro Phe Tyr Asn Pro Arg Ile Pro Phe
1 5 10 15
Ser Gly Gln Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Lys Ser Ile Ile Ile
20 25 30
Ser Gly Arg Val Leu Pro Gly Ala Asn Arg Phe His Val Asn Leu Gln
35 40 45
Cys Gly Ser Arg Ser Gly Ala Asp Ile Ala Leu His Phe Asn Pro Arg
50 55 60
Tyr Glu Ser Leu Gly Tyr Val Val His Asn Thr Cys Gln Ser Arg Asn
65 70 75 80
Trp Gly Ser Glu Glu Arg Lys Tyr Glu Ser Pro Phe Pro Gln Gly Gln
85 90 95
Thr Phe Thr Leu Gln Ile Leu Val Glu Gln Asp Lys Tyr Lys Ile Ser
100 105 110
Thr Asn Gly Arg His Phe Val Asp Tyr Arg His Arg Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Gln Val Asp Thr Val Ser Val Asp Gly Met Val Glu Leu Asn Ser Ile
130 135 140
Ala Phe Gln Asn Pro Ala Pro Tyr Leu Pro Pro Gln Pro Ala Phe Pro
145 150 155 160
Gly Tyr Ile Ala Pro Gln Ala Gly Tyr Gln Pro Gln Phe Ala Met Pro
165 170 175
Pro Gly Cys Gly Phe Pro Ala Tyr Pro Ser Ala Pro Asn Tyr Thr Ile
180 185 190
Pro Tyr Lys Thr Val Ile Asn Gly Gly Leu Tyr Pro Gly Lys Asn Ile
195 200 205
Val Ile Asn Gly Val Ile Asn Pro Asn Ala Ser Arg Ile Thr Phe Asn
210 215 220
Leu Arg Tyr Arg Ser Gly Ile Ala Phe His Tyr Asn Pro Arg Phe Asp
225 230 235 240
Glu Ser Val Val Val Arg Asn Ser Asn Gln Met Glu Gln Trp Gly Ala
245 250 255
Glu Glu Arg Phe Gly Asp Leu Pro Phe Gln Lys Gly Gln Pro Phe Gln
260 265 270
Val Thr Ile Ser Cys Glu Pro His His Tyr Asn Val Phe Val Asn Gly
275 280 285
Lys Gln Ala His Thr Tyr Lys His Arg Tyr Thr Asn Leu Thr Asp Ile
290 295 300
Asp Ile Leu Glu Ile Cys Gly Asp Leu Gln Leu Thr Phe Val Gln Ala
305 310 315 320
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cggggtacca tggcttttta tcagcaacag ccgt 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cccaagcttt taagcctgca caaaagtcag ctgc 34

Claims (6)

1.一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：
（1）CaGal基因的PCR扩增
提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：
正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点；
反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点；
以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列，反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃终延伸10min；
（2）将得到的PCR产物CaGal与原核表达载体pET-32a分别进行Kpn I和Hind III双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接；
（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃ 180rpm振荡培养过夜，提取质粒，Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组表达载体构建成功。
3.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21的具体制备过程为：
（1）将鉴定正确的重组表达载体pET-32a-CaGal 5μL加入到预冷的25μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min，加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；
（2）挑取单菌落接种到含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子，获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21。
4.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的具体制备过程为：
（1）大肠杆菌表达菌株的培养与诱导表达
将筛选得到的阳性转化子pET-32a-CaGal-BL21接种于含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，按1:100接种于新的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌至OD600＝0.6，然后加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm诱导表达6h，6000rpm，15min收集菌体，20mL PBS重悬后，在冰浴中超声破碎，超声3s、间歇3s，全程55min，破碎后的菌液4℃，10000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，CaGal重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；
（2）包涵体变性及复性
20mL Buffer A将沉淀重悬，Buffer A：50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH 7.9，4℃10000rpm离心25min，弃上清，保留沉淀；20mL Buffer B重悬沉淀，Buffer B：50mM Tris-HCl、5mM EDTA、2M脲、pH 7.9，离心后将上清保留以备检测，并重复该步骤一次；沉淀用20mLBuffer C重悬，Buffer C：8M脲、0.1M Tris-HCl、10mM DTT、pH 7.9，置于37℃恒温摇床上220rpm震荡1-2h，4℃、10000rpm离心10min后留上清；将上清置入透析袋，放入1L透析液中，透析液：0.1M Tris-HCl、5mM L-Cysteins、pH 7.9，4℃透析15h以上，并重复一次，透析结束后，蛋白复性液4℃、10000rpm离心15min，留上清；
（3）重组蛋白的亲和纯化
Ni-IDA柱准备：将Ni-IDA琼脂糖振荡均匀，取2mL加入空柱，静置3min，待Ni-IDA琼脂糖沉降均匀；Ni-IDA柱的预处理：3倍柱体积的结合缓冲液冲洗，缓冲液：20mM Tris-HCl、5mM咪唑、0.5M NaCl、pH 7.9；将透析后的重组蛋白，逐滴加入柱中，每次加1mL，待蛋白液流出后再加入1mL，直至所有样品加完，加入10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白；用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液各5mL分别收集洗脱液；通过SDS-PAGE检测洗脱液的蛋白纯度以及浓度，获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。
5.如权利要求1所述的方法制得的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白作为鱼类免疫添加剂或抗菌药物的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白在制备抑制嗜水气单胞菌抗菌药物中的应用。
CN201810089975.4A 2018-01-30 2018-01-30 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用 Pending CN108409850A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810089975.4A CN108409850A (zh) 2018-01-30 2018-01-30 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810089975.4A CN108409850A (zh) 2018-01-30 2018-01-30 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108409850A true CN108409850A (zh) 2018-08-17

Family

ID=63126712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810089975.4A Pending CN108409850A (zh) 2018-01-30 2018-01-30 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108409850A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590926A (zh) * 2019-08-29 2019-12-20 湖南师范大学 一种合方鲫itln蛋白及其制备方法和应用
CN111053890A (zh) * 2020-01-02 2020-04-24 中国科学院水生生物研究所 来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用
CN111529686A (zh) * 2019-11-28 2020-08-14 中国科学院水生生物研究所 一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-9在制备抑菌剂中的应用
CN113912692A (zh) * 2021-09-27 2022-01-11 北京市水产科学研究所（国家淡水渔业工程技术研究中心） 锦鲤Galectin-9蛋白或其编码基因在调控锦鲤抗病原微生物感染中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998015624A1 (en) * 1996-10-09 1998-04-16 Human Genome Sciences, Inc. Galectin 8, 9, 10 and 10sv
CN1982458A (zh) * 2006-04-30 2007-06-20 中山大学 文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用
CN104109195A (zh) * 2014-07-19 2014-10-22 浙江万里学院 一种泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用
CN105063076A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 集美大学 大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用
CN106479987A (zh) * 2016-09-07 2017-03-08 济南大学 一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998015624A1 (en) * 1996-10-09 1998-04-16 Human Genome Sciences, Inc. Galectin 8, 9, 10 and 10sv
CN1982458A (zh) * 2006-04-30 2007-06-20 中山大学 文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用
CN104109195A (zh) * 2014-07-19 2014-10-22 浙江万里学院 一种泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用
CN105063076A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 集美大学 大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用
CN106479987A (zh) * 2016-09-07 2017-03-08 济南大学 一种可溶性家蝇MdproPO1重组蛋白的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI WANG ET AL.: "A C-type lectin, Nattectin-like protein (CaNTC) in Qihe crucian carp Carassius auratus: Binding ability with LPS, PGN and various bacteria, and agglutinating activity against bacteria", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
LI WANG ET AL.: "Molecular characterization and biological function of a tandem-repeat galectin-9 in Qihe crucian carp Carassius auratus", 《FISH AND SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
WANG,L. ET AL.: "Carassius auratus galectin-9 mRNA, complete cds，GenBank: MN954651.1", 《GENBANK》 *
赵桐等: "香鱼半乳糖凝集素3基因的克隆、鉴定和功能初探", 《中国细胞生物学学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590926A (zh) * 2019-08-29 2019-12-20 湖南师范大学 一种合方鲫itln蛋白及其制备方法和应用
CN110590926B (zh) * 2019-08-29 2020-11-24 湖南师范大学 一种合方鲫itln蛋白及其制备方法和应用
CN111529686A (zh) * 2019-11-28 2020-08-14 中国科学院水生生物研究所 一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-9在制备抑菌剂中的应用
CN111529686B (zh) * 2019-11-28 2021-08-10 中国科学院水生生物研究所 一种来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-9在制备抑菌剂中的应用
CN111053890A (zh) * 2020-01-02 2020-04-24 中国科学院水生生物研究所 来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用
CN113912692A (zh) * 2021-09-27 2022-01-11 北京市水产科学研究所（国家淡水渔业工程技术研究中心） 锦鲤Galectin-9蛋白或其编码基因在调控锦鲤抗病原微生物感染中的应用
CN113912692B (zh) * 2021-09-27 2024-02-27 北京市水产科学研究所（国家淡水渔业工程技术研究中心） 锦鲤Galectin-9蛋白或其编码基因在调控锦鲤抗病原微生物感染中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108409850A (zh) 一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用
CN102020716B (zh) 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用
CN103103202A (zh) Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用
CN109576275A (zh) 一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
CN107254486A (zh) 生菜作为宿主在表达生长因子中的应用
CN110982822B (zh) 一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用
CN103789317A (zh) 拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途
CN109897861B (zh) 一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用
CN100478439C (zh) 对虾抗病毒促生长双功能工程菌株及构建方法和应用
CN102586311A (zh) 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗
CN107022549A (zh) 黄颡鱼β防御素基因及其β防御素抗菌肽及其应用
CN102392042A (zh) 毕赤酵母制备刀额新对虾精氨酸激酶的方法
CN102212541B (zh) 一种表达重组阳离子抗菌肽g13大肠杆菌基因工程菌的构建
CN102993309B (zh) 一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用
CN102703390A (zh) 一种草鱼出血病抗原蛋白及制备方法和应用
CN105420174A (zh) 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建
CN101659958B (zh) 一种多效价活疫苗、其制备方法及应用
CN104862330B (zh) 一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法
CN104611343A (zh) 分离的鲤抗病毒天然免疫蛋白trim32及抗病毒活性
CN103724415A (zh) 斜带石斑鱼性别调控基因Rspo1及其制备方法和应用
CN107936107A (zh) 长牡蛎干扰素调节因子CgIRF‑1基因重组蛋白、制备方法及应用
CN104087567B (zh) 菲律宾蛤仔抗菌蛋白的制备方法
CN106749609B (zh) 一种鸡alpha干扰素及其制备方法
CN104086643B (zh) 一种长牡蛎类干扰素（CgIFN‑like）基因重组蛋白及其制备和应用
CN103495159B (zh) 柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180817

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication