CN103495159B - 柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，其步骤包括：(1)表达载体的构建；(2)目的蛋白的表达和纯化；(3)将纯化好的蛋白进行浓度调整，得到可直接使用的柱状黄杆菌基因重组亚单位疫苗。本发明所制备的疫苗具有安全性高、免疫效果稳定、生产效率高等优点。

Description

柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和水产领域，具体的涉及一种能够预防草鱼免受柱状黄杆菌感染的疫苗制备方法。

背景技术

柱状黄杆菌分布广泛，是一种世界范围的水生动物致病菌。其宿主范围极为广泛，可感染包括鲤科、鲈科、鲶科、鲑科、太阳科、鲻科等多个科的鱼类，几乎所有的淡水鱼都对其敏感，在养殖或自然条件下海水鱼和观赏鱼也能感染发病。在美国，柱状黄杆菌是继爱德华氏菌后第二大影响斑点叉尾鮰养殖的病原菌，每年造成约100万美元的经济损失。在我国，柱状黄杆菌主要危害草鱼、鳜鱼、鲤鱼、鲫鱼等鱼类，其引起的柱形病居淡水鱼类细菌性病害之首，给我国水产养殖业造成了严重的危害。

目前，主要靠使用抗生素和消毒剂等化学药物进行柱形病的防治，虽然有一定的效果，但随着抗生素的长期使用和滥用而引起的抗药性菌株的出现、水产品药物残留、环境污染等负面影响已日趋引起人们的重视，在欧盟、挪威、美国、日本等国家，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被限用和禁用。开发新的防治方法迫在眉睫，其它防治途径相比，以疫苗为主的免疫防治方法具有针对性强、抗病周期长、效果显著、无毒无害等不可替代的优势，符合环境友好和可持续发展理念而日益受到人们的重视。

关于柱状黄杆菌疫苗的研究，现有技术主要有两方面的报道

(1)柱状黄杆菌灭活疫苗

将柱状黄杆菌接种于相应的培养基中，25℃培养至平台期，离心集菌，收集的沉淀菌体用生理盐水稀释到一定浓度。在菌液中加入终浓度为2％的苯酚或者0.5％的福尔马林25℃灭活24h，即为柱状黄杆菌灭活疫苗。

(2)柱状黄杆菌减毒活疫苗

将柱状黄杆菌在含利福平的培养基中反复传代，经过243次传代后，培养基中利福平的含量从5μg/mL逐渐上升至200μg/mL。逐渐使柱状黄杆菌的失致病性，离心集菌，用生理盐水调整细菌浓度，即为柱状黄杆菌减毒活疫苗。

柱状黄杆菌灭活疫苗成分复杂，稳定性不强且在灭活过程中会导致部分蛋白免疫原性丧失而影响其免疫效果。柱状黄杆菌减毒活疫苗，虽然具有较好的效果，但减毒活疫苗有回复突变的危险，存在安全隐患。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防草鱼柱状黄杆菌的疫苗制备方法的制备方法及应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)合成表1所示的引物：

表1所用到的引物

(2)提取柱状黄杆菌基因组，以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版，以表1所示的引物进行PCR扩增表达片段；

(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，分别连接到pMD-18T质粒上；

(4)pMD-18T质粒分别进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取pMD-18T质粒并进行双酶切，所使用的酶如表1所示；电泳切胶回收酶切片段；

(5)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接；

(6)将连接产物使用引物maz+和clsA-进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物；

(7)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，将回收片段连接到pMD-18T载体上；

(8)对步骤(7)的pMD-18T载体进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，所使用的酶为SacI和NcoI，电泳回收酶切片段；

(9)将步骤(8)中双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET-32(a)表达载体连接；

(10)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆；

(11)取阳性克隆菌液1∶100接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.4～0.6；

(12)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超生波破碎，200W，30s超声，30s间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬；冰上放置1h，使其彻底溶解；4℃，10000g离心30min，保留上清。

(13)将树脂充分重悬，取悬液加到沉降柱中；依次3体积去离子水；5体积离子化缓冲液润洗，所述离子化缓冲液为浓度为50mmol/L的NiSO4溶液；3体积结合缓冲液润洗，所述结合缓冲液为浓度为0.5mol/L的NaCl、浓度为5mmol/LImidazole及浓度为20mmol/LTris-HCl溶液的混合溶液，该结合缓冲液的pH为7.9；待结合缓冲液降至层析介质表面时，加入制备好的上清样品，流速为每小时10倍床体积，10体积结合缓冲液漂洗，6体积漂洗缓冲液漂洗，6体积洗脱缓冲液洗脱目标产物，目标产物经得到可柱状黄杆菌基因重组疫苗。

本发明另一方面还涉及采用上述方法所制备的预防草鱼的柱状黄杆菌基因重组疫苗。

在本发明的另一方面，还涉及上述预防草鱼的柱状黄杆菌基因重组疫苗在制备预防草鱼柱状黄杆菌感染的疫苗中的应用。

在本发明的一种实施方式中，当年的鱼苗养至8-10cm时，采用本发明的柱状黄杆菌基因重组疫苗疫苗进行免疫，采取腹腔注射的方法给予，每尾注射0.2mL。在本发明的一个优选实施方式中，在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一次，免疫剂量与第一次相同。

本发明所制备的疫苗具有安全性高、免疫效果稳定、生产效率高等优点，能够有效减少由柱状黄杆菌所引发的柱形病而造成的渔业经济损失，为今后开发鱼类基因工程多联疫苗奠定基础。

附图说明

图1五个柱状黄杆菌膜相关基因抗原区序列的PCR扩增结果：1锌蛋白酶基因片段；2脯氨酸寡肽酶基因片段；3嗜热蛋白酶基因片段；4胶原酶基因片段；5硫酸软骨素AC裂解酶基因片段；6五个基因融合后的基因片段

图2：五个柱状黄杆菌膜相关基因抗原区序列连接后的融合序列的示意图；

具体实施方式

实施例1

1.表达载体的构建

(1)从Genbank下载柱状黄杆菌锌蛋白酶、脯氨酸寡肽酶、嗜热蛋白酶、胶原酶、硫酸软骨素AC裂解酶五个基因的基因序列，对其跨膜区、亲水区和抗原区域进行分析，设计并合成表1所示的引物。

表1所用到的引物

(2)使用OMEGA公司的细菌基因组提取试剂盒提取柱状黄杆菌(该菌株为商购或者从中国普通微生物保藏中心都可以获得)基因组。

(3)以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增表达片段。

(4)PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小(见图1)，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，连接到pMD-18T载体。

(5)挑取阳性克隆测序。确认序列正确之后，取5mL含氨苄(100μg/mL)LB培养基，接种阳性克隆，37℃振荡培养过夜；使用细菌质粒提取试剂盒提取的pMD-18T质粒并进行双酶切，酶切三个小时后，65℃变性10min，电泳切胶回收。

(6)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接，连接方式如图2所示。

连接体系如下：

五个基因的扩增产物(5*2μL)10μL

T4ligase(50U/μL)1μL

10×buffer1.2μL

16℃连接过夜。

(7)将连接产物稀释50倍，使用引物maz+和clsA-进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物。

(8)PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段(片段为2053bp)，将片段连接到pMD-18T载体上。

(9)挑取阳性克隆测序。确认序列正确之后，取5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基，接种阳性克隆，37℃振荡培养过夜；使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切。

酶切体系如下：

酶切三个小时后。65℃变性10min，电泳切胶回收。

(10)将双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET-32(a)表达载体连接。连接体系如下：

16℃连接过夜。

(11)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆，挑选阳性克隆，测序检查基因序列的正确性，其基因序列参见SEQIDNO.1。

2.蛋白的表达与纯化

(1)取阳性克隆菌液1∶100接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.8～1.0。

(2)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超生波破碎，200W，30S超声，30S间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬。冰上放置1h，使其彻底溶解。4℃，10000g离心30min，保留上清。

(3)将树脂充分重悬，取1mL悬液加到10mL沉降柱中。3体积去离子水；5体积离子化缓冲液润洗，所述离子化缓冲液为浓度为50mmol/L的NiSO4溶液；3体积结合缓冲液润洗，所述结合缓冲液为浓度为0.5mol/L的NaCl、浓度为5mmol/LImidazole及浓度为20mmol/LTris-HCl溶液的混合溶液，该结合缓冲液的pH为7.9；待结合缓冲液降至层析介质表面时，小心加入制备好的上清样品，流速为每小时10倍床体积，10体积结合缓冲液漂洗，6体积漂洗缓冲液漂洗，6体积洗脱缓冲液洗脱目的产物(产物的分子量为89.5KDa)，将蛋白浓度调整为0.5mg/mL，得到可直接使用的柱状黄杆菌基因重组亚单位疫苗。

3.疫苗的安全性检查

(1)无菌检验：取上述制备好的疫苗，取0.2mL涂布于营养肉汤琼脂平板，37℃培养48h，发现无细菌生长。

(2)鱼体实验：取上述制备好的疫苗，注射健康草鱼30尾，注射剂量为0.2ml/尾，同时注射鱼用生理盐水作为阴性对照。饲养30天，发现对照组和实验组都没有鱼体死亡，则表明疫苗是安全的。

4.疫苗的保护效果评价

柱状黄杆菌亚单位基因重组疫苗的保护效果评估，其具体步骤是：健康的草鱼鱼种(体长10～12cm)于室内饲养10天后，分组每尾注射0.2mL柱状黄杆菌亚单位基因重组疫苗。同时用空载体质粒表达的蛋白注射的草鱼做阴性对照，28℃饲养28天后，用柱状黄杆菌G4株做攻毒试验，测定其免疫保护率。经试验测定；其免疫保护率可达39％。(保护率公式为(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％)

5.疫苗的使用

当年的鱼苗养至8-10cm时，可进行免疫，采取腹腔注射的方法的给予，每尾注射0.2mL。条件允许的情况下，可在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一次，免疫剂量不变，可获得更高的保护率。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)合成表1所示的引物：

表1所用到的引物

(2)提取柱状黄杆菌基因组，以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版，以表1所示的引物进行PCR扩增表达片段；

(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，分别连接到pMD-18T质粒上；

(4)pMD-18T质粒分别进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取pMD-18T质粒并进行双酶切，所使用的酶如表1所示；电泳切胶回收酶切片段；

(5)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接；

(6)将连接产物使用引物maz+和clsA-进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物；

(7)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，将回收片段连接到pMD-18T载体上。

(8)对步骤(7)的pMD-18T载体进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，所使用的酶为NcoI和SacI，电泳回收酶切片段；

(9)将步骤(8)中双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET-32(a)表达载体连接；

(10)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆；

(11)取阳性克隆菌液1∶100接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.4～0.6；

(12)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超声波破碎，200W，30s超声，30s间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬。冰上放置1h，使其彻底溶解；4℃，10000g离心30min，保留上清；

(13)将树脂充分重悬，取悬液加到沉降柱中；依次3体积去离子水、5体积离子化缓冲液润洗，所述离子化缓冲液为浓度为50mmol/L的NiSO4溶液；3体积结合缓冲液润洗，所述结合缓冲液为浓度为0.5mol/L的NaCl，浓度为5mmol/LImidazole及浓度为20mmol/LTris-HCl溶液的混合溶液，该结合缓冲液的pH为7.9；待结合缓冲液降至层析介质表面时，加入制备好的上清样品，流速为每小时10倍床体积，10体积结合缓冲液漂洗，6体积漂洗缓冲液漂洗，6体积洗脱缓冲液洗脱目标产物，经过洗脱的目标产物可用于制备柱状黄杆菌基因重组疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法所制备的柱状黄杆菌基因重组疫苗。

3.权利要求2所述的柱状黄杆菌基因重组疫苗在制备预防草鱼柱状黄杆菌感染的疫苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，当年的鱼苗养至8-10cm时，采所述柱状黄杆菌基因重组疫苗进行免疫，免疫方式为采取腹腔注射的方法的给予，每尾注射0.2mL。

5.根据权利要求4所述的应用，在首次免疫后间隔一个月进行加强免疫一次，免疫剂量与第一次相同。