CN101947325B - 副溶血弧菌二价dna疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及副溶血弧菌二价DNA疫苗及其制备方法和应用，其特征是将副溶血弧菌tdh2基因和vps基因通过6个核苷酸GAATTC相连成的tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；其制备方法包括：利用双酶切技术使基因tdh2和vps获得粘性末端后相连，并克隆到原核表达载体pET28a中构建得到融合基因蛋白原核表达工程载体；再通过双酶切技术，将该融合基因插入到真核载体中构建得到融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法制成副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。本发明操作性强重复率高，安全无毒副作用，可对鱼类双重免疫保护，免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA疫苗高。

Description

副溶血弧菌二价DNA疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域的疫苗及其制备技术，涉及基因工程及免疫学。具体地说是副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法及应用。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性菌，广泛分布于近岸海水环境，能感染海水鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，是世界许多国家和地区养殖对虾和鱼类的主要致病菌，每年都给水产养殖业造成重大经济损失。该菌也是夏、秋季沿海地区海产品食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素、丝氨酸蛋白酶等。

目前已制备的副溶血弧菌疫苗，主要有全菌灭活疫苗和重组蛋白疫苗。灭活疫苗的优点是安全，但其缺点是免疫效果较差。重组蛋白疫苗由于制备过程中涉及蛋白质提取纯化等步骤而造价昂贵。

研究表明，DNA疫苗是一种在重组蛋白疫苗后兴起的新型疫苗，其原理是将疫苗抗原基因克隆于一真核表达载体中，随后将该重组载体导入所要免疫的动物体内。疫苗抗原蛋白在动物体细胞内可以持续表达合成，从而刺激机体的免疫系统，达到免疫保护目的。因此，DNA疫苗具有灭活疫苗和重组蛋白疫苗两者的优点而无其缺点。但是，DNA疫苗免疫保护率仍然较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法及应用，以克服现有技术的不足。二价DNA疫苗技术上是来源于普通DNA疫苗，其原理是将针对细菌两个重要致病因子的功能区域蛋白基因克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对同一细菌的两种不同抗原蛋白的表达。将这种二价DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，就产生针对同一细菌的两种不同抗体，其免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、有效。本发明即是采用这种技术，将副溶血弧菌的两个主要致病因子的基因融合构建于真核表达载体中，制备成二价DNA疫苗，从而达到双重抵抗副溶血弧菌对水产鱼类侵染的目的。

一种副溶血弧菌二价DNA疫苗，其特征在于：所述疫苗为副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-vps融合基因蛋白原核或真核表达工程载体疫苗，其中tdh2-vps融合基因的DNA序列为：

ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATGTTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGGTCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTGCCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTCACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGCCGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTGGTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTACGCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTTGAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAATGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTTTACCGATGCACAACTCGGCGAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATGGCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTCCCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCTACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACACTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAAACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTACGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATTTGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAATGCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGTTGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAGGCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAAAACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAACGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAAAACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA。

本发明的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法或具体步骤如下：首先制备副溶血弧菌的两个致病因子的溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps；然后利用DNA内切酶双酶切技术使目的基因获得粘性末端，再用DNA连接酶将基因tdh2和基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连，并克隆到原核表达载体pET28a中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白原核表达工程载体；同样再通过内切酶双酶切技术，将tdh2-vps融合基因插入到真核载体中构建得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体度苗；最后用常规的方法扩增培养并收获上述tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体载体，即制成副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。

一、制备上述基因tdh2和基因vps的方法：

1.以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI酶切位点的基因tdh2；

引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5′CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3′

5′CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA  3′

2.以副溶血弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI酶切位点的基因vps；

引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’

5’CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’；

二、构建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表达工程载体的步骤：

1.用基因重组方法，在载体pET28a的酶切位点BamHI和EcoRI之间插入基因tdh2，构建成载体pET28a-tdh2；

2.用基因重组方法，将基因vps克隆到载体pMD19-T Simple中，构建成载体pMD19-T Simple-vps；

3.分别将载体pET28a-tdh2和载体pMD19-T Simple-vps用EcoRI和XhoI进行双酶切，得到线性载体pET28a-tdh2和基因vps；将基因vps与线性载体pET28a-tdh2进行重组连接，构建成tdh2-vps融合基因蛋白原核表达工程载体pET28a-tdh2-vps。

将上述工程载体pET28a-tdh2-vps转化到大肠杆菌BL2 1中，培养并进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因蛋白得到表达。

三、构建tdh2-vps融合基因蛋白的真核表达工程载体的步骤：

将上述(2)构建的工程载体pET28a-tdh2-vps转化到大肠杆菌DH5α中，培养并回收载体，用引物c进行PCR，得到含有XhoI和BamHI酶切位点的融合基因tdh2-vps；引物c为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’；

1.将融合基因tdh2-vps再次克隆到pMD19-T Simple上，并转化到大肠杆菌DH5α中，扩增培养后提取载体，用XhoI和BamHI进行双酶切，得到融合基因tdh2-vps，

2.将真核载体pEGFP-N1用XhoI和BamHI进行双酶切，得到线性真核载体pEGFP-N1；

3.将融合基因tdh2-vps插入到线性真核载体pEGFP-N1酶切位点XhoI和BamHI之间，构建成tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-vps，

将tdh2-vps融合基因蛋白真核表达工程载体转入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中，培养并进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因蛋白得到表达；

四、制备副溶血弧菌二价DNA疫苗：

1.将上述所得的tdh2-vps融合基因真核表达工程载体转化到CHO细胞或大肠杆菌DH5α中，进行常规扩增培养，然后将含有tdh2-vps融合基因蛋白的真核表达工程载体提取出来，溶于0.05～0.20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200ug/ml，即得到副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液，该步骤所用器皿、材料及试剂均须无菌无热原处理；

2.按常规免疫方法，以100ul/尾的剂量对鱼类进行免疫。

本发明的副溶血弧菌二价DNA疫苗应用于鱼类，即副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液以50～200ul/尾的剂量应用于鱼类免疫。

本发明具有如下优点：在二价DNA疫苗制备过程中所使用的方法简便，实验可操作性强重复率高；并且制备过程中将融合基因先连接到原核表达载体中，有利于检验融合基因蛋白的表达情况，可以提高融合基因蛋白真核表达的效率；本二价DNA疫苗双基因融合蛋白表达，双重免疫保护；应用于鱼类的免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA疫苗高；免疫保护率高于其他类型的疫苗；使用安全无毒副作用；省时省力，只需一次免疫即可获得有效保护。

附图说明

图1：tdh2-vps融合基因蛋白原核及真核表达载体基因PCR结果电泳图。

其中M1：DL2000DNA Marker；

    M2：DL15000DNA Marker；

1：阴性对照；

2：用引物a进行PCR扩增反应的结果，即基因tdh2；

3：用引物b进行PCR扩增反应的结果，即基因vps；

4和5：用引物c进行PCR扩增反应的结果，即融合基因tdh2-vps。

图2：tdh2-vps融合基因蛋白原核表达蛋白电泳图。

其中，M：蛋白Marker；

1：基因tdh2单独表达的结果；

2：基因vps单独表达的结果；

3：tdh2-vps融合基因的表达结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如J.Sambrook et al：Molecular Cloning：ALaboratory manual(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用载体与试剂皆可从相关厂商购得。

实施例1：构建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表达设苗载体pET28a-tdh2-vps：

一、提取基因组DNA：

1、取副溶血弧菌FYZ8621.4的单菌落，接入5ml 2216E液体培养基，28℃振荡培养24小时；

3、将振荡培养好的菌液，以12000rpm离心2min收集菌体；

3、用酚-氯仿抽提法，提取得到副溶血弧菌的基因组DNA。

二、PCR反应获得基因tdh2和基因vps的方法：

1.制备基因tdh2：

(1)根据GeneBank中所收录的副溶血弧菌的热稳定溶血素亚单位基因tdh2的序列，设计了一对扩增基因tdh2的引物a，其序列为：

5′CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3′

5′CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3′

(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到570bp的PCR产物反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；如此反应30个循环；然后72℃延伸10分钟。

反应体系为：5μl的Buffer，3μl的MgCl₂，0.5μl的dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，各0.5μl的引物a，然后用灭菌去离子水补足到50μl。。

(3)PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有570bp目的片段的凝胶切下，回收纯化后得到含有BamHI和EcoRI酶切位点的基因tdh2。

2.制备基因vps：

(1)根据GeneBank中所收录的的副溶血弧菌的假定丝氨酸蛋白酶基因vps的序列，设计了一对扩增基因vps的引物b，其序列为：

5’CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’

5’CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’；

(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到1779bp的PCR产物。

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，61℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；如此反应30个循环；然后72℃延伸10分钟。

反应体系为：5μl的Buffer，3μl的MgCl₂，0.5μl的dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，各0.5μl的引物b，然后用灭菌去离子水补足到50μl。

(3)PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有1779bp目的片段的凝胶切下，回收纯化后得到含有EcoRI和XhoI酶切位点的基因vps。

三、克隆基因tdh2和基因vps：

1.克隆基因tdh2：

(1)取4.5μl纯化的基因tdh2，加入0.5μl的载体pMD19-T Simple，混合，再加入5μlDNA连接酶，于16℃连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；

(2)将基因tdh2连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有1％氨苄青霉素、40μg/ml X-gal以及、40μg/ml IPTG的LB固体培养基上37℃培养12小时；

(3)培养后利用常规的蓝白斑筛选方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后，提取基因tdh2载体DNA；

(4)以提取的基因tdh2载体DNA为模板，以引物a进行PCR反应检测，并且用BamHI和EcoRI对基因tdh2载体进行双酶切检测，筛选出含有重组载体pMD 19-T Simple-tdh2的阳性菌株。

2.克隆基因vps：

(1)取4.5μl纯化的基因vps，加入0.5μl的载体pMD19-T Simple，混合，再加入5μl DNA连接酶，于16℃连接反应16小时，得到基因vps连接产物。

(2)将上述基因vps连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有1％氨苄青霉素、40μg/ml X-gal以及、40μg/ml IPTG的LB固体培养基上37℃培养12小时。

(3)培养后利用蓝白斑筛选的方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后，提取基因vps载体DNA。

(4)依提出的上述基因vps载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并且用EcoR I和Xho I对基因vps载体进行双酶切检测，筛选出含有重组载体pMD 19-T Simple-vps的阳性菌株。

四、构建原核表达载体pET28a-vps：

1.用EcoRI和XhoI对上述重组载体pMD 19-T Simple-vps进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测后，切胶纯化回收含有基因vps的目的片段。

2.将原核表达载体PET28a也通过EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切产物同样通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后切胶回收线性载体PET28a。

3.将获得的基因vps和线性载体pET28a，通过DNA连接酶在16℃下连接反应16小时，得到基因vps连接产物。

4.将基因vps连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有0.6％卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养12小时。

5.挑取长出的菌落，接入含有0.6％卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养12小时后提取基因vps载体DNA。

6.以提出的载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并且用EcoRI和XhoI对载体进行双酶切检测，经过上述双重检测后筛选出含有重组载体pET28a-vps的阳性菌株。

7.将重组载体pET28a-vps再转化到受体大肠杆菌BL21中，通过异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测，基因vps目的蛋白能够正常表达。

五、构建tdh2-vps融合蛋白原核表达载体pET28a-tdh2-vps：

1.用BamH I和EcoR I对重组载体pMD 19-T Simple-tdh2进行双酶切，，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测后，切胶纯化回收含有基因tdh2的目的片段。

2.将已构建好的原核表达载体pET28a-vps同样用BamH I和EcoR I进行双酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后切胶回收线性载体pET28a-vps。

3.将基因tdh2与线性载体pET28a-vps通过DNA连接酶16℃连接反应16小时得到。

4.将连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有0.6％卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养12小时。

5.挑取长出的菌落，接入含有0.6％卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后提取载体DNA。

6.以提出的载体DNA为模板，分别用基因tdh2的扩增引物a，基因vps的扩增引物b进行PCR扩增检测；分别用EcoRI、XhoI以及BamHI、EcoRI这两对内切酶进行双酶切检测，筛选出了含有tdh2-vps融合基因的原核表达载体pET28a-tdh2-vps的阳性菌株，结果表明分别都得到了1779bp左右和570bp左右的目的片断。即tdh2-vps融合基因蛋白原核表达载体pET28a-tdh2-vps构建成功。

为了验证tdh2-vps融合基因在原核表达载体中能够正常表达，将重组载体pET28a-tdh2-vps再转化到受体大肠杆菌BL21中，通过异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测，得到了与预想的分子量大小相同的目的蛋白，证明该融合蛋白能够正常表达，结果如图2所示。

实施例2：构建tdh2-vps融合基因蛋白真核表达载体pEGFP-N1-tdh2-vps：

1.将连接在一起的tdh2-vps融合基因作为一个单独的基因，以上述的原核表达载体pET28a-tdh2-vps为模板，重新设计一对用来扩增tdh2-vps融合基因的引物c，其序列为：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’

2.以pET28a-tdh2-vps为模板，进行PCR反应，得到2355bp的PCR产物。其反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2分30秒；如此反应30个循环；然后72℃延伸10分钟。

其反应体系为：5μl的Buffer，3μl的MgCl₂，0.5μl的dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，各0.5μl的引物c，最后用灭菌去离子水补足50μl。

3.上述PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的片段的凝胶切下，回收后得到纯的含有XhoI和BamHI酶切位点的tdh2-vps融合基因。

4.将tdh2-vps融合基因与原核载体pMD19-T Simple连接，16℃连接反应16小时后，转化到大肠杆菌DH5α中。挑取白斑培养后提取载体DNA，经PCR反应和Xho I、BamH I双酶切检测后，筛选出含有重组载体pMD19-T Simple-tdh2-vps的阳性菌株。

5.将pEGFP-N1和pMD19-T Simple-tdh2-vps同时经Xho I、BamH I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收得到线性载体pEGFP-N1和tdh2-vps融合基因。将线性载体pEGHP-N1和tdh2-vps融合基因通过DNA连接酶进行连接，得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表达载体pEGFP-N1-tdh2-vps。

为了验证构建的真核表达载体pEGFP-N1-tdh2-vps中同时包含基因tdh2和基因vps，将含有上述真和表达的菌株接入到0.6％卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后提取载体DNA，并经PCR和双酶切检测。PCR检测结果如图1所示。

实施例3：二价DNA疫苗悬液的制备和使用

将上述实施例2所得的pEGFP-N1-tdh2-vps工程载体转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12-18小时后，提取工程载体pEGFP-N1-tdh2-vps，对此载体进行去除内毒素处理后，将载体溶于0.05mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200ug/ml，即得到副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。便可对鱼类进行免疫。以养殖的牙鲆鱼为例。免疫实验前两周购买同一批次的健康牙鲆，饲养于水箱中，通气并正常换水、投饵，水温～20℃。用本发明制备的工程载体pEGFP-N1-tdh2-vps对牙鲆进行肌肉注射免疫，注射部位为靠近背鳍的肌肉较为厚实的地方，注射剂量为100μl/尾。同时设置注射等量灭菌磷酸盐缓冲液PBS的对照组。接种后不同时间尾静脉取血，制备血清用于抗体检测。当实验牙鲆免疫接种4-5周后，用副溶血弧菌对其进行肌肉注射攻毒，攻毒后观察并记录实验牙鲆的死亡情况，其计算相对免疫保护率RPS为80％。

Claims (5)

1.一种副溶血弧菌二价DNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗为副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-vps融合基因原核或真核表达工程载体疫苗，其中tdh2-vps融合基因的DNA序列为：ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATGTTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGGTCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTGCCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTCACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGCCGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTGGTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTACGCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTTGAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAATGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTTTACCGATGCACAACTCGGCGCAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATGGCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTCCCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCTACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACACTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAAACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTACGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATTTGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAATGCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGTTGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAGGCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAAAACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAACGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAAAACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA 。

2.权利要求1所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，首先制备副溶血弧菌的两个致病因子的溶血素亚单位基因tdh2和丝氨酸蛋白酶基因vps；然后利用DNA内切酶双酶切技术使目的基因获得粘性末端，再用DNA连接酶将基因tdh2和基因vps通过6个核苷酸GAATTC相连，并克隆到原核表达载体pET28a中构建得到tdh2-vps融合基因原核表达工程载体；同样再通过内切酶双酶切技术，将tdh2-vps融合基因插入到真核载体中构建得到tdh2-vps融合基因真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法扩增培养并收获上述tdh2-vps融合基因真核表达工程载体，即制成副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。

3.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述tdh2-vps融合基因原核表达工程载体的构建方法：

首先制备基因tdh2和基因vps：

以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI酶切位点的基因tdh2；引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5′CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3′

5′CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA  3′

以副溶血弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI酶切位点的基因vps；引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC3’

5’CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’

构建tdh2-vps融合基因的原核表达工程载体：

在载体pET28a的酶切位点BamHI和EcoRI之间插入tdh2，构建成载体pET28a-tdh2；

在载体pMD19-T Simple的酶切位点EcoRI和XhoI之间插入vps，构建成载体pMD 19-T Simple-vps；

分别将载体pET28a-tdh2和载体pMD19-T Simple-vps用EcoRI和XhoI进行双酶切，得到线性载体pET28a-tdh2和基因vps；

将基因vps与上述线性载体pET28a-tdh2进行重组连接，构建成tdh2-vps融合基因原核表达工程载体pET28a-tdh2-vps；

将上述工程载体pET28a-tdh2-vps转化到大肠杆菌BL21中培养并进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，tdh2-vps融合基因得到表达。

4.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述的tdh2-vps融合基因真核表达工程载体的构建方法：

将上述权利要求3构建的工程载体pET28a-tdh2-vps转化到大肠杆菌DH5α中，培养回收载体，用引物c进行PCR反应，得到含有XhoI和BamHI酶切位点的tdh2-vps融合基因；引物c为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA  3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT  3’

将tdh2-vps融合基因再次克隆到载体pMD19-T Simple上，转化到大肠杆菌DH5α中，提取载体后用XhoI和BamHI进行双酶切，得到融合基因tdh2-vps；

将融合基因tdh2-vps与经XhoI和BamHI进行双酶切处理过的载体pEGFP-N1进行重组连接，构建成tdh2-vps融合基因真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-vps。

5.如权利要求2所述的副溶血弧菌二价DNA疫苗的制备方法，其特征是上述副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液的制备：

将上述所得的tdh2-vps融合基因真核表达工程载体转化到CHO细胞或大肠杆菌DH5α中，进行常规扩增培养，然后将含有tdh2-vps融合基因真核表达工程载体提取出来，溶于0.05～0.20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200ug/ml，即得到副溶血弧菌二价DNA疫苗悬液。

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