CN104357458A - 一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组PotD蛋白及其制备方法。本发明重组PotD蛋白良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的PotD特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白PotD是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗。

Description

一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis，HPS)引起家猪及藏猪的一种泛嗜性细菌性传染病，又称“革拉瑟氏病”(Glasser’s Disease)。随着规模化、集约化猪场的发展,副猪嗜血杆菌引起的以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病给养猪业带来巨大的经济损失,副猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为世界范围的重要疾病。

我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。

我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。

PotD(Polyamine transport protein聚胺转运蛋白)参与大肠埃希氏菌生物膜的形成，属于ATP-结合匣(ATP-binding cassette)中的聚胺转运系统中的一员，该系统包含PotA，B，C和D，他们同属于亚精胺偏爱性的转运蛋白；而PotF，G，H和I则属于盐酸丁二胺偏爱性的转运蛋白。聚胺和盐酸丁二胺则是构成体内多价阴离子化合物的重要组成，普遍存在于包括原核生物在内的生物体内。细胞内聚胺过多或者过少都将造成细胞损害。同时发现，PotABCD中的任何一员缺失，都将导致整个转运系统无法转运聚胺，特别是亚精胺^[8]。因此作为聚胺转运系统中的重要一员，PotD对细菌的生长调节至关重要。

目前未见重组表达PotD基因的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组PotD蛋白及其制备方法。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pET28a质粒。

本发明重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明重组PotD蛋白，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明制备重组PotD蛋白的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2～1.5mmol/L，25～42℃诱导表达1～7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.0mmol/L，诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。

步骤ⅱ中，分离纯化的方法是：取沉淀，用的包涵体洗涤液重悬，离心，弃上清，重复前述步骤2次，即可；其中，包涵体洗涤液包含如下浓度的成分：50mmol/L Tris－HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton。

本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白PotD。该重组蛋白PotD具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的PotD特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，保护率高达80％，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，可以制备成为亚单位疫苗，预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1重组蛋白表达诱导时间的优化。其中M为高分子量蛋白预染marker(购自Tiangen公司)，1是未诱导的PET28a-potD-BL21在0h下的蛋白表达情况，2-9分别为IPTG诱导0h-7h下蛋白的表达情况；

图2重组蛋白表达IPTG浓度的优化。其中M为高分子量蛋白marker(购自Tiangen公司)，其中1是未诱导的PET28a-potD-BL21在培养5h后的蛋白表达情况，2-9分别为不同IPTG浓度诱导5h后蛋白的表达情况；

图3重组蛋白表达诱导温度的优化。其中M为高分子量蛋白marker，1、2分别25℃下未诱导和诱导后的蛋白表达情况，3、4分别30℃下未诱导和诱导后的蛋白表达情况，5、6分别37℃下未诱导和诱导后的蛋白表达情况，7、8分别42℃下未诱导和诱导后的蛋白表达情况；

图4表达产物的SDS-PAGE检测。其中M为高分子量蛋白marker，1为未诱导的PET28a-BL21，2为诱导后的PET28a-BL21；3、4、5为PET28a-PotD-BL21经过IPTG诱导之后表达的蛋白，其中3为超声破碎前的全菌蛋白，4为破碎后的上清蛋白，5为纯化后的PotD蛋白；

图5纯化后的PotD蛋白Western-blot检测结果；

图6攻毒后各组保护率情况统计。

具体实施方式

1、质粒与菌株

PET-28a(+)质粒、感受态大肠杆菌DH5α和BL21，商购。

副猪嗜血杆菌CVCC3361，来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361。

2、主要试剂及缓冲液

氯化钠、碳酸钠、无水乙醇、乙酸、醋酸钠(均购自成都市科龙化工试剂厂)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，购自北京Biotopped公司)，小牛血清(购自上海GIBCO公司)，TSB培养基、TSA培养基(均由上海碧迪医疗器械有限公司代购)，酵母提取物、胰大豆蛋白胨(均购自英国OXOID公司)，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(购自SIGMA公司)，羊抗鼠二抗、诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，购自BIOSHARP)，2×Taq PCR Master Mix(均购自Tiangen)，DL10000DNA marker、DL2000DNA marker、Premixed ProteinMarker(High)、T-Vevor pMD19、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ(均购自Takara)，小量质粒抽提试剂盒(Plasmid Mini KitⅠ)、胶回收试剂盒(GelExtraction Kit)(均购自美国OMEGA公司)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Albumin Bovine V(牛血清白蛋白)(均购自北京Solarbio公司)，T4连接酶(购自NEW ENGLAND BIOLABS)，GoldView(购自赛百盛)，琼脂糖(购自法国Biowest公司)，kanamycin Sulfate(Kan卡那霉素)、Ampicillin Na(氨苄青霉素钠)、枪头、移液枪、EP管等耗材(均由雅安万科公司代购)。

LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.2-7.4，高压蒸汽灭菌30min。

包涵体洗涤液(50mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton)

包涵体溶解液(50mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5mol/L NaCl，8mol/L尿素，0.2mmol/L DTT或100mmol/Lβ-巯基乙醇，2％Triton)

3、实验动物

SPF昆明小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

实施例1本发明副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原PotD的制备

1、重组表达

1.1PotD基因的克隆及表达载体的构建

1.1.1引物设计及合成

按照GenBank上已发表的副猪嗜血杆菌PotD基因序列，利用Primer 5.0软件，设计了一对特异性引物进行PCR扩增。引物序列如下：

上游引物(5'--3')：GGATCCCATCTTTATACTTGGACAGA(划线为BamHⅠ酶切位点)

下游引物(5'--3')：CTCGAGTTACTTCGCAGCTTTTAACT(划线为XhoⅠ酶切位点)

设计的引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成

1.1.2PotD基因的PCR扩增

利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取副猪嗜血杆菌CVCC3361的基因组。以副猪嗜血杆菌CVCC3361基因组DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增。扩增体系：

材料	体积
		模板	1μl
引物(上、下游)	2μl
		E×Taq MasterMix	25μl
ddH2O	22μl
		总体积	50μl

反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min30s，进行30个循环；再72℃延伸10min；4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒对电泳后的PCR片段进行胶回收纯化(按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作)，将纯化后的PCR片段进行测序。

纯化后的目的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

也可以采取合成的方式直接合成目的基因片段。

1.1.3表达载体的构建

1.1.3.1线性载体质粒与目的片段的连接

将回收的PCR产物与克隆载体pMD19T按如下反应体系进行混合：PCR回收产物3.5μl，pMD19T载体1μl，T4DNA Ligase0.5μl，2×Buffer 5μl。混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16℃连接过夜。PCR快速鉴定连接产物，连接后的产物立即用来转化感受态细胞。

1.1.3.2重组克隆质粒的转化、筛选与鉴定

a、转化：用移液枪取-70℃冻存的感受态细胞50μl于冰上溶解，加入重组克隆质粒10μl混匀，-20℃冰浴30min,42℃水浴锅中热激90s，迅速在-20℃冰浴5min。

b、筛选：转化完后，在无菌EP管中迅速加入约600μl LB培养基，混匀，37℃恒温摇床(180r/min)上培养1.5h。在此期间，用诱导剂IPTG(8μl，50mg/ml)和生色底物X-gal(参考值20μl,20mg/m1)铺氨苄平板(60mM)。取复壮后菌液100μl涂于氨苄平板上，正置37℃孵育约30min，待液体被培养基吸收后，倒置平板，37℃培养过夜。进行蓝白斑筛选。

c、鉴定：挑取平板上的单个白色菌落于含Amp抗性的LB液体培养基中37℃220r/min过夜培养，次日进行快速PCR鉴定。

1.1.3.3克隆阳性产物鉴定

采用OMEGA质粒小提取试剂盒对重组克隆质粒转化的感受态细胞进行质粒抽提。以重组质粒为模板，分别用相应基因引物进行PCR扩增，随后用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观察结果。重组质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切和单酶切，酶切体系试质粒浓度而定，双酶切37℃3h，单酶切37℃1h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，紫外线下观察结果。

将初步鉴定为阳性的重组质粒菌送出进行序列测定。采用软件对测定的核苷酸序列及编码氨基酸进行分析比对，检查阅读框架的正确性。

将成功构建好的质粒命名为pMD19T-PotD。

1.1.3.4重组表达质粒的构建

用相同的限制性内切酶双酶切表达载体pET28a和重组克隆质粒，回收双酶切后pET28a大片段和目的基因片段。目的基因产物与pET28a大片段进行16℃过夜连接，连接体系如下：pET28a大片段2.5μl，10×T4 Buffer 1μl，目的基因6μl，T4 DNA ligase 0.5μl，即得重组表达质粒pET28a-PotD。

1.1.4重组菌的构建

1.1.4.1重组表达质粒的转化

用移液枪取-70℃冻存的感受态细胞50μl于冰上溶解，加入重组表达质粒5μl混匀，-20℃冰浴30min,42℃水浴锅中热激90s，迅速在-20℃冰浴5min。加入800ul无抗性的LB液体培养基于37℃空气摇床下培养1h，转速为180r/min；再取培养液200ul(可4000rpm离心3min后取下层菌液)均匀涂布于含有50μg/ml Kan(卡那)的LB固体培养基上，于37℃恒温箱培养12-24h。

1.1.4.2转化菌的筛选及鉴定

挑取单个菌落进行PCR反应鉴定。并采用OMEGE质粒小提取试剂盒抽提质粒，再以重组表达质粒为模板，分别用相应基因引物进行PCR扩增，随后用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观察结果。重组质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切和单酶切，酶切体系试质粒浓度而定，双酶切37℃3h，单酶切37℃1h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，紫外线下观察结果。将初步鉴定为阳性的重组质粒菌送出进行序列测定。采用软件对测定的核苷酸序列及编码氨基酸进行分析比对，检查阅读框架的正确性。鉴定正确的重组质粒，转化感受态BL21，即得工程菌PET28a-PotD-BL21。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

1.2.1重组蛋白初表达及鉴定

①在含50μg/ml Kan的LB琼脂培养基上划线接种含有pET28a与重组表达质粒的表达菌，37℃培养过夜。

②各自挑取生长良好的单个菌落于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃280r/min振荡培养，使菌液OD600值达到0.5～0.6。

③分别吸取诱导前菌液1ml于1.5ml的离心管中，12000g/min离心1min，尽弃上清后置于冰中待用。剩余菌液中分别加入IPTG至终浓度1mM，诱导培养约4h。

④分别取样1ml离心后置于冰中待用。

⑤样品中分别加入1×SDS凝胶上样缓冲液100μl，沸水中煮5min，12000g/min离心1min，取15μl上清液上样电泳，加入蛋白质Marker作为参照。凝胶经考马斯亮兰染色后进行脱色，利用凝胶成像系统照相分析。

1.2.2重组蛋白表达条件的优化

1.2.2.1诱导时间的优化

将重组菌以1:100的比例分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基试管中，待培养至OD600＝0.6左右后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，分别在诱导0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h时取菌液1ml，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.2.2IPTG浓度的优化

将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基试管中，37℃剧烈振荡培养至OD600＝0.6左右，分别加入IPTG至终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L，诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.2.3诱导温度的优化

将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，待培养至OD600＝0.6左右后，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳IPTG浓度，分别在25℃、30℃、37℃、42℃诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.3重组蛋白的大量表达

将重组菌PET28a-PotD-BL21以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，培养至OD600＝0.6左右。在菌液中加IPTG至终浓度为最佳诱导表达的浓度，而后在最佳温度下培养最佳时间后，取1ml菌液12000rpm/min离心，弃上清，200μl PBS重悬。加2×Loading buffer后沸水变性5min，SDS-PAGE电泳以检测蛋白表达情况。其余菌液离心收集菌体于-20℃保存。

1.3分离纯化

诱导表达后的菌液4℃，10000rpm/min离心10min，沉淀用30ml 50mMTris-HCl(pH＝8.0)悬浮，冰浴超声波破碎菌体间歇进行20次左右(根据菌体浓度和体积而定)，每次30s，将破碎后的菌体4℃，10000rpm/min离心10min，沉淀用80ml含2M尿素的包涵体洗涤液，于漩涡振荡仪振荡，悬浮沉淀，再12000g/min离心10min弃掉上清液，重复此步骤2次，所得沉淀即为目的蛋白。

将前述沉淀用含有8M尿素的包涵体溶解液，于漩涡振荡仪振荡至沉淀完全溶解，可于-70℃保存备用。

2、测定

2.1SDS-PAGE检测

①按照试剂盒配方配制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。

②按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75mm间隙15孔的上样量<10uL/孔，1mm间隙10孔的上样量<20ul/孔。上样量根据实际经验自己掌握。

③打开电源将电压调到80V(一般15min左右)，待样品跑过浓缩胶后将电压调到120V至样品电泳到距胶底部0.5cm为止。

将凝胶小心取下放入容器中，加入考马斯亮蓝染色液，用摇床摇2-3h。

⑤待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。

⑥将脱色液倒掉，用相应的凝胶成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。

3、测定结果

如图1～3所示，诱导表达时，IPTG最佳浓度为1.0mmol/L下，诱导温度最佳为30℃，最诱导时间最佳为5h。

如图4所示，诱导后的PET28a-potD-BL21在40KD左右有目标蛋白PotD的表达，主要以包涵体的形式存在，同时经过分离纯化获得了纯品重组蛋白PotD。

重组蛋白PotD的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为：

实验结果说明，本发明通过基因工程的方式，重组表达得到了重组蛋白PotD。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明重组蛋白PotD的免疫反应性分析

1、实验方法

采用western-blot方法测定重组蛋白PotD的免疫反应性。其中一抗由预实验制备，即用纯化后的PotD蛋白免疫家兔，之后采集其血液并获得血清，当抗体效价达到1:32时即可作为检测用抗血清。

Western-blot具体步骤为：根据胶的大小剪出一片NC膜，膜的大小应略微小于胶的大小。将膜置于双蒸水中浸泡1分钟，再移至转移缓冲溶液中待用。在一浅盘中打开转移盒，将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛孔板上，在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的3层滤纸，小心地将胶板放在3层滤纸上，并注意排除气泡。将NC膜放在胶的上方同时注意排除气泡，再在膜的上方放上一张同样用转移缓冲溶液浸湿过的3层滤纸并赶出气泡，放置另一张浸泡过的海绵垫，关闭转移盒。将转移盒按照正确的方向放入转移槽中，转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色端，转移盒的白色筛孔板贴近转移槽的白色端，填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡；连接电源，在4℃条件下维持恒压20V，电转25min；断开电源，将转移盒从转移槽中移出，将转移盒的各个部分分开。用镊子将PVDF膜小心放入一个干净的容器中，用TBS缓冲溶液进行短暂清洗，从膜上剪下一条宽约5mm的膜放入另一个干净的容器中。将这条膜在染色液中浸泡1分钟，然后在脱色液中脱色30min，确定蛋白质已经转移到NC膜上；下面进行膜封闭和清洗，对于没有进行染色的膜，首先倒出TBS缓冲溶液，加入封闭液，37℃轻轻摇动1h。倒掉封闭液，并用TBS缓冲溶液清洗3次，每次5min。倒掉TBS缓冲溶液，加入封闭液稀释的兔抗PotD一抗(预实验进行一抗稀释度的优化)，37℃轻轻摇动1小时。倒出一抗稀释液，用TBS缓冲溶液清洗两次，每次10min；再倒出TBS缓冲溶液，加入封闭液稀释的羊抗兔二抗IgG(1:1000稀释，购自博奥森)。37℃轻轻摇动30min，倒出二抗稀释液，用TBS缓冲溶液清洗两次，每次10min；倒掉TBS缓冲溶液，并加底物反应液，轻轻摇动PVDF膜，观察显色情况，当能够清晰的看到显色带时，用蒸馏水在30min内分三次清洗PVDF膜以终止显色反应的继续进行；最后将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量。

2、实验结果

实验结果如图5所示：本发明重组蛋白PotD与免疫血清充分反应后，在重组蛋白的位置有特异性显色条带，证实了该蛋白具有良好的反应原性。

实验例2本发明重组蛋白PotD的体内保护效果

一、实验方法

1副猪嗜血杆菌CVCC3361半数致死量(LD₅₀)的测定

1.1LD₀和LD₁₀₀的测定

10只小鼠为一组，每只小鼠腹腔注射活菌液1.0×10⁹CFU(预实验中估计的LD₀)，7天后统计小鼠死亡情况，若死亡两只或两只以上，则攻毒剂量减少0.1×10⁹CFU，若全部存活，则攻毒剂量增加0.1×10⁹CFU，直至一组小鼠中只有一只死亡为止，则与此相临的低剂量即为LD₀。同法求得LD₁₀₀。

1.2实验组攻毒剂量的确定

将小鼠随机平均分为7组，每组小鼠均为10只，其中7组为对照组，1-6组为试验组。按下列公式求出r值，其中G为组数，Dm/Dn为LD₁₀₀与LD₀之比。则试验组的攻毒剂量分别为D1＝Dn＝LD₀，D2＝D1×r，D3＝D2×r，D4＝D3×r，D5＝D4×r，D6＝D5×r。按照上述剂量攻毒后，观察记录小鼠的死亡情况。

1.3LD₅₀的计算

通过Bliss-LD₅₀软件计算LD₅₀，在程序中输入各组攻毒剂量、动物数、死亡数，不用输入对照组数据，单击“计算”即可显示副猪嗜血杆菌CVCC3361对小鼠的LD₅₀等参数。通过计算，副猪嗜血杆菌CVCC3361的LD₅₀为1.4×10⁹cfu。

2免疫动物抗体效价测定及保护性研究

2.1表达蛋白PotD的定量

将纯化后的PotD蛋白与作为标准样品并且等比稀释的BSA蛋白于浓缩胶page上85v电泳15min，采用Bio-Rad凝胶成像系统测定PotD蛋白的吸光值并与标准样品进行对比，从而测得纯化后的Pot蛋白溶液的浓度。试验测得PotD蛋白浓度为3mg/mL，以此作为免疫剂量的依据。

2.2动物分组

将小鼠随机平均分为4组，每组10只，分别为阴性对照组，佐剂对照组，副猪嗜血杆菌CVCC3361灭活菌苗组和蛋白PotD免疫组。

2.3动物的免疫、抗体效价测定及攻毒保护试验

分组免疫，其中阴性组腹腔注射生理盐水；佐剂对照组一免用完全弗氏佐剂，二免用不完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射；副猪嗜血杆菌CVCC3361灭活菌苗组则用甲醛灭活并乳化的副猪嗜血杆菌CVCC3361；实验组用表达蛋白PotD乳化免疫，一免用完全弗氏佐剂乳化，二免用不完全弗氏佐剂乳化，免疫计量为50微克/只，即取135μlPotD蛋白溶液，加115μl生理盐水，与佐剂1:1乳化，对小鼠腹腔注射0.5μl/只。免疫7天后，对小鼠进行断尾采血，并进行一次加强免疫，加强免疫7天后对老鼠断尾采血测定抗体效价(间接Elisa法)。当抗体效价较高时，用副猪嗜血杆菌CVCC3361对小鼠进行攻毒，攻毒剂量为(5×LD₅₀)。观察小鼠的临床症状，统计小鼠的死亡率，确定其各自免疫保护性。

二、实验结果

1、鼠血清抗体检测

结果图表1所示：

表1 Elisa检测小鼠血清抗体水平

可以看出，PotD免疫组的抗体滴度明显高于阴性对照组和阳性对照组，说明表达的PotD具有良好的免疫原性。

2、攻毒保护试验

实验结果如表2和图6所示：

表1攻毒保护试验结果

由如表1和图6可以看出，对各组进行攻毒试验中，其中生理盐水组和佐剂对照组在攻毒24h后小鼠全部死亡，而副猪嗜血杆菌CVCC3361灭活苗在24h时死亡一只，48h后又死亡一只，之后小鼠不再死亡，蛋白PotD组则在24h时死亡2只，之后不再死亡，保护率达到80％。

结果说明，本发明PotD免疫能显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌强毒菌株的攻击，免疫保护性较好，保护率高达80％，保护效果与全菌灭活疫苗相当。

综上，本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白PotD。该重组蛋白PotD具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的PotD特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白PotD是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗，临床应用前景良好。

Claims (10)

1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pET28a质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。

6.一种重组PotD蛋白，其特征在于：它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

7.根据权利要求6所述的重组PotD蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种制备权利要求6或7所述重组PotD蛋白的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2～1.5mmol/L，25～42℃诱导表达1～7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取沉淀，分离纯化，即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.0mmol/L；诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法如下：取沉淀，用的包涵体洗涤液重悬，离心，弃上清，重复前述步骤2次，即可；其中，包涵体洗涤液包含如下浓度的成分：50mmol/L Tris－HCl，0.5mol/L NaCl，2mol/L尿素，2％Triton。