CN104004068A

CN104004068A - 具有免疫保护作用的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN104004068A
Application number: CN201410274004.9A
Authority: CN
Inventors: 张亦陈; 刘逸尘; 耿绪云; 蒋嫣冉; 孙金生
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明以感染牙鲆并具有接近100%致死率的β诺达病毒为对象，利用引物设计，将亲和纯化所需的His标签连接在重组的该病毒衣壳蛋白的C端，构建表达载体，确保纯化获得的表达产物均为具有序列表SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的完整翻译的衣壳蛋白；利用BL21(DE3)plyS宿主菌可获得目的蛋白高效表达，产物采用SDS-PAGE及质谱分别进行分离和鉴定质控；在4℃条件下，使用尿素和PBS浓度分别为0.8M和0.05M，pH为7.0的缓冲液，可对包涵体高效复性。目前针对感染牙鲆的β诺达病毒尚无有效防御方法，使用本发明制备的重组衣壳蛋白进行常规免疫后，可显著提高养殖牙鲆对该病毒的抵抗力；本方法与从染病宿主体内分步纯化相比，具有产量大，批次稳定，且不受原料限制等优势，具有良好应用前景。

Description

具有免疫保护作用的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白及其制备方法

本专利申请由天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室完成，得到国家科技支撑计划（2011BAD13B04，2011BAD13B07）国家973项目（2012CB114405）国家863项目（2012AA092205， 2012AA10A401）以及国家自然科学基金（30901094）的资助。

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，涉及一种可用于提高养殖牙鲆对β诺达病毒免疫力的重组蛋白的高效制备方法。更具体地说：是可感染牙鲆的β诺达病毒的衣壳蛋白表达载体构建，产物纯化，复性条件优化以及免疫保护效果评价。

背景技术

诺达病毒(Nodaviradae)亦称神经坏死病毒（Nervous Necrosis Virus，NNV）可分为主要感染昆虫的α诺达病毒属(Alphanodavirus)以及以鱼类为主要感染对象的β诺达病毒属(Betanodavirus)(刘传凤等，2011)，其中β诺达病毒根据来源、感染宿主以及致病性等方面的不同又可分为多种类型。β诺达病毒衣壳蛋白具有大量抗原表位，能诱导宿主产生保护性抗体，因此可通过体外表达该病毒的衣壳蛋白来研制抗病毒疫苗(Hegde et al，2002)。虽然不同β诺达病毒株系衣壳蛋白之间具有较高的相似性，但也存在显著地差异，主要原因是该病毒复制自身基因组所依赖的聚合酶RdRp校正能力弱，容易引发突变，从而产生针对不同宿主细胞表面受体的表位，因此该病毒具有多种类型，可分别侵染不同的宿主。基于β诺达病毒这一特点，有必要研制有针对性的疫苗产品，以提高保护效率；另一方面也可为进一步研究其与特定宿主细胞表面相互识别及结合位点的信息提供参考。近年来已有一些研究尝试利用原核表达系统制备β诺达病毒衣壳蛋白。陈晓艳等(2005)将斜带石斑鱼(Epinephlus coioides)神经坏死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus，OGNNV)衣蛋白基因连接到pet32a表达载体，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，表达获得分子量为55.3kDa的融合蛋白。苏友禄等(2010)将赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)神经坏死病毒(RGNNV)主衣壳蛋白(MCP)基因进行原核重组表达，得到分子量约为44.5kDa的重组蛋白。Tanaka等(2001)将七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus Thunberg)β诺达病毒的MCP基因在大肠杆菌中进行了融合表达，提取包涵体溶液免疫动物后，用不同滴度的病毒液进行攻毒。低剂量病毒攻毒组的相对存活率达69%—88%，平均为78.5%，高剂量病毒攻毒组的相对存活率为35%-37%，因此可利用重组β诺达病毒衣壳蛋白制备疫苗。本研究针对感染牙鲆的β诺达病毒，利用大肠杆菌表达系统，构建用于制备该病毒衣壳蛋白的表达载体RNA2-Pet21a，转化BL21 (DE3) ply sS后经诱导表达获得约37kDa的重组蛋白，质谱鉴定为β诺达病毒衣壳蛋白，这将有助于进一步研制有针对性的疫苗或检测制品。

工业生产重组蛋白药物，一半以上是在大肠杆菌中表达的，并多以包涵体形式存在，因此，复性过程对生产效率和生产成本至关重要，对工业生产影响巨大(冯小黎，2001；吴正辉等，2008)。通常，天然构象的蛋白较包涵体形式具有更多的抗原表位，免疫原性亦更高，因此利用复性后的衣壳蛋白有望获得更佳的免疫效果，但目前对于重组该病毒衣壳蛋白的包涵体复性条件的分析鲜有报道。

发明内容

本研究构建的β诺达病毒衣壳蛋白表达载体转化宿主菌，经诱导表达后利用SDS-PAGE分析发酵液以及菌体裂解液等组分，发现表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在，这与已报道的一些β诺达病毒衣壳蛋白重组表达结果一致(陈晓艳等，2005；苏友禄等，2010)。产物经镍离子亲和柱纯化后得到目的蛋白的单一的条带，在此基础上，尝试了对重组蛋白的包涵体进行复性条件的优化。通过正交试验着重分析了4种关键因素对复性效果的影响，数据分析中极差是反映试验因素影响的关键参数，极差越大表明其对试验结果的影响越大，本研究中极差最大的为B，说明尿素对该包涵体复性的影响较大，其次是复性缓冲液pH值，PBS浓度和温度相对影响较小。复性后蛋白浓度最高的因素组合为A1B1C1D1，即在4℃条件下，利用PBS浓度0.05M，尿素浓度为0.8M，pH为7的缓冲液对包涵体进行稀释复性可以获得较好的效果，其蛋白复性率为17.24%，是较理想的复性条件。本研究成功构建了β诺达病毒衣壳蛋白原核表达载体，实现重组蛋白高效表达，并优化了复性条件，表达产物经检测对养殖牙鲆具有显著地免疫保护效果，本发明可为今后批量放大生产提供技术支持，亦可为同类研究提供重要参考。

本发明的技术内容如下：

本发明公开了一种牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白，其特征在于它为感染牙鲆的β诺达病毒衣壳蛋白，具有序列表SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.2

MVRKGEKKLAKPATTKAANPQPRRRANNRRRSNRTDAPVSKASTVTGFGRGTNDVHLSGMSRISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPRLGHAARIFQRYAVETLEFEIQPMCPANTGGGYVAGFLPDPTDNDHTFDALQATRGAVVAKWWESRTVRPQYTRTLLWTSSGKEQRLTSPGRLILLCVGNNTDVVNVSVLCRWSVRLSVPSLETPEETTAPIMTQGSLYNDSLSTNDFKSILLGSTPLDIAPDGAVFQLDRPLY IDYSLGTGDVDRAVYWHLKKFAGNAGTPAGWFRWGIWDNFNKTFTDGVAYYSDEQPRQILLPVGTVCTRVDSENHHHHHHStop

本发明同时也公开了牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1 所示的碱基序列。

SEQ ID No.1

ATGGTACGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGGCCGCGAATCCGCAACCCCGCCGACGTGCTAACAATCGTCGGCGTAGTAATCGCACTGACGCACCTGTGTCTAAGGCCTCGACTGTGACTGGATTTGGACGTGGGACCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATGTCGAGAATCTCCCAGGCCGTCCTCCCAGCCGGGACAGGAACTGACGGATACGTCGTTGTTGACGCAACCATCGTCCCCGACCTCCTGCCACGACTGGGACACGCTGCTAGAATCTTCCAGCGATACGCTGTTGAAACACTGGAGTTTGAAATTCAGCCAATGTGCCCCGCAAACACGGGCGGTGGTTACGTTGCTGGCTTCCTGCCTGATCCAACTGACAACGACCACACCTTCGACGCGCTTCAAGCAACTCGTGGTGCAGTCGTTGCCAAATGGTGGGAAAGCAGAACAGTCCGACCTCAGTACACCCGTACGCTCCTCTGGACCTCGTCGGGAAAGGAGCAGCGTCTCACGTCACCCGGTCGGCTGATACTCCTGTGTGTCGGCAACAACACTGATGTGGTCAACGTGTCGGTGCTGTGTCGCTGGAGTGTTCGACTGAGCGTTCCATCTCTTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACACCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTGGACCGTCCGCTGTCCATTGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGACCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTGCACCAGGGTTGACTCGGAAAACCACCACCACCACCACCACTAA

本发明还公开了牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白体外重组表达体系，其特征在于利用原核表达系统进行抗菌蛋白体外重组表达的体系，该体系中用于抗菌蛋白重组的表达载体为RNA2-Pet21a，宿主菌为BL21 (DE3) ply S；该体系能够以可控诱导的方式高效地表达重组的病毒衣壳蛋白。

本发明所述牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白体外重组表达体系，针对感染牙鲆的β诺达病毒的衣壳蛋白原核表达重组蛋白的高效复性的缓冲液系统，4℃条件下，pH7.0复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8M和0.05M，可以有效地实现这种类型重组蛋白的复性。

本发明进一步公开了牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白在有效增强养殖牙鲆对β诺达病毒的抵抗力方面的应用。

试验结果表明：采用本发明建立的方法将构建的表达载体RNA2-Pet21a转化BL21 (DE3) ply S宿主菌，诱导表达后经亲和纯化产物产量可达36mg/L；在4℃条件下采用尿素和PBS含量分别为0.8M和0.05M，pH7.0的缓冲液可以获得17.24%的复性率，具备了批量制备的基础；另一方面，使用该重组衣壳蛋白对养殖牙鲆进行常规注射免疫，可获得51.52%的免疫保护率，因此本发明建立的方法可用于批量制备提高牙鲆对β诺达病毒抵抗力的疫苗类免疫保护制品。

本发明更加详细的技术方案如下：

1．重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白的表达载体RNA2-Pet21a的构建：

（1）根据牙鲆β诺达病毒序列（Genbank号：KF841612）设计PCR引物，

正向引物NYQf0001e：序列为5’- CATATGGTACGCAAAGGTGAG-3’，下划线为NdeI酶切位点；反向引物NYQr1014He：序列为5’-AAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT-3’，下划线为HindIII酶切位点；

（2）以天津市水生动物疫病预防控制中心保存的还有牙鲆β诺达病毒基因组RNA2节段完整cDNA序列的质粒载体RNA2-PMD18T为模板（对外可以免费提供），利用（1）中所述引物扩增病毒衣壳蛋白编码区，扩增产物载入pMD-18 T载体进行测序确认；

（3）将确认无误的序列经NdeI和HindIII酶切后连入Promega公司的Pet21a质粒载体相应酶切位点，构建表达载体RNA2-Pet21a；

2．重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白原核表达产物的分离和鉴定：

将RNA2- Pet21a质粒转化表达菌株BL21 (DE3) ply S（来源：购自全式金生物科技有限公司），挑取阳性克隆接种于含有氨苄和卡那抗性的LB（成分：每升LB培养基含有10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g氯化钠，氨苄终浓度为100μg/ml）液体培养基中，37℃震荡培养至OD = 0.5-0.6，取1mL未诱导菌液作为对照，其余加入IPTG至终浓度为1mM，分别于诱导0.5h、1h、2h、3h、4h、5h收集菌液，10000g离心2min，弃上清。用PBS清洗沉淀后，10000g离心2min加入1mL Lysis Buffer (50mM NaH₂PO₄.2H₂O，300mM NaCl，10mM Imidazole)，进行超声破碎，程序为: 400W，5s/次，间隔5s，破碎5min，至半透明。4℃10000g离心20min，收集上清与沉淀，分别适量加1×SDS上样缓冲液，煮沸10min，10000g离心1min后，取上清经15% SDS-PAGE分离，将目的条带切下送华大生物科技公司进行质谱鉴定。

3．重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白包涵体纯化以及复性条件的优化：

（1）将1L诱导表达的重组菌液经10000r/min离心10min收集菌体，按1g湿菌10mL BufferA破碎缓冲液(含1% TritionX-100，2mMEDTA)的比例重悬菌体，冰浴超声破碎3次。破碎后溶液4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。BufferB洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄.2H₂O，，5mM Imidazole，2mM Urea，pH 7.4)洗涤沉淀3次，可得初步纯包涵体。上述包涵体经WashI buffer (500mM NaCl，20mM Imidazole，20mmol PB，8M Urea)溶解，涡旋振荡20min，4℃，10000r/min离心10min，上清经0.22μm滤膜过滤后结合于镍离子亲和柱纯化，具体操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手册进行，纯化产物产量可达36mg/L。

(2)利用正交试验优化重组蛋白的稀释复性条件。以盐离子浓度即PBS浓度(A)、尿素浓度(B)、温度(C)以及pH(D)四个因素做为主要优化参数，针对每个参数设置4个实验条件进行综合正交分析：分别将400μL浓度为1.06μg/μL的重组包涵体蛋白溶液加入到4mL不同复性缓冲液中在不同温度下复性12h，复性产物10000g离心10min，收集上清冻干后用1×PBS溶解，利用微量核酸蛋白测定仪进行蛋白浓度测定，计算可溶蛋白总量；得到4℃条件下，复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8M和0.05M。

本发明公开的具有免疫保护效果的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明针对β诺达病毒易突变，宿主多的特点，选择以牙鲆为感染对象的β诺达病毒，建立具有特异性免疫保护效果的该病毒衣壳蛋白基因工程制备方法，所用原材料均为市场在售产品，从而避免了从染病宿主体内分步抽提的复杂操作，以及利用敏感细胞系制备病毒的高成本，具有效率高，产量大，批次稳定，不受生产原料限制等优点，并可完全避免上述两种病毒制备方法残留活病毒的潜在致病风险。

（2）可利用本发明制备的重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白样品，注射牙鲆进行免疫保护。用1×PBS溶解冻干的复性蛋白，利用微量核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度。采用注射方式免疫宿主。按照2μg/ g剂量分两次，间隔10天免疫牙鲆。第二次免疫10天后进行攻毒实验，每天记录各组生存及活动状况。按照常规方法计算相对存活率，使用SPSS 软件进行 χ2-检验统计分析数据，攻毒实验2周后，对照组全部死，免疫保护实验组平均保护率可达可达51.52%。采用本发明建立的制备方法可高效制备用于提高养殖牙鲆对β诺达病毒免疫力的免疫保护制品，通过采用类似禽类的注射免疫操作方法，可有效提高养殖牙鲆的存活率，增加养殖效益，因此具有较好的应用价值。

（3）本发明建立的制备方法可高效制备感染牙鲆的β诺达病毒的衣壳蛋白，使用该蛋白免疫新西兰大白兔或小鼠可进一步制备在蛋白水平检测该病毒的多克隆抗体或单克隆抗体。

（4）使用本发明建立的表达、纯化及复性方法可获得高纯度的感染牙鲆的β诺达病毒的衣壳蛋白，该蛋白可进一步用于结晶及晶体结构研究，对于对比分析感染不同宿主的β诺达病毒的衣壳蛋白上与宿主细胞表面受体互作的关键位点具有重要意义，因此可为该病毒相关的理论研究提供有效的技术支持。

附图说明:

图1 重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白编码区电泳图。中M泳道，分子量Marker； 1泳道，目的蛋白编码区；

图2 重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白诱导表达检测结果。M泳道，蛋白质分子量Marker；1-7泳道分别为未诱导及诱导1-6小时的结果。箭头所示为目的蛋白条带；

图3 目的蛋白质谱鉴定结果；a、b、c、d峰图中下划线峰值提示为检出的衣壳蛋白预期肽段；

图4 目的蛋白亲和纯化结果；M泳道为蛋白质分子量Marker；1泳道为纯化后的重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。

实施例1 注射免疫养殖牙鲆提高免疫保护率

（1）根据牙鲆β诺达病毒序列（Genbank号：KF841612）设计PCR引物，正向引物NYQf0001e：

序列为5’- CATATGGTACGCAAAGGTGAG-3’，下划线为Nde I酶切位点；反向引物NYQr1014He：

序列为5’-AAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT-3’，下划线为Hind III酶切位点；

（2）以天津市水生动物疫病预防控制中心保存的还有牙鲆β诺达病毒基因组RNA2节段完整cDNA序列的质粒载体RNA2-PMD18T为模板（对外可以提供），利用（1）中所述引物扩增病毒衣壳蛋白编码区，扩增产物载入pMD-18 T载体进行测序确认；

（3）将确认无误的序列经Nde I和Hind III酶切后连入Promega公司的Pet21a质粒载体相应酶切位点，构建表达载体RNA2-Pet21a；

将RNA2- Pet21a质粒转化表达菌株BL21 (DE3) ply S，挑取阳性克隆接种于含有氨苄和卡那抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD = 0.5-0.6，取1mL未诱导菌液作为对照，其余加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）至终浓度为1mM，分别于诱导0.5h、1h、2h、3h、4h、5h收集菌液，10000g离心2min，弃上清。用PBS清洗沉淀后，10000g离心2min加入1mL Lysis Buffer (50mM NaH₂PO4.2H₂O，300mM NaCl，10mM Imidazole)，进行超声破碎，程序为: 400W，5s/次，间隔5s，破碎5min，至半透明。4℃，10000g离心20min，收集上清与沉淀，分别适量加1×SDS（十二烷基磺酸钠）上样缓冲液，煮沸10min，10000g离心1min后，取上清经15% SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶）分离，将目的条带切下送华大生物科技公司进行质谱鉴定。

3．重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白包涵体纯化以及复性：

（1）将1L诱导表达的重组菌液经10000r/min离心10min收集菌体，按1g湿菌10mL Buffer A破碎缓冲液(含1% TritionX-100，2mMEDTA)的比例重悬菌体，冰浴超声破碎3次。破碎后溶液4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。BufferB洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH₂PO4.2H₂O，5mM Imidazole，2mM Urea，pH 7.4)洗涤沉淀3次，可得初步纯包涵体。上述包涵体经Wash I buffer (500mM NaCl，20mM Imidazole（咪唑），20mmol PB，8M Urea（尿素）)溶解，涡旋振荡20min，4℃，10000r/min离心10min，上清经0.22μm滤膜过滤后结合于镍离子亲和柱纯化，具体操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手册进行，纯化产物产量可达36mg/L。

(2)重组蛋白的稀释复性：在4℃条件下，将浓度为1.06μg/μL的重组包涵体蛋白溶液加入到尿素和PBS的浓度分别为0.8M和0.05M的复性缓冲液中复性12h，复性产物10000g离心10min，收集上清冻干后备用。

4．注射牙鲆进行免疫保护。用1×PBS溶解冻干的复性蛋白，利用微量核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度。采用注射方式免疫宿主。按照2μg/ g剂量分两次，间隔10天免疫牙鲆。第二次免疫10天后进行攻毒实验，每天记录各组生存及活动状况。按照常规方法计算相对存活率，使用SPSS 软件进行 χ2-检验统计分析数据，攻毒实验2周后，对照组全部死，免疫保护实验组平均保护率可达51.52%。

实施例2

利用重组牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白制备多克隆抗体用于Western-Blot分析

1．多克隆抗体制备

复性蛋白送往康为世纪公司进行多克隆抗体制备，具体步骤为：

（1）注射免疫

两只成年新西兰大白兔购自本地实验动物中心。将使用本发明方法制备的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白按每只兔子100μg抗原剂量溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂（来源：均购自华生源生物试剂公司），并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只。

每4-6周注射抗原（来源：系采用本发明建立的方法制备），并在注射后的7天-10天采集血清，对比初始血清检查确定产生足量抗体。

（2）收集抗血液

将家兔轻轻放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集，每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。将采集的血液在37℃恒温箱中放置30分钟，然后 4℃，10000rpm离心10分钟，收集上清液即为抗血清，于-20℃保存备用。

2．Western-Blotting分析

取重组蛋白加入6×Loading Buffer，沸水煮5min后置于冰上。经SDS-PAGE电泳后，300 mA电流转印70 min，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。加入一抗（兔抗衣壳蛋白血清，来源：前面1中所述，委托华生源生物科技有限公司利用本发明制备的蛋白免疫新西兰大白兔制备）室温孵育2h，使用1×TBST（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05% Tween 20）清洗3遍，每遍15min，洗涤后加入1:20000稀释的二抗（HRP标记的羊抗兔Ig G，购自碧云天生物技术有限公司），室温孵育2h。1×TBST清洗3遍后，加入化学发光显示液显色5min，暗室胶片曝光。使用本发明方法制备重组牙鲆β诺达病毒蛋白，三次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，Western-Blot显示目的蛋白与抗体有特异性反应。

本发明建立的方法可高效制备高纯度的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白，相较于从染病宿主体内分步提取具有纯度高，产量大，且产量稳定等优势，且由于生产原料均为市场在售产品，因此也避免了原料限制。生产的该病毒的衣壳蛋白可进一步用于抗体生产等方面的应用，为该病毒的检测提供抗体等生物制品，因此具有较好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 具有免疫保护作用的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白及其制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白的编码基因

<400> 1

atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc cgcgaatccg 60

caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc acctgtgtct 120

aaggcctcga ctgtgactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180

tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa ctgacggata cgtcgttgtt 240

gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300

cgatacgctg ttgaaacact ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360

ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgaccacac cttcgacgcg 420

cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480

cagtacaccc gtacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcaccc 540

ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aacactgatg tggtcaacgt gtcggtgctg 600

tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660

cccatcatga cacaaggttc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga cttcaagtcc 720

atcctcctag gatccacacc actggatatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggac 780

cgtccgctgt ccattgacta cagccttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttattgg 840

cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900

tgggacaact tcaataagac gttcacagat ggcgttgcct actactctga tgagcagccc 960

cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcaccaggg ttgactcgga aaaccaccac 1020

caccaccacc actaa 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 2

Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser

20 25 30

Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser

50 55 60

Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val

65 70 75 80

Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala

85 90 95

Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln

100 105 110

Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu

115 120 125

Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asp His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr

130 135 140

Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro

145 150 155 160

Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg

165 170 175

Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr

180 185 190

Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser

195 200 205

Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr

210 215 220

Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser

225 230 235 240

Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val

245 250 255

Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly

260 265 270

Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn

275 280 285

Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe

290 295 300

Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro

305 310 315 320

Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser

325 330 335

Glu Asn His His His His His His

340

Claims

1.牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白，其特征在于它为感染牙鲆的β诺达病毒衣壳蛋白，具有序列表SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1 所述牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1 所示的碱基序列。

3.一种权利要求1 所述牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白体外重组表达体系，其特征在于利用原核表达系统进行抗菌蛋白体外重组表达体系，该体系中用于抗菌蛋白重组的表达载体为RNA2-Pet21a，宿主菌为BL21 (DE3) ply S；该体系能够以可控诱导的方式高效地表达重组的病毒衣壳蛋白。

4.一种权利要求1 所述牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白体外重组表达体系，其特征在于针对感染牙鲆的β诺达病毒衣壳蛋白原核表达重组蛋白的高效复性的缓冲液系统，4℃条件下，pH7.0的复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8M和0.05M，可以有效地实现这种类型重组蛋白的复性。

5.权利要求1 所述牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白在有效增强养殖牙鲆对β诺达病毒抵抗力方面的应用。