CN109879971A

CN109879971A - 一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白及用途

Info

Publication number: CN109879971A
Application number: CN201910264428.XA
Authority: CN
Inventors: 孙金生; 薛淑霞; 张亦陈; 魏俊利
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin University; Tianjin Normal University
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了一种抗β诺达病毒的TAT‑CP重组蛋白及用途，抗β诺达病毒的TAT‑CP重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗β诺达病毒的TAT‑CP重组蛋白，其中的TAT可以携带CP蛋白进入细胞，增强CP蛋白作为亚单位疫苗的免疫水平，显著提高激发CP蛋白特异性细胞毒性淋巴细胞反应水平，对于海水养殖鱼类β诺达病毒病有更高、更长久的保护效果；利用大肠杆菌表达TAT‑CP重组蛋白，表达量大，操作简单，成本低，安全性好。

Description

一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白及用途

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白及用途。

背景技术

β诺达病毒又叫神经坏死病毒，隶属于野田村病毒属，能导致海水鱼脑、神经及视网膜组织坏死，因此，由该病毒感染而引发的疾病又被称为病毒性神经坏死病。β诺达病毒具有较强的传染性，可感染石斑鱼、半滑舌鳎、大菱鲆、褐牙鲆等，患病死亡率接近100％，给海水养殖业造成了较大的经济损失。

海水养殖鱼类病毒性疾病治疗至今没有有效的药物，主要以预防为主。但是在实际的养殖生产中，养殖鱼类发生疾病时，滥用错用渔药的情况十分普遍。长期滥用药物不仅使药物的效果受到了限制，还可诱发病原微生物产生抗药性，导致“无药可用”，更严重的是药物在养殖动物体内残留和养殖环境的进一步污染。随着人们对食品安全和环境安全的重视，消除水产品药物残留隐患的抗病技术研究已显得尤为重要。疫苗作为抗生素的替代品，可使鱼类高特异抵御病原的攻击，减少鱼类病害的发生，保护生态环境，可以说鱼类疫苗的开发和应用具有重要而深远的意义。

鱼类疫苗根据制作工艺的不同，可以分为灭活疫苗、活菌疫苗(弱、减毒疫苗)和基因工程疫苗。灭活疫苗和活菌疫苗是利用物理或化学方法处理病原，使其失活或失去致病力，这种疫苗的优点是制备简单，免疫保护效果较好，但是存在着免疫力不持久和毒力会回复等缺陷。随着生物学技术的发展，基因工程疫苗的优势受到大家的关注。基因工程疫苗是利用基因工程的方法改造或重组病原体基因获得重组蛋白、质粒或完整病原体所构成的新型疫苗。

β诺达病毒的病毒粒子无外膜,只有一种衣壳蛋白，其基因组的RNA2序列编码病毒分子的衣壳蛋白，大小为37.8kd，对病毒的成功组装和入主细胞有着关键作用，同时其衣壳蛋白具有大量抗原表位，可诱导宿主产生保护性抗体。TAT是艾滋病病毒(HIV-1)的反式转录激活催化剂，已经成功地携带多肽、荧光标记蛋白、DNA及小分子药物等，实现体内外的跨膜递送。

但目前尚未有用TAT-CP重组蛋白作为疫苗预防海水养殖鱼类β诺达病毒病的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种编码抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有编码抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白的基因的重组基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白在制备抗β诺达病毒疫苗的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种含有上述基因的重组基因工程菌Arctic-Express^TM(DE3)/pCzn1-TAT-CP，是将含有SEQ ID NO.1所示基因的质粒pCzn1-TAT-CP转化原核宿主菌E.coli Arctic-Express^TM(DE3)感受态细胞中获得。

抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白在制备抗β诺达病毒疫苗的用途。

本发明的优点：

本发明的抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白，其中的TAT可以携带CP蛋白进入细胞，增强CP蛋白作为亚单位疫苗的免疫水平，显著提高激发CP蛋白特异性细胞毒性淋巴细胞反应水平，对于海水养殖鱼类β诺达病毒病有更高、更长久的保护效果；利用大肠杆菌表达TAT-CP重组蛋白，表达量大，操作简单，成本低，安全性好。

附图说明

图1为pCzn1-TAT-CP表达载体构建图谱。

图2为TAT-CP蛋白SDS-PAGE电泳图。M，蛋白Marker；1，未诱导表达蛋白；2，诱导表达蛋白；3，上清液中蛋白；4，沉淀中蛋白。

具体实施方式

pCzn1(商品)。

原核宿主菌大肠杆菌E.coli Arctic-Express^TM(DE3)感受态细胞(商品)。

下面结合附图及具体实施例对本发明做作一步的说明。

在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。

实施例1重组基因TAT-CP的制备及表达质粒构建

从美国生物技术中心(NCBI)基因库中获得β诺达病毒CP蛋白的基因序列，根据蛋白转导结构域多肽TAT编码的基因与外源蛋白基因能够融合表达的特性，在CP基因序列的5’端连接TAT的核苷酸序列，命名为：TAT-CP，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

人工合成TAT-CP基因，并连接到pCzn1上，构建表达质粒pCzn1-TAT-CP(如图1)。

以含有目的基因TAT-CP的质粒为模板，设计上、下游引物，其序列分别为SEQ IDNO.3(上游引物)和SEQ ID NO.4(下游引物)所示。将获得的目的基因TAT-CP克隆到载体pCzn1的NdeⅠ和XbaⅠ位点之间，即可获得含有目的基因的质粒pCzn1-TAT-CP。

实施例2 Arctic-Express^TM(DE3)/pCzn1-TAT-CP重组基因工程菌的构建

取1μl实施例1获得的质粒转化大肠杆菌E.coli Arctic-ExpressTM(DE3)感受态细胞(由安捷伦公司购得。PCR筛选鉴定出阳性转化子，所得的阳性克隆即为含有重组基因TAT-CP的重组基因工程菌：Arctic-Express^TM(DE3)/pCzn1-TAT-CP。简称：重组基因工程菌)

实施例3：基因工程重组蛋白TAT-CP的表达与纯化

(1)将重组基因工程菌的单菌落接种于含50μg/ml氨苄的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜。

(2)次日按1：100接种于50μg/ml氨苄的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇2h。然后取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清。

(3)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导TAT-CP重组蛋白表达。

(4)将诱导表达后的培养菌液4℃6000g，离心10min，菌体沉淀重悬于20ml裂解缓冲液中，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)。

(5)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀。

(6)用溶解缓冲液溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min；

(7)使用包涵体洗涤液洗涤包涵体3次；将沉淀用20ml Ni-IDA Binding-Buffer重悬后，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)，4℃10000g离心20min，取上清。

(8)利用低压层析系统，上清液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(9)用Ni-IDA Elution-Buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜，得到纯化的TAT-CP重组蛋白，其氨基酸序列如为SEQ ID NO.2所示。

实施例3获得的TAT-CP重组蛋白即为亚单位疫苗，在作为疫苗使用时，将TAT-CP重组蛋白用PBS重悬至浓度为400μg/ml，之后与等体积的QuickAntibody^TM佐剂(购买自北京博奥龙免疫技术有限公司)混合，即得，注射鱼体即可。

实施例4：TAT-CP重组蛋白作为亚单位疫苗的免疫学评价

(1)β诺达病毒粗提液制备及半致死剂量确定

取确认感染β诺达病毒的牙鲆脑组织，称重约2g，剪碎后置于研钵中，加入液氮后研磨成粉，将研磨成粉的组织转移至离心管中。加入2ml PBS(pH＝7.4)，4，℃10,000g离心10min，取上清，获得β诺达病毒粗提液，作为实验注射用原液，并以10倍递次稀释法稀释成10^-1～10^-4不同稀释度，RT-PCR检测每个稀释度的病毒。

取重约10g的健康褐牙鲆，实验室暂养后，随机分成5组，每组10尾鱼，每组分别注射病毒粗提液的原液，10^-1稀释度，10^-2稀释度，10^-3稀释度，10^-4稀释度和10^-5稀释度的病毒粗提液50μl，每天统计鱼体死亡率。利用Reed-Muench方法计算病毒的半致死剂量。

注射病毒粗提液5天后，实验组开始出现游泳不协调，表现为螺旋状或旋转游动等典型神经性疾病症状，同时伴有体表发黑等症状，并开始出现死亡。记录牙鲆死亡数目，按照Reed-Muench法列表(表1)对本次β诺达病毒感染牙鲆半数致死量(LD₅₀)进行计算，半数致死量(LD₅₀)计算公式为：距离比例＝(>50％的百分数-50)/(>50％的百分数-<50％的百分数)；LD₅₀＝>50％死亡率稀释度的对数(log)与距离比例相加，得出该病毒粗提液的LD₅₀为10^-1.5，即当对牙鲆腹腔接种50μlβ诺达病毒粗提液的10^-1.5稀释液时，50％的牙鲆会死亡。

表1观察期结束时牙鲆的死亡数据

病毒稀释度	接种牙鲆数	存活牙鲆数	死亡牙鲆数	死亡(％)
					1	5	0	5	100
10<sup>-1</sup>	5	2	3	60
					10<sup>-2</sup>	5	3	2	40
10<sup>-3</sup>	5	3	2	40
					10<sup>-4</sup>	5	4	1	20
10<sup>-5</sup>	5	5	0	0

(2)TAT-CP重组蛋白(亚单位疫苗)的免疫学评价

体重约10g的健康牙鲆来自于天津某海水工厂化养殖场。实验室条件下暂养两周。试验开始前，随机抽取几条牙鲆，取肝脾肾血，用RT-PCR方法检测β诺达病毒，确定无感染。将健康的褐牙鲆随机分为6组，每组20尾鱼。每三组为一个平行组，组别分别为注射TAT-CP重组蛋白的试验组(group1，group2和group3)和注射PBS的对照组(control1，control2和control3)。注射前，将TAT-CP重组蛋白用PBS重悬至浓度为400μg/ml，之后与等体积的QuickAntibody^TM佐剂(购买自北京博奥龙免疫技术有限公司)混合。对照组为PBS与等体积的佐剂混合。

每尾鱼腹腔注射100μl疫苗悬液。注射一周后，加强注射免疫一次。两次注射免疫后，第四-六周从各注射组随机取3尾褐牙鲆，抽血进行抗体效价测定。注射免疫六周后，按半致死剂量两倍的浓度开展攻毒试验。攻毒后每天统计鱼体死亡率，计算免疫保护率。

注射免疫褐牙鲆两次后，第四-六周从每组随机抽取3尾褐牙鲆，尾部抽血，进行抗体效价测定。结果见表2。由表中可以看出，注射TAT-CP重组蛋白后，第四周血清的抗体效价最高可达32，注射后第五周，效价明显上升，最高可达256，到注射后第六周效价达到最高512。注射PBS对照组血清效价≤4。

表2血清效价统计表

注射免疫四周后，按半致死剂量两倍的浓度开展攻毒试验。攻毒后每天统计鱼体死亡率，计算免疫保护率。见表3。

表3免疫保护率统计表

序列表

<110> 天津师范大学

<120> 一种抗ß诺达病毒的TAT-CP重组蛋白及用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatggccg taaaaaacgt cgtcagcgtc 60

gtgtggatcc atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc 120

cgcgaatccg caaccccgcc gacgtgctaa cagtcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc 180

acctgtgtca aggcctcgac tgtgactgga tttggacgtg ggaccaatga cgtccatctc 240

tcaggtatgt cgagaatctc ccaggccgtc ctcccagccg ggacaggaac tgacggatac 300

gtcgttgttg acgcaacatc gtctccgacc tcctgccacg actgggacac gctgctagaa 360

tcttccagcg atacgctgtt gaaacactgg agtttgaaat tcagccaatg tgccccgcaa 420

acacgggcgg tggttacgtt gctgcttcct gcctgatcca actgacaacg accacacctt 480

cgacgcgctt caagcaactc gtggtgcagt cgttgccaaa tggtgggaaa gcagaacagt 540

ccgacctcag tacacccgta cgctcctctg acctcgtcgg gaaaggagca gcgtctcacg 600

tcacccggtc ggctgatact cctgtgtgtc ggcaacaaca ctgatgtggt caacgtgtcg 660

gtgctgtgtc gctggagtgt tcgactgagc gttccattct tgagacacct gaagagacca 720

ccgctcccat catgacacaa ggttccctgt acaacgattc cctttccaca aatgacttca 780

agtccatcct cctaggatcc acaccactgg atattgcccc tgatgagcag tcttccagct 840

ggaccgtccg ctgtccattg actacagcct tggaactgga gatgttgacc gtgctgttta 900

ttggcacctc aagaagtttg ctggaaatgc tggcacacct gcaggctggt tcgctggggc 960

atctgggaca acttcaataa gacgttcaca gatggcgttg cctactactc tgatgagcag 1020

ccccgtcaaa tcctgctgcc tgttggcact gtctgcacca gggttgactc ggaaaac 1077

<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn His Lys Val His His His His His His Gly Tyr Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Val Arg Lys Gly Glu Lys

20 25 30

Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg

35 40 45

Arg Arg Ala Asn Ser Arg Arg Arg Ser Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val

50 55 60

Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val

65 70 75 80

His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly

85 90 95

Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val Asp Ala Thr Ile Val Ser Asp

100 105 110

Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Glu

115 120 125

Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly

130 135 140

Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asp His Thr

145 150 155 160

Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp

165 170 175

Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr

180 185 190

Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu

195 200 205

Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys

210 215 220

Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu

225 230 235 240

Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Ser Ser Thr

245 250 255

Asn Asp Phe Lys Ser Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala

260 265 270

Pro Asp Gly Ala Val Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr

275 280 285

Ser Leu Gly Thr Gly Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys

290 295 300

Lys Phe Ala Gly Asn Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly

305 310 315 320

Ile Trp Asp Asn Phe Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr

325 330 335

Ser Asp Glu Gln Pro Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys

340 345 350

Thr Arg Val Asp Ser Glu Asn

355

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccgtaa aaaacgtc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagttttcc gagtcaac 18

Claims

1.一种抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白，其特征是所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组基因工程菌Arctic-Express^TM(DE3)/pCzn1-TAT-CP，其特征是将含有SEQ ID NO.1所示基因的质粒pCzn1-TAT-CP转化原核宿主菌E.coli Arctic-Express^TM(DE3)感受态细胞中获得。

4.权利要求1的抗β诺达病毒的TAT-CP重组蛋白在制备抗β诺达病毒疫苗的用途。