CN112679616A - 一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，即采用生物技术对牙鲆弹状病毒G蛋白进行抗原表位分析、设计，获得一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，并以该融合蛋白作为抗原来制备牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。本发明中牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其中一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明利用毕赤酵母系统构建了能表达牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的基因工程菌。将重组表达的蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，可使免疫后牙鲆获得免疫保护。

Description

一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。

背景技术

牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HIRRV)为单股负链RNA病毒，是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员。HIRRV病毒粒子呈子弹状，长160～180nm，宽60～80nm。HIRRV基因组大小约11000bp，基因组含有6个开放阅读框(ORFs)，分别编码6种蛋白：核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白、依赖RNA的RNA酶和非结构蛋白。其中，糖蛋白(G蛋白)是HIRRV的主要抗原，能够诱导机体产生中和抗体，同时也能够刺激细胞免疫，因此可以选择G基因作为抗原基因来构建基因工程亚单位疫苗。

HIRRV最早于1986年在日本兵库县的患病牙鲆和香鱼鱼苗中分离获得，主要感染海水鱼类。2012年以后发现HIRRV也能感染淡水鱼类。感染鱼具有鳍、肌肉组织及内部器官出血，造血器官坏死等症状。HIRRV给全球水产养殖业造成了严重的经济损失，目前尚无商业化的牙鲆弹状病毒疫苗进行防控。G蛋白是牙鲆弹状病毒的主要抗原，可以作为亚单位疫苗和DNA疫苗的候选蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，即通过生物软件预测分析牙鲆弹状病毒G蛋白的主要抗原表位，通过引入通用T细胞表位，并去掉N端信号肽区域与C端影响蛋白表达的强疏水区域，获得一个新型融合蛋白rG，并以该蛋白作为抗原来制备牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明首先提供一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其中的抗原为上述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG，其浓度为40～50μg/ml之间；

本发明的牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：

1)选用毕赤酵母偏好密码子，合成牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的重组基因工程酵母菌；用该基因工程菌高密度发酵表达出牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG；

3)对重组表达的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。

本发明利用基因工程技术构建了能表达一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的重组酵母菌株。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫牙鲆，可使其获得对牙鲆弹状病毒强毒的免疫保护。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因的获得

利用生物软件DNAStar对牙鲆弹状病毒G蛋白(GenBank登录号：AB103462)进行抗原表位分析，去掉N端20个氨基酸的信号肽，C端168个氨基酸组成的影响蛋白重组表达的强疏水区域，并在N端42位氨基酸后面引入一个通用的增强免疫功能的T细胞表位(TAKSKKFPSYTATYQF)，获得一种新型融合蛋白rG，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，并利用在线生物软件http://www.jcat.de/进行毕赤酵母稀有密码子优化，获得融合蛋白rG的核苷酸序列SEQ ID NO:2。

将新获得的融合蛋白rG的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上XhoI和XbaI酶切位点。

实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

1、将含牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。

2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大时，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组

菌株。

3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行SDS-PAGE电泳，同时设立未转化的菌液作为对照。结果阳性克隆比对照菌在37kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致。经牙鲆弹状病毒抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌。

实施例3牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗的制备

1、重组菌发酵

1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。

2)发酵结束后，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG半成品。

2、蛋白纯化

镍柱纯化，咪唑洗脱。将收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。用BCA法检测蛋白浓度，稀释至终浓度0.15mg/ml，无菌过滤，待用。

3、重组蛋白灭活

将纯化的蛋白液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。

4、疫苗制备

4.1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。

4.2水相制备取灭菌的吐温-80 4份，加灭活的蛋白液96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。

4.3乳化取油相2份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。

4.4分装定量分装，密封瓶口。

实施例4牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的疗效试验

取2g左右的牙鲆90尾，平均分为3组，每组30只。第一组为免疫组，用本发明制备的牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗进行肌肉注射免疫，50μl/尾；第二组为攻毒对照组，注射同等体积的无菌生理盐水；第三组为阴性对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫28天后免疫组与攻毒对照组肌肉注射牙鲆弹状病毒8601H株，剂量为5.0×10^4.0TCID₅₀/尾。攻毒14天后统计攻毒保护率(死亡尾数占总尾数的百分率)。

结果表明，免疫本发明的牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，14天后对牙鲆的攻毒保护率在83.3％，而攻毒对照组的攻毒保护率为6.7％。本发明的疫苗对牙鲆的保护率良好，具备较高的临床推广价值。

表1牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 337

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Thr Ile Lys Pro Gly Val Asp Ser Val Ser Asp Gln Pro Thr

1 5 10 15

Trp Ala Asn Pro Leu Phe Thr Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser

20 25 30

Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe Tyr Pro Val Asp Cys Pro Ala Ala Lys

35 40 45

Leu Ser Lys Val Ser Pro Ser Gln Leu Arg Cys Pro Arg Ile Phe Asp

50 55 60

Asp Glu Asn Gln Gly Leu Val Ala Tyr Pro Ala Val Ile Arg Ser Leu

65 70 75 80

Ser Val Gly Asn Asn Leu Gly Asp Ile His Thr Gln Gly Glu Tyr Val

85 90 95

His Lys Val Leu Tyr Arg Thr Thr Cys Ser Thr Gly Phe Phe Gly Gly

100 105 110

Gln Thr Ile Glu Lys Ala Leu Val Glu Met Lys Leu Ala Pro Arg Glu

115 120 125

Val Gly Val Tyr Asp Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Phe Pro Ala

130 135 140

Pro Arg Cys Gln Trp Tyr Thr Asp Asn Val His Asn Asp Leu Thr Phe

145 150 155 160

Tyr Tyr Thr Thr Ala Lys Ser Val Leu Arg Asp Pro Tyr Thr Leu Gly

165 170 175

Phe Leu Asp Ser Asp Phe Ile Glu Gly Lys Cys Ser Lys Ser Pro Cys

180 185 190

Gln Thr His Trp Ser Asn Val Val Trp Lys Gly Asp Ser Gly Val Ala

195 200 205

Ala Cys Asp Thr Gly Pro Glu Ile Lys Gly His Ile Phe Val Asp Lys

210 215 220

Thr Ser His His Val Val Lys Ala Thr Ser Tyr Gly His His Pro Trp

225 230 235 240

Gly Pro His Arg Ala Cys Met Ile Thr Phe Cys Gly Lys Pro Trp Ile

245 250 255

Arg Thr Asp Leu Gly Asp Leu Ile Ala Ile Glu Tyr Asn Gly Gly Ala

260 265 270

Thr Leu Leu Ala Phe Pro Ala Cys Lys Asp Thr Thr Val Gly Met Arg

275 280 285

Gly Ser Leu Asp Asp Phe Ala Tyr Leu Asp Asp Leu Val Lys Ser Ser

290 295 300

Glu Ser Arg Glu Glu Cys Leu Glu Ala His Ala Glu Ile Ile Ala Thr

305 310 315 320

Asn Ser Val Thr Pro Tyr Leu Leu Ser Lys Phe Arg Ser Pro His Pro

325 330 335

Gly

<210> 2

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagacca tcaaaccagg tgttgattct gtttctgatc agccaacctg ggctaaccca 60

ctgttcacca ccgctaaatc taaaaaattc ccatcttaca ccgctaccta ccagttctac 120

ccagttgatt gtccagctgc taaactgtct aaagtttctc catctcagct gcgttgtcca 180

cgtatcttcg atgatgaaaa ccagggtctg gttgcttacc cagctgttat ccgttctctg 240

tctgttggta acaacctggg tgatatccac acccagggtg aatacgttca caaagttctg 300

taccgtacca cctgttctac cggtttcttc ggtggtcaga ccatcgaaaa agctctggtt 360

gaaatgaaac tggctccacg tgaagttggt gtttacgata ccaccaccgc ttctgctctg 420

tacttcccag ctccacgttg tcagtggtac accgataacg ttcacaacga tctgaccttc 480

tactacacca ccgctaaatc tgttctgcgt gatccataca ccctgggttt cctggattct 540

gatttcatcg aaggtaaatg ttctaaatct ccatgtcaga cccactggtc taacgttgtt 600

tggaaaggtg attctggtgt tgctgcttgt gataccggtc cagaaatcaa aggtcacatc 660

ttcgttgata aaacctctca ccacgttgtt aaagctacct cttacggtca ccacccatgg 720

ggtccacacc gtgcttgtat gatcaccttc tgtggtaaac catggatccg taccgatctg 780

ggtgatctga tcgctatcga atacaacggt ggtgctaccc tgctggcttt cccagcttgt 840

aaagatacca ccgttggtat gcgtggttct ctggatgatt tcgcttacct ggatgatctg 900

gttaaatctt ctgaatctcg tgaagaatgt ctggaagctc acgctgaaat catcgctacc 960

aactctgtta ccccatacct gctgtctaaa ttccgttctc cacacccagg ttga 1014

Claims (6)

1.一种牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.权利要求1所述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG在制备疫苗中的应用。

4.一种牙鲆弹状病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求1所述的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG。

5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的浓度为40-50μg/ml。

6.权利要求4所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括有如下的步骤：

1)选用毕赤酵母偏好密码子，合成牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG的重组基因工程酵母菌；用该基因工程菌高密度发酵表达出牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG；

3)对重组表达的牙鲆弹状病毒新型融合蛋白rG进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。