CN104497148B - 一种重组泛素化蓝耳病疫苗的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪蓝耳病(繁殖与呼吸系统综合症，PRRSV)重组泛素化疫苗的制备与应用。所述疫苗以PRRSV主要结构蛋白GP5、GP6、GP7的体液和细胞免疫表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与泛素串联，克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组蓝耳病蛋白工程疫苗。本发明还涉及该疫苗的使用方法。动物实验表明，蓝耳病蛋白工程疫苗的攻毒保护力与弱毒苗相当，高于灭活苗，可以在细胞水平上刺激产生T淋巴细胞增殖免疫反应，体液水平上产生具有病毒中和活性的抗体免疫反应，能够预防猪蓝耳病。

Description

一种重组泛素化蓝耳病疫苗的制备

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪蓝耳病的泛素化疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白GP5、GP6、GP7的表位与猪泛素蛋白串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到重组蓝耳病泛素化疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病猪蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，主要引起母猪繁殖障碍、各年龄猪呼吸道症状、仔猪高死亡率等，同时还会导致免疫抑制而继发多种其他疾病。近年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒给我国养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明从PRRSV基因组的变异、介导该病毒感染的细胞受体及剧烈炎症反应的产生等方面是PRRSV致病的关键。目前，我国已研制出针对该病不同流行毒株的灭活苗和弱毒活疫苗。但灭活苗几乎不能诱导细胞免疫，不能减少或阻止蓝耳病病猪排毒，研究表明，灭活苗免疫与未免疫病猪在病毒血症严重程度和持续时间上无显著差异(Niluboletal.；2004)；此外，灭活苗也不能阻止野毒感染，不能减少感染公猪精液排毒(Nielsenearl.；1997)；弱毒苗的效果明显好于灭活疫苗，然而，其存在巨大的毒力返强及散毒的风险。

该病最早于1987年首先在美国发生，随后在加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病，至1989年达到高峰。1991年，wensvoort首次从感染猪体内分离到病原(Wensvoort et al.，1991)。实际上，亚洲地区1988年已经有该病的存在，但分离出病毒是5年之后的1993年(日本和中国台湾)(Hiroseo etal.，1995；华健，2000)。目前，国内外的兽医工作者对PRRS都相当重视，进行了卓有成效的研究，也分离到很多的毒株。

位于病毒外区的S³⁷H(F/L)QLIYN是病毒的中和表位(Ostrowski et al.，2002)。在近年来的研究中备受关注，后来该表位被证实为是病毒的首要中和表位(primaryneutralizing epitope，PNE)(Ansari et al.，2006)。在我国大陆的养猪场以PRRSV CH-la灭活苗和源自VR-2332的弱毒疫苗进行免疫为主。用这些疫苗免疫的猪即使能够产生良好的免疫应答，也产生了高水平的中和抗体，但是这些中和抗体却不能有效地清除病毒。这对疫苗的研制提出了新的挑战。

PRRSV基因组中的结构蛋白基因可分为主要结构蛋白基因和次要结构蛋白基因，主要结构蛋白基因包括由ORF5、ORF6、ORF7编码的主要结构蛋白E、M蛋白和N蛋白，它们都具有重要的经济价值和开发前景(蔡家利等，2001；仇华吉等，1999；谷红等，2004；秦春圃，2003)。

GP5由ORF5编码，为糖基化的囊膜蛋白，又称E蛋白，26kDa，含有4个糖基化位点。GP5是PRRSV的主要保护性抗原，含有中和表位，可以诱导细胞免疫和体液免疫(Pirzadehetal.，1997，Albina et al.，1998，Gonln et al.，1999，Goldberg et al.，2000)。GP5蛋白含有一个胞外结构域，该胞外域中间有一个主要的中和表位(epitope(B)，AA37-45)(Osstrowski et al.，2002)，还有一个非中和表位(epitope(A)，AA27-31)。HuN4株GP5基因与CH-1a株的GP5基因相比较氨基酸的同源性为93％。存在着一些关键氨基酸的差异，在GP5的2个重要抗原性区域(胞外域27-41位AA，另一个是C末端180-197位AA)就存在着5个氨基酸的突变，且39位氨基酸发生了突变，它位于主要的中和表位(epitope(B)，AA37-45位AA)中。已有的研究表明，采用带有GP5基因的DNA疫苗单独免疫即可对同源毒株产生足够的保护效力，用高致病性蓝耳病的GP5基因作为重组病毒的抗原。GP5蛋白是诱导产生中和抗体的主要病毒抗原，与LDV，EAV相同，至少有两种类型的中和表位(Yang et al.，2001；Rodriguez et al.，2001；Ostrowski et al.，2002)，其中和抗原表位包括线性表位和构象表位，而位于其胞外区的表位是最重要的中和表位。单克隆抗体与病毒糖基化的和非糖基化的膜蛋白都发生反应，这表明糖基化与中和表位无必然联系，但其内部构象对中和活性抗体的产生有重要作用(Weiland et al.，1999；Gonin et al.，1999；Zhang et al.，1998；Pirzadeh et al.1997)。经鉴定，GP5在氨基酸AAll7-131和149-163包含两个免疫显性的T细胞表位(Vashisht et al.，2008。此外，GP5蛋白在体内外均能诱导细胞凋亡(Suarez etal.，1996)。

M蛋白又称基质蛋白，属于非糖基化膜蛋白，由ORF6编码而成，分子量大约是18～19kDa(Meulenberg et al.，1995)。NA-type和欧洲型的PRRSV都有一个N-糖基化位点，但该位点不与寡聚糖相结合，因为无论是体外翻译的还是天然的蛋白用内切糖基化酶消化，其分子量都不减少。M蛋白在NA-type毒株间是高度保守的，也是欧美毒株结构蛋白中最保守的蛋白(Meng et al.，1995)。该蛋白有一个重要的特征，即在其N端存在3个非常明显的疏水区，位于第17～88位氨基酸残基，是蛋白的跨膜区(Mardassi et al.，1995)。M蛋白有一段很短的氨基酸(仅有16个氨基酸)暴露在病毒表面，可能与病毒的聚集和结合有关。M蛋白在感染细胞的滑面内质网(ER)中聚集，与25kD的主要糖蛋白GP5形成异源二聚体(分子量分别约40和87kDa)(Snijder et al.，2003)。推测其可能在维持病毒形态、病毒组装和出芽中发挥作用。M蛋白是PRRSV三种重要的结构蛋白中最为保守的，也是感染猪体液免疫的主要对象之一，研究分析表明M蛋白是一种免疫原性很好的蛋白质，可诱导产生抗体反应，且在感染后10天即可检出。表达的重组M蛋白可以作为血清学实验的靶抗原。

ORF7编码核衣壳蛋白(N蛋白)(Meulenberg et al.，1995)是该病毒的主要结构蛋白，位于基因组3’末端，是形成病毒衣壳的唯一蛋白。在PRRS病毒感染的细胞中N蛋白是含量最丰富的蛋白，约占细胞中蛋白总量的20～40％左右(Mardassi et al.，1994)。N蛋白是相对保守的结构蛋白，是PRRSV所有结构蛋白中免疫原性比较强的病毒蛋白(Yoon et al.，1995)，这在免疫学和诊断学上具有重要意义。N蛋白作为结构蛋白，通过与病毒RNA相互作用形成核衣壳；N蛋白还可以调节宿主细胞功能(Yoo，2005)。Lee等(2006)利用反向遗传学技术突变病毒N蛋白的NLS后，发现病毒仍然具有感染性，但病毒产量比野毒低100倍。NLS突变株接种猪表现病毒持续性感染时间缩短、病毒含量下降，但其诱导产生的中和抗体和ELISA抗体比野毒株高，从感染猪扁桃体分离到的病毒株的突变集中在NLS区，表明NLS对于病毒体外复制是非必需的，可在PRRSV感染猪体内发挥重要的病理学作用。北美洲型PRRSV的N蛋白的第23，75和90位氨基酸处分别含有3个半胱氨酸，其中的第23位半胱氨酸参与同源二聚体的形成(Wootton et al.，2003)。

泛素(Ubiquitin，Ub)是一种高度保守的小肽(76个氨基酸)，普遍存在于从单细胞酵母到人类的所有真核细胞内，并且表达水平很高。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，泛素的这种标记作用是非底物特异性的，在蛋白质降解过程中泛素的枢纽作用越来越得到研究者的重视。泛素依赖性的蛋白质降解途径是目前已知的重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径之一。泛素与靶抗原基因的融合表达，可以使泛素化的靶抗原经蛋白酶体降解后，迅速被加工、处理和递呈，刺激机体MHC-I类分子限制的特异性CD+8T淋巴细胞增殖、分化，增强疫苗的免疫应答(Grant E P et al.，1995；Leachman S A et al.，2002)。泛素可以通过调节蛋白的周转而参与细胞的多种生命过程(Ciechanover A et al.，2000]，如热休克反应、DNA损伤修复、细胞周期调控等。泛素与蛋白连接后，可以促进内源性合成蛋白在蛋白酶体中的降解，从而增强蛋白特异性的细胞免疫(Adams J et al.，2001；Lauren D W et al.，2003；M icheal BR et al.，2005)。

发明概述

本发明以主要结构蛋白GP5T细胞表位以及GP6和GP7的中和抗原表位作为疫苗框架结构，与泛素(Ub)基因串联，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组泛素化蓝耳病疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效的体液免疫和细胞免疫反应。

本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防蓝耳病的重组泛素化疫苗多肽及其疫苗组合物；本发明的目的之二在于提供了所述泛素化蓝耳病疫苗的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述泛素化蓝耳病疫苗的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述泛素化蓝耳病疫苗的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述泛素化蓝耳病疫苗在预防蓝耳病中的用途。

在第一方面，本发明提供了一种用于预防蓝耳病的重组泛素化疫苗多肽及其组合物。其含有主要结构蛋白GP5 T细胞表位以及GP6和GP7的中和抗原表位及泛素(Ub)蛋白。所述的泛素化蓝耳病疫苗蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。泛素化蓝耳病疫苗多肽氨基酸序列如下：

NASSNGSSCELNGTDWLIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSSVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSAGSGGSSLDDFCNDSTAPKVSRGRLVVRRPGSTTVVLGGRKAVKQGGGKQQKKKKGNGQPVNQLCQMLGKIIAQQNQSRGKGPGKKNRKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCAAYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRT

在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的泛素化蓝耳病疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列和泛素序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得蓝耳病泛素化蓝耳病疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：

AACGCCAGCAGCAACGGCAGCTCTTGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGTCCGTCATTGTGGAGAAGGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTAATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGGTTCTGGTGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCAAAGGTAAGTCGCGGTCGACTGGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGGTGGTAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTGCAGCATACACCTTGACCGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAGGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAGTCCACCCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAGTCCACTCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCTGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACT

在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码泛素化蓝耳病疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。本发明中优选大肠杆菌BL21(DE3，Plys)作为表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的泛素化蓝耳病疫苗多肽。

在第五方面，本发明提供了一种泛素化蓝耳病疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达泛素化蓝耳病疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

在第六方面，本发明提供了一种用于预防猪蓝耳病的重组泛素化蓝耳病疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述泛素化蓝耳病疫苗能够预防猪蓝耳病的爆发。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组泛素化蓝耳病疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射或鼻内接种注射动物，能够产生足够量的抗体及细胞因子(如IFN等)提供抗病毒活性，保护动物免于蓝耳病流行毒株的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的重组泛素化蓝耳病疫苗是安全的(见实施例四)，能够保护动物免受蓝耳病病毒感染(见实施例五)。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1重组蓝耳病蛋白工程疫苗表达载体pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)构建图；图2pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)载体质粒酶切图，其中泳道1为DNAmarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2为未酶切对照，泳道3为质粒酶切图，泳道4为阴性对照；图3SDS-PAGE检测图，其中泳道1为蛋白Marker，从上至下依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2为未诱导样品，泳道3为阳性对照，泳道4为诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图4 Westemblot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为120KD、85KD、60KD、40KD、22KD，泳道2为阳性对照，泳道3为阴性对照，泳道4为目的蛋白。图5为免疫小鼠血清ELISA检测GP5特异性抗体检测结果；图6为PRRSV刺激鼠肾细胞T淋巴细胞增殖反应检测结果；图7为PRRSV刺激PBMC T淋巴细胞增殖反应检测结果。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。

实施例一大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pMD18T-PRRSV(GP5/6/7/Ub)。用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETA质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New Englandbiolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.86kb pRSETA质粒和1201bp PRRSV(GP5/6/7/Ub)片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)，(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)置冰上融化，加入2μl链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应蓝耳病疫苗基因大小片段的克隆，1200bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在49KD(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名pRSETB-PRRSV(GP5/6/7/Ub)/BL21(DE3，Plys)。

实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化

发酵取生产菌种，接种于2ml LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，180rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在40％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导5个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。

纯化将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(PHS.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；即得重组泛素化蓝耳病疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot印记检定纯化产物是否为目标蛋白。

乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μg/ml。取法国赛比克公司的Montanide ISA 50V2佐剂，经过121℃，灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。

实施例四重组泛素化蓝耳病疫苗安全性试验

疫苗对小白鼠的安全性

皮下注射18-22g Balb/C小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共三个批次，注射15只小白鼠，同时设定2只阴性对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。

疫苗对仔猪的安全性

选择30日龄健康三元杂交仔猪，每头耳后肌肉注射重组泛素化蓝耳病疫苗，每批次5头，共三个批次，注射15头仔猪，同时设立阴性对照2头，每头注射生理盐水白油乳化液2ml，临床观察10天。

结果

疫苗对小白鼠的安全性试验

结果如表1，20120208免疫组1只受试动物第二天体温略有升高，第三天恢复正常，食欲和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见重组泛素化蓝耳病疫苗对小白鼠是安全的，见表1。

表1 疫苗对小白鼠的安全性试验结果

疫苗对仔猪的安全性试验

结果如表2，整个试验观察期10天内，所有免疫的仔猪，体温和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，15头仔猪均健活。对照佐剂组的2头仔猪也无任何不良反应。这说明，重组泛素化蓝耳病疫苗对仔猪是安全的。

表2 疫苗对仔猪的安全性试验结果

组别	动物数量	体温	食欲	异常状况	死亡数量
						20120207	5	正常	正常	无	0
20120208	5	正常	正常	无	0
						20120209	5	正常	正常	无	0
对照	2	正常	正常	无	0

实施例五重组泛素化蓝耳病疫苗与传统疫苗的免疫效力对比试验

为了尽可能多的得到疫苗的有效性评价参数，本发明检测了免疫后BALB/C小鼠的特异性抗体、小鼠及仔猪的病毒中和抗体以及细胞免疫有关的T淋巴细胞增殖情况。

1疫苗与攻毒用病毒

重组蓝耳病蛋白工程疫苗由红桥明勤研发中心提供，批号为20121015、20121016、20121017，PRRSV灭活苗(NVDC-JXA1株)及弱毒苗(JXA1-R)均由广东永顺制药研发中心惠赠，批号分别为2012011、2012025。

2试验动物及分组

30只5周龄的BalB/C雌性小鼠，随机分为6组，重组泛素化疫苗三个批号组、灭活苗组、弱毒苗组以及对照组，每组5只/笼；30头5～6周龄仔猪，雌雄各半，随即分为6组，重组泛素化疫苗三个批号组、灭活苗组、弱毒苗组以及对照组，每组5头，实验前试验动物预饲一周，适应环境。

3试验设计与方法

按照分组情况对Balb/C小鼠及仔猪进行免疫，首免后两周加强免疫一次，20μg/只或20μg/头。首免后2周、4周、6周、8周，小鼠断尾采血并分离血清，并于最后一次采血后，宰杀小鼠，分离鼠肾细胞用于T淋巴细胞增殖试验；首免后6周、8周、10周，仔猪前腔静脉采血并分离血清及PBMC用于细胞免疫检测。

实施例六间接ELISA检测GP5抗体反应

重组蛋白纯化样品用50mmol/l的CBS(PH9.6)稀释至1μg/ml，加入96孔ELISA板，每孔100μl，4℃过夜包被。PBST洗液buffer洗涤三次后，用封闭液5％马血清(PBS缓冲体系)于37℃，封闭1小时。洗涤三次后，血清样品用封闭液(5％马血清，PBS缓冲体系)稀释至1∶20，每孔加入100μl，两个重复，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入稀释至1∶8000的HRP-标记二抗(羊抗鼠)，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入50μl TMB底物，室温、避光、反应10min，加入2M H2SO4停止反应。在450nm波长下读取吸光值(BIORAD680酶标板)。

结果

如图5所示，不同组产生不同水平的GP5特异性抗体。整个试验期间，重组泛素化疫苗组、弱毒苗组以及灭活苗组小鼠产生了明显的GP5特异性IgG抗体，与对照呈极显著差异(P＜0.01)。结果表明本发明提供的重组泛素化疫苗可以刺激Balb/C小鼠产生体液免疫反应，且抗体水平与现有的灭活苗和弱毒苗相当，无显著差异(P＞0.05)。

实施例七抗体中和试验

对首免后4、6、8周采集的血清，进行病毒中和抗体(SN)检测。血样在进行血清中和实验前进行56℃灭活30min，两倍系列稀释后加入等量的200TCID₅₀PRRSV NVDC-JXA1株，加入96孔培养板，5％CO₂培养箱(Sanyo MCO-15AC)，37℃培养一小时，然后，加入100μlMARC-145细胞悬液，每孔含有2×10⁴细胞。培养板置于5％CO2的湿润环境，37℃培养6天至出现PRRSV特异性细胞病变(CPE)为止。中和滴度以未观察到CPE的最高稀释倍数为准。每个样品做三个重复。

结果

见表3，首免后4周(首免后2周加强免疫)在所有的免疫组首次检测到中和抗体，其中灭活疫苗的中和抗体滴度低于重组泛素疫苗组和弱毒苗组，但未呈现显著差异；整个试验期间，重组泛素化疫苗组和弱毒苗组产生的抗体水平相当，高于灭活疫苗组，但免疫组明显高于对照组的中和抗体，呈现极显著差异(P＜0.01)；至首免后8周，对照组未产生任何中和抗体。

表3 免疫小鼠中和抗体检测

注：1抗体滴度＜1∶8视为无中和抗体；2NR代表抗体滴度无确切结果；3a代表小鼠的数量

实施例八淋巴细胞增殖检测

为了进一步对比细胞调节免疫反应，在首免后8周进行了鼠肾细胞增殖试验，首免后6、8、10周进行了猪PBMC增殖试验，以检测疫苗免疫的细胞免疫反应。将鼠肾细胞或仔猪PBMC放入96孔细胞板，100μl/孔(2×10⁵细胞/孔)。随后加入100μl/培养基，或者加入PRRSV蛋白的培养基(PRRSV感染MARC-145细胞通过80000g离心2小时收集)，混匀。伴刀豆球蛋白(5ug/ml，sigma)作为阳性对照。肾细胞或PBMC样品做三个重复。依据Bounous提供的方法，用改进的MTT比色法进行鼠肾细胞或猪PBMC增殖活性检测：鼠肾细胞72小时，或PBMC培养96小时后，每孔加入20μl MTS，孵育5小时，孵育后在490nm波长下读数。刺激指数(SI)用抗原刺激细胞孔的平均值比细胞(未刺激)孔的平均值来计算。

结果

与中和抗体反应类似，在重组泛素疫苗组和弱毒苗组观察了最高水平的肾细胞增殖活性，见图6、图7。灭活疫苗组和对照组的T淋巴细胞增殖明显低于其他免疫组(P＜0.05)，重组泛素化疫苗和弱毒苗免疫组的刺激指数相近，未呈现显著差异(P＞0.05)。而且，与对照组相比，灭活疫苗组首免后6、8周未检测到明显加强的肾细胞增殖活性(P＞0.05)。与鼠肾细胞类似，免疫后6周、8周、10周，对猪PBMC增殖检测中也发现了这一规律(图7)。这些数据表明重组泛素化蓝耳病疫苗能够在天然宿主体内诱导加强细胞免疫反应。

实施例九疫苗免疫仔猪细胞免疫反应的检测

方法见实施例七，结果见表4。重组泛素化蓝耳病疫苗免疫在鼠模型中诱发了抗体和肾细胞增殖反应试验，取得了令人鼓舞的结果，促使我们去研究是否在天然宿主，猪模型中能够得到更加有效的免疫反应。首免后6周、8周、10周，采集血清样品用于病毒中和试验。整个试验期间，对照组仔猪样品未检测到PRRSV中和抗体，这与鼠肾细胞的结果一致。所有免疫组在首免后6周检测到中和抗体，免疫后8周、10周重组泛素化疫苗组和弱毒苗组全部免疫仔猪检测到中和抗体10周有全部仔猪检测到了中和抗体，重组泛素化疫苗组有一头猪中和抗体滴度达到1∶32，其他重组泛素化疫苗组及弱毒苗组均有不同数量的猪只最高中和抗体达到1∶16；灭活疫苗组PRRSV中和抗体滴度在6周、8周、10周分别有1/5、2/5、1/5达到了1∶8，PRRSV中和抗体滴度明显低于重组泛素化疫苗组和弱毒苗组(＜0.01)，但显著高于对照组(＜0.01)。

表4 免疫仔猪中和抗体检测

注：1抗体滴度＜1∶8视为无中和抗体；2NR代表无确切结果；3a代表猪的数量。

Claims (6)

1.一种重组泛素化蓝耳病疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1项所述融合蛋白。

3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。

5.权利要求2所述的核酸分子，其具体序列如下：

AACGCCAGCAGCAACGGCAGCTCTTGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGTCCGTCATTGTGGAGAAGGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTAATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGGTTCTGGTGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCAAAGGTAAGTCGCGGTCGACTGGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGGTGGTAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTGCAGCATACACCTTGACCGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAGGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAGTCCACCCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAGTCCACTCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCTGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACT 。

6.一种用于预防高致病性蓝耳病的疫苗，其包含权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。