CN101696399A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白ctl细胞表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL细胞表位及其应用。本发明将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株M蛋白基因与小鼠泛素基因进行融合并克隆构建DNA疫苗，同时构建了表达M蛋白的WR株牛痘病毒的重组病毒；按照Priming-Boosting策略免疫BALB/c小鼠，然后分离小鼠脾淋巴细胞，用生物信息学方法预测、合成的CTL短肽进行体外培养刺激，借助流式细胞技术与酶联免疫斑点技术鉴定出K₉₃FITSRCRL与F₅₇GYMTFVHF两个CTL表位，PRRSV M蛋白CTL表位的鉴定将为PRRS细胞免疫机制及新型表位肽疫苗的研究奠定一定的理论基础，同时对PRRS防控技术的理论研究具有指导意义。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL细胞表位及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞表位的识别和鉴定，尤其涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL细胞表位的识别和鉴定，本发明还涉及表达M蛋白的WR株牛痘病毒的重组病毒，属于猪繁殖与呼吸综合征的防制领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种高度传染病，又称“猪蓝耳病”。本病以妊娠母猪的繁殖障碍(后期流产、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病(间质性肺炎)为特征。1987年在美国中西部首先发现该病，1991年7月由荷兰中央兽医研究所首次分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，并命名为Lelystadvirus(Lv)，其后在加拿大、德、法、荷兰、英、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国家发生，曾被称为：“猪神秘病”(Swine mystery disease，SMD)、“猪蓝耳病”(Blue-ear disease)、猪不孕与呼吸综合征(SIRS)。1992国际兽疫局在国际专家研讨会上采用猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)这一名称。同年，国际兽疫局(OIE)将该病列为B类传染病。20世纪90年代以来，PRRSV几乎已传播到世界上所有养猪的国家，成为危害规模化养猪业的重要传染病，严重阻碍了世界养猪业的发展。

我国于1996年首次分离到PRRSV，并将其命名为CH-1a株，属于北美洲型。自分离到首株PRRSV以来，该病已严重阻碍了我国养猪业的发展。尤其是2006年5月以来，在我国南方由变异的高致病性PRRSV引发的以高热、高发病率和高死亡率为特征的猪传染病，对我国养猪业特别是养猪业比较发达的省份造成了巨大的经济损失。目前虽有商品化的弱毒疫苗和灭活苗被用于该病的防制。但由于PRRSV的变异与重组、病毒的ADE特性以及其主要侵害免疫系统^[而且还可以造成感染猪群的持续感染等因素，致使现有疫苗难以有效控制该病的发生。对于病毒传染性疾病，只有在搞清楚其发病机制与免疫机制的基础上，才能更加有效地开展预防与治疗研究工作。关于PRRS的免疫机制，目前尚缺乏系统的了解。很长时间以来，有不少学者认为体液免疫在防制PRRS方面发挥主要作用，这在一定程度上促使了有关PRRS的体液免疫的研究，也为预防和控制该病的发生起到了积极的作用。而有关该病细胞免疫方面的研究不过深入，这导致我们对PRRS的免疫机制缺乏全面了解。

对于大多数病毒性疾病，细胞免疫在清除病毒感染方面的作用不容忽视。细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是机体有效控制各种病毒感染及抗肿瘤、抗移植物的免疫细胞之一。在病毒感染时，MHC I类分子限制的抗原特异性CTL反应是清除病毒、控制病毒复制和扩散的主要机制。对大多数病毒性疾病来说，体液免疫与细胞免疫在清除病毒感染过程中是相辅相成不可或缺的。研究证实，PRRSV感染后可以诱发机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，尤其是近来的研究表明，细胞免疫在清除机体PRRSV感染方面可能起着更重要的作用，这为我们进一步开展研究PRRS的细胞免疫机制提供了理论依据。

M蛋白是PRRSV的膜基质蛋白，也是北美洲和欧洲株结构蛋白中最为保守的蛋白。并且该蛋白具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和特异性细胞免疫应答，而且其与GP5蛋白诱导的免疫反应可能与感染猪清除体内PRRSV有关。张治涛等人研究表明，重组腺病毒表达的M蛋白、GP5及其二者的融合蛋白对猪具有较强的免疫效力。这些资料均表明，PRRSV M蛋白在PRRSV与机体相互作用的过程中扮演着十分重要的角色。

CTL细胞表位是指胞内抗原经抗原递呈细胞(APC)加工后与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合，并共同被特异性递呈给T细胞受体(TCR)从而引起CTL免疫应答的短肽。确定CTL细胞表位对于研究病毒感染的细胞免疫机制、发病机制、免疫应答机制以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意义。

发明内容

本发明之一是提供一株重组牛痘病毒，该重组牛痘病毒含有PRRSV M基因；

本发明之二是识别和鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的CTL细胞表位；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株重组牛痘病毒，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3206；分类命名为：痘病毒；保藏时间是：2009年7月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

一种构建上述重组牛痘病毒的方法，包括以下步骤：将猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因克隆到pSC11上得到重组牛痘病毒转移载体pSC11-PRRSV-M；将WR株牛痘病毒液稀释后接种于TK^-143细胞，37℃感作1～2h；将转移重组质粒pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染到已感染病毒的单层TK^-143细胞上；筛选，鉴定，得到重组病毒rWR-PRRSV-M。

在动物机体受到病毒感染时，由MHC I类分子限制的抗原特异性CTL反应是清除病毒、控制病毒复制和扩散的主要机制^[6]。CTL表位一般是由8-11个氨基酸构成，其在CTL免疫应答过程中扮演着十分重要的角色，其决定了CTL特异性杀伤效应。因此，CTL表位的鉴定具有重要意义。

本发明利用预测合成的短肽对免疫小鼠的脾淋巴细胞进行体外刺激，然后利用细胞内胞内因子染色法(Intracellular cytokine staining，ICS)与酶联斑点免疫法(Enzyme-link Immunospot Assay，ELISPOT)两种实验方法检测IFN-γ分泌情况。结果表明，小鼠脾淋巴细胞经PMA+Ionomycin组合物及K₉₃FITSRCRL和F₅₇GYMTFVHF两条短肽刺激后，可以检测到分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞，而经不相关肽和其它短肽刺激后没有检测到分泌IFN-γ的T淋巴细胞。这说明在阳性对照与阴性对照成立的条件下，K₉₃FITSRCRL和F₅₇GYMTFVHF两条短肽均能刺激记忆性CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞，使其增值并分泌IFN-γ，因此，可确认K₉₃FITSRCRL和F₅₇GYMTFVHF两条肽段即为PRRSV M蛋白针对BALB/c小鼠的CTL表位。

考虑到鉴定CTL表位对实验动物模型及其生物安全级别均有较高的要求及实验条件，本发明最终选用SPF级近交系BALB/c小鼠作为动物模型。由于PRRSV不感染小鼠，本发明在构建DNA疫苗的同时又构建了表达PRRSV M蛋白的牛痘重组病毒。在此基础上采用Priming-Boosting策略免疫小鼠，这样不仅增强了免疫效果，也为Priming-Boosting策略的免疫效果提供了实验数据。鉴于单一的CTL表位预测方法的原理及侧重点不同，本发明利用SYFPEITHI、BIMAS、PRED^BALB/c三种常用的生物信息学预测方法同时对PRRSV M蛋白氨基酸序列进行预测，然后筛选并化学合成短肽，这样不仅提高了准确率，也节省了人力物力。

目前用于鉴定CTL表位的实验方法有很多，主要包括⁵¹Cr释放法、荧光测定法、有限稀释法(Limiting dilution analysis，LDA)、MHC I/肽四聚体技术(MHC I/peptidetetramer)、细胞内胞内因子染色法(Intracellular cytokine staining，ICS)、酶联斑点免疫法(Enzyme-link Immunospot Assay，ELISPOT)。鉴定CTL表位的一个主要指标就是分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞的数量，因此本发明将免疫鼠的脾淋巴细胞用短肽进行体外刺激，然后利用PerCP标记的土拨鼠抗小鼠CD3e抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体及FITC标记的大鼠抗小鼠的IFN-γ抗体进行三色荧光染色，具体原理是以总T淋巴细胞(CD3⁺T淋巴细胞)设门，然后圈定CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞，在此基础上直接检测分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴的数量，这样就能从单个CD8⁺T淋巴细胞水平上来反映细胞因子的分泌情况，试验结果更加直接可靠。为验证试验结果的可靠性，本发明又进行了ELISPOT实验。对于本发明而言，该实验检测的是所有分泌IFN-γ的T淋巴细胞，而ICS是检测特异性分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞，将这两种方法结合在一起，这样通过两种实验结果的一致性更能说明鉴定结果的可靠性。

MHC分子在小鼠上被称为H-2分子，因而H-2即代表了小鼠的MHC复合体，其基因位于小鼠第17号染色体上。其中经典的H-2I类基因包括H-2K、H-2D和H-2L三个亚类。对BALB/c小鼠来说，编码H-2分子的等位基因为d，故BALB/c小鼠的H-2I类分子就包括H-2K^d、H-2D^d和H-2L^d三个亚类。本发明鉴定出了两个CTL表位，其中K₉₃FITSRCRL为H-2K^d限制性的CTL表位，而F₅₇GYMTFVHF为H-2D^d限制性的CTL表位。即PRRSV M存在一个H-2K^d限制性的CTL表位和一个H-2D^d限制性的CTL表位。

PRRSV给世界养猪业造成的危害越来越引起人们的重视，各国学者也纷纷在为有效的预防控制该病而努力。全面了解PRRSV的免疫机制，尤其是对细胞免疫机制的认识是有效防控该病的基础。本发明首次利用小鼠这一动物模型鉴定PRRSVCTL表位，将为进一步阐明该病免疫机制奠定基础。

附图说明

图1PRRSV M基因RT-PCR扩增结果；M：DL2000DNAmarker；1：PRRSV M基因的PCR产物；2：阴性对照。

图2小鼠泛素基因RT-PCR扩增结果；M：DL2000DNA Marker；1：小鼠泛素基因PCR产物；2：阴性对照。

图3PRRSV M蛋白的SDS-PAGE实验结果；M：蛋白分子量marker；1：纯化的重组PRRSVM。

图4PRRSV-M蛋白的Western blot实验结果；M：预染色的蛋白分子量marke；1：重组PRRSVM。

图5蛋白标准品BSA浓度标准曲线。

图6重组质粒pVAX1-M的Xba I酶切鉴定；M：DL15000DNA Marker；2：pVAX1-M/Xba I。

图7重组质粒pVAX1-U-M的BamHI和EcoR I酶切鉴定；1：DL15000DNAMarke；3pVAX1-U-M/BamH I和EcoR。

图8pVAX1-M和pVAX1-U-M转染BHK-21细胞后IFA鉴定结果；A：pVAX1-M；B：pVAX1-U-M；C：pVAX1。

图9重组转移质粒pSC11-PRRSV-M的构建。

图10重组转移质粒pSC11-PRRSV-M连接方向鉴定；M：DL2000DNA marker；1，2，3：正向连接；3：反向连接。

图11重组牛痘病毒rWR-PRRSV-M感染；TK^-143细胞后出现蓝色蚀斑。

图12重组牛痘病毒rWR-PRRSV-M的基因组鉴定；M：DL2000DNA marker；1，2：rWR-PRRSV-M的PCR产物；3：WR株牛痘病毒。

图13rWR-PRRSV-M的Western blot结果；FM：预染色的蛋白分子量marke；1：rWR-PRRSV-M；2：WR株牛痘病毒。

图14rWR-PRRSV-M感染BHK-21细胞后IFA鉴定结果；A：rWR-PRRSV-M；B：WR株牛痘病毒。

图15按照prime-boost策略免疫小鼠后，ELISA抗体水平检测结果。

图16刺激后小鼠脾淋巴细胞流式检测结果。

图17刺激后小鼠脾淋巴细胞流式检测数据统计结果。

图18酶联免疫斑点试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例

1材料与方法

1.1.1实验材料PRRSV CH-1a株、PRRSV阳性血清、PRRSV阴性血清、抗PRRSVM蛋白单抗由中国农科院哈尔滨兽医研究所猪病研究室惠赠；WR株牛痘病毒、重组转移质粒pSC11、BHK-21细胞、TK^-143细胞及各种E.coli感受态细胞均由本所人畜共患病课题组步志高研究员惠赠。

1.1.2主要试剂pVAX1质粒、Lipofectamine^TM 2000Reagent购自Invitrogen公司；pGEX-6p-1质粒购自Pharmacia公司。各种限制性内切酶、连接酶、反转录酶、Taq酶、Pyrobest酶、pMD18-T Vector、DNA Marker均购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收小量试剂盒购自上海华舜生物试剂有限公司；

MiniKit、QIAquick PCR Purification Kit、EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；EZ-Sep^TM Mouse 1×Lymphocyte Separationmedium购自达科为生物技术有限公司；BRADFORD法测定蛋白质浓度试剂盒购自上海碧云天生物试剂有限公司；FITC标记的兔抗猪IgG抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体、佛波醇酯(PMA)、娄诺霉素(Ionomycin)、布雷菲尔德菌素(Brefeldin A)、皂苷(saponin)购自SIGMA公司；胎牛血清购自GIBCOBRL公司；FACSCalibur流式细胞仪、FITC标记的大鼠抗小鼠的IFN-γ抗体；PE标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体、PerCP标记的土拨鼠抗小鼠CD3e抗体、ELISPOT Set、AEC Substrate Set购自BD公司；HPLC纯化多肽(纯度≥98％)由中科亚光生物科技有限公司合成；实验所使用的引物均由Invitrogen公司合成；不相关肽为鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白T细胞表位肽N_71-78(WRRQARYK)，由上海吉尔生化有限公司合并由本实验室保存。

1.1.3实验动物：SPF级BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，所有实验小鼠均在SPF隔离器内饲养。

1.2方法

1.2.1PRRSV M基因与小鼠Ub基因的克隆

用

Mini Kit提取PRRSV CH-1a株与小鼠脾脏的总RNA，用随机引物进行逆转录反应后，进行PCR扩增，两目的片段的扩增条件均为：95℃5min；94℃30s，55℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后与pMD18-TVector连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。经质粒抽提、PCR鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD-M、pMD-U。

1.2.2PRRSV-M蛋白的截短表达、纯化及Western blot分析

由于M蛋白在体外表达系统中难以表达，在设计引物(表1)PRRSV-M-JD-F、PRRSV-M-JD-R时将氨基端疏水性较强氨基酸残基去掉。以重组质粒pMD-M为模板PCR扩增截短后的M基因，扩增产物经纯化、酶切、胶回收后与经同样处理的pGEX-6P-1载体连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，经质粒抽提、PCR、酶切鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒命名pGEX-M。将pGEX-M转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG(终浓度为0.8mM)诱导培养4～6h，收集菌体沉淀进行超声破碎。包涵体用含0.6％十二烷基肌氨酸钠盐(SKL)缓冲液进行缓慢溶解后，加入终浓度为0.2％的PEG 4000与终浓度为1.0mM氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽进行复性。然后利用GST纯化试剂盒进行纯化。将纯化后的蛋白进行Westernblot与SDS-PAGE分析，以同样条件处理的pGEX-6P-1空载体为对照。

1.2.3PRRSV-M蛋白的浓度测定

将蛋白纯化后使用Bradford法测定蛋白浓度。即将蛋白标准样品(BSA)稀释至终浓度为0.5mg/mL；然后将蛋白标准样品(BSA)按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL分别加到96孔ELISA板中，同时加标准品稀释液补足到20μL；然后相应体积的待测样品到96孔ELISA板中，同样加标准品稀释液补足到20μL；各孔加入200μL G250染色液，室温静置3～5分钟；测定波长为595nm处的吸光值并使用Microsoft Office Excel(2003)绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中的蛋白浓度。

1.2.4Ub基因与PRRSV M的融合

利用SOE技术将Ub基因与M基因进行融合，根据融合原理针对PRRSV-M设计上下游引物：PRRSV-M-Ub-F、PRRSV-M-Ub-R(表1)。以上述构建好的重组质粒pMD-M与pMD-U为模板进行PCR扩增，对PRRSV-M与Ub的扩增产物分别进行胶回收，以回收产物为模板，以Ub基因的上游引物与PRRSV-M基因的下游引物进行PCR，反应条件为：95℃5min；94℃30s；63.5℃45s；72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。融合产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后与pMD18-T Vector连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。经质粒抽提、PCR鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒命名为pMD-U-M。

1.2.5真核表达质粒pVAX1-M与pVAX1-U-M的构建

以重组质粒pMD-M、pMD-U-M为模板，分别以引物(见表1)PRRSV-M-F、PRRSV-M-R与PRRSV-M-Ub-F、PRRSV-M-Ub-R亚克隆M基因与Ub-M融合基因，对其产物进行纯化、酶切、胶回收后与经同样处理的pVAX1载体连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，经质粒抽提，PCR、酶切鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pVAX1-M、pVAX1-U-M。

1.2.6表达产物的间接免疫荧光(IFA)实验

按照Lipofectamine^TM 2000说明书进行操作，即在转染前一天将BHK-21细胞用无抗生素的DMEM培养液以0.5～2x10⁵cells/孔接种24孔细胞培养板；24h后，将纯化的阳性重组质粒pVAX1-M、pVAX1-U-M与空质粒pVAX1在脂质体的介导下转染到长成80％～90％的单层BHK-21细胞上(质粒转染量为0.8μg)。48h后冷丙酮固定30min，PBST洗涤三次，用含有1％BSA的PBS封闭2h；PBST洗涤三次，加入一抗(抗PRRSV阳性血清)，37℃作用2h；PBST洗涤三次，接着加入FITC标记的兔抗猪的二抗，37℃作用2h；PBST洗涤三次，于荧光显微镜下观察和拍照。

1.2.7重组牛痘病毒转移载体pSC11-PRRSV-M的构建

以上述构建好的重组质粒pMD-M为模板，以引物pSC11-M-F、pSC11-M-R(表1)进行PCR，反应条件为：95℃5min；94℃30s；60℃45s；72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、酶切、胶回收后与经同样处理的重组转移质粒pSC11连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。质粒抽提后，进行目的片段的连接方向鉴定，即使用引物P7.5-F与pSC11-M-R进行PCR，反应条件为：95℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR鉴定方向正确后测序，构建正确的重组质粒命名为pSC11-PRRSV-M。

表1PCR扩增引物设计

引物Ub-F和pSC11-M-F的黑体字是Kozak序列；引物Ub-R的下划线部分代表所设计的突变位点，斜体字部分是连接子序列。

1.2.8病毒重组

病毒重组前一天用含有终浓度为25μg/mL的5’-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)^[20]的MEM培养液将TK^-143细胞以0.5～2×10⁵cells/孔接种6孔细胞培养板。次日，待细胞融合度达到80％时，将WR株痘病毒液(M.O.I＝1)以10倍梯度稀释后接种于TK^-143细胞，37℃感作1～2h。按照Lipofectamine^TM 2000说明书进行操作，将纯化的转移重组质粒pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染到已感染病毒的单层TK^-143细胞上(质粒转染量为2.0μg)。将细胞于37℃培养并观察细胞病变(CPE)，待CPE达到80％时收毒。

1.2.9重组病毒rWR-PRRSV-M的筛选

在终浓度为25μg/mL的BrdU的压力下，将感染转染后的培养物在TK^-143细胞上盲传2～3代，至细胞稍圆缩，但不形成蚀斑时，在Hela细胞上做蚀斑实验纯化病毒(X-gal染色)2～3代至没有可见的非重组病毒斑(白斑)。即取盲传扩增的病毒液接种Hela单层细胞，37℃感作2h后弃掉病毒液，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂，培养24～48h，待出现典型的CPE时，再覆盖一层含250μg/mLX-gal的DMEM营养琼脂，继续培养12～24h后挑取蓝斑，进行新一轮的蚀斑纯化，共进行5轮蚀斑纯化。筛选纯化的重组病毒命名为rWR-PRRSV-M。

1.2.10rWR-PRRSV-M基因组中PRRSV M基因的PCR鉴定

将纯化的rWR-PRRSV-M感染TK^-143细胞，培养后收取病毒液，用碱裂解方法提病毒DNA进行PCR鉴定。即收取病毒培养液437.5μL，然后加入适量蛋白酶K(终浓度为500μg/mL)与10％SDS(终浓度为1％)，37℃水浴30min；加入酚/氯仿抽提，4℃离心后取上层水相并加入1/10体积的3M NaAC(pH5.2)、2倍体积的冷乙醇，-20℃放置过夜；4℃离心后取适量上清，加入0.5mL无水乙醇，-20℃放置3h；4℃离心15min，沉淀用20μL灭菌去离子水溶解；取病毒DNA 1μL做PCR鉴定，反应条件为：95℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

1.2.11rWR-PRRSV-M的间接免疫荧光

在病毒感染前一天将BHK-21细胞用DMEM培养液以每孔0.5～2x10⁵cells接种24孔细胞培养板；24h后，将rWR-PRRSV-M以M.O.I为0.01的感染量接种细胞，待细胞出现明显CPE时，弃去培养液，用PBS冼两次；用90％乙醇固定30min，PBST冲洗5～10min，用含有1％BSA的PBS封闭2h；PBST洗涤三次，加入一抗(原核表达PRRSV M蛋白纯化后免疫小鼠所制备的血清)，37℃作用2h；PBST洗涤三次，接着加入FITC标记的兔抗鼠的二抗，37℃作用2h；PBST洗涤三次，于荧光显微镜下观察和拍照。

1.2.12质粒DNA的制备与小鼠免疫

用EndoFree Plasmid Maxi Kit纯化质粒DNA后，用Prime-boost策略对SPF级BALB/c进行肌肉免疫。即：将6-8周龄的BALB/c小鼠随机分成4组(30只/组)。分别肌肉注射免疫pVAX1、pVAX1-M、pVAX1-U-M，免疫量为100μg/只，共免疫4次，每次间隔3周。四次免疫后一周使用M.O.I约为0.1的量进行腹腔加强免疫，同时空载体组使用WR株牛痘病毒进行免疫。分别在二免、三免、四免、加强免疫后一周(即一免疫后第28d、49d、70d、84d)分离血清进行ELISA抗体水平检测。

1.2.13ELISA抗体水平的检测与分析

以上述原核截短表达、纯化的PRRSV M蛋白为检测抗原，阳性对照的检测抗原为紫外灭活后的全病毒(紫外线照射25分钟)。按常规方法建立间接ELISA法，首先通过方阵滴定实验来确定抗原包被浓度与血清稀释浓度，并在此基础上进一步确定酶标二抗的稀释度以确定最佳工作浓度，建立ELISA方法。同时用方差分析F检验-双样本方差分析试验结果，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。1.2.14CTL表位的预测、筛选及合成

使用SYFPEITHI、BIMAS、PRED^BALB/c三种生物信息学预测方法对PRRSV M蛋白进行CTL表位预测。然后根据预测分数进行筛选并化学合成(见表2)。

表2化学合成的短肽

1.2.15小鼠脾淋巴细胞的制备、体外刺激及流式检测

加强免疫后对小鼠实施安乐死后无菌采取脾脏，并将其剪碎研磨后使用EZ-Sep^TM小鼠的淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，对细胞计数后使用完全1640培养液将淋巴细胞重悬，按10⁶cells/孔加入到96孔细胞培养板中。然后加入终浓度为20μg/ml短肽进行刺激，用PMA与Ionomycin复合物刺激的细胞孔为阳性对照，不相关肽刺激的细胞孔与不加任何刺激物的细胞孔为阴性对照。37℃，5％CO₂培养2～3h后加入Brefeldin A进行阻断，然后继续培养6～8h。完毕后4℃，250×g离心10min，弃培养液加入PBS/NaN3(含有0.09％NaN3)洗一遍；加入1∶100稀释的PE标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体与1∶200PerCP标记的土拨鼠抗小鼠CD3e抗体，4℃，避光染色30min；完毕后4℃，250×g离心10min，弃抗体稀释液加入PBS/NaN3洗2遍；1％多聚甲醛4℃固定20min；4℃，500×g离心10min，弃固定液加入PBS/NaN3洗2遍；加入1％皂素室温避光透膜20min；4℃，500×g离心10min，弃透膜液；加入1∶200FITC标记的大鼠抗小鼠的IFN-γ抗体，4℃，避光染色30min；完毕后4℃，500×g离心10min，弃抗体稀释液加入PBS/NaN3洗2遍；PBS/NaN3重悬细胞，上机检测分析，并运用方差分析统计数据。

1.2.16酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

按照ELISPOT Set说明书进行，即先将捕获抗体以5μg/mL的终浓度4℃包被过夜；24h后用含有10％FBS的1640培养液室温封闭2h；将小鼠脾淋巴细胞按5×10⁵cells/孔加到检测孔中，同时加入短肽、阳性刺激物、阴性刺激物(同流式检测试验)，37℃，5％CO₂培养24h；弃掉细胞并洗涤，加入终浓度为2μg/rnL的检测抗体，室温2h；弃掉检测抗体并洗涤，加入酶标亲和素，室温1h；弃掉酶标亲和素并洗涤，加入AEC底物显色液室温作用30min；弃掉底物显色液并洗涤，然后上机读板并运用方差分析统计数据。

2实验结果

2.1PRRSV M基因及小鼠Ub基因的扩增、克隆及鉴定

应用RT-PCR方法从PRRSV CH-1a株与小鼠脾脏的总RNA中分别扩增出了大小约为546bp与258bp左右的特异性片段(图1、图2)，与预期大小相符。

2.2PRRSV M蛋白的截短表达、纯化及其免疫活性检测

将重组质粒pGEX-M转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以终浓度为0.8mMIPTG进行诱导表达4～6h，菌体诱导培养物经超声波破碎后进行SDS-PAGE，结果获得了大小约为36KDa的PRRSV-M蛋白，然后对按照上述的方法对表达产物进行纯化，并对纯化产物进行SDS-PAGE与Western blot实验。结果表明，在大约36KDa处均出现了PRRSV M蛋白的条带。这说明本研究获得了较纯的PRRSV M蛋白(图3)，并且所获得的目的蛋白具有较强的免疫原性(图4)。

2.3重组质粒pGEX-M表达PRRSV M蛋白浓度测定

表3蛋白标准品标准曲线的绘制

空白调零后，纯化蛋白的OD595的值为0.4493，根据标准曲线和标准方程计算得纯化蛋白液的浓度大约为0.419mg/mL(图5)。将纯化蛋白加甘油到50％，分装后-80℃保存。

2.4真核重组质pVAX1-M、pVAX1-U-M的构建

阳性重组质粒pVAX1-M经XbaI酶切后获得了大小分别约为3000bp、534bp的两条带(图6)；而pVAX1-U-M分别经BamH I与EcoR I酶切后获得了大小约为765bp、3000bp的两条带。条带大小均与预期相符(图7)。

2.5表达产物的间接免疫荧光(IFA)实验IFA实验

将重组质粒转染BHK-21细胞后，IFA实验表明pVAX1-M、pVAX1-U-M在真核细胞内能够进行有效的转录，并表达目的蛋白(图8)。

2.6重组牛痘病毒转移载体pSC11-PRRSV-M的构建

以上述构建好的重组质粒pMD-M为模板，以引物(见表1)pSC11-M-F、pSC11-M-R进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、酶切、胶回收后与经同样处理的重组转移质粒pSC11连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。质粒抽提后，进行正反方向鉴定，PCR扩增得到了大小约为580bp的特异性条带，鉴定正确的重组质粒命名pSC11-PRRSV-M(图9，图10)。

2.7rWR-PRRSV-M的筛选及基因组的PCR鉴定

将重组转移质粒pSC11-PRRSV-M转染至已感染WR株痘病毒的TK^-143细胞，pSC11-PRRSV-M与野毒WR株发生同源重组，重组牛痘病毒带有LacZ基因，在含X-gal的营养琼脂上产生蓝色蚀斑(图11)，而野毒对照无蓝色蚀斑(图略)；通过连续5轮蓝斑筛选、纯化后的rWR-PRRSV-M形成的蚀斑均为蓝色。将纯化的重组病毒rWR-PRRSV-M感染TK^-143细胞后，收取病毒液用碱裂解方法提病毒DNA进行PCR鉴定，结果表明PRRSV-M基因准确重组到牛痘病毒WR株基因组中(图12)。

2.8rWR-PRRSV-M的Western blot实验结果

待感染rWR-PRRSV-M的BHK-21CPE达到90％时，收集细胞进行裂解，然后进行Western blot实验，用同样处理的野毒感染的BHK-21作为对照。结果表明，rWR-PRRSV-M感染的细胞样品在约19kDa处出现了反应条带，而野毒感染的细胞样品则没有相应条带出现(图13)。这说明，rWR-PRRSV-M在感染的细胞内成功表达了PRRSV M蛋白，并且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。

2.9重组病毒rWR-PRRSV-M的间接免疫荧光结果

将rWR-PRRSV-M以M.O.I为0.01的感染量接种BHK-21细胞，待细胞出现明显CPE时，进行IFA实验。结果表明rWR-PRRSV-M在BHK-21细胞内成功表达了PRRSVM蛋白。

2.10免疫后ELISA抗体水平检测

方阵滴定实验的结果表明，抗原包被浓度为0.5μg/mL，血清稀释度为1∶100时，ELISA结果的P/N值最高，将上述抗原包被浓度和血清稀释度定为本实验的工作浓度。ELISA结果表明，二次免疫之后，重组质粒pVAX1-M、pVAX1-U-M均能诱导机体产生抗体，与空载体组相比差异显著(P＜0.05)，但是抗体水平较低，且两免疫组之间未见差异。三免之后小鼠产生的抗体水平明显升高，且两免疫组之间差异显著(P＜0.05)，且质粒免疫组与空载体免疫组相比差异极显著(P＜0.01)。四免之后的抗体水平继续升高，两质粒免疫组、空载体免疫组之间差异极显著(P＜0.01)。而且在使用rWR-PRRSV-M刺激后，抗体水平再次升高，两质粒免疫组之间差异显著(P＜0.05)，而空载体免疫组在使用WR株牛痘病毒刺激后抗体水平无明显变化。这进一步说明本研究所构建的质粒DNA及重组病毒在免疫后均能机体诱导良好的免疫反应(见图15)。

2.11小鼠脾淋巴细胞的制备、体外刺激及流式检测

小鼠脾淋巴细胞经刺激物刺激后，流式检测结果表明阳性对照组可见有明显分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞。而且，经短肽K₉₃FITSRCRL与F₅₇GYMTFVHF刺激的细胞也见有分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞(组图16)。同时对所有免疫小鼠的流式检测结果进行数据统计，结果表明经短肽K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF及PMA和IONO组合刺激的小鼠脾淋巴细胞孔均能分泌IFN-γ，而不经刺激的小鼠脾淋巴细胞与经不相关肽刺激的小鼠脾淋巴细胞却检测不到IFN-γ。这说明短肽K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF均能有效的刺激记忆性的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞增殖分化并分泌IFN-γ(图17)。方差分析结果表明，小鼠脾淋巴细胞经短肽K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF刺激后，分泌IFN-γ的CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞数量与其它肽段所刺激的结果相比较差异极显著(P＜0.01)。

2.12酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

分离小鼠脾淋巴细胞后，按照BD公司BD^TMELISPOT SET说明书进行酶联免疫斑点试验，以检测IFN-γ的分泌细胞.从而进一步验证CTL表位.实验结果表明，经短肽K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF及PMA和Ionomycin组合刺激的小鼠脾淋巴细胞孔均能分泌IFN-γ，而不经刺激的小鼠脾淋巴细胞与经不相关肽刺激的小鼠脾淋巴细胞却检测不到IFN-γ(图18)。方差分析结果表明，小鼠脾淋巴细胞经短肽K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF刺激后的斑点统计结果与其它肽段所刺激的结果相比较差异极显著(P＜0.01)。

Claims (5)

1.一株重组牛痘病毒，其微生物保藏号是：CGMCC NO.3206。

2.一种构建权利要求1所述重组牛痘病毒的方法，包括以下步骤：将猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因克隆到pSC11上得到重组牛痘病毒转移载体pSC11-PRRSV-M；将WR株牛痘病毒液稀释后接种于TK^-143细胞，37℃感作1～2h；将转移重组质粒pSC11-PRRSV-M转染到已感染病毒的单层TK^-143细胞上；筛选，鉴定，即得。

3.权利要求1所述重组牛痘病毒在制备诊断、预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。

4.猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白针对BALB/c小鼠的CTL细胞表位，其特征在于：其氨基酸序列分别为K₉₃FITSRCRL、F₅₇GYMTFVHF。

5.权利要求4所述CTL细胞表位在制备诊断、预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途。

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