CN113181356B - 猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备 - Google Patents
猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备，包括以下步骤：A、PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位；B、Mhp的P46和P65的抗原表位；C、PRRSV和Mhp抗原表位的重组；D、对重组抗原表位蛋白RP1进行亲水性等分析及二级结构分析；F、重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建；G、重组抗原表位蛋白RP1表达及验证；H、重组抗原表位蛋白RP1的纯化及验证。本发明可以同时有效预防PRRSV及Mhp感染，极大的降低了操作难度，节省了疫苗本身和人力注射的成本；能够一次注射，预防多种疾病，适用于养猪业对PRRSV及Mhp的预防，安全性高、免疫效果好。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体的涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备。
背景技术
猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种典型的以母猪生殖障碍及生长猪呼吸窘迫为特征的传染性疾病，其病原体为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，具有连续性传染及抗原变化能力，进化速度快、环境适应能力强、传播速度快，涉及范围广泛，严重制约世界养猪业的健康可持续性发展。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia，Mhp)可引起猪喘气病，此病难以根治，经常季节性爆发，在猪上皮纤维细胞上黏附，破坏呼吸道的滤过功能，造成其他病原菌的继发感染，形成猪的呼吸道疾病综合征(Porcin respiratory disease complex，PRDC)。
猪群经常感染一种以上的呼吸疾病，因此二联或多联疫苗是目前疫苗研究的热点方向。然而目前设计使用的疫苗大都不是为了联合使用设计的，联合使用可能会降低疗效，目前也没有针对猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸障碍综合征的联合疫苗，所以急需一种能够同时预防猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸障碍综合征交叉感染的联合疫苗。
表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗。抗原表位又称为抗原决定簇，根据其引起的免疫应答不同可分为B表位和T表位，同理，表位疫苗也可分为B表位疫苗和T表位疫苗以及T表位和B表位都有的多表位疫苗。
多表位疫苗既含有B表位，也含有T表位，与其他疫苗相比具有高效呈递，能够有效应对病毒分子的变异和免疫中的不利因素，诱发细胞免疫等方面的优势，T细胞免疫的过程需要主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子与抗原表位紧密结合，CTL细胞表位能够与大多数MHC-II类分子结合，不加选择，克服了MHC-II的限制性，增强表位多肽的免疫原性，所以多表位疫苗能够克服MHC分子的遗传限制。
二联或多联表位疫苗既有表位疫苗本身的优势，同时又能够预防多种疾病，极大的降低了操作难度，既节省了疫苗本身的成本，也节省了人力注射的成本，能够一次注射，预防多种疾病，这也是目前疫苗研究的一个热点方向。
传统疫苗主要以灭活疫苗，弱毒疫苗为主。灭活疫苗安全可靠，无毒力返强的危险，但是灭活疫苗存在免疫效果不佳、免疫剂量多、免疫次数多的缺点；弱毒疫苗产生抗体快，免疫次数少，但是弱毒疫苗存在毒力返强的危险，易发生水平和垂直的传播，易发生重组和变异。表位疫苗利用病原体上能与糖蛋白和核蛋白复合体特异性结合的抗体结构，保留了免疫原性且无致病性，安全可靠。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪肺炎支原体是养猪业中常见的两种病原，经常交叉感染，造成巨大经济损失，虽然已有疫苗分别预防两类病原感染，但是联合使用时疫苗的保护效力会受到影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，本发明利用基因工程技术，制备了一种猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗，能够同时预防猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪肺炎支原体感染。
本发明采用的技术方案为∶猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备，其特征在于：包括以下步骤：
A、PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位：获得PRRSV的GP5和GP6蛋白抗原表位数据，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用PRRSV的抗原表位PRRSV-GP5和PRRSV-GP6；
B、Mhp的P46和P65的抗原表位：使用Bepipred Linear Epitope Prediction预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的B细胞表位，使用ProPred-I预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的T细胞表位，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用Mhp的抗原表位Mhp-P46和Mhp-P65；
C、PRRSV和Mhp抗原表位的重组：将PRRSV-GP5、PRRSV-GP6、Mhp-P46和Mhp-P65蛋白抗原表位进行重组，得到重组抗原表位蛋白RP1；B细胞表位之间选择柔性态GGGGS(DNA序列为GGTGGTGGTGGTTCT)间隔连接，T细胞表位与B细胞表位之间以及T细胞表位与T细胞表位之间选择KK(DNA序列为AAAAAA)连接；重组抗原表位蛋白RP1的DNA序列进行密码子优化后合成相应DNA片段；
D、对重组抗原表位蛋白RP1进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析；
E、对重组抗原表位蛋白RP1进行二级结构分析：利用SOPM对重组抗原表位蛋白进行二级结构的分析，重组抗原表位蛋白RP1中的各B细胞表位几乎都位于无规则卷曲和β转角；
F、重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建：将合成的重组抗原表位DNA片段与原核表达载体pET-28a使用限制性内切酶进行双酶切，之后使用T4 DNA连接酶连接，经验证后，得到重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1；
G、对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证；
H、对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证；
I、将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1：(0.1～10)体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.05～5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗。
进一步地，所述A步骤中对应使用PRRSV的抗原表位如下：
| 表位类型 | 蛋白 | 氨基酸序列 |
| B | GP5 | SS-IQLIYNLTLOEL-NG |
| B | GP5 | VEKGGKVEVEGHLIDLKRV |
| T | GP5 | LAALICFVIRLAKNC |
| T | GP5 | RLYRWRSPV |
| B | GP6 | FWRRPGSTTVNGTLVPGLKSLVLGGR |
| B | GP6 | AVKQGVVNLVKYAK |
| T | GP6 | CNDSTAPQKVLLAFS |
| T | GP6 | FGYMTFVHFESTNRV |
。
进一步地，所述B步骤中使用的抗原表位如下：
| 表位类型 | 蛋白 | 氨基酸序列 |
| B | P46 | ANLSPAPKGFIAPENG9GVGTA |
| B | P46 | KYDNQTYKVQGK |
| T | P46 | KKFLYSSAIYA |
| T | P46 | DLSPEGENAVYV |
| B | P65 | DQEEKDDSNAEELKTTNFDDFDENKPTYS |
| B | P65 | STFDTDQEAAIKDDKRT |
| B | P65 | NKVKDYAR |
| T | P65 | GYKKIAHQLLLKLTLDQEEK |
| T | P65 | VREVSL_PIFDNFDFRELIPVPVKNPFV |
进一步地，所述D步骤中对重组抗原表位蛋白进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析的具体方法为：利用Kyte-Doolittle方法预测重组抗原表位蛋白的亲水性，利用Jameson-wolf方法进行重组抗原表位蛋白的抗原性指数分析，利用Karplas-Schulz方法对该重组抗原表位蛋白进行柔韧性分析，利用Emini方法预测特定区域位于重组抗原表位蛋白的表面可及性。
进一步地，所述PRRSV来自QHD株。
进一步地，所述G步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证的具体方法为：将重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达和破碎后，将分离得到的上清液、沉淀经SDS-PAGE分析，与空白载体对照组相比，重组抗原表位蛋白RP1组上清液存在41.14kDa的蛋白片段；经western-blot验证，重组抗原表位蛋白RP1蛋白进行了部分可溶性表达。
进一步地，所述G步骤中诱导表达的条件为20℃，20h，诱导剂为0.5mM IPTG。
进一步地，所述H步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证的具体方法为：经过镍柱纯化后的重组抗原表位蛋白RP1经SDS-PAGE及western-blot验证，得到单一的一条目的蛋白，大小为41.14kDa。
进一步地，所述I步骤中将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1∶1体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗。
本发明获得的有益效果为∶本发明制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗，可以同时有效预防PRRSV及Mhp感染，极大的降低了操作难度，既节省了疫苗本身的成本，也节省了人力注射的成本；能够一次注射，预防多种疾病，适用于养猪业对PRRSV及Mhp的预防；同时具备表位疫苗的各项优点，与传统灭活疫苗或弱毒疫苗相比，安全性高、免疫效果好。
附图说明
图1为本发明抗疫表位排列方式图；
图2为本发明重组表位蛋白的亲水性分析图；
图3为本发明重组表位蛋白抗原性指数分析图；
图4为本发明重组表位蛋白表面可及性分析图；
图5为本发明重组表位蛋白柔韧性分析图；
图6为本发明重组抗原表位蛋白二级结构分析图；
图7为本发明重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1图谱；
图8A为本发明重组抗原表位蛋白SDS-PAGE表达情况分析图；
图8B为本发明重组蛋白western-blot表达情况分析图；
图9A为本发明纯化后蛋白SDS-PAGE验证；
图9B为本发明纯化后蛋白western-blot验证；
图10为本发明重组蛋白与重组蛋白免疫组血清反应图；
图11A为本发明重组蛋白RP1与PRRSV免疫组血清反应图；
图11B为本发明重组蛋白RP1与Mhp免疫组血清反应图；
图12A为本发明Mhp与RP1免疫组血清反应图；
图12B为本发明PRRSV与RP1免疫组血清反应图；
图13A为本发明IL-2细胞因子水平图；
图13B为本发明IL-10细胞因子水平图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
如图1-13B所示，猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备，包括以下步骤：
A、来自QHD株的PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位：获得PRRSV的GP5和GP6蛋白抗原表位数据，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用PRRSV的抗原表位PRRSV-GP5和PRRSV-GP6；
B、Mhp的P46和P65的抗原表位：使用Bepipred Linear Epitope Prediction预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的B细胞表位，使用ProPred-I预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的T细胞表位，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用Mhp的抗原表位Mhp-P46和Mhp-P65；
C、PRRSV和Mhp抗原表位的重组：将PRRSV-GP5、PRRSV-GP6、Mhp-P46和Mhp-P65蛋白抗原表位进行重组，得到重组抗原表位蛋白RP1；B细胞表位之间选择柔性态GGGGS(DNA序列为GGTGGTGGTGGTTCT)间隔连接，T细胞表位与B细胞表位之间以及T细胞表位与T细胞表位之间选择KK(DNA序列为AAAAAA)连接；重组抗原表位蛋白RP1的DNA序列进行密码子优化后合成相应DNA片段；
D、对重组抗原表位蛋白RP1进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析；
E、对重组抗原表位蛋白RP1进行二级结构分析：利用SOPM对重组抗原表位蛋白进行二级结构的分析，重组抗原表位蛋白RP1中的各B细胞表位几乎都位于无规则卷曲和β转角；
F、重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建：将合成的重组抗原表位DNA片段与原核表达载体pET-28a使用限制性内切酶进行双酶切，之后使用T4 DNA连接酶连接，经验证后，得到重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1；
G、对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证；
H、对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证；
I、将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1∶1体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗。
所述D步骤中对重组抗原表位蛋白进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析的具体方法为：利用Kyte-Doolittle方法预测重组抗原表位蛋白的亲水性，利用Jameson-wolf方法进行重组抗原表位蛋白的抗原性指数分析，利用Karplas-Schulz方法对该重组抗原表位蛋白进行柔韧性分析，利用Emini方法预测特定区域位于重组抗原表位蛋白的表面可及性。
所述G步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证的具体方法为：将重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，20℃，20h，诱导剂为0.5mM IPTG，经诱导表达和破碎后，将分离得到的上清液、沉淀经SDS-PAGE分析，与空白载体对照组相比，重组抗原表位蛋白RP1组上清液存在41.14kDa的蛋白片段；经western-blot验证，重组抗原表位蛋白RP1蛋白进行了部分可溶性表达。
所述H步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证的具体方法为：经过镍柱纯化后的重组抗原表位蛋白RP1经SDS-PAGE及western-blot验证，得到单一的一条目的蛋白，大小为41.14kDa。
具体实施时：
一、抗原表位的筛选与合成
1.取自QHD株的PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位
通过查阅文献，获得PRRSV的GP5和GP6蛋白抗原表位数据，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用PRRSV的抗原表位PRRSV-GP5和PRRSV-GP6，如表1所示。
表1 PRRSV-GP5和PRRSV-GP6的抗原表位
| 表位类型 | 蛋白 | 氨基酸序列 |
| B | GP5 | SSHIQLIYNLTLCELNG |
| B | GP5 | VEKGGKVEVEGHLIDLKRV |
| T | GP5 | LAALICFVIRLAKNC |
| T | GP5 | RLYRWRSPV |
| B | GP6 | FVVRRPGSTTVNGTLVPGLKSLVLGGR |
| B | GP6 | AVKQGVVNLVKYAK |
| T | GP6 | CNDSTAPQKVLLAFS |
| T | GP6 | FGYMTFVHFESTNRV |
2.Mhp的P46和P65的抗原表位：使用Bepipred Linear Epitope Prediction预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的B细胞表位，使用ProPred-I预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的T细胞表位，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用Mhp的抗原表位Mhp-P46和Mhp-P65，如表2所示；
表2：Mhp-P46和Mhp-P65抗原表位
| 表位类型 | 蛋白 | 氨基酸序列 |
| B | GP5 | SSHIQLIYNLTLCELNG |
| B | GP5 | VEKGGKVEVEGHLIDLKRV |
| T | GP5 | LAALICFVIRLAKNC |
| T | GP5 | RLYRWRSPV |
| B | GP6 | FVVRRPGSTTVNGTLVPGLKSLVLGGR |
| B | GP6 | AVKQGVVNLVKYAK |
| T | GP6 | CNDSTAPQKVLLAFS |
| T | GP6 | FGYMTFVHFESTNRV |
3.PRRSV和Mhp抗原表位的重组：将PRRSV-GP5、PRRSV-GP6、Mhp-P46和Mhp-P65蛋白抗原表位进行重组，得到重组抗原表位蛋白RP1；B细胞表位之间选择柔性态GGGGS(GGTGGTGGTGGTTCT)间隔连接，T细胞表位与B细胞表位之间以及T细胞表位与T细胞表位之间选择KK(AAAAAA)连接，抗疫表位排列方式如图1所示；重组抗原表位蛋白RP1进行密码子优化后合成相应DNA序列及氨基酸序列，如表3、4所示；
表3密码子优化后合成的抗原表位DNA序列
表4密码子优化后合成的抗原表位氨基酸序列(下划线标注各抗原表位)
4.重组表位蛋白的亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析：
用Kyte-Doolittle方法预测蛋白质的亲水性；暴露于表面的几率较大的区域亲水性指数越高，作为细胞B抗原表位的可能性也最大。≥0的区域表示蛋白亲水性，≤0的区域表示蛋白疏水性。结果可见重组蛋白含有众多的≥0区域切保持各单位间的独立与完整，说明重组后的蛋白亲水性好且各表位保持独立，如图2所示，图中0-4.5的区域表示蛋白亲水性，-4.5-0的区域表示蛋白疏水性。
利用Jameson-wolf方法进行重组表位的抗原性指数分析，≥0的区域表示抗原性良好，≤0的区域表示抗原性较差。结果表明重组表位蛋白各表位的结构预测完整且独立，抗原性均较好，如图3所示，图中0-1.7的区域表示抗原性良好，-1.7-0区域表示抗原性较差。
蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况用蛋白的表面可及性来表示，它是指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性，用Emini方法预测特定区域位于蛋白质的表面可及性，≥1的区域表示蛋白的表面可及性区域。结果表明，重组表位蛋白有较好的表面可及性，如图4所示，图中≥1的区域表示蛋白的表面可及性区域，≤1的区域表示蛋白的表面不可及性区域。
利用Karplas-Schulz方法对该重组表位蛋白进行柔韧性分析，结果表明重组蛋白的含有较多的柔韧性区域，如图5所示，且分布比较均匀，表明重组蛋白的柔韧性较大，发生扭曲，折叠的机率高，能形成丰富的二级结构，容易形成抗原表位。
5.重组抗原表位蛋白二级结构分析
利用SOPM对重组抗原表位蛋白进行二级结构的分析，如图6所示，重组抗原表位蛋白中的各B细胞表位几乎都位于无规则卷曲和β转角，有利于抗体嵌合，对重组蛋白的抗原性不会产生影响；
图6中编码各表位的氨基酸序列用下划线标出，h代表α螺旋；e代表延长链；t代表β转角；c代表无规则卷曲。
二、重组抗原表位蛋白的制备
1.重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建：将合成的重组抗原表位DNA序列与原核表达载体pET-28a使用限制性内切酶进行双酶切，之后使用T4 DNA连接酶连接，经验证后，得到重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1，如图7所示；
2.重组抗原表位蛋白表达及验证
将重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经20℃，20h，0.5mM IPTG诱导表达和破碎后，将分离得到的上清液、沉淀经SDS-PAGE分析，如图8A所示，图8A中1：pET-28a-RP1上清；2：pET-28a-RP1沉淀；M：Marker。与空白载体对照组相比，重组抗原表位蛋白(RP1)组上清液存在41.14kDa的蛋白片段。经过western-blot验证，RP1蛋白进行了部分可溶性表达，如图8B所示，图8B中1：pET-28a-RP1上清；2：pET-28a-RP1沉淀；M：Marker。
3.重组抗原表位蛋白的纯化及验证
经过镍柱纯化后的重组抗原表位蛋白(RP1)经SDS-PAGE及western-blot验证，如图9A和9B所示，得到单一的一条目的蛋白，大小为41.14kDa，图9A中M：14-100kDa；1：RP1；图9B中M：14-100kDa；1-2：RP1。
三、重组抗原表位蛋白(RP1)的免疫源性
1.重组抗原表位蛋白RP1免疫组、Mhp疫苗免疫组、PRRSV疫苗免疫组小鼠血清效价
分别以生理盐水、PRRSV疫苗、Mhp-168疫苗免疫小鼠，作为对照组。将RP1蛋白与弗氏佐剂按照1∶1体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.5mg/mL。后免疫小鼠，每次每只注射0.1mL(重组抗原表位蛋白0.5mg/mL)，每组12只，间隔7d/次，免疫三次(疫苗组肌肉注射，重组抗原表位蛋白和生理盐水组腹腔注射+背部多点注射+腹腔注射)，第三次免疫后第7、14、28、56天，小鼠断尾采血，4000rpm，4℃，10min收集血清，20℃保存备用。4℃过夜分别包被重组抗原表位蛋白RP1、Mhp培养物裂解液、PRRSV培养液到96孔板中(2μg/mL，每孔100μL)，37℃封闭2h后，分别以对应免疫组小鼠血清为一抗在37℃孵育1h，以山羊抗小鼠IgG(1∶5000)为二抗在37℃孵育1h，测定在OD450nm处的吸光值如表5所示。检测结果表明第三次免疫后第7天，RP1蛋白免疫组血清效价在1∶12800以上，PRRSV和Mhp疫苗免疫组血清效价在1：3200-1：6400；第三次免疫后第14天，RP1蛋白免疫组血清效价在1：12800，相较于第一周有所提升，Mhp疫苗免疫组血清效价在1∶6400，PRRSV疫苗免疫组血清效价在1：12800以上；第三次免疫后第28天，RP1免疫组血清效价，约在1：102400-1：204800之间，Mhp疫苗免疫组血清效价在1：1600，PRRSV疫苗免疫组血清效价在1：3200以上；第三次免疫后第56天，RP1免疫组血清效价，约在1：204800以上，Mhp疫苗免疫组血清效价在1：3200，PRRSV疫苗免疫组血清效价在1：6400以上；以上说明重组抗原表位蛋白RP1免疫后，小鼠产生了较高滴度的中和抗体，抗体持续7周仍维持在较高水平。
表5：RP1免疫组、Mhp疫苗免疫组、PRRSV疫苗免疫组三免后第7、14、28、56天血清效价
第三次免疫后7天
第三次免疫后14天
第三次免疫后28天
第三次免疫后56天
2.重组抗原表位蛋白RP1免疫反应性检测
取10μg重组抗原表位蛋白RP1进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以RP1蛋白免疫组小鼠血清为一抗(1∶5000)，以山羊抗小鼠IgG为二抗(1∶5000)检测RP1重组蛋白，结果表明重组蛋白RP1具有很好的免疫反应性，如图10所示，其中1-3：RP1 M：14-180kDa。
3.重组抗原表位蛋白RP1与抗PRRSV、抗Mhp血清的特异性反应检测
取10μg重组抗原表位蛋白RP1，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PRRSV疫苗组小鼠血清为一抗(1∶5000)，以山羊抗小鼠IgG为二抗(1：5000)检测重组蛋白，结果表明重组蛋白RP1能够和抗PRRSV中和抗体发生特异性反应，如图11A所示，其中1：RP1 M：14-180kDa。
取10ug重组蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Mhp疫苗组小鼠血清为一抗(1∶5000)，以山羊抗小鼠IgG为二抗(1∶5000)检测重组蛋白，结果表明重组蛋白RP1能够和抗Mhp中和抗体发生特异性反应，如图11B所示，其中1：RP1 M：14-180kDa。
4.重组蛋白RP1免疫产生的抗体与PRRSV和Mhp的特异性反应
取10ug Mhp培养物全裂解液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以RP1重组蛋白组小鼠血清为一抗(1∶5000)，以山羊抗小鼠IgG为二抗(1∶5000)检测，结果表明重组蛋白RP1免疫组产生的中和抗体能与Mhp发生特异性反应，如图12A所示，其中1-2：Mhp全裂解液M：14-180kDa。
取10μg PRRSV培养液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以RP1重组蛋白组小鼠血清为一抗(1∶2500)，以山羊抗小鼠IgG为二抗(1∶5000)检测，结果表明重组蛋白RP1免疫组产生的中和抗体能与PRRSV发生特异性反应，如图12B所示，其中1：PRRSV+Marc-145 2：Marc-145。
5.细胞因子检测
取第三次免疫后96天的小鼠，阴性对照组和RP1免疫组各5只，麻醉后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏通过组织研磨获得小鼠脾细胞。用RPMI-1640培养基悬浮细胞，台盼蓝染色计数后按照4x106个/孔将细胞铺入12孔板中，每孔加5μL纯化蛋白(2mg/mL)作为刺激物，于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，获得脾淋巴细胞上清。
用ELISA试剂盒检测脾淋巴细胞上清中细胞因子IL-2，如图13A所示和IL-10水平，如图13B所示。结果显示，与对照组相比RP1重组蛋白免疫组IL-2和IL-10的水平均有显著升高，表明RP1蛋白免疫组小鼠有效地激活了Th1型和Th2型细胞免疫反应。
总结：本发明构建了多抗原表位重组蛋白表达载体，并对抗原表位重组蛋白进行了制备、纯化和验证。制备的抗原表位蛋白具有良好的免疫原性和对PRRSV及Mhp的特异性。小鼠免疫实验表明，含有PRRSV和Mhp多抗原表位的重组抗原表位蛋白RP1免疫后，小鼠产生了较高滴度的中和抗体，抗体持续7周仍维持在较高水平。三次免疫后96天对小鼠脾淋巴细胞上清细胞因子IL-2和IL-10检测，表明RP1蛋白免疫组小鼠有效地激活了Th1型和Th2型细胞免疫反应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位：获得PRRSV的GP5和GP6蛋白抗原表位数据，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用PRRSV的抗原表位PRRSV-GP5和PRRSV-GP6；
B、Mhp的P46和P65的抗原表位：使用Bepipred Linear Epitope Prediction预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的B细胞表位，使用ProPred-I预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的T细胞表位，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用Mhp的抗原表位Mhp-P46和Mhp-P65；
C、PRRSV和Mhp抗原表位的重组：将PRRSV-GP5、PRRSV-GP6、Mhp-P46和Mhp-P65蛋白抗原表位进行重组，得到重组抗原表位蛋白RP1；B细胞表位之间选择柔性态GGGGS间隔连接，T细胞表位与B细胞表位之间以及T细胞表位与T细胞表位之间选择KK连接；重组抗原表位蛋白RP1的DNA序列进行密码子优化后合成相应DNA片段；
D、对重组抗原表位蛋白RP1进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析；
E、对重组抗原表位蛋白RP1进行二级结构分析：利用SOPM对重组抗原表位蛋白进行二级结构的分析，重组抗原表位蛋白RP1中的各B细胞表位几乎都位于无规则卷曲和β转角；
F、重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建：将合成的重组抗原表位DNA片段与原核表达载体pET-28a使用限制性内切酶进行双酶切，之后使用T4 DNA连接酶连接，经验证后，得到重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1；
G、对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证；
H、对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证；
I、将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1：(0.1～10)体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.05～5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗；
所述A步骤中对应使用PRRSV的抗原表位如下：
所述B步骤中使用的抗原表位如下：
所述重组抗原表位蛋白RP1进行密码子优化后合成相应DNA序列及氨基酸序列，如下所示；
密码子优化后合成的抗原表位DNA序列：
密码子优化后合成的抗原表位氨基酸序列：
2.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述D步骤中对重组抗原表位蛋白进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析的具体方法为：利用Kyte-Doolittle方法预测重组抗原表位蛋白的亲水性，利用Jameson-wolf方法进行重组抗原表位蛋白的抗原性指数分析，利用Karplas-SChulz方法对该重组抗原表位蛋白进行柔韧性分析，利用Emini方法预测特定区域位于重组抗原表位蛋白的表面可及性。
3.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述PRRSV来自QHD株。
4.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述G步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证的具体方法为：将重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1转化到大肠杆菌BL21中，经诱导表达和破碎后，将分离得到的上清液、沉淀经SDS-PAGE分析，与空白载体对照组相比，重组抗原表位蛋白RP1组上清液存在41.14kDa的蛋白片段；经western-blot验证，重组抗原表位蛋白RP1蛋白进行了部分可溶性表达。
5.根据权利要求4所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述G步骤中诱导表达的条件为20℃，20h，诱导剂为0.5mM IPTG。
6.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述H步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证的具体方法为：经过镍柱纯化后的重组抗原表位蛋白RP1经SDS-PAGE及western-blot验证，得到单一的一条目的蛋白，大小为41.14kDa。
7.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述I步骤中将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1:1体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗。
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