CN113827714A

CN113827714A - 一种h7n9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用

Info

Publication number: CN113827714A
Application number: CN202111130198.1A
Authority: CN
Inventors: 樊惠英; 孔德鑫; 廖明; 陈陶然; 胡小龙
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113827714B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用。本发明提供的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂包含重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其中，所述的重组嵌合蛋白HMN由禽流感病毒保守性抗原表位、蜂毒信号肽以及6x‑His标签蛋白嵌合而成，该重组嵌合蛋白HMN与H7N9亚型禽流感病毒样颗粒抗原联合使用，弥补了禽流感病毒样颗粒疫苗针对变异毒株交叉保护效力不足的缺陷，针对H7N9亚型变异毒株的攻击提供完全的保护，从而实现对禽流感疫情更有效的防控。

Description

一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)是囊膜型的、分节段的、负链RNA病毒，属于正黏病毒科，流感病毒属。由H7N9亚型禽流感病毒引起的高致病性禽流感(Highlypathogenic avian influenza，HPAI)对家禽养殖业危害巨大。更为严重的是，H7N9亚型禽流感病毒已突破禽类和哺乳动物的种间障碍，可造成人类的感染。由于H7N9亚型禽流感病毒对家禽养殖业和人类健康造成双重威胁，因此防控H7N9亚型禽流感不仅能够挽回巨大的经济损失，而且具有重要的公共卫生意义。当前防控H7N9亚型禽流感主要依赖疫苗接种，通过接种禽流感疫苗，我国在防控H7N9亚型禽流感方面取得了不错的成果。但是在免疫压力下，H7N9禽流感病毒不断进化，频繁的变异导致疫苗效力不断下降，造成免疫失败的现象，因此，需要不断更新疫苗毒株来应对AIV的变异。禽流感病毒持续的进化，给H7N9禽流感病毒的防控带来了巨大的压力。

研究证明禽流感病毒保守的抗原表位能够诱导交叉保护性免疫。禽流感病毒保守的抗原表位主要集中在血凝素蛋白茎区HA2、基质蛋白M2的胞外域M2e以及核蛋白NP。禽流感病毒保守性抗原表位多重复串联以及多个抗原表位的结合使用可提高其免疫原性及交叉保护能力。Kwak等(Kwak C,Nguyen QT,Kim J,Kim T-H,Poo H.Influenza ChimericProtein(3M2e-3HA2-NP)Adjuvanted with PGA/Alum Confers Cross-Protectionagainst Heterologous Influenza A Viruses.J Microbiol Biotechnol(2021)31(2):304-16.Epub 2021/02/28.doi:10.4014/jmb.2011.11029.)基于M2e、HA2和NP生成了一种嵌合蛋白(3M2e-2HA2-NP)，免疫小鼠后可诱导交叉保护抵抗异源禽流感病毒的攻击。Kim等(Kim Y-J,Lee Y-T,Kim M-C,Lee Y-N,Kim K-H,Ko E-J,et al.Cross-ProtectiveEfficacy of Influenza Virus M2e Containing Virus-Like Particles Is Superiorto Hemagglutinin Vaccines and Variable Depending on the Genetic Backgroundsof Mice.(2017)8(1730).doi:10.3389/fimmu.2017.01730.)基于M2e生成了一种流感病毒样颗粒(M2e5x VLP)，免疫小鼠后可诱导交叉保护性免疫应答。此外，T细胞免疫应答被证明与禽流感交叉保护性免疫有关，Townsend等(Townsend ARM,Rothbard J,Gotch FM,Bahadur G,Wraith D,McMichael AJ.Pillars Article:The Epitopes of InfluenzaNucleoprotein Recognized by Cytotoxic T Lymphocytes Can Be Defined with ShortSynthetic Peptides.1986.&lt；em&gt；Cell&lt；/em&gt；44:959–968.The Journal ofImmunology(2006)176(9):5141.)证明NP蛋白第55-69个氨基酸为CD4辅助性T细胞表位，在所有禽流感病毒中高度保守。

禽流感病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)是由禽流感病毒的结构蛋白组装而成的类病毒颗粒，其保留了禽流感病毒的结构和免疫学特性，不具有传染性，是新型禽流感疫苗开发的热点。针对禽流感病毒样颗粒疫苗开发面临的问题，亟需开发一种提高疫苗交叉保护能力的辅助制剂，弥补禽流感病毒样颗粒疫苗针对异源毒株或者变异毒株交叉保护效力不足的缺陷，更好地防控H7N9禽流感病毒的流行。

发明内容

为了克服现有技术因禽流感病毒频繁变异而导致禽流感病毒样颗粒疫苗保护效力下降等的不足和缺点，本发明提供了一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，该疫苗制剂由可提高禽流感病毒样颗粒疫苗交叉保护效力的重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒联合制备而成，其中，重组嵌合蛋白HMN可提高H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗对同源、异源及变异禽流感病毒的交叉保护效力，增加禽流感病毒样颗粒疫苗的广谱性。

本发明的再一目的在于提供上述疫苗的制备方法，其中，疫苗主要组分重组嵌合蛋白HMN基于昆虫-杆状病毒表达系统生产，制备简单，便于大批量生产。

本发明的再一目的在于提供上述疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，包含重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其中，所述的重组嵌合蛋白HMN由禽流感病毒保守性抗原表位、蜂毒信号肽以及6x-His标签蛋白嵌合而成；

所述的禽流感病毒保守性抗原表位包含禽流感病毒血凝素蛋白HA2的第76-130位氨基酸残基(HA2 76-130)、禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基(M2e 2-24)和禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基(NP 55-69)中的至少一种；

所述的禽流感病毒血凝素蛋白HA2的第76-130位氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域第的2-24位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；

所述的禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的蜂毒信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的6x-His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基优选为具有四个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基优选为具有八个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述的禽流感病毒血凝素蛋白HA2的76-130位氨基酸残基优选为具有两个拷贝的串联重复，两个拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述的重组嵌合蛋白HMN优选还包括柔性连接分子linker，所述的柔性连接分子实现对蜂毒信号肽、禽流感病毒血凝素蛋白HA2的76-130位氨基酸残基、禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基和禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基之间的连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述的重组嵌合蛋白HMN的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:9所示；

编码所述的重组嵌合蛋白HMN的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法为：将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒按照MOI＝2：1：2共同感染昆虫细胞，收取细胞外培养上清，得到HA、NA和M1蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒；

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂的制备方法，包含如下步骤：

(1)通过人工合成编码上述重组嵌合蛋白HMN的基因，然后将编码重组嵌合蛋白HMN的基因插入到昆虫-杆状病毒表达系统的转递质粒pACEBac1中，构建得到重组转递质粒pACEBac-HMN；

(2)将重组转递质粒pACEBac-HMN转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN；

(3)用脂质体法将重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒BV-HMN；

(4)使用sf9昆虫细胞将重组杆状病毒BV-HMN进行传代，将第三代重组杆状病毒BV-HMN感染High five昆虫细胞进行蛋白表达，得到重组嵌合蛋白HMN；

(5)将重组嵌合蛋白HMN、H7N9亚型禽流感病毒样颗粒和佐剂混合，得到H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂；

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂中，重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的质量比为1:1；

所述的佐剂优选为Montanide^TM ISA 201VG佐剂；

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂在制备防治禽流感产品中的应用；

本发明的原理：禽流感病毒样颗粒疫苗是一种安全有效的新型候选疫苗，为弥补禽流感病毒样颗粒疫苗针对同源毒株、异源毒株或者变异毒株交叉保护效力不足的缺陷，本发明基于禽流感病毒保守性抗原表位，提供了一种重组嵌合蛋白联合禽流感病毒样颗粒抗原，通过诱导交叉保护性免疫应答抵抗同源、异源及变异的禽流感病毒的攻击。本发明提供的重组嵌合蛋白HMN由蜂毒信号肽、2个拷贝的HA2 76-130、4个拷贝的M2e 2-24、8个拷贝的NP 55-69以及6x-His标签蛋白嵌合而成，该重组嵌合蛋白HMN可提高禽流感病毒样颗粒疫苗对H7N9亚型同源、异源及变异毒株的交叉保护力。本发明将重组嵌合蛋白HMN配合禽流感病毒样颗粒疫苗使用，在变异的H7N9禽流感病毒攻击后，可以减少鸡群排毒，完全保护鸡群抵抗野生型H7N9高致病性禽流感病毒的攻击，弥补了禽流感病毒样颗粒疫苗对变异毒株交叉保护力不足的缺陷，为研制禽流感病毒样颗粒疫苗的辅助制剂提供了新的思路。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

(1)本发明提供的重组嵌合蛋白HMN具有以下特点：①基于禽流感病毒保守性表位，可诱导交叉保护性免疫；②基于昆虫-杆状病毒载体系统进行表达，便于大规模生产；③与禽流感病毒样颗粒疫苗配合使用后，在应对变异毒株攻击时，能够减少排毒；④可提高H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗对变异毒株的交叉保护效力。

(2)本发明提供的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂中，重组嵌合蛋白HMN作为辅助蛋白制剂配合禽流感病毒样颗粒疫苗使用时不会影响HI和中和抗体效价；该重组嵌合蛋白HMN联合禽流感病毒颗粒疫苗使用时，可完全保护试验鸡抵抗H7N9变异毒株的攻击，完全抑制鸡只排毒；而仅免疫禽流感病毒颗粒疫苗时，在H7N9变异毒株攻击后，20％的试验鸡检测到排毒。

(3)现有技术是将重组杆状病毒作为提高疫苗交叉保护效力的辅助试剂，其在实际应用中，具有较多缺点和不足：一方面，采用病毒作为助剂存在病毒生物安全性问题，另一方面，其与疫苗配合使用，不能与疫苗直接混合注射，必须与疫苗分别注射，不仅操作复杂，且极大增加了疫苗使用成本，不利于实际应用的推广。而本发明采用重组嵌合蛋白HMN作为辅助蛋白制剂可与H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗很好地乳化混合，无需分别注射，操作简单，成本低，更适于实际应用的推广。

附图说明

图1是HA、NA、M1基因重组转递质粒的酶切鉴定结果分析图，其中，A：pACE-HA，B：pACE-NA，C：pACE-M1。

图2是HA、NA、M1基因重组杆状病毒按照MOI＝2：1：2感染昆虫细胞表达的禽流感病毒样颗粒的SDS-PAGE和Western blot结果分析图。

图3是禽流感病毒样颗粒的电镜观察图。

图4是昆虫细胞感染HMN重组杆状病毒后表达的重组嵌合蛋白HMN的Western blot结果图。

图5是免疫后鸡HI和中和抗体结果分析图。

图6是攻毒后鸡的存活率结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中的试验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的试验方法，若无特别说明，均为常规试验方法。

实施例1禽流感病毒样颗粒(H7N9-VLP)的制备

(一)HA、NA、M1基因重组转递质粒的构建

(1)本实施例中，对禽流感病毒HA、NA、M1基因的核苷酸序列进行了密码子优化，偏向于昆虫细胞表达，且HA、NA、M1基因C末端加入6x his标签；通过人工合成，得到密码子优化后的HA、NA、M1基因的核苷酸序列，并分别连入PUC57载体中，得到对应重组质粒(北京六合华大基因科技有限公司)；其中，密码子优化后的HA基因、NA基因、M1基因的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示。

密码子优化后的HA基因的核苷酸序列：

ATGAACACTCAGATCCTGGTCTTCGCTCTGATCGCTATCATCCCCACTAACGCCGACAAGATCTGCCTGGGTCACCACGCTGTGAGCAACGGCACTAAGGTCAACACTCTGACTGAACGTGGTGTCGAGGTCGTGAACGCTACTGAGACTGTGGAACGCACTAACACCCCCCGCATCTGCAGCAAGGGCAAGCGCACCGTCGACCTGGGTCAGTGCGGCCTGCTGGGCACTATCACTGGTCCCCCCCAGTGCGACCAGTTCCTGGAGTTCAGCGCTGACCTGATCATCGAACGCCGCGAGGGTTCCGACGTCTGCTACCCTGGTAAATTCGTCAACGAAGAAGCTCTGCGCCAGATCCTGCGCGAGAGCGGCGGAATCGACAAGGAGCCTATGGGCTTCACTTACAACGGTATCCGCACTAACGGTGTGACTAGCGCTTGCCGCCGCAGCGGTAGCAGCTTCTACGCCGAAATGAAGTGGCTGCTGTCCAACACCGACAACGCTACTTTCCCCCAGATGACCAAGTCCTACAAGAACACTCGCAAGAGCCCCGCCATCATCGTGTGGGGTATCCACCACTCCGTCTCCACTGCTGAACAGACTAAGCTGTACGGTTCCGGTAACAAGCTGGTGACCGTCGGTTCCTCCAACTACCAGCAGTCCTTCGTCCCCAGCCCTGGTGCCCGTCCTCAGGTGAACGGTCAGAGCGGCCGCATCGACTTCCACTGGCTGATCCTGAACCCTAACGACACCGTGACCTTCAGCTTCAACGGTGCTTTCATCGCTCCTGACCGCGCTTCCTTCCTGCGCGGTAAAAGCATGGGTATCCAGTCCGGCGTGCAGGTGGACGCCAACTGCGAAGGCGACTGCTACCACAGCGGCGGTACTATCATCTCCAACCTGCCTTTCCAGAACATCGACAGCCGTGCTGTCGGTAAATGCCCCCGTTACGTCAAGCAGCGCTCCCTGCTGCTGGCTACTGGCATGAAGAACGTCCCTGAGGTTCCTAAGGGCAAGCGTACTGCTCGCGGTCTGTTCGGCGCCATCGCCGGTTTCATCGAGAACGGTTGGGAGGGCCTGATCGACGGCTGGTACGGTTTCCGCCACCAGAACGCCCAGGGCGAGGGCACTGCTGCTGACTACAAGAGCACTCAGTCCGCTATCGACCAGATCACCGGTAAACTGAACCGCCTGATCGCCAAGACCAACCAGCAGTTCAAGCTGATCGACAACGAGTTTAATGAGGTCGAGAAGCAGATCGGCAACGTCATCAACTGGACTCGTGACTCCATCACTGAGGTCTGGAGCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGGCTATGGAAAACCAGCACACCATCGACCTCGCTGACTCCGAGATGGACAAGCTGTACGAACGCGTCAAGCGCCAGCTGCGCGAGAACGCTGAAGAAGACGGCACTGGCTGCTTCGAGATCTTCCACAAGTGCGACGACGACTGCATGGCTTCCATCCGTAACAACACCTACGACCACCGTAAGTACCGCGAAGAAGCCATGCAGAACCGTATCCAGATCGACCCCGTCAAGCTGAGCTCCGGCTACAAGGACGTCATCCTGTGGTTCTCCTTCGGTGCCAGCTGCTTCATCCTGCTGGCTATTGTTATGGGTCTGGTCTTCATCTGCGTGAAGAACGGTAACATGCGTTGCACCATCCACCACCACCACCATCACTAA

HA蛋白氨基酸序列：

MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNTPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEPMGFTYNGIRTNGVTSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNATFPQMTKSYKNTRKSPAIIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGQSGRIDFHWLILNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEVPKGKRTARGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIAKTNQQFKLIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHRKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTIHHHHHH.

密码子优化后的NA基因的核苷酸序列：

ATGAACCCTAACCAGAAGATCCTGTGCACCTCCGCTACCGCTATCACCATCGGTGCTATCACCGTGCTGATCGGTATCGCTAACCTGGGTCTGAACATCGGTCTGCACCTGAAGTCCGGTTGCAACTGTTCCCGCTCCCAACCTGAGACTACCAACACCTCCCAGACCATCATCAACAACTACTACAACGAGACTAACATCACCAACATCCAGATGGAGGAACGCACCTCCCGCAACTTCAACAACCTGACCAAGGGTCTGTGCACCATCAACTCCTGGCACATCTACGGTAAGGACAACGCTGTGCGCATTGGTGAATCCTCCGACGTTCTGGTGACTCGCGAGCCTTATGTGTCCTGCGACCCTGATGAATGCCGCTTCTACGCTCTGTCCCAGGGTACTACCATTCGCGGTAAGCACTCCAACGGTACTATCCACGACCGTTCCCAATACCGCGCTCTGATCTCTTGGCCTCTGTCCTCTCCTCCTACCGTGTATAACTCCCGCGTGGAGTGTATTGGTTGGTCCTCCACCTCTTGCCACGATGGTAAGTCCCGCATGTCCATCTGCATCTCCGGTCCTAACAACAACGCTTCCGCTGTGATCTGGTACAACCGTCGCCCTGTGGCTGAAATCAACACCTGGGCTCGCAACATCCTGCGTACCCAAGAGTCTGAGTGCGTGTGCCATAACGGTGTGTGCCCTGTGGTGTTCACTGACGGTCCTGCTACTGGTCCTGCTGATACCCGCATCTACTACTTCAAGGAGGGTAAGATCCTGAAGTGGGAGTCCTTGACCGGCACCGCTAAGCACATCGAGGAGTGCTCCTGCTATGGTAAGCGCACCGGTATTACTTGTACCTGCCGCGACAATTGGCAAGGTTCCAACCGCCCTGTGATCCAGATTGACCCTGTGGCTATGACTCACACCTCCCAGTACATCTGCTCCCCTGTGCTGACTGATTCCCCTCGTCCTAACGACCCTAACATCGGTAAGTGCAACGACCCTTACCCTGGTAACAACAACAACGGTGTGAAGGGTTTCTCCTACCTGGACGGTGACAACACTTGGCTGGGTCGTACCATTTCCACCGCTTCCCGTTCCGGTTACGAGATGCTGAAGGTGCCTAACGCTCTGACTGACGACCGCTCCAAGCCTATTCAGGGTCAGACCATCGTGCTGAACGCTGACTGGTCCGGTTACTCCGGTTCCTTCATGGACTACTGGGCTGAGGGTGACTGCTATCGCGCTTGCTTCTACGTTGAGCTGATCCGCGGTAAGCCTAAAGAGGACAAGGTGTGGTGGACCTCCAACTCCATCGTGTCCATGTGCTCCTCCACCGAGTTTCTGGGTCAGTGGAACTGGCCTGACGGTGCTAAGATCGAGTACTTCCTGCACCACCACCACCACCACTAA

NA蛋白氨基酸序列：

MNPNQKILCTSATAITIGAITVLIGIANLGLNIGLHLKSGCNCSRSQPETTNTSQTIINNYYNETNITNIQMEERTSRNFNNLTKGLCTINSWHIYGKDNAVRIGESSDVLVTREPYVSCDPDECRFYALSQGTTIRGKHSNGTIHDRSQYRALISWPLSSPPTVYNSRVECIGWSSTSCHDGKSRMSICISGPNNNASAVIWYNRRPVAEINTWARNILRTQESECVCHNGVCPVVFTDGPATGPADTRIYYFKEGKILKWESLTGTAKHIEECSCYGKRTGITCTCRDNWQGSNRPVIQIDPVAMTHTSQYICSPVLTDSPRPNDPNIGKCNDPYPGNNNNGVKGFSYLDGDNTWLGRTISTASRSGYEMLKVPNALTDDRSKPIQGQTIVLNADWSGYSGSFMDYWAEGDCYRACFYVELIRGKPKEDKVWWTSNSIVSMCSSTEFLGQWNWPDGAKIEYFLHHHHHH.

密码子优化后的M1基因的核苷酸序列：

ATGTCTCTGCTGACCGAGGTGGAGACTTACGTGCTGTCCATCATCCCTTCCGGTCCTCTGAAGGCTGAGATCGCTCAGCGTCTGGAGGATGTGTTCGCTGGTAAGAACGCTGACCTGGAGGCTCTGATGGAGTGGATCAAGACCCGCCCTATCTTGTCCCCTCTGACCAAGGGTATCCTGGGTTTCGTGTTCACCCTGACCGTGCCTTCCGAACGTGGTCTGCAACGTCGTCGTTTCGTGCAGAACGCTCTGAACGGTAACGGTGACCCTAACAACATGGACAAGGCTGTGAAGCTGTACAAGAAGCTGAAGCGCGAGATGACCTTCCACGGTGCTAAGGAGGTGGCTCTGTCCTATTCCACCGGTGCTCTGGCTTCTTGCATGGGTCTGATCTACAACCGCATGGGCACCGTGACTGCTGAAGGTGCTCTGGGTCTGGTTTGTGCTACCTGCGAGCAGATTGCTGACGCTCAGCACCGTTCCCATCGTCAAATGGCTACCACCACCAACCCTCTGATCCGCCACGAAAACCGCATGGTGCTGGCTTCTACCACCGCTAAGGCTATGGAGCAGATGGCTGGTTCCTCCGAGCAAGCTGCTGAGGCTATGGAGGTGGCTTCCCAAGCTCGCCAGATGGTGCAAGCTATGCGCACTGTGGGTACTCACCCTAACTCCTCCACCGGTCTGAAGGACGACCTGATCGAGAACCTGCAGGCTTACCAGAACCGCATGGGTGTTCAACTGCAGCGCTTCAAGCACCATCACCACCACCACTAA

M1蛋白氨基酸序列：MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNADLEALMEWIKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYKKLKREMTFHGAKEVALSYSTGALASCMGLIYNRMGTVTAEGALGLVCATCEQIADAQHRSHRQMATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTVGTHPNSSTGLKDDLIENLQAYQNRMGVQLQRFKHHHHHH.

(2)根据上述密码子优化后的HA、NA、M1基因的核苷酸序列设计引物，以上述重组质粒为模板，进行对应基因扩增，其中，PCR反应体系(50μL)为：2×Premix 25μL，ddH₂O22μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL；PCR仪运行程序为：变性98℃、10s，退火温度57℃、5s，延伸72℃、2min，30个循环；终延伸72℃，2min；4℃，保存；将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后切割目的条带，使用DNA凝胶抽提试剂盒回收目的片段；

表1密码子优化后的HA、NA、M1基因扩增引物信息

注：GCCGCCACC(粗体)代表Kozak序列；下划直线为酶切位点。

(3)将步骤(2)回收的目的片段与pACEBac1质粒(Invitrogen公司)进行BamHI和EcoRI双酶切后进行连接，连接体系(10μL)如下：T4 DNA连接酶1μL，10×Buffer 1μL，目的片段酶切产物5μL，pACEBac1质粒酶切产物3μL；将连接产物转化DH5α感受态细胞(Invitrogen公司)，转化步骤如下：①冰浴静置30min，42℃水浴热激90s后立即冰浴2min；②无菌条件下向1.5mL EP管内加入800μL的无抗液体LB培养基，放置于恒温摇床中，37℃振荡(220rpm)45min；③将生长良好的菌液在生物安全柜中均匀涂布于含Gen+抗性的固体LB培养基中，然后将细菌培养皿倒放置于37℃培养箱内，培养12～16h；使用质粒小提试剂盒提取质粒，酶切、电泳鉴定后测序，将序列保真的阳性质粒分别命名为pACE-HA、pACE-NA、pACE-M1，其中，重组转递质粒pACE-HA、pACE-NA、pACE-M1酶切鉴定结果如图1。

(二)HA、NA、M1基因重组杆状病毒质粒的构建

将测序正确的重组转递质粒pACE-HA、pACE-NA、pACE-M1转化DH10bac感受态细胞(Invitrogen公司)，步骤如下：取1μL重组转递质粒与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后立即冰浴2min；加入900μL无抗LB液体培养基，37℃，220rpm振摇培养4h，使用无抗LB液体培养基对菌液进行10倍稀释，稀释到10^-1、10^-2、10^-3，各取400μL菌液均匀涂布于三抗LB平板中，37℃温箱中放置48h；培养48h后，挑取白色单克隆菌落进行扩大培养，经PCR鉴定正确后提取质粒，得到重组杆状病毒质粒，分别命名为Bacmid-HA、Bacmid-NA、Bacmid-M1。

(三)HA、NA和M1基因的重组杆状病毒的拯救

(1)利用常规脂质体介导转染法，分别将步骤(二)制得的重组杆状病毒质粒Bacmid-HA、Bacmid-NA、Bacmid-M1转染sf9昆虫细胞(Invitrogen公司)，于27℃培养；培养至72h时，细胞出现病变，收集细胞培养上清，即分别获得第一代重组杆状病毒(P1)BV-HA、BV-NA、BV-M1；

(2)将P1代重组杆状病毒接种sf9细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即P2代重组杆状病毒)，依次方法，继续获得P3代HA、NA、M1重组杆状病毒。

(四)H7N9-VLP在昆虫细胞中的表达、优化及纯化

(1)将P3代HA、NA、M1重组杆状病毒按照MOI＝7：4：2接种悬浮培养的High five细胞(Invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为11log2，细胞内破碎上清血凝效价为13log2；

(2)将P3代HA、NA、M1重组杆状病毒按照MOI＝3：3：2接种悬浮培养的High five细胞(Invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为9log2，细胞内破碎上清血凝效价为9log2；

(3)将P3代HA、NA、M1重组杆状病毒按照MOI＝2：1：2接种悬浮培养的High five细胞(Invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为13log2，细胞内破碎上清血凝效价为13log2；

(4)将P3代HA、NA、M1重组杆状病毒按照MOI＝2：1：2共感染High five细胞所收集的细胞外培养上清(步骤(3)制得)中的病毒样颗粒样品进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定，一抗为His标签单克隆抗体(His蛋白的His-tag(4C2)monoclonal antiboby，BiowordTECHNOLOGY公司)，二抗为荧光标记的鼠二抗(

800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody，LI-COR Biosciences公司)。SDS-PAGE和Western blot结果如图2所示，HA蛋白约为70kDa，NA蛋白约为53kDa，M1蛋白约为28kDa。

(5)使用蔗糖密度梯度离心法进行病毒样颗粒纯化

配制不同浓度蔗糖溶液：配制20％、30％、45％、60％(m/v)蔗糖溶液，0.22μm滤器过滤；离心管从上至下分别加入20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入禽流感病毒样颗粒样品(步骤(3)所收集的细胞外培养上清)，100000×g，4℃离心1h；离心结束后，收取20％-30％蔗糖层间的白色透明带；10000×g，4℃离心1.5h去除蔗糖；使用PBS缓冲液重悬禽流感病毒样颗粒，置于4℃保存。样品进行后续实验，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白浓度约1.96mg/ml。

(五)透射电镜观察H7N9-VLP的形态结构

将纯化后的禽流感病毒样颗粒样品(H7N9-VLP)滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下孵育2min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1wt.％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育10min；再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干，在透射电子显微镜下可以观察到直径为100nm左右的、有囊膜、内部无遗传物质的圆形颗粒(图3)，囊膜上可见纤突，其形态特征与天然禽流感病毒高度相似，说明重组杆状病毒共感染成功组装成禽流感病毒样颗粒(H7N9-VLP)。

实施例2重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN的构建

(1)本实施例基于禽流感病毒保守性抗原表位，设计了一种重组嵌合蛋白HMN(氨基酸序列如SEQ ID NO:9)，该重组嵌合蛋白HMN由禽流感病毒保守性抗原表位、蜂毒信号肽以及6x-His标签蛋白嵌合而成，禽流感病毒保守性抗原表位包含血凝素蛋白HA2的第76-130位氨基酸残基(HA2 76-130)、基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基(M2e 2-24)和核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基(NP 55-69)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3所示，蜂毒信号肽、6x-His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～5所示；其中，M2e 2-24具有四个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker1进行连接；NP 55-69具有八个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker2进行连接；8NP 55-69和6x-His标签之间由柔性连接分子linker2进行连接；柔性连接分子linker3实现对蜂毒信号肽、2HA2 76-130、4M2e 2-24和8NP 55-69之间的连接，其氨基酸序列如表2所示：

表2相关蛋白及linker氨基酸序列

蛋白或linker	氨基酸序列(5’-3’)
		HA2 76-130	QIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENA
M2e 2-24	SLLTEVETPTRTGWECNCSGSSD
		NP 55-69	RLIQNSITIERMVLS
蜂毒信号肽	MKFLVNVALVFMVVYISYIYAD
		6x-His标签蛋白	HHHHHH
linker1	PGGSSGGSS
		linker2	GGSS
linker3	GGGGSGGGGSGGGGS

重组嵌合蛋白HMN的氨基酸序列：

编码重组嵌合蛋白HMN的基因的核苷酸序列：

ATGAAGTTCCTGGTGAACGTGGCTCTGGTGTTCATGGTGGTGTACATCTCCTACATCTACGCTGACGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCCAAATTGGTAACGTGATCAACTGGACCCGCGACTCCATCACCGAGGTGTGGTCCTATAATGCTGAGCTGCTGGTGGCTATGGAGAACCAGCACACTATCGACCTGGCTGACTCCGAGATGGACAAGCTGTACGAGCGCGTGAAGCGCCAGCTGCGTGAAAATGCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAAATTGGTAACGTGATCAACTGGACCCGCGACTCCATCACCGAGGTGTGGTCCTATAATGCTGAGCTGCTGGTGGCTATGGAGAACCAGCACACTATCGACCTGGCTGACTCCGAGATGGACAAGCTGTACGAGCGCGTGAAGCGCCAGCTGCGTGAAAATGCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTCCTTGTTGACTGAAGTGGAGACTCCTACCCGTACTGGTTGGGAGTGCAATTGCTCCGGTTCCTCCGACCCTGGTGGTTCCTCCGGTGGTTCCTCCTCCTTGTTGACTGAAGTGGAGACTCCTACCCGTACTGGTTGGGAGTGCAATTGCTCCGGTTCCTCCGACCCTGGTGGTTCCTCCGGTGGTTCCTCCTCCTTGTTGACTGAAGTGGAGACTCCTACCCGTACTGGTTGGGAGTGCAATTGCTCCGGTTCCTCCGACCCTGGTGGTTCCTCCGGTGGTTCCTCCTCCTTGTTGACTGAAGTGGAGACTCCTACCCGTACTGGTTGGGAGTGCAATTGCTCCGGTTCCTCCGACGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCGTCTGATTCAAAATTCCATCACCATCGAGCGCATGGTGCTGTCCGGTGGTTCCTCCCACCATCATCATCATCATTAA

(2)由蜂毒信号肽、2 HA2 76-130、4 M2e、8 NP 55-69以及6x-His标签蛋白嵌合而成的HMN氨基酸序列经北京六合华大基因公司分析后合成其编码基因(SEQ ID NO:10)，并插入到昆虫-杆状病毒载体表达系统转递质粒pACEBac1(Invitrogen公司)中，得到重组转递质粒pACEBac-HMN；

(3)将重组转递质粒pACEBac-HMN转化DH10bac感受态细胞，步骤如下：取1μL重组转递质粒pACEBac-HMN与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后立即冰浴2min；加入900μL无抗LB液体培养基，37℃，220rpm振摇培养4h，使用无抗LB液体培养基对菌液进行10倍稀释，稀释到10^-1、10^-2、10^-3，各取400μL菌液均匀涂布于三抗LB平板中，37℃温箱中放置48h；培养48h后，挑取白色单克隆菌落进行扩大培养，经PCR鉴定正确后提取质粒，得到重组杆状病毒质粒，命名为Bacmid-HMN。

实施例3重组杆状病毒BV-HMN的获得

(1)利用常规脂质体介导转染法，将实施例2制得的重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN转染sf9昆虫细胞(Invitrogen公司)。转染的具体步骤为：

①确认待处理六孔板中Sf9细胞处于对数期(1.0～2.5×10⁶cell/mL)，且细胞活率高于95％；

②取1μL重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN(浓度在1000ng/μL以上)稀释于100μLGrace’s溶液(Thermo Fisher Scientific)中，轻轻混匀；使用前混匀

II脂质体，吸取6～8μL至100μL Grace’s溶液中，短暂涡旋混匀；将稀释后的重组杆状病毒质粒Bacmid-HMN与稀释的

II混合(总体积约210μL)，轻轻混匀并在室温下孵育15～30min，得到DNA-脂质体混合物；

③吸取800μL Grace’s溶液至步骤②中的DNA-脂质体混合物中补足1mL；弃去六孔板中的培养基，使用Grace’s溶液清洗一次，清洗完毕后在细胞中逐滴加入上述大约1mL的DNA-脂质体混合物，27℃下孵育细胞3～5h；

④吸出DNA-脂质体混合物，使用Grace’s溶液清洗一次，加入2mL完全培养基；将六孔板放于27℃培养箱中培养，观察到细胞病变后收取细胞培养上清，即可获得第一代重组杆状病毒BV-HMN；

(2)将P1代重组杆状病毒接种sf9细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即P2代重组杆状病毒)，依次方法，继续获得P3代重组杆状病毒。

实施例4重组嵌合蛋白HMN在昆虫细胞中的表达、鉴定及纯化

将实施例3制得的P3代重组杆状病毒BV-HMN按照MOI＝1接种悬浮培养的Highfive细胞(Invitrogen)，27℃培养72h后收取感染细胞；细胞经超声波处理后获得细胞裂解液，破碎后细胞裂解液经4℃，10000×g离心3min去除细胞碎片，收获的细胞上清液中含有可溶性重组嵌合蛋白HMN；将收获的细胞上清液进行Western blot分析鉴定，一抗为His标签单克隆抗体(His蛋白的His-tag(4C2)monoclonal antiboby，Bioword TECHNOLOGY公司)，二抗为荧光标记的鼠二抗(

800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)SecondaryAntibody，LI-COR Biosciences公司)。Western blot结果如图4所示，重组嵌合蛋白HMN约为52kDa。将收获的细胞上清液使用镍柱纯化系统(6×His-Tagged Protein PurificationKit，Cwbio公司)进行纯化，纯化后的重组嵌合蛋白HMN样品使用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行定量，浓度为0.69mg/ml，蛋白定量后用于后续实验。

实施例5免疫原性分析

(1)疫苗的制备

首先将实施例4收获的重组嵌合蛋白HMN与实施例1制得的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒(H7N9-VLP)抗原以免疫剂量(质量比1:1)混合，得到混合后的疫苗抗原，其中，混合体系中重组嵌合蛋白HMN与H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的浓度均为0.2mg/ml；混合后的疫苗抗原与Montanide^TM ISA 201VG佐剂按照1：1(v/v)的比例混合乳化，混合液乳化至呈均匀的乳白色，进行剂型检验，吸取少量样品至水中，呈不扩散生物油包水外观。单独H7N9亚型禽流感病毒样颗粒抗原与Montanide^TM ISA 201VG佐剂1：1(v/v)乳化后作为疫苗对照。

(2)免疫程序

3周龄SPF鸡(购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司)随机分为3组，10只/组。分组及免疫剂量情况见表3。第一组经颈部皮下注射PBS溶液作为空白对照，0.3ml/只；第二组经颈部皮下免疫禽流感病毒样颗粒疫苗，0.3ml/只；第三组经颈部皮下免疫HMN和禽流感病毒样颗粒联合疫苗，0.3ml/只。

表3动物免疫实验分组

(3)血清抗体检测结果

所有实验组的鸡分别在免疫后第14、19天采血并分离血清。利用常规血清抑制试验(HI)和微量中和实验(MN)进行抗体检测。为评估疫苗血清对H7N9亚型变异毒株的交叉反应性，A/Chicken/Guangdong/E157/2017(H7N9)(即E157株，已在申请号为“201910117092.4”、申请名称为“基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗及制备与应用”中公开)和A/Chicken/Qingyuan/E664/2017(H7N9)(由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供)毒株被使用作为测试毒株，两毒株均为非疫苗同源毒株的H7N9野生型变异毒株。两毒株灭活后配制四单位抗原。

HI结果如图5A和图5B显示，免疫后14天两疫苗组针对两种H7N9变异毒株的平均HI效价均高于4log2；免疫后19天，两疫苗组针对E157株的平均HI效价增长不明显，但两疫苗组针对E664株的平均HI效价增长约1.5log2，同时两疫苗组针对E157和E664毒株的平均HI效价差异不显著。

中和抗体的结果显示(图5C和图5D)，两疫苗组鸡的免疫血清针对E157和E664毒株均具有中和活性。相比于免疫后14天的中和抗体水平，免疫后19天两疫苗组针对E157和E664毒株的平均中和抗体滴度增长明显，并且两疫苗组血清针对E664株的平均中和抗体滴度高于针对E157株的平均中和抗体滴度，这也与HI结果相符。这些结果显示两种疫苗免疫鸡时，针对H7N9变异毒株能够诱导较好的交叉反应性免疫应答，并且重组嵌合蛋白HMN作为辅助蛋白制剂配合禽流感病毒样颗粒疫苗使用时不会影响疫苗的HI和中和抗体水平。

(4)疫苗攻毒保护实验

在免疫后21天，使用野生型H7N9亚型高致病性禽流感病毒E157株以10^6.0EID₅₀的剂量进行攻毒保护实验，滴鼻接种，0.2ml/只。攻毒后每日观察试验鸡的发病或死亡情况并及时记录，持续14日，并于攻毒后的3、5、7、9天采集试验鸡喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计疫苗保护情况。结果显示PBS对照组鸡出现禽流感典型症状，且在攻毒后3天内全部死亡。而免疫组鸡在攻毒后两周内，未出现任何感染禽流感病毒的临床症状，且未发生死亡(图6)。结果说明，VLP+ISA 201疫苗和VLP+ISA 201+HMN疫苗均能提供针对H7N9亚型高致病性禽流感病毒攻击的完全临床保护。

攻毒后的3、5、7、9天采集喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离。结果如表4显示，VLP+ISA 201疫苗和VLP+ISA 201+HMN疫苗在E157株攻击后均能有效抑制试验鸡排毒。VLP+ISA201疫苗组攻毒后检测到20％排毒率，VLP+ISA 201+HMN疫苗攻毒后未检测到排毒。结果说明重组嵌合蛋白HMN作为辅助蛋白制剂配合禽流感病毒样颗粒疫苗使用时能够完全抑制鸡只排毒，效果优于单独使用禽流感病毒样颗粒疫苗。

表4疫苗攻毒保护结果

注：dpc：days post challenge.

上述所有的试验结果表明：(1)该辅助蛋白制剂配合禽流感病毒样颗粒疫苗使用时不会影响HI和中和抗体效价。(2)该辅助蛋白制剂联合禽流感病毒颗粒疫苗使用时，可完全保护鸡群抵抗H7N9变异毒株的攻击，完全抑制鸡只排毒；而仅免疫禽流感病毒颗粒疫苗时，在H7N9变异毒株攻击后，20％的试验鸡检测到排毒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 55

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HA2 76-130

<400> 1

Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val

1 5 10 15

Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr

20 25 30

Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys

35 40 45

Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala

50 55

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> M2e 2-24

<400> 2

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys

1 5 10 15

Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp

20

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> NP 55-69

<400> 3

Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 蜂毒信号肽

<400> 4

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp

20

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 6x-His标签蛋白

<400> 5

His His His His His His

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker1

<400> 6

Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

1 5

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker2

<400> 7

Gly Gly Ser Ser

1

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker3

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重组嵌合蛋白HMN的氨基酸序列

<400> 9

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp

35 40 45

Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met

50 55 60

Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu

65 70 75 80

Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Gly Gly Gly Gly

85 90 95

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gly Asn Val

100 105 110

Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala

115 120 125

Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp

130 135 140

Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu

145 150 155 160

Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

180 185 190

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

210 215 220

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser

225 230 235 240

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

245 250 255

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

275 280 285

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile

305 310 315 320

Glu Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ile Gln Asn Ser

325 330 335

Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ile

340 345 350

Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser

355 360 365

Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Ser Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val

385 390 395 400

Leu Ser Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu

405 410 415

Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile

420 425 430

Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ile Gln

435 440 445

Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Gly Gly Ser Ser His

450 455 460

His His His His His

465

<210> 10

<211> 1410

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码重组嵌合蛋白HMN的基因的核苷酸序列

<400> 10

atgaagttcc tggtgaacgt ggctctggtg ttcatggtgg tgtacatctc ctacatctac 60

gctgacggtg gtggtggttc cggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc ccaaattggt 120

aacgtgatca actggacccg cgactccatc accgaggtgt ggtcctataa tgctgagctg 180

ctggtggcta tggagaacca gcacactatc gacctggctg actccgagat ggacaagctg 240

tacgagcgcg tgaagcgcca gctgcgtgaa aatgctggtg gtggtggttc cggtggtggt 300

ggttccggtg gtggtggttc ccaaattggt aacgtgatca actggacccg cgactccatc 360

accgaggtgt ggtcctataa tgctgagctg ctggtggcta tggagaacca gcacactatc 420

gacctggctg actccgagat ggacaagctg tacgagcgcg tgaagcgcca gctgcgtgaa 480

aatgctggtg gtggtggttc cggtggtggt ggttccggtg gtggtggttc ctccttgttg 540

actgaagtgg agactcctac ccgtactggt tgggagtgca attgctccgg ttcctccgac 600

cctggtggtt cctccggtgg ttcctcctcc ttgttgactg aagtggagac tcctacccgt 660

actggttggg agtgcaattg ctccggttcc tccgaccctg gtggttcctc cggtggttcc 720

tcctccttgt tgactgaagt ggagactcct acccgtactg gttgggagtg caattgctcc 780

ggttcctccg accctggtgg ttcctccggt ggttcctcct ccttgttgac tgaagtggag 840

actcctaccc gtactggttg ggagtgcaat tgctccggtt cctccgacgg tggtggtggt 900

tccggtggtg gtggttccgg tggtggtggt tcccgtctga ttcaaaattc catcaccatc 960

gagcgcatgg tgctgtccgg tggttcctcc cgtctgattc aaaattccat caccatcgag 1020

cgcatggtgc tgtccggtgg ttcctcccgt ctgattcaaa attccatcac catcgagcgc 1080

atggtgctgt ccggtggttc ctcccgtctg attcaaaatt ccatcaccat cgagcgcatg 1140

gtgctgtccg gtggttcctc ccgtctgatt caaaattcca tcaccatcga gcgcatggtg 1200

ctgtccggtg gttcctcccg tctgattcaa aattccatca ccatcgagcg catggtgctg 1260

tccggtggtt cctcccgtct gattcaaaat tccatcacca tcgagcgcat ggtgctgtcc 1320

ggtggttcct cccgtctgat tcaaaattcc atcaccatcg agcgcatggt gctgtccggt 1380

ggttcctccc accatcatca tcatcattaa 1410

Claims

1.一种H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于包含重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其中，所述的重组嵌合蛋白HMN由禽流感病毒保守性抗原表位、蜂毒信号肽以及6x-His标签蛋白嵌合而成；

所述的禽流感病毒保守性抗原表位包含禽流感病毒血凝素蛋白HA2的第76-130位氨基酸残基、禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基和禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基中的至少一种；

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法为：将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒按照MOI＝2：1：2共同感染昆虫细胞，收取细胞外培养上清，得到HA、NA和M1蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于：

所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域第的2-24位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；

所述的蜂毒信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的6x-His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于：

所述的禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基为具有四个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基为具有八个拷贝的串联重复，各拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；

所述的禽流感病毒血凝素蛋白HA2的76-130位氨基酸残基为具有两个拷贝的串联重复，两个拷贝之间由柔性连接分子linker进行连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于：

所述的重组嵌合蛋白HMN还包括柔性连接分子linker，所述的柔性连接分子实现对蜂毒信号肽、禽流感病毒血凝素蛋白HA2的76-130位氨基酸残基、禽流感病毒基质蛋白M2胞外域的第2-24位氨基酸残基和禽流感病毒核蛋白NP的第55-69位氨基酸残基之间的连接，所述的柔性连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

5.根据权利要求1～4任一项所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于：

所述的重组嵌合蛋白HMN的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求5所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂，其特征在于：

编码所述的重组嵌合蛋白HMN的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

7.权利要求1～6任一项所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(5)将重组嵌合蛋白HMN、H7N9亚型禽流感病毒样颗粒和佐剂混合，得到H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂。

8.根据权利要求7所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂的制备方法，其特征在于：

所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂中，重组嵌合蛋白HMN和H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的质量比为1:1。

9.根据权利要求7所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂的制备方法，其特征在于

所述的佐剂为Montanide^TM ISA 201 VG佐剂。

10.权利要求1～6任一项所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂在制备防治禽流感产品中的应用。