CN109706136B - 用作pcr防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用作PCR防腐剂的裂解酶，该裂解酶的基因表达序列如Seq ID No.1所示。本发明提供的用作PCR防腐剂的裂解酶，具有广谱抗菌能力。以该裂解酶作为一种新型防腐剂，用于聚合酶链式反应(PCR)可以有效抑制缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。与传统PCR体外诊断试剂防腐剂相比，该裂解酶属于无毒的生物防腐剂，对人体没有伤害。另外，本发明实施例提供的裂解酶作为PCR防腐剂，对PCR反应有一定的促进作用。

Description

用作PCR防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用作PCR防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95℃左右的高温时会变性成单链，60℃左右的低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP等反应组分就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火(复性)和引物的延伸三个步骤。当今PCR是分子生物学中使用最广泛的技术之一，常被用于生物医学研究、传染病诊断和分子考古学。

PCR实验的成功取决于一系列因素，其中反应组分在扩增汇总中起到了至关重要的作用，这些反应组分主要包括模板DNA、DNA聚合酶、引物、dNTP脱氧核苷酸、镁离子和PCR缓冲液六个部分。其中，PCR缓冲液，是由弱碱及其共轭碱盐类组成的缓冲对配置，能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境，pH通常为8.0-9.5。PCR缓冲液的主要成分包括Tris和HCl，而一些微生物能够利用其中的碳源生长，从而影响PCR缓冲液的性能，进而影响PCR反应。因此，对于长期保存的PCR缓冲液，在其中加入防腐剂是一种防止缓冲液染菌的方法，常见的防腐剂包括叠氮钠、硫柳汞、脱氢醋酸钠、Proclin300等。

但是，常见防腐剂都相应存在一些不足之处。叠氮钠，能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，属于剧毒化合物，半数致死量为27mg/kg，对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，机除对眼和皮肤有刺激性外，还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡，遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用的安全性是其作为防腐剂的制约因素。且叠氮钠对多种酶有抑制作用，可能影响PCR反应。硫柳汞，含有少量有机汞，在理论上具有神经毒性，因此其安全性也是其作为防腐剂使用的制约因素。脱氢醋酸钠，当量为0.03％-0.05％时，对PCR反应会有一定的抑制作用，因此制约了其作为防腐剂应用于PCR体外诊断试剂。庆大霉素，属于抗生物，其缺点是容易产生耐药性而使其作用降低或丧失。Proclin300，在遇到铵、亚硫酸盐、强还原剂或处在强碱性环境中时，活性会降低，在过量使用的情况下有一定的刺激性和致敏性。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种用作PCR防腐剂的裂解酶，旨在解决现有聚合酶链式反应防腐剂对生物体的毒害作用，且对PCR反应有抑制作用的技术问题。

本发明实施例的另一目的在于提供一种PCR防腐剂。

本发明实施例的另一目的在于提供一种用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法。

本发明实施例的又一目的在于提供一种PCR防腐剂在PCR缓冲溶液中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用作PCR防腐剂的裂解酶，所述裂解酶的基因表达序列如Seq ID No.1所示。

一种PCR防腐剂，包括裂解酶，所述裂解酶为上述的裂解酶。

相应地，一种用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，包括以下步骤：

获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列；

根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得裂解酶扩增片段；

将所述裂解酶扩增片段与质粒相连，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株；

培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株；

用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。

进一步地，所述获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列的方法为：

从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；

使用NCBI的CD-Search功能分析获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列；

合成所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。

进一步地，所述引物包括：引物P1和引物P2，所述引物P1的序列如Seq ID No.2所示，所述引物P2的序列如Seq ID No.3所示。

进一步地，所述将所述裂解酶扩增片段与质粒相连的方法为：将所述裂解酶扩增片段与质粒使用EcoRI与HindIII进行双酶切，得到带有粘性末端的线性质粒载体和裂解酶的目的片段，将所述线性质粒载体和所述裂解酶的目的片段连接得到重组质粒。

进一步地，所述克隆宿主菌选自：DH5α菌种、Top10菌种或GM3819菌种中的一种。

进一步地，所述表达宿主菌选自：Rosetta 2菌株、Rosetta-gami 2菌株、Rosetta-gami B菌株、RosettaBlue菌株或BL21(DE3)菌种中的一种。

进一步地，所述用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株的条件为：IPTG的终浓度为0.8～1.2mM，诱导温度为25～35℃，诱导转速为60～100rpm，诱导时间为4～8小时。

一种PCR缓冲溶液，以所述PCR缓冲溶液的重量为100％计，所述PCR缓冲溶液包括1％～2％的上述PCR防腐剂。

本发明提供的用作PCR防腐剂的裂解酶，具有广谱抗菌能力。以该裂解酶作为一种新型防腐剂，用于聚合酶链式反应(PCR)可以有效抑制缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。与传统PCR体外诊断试剂防腐剂相比，该裂解酶属于无毒的生物防腐剂，对人体没有伤害。另外，本发明实施例提供的裂解酶作为PCR防腐剂，对PCR反应有一定的促进作用。

本发明提供的PCR防腐剂，由于包括上述序列的裂解酶，而上述裂解酶具有广谱的抗菌能力，因而本发明实施例提供的PCR防腐剂也具有广谱的抗菌能力，能有效抑制PCR溶液中微生物的生长，提高溶液的稳定性，从而促进PCR反应的进行。

本发明提供的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，通过根据获取的亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，再通过克隆、表达、IPTG诱导，获得裂解酶蛋白。该裂解酶蛋白可用作PCR防腐剂。该裂解酶的制备方法，通过采用简单的方法即可实现裂解酶的制备，操作简便，可实现批量化生产，适于工业应用。

本发明提供的PCR缓冲溶液，含有1％～2％上述PCR防腐剂，该防腐剂包括分离自亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶，因此，该防腐剂具有广谱的抗菌能力，可以有效抑制PCR缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。且该PCR防腐剂无毒性，对人体没有伤害，所以该PCR缓冲溶液也无毒无害。

附图说明

图1是本发明实施例提供的裂解酶蛋白的纯化结果：左边为蛋白标准分子量，右边为裂解酶蛋白。

图2是本发明实施例提供的裂解酶蛋白在PCR反应缓冲溶液Buffer中的抑菌效果对比图。

图3是本发明实施例提供的裂解酶蛋白对PCR反应扩增效果对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例提供了一种用作PCR防腐剂的裂解酶，所述裂解酶的基因表达序列如下所示：

本发明实施例提供的用作PCR防腐剂的裂解酶，具有广谱抗菌能力。以该裂解酶作为一种新型防腐剂，用于聚合酶链式反应(PCR)可以有效抑制缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。与传统PCR体外诊断试剂防腐剂相比，该裂解酶属于无毒的生物防腐剂，对人体没有伤害。另外，本发明实施例提供的裂解酶作为PCR防腐剂，对PCR反应有一定的促进作用。

本发明提供了一种PCR防腐剂，包括上述裂解酶。

本发明实施例提供的PCR防腐剂，由于包括上述序列的裂解酶，而上述裂解酶具有广谱的抗菌能力，因而本发明实施例提供的PCR防腐剂也具有广谱的抗菌能力，能有效抑制PCR溶液中微生物的生长，提高溶液的稳定性，从而促进PCR反应的进行。

相应地，本发明实施例提供了一种用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，包括以下步骤：

S10.获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列；

S20.根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得所述裂解酶扩增片段；

S30.将所述裂解酶扩增片段与质粒相连，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株；

S40.培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株；

S50.用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。

本发明实施例提供的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，通过根据获取的亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，再通过克隆、表达、IPTG诱导，获得裂解酶蛋白。该裂解酶蛋白可用作PCR防腐剂。该裂解酶的制备方法，通过采用简单的方法即可实现裂解酶的制备，操作简便，可实现批量化生产，适于工业应用。

具体地，上述步骤S10中，获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列的方法为：

S11.从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；

S12.使用NCBI的CD-Search功能分析获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列；

S13.合成亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。

其中，合成的亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列以构建的假病毒为载体。亚栖热菌噬菌体P23-45为已知噬菌体，通过NCBI数据库获得该噬菌体的全部DNA序列，再通过CD-Search的分析功能分析获得其裂解酶序列，最后再合成该裂解酶序列，以构建的假病毒为载体，作为克隆表达第一步PCR的模板。该方法通过分析已知噬菌体合成获得裂解酶，将其用作PCR防腐剂，具有好的抗菌性，稳定性，开拓了已知噬菌体的新用途。

具体地，上述步骤S20中，根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得所述裂解酶扩增片段。引用聚合酶链式反应可扩增裂解酶的基因，再通过胶回收纯化可获得扩增后的裂解酶基因片段。根据裂解酶的基因序列设计扩增的引物，以合成的裂解酶基因序列为模板，以设计的引物为延伸对象，通过PCR进行扩增。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。该方法操作简单，能实现裂解酶序列的精准扩增。

在一些实施例中，聚合酶链式反应扩增的具体步骤包括：首先，根据亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列设计两条引物P1和P2，分别在5’端和3’端插入限制性内切酶EcoRI和HindIII的酶切位点。其中，引物P1的序列为：5’-CCGGAATTCCAATGCGTCTACCGACTAAGAC-3’，引物P2的序列为：5’-CCCAAGCTTTTTACCTCCTAGCAACTTGG-3’。然后，用引物P1和P2进行PCR扩增，其中，PCR扩增所用试剂盒选自擎科公司的1.1×T3 Super PCR Mix，具体的PCR反应体系如下表1所示：

表1

其中，DNA模板为纯化获得的噬菌体，DNAmix为擎科公司的1.1×T3 Super PCRMix。最后，PCR扩增反应结束后，胶回收纯化获得扩增片段。作为优选实施例，变性温度为94℃，退火温度为55℃，延伸温度为72℃。

在一些实施例中，胶回收获得扩增片段的方法为，首先，配制1％琼脂糖凝胶；将PCR产物上样品电泳，电泳条件为120V，100mA，时长为18min。然后，在紫外灯下使用干净刀片迅速切下带有目的片段的凝胶，转移至离心管中，称重。最后，使用Biomega公司胶回收试剂盒进行目的片段的回收。在一些实施例中个，纯化的方法为镍柱纯化，洗脱液为浓度为500mM咪唑。

具体地，上述步骤S30中，将所述裂解酶的基因与质粒相连，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株。分别对裂解酶极影和质粒进行双酶切后，使裂解酶基因与质粒相连得到裂解酶重组质粒，重组质粒转入克隆宿主菌进行培养繁殖，得到裂解酶重组质粒的克隆菌株。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。克隆较小且结构简单的DNA片段时，质粒相较于其它任何载体，是最佳的载体选择。在质粒载体上进行克隆，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化克隆菌株中，即可完成重组。该方法操作简单，方便，能较好的实现裂解酶的重组、克隆。

在一些实施例中，质粒通过以下方法获得：将实验室保存的带有pET28a质粒的大肠杆菌菌株用接种环挑取划线，于37℃恒温培养箱过夜培养。挑取单菌落接种至5mLLuria-Bertani培养基中，于恒温摇床37℃，150rpm，培养14小时后用Biomega公司的Plasmid Miniprep Kit(试剂盒)提取pET28a质粒。

作为优选实施例，裂解酶基因与pET28a质粒使用EcoRI与HindIII分别进行双酶切。其中，HindIII切割位点是为A|AGCTT，EcoRI切割位点为G|AATTC。双酶切后得到带有粘性末端的线性载体pET28a和裂解酶目的片段，将线性载体pET28a和裂解酶目的片段连接，得到裂解酶重组质粒。将裂解酶重组质粒化学转化至克隆宿主菌株建重组细胞。

作为优选实施例，克隆宿主菌选自：DH5α菌种、Top10菌种或GM3819菌种中的一种。更优选地，克隆宿主菌选自DH5α菌种。DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，当外源DNA侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰(如甲基化)所以不被限制酶识别，不会被剪切。

在一些实施例中，裂解酶基因与pET28a质粒分别进行双酶切，其中，双酶切体系使用的限制酶EcoRI与HindIII购自Thermo Scientific公司，使用的缓冲溶液Buffer为Thermo Scientific公司的Tango Buffer(10X)。详细的双酶切体系如下表2所示：

表2

在一些实施例中，裂解酶基因与质粒相连得到裂解酶重组质粒的连接体系使用Takara公司快速连接酶solution l，详细连接体系如下表3所示：

表3

体系组分	体积/μL
		裂解酶基因双酶切后产物	4μL
Solution 1	5μL
		pET28a线性载体	1μL
总和	10μL

在一些实施例中，将裂解酶重组质粒化学转化至克隆宿主菌株建重组细胞的方法为：将连接后的裂解酶重组质粒转移至一个无菌的离心管管中，加入适量大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴，热击后立即冰浴，最后加入LB液体培养基，于恒温摇床培养后，取培养后的菌液涂布于含有卡纳青霉素的LB固体平板，置于恒温培养箱培养。其中，LB培养基配方为：Yeast extract 5g，tryptone 10g，NaCl 10g，去离子水1L。调节pH＝7.0，固体培养基加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

具体地，上述步骤S40中，培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株。菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8时，菌株处于对数生长期，生命力最旺盛。作为优选实施例，表达宿主菌选自：Rosetta 2菌株、Rosetta-gami 2菌株、Rosetta-gami B菌株、RosettaBlue菌株或BL21(DE3)菌种。优选地，表达宿主菌选自Rosetta-gami 2菌株。Rosetta-gami 2菌株是集合了Rosetta 2系列菌株和Origami 2系列菌株的优点，增强了细胞内二硫键的形成和含有在大肠杆菌中稀有密码子的真核细胞蛋白的表达能力。优选地，表达宿主菌选自BL21(DE3)菌种，BL21(DE3)菌株适合表达非毒性蛋白，该菌株是以T7 RNA聚合酶为表达系统的外源基因蛋白高效表达的宿主，转化效率高，转化效率可达10⁷，在-80℃环境中，可长时间保存其转化效率不发生改变。

在一些实施例中，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株。本发明实施例对构建表达菌株的方法不做具体地限定，只要能实现构建表达菌株的目的即可。

在一些实施例中，构建表达菌株的方法可以是热激法，大肠杆菌Rossetta菌株在0℃，CaCl₂低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

在一些实施例中，构建表达菌株的方法也可以是电转化法，外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。

具体地，上述步骤S50中，用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。基因诱导表达是一个基因转录和翻译的过程。IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。IPTG能诱导外源基因表达，它不仅仅能作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。能较好的诱导本发明实施例的含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。

在一些实施例中，用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株的条件为：IPTG的终浓度为0.8～1.2mM，诱导温度为25～35℃，诱导转速为60～100rpm，诱导时间为4～8小时。作为优选实施例，IPTG的终浓度为1mM，诱导温度为28℃，诱导转速为80rpm，诱导时间为6小时。在该诱导条件下，含裂解酶重组质粒的表达菌株的诱导效果最好。

在一些实施例中，用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株后，用超声破碎法获得裂解酶蛋白。具体地，超声破碎过程产热量大，样品应在冰浴中超声，一次不超过3秒，不建议超声次数过多，根据样品需要重复3-8次即可，超声破碎电流设置在10A，超声破碎法能破碎表达宿主菌，释放蛋白。再通过离心，收集含裂解酶蛋白的上清液，获得裂解酶蛋白，下层沉淀为宿主菌以及酶蛋白、糖蛋白等杂质。

本发明实施例还提供了一种PCR缓冲溶液，其特征在于，以所述PCR缓冲溶液的重量为100％计，所述PCR缓冲溶液含有1％～2％的上述PCR防腐剂。

本发明实施例提供的PCR缓冲溶液，含有1％～2％上述PCR防腐剂，该防腐剂包括分离自亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶，因此，该防腐剂具有广谱的抗菌能力，可以有效抑制PCR缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。且该PCR防腐剂无毒性，对人体没有伤害，所以该PCR缓冲溶液也无毒无害。

以下通过多个实施例来举例详细说明上述技术方案。

实施例1

PCR扩增裂解酶序列。

S21.以所述亚栖热菌噬菌体P23-45为材料获取其裂解酶的基因序列：从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；使用NCBI的CD-Search功能分析获取其裂解酶序列；构建假病毒，委托给武汉金开瑞生物工程有限公司合成亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。

S22.根据噬菌体的裂解酶序列设计两条引物P1和P2，分别在5’端和3’端插入限制性内切酶EcoRI和HindIII的酶切位点。其中，引物P1的序列为：5’-CCGGAATTCCAATGCGTCTACCGACTAAGAC-3’，引物P2的序列为：5’-CCCAAGCTTTTTACCTCCTAGCAACTTGG-3’。

S23.用引物P1和P2进行PCR扩增：以2μL纯化的噬菌体为基因组模板，加入擎科公司的1.1×T3Super PCR Mix，50μL，正向引物P1和反向引物P2，各加入2μL，然后加入ddH₂O，44μL。反应程序为94℃预变性4分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，完成30各个循环；然后，72℃延伸10分钟。

S24.胶回收获得扩增片段：配制1％琼脂糖凝胶；将PCR产物上样品电泳，电泳条件为120V，100mA，时长为18min。然后，在紫外灯下使用干净刀片迅速切下带有目的片段的凝胶，转移至离心管中，称重。最后，使用Biomega公司胶回收试剂盒进行目的片段的回收。

S25.镍柱纯化获得裂解酶：将Ni NTA Beads装入合适的层析柱中，用5倍柱体积的裂解酶buffer平衡柱子，使填料与裂解酶处于相同的缓冲体系下；将裂解酶样品加到平衡好的镍柱中，收集流出液，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。用10～15倍柱体积的washbuffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。使用5～10倍柱体积的elutionbuffer洗脱柱子，收集洗脱液，即裂解酶组分。利用超滤离心管对纯化的裂解酶进行后续脱盐及浓缩处理。纯化结果如图1所示。

实施例2

裂解酶重组质粒的构建。

S31.裂解酶基因与pET28a质粒使用EcoRI与HindIII分别进行双酶切，其中，双酶切体系使用的限制酶EcoRI与HindIII购自Thermo Scientific公司，使用的缓冲溶液Buffer为Thermo Scientific公司的Tango Buffer(10X)。具体的双酶切体系各组分的体积为：裂解酶基因PCR产物，3μL；10×Tango，2μL；EcoRI，0.3μL；HindIII，0.3μL；ddH2O，4.4μL。

S32.将线性载体pET28a和裂解酶目的片段连接，连接体系使用Takara公司快速连接酶solution l，各组分体积为：裂解酶基因双酶切后产物，4μL；Solution，1 5μL；pET28a线性载体，1μL，得到裂解酶重组质粒。

S33.将裂解酶重组质粒化学转化至DH5α菌株建重组细胞。其中，化学转化法为：将10μL连接后的产物转移至一个无菌的1.5mL EP离心管管中，加入100μL E.coli DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击2min后立即冰浴2min，最后加入200μL LB液体培养基，于恒温摇床37℃，80rpm培养1小时后取100μL涂布于含有卡纳青霉素(Kan⁺)(浓度为40μg/mL)的LB固体平板，置于恒温培养箱37℃倒置培养10小时。LB培养基配方：Yeast extract 5g，tryptone 10g，NaCl 10g，去离子水1L。调节pH＝7.0，固体培养基加入15g Agar。121℃高压蒸汽灭菌20min。

实施例3

构建含裂解酶重组质粒的表达菌株。

培养含有裂解酶重组质粒的DH5α感受态细胞，至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，采用热激法将提取的裂解酶重组质粒转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株。

实施例4

IPTG诱导含裂解酶重组质粒的表达菌株。

将培养至对数生长期的含裂解酶重组质粒的表达菌株的菌液(OD₆₀₀＝0.8)加入IPTG，IPTG的终浓度为1mM，在28℃，80rpm的条件下，诱导培养6小时。

性能测试

1、裂解酶理化性质

裂解酶分子量为19.387kDa；最适反应温度为45℃，在28℃-65℃范围内均有较好的裂解酶活性；最适反应pH为7.8，在pH为6.5-9.5范围内均有较好的裂解酶活性，Zn²⁺、Mg²⁺为该酶的激活剂，Ca²⁺、Fe³⁺为该酶的抑制剂，裂解酶抗菌谱广，在室温下对多数细菌均有很好的抑制作用。

2、裂解酶的抑菌效果测试

配置50mL PCR缓冲液，分别取5mL分装于两只试管中。实验组按1％的比例加入裂解酶，对照组加入等量无菌水，37℃，150rpm摇床培养，24小时后分别对比两管缓冲液的状态，如图2所示。

由反应结果可见：培养24小时后，未添加裂解酶的对照组出现白色絮状菌丝；实验组无明显变化。说明裂解酶对PCR缓冲液中可能生长的微生物有抑制作用。

3、裂解酶的PCR扩增效果测试

使用深圳市生科原生物股份有限公司生产的甲型H1流感病毒核酸检测试剂盒作为对照，实验组PCR缓冲液中加入1％裂解酶，对照组未加入裂解酶。进行荧光PCR反应，反应结果如图3所示。

由反应结果可见：实验组信号值相比于对照组更高，说明裂解酶对荧光PCR反应有一定的促进作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市生科源技术有限公司

<120> 一种亚栖热菌噬菌体P23-45裂解酶

<130> 20181120

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> 裂解酶基因表达序列

<400> 1

atgcgtctac cgactaagac ttcccgcttt ggttatgtgc acggccagag aaaccacgag 60

ggcattccct atgacctgaa taaccacgag ggcattcccc acccaggcta tggccctacg 120

cctactagcg accttggtcg tatgcccctg aggatggcgt ggtggtctat gcccggactg 180

ggtcaggtac ctggggtggg ctggtggtgg caaaagcggc tttgcccatc ggctaggcca 240

tgtgcgcaac attcgggtca aagagggaca ggaggtgaag gaaggccagc aggtggccga 300

gattggggag ttcgggcttc cccacctgca ctacgacatg gtggagccca accacaccat 360

cagtatcctg atcaaggccc cttatgttcg gtttcgggac aacttctggc acgtaaactt 420

tcccaaacag gaccacatgt atgtggaccc ggaagccagg tttcaccctg aactggccaa 480

gttgctagga ggtaaaataa 500

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物P1序列

<400> 2

ccggaattcc aatgcgtcta ccgactaaga c 31

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物P2序列

<400> 3

cccaagcttt ttacctccta gcaacttgg 29

Claims (10)

1.一种用作PCR防腐剂的裂解酶，其特征在于，所述裂解酶的基因表达序列如Seq IDNo.1所示；其中，所述裂解酶属于无毒的生物防腐剂。

2.一种PCR防腐剂，其特征在于，包括裂解酶，所述裂解酶为权利要求1所述的裂解酶。

3.一种如权利要求1所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列；

根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得裂解酶扩增片段；

将所述裂解酶扩增片段与质粒相连接，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株；

培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株；

用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。

4.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列的方法为：

从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；

使用NCBI的CD-Search功能分析获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列；

合成所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。

5.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述引物包括：引物P1和引物P2，所述引物P1的序列如Seq ID No.2所示，所述引物P2的序列如Seq IDNo.3所示。

6.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述将所述裂解酶扩增片段与质粒相连的方法为：将所述裂解酶扩增片段与质粒使用EcoRI与HindIII进行双酶切，得到带有粘性末端的线性质粒载体和裂解酶的目的片段，将所述线性质粒载体和所述裂解酶的目的片段连接得到重组质粒。

7.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述克隆宿主菌选自：DH5α菌种、Top10菌种或GM3819菌种中的一种。

8.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述表达宿主菌选自：Rosetta 2菌株、Rosetta-gami 2菌株、Rosetta-gami B菌株、RosettaBlue菌株或BL21(DE3)菌种中的一种。

9.如权利要求3～8任意一项所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株的条件为：IPTG的终浓度为0.8～1.2mM，诱导温度为25～35℃，诱导转速为60～100rpm，诱导时间为4～8小时。

10.一种PCR缓冲溶液，其特征在于，以所述PCR缓冲溶液的重量为100％计，所述PCR缓冲溶液包括1％～2％的如权利要求2所述的PCR防腐剂。

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