CN102465134A

CN102465134A - 一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法

Info

Publication number: CN102465134A
Application number: CN2011100503115A
Authority: CN
Inventors: 钱永常
Original assignee: HANGZHOU NEUROPEPTIDE BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Hangzhou NeuroPeptide Biological Science and Technology Incorporation, Limited
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2031-02-28
Also published as: CN102465134B

Abstract

本发明提供了一种制备rhSOD1的方法，所述方法包括：将包含hSOD1基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段插入原始载体中，以构建重组载体；将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；将重组菌株扩大培养；将菌体破碎，离心得到上清液；和将上清液纯化，得到纯化后的rhSOD1。本发明进一步包括向纯化后的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子。本发明可用于在工业上大规模地制备具有高比活力的重组人源铜锌超氧化物歧化酶。

Description

一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法，更具体地涉及通过基因工程方法来制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一类广泛存在于生物体内的抗氧化金属酶类，其主要功能是特异性地清除体内过量的强氧化性物质-超氧阴离子自由基，解除其对细胞的毒害作用。SOD现已被用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、炎症等多种疾病；用于辅助放疗、化疗以及器官的保护、移植；加入化妆品中用于防晒、防皮肤衰老和脂褐质的形成；以及用作食品工业中的添加剂。

根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD，也称为SOD1)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞的细胞质中。

最初，SOD主要从动物或植物中提取。动物来源的SOD主要从牛血、猪血中提取，但上世纪末疯牛病的爆发使得欧盟于1997年开始禁止食品、化妆品、医疗等领域使用从动物血液和组织中提取的SOD。鉴于不断爆发的动物流感及人畜混杂流感，为了减少交叉感染的潜在危险、保护人类的健康，全球范围内禁止使用包括SOD在内的动物来源生物制剂必将成为一个大趋势。在这个大趋势下，植物或微生物来源的SOD开始受到人类的青睐。从植物或微生物中提取的SOD对于人类不存在交叉感染的潜在危险，但是它们具有比动物来源的SOD更大的异源性，临床应用可能会带来免疫反应等安全性问题，这就限制了它们在临床上的应用。

随着基因工程技术的发展，人们开始尝试采用基因工程技术来生产SOD，特别是生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)以克服异源性的问题。目前通过基因工程技术生产hSOD1的方法主要是将hSOD1的编码基因连接到含有纯化标签序列的表达载体中以获得重组载体，之后将重组载体转化到合适的表达菌株中，以表达带有纯化标签的重组人源铜锌超氧化物歧化酶(rhSOD1)，并利用纯化标签对rhSOD1进行纯化。随后，还需要将纯化标签切除。

但是，以上方法仍然存在很多问题，主要包括：(1)目的蛋白的比活力不高，一般不高于4000U/mg；(2)目的蛋白的表达量不高，即重组菌株表达出的带有纯化标签的rhSOD1占菌体总蛋白的比率很低；(3)纯化过程复杂，即带有纯化标签的rhSOD1主要存在于菌体破碎后的沉淀中，因此需要对rhSOD1进行繁琐的变性、复性、纯化等一系列工艺才能获得活性形式的rhSOD1；(4)不适于工业化，即rhSOD1所带有的纯化标签有助于后续的纯化操作，但考虑到蛋白活性问题通常需要在蛋白纯化后将这些纯化标签切除，导致工业化生产的工艺繁琐、成本增加和不必要的产物损失；和(5)现有技术中从未提及纯化后rhSOD1中的内毒素问题。

鉴于hSOD1的重要性，人们十分需要一种表达量高、纯化简便并适于工业化的hSOD1生产方法，且此方法生产出的hSOD1具有高比活力和低内毒素。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备rhSOD1的方法，所述方法目的蛋白表达量高，且表达菌株表达出的rhSOD1绝大部分存在于菌体破碎后的上清液中，非常易于纯化获得高纯度的rhSOD1。同时，本发明的另一个目的是提供一种提高rhSOD1比活力的方法，所述方法包括向纯化后的rhSOD1同时加入铜离子和锌离子。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备高表达的rhSOD1的方法，所述方法包括：

(1)将包含hSOD1基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段插入原始载体中，以构建重组载体；

(2)将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；和

(5)将上清液纯化，得到纯化后的rhSOD1。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种提高rhSOD1比活力的方法，包括向纯化后的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子。

在一个实施方式中，向纯化后的rhSOD1中同时加入至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜离子和至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的锌离子，优选铜或锌离子的添加量为rhSOD1蛋白摩尔数的1至10倍，更优选铜或锌离子的添加量为rhSOD1蛋白摩尔数的10倍，优选所述铜离子和锌离子的终浓度相同。

在一个实施方式中，本发明提供了一种制备rhSOD1的方法，所述方法包括：

(1)用PCR方法扩增获得包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段，其中PCR方法所用的上游引物为5’-ATCATGCCATGGCGACGAAGGCCGT-3’(SEQID NO 3)，下游引物为5’-ATAGTCAAGCTTCCTCAGACTACATCCAAG-3’(SEQID NO 4)；

(2)用NcoI和HindIII双酶切pET-28a和PCR扩增出的核苷酸片段，得到酶切后的pET-28a和核苷酸片段SEQ ID NO 2；

(3)将酶切后的pET-28a和核苷酸片段SEQ ID NO 2连接，以构建重组载体pET-28a/hSOD1；

(4)将重组载体pET-28a/hSOD1导入表达菌株，得到重组菌株；

(5)将重组菌株扩大培养；

(6)将菌体破碎，离心得到上清液；

(7)将上清液纯化，得到纯化后的rhSOD1；和

(6)向纯化后的rhSOD1中加入铜和锌离子。

在另一个实施方式中，本发明使用T4DNA连接酶将酶切后的pET-28a和核苷酸片段SEQ ID NO 2连接。

在另一个实施方式中，本发明所用表达菌株为大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

在另一个实施方式中，本发明使用氯化钙转化法将重组载体pET-28a/hSOD1导入基因工程菌株中。

在另一个实施方式中，本发明所述的将重组菌株扩大培养的步骤包括：将重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1在37℃、含10-50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，在16-37℃下诱导8-16小时，离心收集菌体。

在另一个实施方式中，OD₆₀₀值为0.8，IPTG终浓度为0.5mM，诱导温度为20℃，诱导时间为12小时。

在另一个实施方式中，超声波破碎的条件为：超声100次或150次，每次超声3秒并间隔5秒，超声功率为650*0.45W，优选超声150次。

在另一个实施方式中，纯化上清液的方法包括离子交换层析，优选使用阳离子交换层析，更优选使用CM-快流速琼脂糖凝胶层析柱。CM-快流速琼脂糖凝胶层析的步骤包括用0.45μm滤膜预过滤上清液，并用20mM、pH4.8的NaAc-HAc和0.6M的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，流速为2.0ml/min。

在另一个实施方式中，纯化上清液的方法进一步包括分子筛层析，优选使用Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析柱，用20mM、pH6.5的KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min。

本发明方法中无纯化标签的rhSOD1的表达量高，且表达菌株表达出的目的蛋白绝大部分存在于菌体破碎后的上清液中，非常易于纯化获得高纯度的rhSOD1。同时，本发明通过向纯化后的rhSOD1同时加入铜离子和锌离子，极大的提高了rhSOD1的比活力。此外，本发明方法中重组载体的构建方法十分简单，适用于工业化。综上所述，本发明的方法适用于在工业上大规模地制备具有高比活力的rhSOD1。

附图说明

图1a：原始载体pET-28a的物理图谱。

图1b：pET-28a含有多克隆位点区域的部分核苷酸片段。

图2：包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的PCR产物电泳图，其中

泳道1：DNA分子量标准；

泳道2：包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的PCR产物，约510bp。

图3：重组载体pET-28a/hSOD1的PCR检测和酶切检测的电泳图，其中

泳道1：以重组载体pET-28a/hSOD1为模板的PCR产物；

泳道2：重组载体pET-28a/hSOD1经NcoI和HindIII双酶切后的片段；

泳道3：DNA分子量标准。

图4：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1诱导表达产生rhSOD1的检测，其中

泳道1：蛋白质分子量标准；

泳道2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1未用IPTG诱导的菌体总蛋白；

泳道3：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达12小时的总蛋白，箭头处为rhSOD1蛋白。

图5：不同超声破碎次数对上清液和沉淀中rhSOD1比例的影响，其中

泳道1：蛋白质分子量标准；

泳道3：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达的总蛋白；

泳道4：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎150次并离心得到上清液中的rhSOD1；

泳道5：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎150次并离心得到沉淀中的rhSOD1；

泳道6：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎100次并离心得到上清液中的rhSOD1；

泳道7：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎100次并离心得到沉淀中的rhSOD1。

图6：rhSOD1纯化产物的电泳检测，其中

泳道1：蛋白质分子量标准；

泳道2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎150次并离心得到的上清液中的rhSOD1；

泳道3：CM-快流速琼脂糖凝胶层析纯化上清液后得到的rhSOD1；

泳道4：Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析进一步纯化后得到的rhSOD1。

图7：纯化产物Cu/Zn-SOD(SOD1)的Western Blot检测图谱，其中

泳道1：蛋白质分子量标准；

泳道2：1.5μg rhSOD1纯化产物的Western Blot条带。

图8：rhSOD1比活力的铜离子和锌离子的滴定曲线

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明。本部分仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

本发明人发现纯化标签的存在会影响到重组菌株表达出的rhSOD1的正确折叠。无纯化标签的rhSOD1主要以活性蛋白的形式存在于菌体破碎后的上清中，可直接用于纯化；而含有纯化标签如6个组氨酸纯化标签(6×His-Tag)的rhSOD1-His主要以非活性的包涵体形式存在于菌体破碎后的沉淀中，因此需要对蛋白进行复杂繁琐的变性、复性、纯化等工艺才能获得所需的rhSOD1-His。本发明人还发现纯化标签的存在还对重组菌株中rhSOD1的表达量有影响，即BL21(DE3)/rhSOD1重组菌株表达出的不含纯化标签的rhSOD1约占菌体总蛋白(即rhSOD1蛋白和菌体自身蛋白之和)的50％，而BL21(DE3)/rhSOD1-His重组菌株表达出的含纯化标签的rhSOD1-His则仅占菌体总蛋白(即rhSOD1-His蛋白和菌体自身蛋白之和)的15％。

因此，一方面，本发明提供了一种制备不含纯化标签的rhSOD1的方法。在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种制备不含纯化标签的rhSOD1的方法，所述方法包括：

(2)将重组载体导入基因工程菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；

(5)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1。

通常，本领域中获得不含纯化标签的活性蛋白的方法是在构建重组表达载体时选用本身无纯化标签序列的原始载体，或者在得到表达产物后利用合适的蛋白酶将纯化标签切除。但是，可以用于前一种方法的不含纯化标签的载体数量偏少，而后一种方法看似简单，实际上却增加了纯化的步骤和成本，不利于工业化生产。

本发明使用包含hSOD1基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段来构建重组载体。hSOD1基因编码序列SEQ ID NO 1的最后一组三联体密码子为终止密码子(TAA)，蛋白质的翻译在此处终止，仅表达hSOD1蛋白。在选择原始载体时，无论原始载体自身的多克隆位点下游是否存在纯化标签，在仅切除原始载体多克隆位点上游纯化标签的情况下即可获得不含任何纯化标签的rhSOD1。

包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段可以通过PCR扩增、人工合成等方法获得。对于PCR扩增法，本领域技术人员知晓引物的设计、PCR条件的选择等技术。本发明优选通过PCR扩增来制备包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段。

本发明构建重组载体的方法包括：使用限制性内切酶分别对原始载体和包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段进行酶切，将二者的酶切产物连接。酶切后的hSOD1核苷酸片段应保留其自身的终止密码子，并能表达出有活性的rhSOD1，即酶切后的hSOD1核苷酸片段应仍包含如SEQ ID NO 1所示的hSOD1基因编码序列。

本发明所用的原始载体可为原核表达载体和真核表达载体。原核表达系统具有遗传背景清楚、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产的优点。优选地，所述原始载体为原核表达载体，如pET系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体、pMAL系列载体等。在原核表达载体中，本发明优选pET系列载体，特别是pET-28a。

本发明优选的pET-28a是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体系统，具有许多优点，主要包括：(1)pET-28a可高效地表达rhSOD1；(2)pET-28a中T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性地激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平；和(3)pET-28a使用lac启动子，其上游的lacI基因的产物是一种阻遏蛋白，能结合到操纵基因上阻遏转录的起始，降低表达菌株的本底表达。

本发明中所用的限制性内切酶首先需对应于所选用原始载体上可用的酶切位点。例如，对于pET-28a质粒，限制性内切酶可为NcoI、BamHI、EcoRI、HindIII、XhoI等。同时，本发明中所用的限制性内切酶还需满足其它条件，如酶切位点应存在于包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的两端，并且hSOD1基因编码序列内部不含相应酶切位点。对于pET-28a，优选地，本发明使用的限制性内切酶为NcoI和HindIII，酶切后的hSOD1核苷酸片段，即实际插入的序列如SEQ ID NO 2所示。

现以pET-28a为例具体说明本发明所述的构建重组载体的方法。图1a为原始载体pET-28a的物理图谱，且图1b为pET-28a含有多克隆位点区域的部分核苷酸片段。参照图1a和图1b，原始载体pET-28a中多克隆位点的上、下游分别含有一个6×His-Tag，即287-270位的6×His-Tag和157-140位6×His-Tag。当使用NcoI和HindIII对pET-28a进行双酶切消化时，可将其287-270位的6×His-Tag切除。在此两酶切位点之间插入的包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段自身带有终止密码子，使得pET-28a中157-140位的6×His-Tag不能表达。因此可得到不含任何纯化标签的rhSOD1。

因此，在本发明的一个实施方式中，提供了一种制备rhSOD1的方法，所述方法包括：

(4)将重组载体pET-28a/hSOD1导入表达菌株，得到重组菌株；

(5)将重组菌株扩大培养；

(6)将菌体破碎，离心得到上清液；

(7)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1。

相比于常规重组载体构建方法及考虑因素，本发明的方法在构建重组载体时更为简单且适用范围更广。在选择原始载体时，无论原始载体自身的多克隆位点下游是否存在纯化标签，在仅切除原始载体多克隆位点上游纯化标签的情况下即可获得不含任何纯化标签的rhSOD1蛋白。

本发明中所用的连接酶可以为大肠杆菌的DNA连接酶和噬菌体的T4DNA连接酶。大肠杆菌的DNA连接酶对胰蛋白酶敏感，可被其水解。而且，大肠杆菌的DNA连接酶所连接的两条链必须是与同一条互补链配对结合的，而且必须是两条紧邻的DNA链才能被其催化形成磷酸二酯键，因此应用范围受到很大限制。噬菌体的T4DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。本发明优选使用噬菌体T4DNA连接酶。

DNA重组载体在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因。进一步地，本发明人发现rhSOD1的表达产量也与宿主菌株有关。一些宿主菌株如酿酒酵母受自身生长密度、适应性、蛋白分泌能力等因素影响，无法大量地表达出rhSOD1。因此，找到适于稳定、高效和大量地表达出rhSOD1的宿主菌株同样是工业化生产rhSOD1的关键。

本发明所用的基因工程菌株可为原核表达系统，如大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、枯草杆菌等，或真核表达系统，如毕赤酵母。发明人通过比较发现，对于hSOD1的表达，原核表达系统比真核表达系统的产量更高且生产周期更短，因此更适合于工业化生产。在众多原核表达系统中，大肠杆菌的遗传图谱明确、生产周期短、容易培养、成本低且对rhSOD1有很强的耐受能力，因此本发明优选使用大肠杆菌作为表达菌株，特别优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明优选同时使用pET-28a和大肠杆菌BL21(DE3)。pET-28a和大肠杆菌BL21(DE3)组合的优点在于：大肠杆菌菌株BL21(DE3)缺失了lon和ompT蛋白酶，有利于外源蛋白的表达；大肠杆菌BL21(DE3)基因型为F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，是λDE3溶源菌，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，在诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在的条件下可以大量产生T7RNA聚合酶，同pET-28a中的lac启动子结合，进而开启hSOD1基因的转录和翻译，并高水平地表达出rhSOD1。

(4)将重组载体pET-28a/hSOD1导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1；

(5)将重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1扩大培养；

(6)将菌体破碎，离心得到上清液；

(7)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1。

本领域中将重组载体导入宿主菌的方法包括氯化钙化学转化法、高压电击转化法、接合转化法等。高压电击转化法需要额外的放电设备，增加了生产成本；而DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合的方法转化受体细胞；氯化钙化学转化法具有操作简单、成本低且效率高的优点，因此本发明优选使用氯化钙化学转化法将重组载体pET-28a/hSOD1导入大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1可通过LB-卡那霉素平板筛选来进一步确定。为了获得大量的重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1，需要将重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1接种到含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，并加入IPTG诱导rhSOD1表达。

(4)将重组载体pET-28a/hSOD1导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1；

(5)将重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1在37℃、含10-50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，在16-37℃下诱导8-16小时，离心收集菌体；

(6)将菌体超声破碎，离心得到上清液；

(7)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1。

在一个优选实施方式中，OD₆₀₀值为0.8，IPTG终浓度为0.5mM，诱导温度为20℃，诱导时间为12小时。

图4显示了重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1诱导表达产生的rhSOD1的产量，其中泳道1为蛋白质分子量标准；泳道2为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1未用IPTG诱导的菌体总蛋白；泳道3为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达12小时的总蛋白，箭头处为rhSOD1蛋白。如图4所示，在20℃下用终浓度为0.5mM的IPTG诱导12小时，重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1可表达出占菌体总蛋白(即rhSOD1蛋白和菌体自身蛋白之和)50％以上(凝胶定量软件Quantity One，BIO-RAD公司)的rhSOD1。

本发明方法中的rhSOD1主要以活性蛋白的形式存在于菌体破碎后的上清液中。本发明人进一步发现，通过改进菌体的破碎条件，可提高上清液中rhSOD1的比例。通常，在所表达出的目的蛋白总量恒定的情况下，超声波破碎的次数越多，上清液中的目的蛋白占其表达总量的比例就越多。但如果超声波破碎的次数过多，会使得上清液中的目的蛋白变性从而导致其占表达总量的比例减少。此外，超声波破碎的时间、超声功率等也对上清液中的目的蛋白比例有所影响。

图5为不同超声破碎次数对上清液和沉淀中rhSOD1比例的影响。泳道1为蛋白质分子量标准；泳道2为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1未用IPTG诱导的菌体总蛋白；泳道3为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达的总蛋白；泳道4和5分别为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎150次并离心得到的上清液和沉淀；泳道6和7分别为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎100次并离心得到的上清液和沉淀。如图5中泳道4至7所示，泳道4上清液中的rhSOD1占rhSOD1总表达量的90％；泳道5沉淀中的rhSOD1占rhSOD1总表达量的10％；泳道6上清液中的rhSOD1占rhSOD1总表达量的80％；泳道7沉淀中的rhSOD1占rhSOD1总表达量的20％。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种制备rhSOD1的方法，所述方法包括：

(6)将菌体超声破碎100次或150次，每次超声3秒并间隔5秒，超声功率为650*0.45W，优选超声150次，离心得到上清液；

(7)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1。

为了提高最终获得的rhSOD1的纯度，可进一步纯化rhSOD1。因为本发明方法所获得的rhSOD1主要存在于上清液中，所以只需简单分离和纯化即可。

本发明纯化上清液的方法可为本领域技术人员所公知的方法，例如凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。

本发明人发现，如果选择适当的纯化方法，不但能够纯化上清液中的rhSOD1外，而且能够同时降低rhSOD1中所含的内毒素。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖，酸性条件下带有很强的负电荷。rhSOD1的等电点为6.1，在酸性条件下带有正电荷。因此，本发明优选使用阳离子交换树脂层析来纯化rhSOD1。待纯化样品通过阳离子交换树脂，rhSOD1保留在层析柱上，而带有强负电荷的内毒素则随同平衡缓冲液一起穿透出来，从而达到rhSOD1和内毒素分离的目的。

本发明更优选使用CM-快流速琼脂糖凝胶层析。CM-琼脂糖凝胶的活性基团为羧甲基(-O-CH2COO-)，带有负电荷，rhSOD1可以结合CM-琼脂糖凝胶的活性基团羧甲基，保留在CM-琼脂糖凝胶柱上。所述CM-快流速琼脂糖凝胶层析方法包括用0.45μm滤膜预过滤上清液，并用20mM、pH4.8的NaAc-HAc和0.6M的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，流速为2.0ml/min。经测定，本发明中CM-快流速琼脂糖凝胶阳离子交换柱的使用使得rhSOD1中含有的内毒素从过柱纯化前的超过10,000U/ml下降到了71.83U/ml，过柱后的内毒素含量仅为过柱前的0.72％，大大提高了产品的生物安全性。

本发明的纯化上清液的方法进一步包括分子筛层析，优选使用SephadexG-75葡聚糖凝胶层析柱，用20mM、pH6.5的KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min。

图6为rhSOD1纯化产物的电泳检测，其中泳道1为蛋白质分子量标准；泳道2为重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1用IPTG诱导表达后，超声破碎150次并离心得到的上清液中的rhSOD1；泳道3为CM-快流速琼脂糖凝胶层析纯化上清液后得到的rhSOD1；泳道4为Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析进一步纯化后得到的rhSOD1。从图6的泳道3可知通过离子交换层析获得的rhSOD1具有约95％的纯度，且从图6的泳道4可知，通过离子交换层析和分子筛层析获得的rhSOD1具有约97％的纯度。

以上本发明方法的优点在于：

(1)不含任何纯化标签的rhSOD1表达量高；

(2)重组菌株表达的rhSOD1主要存在于重组菌株破碎后的上清液中，简单分离、纯化即可，无需进行蛋白质变性、复性；

(3)在构建重组载体时，使用包含如SEQ ID NO 1所示的hSOD1基因编码序列的核苷酸片段可以无需将所用载体中的纯化标签序列全部切除，这就避免了进行复杂的载体构建设计，且扩大了对载体的选择范围；

(4)挑选出重组载体和重组菌株的最佳组合，极大地提高了rhSOD1的表达量；且

(5)在纯化rhSOD1的同时降低内毒素。

在获得高效生产rhSOD1方法的基础上，本发明人进一步发现通过向纯化后的本发明的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子可极大地提高rhSOD1的比活力。

国内外关于SOD1的相关研究大多是在菌体诱导表达阶段，通过向培养基中添加铜、锌离子来提高所表达的SOD1的比活力。但是，细胞本身是一个复杂的生物系统，向外界培养基中添加的铜离子和锌离子只有一部分能够进入细胞，并且细胞内部的其它酶可能也会利用铜离子和锌离子，这样就无法通过铜、锌离子的添加量来控制SOD1的比活力。其次，向培养基中添加的铜、锌离子在后续的SOD1分离纯化过程中会有一定程度的流失，不利于SOD1比活力的体现。

本发明采用向纯化后的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子获得高比活力的蛋白来取代直接向培养基中添加铜和锌离子，因纯化后的rhSOD1是一个比较单纯的化学系统，向其中同时加入铜离子和锌可显著地提高rhSOD1的比活力，且也可以很好地控制rhSOD1的比活力。此外，也避免了rhSOD1分离纯化过程中铜、锌离子的流失。

因此，本发明进一步提供了一种提高本发明无纯化标签的rhSOD1的比活力的方法，所述方法包括：

(2)将重组载体导入基因工程菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；

(5)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1；

(6)向纯化后的rhSOD1中同时加入铜离子和锌离子。

图8是rhSOD1比活力的铜离子和锌离子滴定曲线。图8的纵坐标为rhSOD1蛋白的比活力，以U/mg蛋白计，横坐标为等比例添加的铜和锌离子的量，以rhSOD1蛋白摩尔数的倍数计，如刻度2.5表示铜和锌离子的添加量均为rhSOD1蛋白摩尔数的2.5倍，刻度10表示铜和锌离子的添加量均为rhSOD1蛋白摩尔数的10倍。

本发明人进一步发现，如图8所示，当向纯化后的rhSOD1中同时加入至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜离子和至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的锌离子时，rhSOD1的比活力可高于5000U/mg蛋白，继续加入铜离子和锌离子至rhSOD1蛋白摩尔数的2倍，此期间rhSOD1的比活力呈指数式升高，当铜离子和锌离子的添加量均为rhSOD1蛋白摩尔数的10倍时，rhSOD1的比活力趋于最大值。在本文中，加入的铜离子和锌离子的比例是1∶1，但本发明不限于此。所加入的铜离子和锌离子的比例还可为例如5∶1、4∶1、3∶1、2∶1等。

铜离子和锌离子可源自本领域技术人员已知的铜和锌的有机盐或无机盐，如硫酸铜、硫酸锌、硝酸铜、硝酸锌、氯化铜、氯化锌等。

在一个实施方式中，提高本发明无纯化标签的rhSOD1的比活力的方法优选包括：

(2)将重组载体导入基因工程菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；

(5)将上清液纯化，得到纯的rhSOD1；

(6)向纯化后的rhSOD1中同时加入至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜离子和至少0.2倍rhSOD1蛋白摩尔数的锌离子。

综上所述，本发明通过将表达无纯化标签的rhSOD1和向纯化后的rhSOD1中添加铜和/或锌离子相结合，提供了一种生产高表达量、高比活力的rhSOD1的方法。而且，本发明通过优化rhSOD1的纯化条件，可显著降低纯化后rhSOD1中内毒素的含量。此外，本发明是在充分考虑工业化实际情况的条件下做出的，有利于发明的工业化应用。

实施例

以下结合实施例进一步说明本发明。实施例中未注明具体实验条件和具体实验步骤的实验方法通常按照《分子克隆》(Sambrook等，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第三版)或制造商的建议进行。

上游和下游引物的设计是根据GenBank数据库已收录的hSOD1基因的基因编码序列，借助于软件Primer Premier 5.0完成，上游和下游引物均由上海英骏生物科技有限公司合成。

试剂的来源：

ExTaq聚合酶，购自TaKaRa公司；琼脂糖，购自Gene公司；NcoI、HindIII，购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，本公司保存；卡那霉素，购自Sigma公司；质粒小提试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；酵母提取物，购自Oxoid公司；蛋白胨，购自Oxoid公司；氯化钠，购自西陇化工股份有限公司；IPTG，购自Sigma公司；人神经细胞cDNA，本公司保存；超声破碎仪，JYD-650L型，购自上海之信仪器有限公司；CM-快流速琼脂糖凝胶层析柱，购自浙江争光实业股份有限公司；Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析柱，购自GE公司。

实施例1：重组载体pET-28a/hSOD1的构建

1)包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的PCR扩增

根据hSOD1的基因编码序列及常规引物设计的原则设计一对引物，其中上游引物和下游引物分别为：

上游引物：5’-ATCATG CCATGG CGACGAAGGCCGT-3’，划线部分为NcoI酶切位点；

下游引物：5’-ATAGTC AAGCTT CCTCAGACTACATCCAAG-3’，划线部分为HindIII酶切位点。

理论上，扩增产物长度应为510bp。

以人神经细胞cDNA为模板，以合成的上、下游引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)5μl、dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各为2.5mM)4μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、ExTaq聚合酶0.5μl和cDNA模板0.5μl，加双蒸水至总体积50μl。

1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

图2显示了包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的PCR产物的电泳图。如图2所示，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段的PCR产物，其长度约为510bp。

2)重组载体pET-28a/hSOD1的构建

将步骤1)中的扩增产物与原始载体pET-28a分别用NcoI和HindIII进行双酶切，利用T4DNA连接酶对两片段进行连接，构建重组载体pET-28a/hSOD1。

3)重组载体pET-28a/hSOD1的鉴定

使用氯化钙化学转化法将此重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-卡那霉素(Kan)平板上筛选阳性菌落。

采用碱裂解法从阳性菌落培养物中提取重组载体pET-28a/hSOD1，用NcoI和HindIII进行双酶切检测。

进一步以重组载体为模板、用上游引物和下游引物进行PCR扩增，随后经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

图3为重组载体pET-28a/hSOD1的PCR检测和酶切检测的电泳图。如图3所示，泳道1为以重组载体为模板、用上游引物和下游引物进行PCR扩增后的产物，约510bp的扩增条带为包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段；泳道2为重组载体pET-28a/hSOD1经NcoI和HindIII双酶切产生的片段，其中约490bp的条带代表酶切后的包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段(即SEQ ID NO 2所示的序列)，约5.4kb的条带代表酶切后的pET-28a载体骨架；泳道3为分子量标准。

对重组载体pET-28a/hSOD1序列进行基因测序，测序结果表明获得的重组载体pET-28a/hSOD1构建正确。测序工作由上海英骏生物科技有限公司完成。

实施例2：重组大肠杆菌BL21(DE3)的构建

1)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备

用氯化钙化学法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，步骤包括：取1ml已活化的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种至100ml LB培养基中；37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.35-0.5时；在4℃下以4500rpm离心收集菌体；加入40ml预冷的0.1MCaCl₂重悬细胞，冰浴10分钟；在4℃下以4500rpm离心收集菌体；加入2ml预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞；加入0.5ml 75％甘油；分装成每管50μl；且4℃保存24小时后转到-80℃冰箱中冻存。

2)重组载体pET-28a/hSOD1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞

将重组载体pET-28a/hSOD1与大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合；冰浴30分钟，42℃热激90秒，随后冰浴2分钟；每管加入400μl SOC培养基，37℃培养45-60分钟(≤220rpm)；涂布LB-卡那霉素平板，37℃倒置培养过夜。

实施例3：重组菌株经IPTG诱导合成rhSOD1

从实施例2的LB-卡那霉素平板中挑取单菌落接种到5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时。按1％接种量转接到50ml含卡那霉素的LB液体培养基中。当37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.8时，添加IPTG至终浓度为0.5mM，20℃诱导12小时。5000rpm离心5分钟，收集菌体。

如图4所示，在20℃下用终浓度为0.5mM的IPTG诱导12小时，重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1可表达出占菌体总蛋白(即rhSOD1蛋白和菌体自身蛋白之和)50％以上的rhSOD1。

实施例4：目的蛋白的粗提

将菌体用pH6.5的10mM PBS重悬后超声波破碎：超声3s，间隔5s，超声150次。4℃、9000rpm离心所得上清液即为包含rhSOD1的溶液。

如图5中泳道3所示，在此超声波破碎条件下，上清液中的rhSOD1占rhSOD1总表达量的90％以上。

实施例5：离子交换层析纯化

将实施例4中所得的上清液用0.45μm滤膜过滤后上预平衡过的CM-快流速琼脂糖凝胶层析柱，用20mM、pH4.8的NaAc-HAc和0.6M的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，流速为2.0ml/min，收集目的蛋白峰溶液。

从图6的泳道3可知通过离子交换层析获得的rhSOD1具有约95％的纯度。

实施例6：分子筛层析纯化

将实施例5中收集的蛋白峰溶液透析、浓缩后上Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析柱，用20mM、pH6.5的KH₂PO₄～Na₂HPO4缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，收集目的蛋白峰溶液。

从图6的泳道4可知，通过离子交换层析和分子筛层析获得的rhSOD1具有约97％的纯度。

实施例7：rhSOD1蛋白的Western Blotting检测

取1.5μg rhSOD1的纯化产物进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE凝胶以200mA恒定电流转印PVDF膜1.5～2h，转印膜用15～20ml封闭液室温封闭1～1.5h，用15～20ml的抗SOD抗体(一抗)于4℃孵育过夜，再用15～20ml的二抗抗体于室温孵育1.5～2h，之后将转印膜放入10～15ml DAB显色液中避光显色10～15min，待条带显示出后用15～20ml双蒸水终止反应。由图7可以看出，本发明方法纯化出的rhSOD1可以同抗SOD的抗体结合，在PVDF膜上显示清晰的蛋白条带。

实施例8：rhSOD1蛋白中内毒素的检测

rhSOD1蛋白经CM-琼脂糖凝胶纯化前后的内毒素含量检测采用厦门鲎试剂实验厂有限公司的显色基质鲎试剂盒进行，具体步骤参见试剂盒说明书。

实验结果显示，本发明制备的rhSOD1蛋白的细菌内毒素仅为0.14EU/ug蛋白。

实施例9：铜和锌离子的添加对rhSOD1比活力的影响

取实施例6纯化后的1mol/ml的rhSOD1共9ml，平均分成9份，每份1ml。每份中分别等比例加入0倍、0.2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍和15倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜离子和锌离子(参见图8)。充分混匀后于4℃静置4h，用邻苯三酚法测定比活力，具体步骤参见：邓碧玉等，“改良的连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的方法”，生物化学与生物物理进展，1991/18/02，163页。

结果如图8所示，当铜和锌离子的添加量均从0倍增至2倍rhSOD1蛋白摩尔数时，rhSOD1比活力呈指数上升，之后rhSOD1比活力的增长趋势变缓，当铜和锌离子的添加量均为10倍rhSOD1蛋白摩尔数时，rhSOD1的比活力达到34,800U/mg蛋白，且已趋近饱和。以后继续增加铜和锌离子的添加量至15倍rhSOD1蛋白摩尔数，rhSOD1的比活力也基本不增加。

对比例1：纯化标签对于rhSOD1表达量的影响

本发明同时构建了用于表达带有纯化标签的rhSOD1-His的重组载体pET-28a/hSOD1-His，具体构建过程为：根据hSOD1的基因编码序列及常规引物设计的原则设计一对引物，其中上游引物和下游引物分别为：

上游引物：5’-ATCATG GGATCC CGACGAAGGCCGT-3’，划线部分为BamHI酶切位点；

以人神经细胞cDNA为模板，以合成的上、下游引物进行PCR扩增。理论上，扩增产物长度应为510bp。PCR产物连同pET-28a通过BamHI和HindIII酶切位点连接，以构建重组载体pET-28a/hSOD1-His。BamHI和HindIII两酶切位点中间插入的hSOD1核苷酸片段同样自带终止密码子，使得pET-28a中位于157-140位的6×His-Tag不能表达。但是，BamHI和HindIII并未将287-270位的6×His-Tag切除，因此，此方法构建的重组载体pET-28a/hSOD1-His中包含pET-28a中287-270位的6×His-Tag。随后，将重组载体pET-28a/hSOD1-His转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/hSOD1-His，并诱导表达带有纯化标签的rhSOD1-His。对比例1中诱导表达条件与实施例3相同。具体操作步骤参见实施例1-3

本对比例显示，所表达出的rhSOD1-His仅占菌体总蛋白(即rhSOD1-His蛋白和菌体自身蛋白之和)的15％，远小于本发明的50％比例。

对比例2：纯化标签对于rhSOD1可溶性的影响

采用与对比例1相同的方法获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/hSOD1-His。用与实施例3相同的条件对重组大肠杆菌BL21(DE3)/hSOD1-His进行诱导表达，随后用与实施例4相同的条件将菌体破碎。具体操作步骤参见实施例1-4。

本对比例显示，带有纯化标签的rhSOD1-His主要以包涵体的形式存在于菌体破碎后的沉淀中，沉淀中的rhSOD1-His约占表达出的rhSOD1-His总量的60％，上清中的rhSOD1-His仅占表达总量的40％。而无纯化标签的rhSOD1主要以活性蛋白的形式存在于菌体破碎后的上清中，上清中的rhSOD1约占表达出的rhSOD1总量的90％。

对比例3：CM琼脂糖凝胶层析柱和DEAE阴离子交换柱纯化rhSOD1能力的比较

本发明对CM琼脂糖凝胶层析柱和DEAE阴离子交换柱纯化具有相同蛋白浓度的破碎后上清液的能力进行了比较。

每毫升DEAE阴离子交换填料处理3.5ml破碎后上清液即可在穿透液中检测到rhSOD1，而每毫升CM琼脂糖凝胶层析填料处理7ml破碎后上清液仍未检测到rhSOD1穿透出来，CM琼脂糖凝胶层析填料处理纯化rhSOD1的能力约为DEAE阴离子交换填料的2倍。

对比例4：纯化标签和铜锌离子添加方式对rhSOD1比活力的影响

按照实施例的方法，分别制备出四组不带纯化标签的rhSOD1：A)在菌体诱导表达期间和纯化后均不加入铜和锌离子；B)仅在菌体诱导表达期间等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子；C)向未纯化的菌体破碎后的上清液中等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子；和D)仅在纯化后等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子。

按照对比例1的方法，分别制备出三组带有纯化标签的rhSOD1-His：E)在菌体诱导表达期间和纯化后均不加入铜和锌离子；F)仅在菌体诱导表达期间等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子；和G)仅在纯化后等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子。

用实施例9中的方法测定rhSOD1的比活力，结果如下表1所示。

表1

组号	比活力(U/mg蛋白)
		A	377
B	606
		C	2,017
D	34,800
		E	247
F	555
		G	4,207

上表1的结果显示，纯化标签的存在以及铜锌离子的添加方式均会影响rhSOD1的比活力。向纯化后的本发明的rhSOD1中等比例加入10倍rhSOD1蛋白摩尔数的铜和锌离子可得到高达34,800U/mg蛋白的比活力。

以上通过优选实施方式和具体实施例详细描述了本发明，然而本领域技术人员应理解，本发明的范围不限于此，任何不背离本发明的修改或改动都在本发明的范围内。

Claims

1.一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括：

(1)将包含人源铜锌超氧化物歧化酶基因编码序列SEQ ID NO 1的核苷酸片段插入原始载体中，以构建重组载体；

(2)将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；和

(5)将上清液纯化，得到纯化后的重组人源铜锌超氧化物歧化酶。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括向纯化后的重组人源铜锌超氧化物歧化酶中加入至少0.2倍所述重组人源铜锌超氧化物歧化酶的蛋白摩尔数的铜离子和至少0.2倍所述重组人源铜锌超氧化物歧化酶的蛋白摩尔数的锌离子的步骤。

3.如权利要求2所述的方法，所述铜和锌离子浓度均是所述重组人源铜锌超氧化物歧化酶蛋白摩尔数的10倍。

4.如权利要求1至3所述的方法，其中所述步骤(1)包括：

用PCR方法扩增获得包含人源铜锌超氧化物歧化酶基因编码序列的核苷酸片段，其中PCR方法所用的上游引物为5’-ATCATGCCATGGCGACGAAGGCCGT-3’(SEQ ID NO 3)，下游引物为5’-ATAGTCAAGCTTCCTCAGACTACATCCAAG-3’(SEQ ID NO 4)；

用NcoI和HindIII双酶切pET-28a和PCR扩增出的核苷酸片段，得到酶切后的pET-28a和核苷酸片段SEQ ID NO 2；和

将酶切后的pET-28a和核苷酸片段SEQ ID NO 2用T4 DNA连接酶连接，以构建重组载体pET-28a/hSOD1；

5.如权利要求4所述的方法，所用表达菌株为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述步骤(3)包括：将重组大肠杆菌BL21(DE3)/rhSOD1在37℃、含10-50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，在16-37℃下诱导8-16小时，离心收集菌体。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述步骤(4)是采用超声波破碎。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述步骤(5)包括使用阳离子交换层析进行纯化。

9.如权利要求8所述的方法，所述阳离子交换层析为CM-快流速琼脂糖凝胶层析。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述步骤(5)进一步包括使用SephadexG-75葡聚糖凝胶层析进行纯化。