CN114634920A

CN114634920A - 一种产人源透明质酸酶ph20的重组毕赤酵母及其构建方法

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Publication number: CN114634920A
Application number: CN202210300484.6A
Authority: CN
Inventors: 康振; 堵国成; 王淼; 庞博; 王阳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-03-24
Also published as: CN114634920B

Abstract

本发明公开了一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明通过对hPH20的C端结构域优化，结合N端蛋白标签融合策略，构建了一个hPH20突变体AP₂‑△491C；利用整合型质粒pPIC9K和强启动子P_AOX1实现了hPH20突变体在P.pastoris GS115中的诱导表达，经3‑L发酵罐培养，发酵液中酶活达到258.1U/L，是目前微生物表达系统发酵制备hPH20的最高水平。该突变体能够水解机体组织中的大分子HA，增加组织细胞膜渗透性，在促进药物扩散吸收、增强药效、降低眼压等临床医学方面具有应用价值。

Description

一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

透明质酸酶(Hyaluronidases，Hyals)是使透明质酸(HA)产生低分子化作用的一类酶的总称。由于具有促药物吸收、抗肿瘤信号传导和降低眼压功能，Hyals在医学上被广泛应用。依据其催化机制和产物不同，Hyals分为三类：第一类为内切β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶(EC 3.2.1.35)，主要存在于哺乳动物、蜜蜂、蛇毒、蜂毒以及溶菌体等毒液中，属于hyaluronate 4-glycanohydrolases家族，作用于HA的β-1,4糖苷键生成四糖(HA4)为主要水解产物，同时也能水解软骨素类多糖且具有转糖苷作用；第二类为内切β-葡萄糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)，主要存在于水蛭、钩虫及唾液腺，属于hyaluronate 3-glycanohydrolases家族，作用于HA的β-1,3糖苷键生成的水解终产物为HA4和HA6且还原端为GlcUA，其中水蛭透明质酸酶具有高度的底物专一性且无转糖苷作用；第三类为透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1)，主要存在于微生物中如链球菌、梭菌，以β-消除裂解方式作用于HA的β-1,4糖苷键，产生不饱和葡糖醛酸-N-乙酰己糖胺。

目前已表征的Hyals大多来源于动植物昆虫毒液(如Hippasa partica、Palamneusgravimanus、Bee hyaluronidase)、动物组织(如Hirudo medicinalis、Bovin testicularhyaluronidases)以及微生物(如Streptococcus agalactiae、Propionibacteriumacnes)，这些Hyals在实际应用中对人体组织和器官均存在一定免疫原性风险，易被当作外来抗原，从而诱发机体免疫识别机制。

hPH20能够水解细胞间基质、改善组织周围体液流动性且不被人体巨噬细胞识别而清除，在临床医学中具有重要应用价值。目前，hPH20已在昆虫、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等宿主中重组表达，但这些宿主存在培养周期长、遗传操作复杂、重组表达hPH20产量低的问题，限制了hPH20的进一步应用。毕赤酵母(P.pastoris GS115)具有生长速度快、遗传操作简单、分泌效率高、对外源蛋白进行糖基化修饰的优点，是实现重组酶高水平分泌表达的常用真核表达系统。2016年，有研究者利用质粒pGAPZαC和启动子P_GAP实现了hPH20在P.pastoris GS115中的组成型表达，然而hPH20在发酵液中的产量仅为2U/L，远不能满足应用需求。

发明内容

本发明提供了一种透明质酸酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一所示。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体为hPH20△484C，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体为hPH20△491C，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体的C端还融合有6×His标签。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体在N端或C端还连接了蛋白标签AP₂、HL₂₈或Sumo。

在一种实施方式中，所述蛋白标签AP₂的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，所述蛋白标签HL₂₈的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，所述蛋白标签Sumo的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明还提供了编码所述透明质酸酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pPIC9K。

本发明还提供了表达人源透明质酸酶突变体的重组毕赤酵母。

在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母GS115为宿主。

本发明还提供一种促进毕赤酵母表达人源透明质酸酶突变体的方法，是将Genbank登录号如NP_003108.2所示的氨基酸序列从第484位或第491位开始截断，将截断后的透明质酸酶突变体在毕赤酵母中表达。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体的N端或C端还融合了蛋白标签AP₂、HL₂₈或Sumo。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体还通过强启动子P_AOX1调控表达。

本发明还提供一种生产人源透明质酸酶突变体的方法，是将所述重组毕赤酵母在发酵培养基中，于28～32℃、200～250rpm发酵至少24h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基为BMMY培养基。

在一种实施方式中，发酵过程中每20～24h采用甲醇诱导酶的表达。

在一种实施方式中，所述方法是将单菌落接种于YPD培养基中，于30℃、200rpm培养过夜，获得种子培养物；将种子培养物转移至BMMY培养基中，于30℃、200rpm培养96h，每隔24h按终浓度1％(v/v)补充甲醇。

在一种实施方式中，所述方法将种子培养物按10％(v/v)接种量转接到BSM培养基中，于30℃、200rpm培养，以25mL/L/h速率流加含1.2％(v/v)PTM1浓度为50％(w/v)的甘油母液，补料10h。

本发明还提供所述透明质酸酶突变体、所述重组毕赤酵母或所述方法在水解透明质酸中的应用。

有益效果：本发明还提供了hPH20突变体AP₂-△491C及其构建方法，本发明通过对hPH20的C端结构域优化，结合N端蛋白标签融合策略，构建了一个hPH20突变体AP₂-△491C，利用整合型质粒pPIC9K和强启动子P_AOX1实现了hPH20突变体在P.pastoris GS115中的诱导表达，经3-L发酵罐培养，发酵液中酶活达到258.1U/L，是目前微生物表达系统发酵制备hPH20的最高水平。该突变体能够水解机体组织中的大分子HA，增加组织细胞膜渗透性，在促进药物扩散吸收、增强药效、降低眼压等临床医学方面具有应用价值。

附图说明

图1为发酵液中hPH20及其突变体的表达和酶活分析；(A)Western blot分析hPH20及其突变体的表达；M:标准蛋白；1:对照；2:hPH20；3:△484C；4:△491C；5:AP₂；6:HL₂₈；7:Sumo；(B)hPH20及其突变体的透明质酸酶酶活分析。

图2为突变体AP₂-△491C的3-L发酵罐小试；(A)Western blot分析不同时间突变体AP₂-△491C在发酵液中的表达水平。M:标准蛋白；1-9:分别为12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h和108h发酵液样品；(B)不同发酵时间突变体AP₂-△491C的透明质酸酶酶活分析。

具体实施方式

(一)菌株及载体

毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株P.pastoris GS115、E.coli JM109购自于Novagen公司。

(二)酶类及其他生化试剂

T4 Polynucleotide激酶、T4 DNA连接酶、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司。限制性内切酶Sal I、DNA纯化试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。质粒提取试剂盒、透明质酸、G418抗生素、氨苄青霉素、卡那霉素、酵母氮源(YNB)购于生工生物工程(上海)有限公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)购于英国OXOID公司，其余试剂为国产分析纯。

(三)培养基

LB培养基(g/L):酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0。固体培养基含20.0g/L琼脂。筛选E.coli克隆或者液体培养时，根据需要在培养基中添加终浓度为100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素。

YPD培养基(g/L):酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。固体培养基含20.0g/L琼脂。根据需要在固体培养基中添加终浓度4mg/mL的G418用于筛选重组子目的基因拷贝数。

MD培养基(g/L):葡萄糖20.0，酵母氮源(YNB)13.4，生物素4×10^-4，琼脂20.0。

BMGY培养基(g/L):酵母粉10.0，蛋白胨20.0，酵母氮源(YNB)13.4，甘油10mL，生物素4×10^-4，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0。

BMMY培养基(g/L):酵母粉10.0，蛋白胨20.0，酵母氮源(YNB)13.4，甲醇10mL，生物素4×10^-4，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0。

BSM培养基(g/L):K₂SO₄18.0，MgSO₄·7H₂O 14.9，KOH 4.13，甘油40.0，CaSO₄0.93，补加27.0mLH₃PO₄和4.4mL PTM1。

PTM1(g/L):MnSO₄·H₂O 3.0，CuSO₄·5H₂O 6.0，MoNa₂O₄·2H₂O 0.2，FeSO₄·7H₂O65.0，CoCl₂0.5，ZnCl₂ 20.0，KI 0.09，H₃BO₃0.02，生物素0.2，补加5.0mLH₂SO₄。

大肠杆菌采用LB液体或固体培养基(按需要添加相应的抗生素)于37℃培养12h，液体培养转速为200rpm。毕赤酵母采用YPD液体或固体培养基于30℃培养24h，液体培养转速为200rpm。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

hPH20酶活的检测方法：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法对发酵液中hPH20酶活进行检测，具体方法如下：200μL的反应体系(100μL 1.25mg/mLHA溶解于100mM pH 5.0醋酸钠缓冲液、100μL发酵液)，37℃保温30min，加入200μL DNS反应液，100℃沸水浴6min，流水速冷至室温，稀释一定倍数后测定OD₅₄₀。1个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟释放相当于1μmolN-乙酰氨基葡萄糖还原力的还原糖所需要的酶量。

实施例1 hPH20及其突变体的构建

根据NCBI报道的hPH20序列(Genbank accession number:NP_003108.2)，对其第36-511位氨基酸序列对应的核苷酸序列按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化，优化后的基因序列SEQ ID NO.1交由通用生物系统(安徽)有限公司合成并连接至表达载体pPIC9K的EcoRI和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-hPH20。接着，设计如表1所示的截断突变引物△484C-F、△484C-R和△491C-F、△491C-R，以质粒pPIC9K-hPH20为模版，利用PCR技术，分别构建删除hPH20的C端第484位以后(即保留483位，截断第484位及484位以后)的氨基酸和第491位以后(即保留490位，截断第491位及491位以后)的氨基酸的截断突变体△484C和△491C，得到携带SQE ID NO.4所示基因的重组质粒pPIC9K-△484C和携带SEQ IDNO.5所示基因的重组质粒pPIC9K-△491C，具体步骤如下：

(1)以质粒pPIC9K-hPH20为模板，分别用引物△484C-F、△484C-R和△491C-F、△491C-R进行PCR克隆；

PCR反应体系如下：

PCR扩增条件：

(2)将步骤(1)获得的上述PCR产物进行回收纯化，以如下反应体系将纯化后PCR产物进行5’磷酸化反应并在16℃连接过夜；

5’磷酸化反应体系：

(3)将步骤(2)获得的上述连接产物转化至E.coli JM109，挑取单菌落进行测序，得到重组菌E.coli-pPIC9K-△484C和E.coli-pPIC9K-△491C。

表1引物序列表

将核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示的蛋白标签序列AP₂，HL₂₈，Sumo交由通用生物系统(安徽)有限公司分别合成至pPIC9K-△491C的SnaBI，EcoRI酶切位点之间，获得在突变体△491C的N端分别融合3种蛋白标签的重组质粒pPIC9K-ap₂-△491C、pPIC9K-hl₂₈-△491C、pPIC9K-sumo-△491C。

将上述6种重组质粒pPIC9K-hPH20、pPIC9K-△484C、pPIC9K-△491C、pPIC9K-ap₂-△491C、pPIC9K-hl₂₈-△491C、pPIC9K-sumo-△491C分别按照如下反应体系在37℃保温2h线性化。

线性化体系：

对上述6种线性化片段进行回收纯化，纯化后的线性片段以电转方式转化至P.pastoris GS115，菌悬液涂布于MD培养基，30℃培养至单菌落出现，将单菌落挑至含有4mg/mL G418抗性的YPD平板，筛选目的基因高拷贝转化子，分别命名为P.pastoris-pPIC9K-hPH20、P.pastoris-pPIC9K-△484C、P.pastoris-pPIC9K-△491C、P.pastoris-pPIC9K-ap₂-△491C、P.pastoris-pPIC9K-hl₂₈-△491C、P.pastoris-pPIC9K-sumo-△491C。

实施例2 hPH20及其突变体的摇瓶发酵

将实施例1构建的重组子P.pastoris-pPIC9K-hPH20、P.pastoris-pPIC9K-△484C、P.pastoris-pPIC9K-△491C、P.pastoris-pPIC9K-ap₂-△491C、P.pastoris-pPIC9K-hl₂₈-△491C、P.pastoris-pPIC9K-sumo-△491C在YPD固体平板上划线，置于30℃恒温培养箱培养至长出单菌落。将单菌落分别接种于含50mL YPD液体培养基的250mL摇瓶中，于30℃、200rpm培养过夜，获得种子培养物。将种子培养物按10％(v/v)接种量转接到含50mLBMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃、200rpm培养至OD₆₀₀达到6，收集所有菌体并用0.9％NaCl清洗3次后转移至含50mL BMMY培养基的250mL摇瓶中，于30℃、200rpm培养96h，每隔24h按终浓度1％(v/v)补充甲醇。

收集96h的摇瓶发酵液，通过Western blot对发酵液目的蛋白进行分析，并检测发酵液中的酶活。Western blot对发酵液目的蛋白进行分析，结果如图1A所示，突变体△484C、△491C、AP₂-△491C、Sumo-△491C目的条带明显，说明它们在毕赤酵母中成功表达并分泌至发酵液中；突变体目的条带大小在62-198kDa之间，较分子量理论数值偏大，这是由于突变体翻译后在内质网中被糖基化修饰导致。对hPH20及其突变体进行发酵液酶活分析，结果如图1B所示，突变体AP₂-△491C酶活达76.9U/L，分别是突变体△484C、△491C、Sumo-△491C的9.2、1.3和1.2倍，与Western blot结果一致。说明截断hPH20的C端第491位及之后的氨基酸后肽段同时在hPH20的N端融合蛋白标签AP2能够显著提高hPH20的分泌表达。

对突变体AP₂-△491C的动力学参数进行表征，结果显示AP₂-△491C的比酶活为234.1U/g，K_m值为0.8mg/mL，催化常数k_cat为41.2/s，催化效率k_cat/K_m为52.5mL/mg/s，与hPH20的动力学参数值接近，表明截断氨基酸不会对酶的催化能力带来显著的影响。

表2 hPH20与AP₂-△491C的动力学参数分析

值得注意的是，在发酵上清中野生型hPH20的表达和酶活几乎没有被检测到。通过收集重组子P.pastoris-pPIC9K-hPH20的发酵菌体，用100mM pH 5.0醋酸钠缓冲液洗涤3次后重悬，之后取100μL菌体悬浮液按照DNS法测定全细胞是否能水解HA。结果显示，在与突变体相同细胞量的情况下，P.pastoris-pPIC9K-hPH20的全细胞酶活为36.6U/L，说明野生型hPH20的C端存在一段疏水跨膜区，该跨膜区锚定在重组P.pastoris的细胞膜，使hPH20不能成功分泌至发酵液，故发酵上清中几乎不能检测到hPH20的表达和酶活；同时，锚定在重组P.pastoris细胞膜的hPH20的N端催化结构域朝向细胞膜外，P.pastoris-pPIC9K-hPH20全细胞具有水解HA的能力。

本发明构建的重组子P.pastoris-pPIC9K-ap₂-△491C表达的突变体AP₂-△491C能够水解机体组织中的大分子HA，增加组织细胞膜渗透性，在促进药物扩散吸收、增强药效、降低眼压等临床医学方面具有应用价值。

实施例3突变体AP₂-△491C的3-L发酵罐小试

将实施例1构建的重组子P.pastoris-pPIC9K-ap₂-△491C在YPD固体平板上划线，置于30℃恒温培养箱培养至长出单菌落。单菌落接种于含50mL YPD液体培养基的250mL三角摇瓶，30℃200rpm培养过夜。种子培养物按10％(v/v)接种量转接到含900mL BSM培养基的3-L发酵罐中，初始参数设置为：温度30℃，pH 5.0，通气量2.0vvm和转速200rpm。当甘油耗尽，发酵液中溶氧出现反弹时，以25mL/L/h速率流加含按体积计1.2％PTM1的浓度为500g/L的甘油母液，补料10h，过程中调整通气量为4.0vvm，转速根据溶氧逐渐提高至800-900rpm，溶氧反弹至最高点后饥饿培养2h。进入甲醇诱导阶段，以7mL/L/h速率流加含按体积计1.2％PTM1的甲醇，每12h收集发酵液检测菌体生长和透明质酸酶酶活。

如图2B所示，在小试发酵第96h，突变体AP₂-△491C在发酵液中酶活最高，达到258.1U/L，是摇瓶水平的3.4倍。Western blot分析结果(图2A)与酶活分析结果一致。

对比例：

具体实施方式同实施例1，区别在于，构建截断506位、501位、496位、488位、486位和484位及其以后氨基酸的突变体，不融合蛋白标签，按照实施例2相同方法发酵，发酵液中酶活如表3所示。截断hPH20C端氨基酸序列的突变体△484C、△485C、△487C、△502C、△507C在发酵液中的酶活均低于hPH20的全细胞酶活。分析原因可能为hPH20的C端第511～491位氨基酸序列中存在疏水跨膜区，与P.pastoris细胞膜结合，使hPH20锚定在细胞膜上，截断该区域若干氨基酸可能导致hPH20与细胞膜的结合能力降低；hPH20的C端第484-490位氨基酸序列可能对维持hPH20的高水解活性不可或缺；缺失该区域的氨基酸易使hPH20的水解活性降低。

表3不同截短突变体的酶活

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法

<130> BAA220266A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgaatt ttagagcccc acctgtaatt cctaacgtac catttttgtg ggcctggaac 60

gcaccttcag agttttgtct gggcaagttt gatgaacctc tggacatgtc actgttcagt 120

ttcattggat ctcctagaat aaacgcaacg ggtcaaggtg ttacaatttt ctacgtggac 180

aggcttggct actatccata tattgattct atcaccggcg taacagtgaa cggaggaatc 240

cctcaaaaaa tctccttgca ggatcatctt gacaaagcaa aaaaagatat tacgttttac 300

atgcctgttg acaacctggg tatggccgta attgattggg aagaatggcg tccaacttgg 360

gctagaaact ggaaacccaa agatgtttac aaaaacagat ctatagagtt ggtccaacag 420

cagaatgtac aactttccct aaccgaagcc acagagaaag ccaagcaaga gtttgaaaaa 480

gctggcaagg attttctagt tgaaaccatc aagttgggta agctacttcg tcccaaccat 540

ctatggggtt attatctgtt tcctgattgc tacaatcatc actataaaaa gcctggctat 600

aacggatctt gctttaacgt agagatcaaa aggaatgacg acctgtcttg gctgtggaat 660

gagtcaaccg cactataccc ctccatatac ttgaatactc agcaatcccc cgttgccgct 720

acgctttacg tcaggaatag agtcagggaa gctataagag taagtaaaat tccagacgcc 780

aaatcccccc ttcctgtatt cgcttatacc agaatcgttt ttactgatca agtactaaag 840

tttctttcac aagacgaact ggtttataca tttggcgaaa cggtggccct gggagcatct 900

ggtatagtga tctggggaac attgagtata atgagatcca tgaagagttg ccttctgctt 960

gataactaca tggagaccat tttgaaccct tacataatta atgttaccct agctgctaag 1020

atgtgctctc aagtcttatg tcaggagcag ggcgtctgca tcaggaaaaa ttggaacagt 1080

tccgactatt tacaccttaa ccctgacaat tttgccatcc aactagaaaa gggtggcaaa 1140

ttcacagtcc gtggcaagcc cacactagag gacttagagc aattcagtga gaaattttat 1200

tgttcttgtt attcaactct atcctgtaag gaaaaggcag acgttaaaga tactgacgcc 1260

gtggatgtct gtatagcaga cggagtgtgt atcgacgcat tcctgaaacc tcctatggag 1320

accgaagaac ctcaaatctt ttataacgct tcaccctcca ctttatcagc cactatgttc 1380

atctggaggt tagaggtgtg ggaccaaggt atttcaagaa taggtttttt ccatcatcat 1440

catcatcatt ga 1452

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu

1 5 10 15

Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu

20 25 30

Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn

35 40 45

Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr

50 55 60

Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile

65 70 75 80

Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp

85 90 95

Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp

100 105 110

Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys

145 150 155 160

Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu

165 170 175

Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn

180 185 190

His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu

195 200 205

Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala

210 215 220

Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala

225 230 235 240

Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys

245 250 255

Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile

260 265 270

Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile

290 295 300

Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu

305 310 315 320

Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr

325 330 335

Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val

340 345 350

Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro

355 360 365

Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg

370 375 380

Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr

385 390 395 400

Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys

405 410 415

Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp

420 425 430

Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr

435 440 445

Asn

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu

1 5 10 15

Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu

20 25 30

Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn

35 40 45

Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr

50 55 60

Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile

65 70 75 80

Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp

85 90 95

Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp

100 105 110

Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys

145 150 155 160

Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu

165 170 175

Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn

180 185 190

His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu

195 200 205

Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala

210 215 220

Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala

225 230 235 240

Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys

245 250 255

Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile

260 265 270

Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile

290 295 300

Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu

305 310 315 320

Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr

325 330 335

Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val

340 345 350

Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro

355 360 365

Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg

370 375 380

Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr

385 390 395 400

Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys

405 410 415

Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp

420 425 430

Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr

435 440 445

Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser

450 455

<210> 4

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctgaatt ttagagcccc acctgtaatt cctaacgtac catttttgtg ggcctggaac 60

gcaccttcag agttttgtct gggcaagttt gatgaacctc tggacatgtc actgttcagt 120

ttcattggat ctcctagaat aaacgcaacg ggtcaaggtg ttacaatttt ctacgtggac 180

aggcttggct actatccata tattgattct atcaccggcg taacagtgaa cggaggaatc 240

cctcaaaaaa tctccttgca ggatcatctt gacaaagcaa aaaaagatat tacgttttac 300

atgcctgttg acaacctggg tatggccgta attgattggg aagaatggcg tccaacttgg 360

gctagaaact ggaaacccaa agatgtttac aaaaacagat ctatagagtt ggtccaacag 420

cagaatgtac aactttccct aaccgaagcc acagagaaag ccaagcaaga gtttgaaaaa 480

gctggcaagg attttctagt tgaaaccatc aagttgggta agctacttcg tcccaaccat 540

ctatggggtt attatctgtt tcctgattgc tacaatcatc actataaaaa gcctggctat 600

aacggatctt gctttaacgt agagatcaaa aggaatgacg acctgtcttg gctgtggaat 660

gagtcaaccg cactataccc ctccatatac ttgaatactc agcaatcccc cgttgccgct 720

acgctttacg tcaggaatag agtcagggaa gctataagag taagtaaaat tccagacgcc 780

aaatcccccc ttcctgtatt cgcttatacc agaatcgttt ttactgatca agtactaaag 840

tttctttcac aagacgaact ggtttataca tttggcgaaa cggtggccct gggagcatct 900

ggtatagtga tctggggaac attgagtata atgagatcca tgaagagttg ccttctgctt 960

gataactaca tggagaccat tttgaaccct tacataatta atgttaccct agctgctaag 1020

atgtgctctc aagtcttatg tcaggagcag ggcgtctgca tcaggaaaaa ttggaacagt 1080

tccgactatt tacaccttaa ccctgacaat tttgccatcc aactagaaaa gggtggcaaa 1140

ttcacagtcc gtggcaagcc cacactagag gacttagagc aattcagtga gaaattttat 1200

tgttcttgtt attcaactct atcctgtaag gaaaaggcag acgttaaaga tactgacgcc 1260

gtggatgtct gtatagcaga cggagtgtgt atcgacgcat tcctgaaacc tcctatggag 1320

accgaagaac ctcaaatctt ttataaccat catcatcatc atcattga 1368

<210> 5

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgctgaatt ttagagcccc acctgtaatt cctaacgtac catttttgtg ggcctggaac 60

gcaccttcag agttttgtct gggcaagttt gatgaacctc tggacatgtc actgttcagt 120

ttcattggat ctcctagaat aaacgcaacg ggtcaaggtg ttacaatttt ctacgtggac 180

aggcttggct actatccata tattgattct atcaccggcg taacagtgaa cggaggaatc 240

cctcaaaaaa tctccttgca ggatcatctt gacaaagcaa aaaaagatat tacgttttac 300

atgcctgttg acaacctggg tatggccgta attgattggg aagaatggcg tccaacttgg 360

gctagaaact ggaaacccaa agatgtttac aaaaacagat ctatagagtt ggtccaacag 420

cagaatgtac aactttccct aaccgaagcc acagagaaag ccaagcaaga gtttgaaaaa 480

gctggcaagg attttctagt tgaaaccatc aagttgggta agctacttcg tcccaaccat 540

ctatggggtt attatctgtt tcctgattgc tacaatcatc actataaaaa gcctggctat 600

aacggatctt gctttaacgt agagatcaaa aggaatgacg acctgtcttg gctgtggaat 660

gagtcaaccg cactataccc ctccatatac ttgaatactc agcaatcccc cgttgccgct 720

acgctttacg tcaggaatag agtcagggaa gctataagag taagtaaaat tccagacgcc 780

aaatcccccc ttcctgtatt cgcttatacc agaatcgttt ttactgatca agtactaaag 840

tttctttcac aagacgaact ggtttataca tttggcgaaa cggtggccct gggagcatct 900

ggtatagtga tctggggaac attgagtata atgagatcca tgaagagttg ccttctgctt 960

gataactaca tggagaccat tttgaaccct tacataatta atgttaccct agctgctaag 1020

atgtgctctc aagtcttatg tcaggagcag ggcgtctgca tcaggaaaaa ttggaacagt 1080

tccgactatt tacaccttaa ccctgacaat tttgccatcc aactagaaaa gggtggcaaa 1140

ttcacagtcc gtggcaagcc cacactagag gacttagagc aattcagtga gaaattttat 1200

tgttcttgtt attcaactct atcctgtaag gaaaaggcag acgttaaaga tactgacgcc 1260

gtggatgtct gtatagcaga cggagtgtgt atcgacgcat tcctgaaacc tcctatggag 1320

accgaagaac ctcaaatctt ttataacgct tcaccctcca ctttatcaca tcatcatcat 1380

catcattga 1389

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala

1 5 10 15

Lys

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp Glu Tyr Ala Thr Glu Glu Thr Leu

1 5 10 15

Ser His His His His His His Gly Asp Asp Asp Asp Lys

20 25

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

35 40 45

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg

50 55 60

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

65 70 75 80

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Asp Asp Asp Lys

100 105

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggctgaag ctgaagctaa agctaaagct gaagctgaag ctaaagctaa a 51

<210> 10

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggaagatg aagatggtga cgatgaatat gcaacagaag agactttgag ccatcatcat 60

catcatcatg gtgatgatga tgataaa 87

<210> 11

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtgctacg 300

tatgatgatg atgataaa 318

Claims

1.一种透明质酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一所示。

2.根据权利要求1所述的透明质酸酶突变体，其特征在于，所述透明质酸酶突变体在N端或C端还连接了蛋白标签AP₂、HL₂₈或Sumo。

3.编码权利要求1或2所述透明质酸酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.表达权利要求1或2所述透明质酸酶突变体的重组毕赤酵母。

6.根据权利要求5所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母GS115为宿主，以pPIC9K为表达载体表达权利要求1或2所述的透明质酸酶突变体。

7.一种促进毕赤酵母表达人源透明质酸酶突变体的方法，其特征在于，将Genbank登录号如NP_003108.2所示的氨基酸序列从第484位或第491位开始截断，将截断后的透明质酸酶突变体在毕赤酵母中表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述透明质酸酶突变体通过强启动子P_AOX1调控表达。

9.一种生产透明质酸酶突变体的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的重组毕赤酵母在发酵培养基中，于28～32℃、200～250rpm发酵至少24h。

10.权利要求1～2任一所述的透明质酸酶突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组质粒，或权利要求5～6任一所述的重组毕赤酵母，或权利要求7～9任一的方法在水解透明质酸中的应用。