CN102083458A - 超速效胰岛素组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了包含被配制用于肠胃外给药的速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物的组合、组合物和药盒。这些产品可用于治疗胰岛素可治疗的疾病或病症的方法中。本文也提供了给药速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的方法。

Description

超速效胰岛素组合物

相关专利申请

本申请主张由Gregory Frost、Igor Bilinsky、Daniel Vaughn和BarrySugarman于2008年4月28日提交的标题为“超速效胰岛素组合物”的第61/125,835号美国临时专利申请和Gregory Frost、Igor Bilinsky、DanielVaughn和Barry Sugarman于2008年5月9日提交的标题为“超速效胰岛素”的第61/127,044号美国临时专利申请的优先权。

本申请与对应的Gregory Frost、Igor Bilinsky、Daniel Vaughn和BarrySugarman的标题为“超速效胰岛素组合物”的第12/387,225号美国专利申请相关，后者同样要求第61/125,835号和第61/127,044号美国临时专利申请的优先权。

上文引用的各专利申请的主题以其整体通过援引纳入本文。

技术领域

提供包含被配制用于肠胃外给药的速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物的组合、组合物和药盒。

背景技术

糖尿病由于胰脏不能产生足量的胰岛素或细胞不能适当地合成和释放胰岛素而引起慢性高血糖症。危重患者也会经历高血糖症，引起死亡率和发病率增加。已将胰岛素作为药物给药用于治疗患有包括例如I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病在内的糖尿病患者以模拟发生在正常个体中的内源性胰岛素反应。也将胰岛素给药于患有高血糖症的危重患者以控制血糖水平。

通常，响应高血糖症或对高血糖症的预期(例如进食后)，向这些个体给药可引起血糖控制的速效胰岛素。然而，现有速效形式的胰岛素的吸收和起效存在延迟，并因此不近似快速的内源性胰岛素作用。因此，这些制剂起效不够快速以致不能阻止该第一相胰岛素释放后立即发生的肝葡萄糖产生。由于药理学作用的延迟，应在进食之前给药速效胰岛素制剂以达到所需的血糖控制。而且，必须给予的剂量导致作用时间延长，其可引起低血糖症并且在许多情况下引起肥胖症。因此，需要当给药于个体时可更有效地模拟内源性胰岛素反应、引起更有效的血糖控制并减少胰岛素疗法的不良副作用例如体重增加的备选胰岛素组合物。

发明概述

本文提供与速效组合物相比可在预选时间段内更快起效和/或增加全身暴露(exposure)的超速效胰岛素组合物。因此，本文提供超速效胰岛素组合物。所述组合物包含治疗有效量的速效胰岛素和其量使得所述组合物达到超速效的乙酰透明质酸降解酶。所述组合物被配制用于肠胃外给药，例如皮下、皮内或肌肉内给药。可通过足以达到血糖控制(可凭经验确定，例如糖负荷(glucose challenge))的量确定胰岛素剂量(给药量)。通常，治疗目标为给药达到血糖控制并减少高血糖和/或低血糖事件的数量的最可能低的胰岛素量。所述超速效胰岛素组合物中使用的较低的胰岛素剂量可降低糖尿病个体体重增加和肥胖的风险。可将所述组合物提供于任何合适的容器或载体中，例如无菌小瓶、注射器、药筒(cartridge)、胰岛素笔、胰岛素泵或闭环系统容器中。

本文提供超速效胰岛素组合物，其包含用于控制血糖水平的治疗有效量的速效胰岛素和其量足以使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的乙酰透明质酸降解酶。本文也提供制备例如本文描述的任何超速效胰岛素组合物的超速效胰岛素组合物的方法，所述方法通过选择速效胰岛素并将其与使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶组合。在所述组合物和制备所述组合物的方法的一些实施例中，所述治疗有效量的速效胰岛素为10U/mL或约10U/mL至500U/mL或约500U/mL，且使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL。在一些实施例中，使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少30或35单位透明质酸酶活性/mL或者约30或35单位透明质酸酶活性/mL。例如，所述组合物中速效胰岛素的量可为10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL或者约10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL，且所述组合物中乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL。所述组合物的体积，例如，可为1mL、3mL、5mL、10mL、20mL或50mL或约1mL、3mL、5mL、10mL、20mL或50mL。在一些实施例中，所述组合物被配制用于通过闭环系统、胰岛素笔或胰岛素泵递送，并可被配制用于单剂量给药或多剂量给药。

在一些实施方案中，所述速效胰岛素的治疗有效量小于无所述乙酰透明质酸降解酶时达到相同疗效所需的所述速效胰岛素的治疗有效量。乙酰透明质酸降解酶的量足以在肠胃外给药后最初的3、6、9、12、15、20、25、30、35、40、50或60分钟达到比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药相同的速效胰岛素后的相同时间段的胰岛素全身暴露大至少30％或约30％的胰岛素全身暴露，和/或足以在给药后最初的30、45、60、90、120或180分钟达到比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药相同的速效胰岛素后的相同时间段的全身葡萄糖代谢大至少30％或约30％的全身葡萄糖代谢(本文中有时称作葡萄糖消除)。在本文提供的所有组合物中和本文提供的方法中，各组分的量可根据被给药所述组合物的个体和/或所提供的具体速效胰岛素(或其混合物)而变化。必要时，可根据经验确定所述量。

本文提供包含治疗有效量的速效胰岛素和某量的乙酰透明质酸降解酶的胰岛素组合物。乙酰透明质酸降解酶的量足以使得给药后最初的30至40分钟达到比无所述乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药相同的速效胰岛素后相同时间段的全身暴露大至少30％或约30％的胰岛素全身暴露。

乙酰透明质酸降解酶的量可足够使得所得超速效胰岛素组合物可在肠胃外给药后最初的30、45、60、90、120或180分钟引起比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药相同的速效胰岛素后的相同时间段的血糖水平增加低至少20％至30％或约20％至30％的血糖水平增加。所述血糖水平增加可以比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药所述速效胰岛素后的血糖水平增加低至少30％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或者约30％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。

本文也提供这样的超速效胰岛素组合物，其包含治疗有效量的速效胰岛素和某量的乙酰透明质酸降解酶，所述乙酰透明质酸降解酶的量足以达到比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药相同的速效胰岛素后最初60分钟的全身葡萄糖消除(即代谢)大至少30％或约30％的全身葡萄糖代谢。

在本文提供的超速效胰岛素组合物中，胰岛素的示例性量(即，所述组合物提供用于单次剂量的量)为0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位或者约0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位。乙酰透明质酸降解酶的示例性量包括在功能上等价于0.3单位、0.5单位、1单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、3000单位、4000或者约0.3单位、0.5单位、1单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、3000单位、4000或更多的透明质酸酶活性的量。

本文提供的超速效胰岛素组合物可达到比所述无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃外给药胰岛素后的全身暴露大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、300％或400％或者约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、300％或400％的餐时(例如，给药后0-4小时)胰岛素全身暴露。本文提供的超速效胰岛素组合物可达到比无乙酰透明质酸降解酶时在肠胃药给药胰岛素后的血糖代谢大至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、350％或400％或者约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、350％或400％的全身葡萄糖代谢(即，表示为速率(量/时间)或预定时间段内的总量的葡萄糖从血液中的清除的定量)。

本文提供的超速效胰岛素组合物任选包含螯合剂，例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺四乙酸盐。所述螯合剂可以作为和与之等摩尔或约等摩尔浓度的金属的复合物提供，例如所述螯合剂乙二胺四乙酸钙复合物。乙二胺四乙酸钙的浓度为0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或者约0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM或20mM。

本文提供的超速效胰岛素组合物通常包含锌。锌的浓度通常为0.002毫克每100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.28mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U或者约0.002毫克每100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.28mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U。通常，将速效胰岛素与锌一起配制；本文使用的量可为当与乙酰透明质酸降解酶组合时保持相同锌浓度的量。示例性组合物可包含摩尔比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、300∶1或1000∶1或者约0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、300∶1或1000∶1的乙二胺四乙酸钙和锌，例如约0.010-0.50mg锌如0.017mg锌每100U胰岛素或0.010-0.50mg锌如0.017mg锌每100U胰岛素，以及0.1至50mM乙二胺四乙酸钙。其他示例性超速效胰岛素组合物包含与所述速效胰岛素摩尔比约1∶3的锌和与所述速效胰岛素摩尔比为约1∶3至10∶1的乙二胺四乙酸钙。

所述超速效胰岛素组合物也任选包含张力调节剂，例如但不限于氨基酸、例如甘油的多元醇和/或例如氯化钠的盐。所述组合物的同渗浓度可为200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg或者约200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg。pH适于肠胃外给药，例如约5.5至8.5或5.5至8.5，特别是6至8，如约6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8，或者6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。所述组合物可任选包含所述速效胰岛素的稳定剂、所述乙酰透明质酸降解酶的稳定剂或二者。稳定剂包括但不限于去污剂、多元醇、金属、盐、共溶剂和/或蛋白质。这样的稳定剂的示例为血清白蛋白和/或聚山梨醇酯，其浓度足以达到所述组合物和/或组分的较大稳定性。包含的血清白蛋白的浓度可为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL或者约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL。包含的聚山梨醇酯的浓度例如可为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％或者约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。其他任选的成分包括，例如，浓度可为1mM、2mM、3mM、5mM、10mM或20mM的除氧剂，例如抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、甲硫氨酸，和/或白蛋白和/或防腐剂，例如包含芳香环的化合物，如间甲酚或苯酚。

所述速效胰岛素可为例如单体或多聚体，如二聚体或六聚体。所述速效胰岛素包括正规胰岛素，例如但是不限于人胰岛素或猪胰岛素，如具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链，和氨基酸序列如SEQ ID NO：104所示的B链的胰岛素，或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。所述胰岛素可为重组胰岛素、或者可为合成的或部分合成的、或者可为分离自天然来源的。所述胰岛素可为胰岛素类似物。示例性的胰岛素类似物为选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素的胰岛素类似物。在一些示例性超速效胰岛素组合物中，所述速效胰岛素为速效人胰岛素。而且，所述超速效胰岛素组合物可包含胰岛素的混合物。该混合物可为速效胰岛素或速效胰岛素与较慢作用的胰岛素例如基础作用胰岛素(basal-acting insulin)的混合物。

包含于本文提供的组合物和组合中的乙酰透明质酸降解酶包括例如透明质酸酶，如动物(包括人)透明质酸酶，特别是其可溶形式。示例性乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶，特别是可溶性透明质酸酶，例如PH20或其截短形式。所述PH20可为，例如，羊的、牛的或截短的人PH20。包括包含或含有SEQ ID NO：1-39和67-96中任一所示氨基酸序列的那些及其截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体。截短的人PH20，特别是可溶性截短形式，包括任意具有SEQ ID NO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或其等位基因变体和其他变体。所述透明质酸酶的变体通常与SEQ ID NO：1-39和67-96中任一，特别是与可溶形式具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性并保留透明质酸酶活性。所述可溶性透明质酸酶可为组合物，该组合物为rHuPH20。

所述乙酰透明质酸降解酶可为软骨素酶，例如但不限于软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。示例性软骨素酶具有或包含SEQ ID NO：98-100中任一所示的氨基酸序列、或者其截短形式、或其等位基因变体、物种变体和其他变体。变体通常与SEQ ID NO.98-100中任一所示的多肽或与野生型软骨素酶具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性。

本文提供的超速效胰岛素组合物可被配制用于多剂量给药，用于稀释至所需剂量或用于单剂量给药。示例性的胰岛素治疗有效量取决于所述组合物中的胰岛素和被给药所述组合物的个体。这些单剂量的量包括例如，0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位或者约0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位。在这些组合物中，乙酰透明质酸降解酶的量可以或实际在功能上等价于0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、4单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位或1000单位的透明质酸酶活性或者约0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、4单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位或1000单位的透明质酸酶活性。

所述超速效胰岛素组合物可被配制通过泵递送。本文提供用于控制血糖水平的闭环系统。所述系统为本领域技术人员已知的任意闭环系统，但接受了以下修改：包含本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶，并适于给药或程序化递送治疗剂量的速效胰岛素和产生超速效胰岛素组合物的乙酰透明质酸降解酶。所述闭环系统可包含含有速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的容器(reservoir)，其中所述乙酰透明质酸降解酶的存在量足以使得所得组合成为超速效胰岛素组合物。在另一实施方案中，提供用于控制血糖水平的包含含有速效胰岛素的容器和包含乙酰透明质酸降解酶的另一容器的闭环系统。

所述闭环系统可任选包含葡萄糖传感器、递送所述乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素的递送系统以及程序化的用于整合泵药和监测功能的软件中的一个或多个，藉此递送乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素以达到模拟非糖尿病个体中的血糖控制的血糖控制。所述闭环系统也可包含在单独容器中的或与所述速效胰岛素和/或乙酰透明质酸混合的较慢作用的胰岛素例如基础胰岛素。所述系统也可包含任何上文提到的任选的成分。所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶可包括任意上文描述的那些。

在所述闭环系统中，包含所述速效胰岛素的容器可包含用于维持至少半天、一天或更多天的血糖控制的足够的单位数量，并可包含0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位、100单位、200单位、300单位、400单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、5000单位、6000单位、7000单位或者约0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位、100单位、200单位、300单位、400单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、5000单位、6000单位、7000单位或更多的胰岛素。所述闭环系统可递送任意所需量或剂量增量的胰岛素和/或乙酰透明质酸降解酶，例如0.05单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或者约0.05单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或更多的胰岛素每增量。包含所述乙酰透明质酸降解酶的容器可包含在功能上等价于1单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、3000单位、4000单位、5000单位、6000单位、7000单位、8000单位、9000单位、10000单位、20000单位或者约1单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、3000单位、4000单位、5000单位、6000单位、7000单位、8000单位、9000单位、10000单位、20000单位或更多的透明质酸酶活性的量的乙酰透明质酸降解酶，并且能够以功能上等价于例如0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位或者约0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位或更多的透明质酸酶活性的乙酰透明质酸降解酶量的单个剂量增量递送所述乙酰透明质酸降解酶。

本文也提供组合，其包含：包含10U或约10U至500U或约500U胰岛素的第一组合物和包含当与所述胰岛素一起给药时使得所述速效胰岛素成为超速效胰岛素的足量的乙酰透明质酸降解酶的第二组合物。所述足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL。在一些实施例中，所述足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等于至少35U透明质酸酶活性/mL或约35U透明质酸酶活性/mL。例如，所述第二组合物中乙酰透明质酸降解酶的量可在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL。在一些实施例中，所述第一组合物中的速效胰岛素的量为10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL或者约10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL。

本文也提供包含乙酰透明质酸降解酶的第一组合物和包含速效胰岛素的第二组合物的组合。这些组合物被配制用于肠胃外给药。在一些情况下，当与所述第二组合物混合时乙酰透明质酸降解酶的量足以使所得组合物成为超速效胰岛素组合物。在其他情况下，如果在给药所述第一组合物前给药，乙酰透明质酸降解酶的量足以使得所述速效胰岛素组合物成为超速效胰岛素组合物。

在本文提供的组合中，所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶以及其他组分如上文对组合物所述。本文也提供包含这些组合的药盒。胰岛的素组合物可被配制用于给药针对单次进食的餐时剂量，例如但不限于约0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg、1U/kg、1.5U/kg或2U/kg。乙酰透明质酸降解酶的量可被配制用于向个体给药针对单次进食的餐时剂量，且所述量例如为0.3U、0.5U、1U、2U、3U、4U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2000U、3000U、4000U、5000U或者约0.3U、0.5U、1U、2U、3U、4U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2000U、3000U、4000U、5000U或更多。所述组合中的组合物可被配制用于皮下给药。

本文提供给药本文提供的超速效胰岛素组合物和组合的方法。通常该类给药为肠胃外给药，例如静脉内、皮下或通过任何合适的途径。在本文提供的任何所述方法中，可分别地、间歇地或一起(在单独的组合物中或一起配制的组合物中)给药所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶。本文也提供通过给药本文提供的任何所述超速效胰岛素组合物或组合来控制个体中葡萄糖水平的方法。在一些情况下，以餐时剂量的形式给药所述组合物或组合，包括例如在进餐前少于20、10或5分钟或者约20、10、5分钟至进餐后少于10分钟或约10分钟给药所述组合物或组合，或与食物一起给药所述组合物或组合。

本文也提供涉及指示患者在进餐前少于20、10、5分钟或者约20、10、5分钟至进餐后少于30分钟或约30分钟给药速效胰岛素组合物的方法，其中将所述速效胰岛素与使得所述速效胰岛素组合物成为超速效组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶联合给药。可将所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶一起配制或分别提供用于联合给药。在这些方法中，可指示所述患者在或约在进餐时给药所述速效胰岛素组合物。在一些实施例中，所述指示为书面的在其他实施例中，所述指示为口头的。

本文提供通过向个体给药乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素来控制个体血糖水平的方法，其中给药的所述乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素的量足以

a)获得比无乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药所述速效胰岛素后获得的血胰岛素浓度的最大增加大至少20％至30％或约20％至30％的血胰岛素浓度的最大增加；和/或

b)将达到最大血胰岛素浓度所需时间减少至不多于无乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药所述速效胰岛素时达到最大血胰岛素浓度所需时间的80％；和/或

c)给药后15分钟将胰岛素浓度增加至少50、60、70、80、90或100pmol/L或者约50、60、70、80、90或100pmol/L。

通过所述方法，血胰岛素浓度的最大增加比无所述乙酰透明质酸降解酶时胰岛素浓度的最大增加大至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、350％或400％或者约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、250％、300％、350％或400％。可将达到血最大胰岛素浓度所需的时间减少至不多于无所述乙酰透明质酸降解酶时达到血最大胰岛素浓度所需时间的80％。例如，给药20U剂量的胰岛素后，在给药15分钟后，可将胰岛素浓度增加至少60pmol/L、80pmol/L、100pmol/L、120pmol/L、140pmol/L、160pmol/L、180pmol/L或200pmol/L或者约60pmol/L、80pmol/L、100pmol/L、120pmol/L、140pmol/L、160pmol/L、180pmol/L或200pmol/L。

在示例性实施方案中，所述糖尿病个体患有I型或II型糖尿病，与无乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药所述速效胰岛素相比减少了向所述个体给药的速效胰岛素的量。例如，可将向I型糖尿病患者给药的速效胰岛素的量减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或者约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多，且可将向II型胰岛素个体给药的速效胰岛素的量减少至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。

本文也提供用于控制或预防糖尿病个体体重增加和/或肥胖症，例如与餐时胰岛素疗法相关的体重增加的方法。通常，这是通过给药乙酰透明质酸降解酶和剂量小于无乙酰透明质酸降解酶时给药的速效胰岛素剂量的速效胰岛素来实现。糖尿病个体可为肥胖的或存在肥胖症风险，并且可患有I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病或其他糖尿病。示例性糖尿病个体为II型糖尿病个体。在一个实施例中，通过向肥胖的糖尿病个体或具有肥胖症风险的糖尿病个体给药治疗有效剂量的与乙酰透明质酸降解酶组合的速效胰岛素，来达到控制或预防糖尿病个体的肥胖症。可在进餐时或约进餐时给药所述组合物，且

a)乙酰透明质酸降解酶的量足以使得所给药的速效胰岛素成为超速效胰岛素；且

b)速效胰岛素的剂量在给药后最初的40分钟内达到与无所述乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药更高剂量的相同速效胰岛素基本相同程度的餐时葡萄糖消除。与所述更高剂量的速效胰岛素相比，所述超速效胰岛素组合物中的速效胰岛素的剂量引起餐后低血糖症和肥胖症的趋势减小。在示例性实施方案中，所述糖尿病个体患有II型糖尿病，且与无乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药速效胰岛素相比，向所述个体给药的所述速效胰岛素的量减少。例如，可将向II型糖尿病个体给药的速效胰岛素的量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。

本文也提供降低或防止与餐时胰岛素疗法相关的体重增加的方法，其通过在进餐时或约进餐时向具有餐时胰岛素疗法引起的体重增加风险的糖尿病个体给药包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的组合物，使得与无所述乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药时治疗个体餐后高血糖症所需的相同速效胰岛素的量相比，所给药的用于治疗所述高血糖症的速效胰岛素的量减少。量减少的速效胰岛素使得包含所述乙酰透明质酸降解酶的组合物较不可能引起所述个体体重增加。例如，可向II型糖尿病个体给药如上文所述的胰岛素组合物，其包含的速效胰岛素的量比无所述乙酰透明质酸降解酶时以相同方式给药时治疗所述高血糖症所需要的相同速效胰岛素的量少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％或者约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些情况下，在餐时胰岛素疗法的长期给药方案中给药所述胰岛素组合物。

本文提供通过在至少三十天的时间里向具有餐时胰岛素疗法引起的体重增加风险的糖尿病个体实施皮下餐时胰岛素疗程来降低或预防糖尿病个体体重增加的方法。在所述疗程中给药的餐时胰岛素剂量包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的组合。各剂量中的乙酰透明质酸降解酶的量足以使得所述速效胰岛素成为超速效胰岛素组合物，且用于治疗所述个体的餐后高血糖症的剂量中包含的速效胰岛素的量低于无所述乙酰透明质酸降解酶时用于治疗所述高血糖症所需的相同速效胰岛素的量。这样的餐时胰岛素疗程与无乙酰透明质酸降解酶时使用更高剂量的速效胰岛素的相似疗程相比可引起较少的体重增加。

本文也提供通过向个体给药餐时剂量的超速效胰岛素组合物来控制所述个体中葡萄糖水平的方法，其中：

a)所述超速效胰岛素组合物包含治疗有效量的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶；

b)所述速效胰岛素为正规胰岛素；

c)所述剂量用于或建议用于餐时给药或者比无乙酰透明质酸降解酶时以相同的给药途径给药的相同或更大剂量的相同速效正规胰岛素更接近进餐时间的餐前给药；且

d)所述超速效胰岛素组合物的剂量具有至少与无所述乙酰透明质酸降解酶时所述速效正规胰岛素相同的疗效。

例如，所述超速效胰岛素组合物用于或建议用于在进餐前少于20分钟或约20分钟至进餐后少于10或20分钟或者约10或20分钟给药。通常，所述超速效胰岛素组合物中速效胰岛素的剂量小于或等于无所述乙酰透明质酸降解酶时通过相同途径给药的所述速效胰岛素的剂量。

在实施本文提供的任何方法时，可通过任何合适的途径并使用任何合适的装置或容器例如通过注射器、胰岛素笔、胰岛素泵或闭环系统来给药所述组合物。所述组合物或组合可包含上文所述的任何速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶以及上文所述的任何附加试剂。向个体给药的组合物中的胰岛素量可为针对单次进食的餐时剂量，并且为0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.05U/kg至0.30U/kg例如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg、1.0U/kg、1.5/kg或2U/kg或者约0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.05U/kg至0.30U/kg例如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg、1.0U/kg、1.5/kg或2U/kg。向个体给药的乙酰透明质酸降解酶的量为用于与针对单次进餐的餐时剂量的速效胰岛素联合给药(单独地、间歇地、或者一起(在单独的组合物中或一起配制的组合物中))。所述乙酰透明质酸降解酶的量可为或者实际为约0.3U、0.5U、1U、2U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2000U、3000U、4000单位、5000U或更多。

本文提供制品，其包含包装材料和在所述包装材料内的任意所述超速效胰岛素组合物或组合，以及任选的用于向糖尿病个体给药的使用说明。

所述速效胰岛素、胰岛素、乙酰透明质酸降解酶和其他组分包括上文所述的那些。特别地，给药本文提供的组合物和组合。

附图简述

图1描绘了在与或不与rHuPH20联合给药的情况下皮下给药时速效胰岛素类似物

胰岛素和速效正规胰岛素

R胰岛素的药动学性质(profile)。使用高血胰岛素-正常血糖钳夹法(Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp procedure)，通过放射免疫测定法(RIA)测定了向正常健康个体给药后各时间点的血浆胰岛素浓度。

图2描绘了使用高血胰岛素-正常血糖钳夹法，在与或不与rHuPH20联合给药的情况下皮下给药时速效胰岛素类似物

胰岛素和速效正规胰岛素

R胰岛素的药效学性质。测定了在将胰岛素给药于正常健康个体后将血糖水平维持在90-110mg/dL所需的葡萄糖输注速度。

发明详述

大纲

A.定义

B.“超速效”胰岛素

1.胰岛素、糖尿病和现有速效胰岛素疗法的综述

2.超速效胰岛素组合物的药效学和药动学

C.胰岛素多肽和制剂

D.乙酰透明质酸降解酶

1.透明质酸酶

a.哺乳动物型透明质酸酶

b.细菌透明质酸酶

c.来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶

2.其他乙酰透明质酸降解酶

3.可溶性乙酰透明质酸降解酶

a.可溶性人PH20

b.重组可溶性人PH20(rHuPH20)

4.乙酰透明质酸降解酶的糖基化

5.透明质酸酶的修饰以提高它们的药动学性质

E.制备编码可溶性透明质酸酶及其多肽的核酸的方法

1.载体和细胞

2.接头部分

3.表达

a.原核细胞

b.酵母细胞

c.昆虫细胞

d.哺乳动物细胞

e.植物

4.纯化技术

F.胰岛素和可溶性透明质酸酶多肽的制备、制剂和给药

1.制剂

冻干粉

2.剂量和用法

给药方式

a.注射器

b.胰岛素笔

c.胰岛素泵和其他胰岛素递送装置

d.闭环系统

G.评价活性、生物利用度和药动学的方法

1.药动学、药效学和耐受性

2.生物学活性

a.胰岛素

b.乙酰透明质酸降解酶

H.治疗用途

1.糖尿病

a.I型糖尿病

b.II型糖尿病

c.妊娠糖尿病

2.用于危重患者的胰岛素疗法

I.联合疗法

J.制品和药盒

K.实施例

A.定义

除非另外指明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。除非另外指明，本文完整公开内容通篇提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站和其他公开的材料以其整体通过援引纳入本文。当本文术语存在多个定义时，以本章节的那些为准。当提及URL或其他这样的标识符(identifier)或地址时，应理解这些标识符可发生变化并且因特网上的具体信息会不断变化，但是通过搜索因特网可以发现等同的信息。对它们的参考证明了这些信息的可获得性和公开传播性。

如本文所使用，“胰岛素”指用于增加葡萄糖摄取和储存和/或降低内源性葡萄糖产生的激素、其前体或者合成的或重组的类似物。示例性人胰岛素被翻译为110个氨基酸的前体多肽，前胰岛素原(SEQ ID NO：101)，其包含可将该蛋白质引导至内质网(ER)的24个氨基酸的信号肽，该信号肽在内质网被裂解，生成胰岛素原(SEQ ID NO：102)。胰岛素原经进一步加工释放31个氨基酸的C-或连接链肽(对应于SEQ ID NO：101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基57至87，和SEQ ID NO：102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基33至63)。所得胰岛素包含通过二硫键交联的21个氨基酸的A-链(对应于SEQ ID NO：101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基90至110，以及SEQ ID NO：102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基66至86)和30个氨基酸的B-链(对应于SEQ ID NO：101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基25至54，以及SEQ ID NO：102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基1至30)。适当交联的人胰岛素包含3个二硫键：一个在A-链的7位和B-链的7位之间，第二个在A-链的20位和B-链的19位之间，以及第三个在A-链的6和11位之间。提及的胰岛素包括单链或双链形式的前胰岛素原、胰岛素原和胰岛素多肽，其具有活性的截短形式，并包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体、和其他变体，例如胰岛素类似物，包括与SEQ IDNO：101所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。示例性胰岛素类似物包括SEQ ID NO：147-149、152所示的那些和包含SEQ ID NO：150、156、158、160、162和164所示的A-链和/或SEQ ID NO：151、153-155、157、159、161、163和165所示的B-链的那些。

示例性胰岛素多肽为包括人在内的哺乳动物来源的那些。人源胰岛素的示例性氨基酸序列显示于SEQ ID NO：101-104。示例性胰岛素类似物包括SEQ ID NO：147-149、152所示的那些和包含SEQ ID NO：150、156、158、160、162和164所示的A-链和/或SEQ ID NO：151、153-155、157、159、161、163和165所示的B-链的那些。胰岛素多肽也包括任何非人源的，包括但不限于SEQ ID NO：105-146所示的任何前体胰岛素多肽。提及的胰岛素包括单体和多聚体胰岛素，包括六聚体胰岛素以及人源化胰岛素。

如本文所使用，“速效胰岛素”指响应于在给药速效胰岛素时或给药速效胰岛素后约四小时内发生的真实的、察觉到的或预期的高血糖症(例如由进食引起的或预期由进食引起的餐时高血糖症)而紧急给药于糖尿病个体的任何胰岛素或速效胰岛素组合物，从而所述速效胰岛素能够预防、控制或缓解所述急性高血糖症。通常速效胰岛素组合物在皮下给药至个体后不超过四小时或约不超过四小时显示峰胰岛素水平。速效胰岛素组合物包括重组胰岛素和分离的胰岛素(也称作“正规”胰岛素)，例如以

R销售的胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素，以及经设计因为氨基酸改变而变为速效的胰岛素类似物。示例性正规胰岛素制剂包括但不限于人正规胰岛素，例如以商品名

R、

R和

出售的那些，InsulinHuman，USP和Insulin Human Injection，USP以及胰岛素的酸制剂，例如Toronto Insulin、Old Insulin和Clear Insulin，和正规猪胰岛素，例如Iletin

(猪胰岛素)。示例性速效胰岛素类似物包括例如赖脯胰岛素(如胰岛素)、门冬胰岛素(如

胰岛素)和谷赖胰岛素(如

胰岛素)、以

和

出售的速效胰岛素组合物(见例如美国专利第7,279,457号)。尽管术语“速效胰岛素”不涵盖“基础作用胰岛素”，但是本文描述的超速效胰岛素组合物可任选地包含除速效胰岛素外的一种或多种基础作用胰岛素。

如本文所使用，人胰岛素指基于人多肽的合成或重组产生的胰岛素，包括其等位基因变体和类似物。

如本文所使用，速效人胰岛素或人速效胰岛素组合物包括任何速效的人胰岛素或人胰岛素组合物，但是不包括非人胰岛素例如正规猪胰岛素。

如本文所使用，术语“基础作用胰岛素”或“基础胰岛素”指作为用于至少例如糖尿病的慢性病症的整体治疗方案的一部分用于维持基础胰岛素水平而给药的胰岛素。通常，基础作用胰岛素被配制用于当周期性(例如，每天一次或两次)给药时通过胰岛素的控释维持接近稳定状态的胰岛素水平。基础作用胰岛素包括结晶胰岛素(例如，NPH和

，鱼精蛋白胰岛素、surfen insulin)、基础胰岛素类似物(甘精胰岛素、HOE 901、NovoSolBasal)和减缓正规胰岛素吸收速率的其他胰岛素化学制剂(例如，阿拉伯胶、卵磷脂或油混悬剂)。如本文所使用，所述基础作用胰岛素可包括通常理解为长效(通常达到相对低的峰浓度，但是具有约20-30小时的最长作用时间)或中效(通常在给药后约4-12小时引起峰胰岛素浓度)的胰岛素。

如本文所使用，“超速效胰岛素组合物”指包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(例如可溶性透明质酸酶，包括但不限于rHuPH20制剂)的胰岛素组合物，以致于在肠胃外给药至个体后的最初的四十分钟，所述胰岛素组合物在所述个体中提供的累积全身胰岛素暴露大于无所述乙酰透明质酸降解酶时以相同途径给药相同剂量的相同速效胰岛素后经过相同时间提供给所述个体的累积全身胰岛素暴露。本文描述的超速效胰岛素组合物可任选地包含基础作用胰岛素。

如本文所使用，术语“高血糖病症”或“高血糖症”指不期望的血糖升高。

如本文所使用，术语“低血糖病症”或“低血糖症”指不期望的血糖降低。

如本文所使用，“全身胰岛素消除”或“全身葡萄糖代谢”指从血中清除葡萄糖并可表示为速率(量/时间)或量(一段时间的量)。可采用本领域任何已知的适当方法测定全身葡萄糖消除。例如，可在禁食条件下采用高血胰岛素-正常血糖钳操作(如本文所示例和描述的)测定全身葡萄糖消除，其中用以维持恒定血糖水平例如90-110mg/dL的静脉输注的葡萄糖的量或速率等于全身葡萄糖消除。因此可采用这些操作测定不同胰岛素组合物达到的全身葡萄糖消除方面的差异，例如通过给药超速效胰岛素组合物达到的全身葡萄糖消除相对通过速效胰岛素达到的全身葡萄糖消除的差异。也可通过在糖负荷试验后的给定时间点测量对照(comparator)胰岛素的相对葡萄糖降低活性来测定对照胰岛素之间的全身葡萄糖消除方面的差异。例如，可利用糖负荷试验(例如，本领域技术人员熟知的75-g的口服葡萄糖耐量试验或标准的试验餐剂(test meal formulation))比较不同的胰岛素制剂。在这些负荷试验中，在非静脉内肠胃外给药胰岛素组合物后立即向个体给药某量的葡萄糖或其他碳水化合物。然后在预定的时间测量血糖水平(即，个体血液中的葡萄糖浓度)以测定该胰岛素的降血糖作用。在各种胰岛素制剂的这些口服负荷比较中，必须经过足以允许全身葡萄糖摄取的时间后测量血糖水平。上文描述的测定全身葡萄糖消除的研究可采用动物模型和/或人类个体进行。

如本文所使用，血糖控制或“控制血糖水平”指将血糖浓度维持在期望的水平，通常为70-130mg/dL或90-110mg/dL。

如本文所使用，“累积全身胰岛素暴露”或“对胰岛素的累积全身暴露”指肠胃外给药胰岛素后被吸收进入血液的所述胰岛素的量。可通过计算特定时间段曲线下面积测定对胰岛素的累积全身暴露，其中通过将血液、血清或血浆中的胰岛素浓度作为时间的函数作图生成该曲线。

如本文所使用，闭环系统为用于提供持续血糖控制的整合系统。闭环系统包括测量血糖的装置(mechanism)、递送包括胰岛素组合物在内的一种或多种组合物的装置以及用于测定达到血糖控制需要递送的胰岛素的量的装置。因此，闭环系统通常包括葡萄糖传感器、例如胰岛素泵的胰岛素递送装置和接受来自所述葡萄糖传感器的信息并向所述胰岛素递送装置提供指令的控制器。这些指令可由所述控制器中的软件生成。该软件通常包括用于基于葡萄糖传感器检测的或使用者预期的血糖水平来测定达到血糖控制需要递送的胰岛素的量的算法。

如本文所使用，给药方案指给药胰岛素的量和给药频率。所述给药方案取决于欲治疗的疾病或病症，因此可发生变化。

如本文所使用，乙酰透明质酸降解酶指催化乙酰透明质酸聚合物(也称作透明质酸或HA)裂解成较小分子量片段的酶。示例性乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶，特别是具有解聚乙酰透明质酸的能力的软骨素酶和裂解酶。示例性的作为乙酰透明质酸降解酶的软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素果胶酶)和软骨素C裂解酶。软骨素ABC裂解酶包括两种酶，硫酸软骨素ABC内解酶(endolyase)(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外解酶(exolyase)(EC 4.2.2.21)。示例性的硫酸软骨素ABC内解酶和硫酸软骨素ABC外解酶包括但不限于来自普通变形杆菌(Proteusvulgaris)和肝黄黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的那些(普通变形杆菌的硫酸软骨素ABC内解酶显示于SEQ ID NO：98；Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1)：39-46)。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝黄黄杆菌，Victivallis vadensis(显示于SEQ ID NO：99)，和金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)的那些(Tkalec等人(2000)Applied andEnvironmental Microbiology 66(1)：29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology 30(5)：387-444)。示例性的来自于细菌的软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属(Streptococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2)：121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251：1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262：127-133)。

如本文所使用，透明质酸酶指一类乙酰透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物(EC 3.2.1.36)的透明质酸酶以及哺乳动物类型的透明质酸酶(EC3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人来源(包括但不限于鼠科、犬科、猫科、兔属、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙类、细菌)的，和任何来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类动物的。示例性非人透明质酸酶包括，来自奶牛的透明质酸酶(SEQ ID NO：10，11，64和BH55(美国专利第5,747,027号和第5,827,721号)、来自黄蜂的(SEQ ID NO：12和13)、来自蜜蜂的(SEQ IDNO：14)、来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO：15)、来自胡蜂的(SEQ ID NO：16)、来自小鼠的(SEQ ID NO：17-19，32)、来自猪的(SEQ ID NO：20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO：22-24，31)、来自家兔的(SEQ ID NO：25)、来自绵羊的(SEQID NO：26，27，63和65)、来自猩猩的(SEQ ID NO：28)、来自食蟹猴的(SEQ IDNO：29)、来自豚鼠的(SEQ ID NO：30)、来自节杆菌属的(Arthrobacter sp.)的(菌株FB24)(SEQ ID NO：67)、来自食菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)的(SEQ ID NO：68)、来自痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的(SEQ ID NO：69)、来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的((SEQ ID NO：70)；来自18RS21的(SEQ ID NO：71)；来自血清型Ia的(SEQID NO：72)；来自血清型III的(SEQ ID NO：73)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的(菌株COL)(SEQ ID NO：74)；来自菌株MRSA252的(SEQ ID NO：75和76)；来自菌株MSSA476的(SEQ ID NO：77)；来自菌株NCTC 8325的(SEQ ID NO：78)；来自菌株牛RF122的(SEQ IDNO：79和80)；来自菌株USA300的(SEQ ID NO：81)，来自肺炎链球菌的(Streptococcus pneumoniae)((SEQ ID NO：82)；来自菌株ATCCBAA-255/R6的(SEQ ID NO：83)；来自血清型2，菌株D39/NCTC 7466的(SEQ ID NO：84)、来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(血清型M1)的(SEQ ID NO：85)；来自血清型M2，菌株MGAS10270的(SEQ ID NO：86)；来自血清型M4，菌株MGAS10750的(SEQ ID NO：87)；来自血清型M6的(SEQ ID NO：88)；来自血清型M12，菌株MGAS2096的(SEQ ID NO：89和90)；来自血清型M12，菌株MGAS9429的(SEQ ID NO：91)；来自血清型M28的(SEQ ID NO：92)；来自猪链球菌(Streptococcus suis)的(SEQ IDNO：93-95)；来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)(菌株ATCC 700601/ES114(SEQID NO：96))的透明质酸酶，以及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对透明质酸具有特异性并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.andKaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198：607)。透明质酸酶也包括人源的那些。示例性人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO：36)、HYAL2(SEQID NO：37)、HYAL3(SEQ ID NO：38)、HYAL4(SEQ ID NO：39)和PH20(SEQID NO：1)。透明质酸酶也包括可溶性透明质酸，包括羊和牛PH20、可溶性人PH20以及可溶性rHuPH20。示例性可商购的牛或羊透明质酸酶为

(羊透明质酸酶)和

(牛透明质酸酶)。

乙酰透明质酸降解酶包括前体乙酰透明质酸降解酶多肽和成熟乙酰透明质酸降解酶多肽(例如已去除其中的信号序列的那些)、其具有活性的截短形式，并包括与SEQ ID NO：1和10-48、63-65、67-100中所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，包括多肽。例如，提到的乙酰透明质酸降解酶也包括SEQ ID NO：50-51所示的人PH20前体多肽变体。乙酰透明质酸降解酶也包括包含化学或翻译后修饰的那些以及不包含化学或翻译后修饰的那些。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。

如本文所使用，可溶性透明质酸酶指以其在生理条件下的可溶性为特征的多肽。可溶性透明质酸酶可通过例如其分配在加热到37℃的TritonX-114溶液的水相中进行区分(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-7)。膜锚定的例如脂质锚定的透明质酸酶会分配到富含去污剂的相中，但是用磷脂酶C处理后会分配到去污剂含量少的相中或水相中。可溶性透明质酸酶包括这样的膜锚定透明质酸酶，其中的该透明质酸酶锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰，其中该可溶性形式保留了透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶和那些包含于或纯化自天然来源例如来自绵羊或奶牛的睾丸提取物的那些。这样的可溶性透明质酸酶的实例是可溶性人PH20。其他可溶性透明质酸酶包括羊(SEQ ID NO：27、63、65)和牛(SEQ ID NO：11、64)PH20。

如本文所使用，可溶性人PH20或sHuPH20包括成熟多肽，所述多肽在C-端缺乏全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点，使得表达后所述多肽为可溶性的。示例性sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO：4-9和47-48中任一所示氨基酸序列的成熟多肽。这样的示例性sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。所述前体的示例为SEQ ID NO：3和40-46所示的那些，其中每一个均在氨基酸位点1-35包含35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽也包括在本文所述的生产和纯化方法之中或之后降解的那些。

如本文所使用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)指重组表达于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的可溶形式的人PH20。可溶性rHuPH20由包含所述信号序列并由SEQ ID NO：49所示的核酸编码。也包括作为其等位基因变体和其他可溶性变体的DNA分子。编码可溶性rHuPH20的核酸表达于分泌所述成熟多肽的CHO细胞中。当产生于培养基中时，在C-端存在异质性使得该产物包含不同种(species)的混合物，其可包含各种丰度的一个或多个SEQ ID NO.4-9。也包括对应的等位基因变体和其他变体，包括对应于SEQ ID NO：50-51中所示前体人PH20多肽的那些。其他变体可与SEQ IDNO：4-9和47-48中任一具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，只要它们保留透明质酸酶活性并且为可溶的。

如本文所使用，活性指与全长(完整)蛋白相关的多肽或其部分的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(与多肽结合或竞争以结合抗-多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异结合至所述多肽的受体或配体的能力。

如本文所使用，透明质酸酶活性指酶催化透明质酸裂解的能力。美国药典(USP)XXII透明质酸酶的测定通过测量较大分子量的透明质酸、或乙酰透明质酸，即使酶与HA在37℃反应30分钟后剩余的(HA)底物，来直接测定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United StatesPharmacopeia Convention，Inc，Rockville，MD)。在测定中可使用参比标准溶液以确定任何透明质酸酶的相对活性(以单位计)。测定例如可溶性rHuPH20的透明质酸酶的透明质酸酶活性的体外测定法为本领域已知的并描述于本文中。示例性测定法包括下文描述的微浊度测定法(见实施例3)，其通过检测未裂解的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀间接测定透明质酸酶对透明质酸的裂解。例如可使用参比标准品生成标准曲线以测定被测透明质酸酶的活性(以单位计)。

如本文所使用，关于乙酰透明质酸降解酶的“功能等价量”或其语法变体，指达到与某量(例如已知单位数量的透明质酸酶活性)的参比酶例如透明质酸酶相同作用的乙酰透明质酸降解酶的量。例如，可将任何乙酰透明质酸降解酶的活性与rHuPH20的活性比较，以测定会达到与已知量的rHuPH20相同作用的乙酰透明质酸降解酶的功能等价量。例如，乙酰透明质酸降解酶作为扩展剂或分散剂的能力可通过将其与锥虫蓝一起注射入小鼠的侧面皮肤来进行评价(见例如美国专利公布第20050260186号)，且可测定达到与例如100单位透明质酸酶参比标准品相同的扩散量所需的乙酰透明质酸降解酶的量。因此，所需的乙酰透明质酸降解酶的量功能上等价于100单位。在另一实施例中，可在人类个体中评价乙酰透明质酸降解酶增加联合给药的胰岛素的水平和吸收速率的能力，如下文实施例1中所述，且可测定达到与例如所给药量的rHuPH20相同的胰岛素水平和吸收速率的增加所需的乙酰透明质酸降解酶的量(例如通过测定最大血胰岛素浓度(C_max)、达到最大血胰岛素浓度所需的时间(t_max)和经给定时间后的累积全身胰岛素暴露(AUC))。

如本文所使用，天然存在的α-氨基酸的残基为那些自然届发现的20个α-氨基酸的残基，其通过人体中加载的(charged)tRNA分子与其同族的mRNA密码子的特异性识别而并入蛋白质中。

如本文所使用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可为单链或双链的。当指探针或引物(其任选地被例如可检测标记如荧光或放射标记进行标记)时，单链分子是被涵盖的。这些分子通常具有的长度使得在用于探测或引导文库时它们的靶点是统计学上独特的或具有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)。通常探针或引物包含至少14、16或30个与感兴趣的基因互补或相同的连续核苷酸序列。探针和引物的长度可为10、20、30、50、100或更多核酸。

如本文所使用，肽指长度大于或等于两个氨基酸并且长度小于或等于40个氨基酸的多肽。

如本文所使用，出现在本文提供的各种氨基酸序列中的氨基酸根据它们已知的三字母或单字母缩写(表1)进行识别。出现在各种核酸片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准的单字母名称进行命名。

如本文所使用，“氨基酸”为包含氨基和羧基的有机化合物。多肽包含两个或多个氨基酸。用于本文目的，氨基酸包括所述二十个天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即，其中的α-碳具有侧链的氨基酸)。

如本文所使用，“氨基酸残基”指多肽在其肽键处的化学消化(水解)所形成的氨基酸。假定本文描述的氨基酸残基为“L”异构形式。如此命名的“D”异构形式的残基可由任何L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留期望的功能性质。NH₂指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游离羧基。为了与J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)中描述并在37C.F.R.§§1.821-1.822中采用的标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写显示于表1。

表1-对照表

应注意到本文以表达式显示的所有氨基酸残基序列在从氨基端到羧基端的常规方向中具有从左到右的定向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对照表(表1)中列出的氨基酸以及经修饰的和稀有的氨基酸，例如37C.F.R.§§1.821-1.822中提到的那些，并通过援引将其纳入本文。而且，应注意到氨基酸残基序列的开头或结尾处的破折号表示肽键，其与一个或多个氨基酸残基的进一步的序列连接，或者与例如NH₂的氨基端基团或与例如COOH的羧基端基团连接。

如本文所使用，“天然氨基酸”指出现在多肽中的20种L-氨基酸。

如本文所使用，“非天然氨基酸”指具有与天然氨基酸相似的结构但是经结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此非天然氨基酸包括例如除所述20种天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸描述于本文并是本领域技术人员已知的。

如本文所使用，DNA构建体为包含以自然界不存在的方式结合和并列的DNA区段的单链或双链、线性或环状的DNA分子。DNA构建体由于人为操作而产生并包括所操作分子的克隆和其他拷贝。

如本文所使用，DNA区段为较大DNA分子的具有特定属性的部分。例如编码特定多肽的DNA区段为较长DNA分子的部分，例如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向阅读时其编码所述特定多肽的氨基酸序列。

如本文所使用，术语多聚核苷酸指从5’至3’端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多聚核苷酸包括RNA和DNA，且可分离自天然来源、在体外合成或从自天然和合成分子的组合制备。本文以核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(“缩写为bp”)的方式给出多聚核苷酸分子的长度。当上下文允许时将术语核苷酸用于单链和双链分子。当将该术语用于双链分子时，其用于表示完整长度并理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员会意识到双链多聚核苷酸的两条链的长度可略有差异并因此这些末端可为交错的；因此双链多聚核苷酸分子中的核苷酸可以不全是配对的。这些未配对末端的长度一般不超多20个核苷酸。

如本文所使用，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”指所述蛋白质的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可基于残基序列及其中所包含残基的相同性和/或同源性的程度。评价蛋白质或核酸之间相似性的程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一种评价序列相似性的方法中，以得到序列之间最大相同性水平的方式比对两个氨基酸或核苷酸序列。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列无变化的程度。氨基酸序列的比对以及某种程度上核苷酸序列的比对，也可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守性差异和/或经常性取代。保守性差异是那些保持所涉及残基的理化性质的差异。比对可为全局性的(所比对序列在这些序列全长上的比对并包括所有残基)或局部性的(仅包括最相似的一个或多个区域的一部分序列的比对)。

“相同性”本身具有本领域认可的含义并可采用已公开的技术计算。(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。尽管存在许多测定两个多聚核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”为本领域技术人员熟知(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAMJ Applied Math 48：1073(1988))。

如本文所使用，同源的(就核酸和/或氨基酸序列而言)意指约大于或等于25％的序列同源性，通常大于或等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同源性；必要时可指定精确的百分数。用于本文目的，术语“同源性”和“相同性”通常可替换使用，除非另外指明。一般而言，为了测定同源性或相同性百分数，将序列进行比对以得到最高等级的匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，yon Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。就序列同源性而言，保守氨基酸的数量通过标准比对算法程序来测定，并且可与各供应商建立的默认空位罚分(gappenalties)一起使用。基本上同源的核酸分子通常会沿着所感兴趣的核酸的长度以中等的严格性或高度的严格性杂交。也涵盖包含取代杂交核酸分子中密码子的简并密码子的核酸分子。

任何两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列可采用已知的计算机算法例如″FASTA″程序，使用例如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中的默认参数来测定(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等人，J Molec Biol 215：403(1990))；Guide toHuge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，和Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，National Center forBiotechnology Information数据库的BLAST功能可用于测定相同性。其他可商购的或可公开获得的程序包括DNAStar″MegAlign″程序(Madison，WI)和University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)″Gap″程序(Madison WI)。蛋白质和/或氨基酸分子的同源性或相同性百分数可通过例如采用GAP计算机程序(例如，Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443，由Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482修改)比较序列信息来测定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列的符号的总数。用于GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(comparison matrix)(包括相同为数值1，不相同为0)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCEAND STRUCTURE，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每一个空位罚分3.0和每一个空位中每一个符号另外罚分0.10；以及(3)末尾空位不罚分。

因此，如本文所使用，术语“相同性”或“同源性”表示待测和参比多肽或多聚核苷酸之间的比较。如本文所使用，术语至少“90％相同”指相对于多肽的参比核酸或氨基酸序列从90到99.99的相同性百分数。90％或更高水平的相同性表明下列事实：假设为了举例说明，比较长度为100个氨基酸的待测和参比多肽。待测多肽中不多于10％(即100中的10个)的氨基酸与参比多肽的不同。可在待测和参比多聚核苷酸之间进行相似的比较。这些差异可表现为随机分布在多肽全长中的点突变，或者它们聚集在长度变化的一个或多个位置，所述长度变化可长至最大允许的值，例如10/100氨基酸差异(约90％相同性)。差异定义为氨基酸取代、插入或缺失。在同源性或相同性大于约85-90％的水平时，该结果应不依赖于程序或所设定的空位参数；这样的高水平相同性可容易地进行评价，通常通过手工比对而不依赖于软件。

如本文所使用，被比对的序列指使用同源性(相似性和/或相同性)比对核苷酸或氨基酸序列中的对应位点。通常，比对由50％或更高相同性相关联的两个或多个序列。序列的比对集合指在对应位置比对的2个或多个序列并可包括比对衍生自RNA的序列，例如与基因组DNA序列比对的EST和cDNA。

如本文所使用，“引物”指在适当条件下(例如，存在四种不同的三磷酸核苷和聚合剂例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶)，在适当的缓冲液中以及在合适的温度下可作为模板引导的DNA合成的起始点的核酸分子。应理解某些核酸分子可作为“探针”和“引物”。然而，引物具有用于延伸的3’羟基基团。引物可用于各种方法中，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄(panhandle)PCR、捕获(capture)PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导的PCR和其他扩增方案。

如本文所使用，“引物对”指包括与预扩增(例如，通过PCR)序列的5′端杂交的5′(上游)引物和与预扩增序列3′端互补序列(complement)杂交的3′(下游)引物的集合。

如本文所使用，“特异性杂交”指核酸分子(例如，寡聚核苷酸)与目标核酸分子通过互补碱基配对的退火(annealing)。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，例如特定分子的长度和组成。与体外杂交尤其相关的参数另外包括退火和洗脱温度、缓冲液组成和盐浓度。用于去除非特异结合的核酸分子的示例性的高度严格性洗脱条件为0.1xSSPE、0.1％SDS、65℃，中度严格性洗脱条件为0.2xSSPE、0.1％SDS、50℃。等效严格性条件是本领域已知的。本领域技术人员可轻易地调整这些参数以达到核酸分子和目标核酸分子的特异杂交以用于具体应用。当指两个核苷酸序列时，互补指两个核苷酸序列能够杂交，通常相对的核苷酸之间的错配(mismatches)低于25％、15％或5％。必要时可指定互补性百分数。通常选择两个分子使得它们会在高度严格性条件下杂交。

如本文所使用，与产物基本相同指足够相似，从而使感兴趣的性质基本未改变，使得该基本相同的产物可替代该产物使用。

如本无所使用，也应理解术语“基本相同”或“相似”如相关领域技术人员所理解随语境而变化。

如本文所使用，等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种可替换形式的任一种。等位基因变异通过突变自然产生并可在群体中引起表型多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”也用于本文以表示由基因的等位基因变体编码的蛋白。通常基因的参比形式编码来自物种的群体或单一参比成员的多肽的野生形式和/或主要形式。通常，包括物种间或物种内变体的等位基因变体通常与来自相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80％、90％或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取决于该基因以及比较为物种间还是物种内。一般地，种内等位基因变体与多肽的野生型和/或主要形式具有至少约80％、85％、90％或95％相同性或更高，包括与多肽的野生型和/或主要形式具有96％、97％、98％、99％或更高的相同性。本文提及等位基因变体一般指相同物种成员之间的蛋白质中的变异。

如本文所使用，在本文中与“等位基因变体”可替换使用的“等位基因”指基因或其部分的可替换形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当个体具有基因的两个相同等位基因时，认为该个体就该基因或等位基因而言是纯合的。当个体具有基因的两个不同等位基因时，认为该个体就该基因而言是杂合的。具体基因的等位基因可在单个核苷酸或数个核苷酸上彼此不同，并且包括例如核苷酸取代、缺失和插入的修饰。基因的等位基因也可为包含突变的基因形式。

如本文所使用，物种变体指不同物种包括不同的哺乳动物物种例如小鼠和人之间的多肽的变体。

如本文所使用，剪接变体指由可得到多于一种mRNA的基因组DNA的初级转录的差异加工(differential processing)产生的变体。

如本文所使用，修饰分别指多肽的氨基酸序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，并且包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和替代。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，例如通过使用重组DNA方法。

如本文所使用，术语启动子指包含提供RNA聚合酶结合并起始转录的DNA序列的基因部分。启动子序列通常，但不总是，存在于基因的5′非编码区。

如本文所使用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物活性部分基本不含来自于产生该蛋白的细胞或组织的细胞物质或其他污染性蛋白质，或者当为化学合成的时基本不含化学前体或其他化学物质。如果制剂表现为不含用标准分析方法可轻易检测的杂质(所述标准分析方法如本领域技术人员用来评价这些杂质的薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC))，则它们可被确定为基本上不含该杂质，或者足够纯以致于进一步纯化不能可检测地改变该物质的物理和化学性质，例如酶和生物学活性。用于纯化化合物以生产基本化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可为立体异构体的混合物。在这些情况下，进一步纯化可增加该化合物的比活。

术语基本不含细胞物质包括其中的蛋白分离自细胞的细胞组分的蛋白制剂，该蛋白从所述细胞中分离或者在该细胞中重组产生。在一个实施方案中，术语基本不含细胞物质包括包含小于约30％(以干重计)非酶蛋白质(本文也称作污染性蛋白)，一般小于约20％非酶蛋白质或10％非酶蛋白质或小于约5％非酶蛋白质的酶蛋白制剂。当该酶蛋白为重组产生时，它也基本不含培养基，即，以该酶蛋白制剂的体积计，培养基小于约20％、10％或5％或者为20％、10％或5％。

如本文所使用，术语基本不含化合物前体或其他化合物包括酶蛋白的制备品，其中所述蛋白分离自参与所述蛋白的合成的化合物前体或其他化合物。该术语包括包含小于约30％(以干重计)、20％、10％、5％或更少的化合物前体、非酶化合物或组分的酶蛋白制备品。

如本文所使用，当提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽时，合成的指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。

如本文所使用，使用重组DNA方法通过重组方式产生意指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆DNA编码的蛋白质。

如本文所使用，载体(或质粒)指为了异源核酸的表达或复制而将其引入细胞中所使用的分离的元件(element)。这些载体通常保持为附加体，但是可经设计实现基因或其部分整合入基因组的染色体中。也涵盖作为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和用途为本领域技术人员所熟知。

如本文所使用，表达载体包括能够表达通过操作(operatively)与调控序列连接的DNA的载体，所述调节序列(例如启动子区)能够实现这些DNA片段的表达操作。这些额外的区段可包含启动子和终止子序列，并任选地可以包含一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可包含二者的元件。因此，表达载体指在引入合适的宿主细胞后可引起克隆的DNA表达的重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知并包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些以及保持为附加体的那些或整合入宿主细胞基因组的那些。

如本文所使用，载体也包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒载体为通过操作与异源基因操作连接以将所述异源基因转移(作为载体或穿梭质粒(shuttle))进细胞的工程化病毒。

如本文所使用，当提及DNA区段时，操作性地(operably)连接或通过操作操作连接意指该区段经排列使得它们为了其预期目的一致发挥功能，例如转录起始启动子下游和任何已转录序列的上游。所述启动子通常为转录机结合的结构域以起始转录并沿着编码区段前进到达终止子。

如本文所使用，术语评价，就获得存在于样品中的蛋白酶或其结构域的活性的绝对值以及就获得表明该活性的水平的指数、比例、百分数、直观的或其他数值指示而言，意在包括定量和定向测定。评价可以是直接的或间接的，并且实际检测的化学个体(species)本身不一定是蛋白酶解产物但可以是例如其衍生物或一些另外的物质。例如，通过例如SDS-PAGE和考马斯蓝蛋白质染色检测补体蛋白的裂解产物。

如本文所使用，生物活性指化合物的体内活性或体内给药化合物、组合物或其他混合物后引起的生理学反应。因此生物学活性涵盖这些化合物、组合物和混合物的疗效和药物活性。可在被设计用于试验或使用这些活性的体外系统中观察生物活性。因此，用于本文目的，蛋白酶的生物学活性为催化活性，多肽因之被水解。

如本文使用，当提及两个核酸序列时，相同意指所讨论的两个序列编码相同的氨基酸序列或相同的蛋白。当相同用于指两个蛋白或肽时，其意指这两个蛋白或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本不改变该蛋白或肽的活性或功能的氨基酸取代。当相同指性质时，该性质不需要以相同的程度存在(例如，两个肽可显示不同速率的相同类型的酶活性)，但是所述活性通常是基本相同的。

如本文所使用，“调节(modulate)”和“调节(modulation)”或“改变”指分子例如蛋白质的活性的改变。示例性的活性包括但不限于生物学活性，例如信号转导。调节可包括增加活性(即上调或激动剂活性)、降低活性(即下调或抑制)或活性的任何其他改变(例如周期性、频率、持续时间、动力学或其他参数的变化)。调节可为语境相关的并且通常将调节与指定状态例如野生型蛋白比较，该蛋白为组成型状态或该蛋白表达于指定的细胞类型或条件。

如本文所使用，组合物指任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。

如本文所使用，组合(combination)指两个或多个项目之间的任何关联。所述组合可为两个或多个分离的项目例如两种组合物或两个集合，可为其混合物，例如两个或多个项目的单一混合物或其任何变型。组合的要素通常在功能上关联或相关。

如本文所使用，“疾病或病症”指由包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况的病因或状况引起的生物体的病理状态，以可识别的症状为特征。本文感兴趣的疾病和病症为涉及ECM组分的那些。

如本文所使用，“治疗”患有疾病或病症的个体意指该个体的症状得到部分或全部缓解或在治疗后保持稳定。因此，治疗涵盖预防、治疗和/或治愈。预防指防止可能的疾病和/或防止症状的恶化或疾病的进展。治疗也涵盖本文提供的超速效胰岛素组合物的任何药物用途。

如本文所使用，药学上有效的药剂包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物包括小分子药物和治疗性蛋白质。

如本文所使用，治疗意指缓解或在其他方面有利地改变病症、障碍或疾病或其他适应症的症状的任何方式。

如本文所使用，疗效意指对个体的治疗引起的作用，所述治疗改变(通常为改善或缓解)疾病或病症的症状或者治愈疾病或病症。治疗有效量指在给药于个体后引起疗效的组合物、分子或化合物的量。

如本文所使用，术语“个体”指动物，包括哺乳动物，例如人。

如本文所使用，患者指显示出疾病或病症的症状的人类个体。

如本文所使用，通过治疗例如通过给药药物组合物或其他治疗药改善具体疾病或病症的症状，意指可归因于或与所述组合物或治疗药的给药相关的所述症状的任何减少，不论是持久的或暂时的，永久的或短暂的。

如本文所使用，预防或防止指降低发生疾病或病症的风险的方法。

如本文所使用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指药剂、化合物、物质或包含化合物的组合物至少足以产生疗效的量。因此，其为用于预防、治疗、缓解、阻止或部分阻止疾病或病症的症状所必需的量。

如本文所使用，治疗有效的胰岛素剂量为达到血糖控制所需要的或足以达到血糖控制的胰岛素的量。该量可凭经验确定，例如通过糖负荷或食物负荷。本文提供的组合物包含治疗有效量或治疗有效浓度的胰岛素从而给药治疗有效剂量。

如本文所使用，单位剂量形式指如本文领域已知的适用于人或动物个体并单独包装的物理不连续的单位。

如本文所使用，单一剂量制剂指用于直接给药的制剂。

如本文所使用，“制品”为生产和出售的产品。如本申请全文所使用，该术语意在涵盖包含于相同的或单独的包装品(article of packaging)中的速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物。

如本文所使用，流体指任何可以流动的组合物。因此流体涵盖为半固体、糊剂、溶液剂、含水混合物、凝胶、洗剂、乳膏形式的组合物和其他这样的组合物。

如本文所使用，“药盒”指本文提供的组合物和另一用于包括但不限于复制(reconstitution)、活化的物品(item)、用于递送、给药、诊断和评价生物学活性或性质的仪器/装置的组合。药盒任选包括使用说明。

如本文所使用，细胞提取物或溶胞产物指从裂解的或破裂的细胞制备的制剂或部分(fraction)。

如本文所使用，动物包括任何动物，例如但不限于包括人、大猩猩和猴子在内的灵长类动物；啮齿类，例如小鼠和大鼠；家禽，例如鸡；反刍动物，例如山羊、奶牛、鹿、绵羊；羊，例如猪以及其他动物。非人类动物排除人作为所涵盖的动物。本文提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。绝大多数酶为动物来源，包括哺乳动物来源。

如本文所使用，对照指除了未受试验参数处理外与受试样品基本相同的样品，或者，如果其为血浆样品，其可来自未受所感兴趣的病症影响的健康志愿者。对照也可为内部对照。

如本文所使用，单数形式英文单词“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文明确另外指明。因此，例如，提及的包含“胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。

如本文所使用，范围和量可表示为“约”某具体的值或范围。也包括精确的量。因此“约5个碱基”意指“约5个碱基”并且也指“5个碱基”。

如本文所使用，“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件或条件发生或未发生，并且该描述包括所述事件或条件发生的情况或其未发生的情况。例如，任选地取代的基团意指该基团未被取代或被取代。

如本文所使用，除非另外指明，任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写与它们的通常用法、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(见，(1972)Biochemistry 11：1726)一致。

B.超速效胰岛素组合物

本文提供超速效胰岛素组合和组合物。所述超速效胰岛素组合物为通过在给药前或给药时将速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶混合获得。本文也提供所述超速效胰岛素组合物治疗速效胰岛素迄今为止适合治疗的相同疾病和病症例如糖尿病(用于控制高血糖)以及其他疾病和病症的方法和用途。速效胰岛素(例如赖脯胰岛素和

R胰岛素)不足够地模拟第一相餐时胰岛素释放的内源性胰岛素大量增加(spike)。现已发现通过将速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合，本文提供的方法、组合物和组合提供更近似地模拟非糖尿病个体的内源性(即天然的)餐后胰岛素释放的超速效胰岛素组合物。

1.胰岛素、糖尿病和现有速效胰岛素疗法的综述

胰岛素为天然存在的由胰脏分泌的多肽激素。身体细胞需要胰岛素以从血液中有效摄取和利用葡萄糖。葡萄糖为实现细胞功能的主要能量底物。除了作为碳水化合物内环境稳定的主要调节剂，胰岛素还对脂肪代谢具有作用。它可以改变肝脏和脂肪组织的能力，包括释放脂肪储备的能力。胰岛素在全身具有多种药效学作用，包括但不限于增加脂质合成、减少脂质分解、增加蛋白质合成、调节葡萄糖代谢的关键酶和过程(包括葡萄糖摄取刺激、葡萄糖氧化刺激、增加葡萄糖合成以及减少糖原分解)。

尽管胰岛素被基础地分泌，通常每小时0.5至1.0个单位，但是进食后其水平增加。进食后，胰脏响应葡萄糖升高分泌大量的胰岛素。胰岛素刺激向细胞内摄取葡萄糖，并向肝脏发出减少葡萄糖产生的信号；这导致血糖回复至正常水平。在健康的成体中，有两个阶段的胰岛素释放响应进食。早期阶段为在进食的2-15分钟内发生的胰岛素释放峰。后期阶段释放延续约2小时。早期阶段负责停止肝脏的葡萄糖产生，藉此降低血糖水平并将外周组织致敏或向其传递信号以增加葡萄糖摄取。在肌肉中，大量的葡萄糖储存为糖原。这些糖原的部分被分解成乳酸酯，其循环至肝脏并可被转化回葡萄糖并储存为糖原。在进食之间，肝脏分解这些糖原储备以向脑和其他组织提供葡萄糖。

由于胰脏不能产生足量的胰岛素或胰脏产生足量的胰岛素的能力降低，或者由于细胞不能合成和/或释放所需要的胰岛素或细胞合成和/或释放所需要的胰岛素的能力降低，糖尿病会引起慢性高血糖症。在糖尿病患者中，上文所述的第一阶段响应的效力减少或缺乏，导致餐后葡萄糖水平升高。例如，糖尿病患者餐后最初四个小时的血糖曲线下面积(AUC)是非糖尿病患者的2.5至3.0倍。餐后血糖波动导致了总体的高血糖症(overallhyperglycemia)和HbA1c水平升高，并且这些波动是在II型糖尿病早期观察到的HbA1c升高的主要诱因。

当胰脏产生的胰岛素不足或不能使用其产生的胰岛素时，许多糖尿病患者需要用胰岛素进行治疗以维持足够的血糖控制。胰岛素已被作为治疗药给向患有包括例如I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病在内的糖尿病的患者，以模拟正常个体中发生的内源性胰岛素反应。也将胰岛素给药于患有高血糖症的危重患者用于控制血糖水平。根据患者需要使用不同来源的胰岛素。市售胰岛素制剂可根据它们的活性的持续时间进行分类(见，例如，DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.InEllenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-HillProfessional)。例如，胰岛素被以速效制剂以及中效或长效制剂的形式提供，后两类在本文中称作基础作用胰岛素。速效形式起效快，通常在2-3小时或更短并且不超过四小时显示峰胰岛素水平。因此，速效形式的胰岛素用于餐时葡萄糖调节。其他形式的胰岛素包括在皮下给药后约4-12小时达到峰胰岛素浓度中效胰岛素，以及达到相对中等的峰值并具有20-30小时的最大作用时间的长效胰岛素。中效和长效形式通常由无定形和/或结晶胰岛素制剂组成，并主要用于基础治疗。

速效胰岛素组合物的餐时给药的目标为在进餐时间之前、之中或之后立即肠胃外给药速效胰岛素以随着时间的推移达到稳定的血糖水平。以这一方式，胰岛素的血液水平暂时升高以(a)停止肝葡萄糖产生和(b)增加葡萄糖摄取；因此在与食物消化相关的血糖升高过程中维持血糖控制。

重组人胰岛素(例如

R胰岛素)用于在进餐时间之前通过注射自我给药。不幸的是，重组胰岛素必须在进餐时间之前约半小时或更长的时间通过注射给药，以确保不出现外源胰岛素水平不能应对的血糖升高。重组人胰岛素吸收慢的原因之一是因为在锌离子存在下胰岛素在体内和体外均形成六聚体复合物。该含锌的六聚体复合物比不含锌的单体胰岛素更稳定。皮下注射后，这些胰岛素六聚体在它们可以通过毛细血管床吸收并进入体循环之前必须解离成更小的二聚体或单体。六聚体解离成二聚体和单体为浓度依赖性的，仅当胰岛素从注射部位扩散时在较低的浓度下发生。因此，皮下给药胰岛素后注射部位存在局部胰岛素贮库，其在注射部位提供了起始高浓度的六聚体胰岛素，该六聚体胰岛素直到胰岛素浓度降低才会被吸收(Soeborg等人，(2009)Eur.J.Pharm.Sci.36：78-90)。当胰岛素从注射部位缓慢扩散时，胰岛素浓度随着与注射部位的距离增加而降低，引起六聚体的解离以及胰岛素单体和二聚体的吸收。因此，尽管六聚体胰岛素复合物的扩散自然地发生在人体中，但是需要经过一段时间才发生，延迟了胰岛素的全身利用度。而且，由于该浓度依赖性的吸收，胰岛素浓度越高，剂量越大，吸收越缓慢(Soeborg等人，(2009)Eur.J.Pharm.Sci.36：78-90)。

由于单体形式的胰岛素吸收更迅速，而六聚体状态的胰岛素更稳定，所以开发了皮下给药后显示更快地从六聚体解离至单体的速效类似物形式的胰岛素。这些胰岛素被修饰，例如通过氨基酸改变，以增加解离速率，藉此使其在注射后具有更快的药效学活性。如章节C所描述，速效类似物形式的胰岛素包括但不限于谷赖胰岛素、门冬胰岛素和赖脯胰岛素。

包括速效类似物在内的速效形式的胰岛素具有延迟的吸收和起效，因此不接近具有进食后约10分钟发生的早期阶段的内源性胰岛素。因此，该类制剂起效不够迅速，不能停止该第一阶段胰岛素释放后不久出现的肝脏葡萄糖生成。由于这一原因，即使是速效胰岛素类似物制剂也必须在进餐之前给药以把握期望的血糖控制的任何机会。尽管与正规胰岛素要求的30-60分钟相比在15分钟内估算进餐时间更简单，但是存在患者进食太早或太晚以致于不能提供最佳血糖控制的风险。

而且，使用包括速效胰岛素疗法在内的任何胰岛素疗法进行的治疗的主要副作用之一为低血糖症。低血糖症定义为低血糖并与多种病症相关，所述病症的范围可以为从饥饿到更麻烦的症状例如震颤、出汗、意识错乱或甚至到癫痫发作、昏迷和死亡。低血糖的发生可归因于进食不足、节食(skipping meal)、运动过度或服用过多的胰岛素或使用暴露和作用时间长度不适当的餐时胰岛素制剂。例如，由于许多速效胰岛素疗法必须在进食前给药，因此患者有可能放弃或省去进食而导致低血糖。此外，给药速效胰岛素后，血浆胰岛素水平和胰岛素作用(例如以葡萄糖输注速率(GIR)测定)通常在餐时葡萄糖负荷减轻后仍保持升高，可能导致低血糖症。通过增加胰岛素剂量以更好地控制峰葡萄糖负荷的尝试进一步增加这一风险。而且，因为餐后低血糖症为胰岛素疗法的常见后果，它通常导致或要求患者在正餐之间吃点心。这会导致通常与胰岛素疗法相关的体重增加和肥胖症。

2.超速效胰岛素组合物的药效学和药动学

本文发现速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的组合引起所述速效胰岛素的吸收增加，引起更快速的血清胰岛素浓度升高(即，更快的吸收速率)和药理学作用。因此，速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的组合得到能够在肠胃外(即，非静脉内的)推注给药(例如通过皮下(SC)、肌肉内(IM)、腹膜内(IP)或皮内(ID)给药途径的肠胃外给药)后实现血糖快速升高的速效胰岛素组合物。

尽管不受任何理论的束缚，速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的组合可引起所述速效胰岛素的吸收比单独给药所述胰岛素时增加，这归因于皮下给药后的分散机制的改变。通常，高分子量透明质酸的存在对单独皮下注射胰岛素后液体团块(bulk fluids)的流动造成障碍。因此，如上文所论述，所述胰岛素通过扩散介导的机制从注射部位分散。随着所述胰岛素从注射部位分散，浓度降低，促进胰岛素六聚体解离成足够小能被吸收通过毛细血管床的单体和二聚体。因此，为了在皮下给药后被吸收，所述胰岛素必须首先缓慢地从注射部位分散以产生足够低的胰岛素浓度以促进解离，并因此促进吸收。然而，当将所述胰岛素与乙酰透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶联合给药时，乙酰透明质酸被所述乙酰透明质酸降解酶降解，使得液体团块能够流动，所述与压力梯度(或导水率)成比例地快速分散。例如在生理压力下，可溶性透明质酸酶例如rHuPH20产生导水率约20倍的增加。因此，当与乙酰透明质酸降解酶联合给药时，所述胰岛素在所述乙酰透明质酸屏障被降解后以对流介导的方式快速分散。与乙酰透明质酸降解酶皮下联合给药时的这种胰岛素快速吸与单独给药所述胰岛素相比，可得到所述胰岛素的改善的药动学和药效学性质。

例如，如本文所提供，所述超速效胰岛素组合物吸收更快，这由t_max降低以及C_max和累积全身胰岛素暴露(在最初的40分钟尤其显著)的增加证明。这一改善的药动学性质反映在起效变短和胰岛素作用时间方面。这可由药效学测量，例如通过如实施例1描述的血糖钳技术中的葡萄糖输注速率来证明。因此，超速效胰岛素组合物比对应的速效胰岛素吸收更快。有趣的是，如图1和2所示，包含乙酰透明质酸降解酶的超速效胰岛素组合物显示速效正规胰岛素和速效胰岛素类似物二者的加速吸收，引起相似药效学(PD)和药动学(PK)性质，尽管在无所述乙酰透明质酸降解酶的情况下速效胰岛素类似物比速效正规胰岛素吸收更快。因此，超速效胰岛素组合物显示相似的药效学(PD)和药动学(PK)性质，与所述组合物中包含速效胰岛素类似物还是速效正规胰岛素无关。该相似性在给药后最初的40至60分钟内尤其显著(见图1和2)。因此，所述超速效胰岛素组合物的其他优点为在给药后最初的40至60分钟内达到类似的药效学和药动学性质，与所述速效胰岛素为速效正规胰岛素(例如，

R胰岛素)还是速效类似物(例如

赖脯胰岛素、

门冬胰岛素或

谷赖胰岛素)无关。在一些情况下，例如所述超速效胰岛素组合物中的速效胰岛素为速效胰岛素类似物而不是正规胰岛素时，所述速效胰岛素与所述乙酰透明质酸降解酶一起(即，作为超速效胰岛素组合物)给药时的吸收快于单独的所述速效胰岛素的最快吸收。这一点本身显示为例如t_max降低，和累积全身胰岛素暴露增加，尤其是最初的40分钟。

所述超速效胰岛素组合物的药动学在几个重要方面不同于对应的速效胰岛素。首先，作为时间的函数的血胰岛素浓度在早期转变成较高的浓度之一(见例如图1)。胰岛素进入体循环的该表观速率描述为吸收速率，与描述为消除速率的从体循环清除的速率区别开来。超速效胰岛素组合物与对应的速效胰岛素相比具有更高的吸收速率，引起更大的早期暴露。此外，因为所述乙酰透明质酸降解酶短暂地并局部地作用于给药部位，所以超速效胰岛素组合物一旦进入体循环后其消除速率和效力与对应的速效胰岛素无本质差异。通过增加吸收速率同时维持相同的消除速率，与对应的速效胰岛素相比，超速效胰岛素组合物的最大血胰岛素浓度(C_max)也增加。因此，相对于对应的速效胰岛素，超速效胰岛素的相同总量的全身可利用胰岛素随时间分布不同，从而在肠胃外给药超速效胰岛素组合物后，与仅为速效的胰岛素相比，在早期的时间点产生更大部分的累积全身胰岛素暴露并在后期的时间点产生更小部分的累积全身胰岛素暴露。该吸收速率的转变使得所述超速效胰岛素组合物能够更近似地模拟对身体对进食后出现的血糖水平峰的内源性胰岛素反应。

另一个并且是独立的药动学参数，即，到达体循环的给药剂量的部分，也可以将所述超速效胰岛素组合物相对于对应的速效胰岛素加以区分。对于某些速效胰岛素，绝大部分的给药剂量是可全身生物利用的，因此对于对应的超速效胰岛素组合物而言可能仅有逐步的增加(incrementalincrease)。然而对于其他速效胰岛素例如正规胰岛素(例如

R胰岛素)而言，生物利用度的增加可以是显著的。将本文所述的超速效胰岛素组合物与其对应的速效胰岛素的相对生物利用度描述为在相同的非静脉肠胃外给药后这两种组合物的总体全身暴露(AUC_0-无穷大)的比。

所述超速效胰岛素组合物的另一重要方面涉及实现改善药效学参数的能力，所述参数测定对全身可利用胰岛素的生理学响应。因为本文描述的超速效胰岛素组合物在达到体循环后与对应的速效胰岛素具有相同的药理学效力，所以所述超速效胰岛素组合物提供的改善的药效学性质(如上文所述)引起测定对全身可利用胰岛素的生理学响应的药效学参数的有利变化。例如在血糖钳操作中当向个体给药胰岛素时测定的葡萄糖输注速率(GIR)表示药效学参数，因为它测定随时间的维持目标血糖浓度所要求的静脉内葡萄糖给药速度。由于与对应的速效胰岛素相比超速效胰岛素组合物取得吸收速率更高的药动学优势，所述超速效胰岛素组合物能够在早期使GIR分布(对胰岛素的生理学响应的量度)向更高的输注速率(即更大的生理学响应)变化。对于那些也具有有意义的相对全身生物利用度增加的超速效胰岛素组合物，可观察到GIR响应的进一步增加，但是总GIR取决于随时间的胰岛素水平分布和给药的全身剂量二者。

由本文描述的超速效胰岛素组合物提供的药动学和药效学优势产生许多重要用途。首先，通过将PK和PD响应转变到早期，与对单独的对应速效胰岛素可能产生的胰岛素响应相比，对所述超速效胰岛素组合物可产生更自然的胰岛素响应以控制餐后葡萄糖水平。身体自然的胰岛素响应包括(a)最初10-15分钟内的初始胰岛素快速释放(burst)，传递信号停止肝脏葡萄糖释放并在进餐之间提供最低血糖浓度；和(b)在约2小时中的总胰岛素暴露，所述总胰岛素暴露通过如下方式与食物的碳水化合物组成匹配：通过复杂的激素响应的相互作用(包括β-细胞对全身代谢产物(主要为葡萄糖)水平的响应和当肠道发觉存在营养物质时促进胰岛素分泌的肠促胰岛素激素二者)，根据葡萄糖水平调整胰岛素释放进入体循环。通过在最初的10-15分钟具有较大部分的全身可利用胰岛素暴露，所述超速效胰岛素组合物能够比对应的速效胰岛素组合物更好地发出信号使肝脏葡萄糖释放停止(像身体的内源性餐时胰岛素反应)。而且，本文描述的超速效胰岛素组合物也能更好地模拟自然的餐后葡萄糖控制，其方式为：在最初的2小时中具有更高部分的全身可利用胰岛素暴露以及在2小时后胰岛素暴露的相应减少。当餐后葡萄糖吸收完全时，给药后超过2小时出现的胰岛素水平升高可引起葡萄糖代谢增加，这一情况导致低血糖水平或低血糖症。此外，因为所述超速效胰岛素组合物具有与自然的胰岛素反应相似的起效，所以这些组合物可在进餐时间给药，而许多速效胰岛素组合物(例如

R胰岛素)在进食前30-60分钟给药，如果个体推迟或省去进餐，这些速效胰岛素组合物会带来低血糖症的风险。因此，通过最初15分钟内胰岛素暴露增加与2小时后胰岛素暴露减少的组合，超速效胰岛素组合物比对应的速效胰岛素组合物能够更好地控制餐后葡萄糖水平。

通常以宽范围的剂量给药速效胰岛素，所述剂量由医生或其他有资质的医疗保健人员根据包括实际的葡萄糖水平、个体、糖尿病类型和食物的组成在内的许多因素确定。通常，这样的速效胰岛素的剂量可为0.05单位/kg至2单位/kg。由于它们的药动学和药效学，与无乙酰透明质酸降解酶时给药的速效胰岛素相比，可以更低的剂量给药超速效胰岛素组合物。可以通过将速效胰岛素作为超速效胰岛素组合物给药来降低所述速效胰岛素的量的程度是变化的，这取决于例如患者具有的糖尿病类型。通常，当以超速效胰岛素组合物的形式给药时给药于II型糖尿病患者的速效胰岛素量的减少大于当以超速效胰岛素组合物的形式给药时给药于I型糖尿病患者的速效胰岛素量的减少。例如，在向I型糖尿病患者和II型糖尿病患者各给药0.20U/kg速效胰岛素以控制餐后葡萄糖水平的情况中，可以超速效胰岛素组合物的形式向该I型糖尿病患者给药0.15U/kg速效胰岛素以达到相同或更好的血糖控制，可以超速效胰岛素组合物的形式向该II型糖尿病患者给药0.10U/kg速效胰岛素以达到相同或更好的血糖控制。因此，在一些实施例中，本文涵盖：与在无乙酰透明质酸降解酶的情况下给药时血糖控制所需要的量相比，当与乙酰透明质酸降解酶一起作为超速效胰岛素组合物给药时，给药于II型糖尿病患者以达到血糖控制的速效胰岛素的量可减少例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多，以及与在无乙酰透明质酸降解酶的情况下给药时血糖控制所需要的量相比，当与乙酰透明质酸降解酶一起作为超速效胰岛素组合物给药时，给药于I型糖尿病患者以达到血糖控制的速效胰岛素的量可减少例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。

尽管不受任何理论的束缚，当与乙酰透明质酸降解酶一起作为超速效胰岛素组合物给药胰岛素时，与I型糖尿病患者相比用于II型糖尿病患者的速效胰岛素剂量更大的减少反映了I型和II型患者不同的餐后血糖特征，以及所述超速效胰岛素更近似地模拟健康个体中自然的第一阶段胰岛素释放的能力。II型糖尿病由β细胞功能受损、胰岛素抵抗和/或胰岛素分泌受损引起。这些患者缺乏发生在葡萄糖负荷例如进食后数分钟之内的早期胰岛素释放，但是仍随时间缓慢释放胰岛素。相反，I型糖尿病患者不产生任何胰岛素，所以缺乏第一阶段和第二阶段的胰岛素释放，其中后者在健康个体中持续到达到血糖控制。因此，由于II型糖尿病通常仅要求主要用于解决餐后高血糖的胰岛素疗法，所以在这些糖尿病患者中餐时胰岛素疗法中需要解决的问题为低血糖症的出现。当个体自身延迟的和/或基础的胰岛素分泌与餐时峰已被减少后仍然存在的任何过量外源胰岛素的降糖作用联合时，可引起低血糖症。长此以往，这些餐后低血糖发作的重复出现可引起体重增加和肥胖症。速效胰岛素的药动学和药效学使得为了足够快地达到适当的血胰岛素浓度以在食物消化后立即降低葡萄糖水平所需的剂量(即涵盖(cover)自然的早期胰岛素释放的剂量)成为引起过量胰岛素在消化后循环于血液中并降低餐后葡萄糖水平的剂量。因此，II型糖尿病患者接受的胰岛素剂量涵盖多于仅仅的早期胰岛素释放。本文提供的超速效胰岛素组合物更近似地模拟内源性胰岛素反应。因此，可以仅包括早期胰岛素释放的剂量向II型糖尿病患者给药超速效胰岛素组合物，而以包括所有阶段的胰岛素释放的剂量向I型糖尿病患者给药超速效胰岛素组合物。

因此，本文提供的超速效胰岛素组合物的另一用途为减少与速效胰岛素疗法相关的体重增加和肥胖症的副作用。该副作用的大小与所给药的胰岛素剂量大约成正比或成正比。如上文所述，超速效胰岛素组合物可通过例如更高的生物利用度和给药后最初的0.25、0.5、0.75、1、1.5或2小时内更大部分的累积全身胰岛素暴露的组合以较低剂量的速效胰岛素提供与对应的速效组合物相同的血糖控制。尽管由于胰岛素疗法I型和II型糖尿病患者会经历体重增加，但是II型糖尿病患者体重增加的风险尤其显著。II型糖尿病患者缺乏第一阶段的胰岛素释放，但是仍长期缓慢地释放胰岛素。结果，在疾病的早期，II型糖尿病患者的内源性胰岛素水平在进食开始时太低而在食物消化之后太高。当不存在第一阶段胰岛素释放时，肝脏不接受停止产生葡萄糖的信号。当身体开始从食物的消化产生新的葡萄糖时肝脏继续产生葡萄糖，引起高血糖症。进食后的两到三小时，未治疗的糖尿病患者的血糖升高使得胰脏接受信号分泌大量胰岛素。在患有早期II型糖尿病的患者中，胰脏仍可响应并分泌该大量的胰岛素。这发生在消化几乎结束并且血糖水平应该开始降低时。该大量的胰岛素具有两种有害作用。首先，它向已经受损的胰脏下达了过分的命令，其可导致更快速的胰脏损害并最终使得胰脏不能产生胰岛素。第二，消化后过多的胰岛素可导致体重增加，其可进一步加重疾病状态。当向II型糖尿病患者给药速效胰岛素以控制餐后高血糖症时，如上文所述，消化后仍可保留过多的胰岛素。因此，接受胰岛素疗法的II型糖尿病患者在消化后可具有过多的胰岛素，其可导致低血糖症和由此引起的体重增加。给药本文提供的超速效胰岛素组合物以控制餐后高血糖症降低了糖尿病患者体重增加和肥胖症的风险。所述超速效胰岛素组合物可包含较低剂量的速效胰岛素。

为了达到血糖控制，可以无所述乙酰透明质酸降解酶时给药所述速效胰岛素的水平的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％来给药所述超速效胰岛素组合物中的速效胰岛素。因此，例如，在超速效胰岛素组合物中给药的速效胰岛素的量通常为0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、1.0U/kg、1.1U/kg、1.2U/kg、1.3U/kg、1.4U/kg、1.5U/kg、1.6U/kg、1.7U/kg、1.8U/kg、1.9U/kg或2.0U/kg或者约0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、1.0U/kg、1.1U/kg、1.2U/kg、1.3U/kg、1.4U/kg、1.5U/kg、1.6U/kg、1.7U/kg、1.8U/kg、1.9U/kg或2.0U/kg。由于较低的剂量，可减少该类胰岛素的作用时间已最小化由延续数小时的升高的血浆胰岛素浓度引起的后期低血糖症的可能。因此，预期所述超速效胰岛素组合物更快速的起效，其更近似地模拟第一阶段餐时胰岛素释放的内源性胰岛素峰，会在更好的血糖控制和糖尿病患者中较少的体重增加方面提供临床益处。

而且，通过提供增加的吸收速率，如本文描述的超速效胰岛素组合物与对应的速效胰岛素组合物相比，可提供给药的胰岛素的效力和对观察到的葡萄糖水平的影响之间更短的反馈循环，并因此能更好地模拟餐后葡萄糖水平的自然调节。因此，超速效胰岛素组合物改良的药动学也有利于现有的“胰岛素泵”和持续葡萄糖监测(GCM)技术的性能。通过缩短餐后胰岛素推注和全身血糖响应之间的时间，利用GCM由重复的较小剂量皮下注射胰岛素进行更严格的葡萄糖水平控制可在组合的胰岛素泵/葡萄糖监测装置上形成“闭环”(即闭环系统或人工胰脏)。

不论是以单一的混合物还是以分离的制剂形式提供，速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的超速效胰岛素组合物可包含另外的成分以提供期望的物理和化学性质。例如，注射液可包含一种或多种张力调节剂以提供接近于等渗的溶液，和用酸或碱以及可能用pH缓冲组分滴定至中性pH的含水溶剂。速效胰岛素制剂通常包含Zn和酚类抗菌防腐剂例如间甲酚以将它们在结构上稳定在更稳定的六聚体状态。金属螯合剂例如EDTA可用于调节这些六聚体的解离速率，可存在其他二价金属例如钙以缓冲螯合能力(chelating capacity)。乙酰透明质酸降解酶通常需要另外的组分以提供物理和化学稳定性，包括但不限于表面活性剂、除氧剂、盐、氨基酸和多元醇。

所提供的超速效胰岛素组合物可以是包括用于连续(以任何顺序)或同时联合给药的两个分离容器的药盒，一个容器包含速效胰岛素组合物，另一个容器包含乙酰透明质酸降解酶组合物；或包含单一容器的药盒，该容器包含速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物的混合物。如果联合给药所述速效胰岛素和所述乙酰透明质酸降解酶，所述联合给药可以任何顺序连续进行(例如在所述速效胰岛素之前给药所述乙酰透明质酸降解酶，藉此所述乙酰透明质酸降解酶在给药所述速效胰岛素前在注射部位降解乙酰透明质酸)；或者，所述速效胰岛素和所述乙酰透明质酸降解酶的联合给药可同时进行。可将所述速效胰岛素组合物和所述乙酰透明质酸降解酶组合物配制(一起或单独地)成用适当稀释剂复制后用于注射的固体、注射液或注射混悬剂。

以下章节描述用于本文提供的超速效胰岛素组合物中的示例性速效胰岛素和可溶性乙酰透明质酸降解酶、它们的制备方法以及使用它们治疗现有速效胰岛素用于治疗的疾病和病症。

C.胰岛素多肽和制剂

胰岛素为由51个氨基酸残基组成的多肽，分子量为5808道尔顿。其由胰脏中的胰岛β-细胞产生。示例性人胰岛素被翻译为110个氨基酸的前体多肽，前胰岛素原(SEQ ID NO：101)，其包含定向至ER的24个氨基酸的信号肽，该信号序列被裂解，产生胰岛素原(SEQ ID NO：102)。接着通过已知为激素原转化酶(PC1和PC2)的蛋白水解酶的作用和外切蛋白酶(exoprotease)羧肽酶E的作用，胰岛素原分子被转化成成熟的胰岛素。这引起4个碱性氨基酸残基和剩余的31个氨基酸C-肽或连接链(对应于SEQ ID NO：101所示的前胰岛素原多肽的氨基酸残基57-87)的去除。所得胰岛素包含21个氨基酸的A-链(对应于SEQ ID NO：102所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基90-110)和30个氨基酸的B-链(对应于SEQ ID NO：102所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基1-30)，它们通过二硫键交联。通常，成熟的胰岛素包含三个二硫桥：一个在A-链的7位和B链的7位之间，第二个在A链的20位和B链的19位之间，第三个在A链的6位和11位之间。成熟胰岛素A链的序列显示于SEQ ID NO：103，B链的序列显示于SEQID NO：104。

提及的胰岛素包括前胰岛素原、前胰岛原以及单链或双链形式的胰岛素多肽、其具有活性的截短形式，并包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体或其他变体，例如胰岛素类似物或其他衍生化形式，包括与SEQ ID NO：101所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽，只要该胰岛素与人胰岛素受体结合起始引起葡萄糖摄取和贮存增加和/或内源性葡萄糖产生降低的信号转导级联。例如，胰岛素包括胰岛素的物种变体。这些包括但不限于衍生自牛(SEQ IDNO：133)和猪(SEQ ID NO：123)的胰岛素。牛胰岛素与人胰岛素在A链的8和10位氨基酸以及B链的30位氨基酸存在差异。猪胰岛素与人胰岛素仅在B链的30位氨基酸存在差异，该位点与牛胰岛素序列一样存在代苏氨酸的丙氨酸取代。其他示例性的胰岛素物种变体显示于SEQ ID NO：105-146中任一个。胰岛素变体也包括与SEQ ID NO：103和104(A和B链)所示的人胰岛素相比包含一个或多个氨基酸修饰的胰岛素类似物。包括速效和长效胰岛素类似物形式在内的示例性胰岛素类似物(A和B链)显示于SEQ ID NO：147-165、182-184。例如，胰岛素类似物包括但不限于谷赖胰岛素(LysB3、GluB29；显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：149(B-链))、HMR-1 153(LysB3、IleB28；显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQID NO：182(B-链))、HMR-1423(GlyA21、HisB31、HisB32；显示于SEQ IDNO：183(A-链)和SEQ ID NO：184(B-链))、门冬胰岛素(AspB28；显示于SEQID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：147(B-链))以及赖脯胰岛素(LysB28，ProB29；显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：148(B-链))。在上述任何一个例子中，所述类似物的命名基于胰岛素A或B链上具体位点的氨基酸取代的描述，从链的N端数起，其中序列的剩余部分为天然人胰岛素。

任意上述胰岛素多肽包括由任何物种例如人的胰脏产生的那些，也包括合成产生的或使用重组技术产生的胰岛素。例如，如本文其他地方所描述，可通过表达胰岛素A和B链的合成基因，通过表达完整的胰岛素原并将其暴露于合适的酶法和化学方法以产生成熟的胰岛素，或通过表达由接头肽连接的A和B链，来生物合成地产生胰岛素(见，例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’sDiabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。

胰岛素也包括单体和寡聚体形式，例如六聚体形式。胰岛素在血浆中循环时可以单体存在，并且其做为单体形式时也结合它的受体。然而，胰岛素具有自身缔合形成二聚体的倾向，并且在金属离子例如Zn²⁺存在时易于缔合形成更高级别的结构例如六聚体。有两个对称的Zn²⁺高亲和力结合位点，然而也报道了其他较弱的锌结合位点(见，例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’s DiabetesMellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。自我缔合(self-association)对于分子防止化学降解和物理变性的稳定性是重要的。因此，在胰脏β细胞的储存囊泡中，胰岛素以六聚体存在。然而，释放到胞外空间后，人们认为这些胰岛素六聚体可能经历pH向更中性的条件的变化并且含锌离子的六聚体被稀释，这使得该六聚体不稳定。可能有其他原因导致该胰岛素六聚体在胞外空间的去稳定化。因此存在于血液中的胰岛素主要为单体。为了利用这一稳定作用，绝大多数市售胰岛素制剂包含足量的锌离子以促进自我缔合形成六聚体。然而，六聚体结构减慢这些制剂皮下给药后的吸收速率。

如章节B所论述，胰岛素用作例如糖尿病患者的血糖控制的药物。根据给药胰岛素控制血糖是用于基础疗法、餐时疗法或其组合，存在许多类型的胰岛素制剂。可仅以速效制剂、仅以基础作用制剂(即中效和/或长效形式)、或以其混合物(见，例如表2)的形式提供胰岛素制剂。通常，混合物包含速效和中效或长效胰岛素。例如，可以包括10∶90、20∶80、30∶70、40∶60和50∶50在内的各种混合比例将速效胰岛素与NPH胰岛素(如下文论述的示例性中效胰岛素)组合。这些预混合的制剂可通过在单一制剂中方便地提供进餐相关的和基础的胰岛素需求从而减少每日胰岛素注射的次数。因此，本文描述的超速效胰岛素组合物制剂包括任选地可提供基础作用胰岛素的那些。

通常，任何胰岛素制剂均包含胰岛素多肽或其变体(即，类似物)并且仅在组成制剂的其他物质上存在差异。因此，可以影响不同胰岛素类型的作用时间的是制剂的细节(specifics)。胰岛素制剂包含的物质的实例包括但不限于稳定剂例如锌、pH缓冲液、张力调节剂例如甘油；防腐剂/抗菌剂例如间甲酚；以及鱼精蛋白或其他沉淀剂或控释剂。而且，如本文所提供，也可制备包含钙和金属螯合剂例如EDTA或EGTA的胰岛素制剂。可将任何一种或多种上述物质加到胰岛素多肽中，例如加到超速效胰岛素组合物中。加入的具体组分以及它们的量影响胰岛素的类型、其作用时间、其吸收和生物利用度，并因此影响其应用。

例如，大多数胰岛素制剂在制剂中包含金属离子例如锌，所述金属离子通过促进分子的自我缔合稳定胰岛素。自我缔合形成六聚体形式可影响给药后的胰岛素吸收。因此，该类稳定剂的比例以及向胰岛素中加入EDTA或EGTA允许进一步调节和控制胰岛素的吸收和生物利用度，例如通过影响多肽中存在的较高级别结构的比例。通常，速效的正规胰岛素包含锌，其量为0.01-0.04mg/100单位或约0.01-0.04mg/100单位。化学研究已显示，胰岛素的溶解度很大程度上取决于锌含量和其中悬浮有该胰岛素的缓冲液的性质。因此，一些较长效的基础胰岛素制剂通过加入锌使胰岛素从醋酸盐缓冲液(而不是磷酸盐)中沉淀而制备。当收集具有高的锌含量的大胰岛素晶体并将其再悬浮于醋酸钠-氯化钠溶液(pH7.2至7.5)中时，其在皮下注射后被缓慢吸收并发挥长期作用。该晶体制剂被称为长效胰岛素锌混悬剂(特慢胰岛素)。其他含锌胰岛素制剂包括，例如Semilente胰岛素(速效胰岛素锌混悬剂)和缓释胰岛素(胰岛素锌混悬剂)，它们的差别主要在于所使用的锌浓度。含锌胰岛素制剂也包括经鱼精蛋白修饰的那些，例如NPH胰岛素。

在另一实施例中，可向胰岛素多肽中加入沉淀剂例如鱼精蛋白以生产微晶混悬剂。通常，结晶胰岛素与不以结晶形式存在的胰岛素相比具有延长的作用时间。当在含水混悬剂中皮下注射时，鱼精蛋白锌胰岛素仅在沉积部位缓慢溶解，并且该胰岛素以减慢的速率被吸收。鱼精蛋白锌混悬剂胰岛素已大量地被也称作NPH胰岛素的低精蛋白胰岛素混悬剂替代。其为结晶形式的经修饰的鱼精蛋白锌胰岛素混悬剂。调节胰岛素、鱼精蛋白和锌的浓度使得该制剂具有介于正规胰岛素和鱼精蛋白锌胰岛素混悬剂之间的起效和作用时间。

另外，制剂的pH差异也影响胰岛素的类型和性质。原始的正规胰岛素制剂在2.8-3.5的pH下制备，否则他们会在更高pH范围下形成颗粒。然而，高度纯化的胰岛素制剂可在一系列pH值下制备。而且，对胰岛素制剂进行缓冲允许在宽pH范围的溶液中制备胰岛素。通常，在中性pH下制备的胰岛素比在酸性pH下制备的那些具有更高的稳定性。因此，大多数胰岛素为在中性pH下配制。例外的是甘精胰岛素，其以pH4.0的市售制剂的形式提供。由于向B-链的C-端添加了两个精氨酸，改变了甘精胰岛素的等电点，使其在酸性pH下溶解度更高。另外的氨基酸变化存在于A链(N21G)以防止酸敏感的天冬酰胺引起的脱酰胺作用和二聚化。甘精胰岛素的A链序列显示于SEQ ID NO：150且B链显示于SEQ ID NO：151。由于在给药后暴露于生理pH，所以形成了微量沉淀，其使得甘精胰岛素与结晶、长效胰岛素相似。

下文表2总结了各种类型的胰岛素、它们的起效和它们的应用。

最常用的胰岛素为速效胰岛素，其包括正规胰岛素(即天然的或野生型胰岛素，包括其等位基因变体和物种变体)和速效胰岛素类似物。用于本文目的，除非另外具体指明，提及的胰岛素指速效胰岛素。

速效胰岛素

本文提供包含速效胰岛素和可溶性乙酰透明质酸降解酶的超速效胰岛素组合物。一般而言，这些超速效胰岛素组合物在皮下给药后被吸收并且是可检测的，在30分钟或更短的时间内在血液中起效。可用于获得本文描述的超速效胰岛素组合物的速效胰岛素包括作为野生型或天然胰岛素的正规胰岛素。速效胰岛素也包括胰岛素类似物。由于它们与基础胰岛素相比具有快速的吸收速率，所以速效胰岛素主要用于餐后控制目的。示例性速效胰岛素列于下文表3。速效胰岛素也包括任何本领域已知的，例如但不限于美国专利7279457和美国专利公布20070235365、20080039368、20080039365、20070086952、20070244467和20070191757中公开的任何胰岛素制剂和装置。通过与乙酰透明质酸降解酶一起配制和/或联合给药可使任何速效胰岛素成为超速效的。超速效胰岛素组合物制剂除了乙酰透明质酸降解酶外也可进一步包含速效胰岛素与中效或长效胰岛素的混合物。

a.正规胰岛素

正规胰岛素包括包含天然或野生型胰岛素多肽的制剂。这些包括人胰岛素以及来自牛、猪和其他物种的胰岛素，这些胰岛素可在酸性pH(例如2.5-3.5)下制备或可在中性pH(例如7.0-7.8)下制备。正规胰岛素也包括包含锌的那些。通常，正规胰岛素制剂中的锌含量为0.01-0.04mg/100单位或约0.01-0.04mg/100单位。正规人胰岛素以

R、

R和

销售。猪胰岛素以Iletin

销售。一般而言，正规胰岛素在皮下给药后30分钟起效。最大血浆水平出现在1-3小时并且强度的持续随剂量增加。皮下给药后的血浆半衰期约为1.5小时。

b.速效类似物

速效胰岛素类似物为胰岛素的修饰形式，其通常包含一个或多个氨基酸改变的。为了与正规胰岛素相比增加吸收速率和起效，对这些类似物进行设计以减少胰岛素分子的自我缔合。一般而言，在锌存在下配制这些类似物，它们因此作为稳定的锌六聚体存在。然而，由于修饰，它们与正规胰岛素相比在皮下给药后更快地从六聚体状态解离。

i.赖脯胰岛素

人赖脯胰岛素为这样的胰岛素多肽制剂，其包含在B-链的28和29位的氨基酸改变使得SEQ ID NO：104所示野生型胰岛素B-链在该位点的Pro-Lys转换为Lys-Pro。赖脯胰岛素的序列显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：148(B-链)。它以商品名

销售。这两个氨基酸的转换(inversion)得到自我缔合倾向降低的多肽，使得起效更快。具体而言，B-链中的序列转换引起两个疏水作用的消除和稳定二聚体的两个β-折叠片氢键的减弱(参见，例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry andPharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。由于所述制剂中提供的赋形剂例如抗菌剂(例如间甲酚)和起稳定作用的锌，该多肽自我缔合并形成六聚体。

ii.门冬胰岛素

人门冬胰岛素为包含在SEQ ID NO：104所示人胰岛素B链28位处由脯氨酸向门冬氨酸的氨基酸取代的胰岛素多肽制剂。门冬胰岛素的序列显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：147(B-链)。它以商品名

销售。门冬胰岛素中的修饰提供带负电荷的侧链羧基，以产生电荷排斥并使单体-单体相互作用不稳定。此外，脯氨酸的去除消除了单体之间关键的疏水相互作用(参见，例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistryand Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。该类似物主要以单体存在，并且与其他速效类似物例如赖脯胰岛素相比较不易聚集。一般而言，门冬胰岛素和赖脯胰岛素在各自的药动学和药效学性质方面相似。

iii.谷赖胰岛素

人谷赖胰岛素为与SEQ ID NO：104所示的人胰岛素B链的序列相比包含在B-链的B3位处由天冬酰胺向赖氨酸的氨基酸取代和在氨基酸B29处由赖氨酸向谷氨酸的氨基酸取代的胰岛素多肽制剂。谷赖胰岛素的序列显示于SEQ ID NO：103(A-链)和SEQ ID NO：149(B-链)。它以商品名

销售。这些修饰使得该多肽分子与人胰岛素相比较不易自我缔合。与其他胰岛素类似物不同，该多肽在商业上是在不存在促进六聚体的锌的存在下配制的(Becker等人(2008)Clinical Pharmacokinetics，47：7-20)。因此，谷赖胰岛素与赖脯胰岛素和门冬胰岛素相比起效更快。

D.乙酰透明质酸降解酶

本文提供由速效胰岛素和乙酰透明质酸(透明质酸)降解酶的组合得到的超速效胰岛素组合物和组合，以及使用这些组合物和组合治疗胰岛素介导的疾病和病症的方法。乙酰透明质酸降解酶包括任何降解乙酰透明质酸的酶。示例性乙酰透明质酸降解酶包括但不限于透明质酸酶和特定的软骨素酶以及具有裂解乙酰透明质酸的能力的裂解酶。因此，在本文提供的方法和用途描述透明质酸酶与胰岛素一起的用途时，可使用任何乙酰透明质酸降解酶。本文提供的组合物、组合和方法中的乙酰透明质酸降解酶的示例为可溶性乙酰透明质酸降解酶。由于乙酰透明质酸降解酶例如透明质酸酶降解胞外基质中的透明质酸的能力，这些酶促进治疗药剂的给药。例如，通过例如皮下给药与乙酰透明质酸降解酶联合给药的治疗剂的吸收和分散增加。

乙酰透明质酸也称作透明质酸或透明质酸盐(hyaluronate)，为广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织的非硫酸化糖胺聚糖。乙酰透明质酸为胞外基质的主要组分并为间质屏障的主要成分。通过催化乙酰透明质酸的水解，乙酰透明质酸降解酶降低乙酰透明质酸的粘性，藉此增加组织渗透性并增加肠胃外给药的液体的吸收速率。因此，乙酰透明质酸降解酶例如透明质酸酶已作为扩散剂或分散剂与其他药剂(agent)、药物和蛋白质一起使用以增强它们的分散和递送。

乙酰透明质酸降解酶的功能为通过裂解乙酰透明质酸多聚体降解乙酰透明质酸，该多聚体由通过交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起的重复的二糖单位D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)组成。乙酰透明质酸链的长度可达到约25000或更多的二糖重复，并且体内乙酰透明质酸的多聚体的大小可约为5000至20000000Da。因此，用于本文所提供的用途和方法的乙酰透明质酸降解酶包括任何具有催化乙酰透明质酸二糖链或多聚体裂解的能力的酶。在一些实施例中，所述乙酰透明质酸降解酶裂解乙酰透明质酸链或多聚体中的β-1→4糖苷键。在其他实施例中，所述乙酰透明质酸降解酶催化乙酰透明质酸链或多聚体中的β-1→3糖苷键的裂解。

如下文所述，乙酰透明质酸降解酶以膜结合或可溶形式存在。为了本文目的，提供可溶性乙酰透明质酸降解酶用于本文的方法、用途、组合物或组合中。因此，当乙酰透明质酸降解酶包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白(anchor)和/或要不然是膜锚定的或不溶的时，本文提供的乙酰透明质酸降解酶为可溶形式的。因此，乙酰透明质酸降解酶包括截短变体，例如被截短以去除全部或部分GPI锚蛋白。本文提供的乙酰透明质酸降解酶也包括可溶性乙酰透明质酸降解酶的等位基因变体或物种变体或其他变体。例如，乙酰透明质酸降解酶可在其一级序列中包含一个或多个变异，例如氨基酸取代、添加和/或缺失。与不包含所述变异的乙酰透明质酸降解酶相比，乙酰透明质酸降解酶的变体一般显示至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。任何变异均可包含于用于本文目的的乙酰透明质酸降解酶中，条件是该酶保留透明质酸酶活性，例如至少为或者约为不含所述变异的乙酰透明质酸降解酶的活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多(通过本领域熟知的和本文描述的体外和/或体内测定法测量)。

1.透明质酸酶

透明质酸酶为乙酰透明质酸降解酶大家族的成员。有三大类透明质酸酶：哺乳动物型透明质酸酶、细菌透明质酸酶和来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶。这些酶可用于本文提供的组合物、组合和方法中。

a.哺乳动物型透明质酸酶

哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)为水解乙酰透明质酸的β-1→4糖苷键产生各种寡糖长度例如四糖和六糖的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，并可降解乙酰透明质酸和硫酸软骨素(CS)(一般为C4-S和C6-S)。这一类型的透明质酸酶包括但不限于来自奶牛(牛)的透明质酸酶(SEQ ID NO：10，11和64以及BH55(美国专利5,747,027和5,827,721))、来自绵羊(绵羊)的(SEQ ID NO：26、27、63和65)、来自黄蜂的(SEQ ID NO：12和13)、来自蜜蜂的(SEQ ID NO：14)、来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO：15)、来自胡蜂的(SEQ ID NO：16)、来自小鼠的(SEQ IDNO：17-19，32)、来自猪的(SEQ ID NO：20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO：22-24，31)、来自家兔的(SEQ ID NO：25)、来自猩猩的(SEQ ID NO：28)、来自食蟹猴的(SEQ ID NO：29)、来自豚鼠的(SEQ ID NO：30)，和人透明质酸酶。本文提供的组合物、组合和方法中的透明质酸酶的示例为可溶性透明质酸酶。

哺乳动物透明质酸酶可进一步细分为主要存在于睾丸提取物中中性活性的那些和主要存在与器官例如肝脏中的酸性活性的那些。示例性的中性活性透明质酸酶包括PH20，包括但不限于得自不同物种的PH20例如得自羊的(SEQ ID NO：27)、得自牛的(SEQ ID NO：11)和得自人的(SEQ IDNO：1)。人PH20(也称作SPAM1或精子表面蛋白PH20)通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白与质膜结合。其天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。

除人PH20(也称作SPAM1)外，已在人类基因组中鉴定出五个透明质酸酶样基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1为假基因，HYAL3(SEQ ID NO：38)未显示具有对任何已知底物的酶活性。HYAL4(显示于SEQ ID NO：39的前体多肽)为软骨素酶并显示很小的对乙酰透明质酸的活性。HYAL1(显示于SEQ ID NO：36的前体多肽)为原型的酸性活性酶，PH20(显示于SEQ ID NO：1的前体多肽)为原型的中性活性酶。酸性活性透明质酸酶例如HYAL1和HYAL2(显示于SEQ ID NO：37的前体多肽)一般在中性pH(即pH7)时缺乏催化活性。例如，HYAL1在大于pH4.5时几乎无体外催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochem.251：263-269)。HYAL2为具有很低的体外特异性活性的酸性活性酶。透明质酸酶样酶也由通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白与质膜结合的那些(例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA100(8)：4580-5))，以及一般为可溶的那些(例如人HYAL1(Frost等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1)：10-5))来表征。

PH20

与其他哺乳动物透明质酸酶一样，PH20也为可水解透明质酸的β-1→4糖苷键产生各种寡糖长度例如四糖和六糖的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性，并可降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)(一般为C4-S和C6-S)。PH20天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。PH20位于精子表面，并在溶酶体衍生的顶体中，在那里其与顶体内膜结合。质膜PH20仅在中性pH下具有透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20在中性和酸性pH下都具有活性。除了为透明质酸酶外，PH20也显示为HA-诱导的细胞信号转导的受体并为环绕卵母细胞的透明带的受体。

示例性PH20蛋白包括但不限于人PH20多肽(显示于SEQ ID NO：1的前体多肽，显示于SEQ ID NO：2的成熟多肽)、猩猩PH20多肽(SEQ IDNO：185)、猕猴PH20多肽(SEQ ID NO：186)、牛PH20多肽(SEQ ID NO：11和64)、家兔PH20多肽(SEQ ID NO：25)、羊PH20(SEQ ID NO：27、63和65)、食蟹猴PH20多肽(SEQ ID NO：29)、豚鼠PH20多肽(SEQ ID NO：30)、大鼠PH20多肽(SEQ ID NO：31)和小鼠PH20多肽(SEQ ID NO：32)。

牛PH20为553个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：11)。牛PH20与人PH20的比对显示仅存在弱同源性，从氨基酸470到各自的羧基端存在多个空位，这归因于牛多肽中无GPI锚蛋白(见例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4：427-440)。事实上，在除人之外的许多其他PH20种类中未预测出明确的GPI锚蛋白。因此，从羊和牛产生的PH20多肽天然以可溶形式存在。尽管牛PH20非常松散地与质膜结合，但是其并未通过磷脂酶敏感的锚蛋白连接(Lalancette等人(2001)Biol Reprod.65(2)：628-36)。牛透明质酸酶的这一特性允许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为提取物用于临床用途

人PH20mRNA转录物正常情况下下翻译生成509个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：1；复制于下文)，其包含在N-端的35个氨基酸信号序列(氨基酸残基位点1-35)和在C-端的19个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白结合信号序列(氨基酸位点491-509)。因此，成熟的PH20为显示于SEQID NO：2的474个氨基酸的多肽。在将前体多肽转运至ER并去除信号肽后，C-端GPI-结合信号肽被裂解以促进GPI锚蛋白与位于对应于SEQ ID NO：1所示前体多肽的490位点的氨基酸位点处新形成的C-端氨基酸共价结合。因此，产生了具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的474个氨基酸的GPI-锚定的成熟多肽。

人PH20前体多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：1；509个氨基酸)：MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSATMFIVSILFLIISSVASL。

人PH20在中性和酸性pH下显示透明质酸酶活性。一方面，人PH20为一般通过GPI锚蛋白锁定至质膜的原型中性活性透明质酸酶。另一方面，PH20表达于顶体内膜，在那里其在中性和酸性pH下具有透明质酸酶活性。显示PH20包含位于该多肽的不同区域的两个催化位点：肽1和肽3区域(Cherr等人，(2001)Matrix Biology 20：515-525)。证据表明对应于SEQ IDNO：2所示成熟多肽的氨基酸位点107-137和SEQ ID NO：1所示前体多肽的位点142-172的PH20的肽1区是在中性pH下的酶活性必需的。这一区内位点111和113处的氨基酸(对应于SEQ ID NO：2所示的成熟PH20多肽)显示对于活性是重要的，因为氨基酸替换突变分别得到与野生型PH20相比具有3％透明质酸酶活性或不可检测的透明质酸酶活性的PH20多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。

对应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的氨基酸位点242-262和SEQ IDNO：1所示前体多肽的位点277-297的肽3区对于在酸性pH下的酶活性是重要的。在这一区内，成熟PH20多肽的位点249和252处的氨基酸对于活性是必需的，二者中任何一个的突变得到基本无活性的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。

除了催化位点，PH20也包含透明质酸结合位点。试验证据显示该位点位于肽2区内，肽2区对应于SEQ ID NO：1所示前体多肽的氨基酸位点205-235和SEQ ID NO：2所示成熟多肽的位点170-200。这一区在透明质酸酶中高度保守并与肝素结合模体相似。位点176处的精氨酸残基(对应于SEQ ID NO：2所示的成熟PH20多肽)突变至甘氨酸得到仅具有野生型多肽的透明质酸酶活性的约1％的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。

在人PH20中在SEQ ID NO：1所示多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处存在七个潜在的N-联糖基化位点。由于SEQ ID NO：1的氨基酸36至464显示包含最小活性的人PH20透明质酸酶结构域，所以N-联糖基化位点N-490不是适当的透明质酸酶活性必需的。人PH20中有六个二硫键。两个二硫键在SEQ ID NO：1所示多肽的半胱氨酸残基C60和C351以及C224和C238之间(分别对应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的残基C25和C316，以及C189和C203)。另外的四个二硫键形成于SEQ IDNO：1所示多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间；C381和C435之间；C437和C443之间；以及C458和C464之间(分别对应于SEQ ID NO：2所示成熟多肽的残基C341和C352之间；C346和C400之间；C402和C408之间；以及C423和C429之间)。

b.细菌透明质酸酶

细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)降解乙酰透明质酸，并在不同程度上降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。分离自细菌的乙酰透明质酸裂解酶与透明质酸酶(来自其他来源，例如透明质酸氨基葡糖苷酶EC 3.2.1.35)在它们的作用方式上存在差异。它们为催化乙酰透明质酸的N-乙酰-β-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基之间的β1→4-糖苷键的消除反应而不是水解反应从而得到3-(4-脱氧-β-D-gluc-4-enuronosyl)-N-乙酰-D-葡糖胺四糖和六糖以及二糖终产物的内切-β-N-乙酰己糖胺酶。该反应形成在非还原末端具有不饱和抗坏血酸残基的寡糖。

用于本文所提供的组合物、组合和方法中的来自细菌的透明质酸酶的示例包括但不限于微生物中的乙酰透明质酸降解酶，包括节杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、梭菌属(Clostridium)、细球菌属(Micrococcus)、链球菌属、消化球菌属(Peptococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和链霉菌属(Streptomyces)的菌株。这些酶的具体实例包括但不限于节杆菌属(菌株FB24)(SEQ ID NO：67)、食菌蛭弧菌(SEQ IDNO：68)、痤疮丙酸杆菌(SEQ ID NO：69)、无乳链球菌((SEQ ID NO：70)；18RS21(SEQ ID NO：71)；血清型Ia(SEQ ID NO：72)；血清型III(SEQ IDNO：73)、金黄色葡萄球菌(菌株COL)(SEQ ID NO：74)；菌株MRSA252(SEQID NO：75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO：77)；菌株NCTC 8325(SEQID NO：78)；菌株牛RF 122(SEQ ID NO：79和80)；菌株USA300(SEQ IDNO：81)、肺炎链球菌((SEQ ID NO：82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ IDNO：83)；血清型2，菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO：84)、酿脓链球菌(血清型M1)(SEQ ID NO：85)；血清型M2，菌株MGAS10270(SEQ ID NO：86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ ID NO：87)；血清型M6(SEQ ID NO：88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ ID NO：89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQ ID NO：91)；血清型M28(SEQ ID NO：92)；猪链球菌(SEQID NO：93-95)；费氏弧菌(菌株ATCC 700601/ES114(SEQ ID NO：96))，以及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对透明质酸具有特异性并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.和Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198：607)。

c.来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶

来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)为可生产四糖和六糖终产物的内切-β-葡糖醛酸糖苷酶。这些酶催化透明质酸盐中β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1→3-连接的水解。来自水蛭的示例性透明质酸酶包括但不限于来自水蛭科(Hirudinidae)(例如欧洲医蛭(Hirudo medicinalis))、石蛭科(Erpobdellidae)(例如，Nephelopsisobscura和Erpobdella punctata)、舌蛭科(Glossiphoniidae)(例如Desserobdella picta、静泽蛭(Helobdella stagnalis)、扁舌蛭(Glossiphoniacomplanata)、润饰盾蛭(Placobdella ornata)和Theromyzon sp.)以及黄蛭科(Haemopidae)(马蛭(Haemopis marmorata))的透明质酸酶(Hovingh等人(1999)Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.124(3)：319-26)。与水蛭透明质酸酶具有相同作用机制的来自细菌的示例性透明质酸酶为来自蓝细菌聚球藻(Synechococcus sp.)(菌株RCC307，SEQ ID NO：97)的透明质酸酶。

2.其他乙酰透明质酸降解酶

除了透明质酸酶家族，其他乙酰透明质酸降解酶可与本文提供的组合物、组合和方法中的速效胰岛素一起使用。例如，可使用包括具体的软骨素酶和裂解酶在内的具有裂解乙酰透明质酸的能力的酶。可降解乙酰透明质酸的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素果胶酶)和软骨素C裂解酶。用于本文提供的组合物、组合和方法中的这些酶的生产和纯化方法为本领域已知的(例如美国专利6,054,569；Yamagata，等人(1968)J.Biol.Chem.243(7)：1523-1535；Yang等人(1985)J.Biol.Chem.160(30)：1849-1857)。

软骨素ABC裂解酶包括两种酶，硫酸软骨素ABC内解酶(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外解酶(EC 4.2.2.21)(Hamai等人(1997)J Biol Chem.272(14)：9123-30)，它们降解多种硫酸软骨素型和硫酸皮肤素型糖胺聚糖。硫酸软骨素、硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素是硫酸软骨素ABC内解酶的优选底物，但是该酶也可以较低速率作用于乙酰透明质酸。硫酸软骨素ABC内解酶降解多种硫酸软骨素型和硫酸皮肤素型糖胺聚糖，产生不同大小的Δ4-不饱和寡聚糖的混合物，所述不饱和寡聚糖最终被降解成Δ4-不饱和的四糖和二糖。硫酸软骨素ABC外解酶具有相同的底物特异性但是可从聚合硫酸软骨素和它们由硫酸软骨素ABC内解酶产生的寡糖片段的非还原末端去除二糖残基(Hamai，A.等人(1997)J.Biol.Chem.272：9123-9130)。示例性硫酸软骨素ABC内解酶和硫酸软骨素ABC外解酶包括但不限于来自普通变形杆菌和肝黄黄杆菌的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内解酶示于SEQ ID NO：98)(Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1)：39-46)。

软骨素AC裂解酶(EC 4.2.2.5)对硫酸软骨素A和C、软骨素和透明质酸具有活性，但是对硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)无活性。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于分别显示于SEQ ID NO：99和100的来自肝黄黄杆菌和Victivallis vadensis的那些(Tkalec等人(2000)Applied andEnvironmental Microbiology 66(1)：29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology 30(5)：387-444)。

软骨素酶C裂解硫酸软骨素C，产生四糖和不饱和的6-硫酸化的二糖(ΔDi-6S)。它也裂解透明质酸，产生不饱和的非硫酸化二糖(ΔDi-OS)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属和黄杆菌属的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2)：121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251：1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262：127-133)。

3.可溶性乙酰透明质酸降解酶

本文组合物、组合和方法中提供了包括可溶性透明质酸酶在内的可溶性乙酰透明质酸降解酶。可溶性乙酰透明质酸降解酶包括以可溶形式存在的任何乙酰透明质酸降解酶，包括但不限于可溶性透明质酸酶，包括非人类的可溶性透明质酸酶，包括非人类的动物可溶性透明质酸酶、细菌可溶性透明质酸酶和人透明质酸酶、Hyal1、牛PH20和羊PH20、它们的等位基因变体以及它们的其他变体。例如，可溶性乙酰透明质酸降解酶包括被修饰为可溶性的任何乙酰透明质酸降解酶，包括美国临时专利申请第61/201,384号(通过援引以其整体纳入本文)中记载的任何乙酰透明质酸降解酶。例如包含GPI锚蛋白的乙酰透明质酸降解酶可通过截短或去除全部或部分GPI锚蛋白而成为可溶性的。在一个实施例中，正常情况下通过GPI锚蛋白锚定于膜的人透明质酸PH20可通过截短或去除全部或部分C-端的GPI锚蛋白而成为可溶性的。

可溶性乙酰透明质酸降解酶也包括中性活性和酸性活性的透明质酸酶。根据例如但不限于给药后期望的酶活性水平和/或给药部位的因素，可选择中性活性和酸性活性的透明质酸酶。在具体的实施例中，用于本文的组合物、组合和方法中的乙酰透明质酸降解酶为可溶性中性活性的透明质酸酶。

示例性可溶性透明质酸酶为来自任何物种的PH20，例如SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和85-186中任一所示的任何PH20，或它们缺乏全部或部分C-端GPI锚蛋白的截短形式，只要该透明质酸酶是可溶性的并保留透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶也包括SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和185-186中任一的等位基因变体或其他变体，或它们的截短形式。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知的，并包括与SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30、31、63-65和185-186中任一具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高序列相同性的多肽、或其截短形式。氨基酸变体包括保守和非保守突变。应理解，对于透明质酸的活性是重要的或必需的残基，如任意上文所述或本领域技术人员已知的，一般是不变的。这些包括例如活性位点残基。因此，例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(对应于SEQ ID NO：2所示成熟PH20多肽的残基)一般是不变的并且不被改变。提供正确折叠必需的糖基化和二硫键的形成的其他残基也可以是不变的。

在一些情况下，可溶性乙酰透明质酸降解酶通常为GPI锚定的(例如，人PH20)并通过在C-端截短变得可溶。这些截短物可去除全部的GPI锚蛋白结合信号序列或可仅去除部分的GPI锚蛋白结合信号序列。然而，所得多肽为可溶的。在可溶性乙酰透明质酸降解酶保留部分的GPI锚蛋白结合信号序列的情况中，可保留1、2、3、4、5、6、7或更多个GPI锚蛋白结合信号序列中的氨基酸残基，条件是该多肽为可溶的。将包含一个或多个GPI锚蛋白的氨基酸的多肽称作延长的乙酰透明质酸降解酶。本领域的技术人员可使用本领域熟知的方法测定多肽是否为GPI锚定的。这些方法包括但不限于使用已知算法预测GPI锚蛋白结合信号序列和ω-位点的存在和位置，并在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)进行消化之前和之后进行溶解度分析。

延长的可溶性乙酰透明质酸降解酶可通过制备任何天然地GPI锚定的乙酰透明质酸降解酶的C-端截短物来产生，从而所得多肽为可溶的并包含来自GPI锚蛋白结合信号序列的一个或多个氨基酸残基。C端被截短但保留部分的GPI锚蛋白结合信号序列的示例性延长的可溶性乙酰透明质酸降解酶包括但不限于灵长类来源的延长的可溶PH20(esPH20)多肽，例如人和猩猩esPH20多肽。例如，可通过将SEQ ID NO：1、2或185所示成熟的或前体多肽或它们的等位基因变体或其他变体(包括它们的活性片段)中任一进行C端截短，产生esPH20多肽，其中所得多肽为可溶的并保留来自GPI锚蛋白结合信号序列的一个或多个氨基酸残基。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知的，并包括与SEQ ID NO：1或2中任一具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高序列相同性的多肽。与野生型多肽例如具有SEQ ID NO：1、2或185所示序列的多肽相比，可将本文提供的esPH20多肽在C-端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸，条件是所得esPH20多肽为可溶的并保留来自GPI锚蛋白结合信号序列的一个或多个氨基酸。

通常，为了用于本文的组合物、组合和方法，使用可溶性人乙酰透明质酸降解酶，例如可溶性人PH20。尽管可使用来自其他动物的乙酰透明质酸降解酶例如PH20，但是这些制剂均有潜在的免疫原性，因为它们为动物蛋白。例如，大部分患者显示继发于摄入的食物的早期致敏(priorsensitization)，并且因为这些是动物蛋白，所有的患者具有后续致敏的风险。因此，非人类的制剂可能不适于长期使用。如果需要非人类的制剂，本文也包括对这些多肽进行制备以具有降低的免疫原性。这些修饰在本领域技术人员的水平之内并可包括例如去除和/或替换分子上的一个或多个抗原表位。

用于本文方法中的包括透明质酸酶(例如PH20)在内的乙酰透明质酸降解酶可以是重组产生的或可以纯化或部分纯化自天然来源例如睾丸提取物。产生包括重组乙酰透明质酸降解酶在内的重组蛋白的方法提供于本文其他部分并为本领域熟知。

a.可溶性人PH20

示例性可溶性透明质酸酶为可溶性人PH20。已产生了重组人PH20的可溶形式并可用于本文描述的组合物、组合和方法中。PH20的这些可溶形式的产生描述于公布的美国专利申请US20040268425、US 20050260186和US20060104968(通过援引以其整体纳入本文)和下文的实施例中。例如，可溶性PH20多肽包括这样的C端截短的变体多肽，其包含SEQ ID NO：1中的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1中包含的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、95％，、97％、98％的序列相同性，保留透明质酸酶活性并为可溶的。这些多肽包括完全缺乏全部的或部分的GIP锚蛋白结合信号序列的可溶性PH20多肽。也包括包含至少一个GPI锚蛋白的氨基酸的延长的可溶性PH20(esPH20)多肽。因此，这些多肽是被分泌的并且是可溶的，而不是具有在ER中与蛋白的C端共价结合的GPI锚蛋白并被锚定至质膜的外片(extracellular leaflet)。与全长野生型多肽例如具有SEQID NO：1或2所示序列的全长野生型多肽或其等位基因变体或物种变体或其他变体相比，C端截短的PH20多肽可在C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、5、60或更多个氨基酸。

本文提供的示例性C端截短的人PH20多肽包括具有C端截短以生成包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸1到氨基酸465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、或者其等位基因变体或物种变体的对应位点的多肽的任意C端截短的人PH20多肽。当表达于哺乳细胞时，在加工过程中35个氨基酸的N-端信号序列被裂解，分泌该蛋白质的成熟形式。因此，成熟的C端截短的可溶性PH20多肽的示例可包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸36至465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、或者其等位基因变体或物种变体的对应位点。表4提供了包括C断截短的可溶性PH20多肽在内的示例性C端截短的PH20多肽的非限制性实例。在下文表4中，提供了前体和成熟多肽的长度(以氨基酸计)以及其中显示C端截短PH20蛋白的前体和成熟多肽的示例性氨基酸序列的序列标识(SEQ ID NO)。野生型PH20多肽也包括于表4中用于比较。

表4.示例性C-端截短的PH20多肽

可溶形式包括但是不限于具有C-端截短以生成包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸467、477、478、479、480、481、482和483的多肽的任意可溶形式。当表达于哺乳动物细胞时，35个氨基酸的N-端信号肽在加工过程中被裂解，并分泌该蛋白的成熟形式。因此，成熟的可溶性多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸36至467、477、478、479、480、481、482和483。在氨基酸位点477至483(对应于SEQ ID NO：1所示前体多肽)结束的缺失突变体显示比全长的GPI-锚定形式更高的分泌型透明质酸酶活性。因此，示例性的可溶性透明质酸酶为如SEQ ID NO：4-9或者其等位基因变体或物种变体或其他变体中任一所示的长度为442、443、444、445、446或447个氨基酸的可溶性人PH20多肽。

因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的，所以一般使用有助于正确的N-糖基化的蛋白表达系统来产生PH20的可溶形式以确保该多肽保留活性。这些细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。

b.rHuPH20

已生成了人PH20的重组可溶形式并可用于本文提供的组合物、组合和方法中。这些可溶形式的重组人PH20的生成记载于公布的美国专利申请US20040268425、US 20050260186和US20060104968以及下文的实施例2-6中。该类多肽的示例为由编码氨基酸1-482(显示于SEQ ID NO：3)的核酸分子生成的那些。这样的核酸分子的示例显示于SEQ ID NO：49。翻译后加工去除了35个氨基酸的信号序列，剩余447个氨基酸的可溶性重组人PH20(SEQ ID NO：4)。由于在培养基中产生，所以C-端存在异质性，使得命名为rHuPH20的产物包含不同种的混合物，其可包含各种丰度的SEQ IDNO.4-9中的任何一个或多个。通常，rHuPH20产生于有助于正确的N-糖基化以保留活性的细胞例如CHO细胞(例如，DG44CHO细胞)中。

4.乙酰透明质酸降解酶的糖基化

包括透明质酸酶在内的一些乙酰透明质酸降解酶的糖基化包括N-和O-联糖基化对于它们的催化活性和稳定性是重要的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解度和稳定性具有显著作用，但是认为为了最佳的酶活性，大多数酶不需要糖基化。对于一些透明质酸酶，去除N-联糖基化可引起透明质酸酶活性接近完全失活。因此，对于这些透明质酸酶，N-联聚糖的存在对于生成活性的酶是必需的。

N-联寡糖分属几种主要类型(寡甘露糖型、复合型、杂合型(hybrid)、硫酸化型)，其全部具有通过属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不为Pro)的Asn残基的酰胺氮连接的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。对于凝固蛋白C(coagulation protein C)在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化已有报道。在某些情况下，乙酰透明质酸降解酶例如透明质酸酶可既含有N-糖苷键也含有O-糖苷键。例如，PH20具有O-联寡糖以及N-联寡糖。在SEQ ID NO：1所示的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处存在七个潜在的N-联糖基化位点。如上文所述，N490处的N-联糖基化不是透明质酸酶活性必需的。

在一些实施例中，用于本文提供的组合物、组合和/或方法中的乙酰透明质酸降解酶在一个或所有的糖基化位点上被糖基化。例如，对于人PH20或其可溶形式而言，对应于SEQ ID NO：1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的糖基化位点的2、3、4、5或6个被糖基化。在一些实施例中，所述乙酰透明质酸降解酶在一个或多个天然糖基化位点被糖基化。在其他实施例中，所述乙酰透明质酸降解酶在一个或多个非天然的糖基化位点被修饰提供该多肽在一个或多个另外的位点处的糖基化。在这些实施例中，另外的糖部分的结合可增强分子的药动学性质，例如改善半衰期和/或提高活性。

在其他实施例中，用于本文提供的组合物、组合和/或方法中的乙酰透明质酸降解酶为部分去糖基化的(或N-部分糖基化的多肽)。例如，保留完全糖基化的透明质酸酶的全部或部分透明质酸酶活性的部分去糖基化的可溶性PH20多肽可用于本文提供的组合物、组合和/或方法中。示例性的部分去糖基化的透明质酸酶包括来自任何物种例如SEQ ID NO：1、2、11、25、27、29、30、31、32、63、65、185和186、或者它们的等位基因变体、截短变体或其他变体中任一所示的任何物种的可溶形式的部分去糖基化的PH20多肽。这些变体为本领域技术人员已知的并包括与SEQ ID NO：1、2、11、25、27、29、30、31、32、63、65、185和186中任一具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高序列相同性的多肽或其截短形式。本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶也包括杂合型、融合型和嵌合型部分去糖基化透明质酸酶，以及部分去糖基化的透明质酸酶缀合物。

糖苷酶或糖苷水解酶为催化糖苷键的水解以生成两个更小的糖的酶。脊椎动物中N-聚糖的主要类型包括高甘露糖型聚糖、杂合型聚糖和复合型聚糖。有几种仅引起部分的蛋白质去糖基化的糖苷酶，包括：EndoF1，其裂解高甘露糖型和杂合型聚糖；EndoF2，其裂解二分支的(biantennary)复合型聚糖；EndoF3，其裂解二分支的和更多分支的复合型聚糖；以及EndoH，其裂解高甘露糖型和杂合型聚糖。用一种或所有这些糖苷酶处理乙酰透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶如可溶性PH20仅能引起部分去糖基化，并因此保留了透明质酸酶活性。

可通过用一种或多种糖苷酶(通常为不去除所有N-聚糖但是仅使蛋白质部分去糖基化的糖苷酶)进行消化，来产生部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶，例如部分去糖基化的可溶性透明质酸酶。例如，用一种或多种上述糖苷酶(例如EndoF1、EndoF2和/或EndoF3)处理PH20(例如命名为rHuPH20的重组PH20)引起部分去糖基化。这些部分去糖基化的PH20多肽可显示与完全糖基化的多肽类似的透明质酸酶酶活性。相反，用PNGaseF(裂解所有N-聚糖的糖苷酶)处理PH20引起所有N-聚糖的全部去除并藉此使得PH20无酶活性。因此，尽管所有的N-联糖基化位点(例如，位于SEQ ID NO：1所示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的那些)可被糖基化，但是，与未用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比，用一种或多种糖苷酶处理可使糖基化程度降低。

包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽的部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶可具有完全糖基化的多肽的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。通常，包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽在内的部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶显示的透明质酸酶活性是完全糖基化的多肽显示的透明质酸酶活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。

5.修饰乙酰透明质酸降解酶以改善它们的药动学性质

可以修饰乙酰透明质酸降解酶以改善它们的药动学性质，例如增加它们的体内半衰期和/或活性。用于本文提供的组合物、组合和/或方法中的乙酰透明质酸降解酶的修饰可包括直接或通过接头间接连接，例如共价地或通过其他稳定的键、聚合物(例如葡聚糖、聚乙二醇(聚乙二醇化(PEG))或唾液酸基(sialyl)部分)或其他这样的聚合物(例如天然的或糖聚合物)连接。

已知药物的聚乙二醇化可增加对蛋白质水解的抗性、增加血浆半衰期并减少抗原性和免疫原性。因此，聚合物分子例如聚乙二醇部分(PEG)与乙酰透明质酸降解酶的共价或其他稳定连接(缀合)可赋予所得的酶-聚合物复合物(composition)有益的性质。这些性质包括提高的生物相容性、在个体血液、细胞和/或其他组织中的蛋白质(和酶活性)的半衰期延长、有效保护蛋白质不被蛋白酶作用和水解、提高生物分布、增强药动学和/或药效学以及增加水溶性。

可与乙酰透明质酸降解酶缀合的示例性聚合物包括天然的和合成的同聚物，例如多元醇(即，多-OH)、多胺(即，多-NH2)和多羧酸(即，多-COOH)，以及另外的杂聚物，即包含一种或多种不同的偶联基团例如羟基和氨基的聚合物。合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，例如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚丙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链聚丙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯-马来酸酐共聚物、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、芽霉菌糖(pullulan)、胰岛素、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸水解物和生物聚合物。

通常，所述聚合物为聚亚烷基氧化物(PAO)，例如聚氧化乙稀，如PEG，典型的为mPEG，其与多糖例如葡聚糖、芽霉菌糖等相比具有很少的能够交联的反应性基团。通常，所述聚合物为无毒性的聚合物分子例如可以使用相对简单的化学方法与乙酰透明质酸降解酶共价缀合(例如与蛋白质表面的基团结合)的(m)聚乙二醇(mPEG)。

用于与乙酰透明质酸降解酶连接的合适的聚合物分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEGs和聚氧化乙烯(见，例如Roberts等人，Advanced Drug Delivery Review 2002，54：459-476；Harris和Zalipsky，S(eds.)″Poly(ethylene glycol)，Chemistry and BiologicalApplications″ACS Symposium Series 680，1997；Mehvar等人，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136，2000；Harris，Nature Reviews 2：215 et seq.(2003)；以及Tsubery，J Biol.Chem 279(37)：38118-24，2004)。所述聚合物分子的分子量通常可以是约3kDa至约60kDa。在一些实施方案中，与蛋白质例如rHuPH20缀合的聚合物分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa的分子量。

通过共价连接(缀合)PEG或PEG衍生物(即“PEG化”)来修饰多肽的多种方法为本领域已知的(见，例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。PEG化技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见，例如Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476，2002)，将多个PEG部分连接到单个缀合位点(例如通过使用支链PEG；见，例如Veronese等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180，2002)，位点特异性PEG化和/或单-PEG化(见，例如Chapman等人，Nature Biotech.17：780-783，1999)和定点酶促PEG化(参见，例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54：487-504，2002)(也见，例如Lu和Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.43：127-138；Lu和Felix(1993)Peptide Res.6：142-6，1993；Felix等人(1995)Int.J.PeptideRes.46：253-64；Benhar等人(1994)J.Biol.Chem.269：13398-404；Brumeanu等人(1995)J Immunol.154：3088-95；也见，Caliceti等人(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55(10)：1261-77以及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt2)：3S-8S)。本领域描述的方法和技术可产生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个PEG或PEG衍生物与单个蛋白质分子结合的蛋白质(参见，例如U.S.2006/0104968)。

本领域记载了许多用于PEG化的试剂。这些试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)活化的PEG、琥珀酰亚氨基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酸亚氨基酯、同基双功能PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯、同基双功能PEG-丙醛、同基双功能PEG-丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、邻-硝基苯基-羧酸酯PEG、mPEG-苯并三唑羧酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支链mPEG2丁醛、乙酰基mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG″无接头″马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG正吡啶基硫代酸酯、mPEG正吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见，例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6：62-69，1995；Veronese等人，J.Bioactive CompatiblePolymers 12：197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,183,550；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US  2004/0235734；U.S.2005/000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 01064951；EP 0822199；WO 00176640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。

在一个实施例中，用于所提供的方法、组合物和组合中的乙酰透明质酸降解酶为PEG化的可溶性透明质酸酶。在具体的实施例中，所述可溶性透明质酸酶为PEG化的PH20透明质酸酶。在另一具体的实施例中，所述可溶性透明质酸酶为PEG化的rHuPH20，例如实施例10所述的。

E.产生编码胰岛素或乙酰透明质酸降解酶及其多肽的核酸的方法

本文所述胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的多肽可通过本领域熟知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。多肽也可为化学合成的。例如，可化学合成胰岛素的A-链和B-链，接着通过二硫键例如经还原-再氧化反应交联。当通过重组方法产生多肽时，可使用本领域技术人员已知的任何用于鉴定编码期望的基因的核酸的方法。可使用本领域可用的任何方法从例如细胞或组织来源获得编码透明质酸酶的全长(即包含完整的编码区域)cDNA或基因组DNA克隆。经修饰的或变体胰岛素或乙酰透明质酸降解酶可从野生型多肽通过例如定点突变经工程化获得。

可使用本领域已知的任何可获得的用于克隆和分离核酸分子的方法克隆和分离多肽。这些方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。

可使用用于核酸扩增的方法来分离编码期望的多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应(PCR)法。可将包含核酸的材料用作起始材料，由其可分离期望的编码多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病个体的样品可用于扩增方法。核酸文库也可用作起始材料的来源。可设计引物以扩增期望的多肽。例如，可基于产生期望的多肽的表达的序列来设计引物。可基于多肽氨基酸序列的回译来设计引物。可对通过扩增生成的编码期望的多肽的核酸分子进行测序和验证。

另外的核苷酸序列可结合至编码多肽的核酸分子，包括接头序列，其包含用于将合成基因克隆到载体例如蛋白表达载体或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体的限制性内切核酸酶位点。此外，可通过操作将限定(specify)功能DNA元件的另外的核苷酸序列与编码多肽的核酸分子操作连接。这些序列的实例包括但不限于设计用于促进胞内蛋白表达的启动子序列，设计用于促进蛋白质分泌的分泌序列例如异源信号序列。这些序列为本领域技术人员已知的。也可将另外的核苷酸残基序列例如限定蛋白质结合区域的碱基序列与编码酶的核酸分子连接。这些区域包括但不限于促进或编码这样的蛋白质的残基序列，所述蛋白质促进将酶摄取入到特异靶细胞，或者改变合成基因的产物的药动学。例如，可将酶与PEG部分连接。

此外，可加入标记或其他部分例如以辅助多肽的检测或亲和纯化。例如，也可将另外的核苷酸残基序列例如限定表位标记或其他可检测标记的碱基序列与编码酶的核酸分子连接。示例性的这些序列包括编码His标记的核酸序列(例如，6xHis，HHHHHH；SEQ ID NO：54)或Flag Tag(DYKDDDDK；SEQ ID NO：55)。

接着可将已鉴定和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可使用本领域已知的大量的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或经修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这些载体包括但不限于噬菌体例如λ衍生物，或质粒例如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。其他表达载体包括本文举例说明的HZ24表达载体。插入到克隆载体中可例如通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体来实现。可使用TOPO克隆载体(INVITROGEN，Carlsbad，CA)实现插入。如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，可酶法修饰该DNA分子的末端。或者，可通过连接核苷酸序列(接头)至该DNA末端来产生任何所需的位点；这些连接的接头可包含编码限制性内切核酸酶识别序列的特定的化学合成的寡核苷酸。在备选方法中，被裂解的载体和蛋白质基因可通过同聚物加尾来修饰。可通过例如转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔将重组分子引入宿主细胞中。

可使用多种技术产生胰岛素(见，例如Ladisch等人(1992)Biotechnol.Prog.8：469-478)。在一些实施例中，将编码前胰岛素原或胰岛素原多肽的核酸插入表达载体中。表达后，通过可裂解信号序列和/或C肽的酶法或化学方法将前胰岛素原或胰岛素原转化成胰岛素，得到经例如还原-再氧化反应通过二硫键交联的A链和B-链(参见，例如Cousens等人，(1987)Gene61：265-275，Chance等人，(1993)Diabetes Care 4：147-154)。在另一实施例中，将编码胰岛素A-链和B-链的核酸插入一个或两个表达载体中用于从一个表达载体共表达为单一的多肽，或者从一个或两个表达载体表达为两个多肽。因此，可分别表达A-链和B-链多肽，然后组合以生成胰岛素，或可在缺乏C-链的情况下共表达。在A-链和B-链共表达为单一多肽的情况中，编码该亚基的核酸也可编码B-链和A-链之间的接头或间隔区，例如下文描述的接头或间隔区。插入到表达载体中的核酸可包含例如编码胰岛素B-链、接头例如丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸接头以及A-链的核酸，导致表达例如“胰岛素B链-Ala-Ala-Lys-胰岛素A链”。

在特定的实施方案中，用包含分离的蛋白质基因、cDNA、或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生该基因的多个拷贝。因此，通过使转化体生长、从所述转化体中分离所述重组DNA分子，并且必要时从所述分离的重组DNA中回收插入的基因，可大量获得该基因。

1.载体和细胞

为了一个或多个期望的蛋白质例如本文所述的任何蛋白质的重组表达，可将包含编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或部分的核酸插入到合适的表达载体中，即包含用于所插入的蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。也可由酶基因和/或它们的侧翼区的天然启动子提供必要的转录和翻译信号。

本文也提供包含编码酶的核酸的载体。本文也提供包含所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，并且所述载体为任何适合用于其中的载体。

本文提供了包含所述载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这些细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过使以上所述的细胞在该细胞表达编码的蛋白质的条件下生长并回收表达的蛋白质，将所述细胞用于产生其蛋白质。用于本文目的，例如，所述酶可被分泌到培养基中。

本文提供包含编码与天然或异源信号序列偶联的可溶性透明质酸酶多肽的核苷酸序列以及其多个拷贝的载体。可选择所述载体用于将所述酶蛋白表达在细胞中或使所述酶蛋白表达为分泌型蛋白。

可使用多种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒和其他病毒)感染的哺乳动物系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；包含酵母载体的微生物例如酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件具有不同的长度和特异性。根据所使用的宿主-载体系统，可使用许多合适的转录和翻译元件中的任一种。

可使用本领域技术人员已知的任何用于将DNA片段插入载体的方法构建包含嵌合基因(包含合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列)的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体(遗传重组)。编码蛋白质或其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可用另一核酸序列来调控，从而使该基因或其片段表达于用重组DNA分子转化的宿主中。例如，可用本领域已知的任何启动子/增强子来控制蛋白质的表达。在特定的实施方案中，启动子对于期望的蛋白的基因而言不是天然的。可使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist和Chambon，Nature 290：304-310(1981))、包含于劳氏肉瘤病毒3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人Cell 22：787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))；也参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”：in Scientific American242：79-94(1980))；包含胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrara-Estrella等人，Nature 303：209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Garder等人，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))，以及光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人，Nature 310：115-120(1984))；来自酵母和其他真菌的启动子例如Gal4启动子、乙醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子以及下列显示组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz等人，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology7：425-515(1987))；在胰脏β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan等人，Nature 315：115-122(1985))，在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，Cell 38：647-658(1984)；Adams等人，Nature318：533-538(1985)；Alexander等人，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，Cell 45：485-495(1986))，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinckert等人，Genes and Devel.1：268-276(1987))，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer等人，Science 235：53-581987))，在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，Genes and Devel.1：161-171(1987))，在髓样细胞中具有活性的β珠蛋白基因控制区(Magram等人，Nature315：338-340(1985)；Kollias等人，Cell 46：89-94(1986))，在脑少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人，Cell 48：703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，Nature314：283-286(1985))以及在下丘脑的促性腺激素细胞中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，Science 234：1372-1378(1986))。

在特定的实施方案中，所使用的载体包含与编码期望的蛋白或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸操作性地连接的启动子、一个或多个复制起点以及任选的一个或多个可选标记(例如抗生素抗性基因)操作。用于转化大肠杆菌(E.coli)细胞的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen，Valencia，CA；也可参见Qiagen出版的描述该系统的文献)。pQE载体具有用于提供重组蛋白在大肠杆菌中的严格调控的、高水平的表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和两个lac操作子阻抑模块，用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)、6XHis标记编码序列、t₀和T1转录终止子、ColE1复制起点以及用于使其具有氨苄西林抗性的β内酰胺酶基因。pQE载体能够将6xHis标记置于重组蛋白的N-或C-端。这些质粒包括为所有三个阅读框提供多克隆位点并提供N-端6xHis标记的蛋白的表达的pQE 32、pQE 30和pQE 31。用于转化大肠杆菌细胞的其他示例性质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496；可获自NOVAGEN，Madison，WI；也可见Novagen出版的描述该系统的文献)。这些质粒包括pET 11a，其包含T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操作子以及lac阻遏基因；pET 12a-c，其包含T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(NOVAGEN，Madison，WI)，其包含用于使用His柱纯化的His-Tag^TM前导序列和允许在所述柱上纯化后进行裂解的凝血酶裂解位点、T7-lac启动子区和T7终止子。

示例性哺乳动物细胞表达载体为HZ24表达载体。该HZ24表达载体衍生自pCI载体骨架(Promega)。它包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。该表达载体也具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。

2.接头部分

在一些实施例中，通过生成具有接头的A-链和B-链的多肽使得例如B-链的C-端可通过短接头与A-连的N-端结合而生成胰岛素。A-链和B-链可表达来自包含接头的单个多肽，或可分别表达后通过接头结合。根据所需性质选择接头部分。接头部分应足够长并且具有足够的柔性，使得A-链和B-链可以模拟胰岛素的天然构象。接头可为适合胰岛素A-链和B-链的任何部分。这些部分包括但不限于肽连接(peptidic linkage)；氨基酸键和肽键，通常包含一个至约60个氨基酸；化学接头，例如异基双功能可裂解的交联接头、光可裂解的(photocleavable)接头和酸可裂解的(acid cleavable)接头。

所述接头部分可为肽。该肽通常具有约2个至约60个氨基酸残基，例如约5个至约40个，或约10个至约30个氨基酸残基。肽接头可方便地由核酸编码并在宿主细胞例如大肠杆菌中表达后被整合在融合蛋白中。在一个实施例中，丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸(AAK)(SEQ ID NO：178)接头由编码胰岛素B-链的核酸和编码A-链的核酸之间的核酸编码，从而在表达后产生“胰岛素B-链-AAK-胰岛素A链”多肽。肽接头可为柔性间隔区氨基酸序列，例如单链抗体研究中已知的那些。这些已知的接头部分的实例包括但不限于RPPPPC(SEQ ID NO：166)或SSPPPPC(SEQ ID NO：167)、GGGGS(SEQ ID NO：168)、(GGGGS)_n(SEQ.ID NO：169)、GKSSGSGSESKS(SEQ IDNO：170)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ.ID  NO：171)、GSTSGSGKS SEGSGSTKG(SEQ ID NO：172)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQID NO：173)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：174)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO：175)、SRSSG(SEQ.ID NO：176)和SGSSC(SEQ ID NO：177)。

或者，所述肽接头部分可为VM(SEQ ID NO：179)或AM(SEQ ID NO：180)，或所述肽接头部分具有式AM(G_2-4S)_xAM所描述的结构，其中X为从1到11的整数(SEQ ID NO：181)。另外的连接部分记载于例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883；Whitlow，M.等人(1993)Protein Engineering 6：989-995；Newton等人(1996)Biochemistry 35：545-553；A.J.Cumber等人(1992)Bioconj.Chem.3：397-401；Ladurner等人(1997)J.Mol.Biol.273：330-337；和美国专利4,894,443。

在一些实施例中，肽接头由核酸编码并在于宿主细胞例如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达后被整合在B-链和A-链之间。在其他实施例中，肽接头为通过化学方法合成的。这可在与一个或多个A-链和B-链的合成分开的方案中实施，之后例如使用异基双功能接头将这些组件连接。或者，肽接头可在胰岛素链之一的N-或C-末端合成，然后通过该肽接头例如异基双功能接头将该链与另一条链连接。

本领域技术人员已知的任何接头均可用于本文以连接胰岛素A-链和B-链。适用于化学连接这些链的接头和键包括但不限于二硫键、硫醚键、受阻的二硫键(hindered disulfide bond)以及游离反应性基团例如胺和硫醇基之间的共价键。通过使用异基双功能试剂在这些多肽之一或其二者上产生反应性硫醇基团，接着使一个多肽上的硫醇基团与另一多肽上的反应性硫醇基团或胺基团(反应性马来酰亚胺基团或硫醇基团可与之结合)反应，来产生这些键。其他接头包括酸可裂解的接头，例如会在酸性更强的胞内小室中被裂解的二马来酰亚胺基乙氧基丙烷(bismaleimideothoxy propane)、酸不稳定的转铁蛋白缀合物和己二酸二酰肼；暴露于紫外线或可见光后被裂解的交联接头以及例如人IgG1恒定区的各种结构域例如CH1、CH2和CH3的接头(见，Batra等人(1993)Molecular Immunol.30：379-386)。在一些实施方案中，可包含数个接头以利用所需的各个接头的性质。可通过将接头与胰岛素A-链和B-链共价偶联插入化学接头和肽接头。下文所述的异基双功能试剂可用于实现这样的共价偶联。也可通过表达编码B-链和A-链之间的接头的DNA来连接肽接头。

可用于连接胰岛素A-链和B-链的其他接头包括：酶底物，例如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、凝血因子Xa底物以及肠激酶底物；可增加溶解度、柔性和/或胞内可裂解性(cleavability)的接头，包括例如(gly_mser)_n和(ser_mgly)_n的接头，其中m为1至6，优选1至4，更优选2至4，且n为1至30，优选1至10，更优选1至4(参见，例如PCT国际申请WO 96/06641，其提供示例性的接头)。在一些实施方案中，可包含几种接头以利用所需的各个接头的性质。

3.表达

可通过本领域技术人员已知的包括体内和体外方法在内的任何方法产生胰岛素和乙酰透明质酸降解酶多肽。可在适于产生必需的量和形式的蛋白质(例如给药和治疗所需的)的任何生物体中表达所需蛋白。表达宿主包括原核生物和真核生物例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主可在它们的蛋白质产生水平以及所表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型上存在差异。可根据这些和其他因素例如管理和安全考虑、生产成本和纯化的需要和方法等选择表达宿主。

许多表达载体是本领域技术人员可用的和已知的，并可用于蛋白质表达。表达载体的选择会受到宿主表达系统的选择的影响。一般而言，表达载体可包含转录启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许进行转化细胞的筛选和维持的选择标记。在一些情况下，可使用复制起点来扩增所述载体的拷贝数量。

可溶性透明质酸酶多肽也可被用作或表达为蛋白融合物。例如，可生成酶融合物以向酶添加另外的功能性。酶融合物蛋白的实例包括但不限于信号序列、例如用于定位的标记(如his6标记或myc标记)、或用于纯化的标记(例如GST融合物)，以及用于引导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合物。

a.原核细胞

原核生物尤其是大肠杆菌提供用于产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简单和快捷的技术。用于大肠杆菌的转化载体可包含诱导型启动子，这些启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达显示对宿主细胞的某种毒性的蛋白质。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调控的λPL启动子。

蛋白质例如本文提供的任何蛋白质可表达于大肠杆菌的胞质环境中。胞质为还原性环境并且对于一些分子而言，这可引起不溶性包涵体的形成。还原剂例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇以及变性剂例如盐酸胍和尿素可用于重新溶解蛋白质。另一种方法为将蛋白质表达于细菌的周质空间，其提供氧化环境以及类伴侣蛋白和二硫化物异构酶，并可引起可溶性蛋白的产生。通常，将引导蛋白质到周质的前导序列与待表达的蛋白质融合。然后通过周质内的信号肽酶去除前导序列。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酶基因的pelB前导序列和得自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下，周质表达使表达的蛋白可以渗漏到培养基中。蛋白质的分泌使得可以从培养基上清中快速并简单地纯化。非分泌型的蛋白可通过渗透裂解从周质获得。与胞质表达相似，在一些情况下，蛋白质可变成不溶的，可使用变性剂和还原剂促进溶解和重新折叠。诱导和生长的温度也可影响表达水平和溶解度，通常使用25℃至37℃的温度。通常细菌产生非糖基化的(aglycosylated)蛋白质。因此，如果蛋白质的功能需要糖基化，可在从宿主细胞纯化后在体外增加糖基化。

b.酵母细胞

酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)为可用于产生蛋白质例如本文所述的任何蛋白质的熟知的酵母表达宿主。可用附加型复制载体或通过利用同源重组进行的稳定的染色体整合来转化酵母。通常，使用诱导型启动子调控基因表达。该类启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，例如CUP1、AOX1或其他毕赤酵母或其他酵母启动子。表达载体经常包括用于筛选和维持转化的DNA的选择标记例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。表达于酵母中的蛋白质通常为可溶的。与伴侣蛋白例如Bip和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可提高表达水平和溶解度。此外，使用分泌信号肽融合物例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白例如Aga2p交配型粘附受体或Arxula adeninivorans的葡萄糖淀粉酶的融合物可引导表达于酵母中的蛋白质以进行分泌。可以改造蛋白质酶裂解位点例如Kex-2蛋白酶的裂解位点，以在它们退出分泌途径时从表达的多肽去除融合的序列。酵母也能够在Asn-X-Ser/Thr模体进行糖基化。

c.昆虫细胞

昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达的昆虫细胞，可用于表达多肽例如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白并且能够进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，这提高了安全性，并减少了对真核表达调控方面的担忧。典型的表达载体使用启动子进行高水平表达，例如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)以及昆虫细胞系，例如来自于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和君主斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。为了高水平表达，紧接于多角体蛋白起始密码子的下游将待表达的分子的核苷酸序列融合。在昆虫细胞中，哺乳动物的分泌信号被准确加工并可用于将表达的蛋白质分泌到培养基中。此外，美洲粘虫(A7S)和君主斑蝶(DpN1)细胞系产生具有与哺乳动物细胞系相似的糖基化模式(pattern)的蛋白质。

昆虫细胞中的另一表达系统为使用稳定转化的细胞。细胞系例如Schneider2(S2)细胞系、Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。在用镉或铜进行重金属诱导的情况下，果蝇的金属硫蛋白启动子可用于诱导高水平表达。通常通过使用选择标记例如新霉素和潮霉素来维持表达载体。

d.哺乳动物细胞

哺乳动物细胞表达系统可用于表达包括可溶性透明质酸酶多肽在内的蛋白质。通过病毒感染例如腺病毒，或通过直接DNA转移例如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方法例如电穿孔和显微注射，可将表达构建体转移到哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多聚腺苷酸化元件。也可加入IRES元件，以允许与另一个基因例如选择标记的进行双顺反子表达。该类载体常常包含用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV-40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中具有活性。组织型和细胞型的启动子和增强子区也可用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自基因例如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素控制区的那些。选择标记可用于包含表达构建体的细胞的筛选和维持。选择标记基因的例子包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可在甲氨蝶呤存在下进行表达以仅筛选出表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号转导分子例如TCR-ζ和Fc_εRI-γ的融合可引导蛋白以活性状态在细胞表面直接表达。

许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌型)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、SP2/0、COS、NIH3T3、293、293S、2B8和HKB细胞。还可用适应无血清培养基的细胞系，无血清培养基有助于从细胞培养基中纯化分泌的蛋白。实例包括CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat# 11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham等人，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42。)。还可用适于在经优化用于最大表达的特殊培养基中生长的细胞系。例如，DG44 CHO细胞适于在化学成分明确的、不含动物产品的培养基中悬浮培养生长。

e.植物

转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，如本文所描述的任何蛋白质。通常使用直接DNA转移例如微粒轰击和PEG介导转移进入原生质体以及用农杆菌介导的转化将表达构建体转移到植物中。表达载体可包含启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。通常将表达载体和转化技术在双子叶植物宿主例如拟南芥(Arabidopsis)和烟草以及单子叶植物宿主例如玉米和水稻之间进行区分。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶、泛素和UBQ3启动子。经常使用选择标记例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶来辅助转化细胞的筛选和维持。可将转化的植物细胞以细胞、聚集物(愈伤组织)维持在培养物中或再生成完整植物。转基因植物细胞也可包括经工程化以产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可能影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。

4.纯化技术

从宿主细胞中纯化包括胰岛素和乙酰透明质酸降解酶多肽或其他蛋白质在内的多肽的方法取决于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌型分子，通常在去除细胞后从培养基中纯化蛋白。对于胞内表达，可裂解细胞，然后从提取物中纯化蛋白质。当将转基因生物例如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可作为制备裂解细胞提取物的起始材料。此外，转基因动物生产可包括产生在牛奶或鸡蛋中的多肽，它们可被收集，如有必要，可使用本领域的标准方法提取蛋白并进一步纯化。

可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来纯化蛋白质例如胰岛素多肽或乙酰透明质酸降解酶多肽，这些技术包括但不仅限于SDS-PAGE、体积分级和尺寸排阻色谱法、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法，例如阴离子交换。也可采用亲和纯化技术以提高效率和制备物的纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体和其他分子可用于亲和纯化。也可改造表达构建体以给蛋白质添加亲和标记，如myc表位、GST融合蛋白或His₆，分别使用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和纯化。可通过包括凝胶电泳、正交HPLC法、染色和分光光度技术在内的本领域任何已知的方法评价纯度。

F.胰岛素和乙酰透明质酸降解酶多肽的制备、制剂和给药

本文提供用于给药的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的药物组合物。将乙酰透明质酸降解酶与速效胰岛素的药物制剂一起配制或联合给药，通过提高胰岛素的吸收速率和增加胰岛素的生物利用度来增强速效胰岛素向血液的递送。可通过乙酰透明质酸降解酶可逆地解聚透明质酸(这样暂时地(通常持续小于24小时的时间)增加皮下空间的导水率)，来实现增加吸收速率和生物利用度。因此，与传统的皮下给药方法相比，可使用乙酰透明质酸降解酶以在肠胃外(例如皮下)给药后实现提高胰岛素浓度和/或更迅速达到胰岛素浓度，以提供例如给定剂量的更有效和/或更迅速的效应。因此，乙酰透明质酸降解酶与速效胰岛素联合给药可使该速效胰岛素成为超速效胰岛素。乙酰透明质酸降解酶也可用于以较低剂量的所给药的胰岛素达到血糖控制。乙酰透明质酸降解酶增加注射或输注部位及其附近液体团块流动的能力还可以改善相关的药物递送的其他方面。例如，液体团块流动的增加有助于使注射的流体体积更容易从注射部位分散(减轻注射潜在的疼痛的或其他不良后果)。这对于允许给药较高剂量的皮下输注尤为重要。

因此，由于吸收速率增加，所以当与乙酰透明质酸降解酶一起给药时，肠胃外给药的速效胰岛素可成为超速效胰岛素。与无乙酰透明质酸降解酶时的胰岛素给药相比的优势为联合给药或一起配制的乙酰透明质酸降解酶/胰岛素可得到更有利的给药方案，例如，降低胰岛素剂量和/或使用更有效的闭环系统，以及改善疗效例如更有效的血糖控制和/或减少过量胰岛素。例如，通过降低剂量可减少与过量循环胰岛素相关的副作用，例如较高剂量的胰岛素的情况下所观察到的那些。这些副作用包括但不仅限于低血糖症和肥胖症。

所述组合物可配制成冻干形式或液体形式。当以冻干形式提供所述组合物时，可在使用前用合适的溶液例如无菌生理盐水或无菌注射用水将它们复制。可一起或分别提供所述组合物。例如，可将速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶一起配制在单个组合物中，或以分离的组合物提供。当以分离的组合物提供时，可将乙酰透明质酸降解酶和胰岛素包装用于同时、连续地或间歇地给药。所述组合可包装为药盒。

1.制剂

可将化合物配制成任何合适的供肠胃外给药的药物制剂，例如溶液剂、混悬剂、缓释制剂或粉剂。通常使用本领域熟知的技术和操作将化合物配制成药物组合物(参见，例如Ansel Introduction to Pharmaceutical DosageForms，第14版，1985，126)。药学可接受的组合物在管理机构或其他机构的批准下制备，按照公认的用于动物和人的药典制备。所述制剂应当适合给药方式。

药物组合物可包括与乙酰透明质酸降解酶和胰岛素一起给药的载体，例如稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。合适的药物载体的实例记载于E.W.Martin，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。这些组合物会包含治疗有效量的一般为纯化形式或部分纯化形式的化合物，以及适量的载体，以提供用于向患者正确给药的形式。这些药物载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物通过静脉内给药时，水是典型的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于注射剂溶液。组合物还可同活性成分一起包含：填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；粘合剂，例如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其他本领域技术人员已知的此类粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、甘油、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水和乙醇。如需要，组合物也可包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸钠、甘油、环糊精衍生物、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸酯以及其他此类试剂。

药学治疗活性化合物及其衍生物通常以单位剂量形式或多剂量形式进行配制和给药。每单位剂量包含足以产生期望的疗效的预定量的治疗活性化合物和所需的药物载体、媒介物或稀释剂。单位剂量形式的实例包括安瓿和注射器以及独立包装的片剂或胶囊。单位剂量形式可以其部分或倍数给药。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同的单位剂量形式，用于以分离的单位剂量形式给药。多剂量形式的实例包括小瓶、药筒(cartridge)、片剂或胶囊瓶、或者品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂量形式是包装上不分离的多个单位剂量形式。一般情况下，可制备包含0.005％～100％活性成分且余量由无毒载体组成的剂型或组合物。

通常将本文提供的组合物进行配制以用于皮下途经给药，但是也考虑其他的给药途径，如本领域技术人员已知的任何途径，包括肌肉注射、腹膜内、静脉内、皮内、损伤部位内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳、透皮给药或任何途经。适用于这些途径的制剂为本领域技术人员已知的。给药可为局部的(local)、局部的(topical)或全身的，视治疗部位而定。可通过例如但不限于外科手术中的局部输注、例如与外科手术后的伤口敷料联合的局部施用、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物，实现向需要治疗的区域部位给药。也可将组合物与其他生物学活性剂连续地、间歇地或在同一组合物中给药。

对于任何给定的病例，最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、个体对具体给药途径的耐受性、疾病的严重程度和所用的具体组合物。本文提供的组合物通常为肠胃外给药。在一些实施例中，给药乙酰透明质酸降解酶，从而使它们到达皮肤或组织的间隙，藉此为后续的胰岛素递送降解组织间隙。因此，在一些实施例中，包括在皮肤下直接给药，例如通过皮下给药方法。由此，在一个实施例中，可通过例如从注射器或胰岛素笔或其他包含注射装置例如注射针的制品的注射实现局部给药。在另一个实施例中，可通过输注实现局部给药，可使用泵或其他相似装置辅助输注。也包括其他的给药方式。可将药物组合物配制成适合每一种给药途径的剂型。

本文包括一般以注射或输注为特征的皮下给药。可将注射剂制备成常规形式(液体溶液剂或混悬剂)、适于在注射前在液体中形成溶液剂或混悬剂的固体、或乳剂。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。所述药物组合物可包含其他的少量无毒的辅助成分，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及其他类似试剂，例如醋酸钠、磷酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸脂和环糊精。在一些实施例中，所述组合物也包含锌、钙、血清白蛋白、EDTA、氯化钙和/或酚类防腐剂。该类组合物所包含的活性化合物的百分比很大程度上取决于其具体性质以及所述化合物的活性和个体的需要。

可将注射剂设计为用于局部和全身性给药。用于本文目的，需要局部给药以直接给药到受影响的间质。用于肠胃外给药的制剂包括注射用无菌溶液剂、无菌干燥可溶性产品，例如在使用前易与溶剂混合的冻干粉剂，包括皮下注射用片、注射用无菌混悬剂、在使用前与媒介物混合的无菌干燥不溶性产品以及无菌乳剂。所述溶液剂可为水性的或非水性的。如果为静脉内给药，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)、以及含有增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物的溶液。

用于肠胃外制剂的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水、葡萄糖和乳酸林格注射液。非水性肠胃外媒介物包括蔬菜来源的非挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油以及花生油。可将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂加入到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括酚类或甲酚类、汞制剂、苯甲醇、三氯叔丁胺、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(TWEEN 80)。金属离子掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

调节药物活性化合物的浓度，使注射或输注提供产生所需药理学作用例如血糖控制的有效量。如本领域已知，确切的剂量取决于的患者或动物的年龄、体重及身体状况。单位剂量的肠胃外制剂可包装在例如安瓿、药筒、小瓶或带针的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液剂或复制的粉末制剂的体积取决于待治疗的疾病和选择用于包装的具体制品。如本领域已知和所实践的，所有用于肠胃外给药的制剂必须是无菌的。

在一个实施例中，药物制剂可为液体形式，如溶液剂、糖浆剂或混悬液。如果以液体形式提供，所述药物制剂可作为在使用前稀释到治疗有效浓度的浓缩制剂提供。该类液体制剂可通过常规方法与药学可接受的添加剂一起制备，如助悬剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用油)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油酯或分馏植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在另一个实施例中，药物制剂可为在使用前用水或其他合适的媒介物复制的冻干形式。

所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合物可一起配制为单一的组合物，或者可以做为两个分离的组合物提供。当以两个组合物提供时，可在给药之前将所述组合物混合用于联合给药，或可保持分离然后同时、连续地或间歇地联合给药。在一些实施例中，将所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶一起配制成超速效胰岛素组合物。如下文所讨论，所述组合物可配制成单或多剂量，其中该剂量可做为给药的乙酰透明质酸降解酶与胰岛素的量的比率提供。例如，可以1透明质酸酶U/胰岛素U(1∶1)至50∶1或更大，例如以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或者约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或更大给药乙酰透明质酸降解酶。在其他实施例中，给药较低的乙酰透明质酸降解酶与胰岛素比率，包括例如1透明质酸酶U/2胰岛素U(1∶2)、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15或1∶20。所述速效胰岛素可以10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL或者约10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL的浓度存在于一起配制的或分离的组合物中。通常，一起配制的或分离的组合物中的乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U/mL或等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U/mL的透明质酸酶活性。在一些实施例中，一起配制的或分离的组合物中的乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于30或35U/mL或等价于至少30或35U/mL的透明质酸酶活性，例如30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL的透明质酸酶活性。

本文提供的超速效胰岛素组合物可包含一种或多种pH缓冲剂(例如组氨酸、磷酸盐、Tris或其他缓冲剂)或酸性缓冲剂(例如醋酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、Gly-HCl、琥珀酸盐、乳酸盐、马来酸盐或其他缓冲剂)、张力调节剂(例如氨基酸、多元醇、甘油、NaCl、海藻糖、其他盐类和/或糖类)、稳定剂(例如用于稳定胰岛素的苯甲酸钠)、螯合剂例如乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐或EDTA钙、除氧剂例如甲硫氨酸、抗坏血酸/抗坏血酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、或白蛋白，和/或防腐剂例如包含芳族环的防腐剂(如苯酚或甲酚)。可用于于本文提供的组合物的示例性防腐剂包括但不仅限于间甲酚、苯酚和尼泊金或其任意组合。在一些实施例中，加入的间甲酚为0.05％-0.2％或者约0.05％-0.2％，例如0.1％～0.15％(例如0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％或者约0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％)。苯酚和对尼泊金的合适浓度包括0.05-0.25％，例如0.1-0.2％(例如0.1％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％和0.2％或者约0.1％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％和0.2％)。通常将NaCl或其他盐类提供于包含乙酰透明质酸降解酶的组合物中。NaCl的示例性浓度包括50mM-200mM，例如50mM-150mM，包括50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、130mM、140mM和150mM NaCl。在一些实施例中，为了维持本文提供的组合物的稳定性，随着所述组合物中的盐浓度增加，pH值也增加。可包含甘油作为张力调节剂和/或用于增加所述组合物的粘度。

可用于包含乙酰透明质酸降解酶的组合物的示例性稳定剂包括去污剂或表面活性剂，例如聚山梨酯和蛋白质如人血清白蛋白。在一些实施例中，在所述组合物中包含一种或多种表面活性剂(例如Pluronic F68)，例如以0.001％-0.1％或者约0.001％-0.1％，通常以0.005％-0.03％或者约0.005％- 0.03％(例如0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％或0.03％)。可用于本文的组合物的血清白蛋白的示例性浓度包括0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，但是可以更多或更少。聚山梨酯也可存在于所述组合物中，例如其浓度为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％或者约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。可用于包含胰岛素的组合物的示例性稳定剂包括锌和间甲酚。例如，锌可用于稳定胰岛素六聚体。锌可做为例如氧化锌、醋酸锌或氯化锌提供。锌可以0.001至0.1mg每100U胰岛素或者约0.001至0.1mg每100U胰岛素存在于本文提供的组合物，例如0.002毫克每100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.28mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U。在一个实施例中，锌以0.017mg每100U胰岛素存在。也可存在浓度例如为约0.2mM-20mM的金属螯合剂，例如EDTA钙(CaEDTA)，所述浓度为例如0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更高。在一些实施例中，当螯合剂和锌二者都存在于本文提供的组合物中时，所述螯合剂以与锌大约相等的量(即0.6-1.4的摩尔比)或摩尔过量存在，例如2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或者约2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或更大的螯合剂∶锌比率。所述组合物中也可包含例如约0.2mM-20mM的氯化钙。

在一些情况下，上述任何一种或多种组分仅存在于所述速效胰岛素组合物或所述乙酰透明质酸降解酶组合物中，直到这两种组合物被一起配制或作为超速效胰岛素组合物递送给患者。例如，所述速效胰岛素组合物可包含0.001至0.1mg/100单位胰岛素或者约0.001至0.1mg/100单位胰岛素的锌，例如0.002毫克每100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.28mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U，并且不包含螯合剂例如EDTA，而所述乙酰透明质酸降解酶组合物可包含0.02mM-20mM或约0.02mM-20mM的螯合剂(例如EDTA)，例如0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更高，并且不含锌。因此，只有当这两种组合物混合时，例如一起配制或联合给药时，包含胰岛素的组合物也包含EDTA，且包含乙酰透明质酸降解酶的组合物也包含锌。在一些情况下，起始的速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物分别包含足量的锌或螯合剂，使得当混合用于一起配制或联合给药时，所述螯合剂以与锌大约等摩尔的量(即0.6-1.4的摩尔比)或摩尔过量存在，例如以2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或者约2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或更大的螯合剂∶锌比率。

本领域技术人员可调节所述组合物的pH值和同渗浓度以优化达到所需组合物活性和稳定性的条件。例如，如上文所述，在一些情况下，如果增加了盐浓度，也可增加pH值以保持所述组合物的稳定性。而且，本领域技术人员可改变pH值以增加用于本文提供的超速效胰岛素中的具体胰岛素的溶解度。在一些实施例中，本文提供的包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶之一或二者的组合物的同渗浓度为100mOsm/kg、120mOsm/kg、140mOsm/kg、160mOsm/kg、180mOsm/kg、200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg、400mOsm/kg、420mOsm/kg、440mOsm/kg、460mOsm/kg、500mOsm/kg或者约100mOsm/kg、120mOsm/kg、140mOsm/kg、160mOsm/kg、180mOsm/kg、200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg、400mOsm/kg、420mOsm/kg、440mOsm/kg、460mOsm/kg、500mOsm/kg或更大，并且pH值为6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8或者约6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。在一些实施例中，所述pH为6.5或约6.5至7.5或约7.5，例如6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

给药方法可用于减少所选化合物暴露于降解过程，例如蛋白水解降解和通过抗原和免疫应答的免疫干扰。此类方法的实例包括在治疗部位局部给药。已报道药物的聚乙二醇化可增加对蛋白水解的抗性，延长血浆半衰期并降低抗原性和免疫原性。聚乙二醇化方法的实例为本领域已知的(参见，例如Lu和Felix，Int.J.Peptide Protein Res.，43：127-138，1994；Lu和Felix，Peptide Res.，6：142-6，1993；Felix等人，Int.J.Peptide Res.，46：253-64，1995；Benhar等人，J.Biol.Chem.，269：13398-404，1994；Brumeanu等人，JImmunol.，154：3088-95，1995；也参见Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。聚乙二醇化也可用于体内核酸分子递送。例如，腺病毒的聚乙二醇化可提高稳定性和基因转移(参见，例如Cheng等人(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。

冻干粉剂

冻干粉剂是本文感兴趣的，其可复制成溶液剂、乳剂或其他混合物用于给药。它们也可被复制并配制成固体制剂或凝胶剂。

通过将活性化合物溶解在缓冲液中制备无菌冻干粉剂。所述缓冲液可包含提高稳定性的赋形剂、或者所述粉剂或从所述粉剂制备的复制溶液的其他药理学组分。然后将所述溶液无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供所需的制剂。简而言之，通过将赋形剂例如葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的成分溶解于合适的缓冲液(例如柠檬酸、Tris、组氨酸、磷酸钠或磷酸钾、或其他本领域技术人员已知的此类缓冲液)中，以制备所述冻干粉剂。然后，将所选择的酶加入所得混合物中，并搅拌至其溶解。将所得混合物无菌过滤或进行处理去除微粒并确保无菌，均分至小瓶中进行冻干。每个小玻璃瓶会包含单剂量或多剂量的所述化合物。可将冻干粉剂保存在合适的条件例如约4℃至室温下。用缓冲液复制该冻干粉剂，提供用于肠外给药的制剂。

2.剂量和给药

本文提供的乙酰透明质酸降解酶可配制为用于单剂量或多剂量给药的药物组合物。例如，本文提供的组合物可包含1透明质酸酶U/胰岛素U(1∶1)至50∶1或更多的乙酰透明质酸降解酶，例如1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或者约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或更大。在其他实施例中，将较低的乙酰透明质酸降解酶与胰岛素比率提供于所述组合物中，包括例如1透明质酸酶U/2胰岛素U(1∶2)、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15或1∶20。所选透明质酸酶的含量足以在被治疗的患者中在无不良副作用的情况下产生疗效。可通过在已知的体外和体内系统中试验这些多肽例如通过使用本文提供的或本领域已知的测定法(见例如Taliani等人(1996)Anal.Biochem.，240：60-67；Filocamo等人(1997)J Virology，71：1417-1427；Sudo等人(1996)Antiviral Res.32：9-18；Buffard等人(1995)Virology，209：52-59；Bianchi等人(1996)Anal.Biochem.，237：239-244；Hamatake等人(1996)Intervirology 39：249-258；Steinkuhler等人(1998)Biochem.，37：8899-8905；D’Souza等人(1995)J Gen.Virol.，76：1729-1736；Takeshita等人(1997)Anal.Biochem.，247：242-246；也参见例如Shimizu等人(1994)J.Virol.68：8406-8408；Mizutani等人(1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani等人(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.，227：822-826；Lu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)，93：1412-1417；Hahm等人，(1996)Virology，226：318-326；Ito等人(1996)J.Gen.Virol.，77：1043-1054；Mizutani等人(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.，212：906-911；Cho等人(1997)J.Virol.Meth.65：201-207)，然后由此外推用于人的剂量，从而能经验性地确定治疗有效浓度。

可根据例如药动学(PK)数据和药效学(PD)数据，例如下文所述和实施例1中所述，以及已知的在无乙酰透明质酸降解酶时递送的所述速效胰岛素的治疗剂量，来确定包含所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的超速效胰岛素组合物的治疗有效量。血液、血浆或血清中的胰岛素浓度随时间的变化提供关于胰岛素的体内(1)肠胃外给药的吸收；(2)分布和(3)消除的信息。药动学模型将胰岛素浓度的这些生理学变化定义为时间函数(即

)，并使用速率和容积对它们进行数学表征。所推导的用于胰岛素的模型参数会保持相对稳定直到干扰出现。公认的胰岛素PK模型可提供暴露(它与疗效和过度的用药引起的药物安全性密切相关)的合理预测。使用PK建模和模拟可辅助和验证有关胰岛素剂量选择和给药方案的临床决策。药效学模型在临床结果预测方面用于相似的目的。

乙酰透明质酸降解酶的治疗有效剂量通常为0.3单位(U)至5,000U或约0.3单位(U)至5,000U的乙酰透明质酸降解酶。例如，可以0.3U、0.5U、1U、2U、3U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或者约0.3U、0.5U、1U、2U、3U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或更高皮下给药透明质酸酶。在一些实施例中，剂量可做为给药的乙酰透明质酸降解酶与胰岛素的量的比率提供。例如，可以1透明质酸酶U/胰岛素U(1∶1)至50∶1或更大，例如以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或者约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或更大给药乙酰透明质酸降解酶。在其他实施例中，给药较低的乙酰透明质酸降解酶酶与胰岛素的比率，包括例如1透明质酸酶U/2胰岛素U(1∶2)、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15或1∶20。通常，本文包括的乙酰透明质酸降解酶的注射或输注体积为0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9ml、10ml或者约0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9ml、10ml或更大。乙酰透明质酸降解酶可作为储备液提供，其浓度为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/ml、150U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml、500U/mL、600U/mL、800U/mL或1000U/mL或者约为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/ml、150U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml、500U/mL、600U/mL、800U/mL或1000U/mL，或可以供直接使用或在使用前稀释至有效浓度的更浓缩的形式提供，例如浓度为2000U/ml、3000U/ml、4000U/ml、5000U/ml、8000U/ml、10,000U/mL或20,000U/mL或者约2000U/ml、3000U/ml、4000U/ml、5000U/ml、8000U/ml、10,000U/mL或20,000U/mL。可以液体或冻干制剂的形式提供所述乙酰透明质酸降解酶。

可将本文提供的胰岛素制剂配制成用于单剂量或多剂量用途的药物组合物。例如，在一些情况下，配制胰岛素制剂用于以足以提供餐后血糖控制的量进行单剂量给药。在其他实施例中，配制胰岛素制剂用于多剂量给药或多次使用的小瓶，例如用于胰岛素笔、胰岛素泵或其他连续胰岛素递送装置或闭环系统。所述胰岛素制剂可以本文其他地方所述的冻干或液体形式提供。

可以治疗有效剂量提供所述胰岛素。可通过在已知的体外和体内系统中试验化合物例如本文提供的测定法，来经验性地确定治疗有效剂量，也可针对每一个体根据例如代谢、食物摄取和疾病严重程度的此类因素加以个体化。所述组合物中所选择的胰岛素的浓度取决于例如复合物的吸收、灭活和排泄率、复合物的理化特性、剂量日程、给药量以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，应理解精确的治疗剂量与个体血糖水平相关，并可使用已知的算法或通过从体内或体外试验数据外推、个体的以往经验，计算碳水化合物以测定食物中的碳水化合物含量以及因此估计的餐时血糖增加和之后的胰岛素需求，来经验性地确定。应注意的是，浓度和剂量值可因每一名被治疗的个体而异。应进一步理解的是，对于任何具体的个体，应该根据个体需要和管理或监督制剂的给药的人员的专业判断随时调整具体给药方案，且本文显示的浓度值域仅为示例性的且无意限制其范围。可通过标准的临床技术确定为治疗糖尿病而给药的所选胰岛素制剂的量。此外，可应用体外测定法和动物模型帮助鉴定最佳剂量范围。

因此，可凭经验确定的精确剂量可以取决于具体的胰岛素制剂、与乙酰透明质酸降解酶的给药方案和给药时间表、给药途径、待治疗的糖尿病类型、疾病的严重程度和接受治疗的个体。一般情况下，以达到血糖控制的量提供胰岛素。例如，为了达到餐后血糖控制，当在无乙酰透明质酸降解酶的情况下递送胰岛素时，在餐前30分钟到5分钟，通常向糖尿病个体给药0.05U速效胰岛素每千克体重(U/kg)至1.0U/kg或约0.05U速效胰岛素每千克体重(U/kg)至1.0U/kg的推注。应理解的是，根据例如特殊个体的代谢、食物的内含物和血糖水平适当地增加或减少这一剂量。还应理解为了控制餐后血糖而递送胰岛素的时间可变得与进食时间更近或更远，并且在一些情况下可进行改变，从而在进餐时或进餐后递送胰岛素。因此，可通过以比单独给药胰岛素时的给药剂量低的剂量和/或在比通常单独给药胰岛素剂量的时间相比更接近进食的时间，与乙酰透明质酸降解酶组合给药胰岛素例如速效胰岛素，来向个体给药本文提供的超速效胰岛素组合物。

通常以0.05单位/kg至0.25单位/kg剂量例如0.10单位/kg给药速效胰岛素，然而具体剂量各不相同。可以比无乙酰透明质酸降解酶时给药的速效胰岛素更低的剂量给药超速效胰岛素组合物。如本文其他地方所论述的，可以通过将速效胰岛素作为超速效胰岛素组合物给药来降低所述速效胰岛素的量的程度是变化的，这取决于例如患者的糖尿病类型。通常，当以超速效胰岛素组合物的形式给药时给药于2型糖尿病患者的速效胰岛素量的减少大于当以超速效胰岛素组合物的形式给药时给药于1型糖尿病患者的速效胰岛素量的减少。例如，在向1型糖尿病患者和2型糖尿病患者均给药0.20U/kg速效胰岛素以控制餐后血糖水平的情况下，可以超速效胰岛素组合物的形式向该1型糖尿病患者给药0.15U/kg速效胰岛素以达到相同或更好的血糖控制，可以超速效胰岛素组合物的形式向该2型糖尿病患者给药0.10U/kg速效胰岛素以达到相同或更好的血糖控制。因此，在一些实施例中，本文涵盖：与在无乙酰透明质酸降解酶的情况下给药时血糖控制所需要的量相比，与乙酰透明质酸降解酶一起作为超速效胰岛素组合物给药于2型糖尿病患者的速效胰岛素的量可减少例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多，以及与在无乙酰透明质酸降解酶的情况下给药时血糖控制所需要的量相比，与乙酰透明质酸降解酶一起作为超速效胰岛素组合物给药于1型糖尿病患者的速效胰岛素的量可减少例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。

使用本文提供的方法和组合物控制餐后血糖水平的肠胃外例如皮下给药的示例性剂量范围为0.05U/kg至0.50U/kg或约0.05U/kg至0.50U/kg，例如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg或1.0U/kg。具体剂量及其制剂取决于疾病和个体。如有必要，可凭经验确定剂量。为了达到这些剂量，为了控制餐后血糖水平而皮下给药的胰岛素制剂的体积可为10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1000μL或者约为10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1000μL或更多。例如，可将用于本文描述的适应症的100U/mL胰岛素制剂以35μL至350μL的体积皮下给药于70kg个体以达到0.05U/kg至0.50U/kg的胰岛素剂量。除了控制餐后血糖，也可将本文提供的组合物和方法施用于糖尿病个体以达到整个白天和夜晚的血糖控制。为了提供持续血糖控制而给药的胰岛素剂量通常小于达到餐后血糖控制所需的剂量。然而，可根据血糖水平增加或减少剂量。使用本文提供的方法和组合物以提供持续血糖控制的肠胃外例如皮下给药的示例性剂量范围为0.001U/kg至0.30U/kg或约0.001U/kg至0.30U/kg，例如0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg，0.05U/kg至0.30U/kg例如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg或1.0U/kg。具体剂量及其制剂取决于疾病、给药时间和个体。如有必要，可凭经验确定剂量。通常将用于个体的剂量逐渐减少至实现治疗效果所需的最小剂量，例如实现血糖控制所需的最小剂量。足以实现血糖控制的胰岛素量可凭经验例如通过糖负荷来确定。

可在胰岛素制剂之前、之后、间歇地或同时给药乙酰透明质酸降解酶。一般地，在给药所述胰岛素制剂之前或同时给药所述乙酰透明质酸降解酶以允许所述乙酰透明质酸降解酶降降解间质空间的透明质酸。在一个实施例中，将所述胰岛素组合物与乙酰透明质酸降解酶组合物一起配制，并因此同时给药。在另一实施例中，在所述胰岛素组合物之前例如在给药所述胰岛素制剂前1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟前或更早给药所述乙酰透明质酸降解酶组合物。在一些实施例中，将透明质酸酶与胰岛素制剂一起给药。本领域技术人员会理解，可通过在合适的模型中例如在合适的动物模型中通过试验在不同时间给药这些药剂的效力来容易地优化所需的联合给药的接近程度。

所述胰岛素制剂和所述乙酰透明质酸降解酶制剂均可一次性给药，也可以分成几个较小的剂量以一定时间间隔给药。在治疗时间的过程中例如几分钟、几小时、几天、几周或几个月，以一次或多次剂量给药所选的胰岛素制剂。在一些情况下，连续给药是有用的。应理解的是精确的剂量和疗程取决于适应症和患者的耐受性。

也应理解精确剂量和疗程也与正在治疗的糖尿病有关，并可使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验数据外推，来经验性地确定。应注意的是，浓度和剂量值还可随糖尿病严重程度和其他因素例如个体的代谢、食物摄取和体重而变化。应进一步理解的是，对于任何具体的个体，应该根据个体需要和管理或监督制剂给药的人员的专业判断随时调整具体给药方案，且本文显示的浓度值域仅为示例性的且无意限制包含它们的组合物和组合的范围和用途。根据个体和糖尿病状态，可每分钟、每几分钟、每小时、每天、每周、每月、每年一次给药组合物。一般而言，选择给药方案以限制毒性和/或其他负面作用，如胰岛素过量。应注意的是，主治医师会知道如何以及何时终止治疗、中断治疗或将治疗调整到较低剂量。相反，如果临床响应不足(排除毒副作用)，主治医师也会知道如何以及何时将治疗调整到较高剂量。

给药方式

a.注射器

可使用一种或多种给药方式将本文提供的组合物肠胃外给药于个体，包括但不限于注射器、胰岛素笔、胰岛素泵或在闭环系统中或其任意组合。例如，包括胰岛素注射器在内的一次性注射器可用于给药不连续的组合物推注。例如当胰岛素和乙酰透明质酸降解酶制剂一起配制时，可使用同一个注射器给药组合物，或可使用不同的注射器连续给药组合物。可用于给药本文提供的组合物的注射器包括胰岛素注射器，其可被设计为容纳标准浓度的胰岛素制剂，包括100U/ml浓度的胰岛素制剂，并且具有胰岛素单位标记以方便给药。在其他实施例中，胰岛素注射器或胰岛素泵或类似的装置中的任何一种或多种用于给药胰岛素制剂和乙酰透明质酸降解酶制剂之一或二者。

b.胰岛素笔

胰岛素笔是可用于给药本文提供的组合物的递送系统。胰岛素笔包括具有填充了待给药的组合物的可更换药筒的那些和具有不可更换的药筒的那些。具有不可更换的药筒的胰岛素笔通常在药筒用空后被丢弃。胰岛素笔使能够以半个单位、一个单位或两个单位的增量给药，一般使用给药刻度盘或用于设定剂量的其他机制来测定增量(参见例如，美国专利5947934，6074372，6110149，6524280，6582404)。然后通过连接在笔上的细针头递送组合物。胰岛素笔为本领域熟知的并包括其他地方记载的那些，包括但不仅限于美国专利第5947934、4973318、5462535、5599323、5626566、5984906、6074372、6110149、6302869、6379339和7241278号记载的那些。其他类似的给药装置例如美国专利第5947394、6074372、6110149和6379339号所记载的那些也可用于给药作为胰岛素与乙酰透明质酸降解酶的合剂的本文提供的组合物，或者单独给药作为胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物的本文提供的组合物。在一些实施例中，胰岛素笔或类似装置还包含可测量个体血糖水平的传感器或监测器(参见，例如WO2003047426)。

可用于或经改造后可用于递送本文提供的胰岛素组合物的胰岛素笔和类似递送装置为本领域熟知的，包括但不限于以商标

(OwenMumford，Inc.)、Disetronic Pen(Disetronic Medical Systems)、

Pen(Eli Lilly and Company)、

Mix 75/25 Pen(Eli Lilly and Company)、

70/30 Pen(Eli Lilly and Company)、

N Pen(Eli Lilly andCompany)、

FlexPen(Novo Nordisk)、

3(Novo Nordisk)、

4(Novo Nordisk)、Junior(Novo Nordisk)、

Mix70/30 FlexPen(Novo Nordisk)、(Novo Nordisk)、

(Novo Nordisk)、

(Novo Nordisk)、

(Sanofi-Aventis)、

Pro2(Sanofi-Aventis)、

(Sanofi-Aventis)和

(Sanofi-Aventis)销售的那些。

c.胰岛素泵和其他胰岛素递送装置

可使用胰岛素递送装置例如胰岛素泵或其他类似的连续输注装置向糖尿病个体给药本文提供的组合物。所述胰岛素递送装置通常包括至少一个包含胰岛素组合物的一次性的容器、泵(包括任何控制器、软件、处理模块和/或电池)和一次性输液装置，包括用于皮下注射的插管或针头以及将插管或针头连接至胰岛素容器的导管。为了与超速效胰岛素组合物一起使用，胰岛素递送装置可包括一个包含一起配制的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合物的容器，或可包括一个或多个容器，从而速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合物可包含在同一个或不同的容器中。在此类情况下，所述胰岛素递送装置可同时或彼此先后递送每一种组合物。因此，此类装置可用于给药本文所提供的超速效胰岛素组合物。所述组合物可持续或推注给药。而且，胰岛素递送装置的使用者能够通过决定推注的进程(shaping thebolus)来影响胰岛素性质。例如，可给药标准推注，其为类似于不连续注射的输注，因为所有的剂量被即刻泵出。持续推注(extended bolus)为一段时间内的缓慢输注，其避免高起始剂量并延长组合物的作用。可使用胰岛素泵或其他持续递送系统给药包含标准推注和持续推注二者的组合推注。胰岛素递送装置为本领域已知的并记载于其他地方，包括但不限于美国专利第6554798、6641533、6744350、6852104、6872200、6936029、6979326、6999854、7025713和7109878号。胰岛素递送装置也可与葡萄糖监测器或传感器连接，和/或可包括基于血糖水平、食物中碳水化合物含量或其他输入来计算推荐胰岛素剂量的装置。另有胰岛素递送装置可以为可植入的或可在个体外部。

d.闭环系统

闭环系统，有时被称作人工胰脏，是特别关注的，用于与本文提供的组合物和方法一起使用。闭环系统指具有集成的连续血糖监测器、胰岛素泵或其他递送系统和控制器的系统，所述控制器包括根据血糖水平的实时测量不断计算控制血糖所需的胰岛素输注的数学算法。当被优化时，此类系统有助于不断的和非常严格的血糖控制，类似于在健康的非糖尿病个体中观察到的天然胰岛素反应和血糖控制。然而，为了有效，闭环系统要求既可靠又准确的持续血糖监测器，以及非常快速地递送胰岛素。例如，与皮下递送速效胰岛素相关的胰岛素吸收和起效的延迟可导致大的餐后血糖波动(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23：1-12)。由于胰岛素吸收、胰岛素起效、间质葡萄糖动力学(interstitial glucose kinetics)及基于离体的监测系统(例如基于微量透析技术的那些)的传送时间引起的延迟可导致从胰岛素递送时间到其可检测的降糖作用峰值之间总共100分钟或更长的时间滞后(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23：1-12)。因此，一旦给药，胰岛素会继续增加它可测量的作用，持续接近2个小时。这使得使用闭环系统有效降低摄入食物后的血糖浓度变得复杂。首先，必须检测到葡萄糖升高。然而，这通常仅发生在约10-40分钟后。系统必须确定食物已被消化并给药合适的胰岛素剂量。长时间延迟和一旦给药后不能“撤回”胰岛素损害了该系统在“错误判断”胰岛素剂量后补偿的能力。通过使用超速效胰岛素组合物，例如本文提供的显示增加的吸收速率和水平以及药效学方面的相关改善(如实例1所述，下文)的超速效胰岛素组合物，至少可以部分解决此类问题。本文提供的超速效胰岛素组合物比速效胰岛素具有减少的t_max(即，更快地达到最大浓度)并且比速效胰岛素更快地开始控制血糖水平。该加快的吸收和起效速率缩短了胰岛素起效与葡萄糖监测和输入之间的延迟，得到可以更严格地控制血糖水平从而减少血糖波动的更有效的闭环系统。

闭环系统为本领域熟知的并记载于其他地方，包括但不限于美国专利第5279543、5569186、6558351、6558345、6589229、6669663、6740072、7267665和7354420号，这些专利通过援引纳入本文。这些以及本领域技术人员可容易辨别的类似系统可用于递送本文提供的超速效胰岛素组合物。闭环系统包括测量血糖水平的传感器系统、控制器和递送系统。这一集成系统被设计成模仿胰腺β细胞(β-细胞)，使得它以相似于完全功能的人β-细胞在响应身体中血糖浓度的变化时产生的浓度曲线来控制输注装置将胰岛素递送入个体中。因此，该系统模拟人体对血糖水平的天然胰岛素反应，并且不仅有效使用胰岛素而且还补偿(account for)其他身体功能，因为胰岛素既具有代谢作用又具有促有丝分裂作用。而且，使用闭环系统达到血糖控制不需要任何关于进餐的数量和时间的信息或其他因素即可达到。该系统可仅依赖于实时血糖浓度测量值。葡萄糖传感器产生表示体内血糖水平的传感器信号，并将该传感器信号提供给控制器。控制器接收传感器信号并产生传达至胰岛素递送系统的指令。胰岛素递送系统接收该指令，并响应该指令将胰岛素输注入人体。下文提供了可用于递送本文提供的超速效胰岛素组合物的闭环系统的示例性组件的描述。应理解的是本领域技术人员可以很容易地识别用于本文的合适的闭环系统。该类系统在本领域已有所记载，包括但不限于在美国专利第5279543、5569186、6558351、6558345、6589229、6669663、6740072、7267665和7354420号中所描述的那些。本领域也单独地或在用于达到血糖控制的闭环系统的背景下记载了此类系统的单个组件。应理解的是本文提供的实例仅为示例性的，也可使用其他闭环系统或单个组件用于递送本文的超速效胰岛素组合物。

闭环系统包括持续发挥功能的葡萄糖传感器或监测器。这类装置可包括插入皮下并连接至通过射频遥测将葡萄糖数据无线发送到小接收器的小发射器的针头式传感器。在一些实施例中，使用插入针头将传感器插入个体皮肤，一旦将传感器置于皮下组织就将所述插入针头拔除并丢弃。插入针头有锋利的针尖和在插入皮肤的过程中容纳传感器的开口插槽(参见，例如美国专利第5,586,553和5,954,643号)。闭环系统中使用的传感器可任选地包括三个暴露于皮下组织间质液(ISF)中的电极。这三个电极包括一个工作电极，一个参比电极和一个用于形成回路的对电极。当在工作电极和参比电极间提供一个合适的电压时，ISF提供两个电极之间的阻抗。模拟电流信号从工作电极流出通过人体到达对电极。工作电极的电压一般保持接地，参比电极的电压可保持在设定电压(V设定)，例如300至700mV。由电极间电压差激发的最显著的反应是葡萄糖的还原，因为它首先与葡萄糖氧化酶(COX)反应生成葡糖酸和过氧化氢(H₂O₂)。然后，H₂O₂在工作电极表面被还原为水(H2O)和(O^-)。O^-从传感器电子组件吸引一个正电荷，从而排斥一个电子并引起电流流动。这导致模拟电流信号与和传感器电极接触的ISF中的葡萄糖浓度成正比例(参见例如美国专利第7,354,420号)。

在一些实施例中，使用多余一个传感器测定血糖。例如，当某一传感器发生故障时，可使用多余的传感器并可由遥测特性监测器发送器电子元件告知个体。指示器也能够告知个体哪些传感器仍在工作和/或仍在工作的传感器的数量。在其他实施例中，通过叠加(averaging)装置或其他装置组合传感器信号。而且，可使用不同类型的传感器。例如，可同时使用体内葡萄糖传感器和体外葡萄糖传感器来测量血糖。

可用于递送本文提供的超速效胰岛素组合物的闭环系统中的葡萄糖传感器为本领域熟知的，并可被容易地识别，并任选地由本领域技术人员进一步改良。示例性体内葡萄糖传感器包括但不限于美国专利第5,497,772、5,660,163、5,791,344、5,569,186、6,895,265号记载的那些。美国专利第6,011,984号记载了使用荧光的示例性葡萄糖传感器。葡萄糖传感器系统也可使用其他传感技术，包括光束、电导率、喷射取样(jet sampling)、微透析、微穿孔、超声取样、反向离子透入或其他方法(例如，美国专利第5,433,197和5,945,676号，以及国际专利公布WO199929230)。在一些实施例中，只有工作电极位于皮下组织并与ISF接触，对电极和参比电极位于体外并与皮肤接触。对电极和参比电极可位于监测器外壳表面并可保持在皮肤上作为遥测特性监测器的一部分。在另外的实例中，使用其他装置将对电极和参比电极保持在皮肤上，例如在电极上缠一根金属线并将电极绑在皮肤上，将电极合并在接触皮肤的手表底面。另外，可将多于一个工作电极放入皮下组织以具有多余的电极。也可从个体体内收集间质液，并使其流过未植入体内的体外传感器。

控制器接收来自葡萄糖传感器的输入。将控制器设计为模仿胰腺β细胞(β-细胞)并向胰岛素递送提供指令以输注控制血糖所需的胰岛素量。控制器采用具有根据葡萄糖传感器检测到的葡萄糖水平计算所需胰岛素量的算法的软件。示例性算法包括近似地模仿β-细胞的那些，因为被设计用以最小化体内葡萄糖波动而不考虑胰岛素的递送量的算法可导致过多的体重增加、高血压和动脉粥样硬化。系统通常倾向于模仿体内胰岛素分泌模式并且将这一模式调整得与正常健康个体经历的体内β-细胞适应一致。可用于闭环系统的控制算法包括比例-积分-微分(PID)控制器所使用的那些。在一些系统中也可使用比例微分控制器和模仿预测控制(MPC)算法(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23：1-12)。示例性算法包括但不仅限于Hovorka等人(Diabetic Med.(2006)23：1-12)、Shimoda等人(Front Med BiolEng(1997)8：197-211)、Shichiri等人(Artif.Organs(1998)22：32-42)、Steil等人(Diabetes Technol Ther(2003)5：953-964)、Kaletz等人(Acta Diabetol.(1999)36：215)以及美国专利第5279543、5569186、6558351、6558345、6589229、6740042、6669663、6740072、7267665、7354420号和美国专利公布第20070243567号中记载的那些。

在一个实施例中，在闭环系统中采用PID控制器。PID控制器通过从三个角度评价葡萄糖波动来持续调节胰岛素输注：与目标葡萄糖的偏离(比例分量)，环境葡萄糖(ambient glucose)和目标葡萄糖之间的曲线下面积(积分分量)，环境葡萄糖的变化(微分分量)。一般而言，体内β-细胞对葡萄糖变化的响应的特征在于“第一”和“第二”相胰岛素反应。可使用比例、加积分、加微分(PID)控制器模拟β-细胞双相胰岛素反应(参见例如，美国专利第7,354,420号)。

控制器产生对所需胰岛素递送的指令。胰岛素递送系统例如胰岛素泵为本领域已知的并可用于闭环系统中。示例性胰岛素递送装置(例如上文所描述的那些)包括但不限于美国专利第4562751、467840、4685903、4373527、4573994、6554798、6641533、6744350、6852104、6872200、6936029、6979326、6999854、7025713和7109878记载的那些。胰岛素递送装置通常包括一个或多个包含胰岛素制剂例如本文描述的超速效胰岛素组合物的容器，所述容器通常为一次性的。所述容器可包含多于一种胰岛素，例如基础作用胰岛素和速效胰岛素，这些胰岛素一起配制并包含于同一个容器中或分别包含于两个或更多个容器中。为了与超速效胰岛素组合物一起使用，胰岛素递送装置可包括一个包含一起配制的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合物的容器，或者可包括两个或更多个容器，使速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶组合物分别包含于不同的容器中。在这些情况下，胰岛素递送装置可同时或先后递送各组合物。在一些实施例中，使用输液管和插管或针头递送组合物。在其他实施例中，将输注装置直连接在皮肤上，组合物从输注装置流出经过插管或针头直接进入体内而不使用输液管。在另外的实施例中，输注装置在体内并且可任选地用输液管递送组合物。闭环系统还包括其他组件，包括但不限于过滤器、校准器和发射器。

G.活性、药动学和药效学的评价方法

可使用测定法来评价单独的或与乙酰透明质酸降解酶组合的胰岛素的体内和体外活性。这类测定法包括评价皮下或腹膜内给药的胰岛素的药动学和药效学性质包括生物利用度和耐受性的那些。也可使用本领域熟知的测定法评价胰岛素和乙酰透明质酸降解酶二者的生物学活性。这类测定法可用于，例如，测定用于治疗的胰岛素例如速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的合适的剂量及给药频率。

1.药动学、药效学和耐受性

可使用动物模型(包括猪模型例如实施例11和12描述的那些)或可在具备患者的临床研究中进行药动学(PK)、药效学(PD)和耐受性研究，例如下文实例1描述的那些。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、犬、豚鼠和非人类灵长类模型，如食蟹猴或猕猴。在一些情况下，以健康动物或人类个体进行药动学和耐受性研究。在其他实施例中，使用糖尿病动物模型例如下文描述的那些，或在糖尿病个体中进行这些研究。可用于进行这些研究的示例性操作包括葡萄糖钳技术(Brehm等人(2007)，ClinDiabetes Res：Methods and Techniques.Ed Michael Rosen，pp 43-76，实施例1)。在高血胰岛素-正常血糖钳操作中，输注外源胰岛素以产生高胰岛素血桨胰岛素浓度，同时通过可变的外源葡萄糖输注将血桨葡萄糖浓度保持恒定在正常血糖水平。在高血胰岛素期间维持恒定葡萄糖水平所需的葡萄糖输注速率(GIR)提供了输注的胰岛素对葡萄糖代谢的作用的量度。GIR反映了身体利用的葡萄糖的量(即当身体利用更多的葡萄糖时需要输注更多的外源葡萄糖以维持正常的血糖水平，即90-110mg/dL)，因此反映了给药的胰岛素的活性(即增加的胰岛素活性引起内源性葡萄糖输出减少和血糖利用增加，导致血糖整体下降)。因此，这样的操作除了用于评价个体的胰岛素分泌和胰岛素抵抗之外，也可用于安全地评价胰岛素例如与乙酰透明质酸降解酶联合给药的胰岛素的药动学和药效学性质。

可通过测量胰岛素的时间-浓度曲线并计算给药后任何给定时间间隔的参数例如最大(峰)血清胰岛素浓度(C_max)，峰时间(即最达血清胰岛素浓度出现的时间；t_max)和曲线下面积(即通过将时间对血胰岛素浓度作图生产的曲线下的面积；AUC)，来评价皮下或腹膜内给药的胰岛素的药动学。通过比较皮下递送后胰岛素的曲线下面积(AUC_sc)与静脉递送后胰岛素的AUC(AUC_iv)测定皮下给药胰岛素的绝对生物利用度。可使用公式F＝[([AUC]_sc×剂量_sc)/([AUC]_iv×剂量_iv)]×100来计算绝对生物利用度(F)。也可计算经相同给药途径的两种治疗例如与或不与乙酰透明质酸降解酶联合给药的情况下胰岛素的相对生物利用度(F_rel)，例如在实施例1中。例如，可计算与rHuPH20联合给药的皮下给药的

赖脯胰岛素和单独皮下给药的

赖脯胰岛素的相对生物利用度(F_rel)，{[AUC(

赖脯胰岛素/rHuPH20)]/[AUC(单独的

赖脯胰岛素]}×100，其中各自的

赖脯胰岛素剂量相同，并在相同的时间间隔计算AUC。可使用本领域任何已知的适用于评价血样中胰岛素浓度的方法来测量皮下给药后的胰岛素血桨浓度。示例性方法包括但不仅限于ELISA和RIA。

可通过测量参数如葡萄糖输注速率(GIR)(mg/kg/min)、达到最大效力的时间(tGIR_max)(分钟)；达到后期半最大效力的时间(tGIR_后期50％)(分钟)；达到早期半最大效力的时间(tGIR_早期50％)(分钟)；最大代谢效力(GIR_max)(mg/kg/分钟)；AUC-GIR_0-60min(g/kg)；AUC-GIR_0-120min(g/kg)；AUC-GIR_{0-180 min}(g/kg)；AUC-GIR_0-240min(g/kg)；AUC-GIR_0-300min(g/kg)和AUC-GIR_0-360min(g/kg)，来评价皮下或腹膜内注射的胰岛素的药效学性质。

可在药动学研究中施以一系列的剂量和不同给药频率的给药以评价增加或降低剂量中的胰岛素和/或乙酰透明质酸降解酶的浓度的作用。也可在与或不与乙酰透明质酸降解酶联合给药的情况下评价皮下或腹膜内给药的胰岛素的药动学和药效学性质，如生物利用度。例如，可在高血胰岛素-正常血糖钳操作中向动物或人类个体单独地或与乙酰透明质酸降解酶联合地皮下给药胰岛素。然后在各个时间点取血样，并例如通过放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定血清中的胰岛素量。也可计算该方法整个过程中的葡萄糖输注速率。然后测定有或无乙酰透明质酸降解酶时皮下给药的胰岛素的药动学和药效学性质，以评价与乙酰透明质酸降解酶联合给药对任何胰岛素的这些性质的作用。

评价安全性和耐受性的研究为本领域已知并可用于本文。在与或不与乙酰透明质酸降解酶联合给药的情况下皮下给药胰岛素后，可检测任何不良反应的发生。不良反应包括但不限于注射部位反应例如水肿或肿胀、头痛、发热、乏力、寒战、潮红、头晕、荨麻疹、气喘或胸闷、恶心、呕吐、僵直、背痛、胸痛，肌肉痉挛、癫痫发作或惊厥、血压变化以及过敏反应或严重超敏反应。在安全性和耐受性研究中，通常施以一系列的剂量和不同的给药频率以评价增加或降低剂量中的胰岛素和/或透明质酸的浓度的作用。

2.生物学活性

a.胰岛素

可在体外或体内评价胰岛素例如胰岛素类似物作为治疗药剂的能力。例如，可进行本领域熟知的体外测定以评价胰岛素结合胰岛素受体的能力。在一个实施例中，进行竞争性结合测定，其中制备人胎盘细胞膜作为胰岛素受体的来源并在有或无未标记的胰岛素类似物的情况下与放射性标记的人胰岛素一起温育。然后检测结合的放射性标记的胰岛素的量，以测定胰岛素类似物竞争结合的能力并计算胰岛素类似物与胎盘胰岛素受体的相对亲和力(参见，例如，Weiss等人，(2001)J.Biol.Chem.276：40018-40024)。其他来源的胰岛素受体，包括其他天然地或重组地表达胰岛素受体的细胞，也可用于这类竞争性结合测定(Duttaroy等人，(2005)Diabetes 54：251-258)。

可体外评价胰岛素刺激葡萄糖摄取或实现其任何其他典型的代谢结果的能力。为了测量胰岛素刺激的葡萄糖摄取，在有或无胰岛素的情况下将脂肪细胞与标记的葡萄糖例如2-脱氧-D-[2，6³-H]葡萄糖或D-[U-¹⁴C]葡萄糖一起温育。然后测量掺入的放射性以测定存在或不存在胰岛素的情况下的葡萄糖摄取量(Louveau等人，(2004)J Endocrin.181：271-280，Duttaroy等人，(2005)Diabetes 54：251-258)。当评价胰岛素类似物的活性时，也可评价人胰岛素的活性并用于比较。也可进行评价在胰岛素存在下H4IIE细胞中的葡萄糖生成的体外测定(Wang等人，(2000)J.Bioche，275：14717-14721，Duttaroy等人，(2005)Diabetes 54：251-258)。

也可进行使用糖尿病或健康的动物模型或人类个体的体内试验，以评价胰岛素的治疗活性。可将胰岛素给药于糖尿病动物模型以评价例如对血糖水平、循环胰岛素水平和血红蛋白A1c(HbA1c)的作用。当葡萄糖与血红蛋白结合(这发生在血糖水平升高时)时，形成血红蛋白A1c。可通过例如HPLC、ELISA、RIA或其他免疫测定法评价血样中的HbA1c水平，健康个体的正常HbA1c值大约为4.0％-6.2％。美国糖尿病协会建议，对于糖尿病患者该值应低于7％(或在某些人中低于6％)以有助于预防糖尿病的并发症。可通过例如ELISA或RIA测量胰岛素水平。通常使用葡萄糖传感器或分析仪测量葡萄糖水平。

I型糖尿病动物模型包括非肥胖症→糖尿病(NOD)小鼠和BioBreeding(BB)大鼠(Atkinson等人，(1999)Nature Med.5：601-604)。2型糖尿病动物模型包括但不限于分别具有瘦素基因或瘦素受体突变的ob/ob小鼠和db/db小鼠、KK小鼠、Nagoya-Shibata-Yasuda(NSY)小鼠、Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠和Gato-Katazaki(GK)大鼠(Cefalu(2006)ILAR Journal47：186-198)。在其他实例中，使用健康动物在有或无乙酰透明质酸降解酶的情况下试验胰岛素活性。

b.乙酰透明质酸降解酶

可使用本领域熟知的方法评价乙酰透明质酸降解酶的活性。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定法通过测量使酶与HA于37℃反应30min后剩余的未降解的透明质酸，或乙酰透明质酸，(HA)底物，来间接测定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States PharmacopeiaConvention，Inc，Rockville，MD)。在测定中可使用透明质酸酶参比标准品(USP)或National Formulary(NF)标准透明质酸酶溶液以确定以单位计的任何透明质酸酶的活性。在一个实施例中，使用微浊度(microturbidity)测定法测量活性。它基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶性沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠(透明质酸)温育设定的时间段(例如10分钟)，然后通过加入酸化的血清白蛋白使未消化的透明质酸钠沉淀，来测量活性。在进一步的生成时间后，在640nm处测量所得样品的浊度。透明质酸酶对透明质酸钠底物的活性导致的浊度降低是透明质酸酶活性的量度。在另一实施例中，使用微量滴定测定法测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶温育后测量残留的生物素化的透明质酸(参见例如，Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，美国专利公布20050260186)。透明质酸的葡萄糖醛酸残基上的游离羧基被生物素化，生物素化的透明质酸底物共价偶联到微量滴定板上。与透明质酸酶温育后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应检测残留的生物素化的透明质酸，并和与已知活性的透明质酸酶标准品反应后获得的进行比较。其他测量透明质酸酶活性的测定法也为本领域已知并可用于本文的方法中(参见例如，Delpech等人，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashi等人，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。

也可评价乙酰透明质酸降解酶作为扩散剂或分散剂的能力。例如，可在有或无乙酰透明质酸降解酶的情况下将锥虫蓝染料皮下注射到裸鼠每侧的侧面皮肤中。然后例如使用微测径器(microcaliper)测量染料面积以测定乙酰透明质酸降解酶作为分散剂的能力(美国专利第20060104968号)。可使用动物模型和/或人类个体(例如在临床试验背景下)体内评价透明质酸酶与另一药剂例如胰岛素的联合给药对该药剂的药动学和药效学性质的作用，如上文所论述的和下文实例1中所说明的。可使用任何一种这些测定法将不为透明质酸酶的乙酰透明质酸降解酶的功能活性和透明质酸酶进行比较。这样做可以测定乙酰透明质酸降解酶的功能等价量。例如，可通过与锥虫蓝一起向小鼠腹侧皮肤注射乙酰透明质酸降解酶来评价它作为扩散剂或分散剂的能力，并且可测定达到与例如100单位的透明质酸酶参比标准品相同扩散量所需的量。因此，所需的乙酰透明质酸降解酶的量功能上等价于100个透明质酸酶单位。

H.治疗用途

本文描述的方法可以用于治疗使用速效胰岛素的任何病症。可与乙酰透明质酸降解酶联合皮下给药胰岛素，以治疗任何可用胰岛素改善的病症。通常将乙酰透明质酸酶降解酶与速效胰岛素联合给药。本节提供速效胰岛素的示例性治疗用途。下文描述的治疗用途为示例性的并且不限制本文所描述的方法的应用。治疗用途包括但不限于用于1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和用于危重患者的血糖控制的治疗。例如，可以在进食前以不连续的剂量(例如通过注射器或胰岛素笔)将乙酰透明质酸降解酶与速效胰岛素联合给药作为糖尿病患者的餐时胰岛素治疗以达到血糖控制。也可使用胰岛素泵或在闭环系统中，将速效胰岛素与乙酰透明质酸降解酶联合皮下或腹膜内给药以在整个白天和夜间持续控制血糖水平和/或控制餐后血糖波动。鉴别这些疾病或病症在治疗医生的技术范围之内。

如上文所讨论的，通常为每例个体个体化具体剂量和治疗方案。必要时，可凭经验确定或推断具体剂量、持续时间和治疗方案。例如，可将无乙酰透明质酸降解酶时的速效胰岛素的示例性剂量作为起点，以确定用于本文提供的方法的合适剂量。可基于各种因素例如个体体重、一般健康状况、年龄、所使用的具体化合物的活性、性别、饮食、代谢活性、血糖浓度、给药时间、排泄速率、药物联合、疾病的严重程度和病程以及患者对疾病的倾向(disposition)和治疗医生的判断来确定剂量水平。特别地，可测量血糖水平(例如通过血糖传感器测量)并用于确定为达到血糖控制而要给药的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的量。可用于基于本文提供的超速效组合物的吸收速率和吸收水平以及基于血糖水平来确定剂量的算法是本领域已知的。也可通过例如测定食物的碳水化合物含量来计算或调整用于餐后血糖控制的胰岛素剂量(Bergenstal等人，(2008)Diabetes Care，Lowe等人，(2008)Diabetes Res.Clin.Pract.，Chiesa等人，(2005)Acta Biomed.76：44-48)。

1.糖尿病

糖尿病(diabetes mellitus)(或糖尿病(diabetes))以葡萄糖代谢受损为特征。血糖来自吸收进入肠道的碳水化合物并由肝脏产生。升高的血糖水平刺激胰岛素释放。餐后葡萄糖注入(influx)可比所在两餐之间观察到的肝脏葡萄糖生成高20-30倍。持续10分钟或约10分钟的早期胰岛素释放抑制肝脏葡萄糖生成，之后是较长(后期)的释放期，其持续两小时或更多并处理(cover)餐时碳水化合物注入。在两餐之间，持续的低胰岛素水平，即基础胰岛素，满足正在进行的代谢需要，特别是调节肝脏葡萄糖输出以及脂肪组织、肌肉组织和其他目标部位对葡萄糖的利用的代谢需要。糖尿病患者出现升高的血糖水平(高血糖症)。糖尿病可分为两大类：1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的特征为胰脏中胰岛的产胰岛素β-细胞损失，导致胰岛素缺乏。β-细胞缺乏的主要原因是T细胞介导的自身免疫。2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，发生在β-细胞功能受损的患者中。这些患者有胰岛素抵抗或胰岛素敏感性降低，伴有胰岛素分泌减少。2型糖尿病，最终可能发展成1型糖尿病。糖尿病还包括妊娠糖尿病。可向糖尿病患者给药胰岛素用于维持基础胰岛素水平并防止例如进食后的血糖波动。

a.1型糖尿病

1型糖尿病是T细胞依赖性自身免疫性疾病，其特征为胰腺内分泌单位胰岛的浸润和β-细胞破坏，导致胰岛素产生不足和高血糖症。最常在儿童和年轻人中诊断出1型糖尿病，但也可在任何年龄诊断出。除了低胰岛素水平和高血糖水平之外，1型糖尿病患者也可出现多尿、多饮、多食、视力模糊和疲劳。可根据空腹血浆葡萄糖水平达到或超过126mg/dL(7.0mmol/l)、例如在葡萄糖耐量检测中75g口服葡萄糖负荷后两小时血浆葡萄糖水平达到或超过200mg/dL(11.1mmol/l)和/或随机血浆葡萄糖水平达到或超过200mg/dL(11.1mmol/l)对患者作出诊断。

用于1型糖尿病患者的主要治疗为作为替代疗法的胰岛素给药，其通常与血糖监测相结合。如果没有足够的替代胰岛素，可形成糖尿病酮症酸中毒，其可导致昏迷或死亡。可使用例如注射器、胰岛素笔或胰岛素泵向患者皮下注射速效胰岛素以整天维持适当的血糖水平，以及控制餐后血糖水平。在一些情况下，可使用胰岛素泵(包括在闭环系统中)腹膜内递送胰岛素。因此，可使用本文所描述的方法通过注射器、胰岛素笔或胰岛素泵，或任何其他可用于递送胰岛素的装置，向1型糖尿病患者皮下或腹膜内给药本文描述的超速效胰岛素组合物以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。

b.2型糖尿病

2型糖尿病与胰岛素抵抗相关，并且在一些群体中也由胰岛素缺乏(β-细胞功能丧失)引起。在2型糖尿病中，缺失第1相胰岛素释放并且第2相释放被延迟并且不足。在2型糖尿病患者中，餐时和餐后发生在健康个体内的胰岛素释放的急剧大量增加被延迟、延长并且量不足，从而导致高血糖症。可向2型糖尿病患者给药胰岛素以控制血糖水平(Mayfield等人(2004)Am Fam Physican 70：489-500)。这可与其他治疗和治疗方案包括节食、运动和其他抗糖尿病治疗剂(例如磺脲类、双胍类、氯茴苯酸类、噻唑啉二酮类和α-糖苷酶抑制剂)联合。因此，可使用本文所描述的方法通过注射器、胰岛素笔或胰岛素泵，或任何其他可用于递送胰岛素的装置向2型糖尿病患者皮下或腹膜内给药本文描述的超速效胰岛素组合物，以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。如本文其他地方所论述的，与相应的速效胰岛素相比，向2型糖尿病患者给药超速效胰岛素组合物除了达到更好的血糖控制外，还能够降低2型糖尿病患者的经常与胰岛素治疗相关的体重增加和肥胖症的风险。

c.妊娠糖尿病

之前从未患有糖尿病但在妊娠期间具有高血糖水平的孕妇被诊断为患有妊娠糖尿病。这种类型的糖尿病影响全部孕妇的约1-14％，取决于所研究的群体(Carr等人，(1998)Clinical Diabetes 16)。虽然潜在的诱因仍然未知，但似乎可能是在妊娠期间产生的激素降低了孕妇对胰岛素的敏感性。胰岛素抵抗机制可能是受体后缺陷，因为已经证明了胰岛素敏感细胞的正常胰岛素结合。胰脏释放1.5-2.5倍多的胰岛素以响应所引起的胰岛素抵抗增加。胰脏功能正常的患者可以满足这些要求。具有临界胰脏功能的患者难以增加胰岛素分泌并因此产生不足水平的胰岛素。因此，当胰岛素分泌延迟或不足时，妊娠糖尿病导致出现外周胰岛素抵抗增加。

可向妊娠糖尿病患者给药胰岛素来控制血糖水平。因此，可使用本文所描述的方法通过注射器、胰岛素笔或胰岛素泵，或任何其他可用于递送胰岛素的装置向妊娠糖尿病患者皮下给药本文描述的超速效胰岛素组合物，以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。

2.危重患者的胰岛素治疗

在医疗和/或手术中的危重患者中经常出现高血糖症和胰岛素抵抗并且与糖尿病和非糖尿病患者及具有外伤、中风、缺氧性脑损伤、急性心肌梗死、心脏术后和其他危重病因的患者的发病率和死亡率增加相关(McCowen等人(2001)Crit Clin.Care 17：107-124)。已使用胰岛素治疗具有高血糖症的危重患者以控制血糖水平。这种治疗可以降低这一组患者的发病率和死亡率(Van den Berghe等人(2006)N.Eng.J Med.354：449-461)。通常将胰岛素静脉给药至患者，例如由医生用注射器注射或使用胰岛素泵输注。在一些实施例中，使用算法和软件计算剂量。因此，可向具有高血糖症的危重患者给药本文提供的速效胰岛素组合物以控制血糖水平，藉此缓解高血糖症并降低发病率和死亡率。

I.联合疗法

本文描述的任何超速效胰岛素组合物可在其他治疗剂或操作包括但不仅限于其他的生物制品和小分子化合物之前、与其间歇地或在其之后与其合给药。对于适于使用或已使用速效胰岛素治疗并且也可用其他药物和治疗的任何疾病或病症，包括以上所有举例说明的那些，所述超速效胰岛素组合物可与其联合使用。根据待治疗的疾病或病症，示例性的联合包括但不限于与抗糖尿病药物的联合，所述抗糖尿病药物包括但不限于磺脲类、双胍类、氯茴苯酸类、噻唑啉二酮类、α-糖苷酶抑制剂、包括胰高血糖素样肽(GLP)类似物在内的肽类似物、抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂。在另一实施例中，本文所描述的超速效胰岛素组合物可在一种或多种包括速效胰岛素和基础作用胰岛素在内的其他胰岛素之前、与其间歇地或在其之后与其联合给药。

J.制品和药盒

本文提供的超速效胰岛素组合物、胰岛素和/乙酰透明质酸降解酶组合物可包装为包含包装材料、有效控制例如糖尿病或危重病个体的血糖水平的药物组合物以及标明所述超速效胰岛素组合物、胰岛素和/或乙酰透明质酸降解酶组合物为用于控制血糖水平的标签的制品。

本文提供的制品包括包装材料。用于包装药品的包装材料为本领域技术人员熟知的。参见，例如，美国专利第5,323,907、5,052,558和5,033,352号，每件专利以其整体通过援引纳入本文。药品包装材料的实例包括但不限于吸塑包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶子以及任何适合所选的制剂和预期的给药和治疗方式的包装材料。将本文提供的化合物和组合物的大量制剂设想作为用于止血疾病或障碍的各种治疗。

也可以作为药盒提供超速效胰岛素组合物、胰岛素和/或透明质酸酶降解酶组合物。药盒可包含本文描述的组合物和用于给药的物品。所述药盒也可包含其他药物组合物。在一个实施例中，所述药盒可包含本文提供的超速效胰岛素组合物、胰岛素和/乙酰透明质酸降解酶组合物中的一种或多种，以及一种或多种其他胰岛素组合物，例如，包括结晶胰岛素在内的慢效胰岛素或中效胰岛素，或者它们的任意组合。所述超速效胰岛素组合物、胰岛素和/或透明质酸酶降解酶组合物和/或其他药物组合物可与给药装置一起提供，例如注射器、胰岛素笔、泵、或者插入胰岛素笔、泵或其他递送装置内的容器。所述药盒可任选包含施用说明书(包括剂量、给药方案)和给药方式说明书。药盒也可包含本文描述的药物组合物和用于诊断的器件。例如，该类药盒可包含葡萄糖监测器或传感器。

例如，所述药盒也可包含以单独的容器和不同剂量提供的多种速效胰岛素组合物、或其他胰岛素组合物包括一种或多种基础作用胰岛素，藉此提供给使用者根据涉及实际或预期出现的高血糖症的具体情况选择给定胰岛素剂量例如餐时剂量的机会。

K.实施例

包括以下实施例仅用于举例说明并且无意限制本发明的范围。

实施例1

重组人PH20(rHuPH20)和速效胰岛素的联合给药有助于改善药动学和药效学

将包括胰岛素类似物在内的胰岛素给药于患有糖尿病的个体用于控制高血糖症。为了更有效地复制在健康个体中观察到的正常生理性餐时胰岛素释放，进行了临床研究以测定联合给药重组人PH20(rHuPH20)是否可以增加所给药的速效胰岛素的早期吸收速率和吸收量。吸收增加可导致所述速效胰岛素更加速效，并因此更近似地模拟在健康个体中观察到的内源性胰岛素-时间曲线。在糖尿病个体的更好的血糖控制和减少体重增加方面，这可提供临床益处。设计所述临床研究以评价单独或与rHuPH20联合皮下给药时R胰岛素和赖脯胰岛素(二者均为如本文所述的速效胰岛素)的安全性、耐受性、药动学(PK)和药效学(PD)。

实施例1a

与或不与rHuPH20联合给药的情况下

R胰岛素和

赖脯胰岛素在健康(无糖尿病)个体中的药动学和药效学

进行随机、双盲、交叉、两阶段、连续的对照研究(2-arm study)，以评价在与或不与rHuPH20联合给药的情况下皮下给药20单位的

赖脯胰岛素或R胰岛素。二十五名健康成年男性个体入选本研究。在第1阶段，12名个体接受赖脯胰岛素和rHuPH20的皮下注射以及仅

赖脯胰岛素的单独皮下注射剂。注射通常间隔7天，一半个体首先接受

赖脯胰岛素和rHuPH20，然后接受单独的

赖脯胰岛素，一半的个体首先接受单独的

赖脯胰岛素，然后接受

赖脯胰岛素和rHuPH20。在第2阶段，13名个体接受R胰岛素和rHuPH20的皮下注射以及仅

R胰岛素的单独皮下注射剂。注射一般间隔7天，约一半个体首先接受

R和rHuPH20，然后接受单独的

R胰岛素，一半个体首先接受单独的

R胰岛素然后接受

R胰岛素和rHuPH20。

每次注射前约14小时，每名个体进食根据美国糖尿病协会2000卡路里膳食计划的含有60g碳水化合物的正餐。也提供30g碳水化合物的点心。正餐后约6小时，个体开始禁食(水除外)至少8小时，然后开始持续8小时的高血胰岛素-正常血糖钳操作。采集治疗前的血样，并在给个体注射

赖脯胰岛素、

赖脯胰岛素/rHuPH20、

R胰岛素或

R胰岛素/rHuPH20之前和高血胰岛素-正常血糖钳操作开始后2小时测量生命体征和体重。在如下文所述的规定时间间隔采集血样并对6小时内的葡萄糖和胰岛素水平进行定量。

A.给药

如上文所述，在本研究第一阶段在左下腹象限向12名个体皮下给药220μL的20U赖脯胰岛素和300U rHuPH20以及220μL的20U

赖脯胰岛素。通过首先在室温下融化rHuPH20(1mg/mL，约等于pH～7.0的10mM HEPES/130mM NaCl中120,000U/mL)一小时并将0.153cc(等于18,360U)rHuPH20无菌吸取到0.3cc容量的胰岛素注射器中，来制备

赖脯胰岛素/rHuPH20剂量。然后将0.153cc rHuPH20缓慢转移到包含1.17mL 150U/mL HYLENEX(rHuPH20)的小瓶中。从此小瓶吸取1.1mL并转移到包含从小瓶中吸取的约10.2mL 100U/mL

赖脯胰岛素的小瓶中。接着使用0.3cc容量的胰岛素注射器吸取二百二十微升的赖脯胰岛素/rHuPH20混合物并在4小时内用于一名个体的皮下给药。

因此，所递送的

赖脯胰岛素/rHuPH20混合物为220μL并包含300U rHuPH20(2.5μg)、20U

赖脯胰岛素、0.02mg HumanSerum Albumin(来自Hylenex制剂(用于稳定rHuPH20防止吸附性损失并可具有相对于胰岛素的稳定化性质和/或作为除氧剂)；3mg甘油(来自

赖脯胰岛素制剂(作为pH缓冲剂、胰岛素稳定剂和/或张力调节剂))；0.6mg间甲酚(来自赖脯胰岛素制剂(以高浓度存在的抗微生物生长防腐剂，用于稳定胰岛素六聚体构象))；0.004mg锌(来自

赖脯胰岛素制剂用于稳定胰岛素六聚体构象)；0.18mg NaCl(来自Hylenex制剂和rHuPH20 API，作为张力调节剂)；0.4磷酸氢二钠(来自Hylenex制剂，作为pH缓冲剂)；0.017mg EDTA二钠(来自Hylenex制剂，作为金属螯合剂，具有结合Zn²⁺和Ca²⁺离子的能力)；0.006mg氯化钙(来自Hylenex制剂，与EDTA形成复合物并可提高皮下注射的舒适度)；0.006mg HEPES(来自rHuPH20API制剂，作为pH缓冲剂)；水(作为溶剂)以及用于调节pH的NaOH和/或HCl。

在第2阶段，如上所述，在左下腹象限向13名个体皮下给药200μL的20U Humulin R胰岛素和240U rHuPH20二者以及200μL的20U

R胰岛素。通过首先用0.3cc容量的胰岛素注射器从

R胰岛素小瓶中吸取0.3cc(150U)并将其转移到包含1.2mL 1500U/mLrHuPH20(配制成10X HYLENEX组合物)的小瓶中，来制备

R胰岛素/rHuPH20剂量。将该混合物轻轻地混合并在使用0.3cc容量的胰岛素注射器吸取200μL(包含20U

R胰岛素和240 U rHuPH20)之前从小瓶中去除0.3cc空气。在4小时内将其用于一名个体的皮下给药。通过使用单个注射器制备200μL剂量中20UR胰岛素。

因此，所递送的

R胰岛素/rHuPH20混合物为200μL并包含240USP U rHuPH20(2μg)、20U

R胰岛素、0.16mg Human SerumAlbumin(来自10X HYLENEX制剂，用于稳定rHuPH20防止吸附性损失，也潜在地提供相对于胰岛素稳定化性质和/或作为除氧剂)；3mg甘油(来自

R制剂，作为pH缓冲剂、胰岛素稳定剂和/或张力调节剂))；0.4mg间甲酚(来自

R制剂(以高浓度存在作为抗微生物生长防腐剂，以稳定胰岛素六聚体构象))；1.36mg NaCl(来自10X Hylenex制剂和rHuPH20API，作为张力调节剂)；0.224磷酸氢二钠(来自10X Hylenex制剂，作为pH缓冲剂)；0.161mg EDTA二钠(来自10X Hylenex制剂，作为金属螯合剂，具有结合Zn²⁺和Ca²⁺离子的能力)；0.048mg氯化钙(来自10X Hylenex制剂，与EDTA形成复合物并可提高皮下注射的舒适度)；水(作为溶剂)以及用于pH调节的NaOH和/或HCl。

B.高血胰岛素-正常血糖钳操作

通过采集血样测量胰岛素(即

赖脯胰岛素或

R胰岛素)和葡萄糖水平评价联合给药rHuPH20对皮下给药的

赖脯胰岛素或R胰岛素的药动学和药效学的作用。使用高血胰岛素-正常血糖钳操作来维持90-110mg/dL的血浆糖水平使得给药胰岛素制剂不引起低血糖症。

该操作包括首先获得个体的体重和身高并在以坐位休息5分钟后测量生命体征。将两只手臂放置在加热垫中以使静脉扩张然后插入IV导管。将一个导管置于一只手臂的肘前静脉中用于经两个单独的旋塞(stop cock)进行20％右旋糖的输注。将另一个动脉内导管置于另一手臂中用于采集动脉血以检测葡糖糖。可从葡糖糖输注部位撤去加热垫，但是逆行导管部位应保持于65℃。在注射胰岛素制剂前30分钟获得起始的血样以测量基线葡萄糖。在注射

赖脯胰岛素、

赖脯胰岛素/rHuPH20、

R胰岛素、或

R胰岛素/rHuPH20前10分钟和1分钟采集血样，然后在前60分钟内每三分钟采集一次血样，从60分钟至3小时每15分钟采集一次血样，其后至6小时每小时采集一次血样。在整个操作中使用YSI 2300 Glucose Analyzer(YSI Inc.)分析每一名个体的葡萄糖水平并在必要时调节葡萄糖输注速率(GIR)以将血糖维持在90-110mg/dL。使用量化

赖脯胰岛素和

R胰岛素(Millipore BioPharmaServices Division，St.Charles MO)水平的放射免疫吸附测定法(RIA)分析胰岛素的循环浓度。

C.联合给药rHuPH20对速效胰岛素药动学的作用

测量若干参数以测定联合给药rHuPH20对速效胰岛素组合物

赖脯胰岛素和

R胰岛素的药动学的作用。这些包括在所选给药间隔中测量到的最大胰岛素浓度(C_max)；达到C_max的时间(t_max)；以及浓度-时间曲线下面积(AUC)(评价多个时间间隔的AUC)。

1.rHuPH20和

胰岛素联合给药对胰岛素药动学的作用

通过RIA评价

赖脯胰岛素、或

赖脯胰岛素/rHuPH20给药后各时间间隔的胰岛素浓度，并分别显示于表5和6。也提供了不同时间间隔(0分钟至x分钟；例如AUC_0-3分钟，AUC_0-6分钟，AUC_0-9分钟等)的AUC，其作为相对生物利用度(F_rel)，计算为[AUC_0-x(

R胰岛素+rHuPH20)]/[AUC_0-x(单独

R胰岛素]*100。也显示通过计算一段时间间隔内胰岛素水平几何平均值的变化而确定的增量斜率，其为斜率变化平均值(其为三个增量斜率值的平滑移动平均值(smoothedaverage))。

表5.

赖脯胰岛素给药后血中的胰岛素浓度

表6.

赖脯胰岛素和rHuPH20联合给药后血中的胰岛素浓度

赖脯胰岛素以及与rHuPH20联合给药的

赖脯胰岛素的C_max(pmol/L)、t_max(分钟)和AUC_0-360(min*pmol/L)提供于表7。不同时间间隔的AUC提供于表8。该结果表明接受

赖脯胰岛素/rHuPH20剂量的个体比仅单独给药

赖脯胰岛素的个体在早期时间间隔具有更大的

赖脯胰岛素暴露。表9提供了各给药顺序(例如，首先(1)或然后(2)给药的Humalog赖脯胰岛素/rHuPH20以及二者(全部)的PK)具体PK参数的总结以及表明给药顺序对所观察到的药动学无作用的统计学总结。该统计学分析测定了使用不同治疗组(即单独的赖脯胰岛素对比

赖脯胰岛素/rHuPH20)观察到的PK差异的p-值以及使用不同给药顺序(即先单独给药

赖脯胰岛素然后给药

赖脯胰岛素/rHuPH20，对比先给药

赖脯胰岛素/rHuPH20然后单独给药

赖脯胰岛素)的PK差异的p-值。表中也提供了相对生物利用度(F_rel)，其计算为[AUC_0-360(

胰岛素/rHuPH20)]/[AUC_0-360(单独

胰岛素]*100。

对于胰岛素的PK，在联合给药rHuPH20的情况下，t_max中值从105min减少到48min，减少了50％(p＝0.0006)，在所有12名个体中均观察到该作用。C_max平均值从仅向个体给药赖脯胰岛素的697pmol/L增加到联合给药rHuPH20时的1,300pmol/L，增加了87％(p＝0.0003)。AUC_0-360min从134,867min*pmol/L增加到149,523min*pmol/L，增加了11％，但是早期时间间隔的差异更明显(即AUC_0-30min和AUC_0-60min分别增加了155％和140％)。t_max的个体之间差异(SD/平均值)从个体接受单独的

赖脯胰岛素时的34％改善至个体接受与rHuPH20组合的

赖脯胰岛素时的17％。这一实施例证明，通过与乙酰透明质酸降解酶(rHuPH20)联合给药，使

赖脯胰岛素成为本文描述的超速效胰岛素。

表7.与或不与rHuPH20联合给药的情况下皮下

赖脯胰岛素注射后的胰岛素药动学

表8.单独的或与rHuPH20联合给药的赖脯胰岛素的胰岛素浓度几何平均值的时间间隔AUC

^a差异百分数：(AUC_0-x[rHuPH20]-AUC_{0-x[无rHuPH20]})/(AUC_{0-x[无rHuPH20]})

表9.

赖脯胰岛素的给药顺序对所观察到的药动学的作用

2.rHuPH20和

R胰岛素联合给药对胰岛素药动学的作用

在第2阶段，患者或者首先接受

R胰岛素/rHuPH20给药，然后通常在7天后接受单独的

R胰岛素，或者首先接受单独的

R胰岛素给药，然后通常在7天后接受

R胰岛素/rHuPH20给药。

R胰岛素或与rHuPH20联合给药的

R胰岛素给药后各时间点的胰岛素浓度分别提供于表10和11。不同时间间隔的AUC(即0至x分钟(AUC_(0-x))的AUC；例如AUC_0-3分钟、AUC_0-6分钟、AUC_{0-9 分钟}等)(表10、11和12)作为相对生物利用度(F _rel)，其计算为[AUC_0-x(

R胰岛素/rHuPH20)]/[AUC_0-x(单独

R胰岛素]*100。也显示了通过计算一段时间间隔内胰岛素水平几何平均值而确定的增量斜率，其为斜率变化平均值(其为五个增量斜率值的平滑移动平均值)。

表10.

R胰岛素给药后血中的胰岛素浓度

表11.联合给药R insulin和rHuPH20后血中的胰岛素浓度

表12.单独的或与rHuPH20联合给药的R胰岛素胰岛素浓度几何平均值的时间间隔AUC

^a差异百分数：(AUC_0-x[rHuPH20]-AUC_{0-x[无rHuPH20]})/(AUC_{0-x[无rHuPH20]})

3.与和不与rHuPH20联合给药的情况下胰岛素和

R胰岛素的药动学比较

比较与和不与rHuPH20联合给药的情况下赖脯胰岛素和

R胰岛素的药动学。图1显示了各时间间隔胰岛素浓度几何平均值(各组合物的所有个体)的曲线。对于和

R二者，浓度时间曲线向上(更高的胰岛素浓度)和向左(时间更快)移。例如，在rHuPH20存在下，与对照相比，

的最大胰岛素浓度(C_max)几何平均值几乎加倍(从697到1200pmol/L)，且

R大于两倍(从433到967pmol/L)。相似的，在rHuPH20存在下，与对照相比，

R(从105到48分钟)和

(从165到60分钟)达到这一最大浓度的时间(t_max)中值减少。在早期时间点向更高浓度的位移与吸收速率增加和恒定的消除速率一致。因此，联合给药rHuPH20增加了速效胰岛素类似物

赖脯胰岛素和速效正规胰岛素

R胰岛素的吸收速率。

天然餐时胰岛素反应包括进食后最初的10-15分钟出现的立即大量释放(bolus)。胰岛素水平的这一快速升高提供引起停止肝脏向体循环释放萄糖的重要生理学信号。因此，15分钟内胰岛素浓度升高是尤其重要的参数。上文显示的数据证明无rHuPH20时，给药后15分钟赖脯胰岛素浓度几何平均值从它们的给药前水平增加了70％(从65到112pmol/L)，但是与rHuPH20联合给药后，浓度大于四倍(从64到264pmol/L)。更显著的是，无rHuPH20时给药的

R的胰岛素浓度几何平均值仅略微增加(从62到74pmol/L)，但是当与rHuPH20联合给药时再一次大于四倍(从53到251pmol/L)。因此，与rHuPH20联合给药提供胰岛素浓度的快速升高，其更好地表示健康个体中早期生理性餐时胰岛素反应。

天然餐时反应持续约2小时并提供对进餐时间碳水化合物的血糖控制，因此最初约2小时的累积全身胰岛素暴露是另一尤其重要的参数。根据本文提供的数据，存在rHuPH2时，相对于对照，

(从50,000到87,000min*pmol/L)和R(从30,000到77,000min*pmol/L)最初两小时的胰岛素几何平均值曲线下累积面积(AUC_0-120)增加了。相似地，天然餐时反应在进食后约4小时有效结束，餐后时间的胰岛素暴露可导致低血糖波动。存在rHuPH2时，相对于对照，

(从31,000到20,000min*pmol/L)和

R(从35,000到20,000min*pmol/L)从4小时直到第6小时(AUC_240-360)后期观察期间的相应暴露减少。因此，与对照相比与rHuPH20联合给药时，与rHuPH20联合给药将期望的胰岛素暴露分别增加175和256％并将不期望的胰岛素暴露分别减少67和58％。

胰岛素给药的药动学的患者间差异性要求医生在亚治疗水平对患者开始进行胰岛素疗法并逐渐增加剂量以避免给予患者的剂量过多和发生低血糖事件的风险。药动学的差异性可表示为用作关键参数的变异系数(CV；定义为标准偏差/平均值，通常表示为百分数)。存在rHuPH20时，相对于对照，

(从48％到35％)和

R(从34％到26％)在个体之间比较的最大浓度(C_max)的CV减少了。存在rHuPH20时，相对于对照，

(从48％到35％)和

R(从32％到28％)的达到最大浓度的时间(t_max)的CV减少了。上述数据表明存在rHuPH20时，相对于对照，

(从147％到141％)和

R(从165％到40％)在给药后最初15分钟的胰岛素浓度变化的CV减少了。存在rHuPH20时，相对于对照，

(从41％到22％)和

R(从34％到26％)在最初2小时的累积胰岛素暴露(AUC_0-120)的CV减少了。因此，相对于对照，与rHuPH20联合给药的胰岛素的胰岛素药动学的患者间差异减少了。

联合给药rHuPH20改善了R的药动学，从而药动学基本类似于

赖脯胰岛素与rHuPH20联合给药时的药动学曲线。具体地，当与rHuPH20联合给药时，两个不同类型的胰岛素在最初20分钟的胰岛素吸收速率和胰岛素血清浓度是相当的(参考表9和13)。相反，当不给药rHuPH20时，与

赖脯胰岛素相比，在早期时间间隔

R胰岛素显示慢得多的吸收速率和减少的吸收水平。因此，乙酰透明质酸降解酶rHuPH20与速效胰岛素的联合得到在早期(即小于给药后20分钟)比单独的速效胰岛素作用更快并且程度更高的组合物，且基本与速效胰岛素的类型无关。

D.联合给药rHuPH20对葡萄糖输注速率(GIR)药效学的作用

为了评价与rHuPH20联合给药对葡萄糖输注速率(GIR)的药效学作用，测定有和无rHuPH20时给药

R的个体的各种药效学(或葡萄糖药效学(glucodynamic)(GD))参数。这些参数包括达到最大效力的时间(tGIR_max)(分钟)；达到后期半最大效力的时间(tGIR_后期50％)(分钟)；达到早期半最大效力的时间(tGIR_早期50％)(分钟)；最大代谢效力(GIR_max)(mL/hr)；AUC-GIR_0-60min；AUC-GIR_0-120min；AUC-GIR_0-180min；AUC-GI_R0-240min；AUC-GIR_0-300min和AUC-GIR_0-360min。GIR表示为每小时输注的右旋糖毫升数(mL/hr)，其可使用下式转化为mg/kg/min：

GIR(mg/kg/min)＝[IV输注速率(mL/hr)×右旋糖浓度(g/dL)×0.0167/个体体重(kg)

其中右旋糖浓度＝190.6mg/mL。

1.rHuPH20和

胰岛素联合给药对GIR药效学的作用

计算单独的

赖脯胰岛素、或

赖脯胰岛素/rHuPH20给药后各时间间隔的葡萄糖输注速率并分别显示于表13和14。也计算了AUC(与累积葡萄糖给药成正比)和相对AUC(F_rel)。也显示了通过计算一段时间间隔的GIR变化而测定的增量斜率。

表13.

赖脯胰岛素给药后的葡萄糖输注速率

表14.赖脯胰岛素和rHuPH20联合给药后的葡萄糖输注速率

也测定了这些个体各时间间隔的GIR_max、t_max和AUC-GIR并显示于表15和16。表17提供了各给药顺序的PD参数总结(例如，首先(1)或然后(2)给药的

赖脯胰岛素/rHuPH20以及二者(全部)的GIR PD)以及测定给药顺序是否影响所观察的药效学的统计学分析。该统计学分析测定使用不同治疗组(即单独的

赖脯胰岛素对比

赖脯胰岛素/rHuPH20)观察到的PD差异的p-值，以及使用不同给药顺序(即先单独给药赖脯胰岛素然后给药

赖脯胰岛素/rHuPH20对比先给药

赖脯胰岛素/rHuPH20然后单独给药赖脯胰岛素)观察到的PK差异的p-值。

表15.与和不与rHuPH20联合给药的情况下皮下

赖脯胰岛素注射后的胰岛素药效学

NC＝未计算

表16.与和不与rHuPH20联合给药的情况下皮下

赖脯胰岛素注射后的胰岛素药效学-间隔GIR-AUC

表17.

赖脯胰岛素给药顺序对所观察到的药效学的作用

葡萄糖输注速率PD数据支持PK测量值，显示当联合rHuPH20向患者给药赖脯胰岛素(中值135分钟)时与单独的

赖脯胰岛素(中值210分钟)给药相比，达到最大效力的时间(tGIR_max)缩短了36％，最大代谢效力(GIR_max)从个体接受单独的赖脯胰岛素时的平均值181mL/hr增加到个体接受

赖脯胰岛素和rHuPH20时的205mL/hr，增加了13％(p＝0.35)。达到早期半最大效力的时间(tGIR_早期50％)从向患者给药单独的

赖脯胰岛素时的中值68分钟减少到联合rHuPH20向个体给药赖脯胰岛素时的42分钟，减少了38％(p＝0.0006)。

2.rHuPH20和

R胰岛素联合给药对GIR药效学的作用

在第2阶段，患者或者首先接受

R胰岛素/rHuPH20给药，然后通常在7天后接受单独的

R胰岛素给药，或者首先接受单独的

R胰岛素给药，然后通常在7天后接受R胰岛素/rHuPH20给药。计算给药单独的

R胰岛素、或

R胰岛素/rHuPH20后各时间间隔的葡萄糖输注速率并分别显示于表18和19。也计算了AUC和各时间输注的相对葡萄糖量(G_rel)。也显示了通过计算一段时间间隔GIR变化而确定的增量斜率。

表18.

R胰岛素给药后的葡萄糖输注速率

表19.

R胰岛素和rHuPH20给药后的葡萄糖输注速率

3.与和不与rHuPH20联合给药的情况下

赖脯胰岛素和R胰岛素的药效学的比较

比较与和不与rHuPH20联合给药的情况下

赖脯胰岛素和

R胰岛素的药效学。评价联合给药rHuPH20对各类型的胰岛素的药效学的相对作用。图2显示了各时间间隔的葡萄糖输注速率的曲线。观察到，与无rHuPH20时给药胰岛素相比，rHuPH20和

或

R联合给药显著地将随时间变化的葡萄糖输注速率上移和左移，与胰岛素浓度-时间曲线的移动相似。相对于对照，与rHuPH20联合给药的

的最大输注速率从平均值201略微增加到221mL/hr，与rHuPH20联合给药的

R从187略微增加到203mL/hr。相似的，相对于对照，与rHuPH20联合给药的的最大GIR时间从193分钟减少到136分钟，与rHuPH20联合给药的

R从253分钟减少到206分钟。相对于对照，与rHuPH20联合给药的

的通过达到早起半最大GIR的时间(tGIR_早期50％)测得的起效从72分钟减少到43分钟，与rHuPH20联合给药的

R从113分钟减少到83分钟。

在进餐后视碳水化合物的类型而定的最初数个小时(例如2-4)中进餐时间碳水化合物被大量消化并进入体循环，因此最初2或3个小时(例如，从0到120分钟)的累积GIR尤其相关。相对于对照，与rHuPH20联合给药的

最初2小时递送的190.6mg/mL葡萄糖溶液的累积体积从163mL增加到248mL，与rHuPH20联合给药的R从112mL增加到226mL。进餐时间碳水化合物消化完毕后的过度的葡萄糖代谢可导致不利的低血糖事件。相对于对照，与rHuPH20联合给药的

从第4到第6小时递送的葡萄糖溶液的累积体积从289mL减少至212mL，与rHuPH20联合给药

R从337mL减少到252mL。因此，将rHuPH20与速效胰岛素类似物或速效正规胰岛素制剂联合给药增加早期降低葡萄糖的能力以促进餐后消化并在葡萄糖降低活性可导致低血糖波动时减少葡萄糖降低活性。

GIR反映身体利用的葡萄糖的量(即当身体使用更多的葡萄糖时，需要输注更多的外源葡萄糖以将血糖水平维持在90-110mg/dL)，因此，也反映给药的胰岛素的药理学活性(即胰岛素活性引起内源性葡萄糖输出减少和/或血糖利用增加，引起血糖整体降低)。因此，这些数据表明当与乙酰透明质酸降解酶rHuPH20联合给药时，相对于不与rHuPH20联合给药的胰岛素，各胰岛素的生物学作用在速度(葡萄糖代谢的开始)和程度上均大量增加。

在这一研究中，当与rHuPH20联合给药时，

R胰岛素的药效学性质得到改善，由此该药效学性质类似于当与rHuPH20联合给药时

的药效学曲线，与无rHuPH20给药时

R胰岛素相对于

赖脯胰岛素大量延迟的药效学性质相反。当与rHuPH20联合给药时，两种不同类型的胰岛素在注射后最初60分钟将血糖水平维持在90-110mg/dL所需的GIR以及推而广之的胰岛素的药理学活性(特别是注射后最初60-90分钟)，是基本相同的。相反，和不与HuPH20联合给药时的

赖脯胰岛素相比，不与rHuPH20联合给药时的速效正规胰岛素

R具有显示较慢的胰岛素作用速率的GIR曲线。因此，乙酰透明质酸降解酶rHuPH20和速效胰岛素在那些例如本研究所描述的条件下的联合可得到比单独的所述速效胰岛素作用更快并且程度更高的超速效胰岛素组合物，且在早期(即小于给药后60分钟)基本与速效胰岛素的类型无关。

实施例1b

在与和不与rHuPH20联合给药的情况下皮下注射的

赖脯胰岛素或

R胰岛素在进食流食后在I型糖尿病患者中的药动学和餐后血糖响应

进行了评价在与和不与rHuPH20联合给药的情况下皮下注射的

赖脯胰岛素和R胰岛素在进食流食后在I型糖尿病患者中的药动学和餐后血糖响应(即药效学(PD))的试验。该试验为I型糖尿病患者中的单盲(仅患者设盲)、单中心、交叉、流食试验(包括一系列标准化的流食负荷)，在给药前2小时和给药后8小时采集血样用于PK和PD参数分析。

每一名个体经历一系列的

赖脯胰岛素和rHuPH20的剂量探索(dose-finding)就诊(就诊2A-C；共三次注射)以确定当与rHuPH20一起注射时可以最佳血糖控制(定义为将患者的餐后血糖维持在60mg/dL到160mg/dL的范围)处理流食的合适的个体胰岛素剂量。一经确定，将这一相同的经优化的剂量应用于被赖脯胰岛素在无rHuPH20的情况下处理的试验食物(第3次就诊)。然后使用正规人胰岛素(R胰岛素)使个体经历相同系列的研究(就诊4A-B；共两次注射)以确定用于最佳血糖控制的与rHuPH20一起时的合适的个体正规胰岛素剂量。将同一经优化的剂量用于被

R胰岛素在无rHuPH20的情况下处理的试验食物(第5次就诊)。

本试验允许比较在有或无rHuPH20的情况下给药餐时胰岛素时的PK曲线和餐后葡萄糖波动。也评价了餐后低血糖症以验证任何观察到的PK差异的临床相关性。主要目的为了比较早期胰岛素暴露，其通过在流食之前在有和无重组人透明质酸酶(rHuPH20)的情况下皮下注射(SC)的

赖脯胰岛素和R胰岛素的AUC_0-60的主要药动学(PK)终点来测定。所测定的其他胰岛素PK参数包括C_max；t_max；早期t_50％(达到早期半最大血清浓度的时间)、后期t_50％(达到后期半最大血清浓度的时间)、AUC_最终(从时间0到最后一次观察的浓度-时间曲线下面积，根据方案其为给药后480分钟)；AUC_(0-inf)(从时间0到无穷大的总AUC)；时间间隔AUC(0-15分钟、0-30分钟、0-45分钟、0-60分钟、0-90分钟、0-120分钟、0-180分钟、0-240分钟、0-360分钟、0-480分钟、15-480分钟、30-480分钟、45-480分钟、60-480分钟、90-480分钟、120-480分钟、180-480分钟和240-480分钟)、λz(终末消除速率常数；通过对数线性血清浓度-时间曲线的终点的线性回归测定)；t1/2(消除半衰期，定义为0.693/λz)；CL/F(随生物利用度变化的消除；计算为剂量/AUC(0-inf))；MRT(最终)(从时间0到最后一次观察的平均滞留时间，根据方案其为给药后480分钟)；MRT(0-inf)(从时间0到无穷大的平均滞留时间)，以及随生物利用度变化的Vz/F分布体积。

药效学(PD)终点为餐后血糖响应参数，包括AUC_BG 0-4h(其中BG表示血糖)，其他PD终点，包括特定时间间隔的AUC_BG、BG_max、t_BGmax、早期t_BG 50％、后期t_ag50％、特定时间间隔的低血糖事件(HE)、用于治疗低血糖症的20％葡萄糖溶液的输注(量和持续时间)、使用50％葡萄糖溶液用于紧急复苏(即，存在严重症状和/或血糖＜36mg/dL)和通过高于36mg/dL和低于70mg/dL血糖的AUC定量的低血糖波动。也评价了安全性参数例如不良反应、血液学、生物化学、尿液分析、体检、生命体征、ECG、血糖、注射部位的局部耐受性以及对胰岛素药物和rHuPH20的抗体形成。

A.患者筛选

患有I型糖尿病，用胰岛素治疗≥12个月的男性和女性患者具有资格进入本试验。要求患者为18至65岁。要求育龄女性在试验期间采用标准和有效的节育方法。其他入选条件包括：BMI 18.0至29.0kg/m²，含端点；基于当地的实验室结果的HbA1c(糖基化血红蛋白A1c)≤10％；空腹C-肽＜0.6ng/mL；当前胰岛素治疗＜1.2U/kg/日。也要求基于医疗史和体检，患者一般健康状况良好，无可能妨碍完成试验药物注射和本方案所要求的评价的医学病症。

各种试验排除条件包括：已知或疑似对本试验中任何试验药物的任何组分过敏；之前招募于本试验中；患有增殖性视网膜病或黄斑病变和/或严重神经病特别是自主神经病的患者；胃肠道、心血管(包括心律不齐或ECG传导延迟的病史)、肝脏的、神经学上的、肾脏的、泌尿生殖或血液系统的临床显著活动期疾病或未控制的高血压(仰卧位5分钟后舒张压≥100mmHg和/或收缩压≥160mmHg)；可能混淆本试验结果或造成向患者给药本试验药物的附加风险的任何病症或疾病史；常规实验室数据中具有临床意义的发现；筛选时具有低于正常值下限的血红蛋白的贫血尤其被排除在外；使用可能干扰试验结果分析或已知引起对胰岛素作用、葡萄糖利用或低血糖症恢复的临床相关干扰的药物；由研究者判断的复发性严重低血糖症或不自觉低血糖症；当前有酒精成瘾或物质滥用(substances ofabuse)；在本试验2A就诊(见章节B，下文)前9周内献血(＞500mL)；怀孕，哺乳，计划怀孕或未采取充分的避孕措施(充分的避孕措施包括绝育、子宫内避孕器[IUD]、口服或注射避孕药或屏障方法)；精神残疾(mentalincapacity)、不愿意、或存在妨碍充分理解或协作的语言障碍；有症状的胃轻瘫；在本试验的2A就诊的4周内接受任何研究用药物(见章节B，下文)；可干扰试验参与或数据评价的任何病症(内在的或外在的)；目前使用胰岛素泵疗法且不愿意在试验期间换成与短效胰岛素联用的Lantus。

二十一名可评价的患者完成了本试验：14名男性；7名女性；年龄＝41.6±10.6岁；BMI＝24.4±286kg/m²)。可评价的患者为完成就诊3和就诊5并具有用于终点分析的足够的血液采样和安全性评价的患者。通过招募另外的患者取代任何未完成全部方案规定的试验药物注射和/或经过就诊5不具有足够的血液采样和安全性评价的患者。

B.试验方法

1.就诊操作

每一名患者参与筛选就诊(就诊1)以确定参与本试验的资格。一旦被招募，每一名患者则接受至少一次和最多三次的剂量探索就诊2A-C(赖脯胰岛素和rHuPH20)，一次给药就诊3(单独的

赖脯胰岛素)、至少一次并且最多两次的剂量探索就诊4A-B(

R胰岛素和rHuPH20)、一次给药就诊5(单独的

R胰岛素)以及一次随访(就诊6)。

参与本试验并且正在使用胰岛素泵、NPH或任何其他长效胰岛素的患者在本试验期间转换成Lantus。一旦个体通过筛选评价，但至少在他们第一次给药就诊前36小时，进行该转换。

每一次剂量探索就诊和每一次给药就诊均在一天完成。早晨登记后，观察患者，并使用使血糖达到100mg/dL目标值的静脉内葡萄糖和/或胰岛素，使患者稳定约2小时。在紧邻给药前30分钟内不允许进行任何的胰岛素或葡萄糖输注。然后给药受试品(即

赖脯胰岛素、

赖脯胰岛素/rHuPH20、

胰岛素、或

胰岛素/rHuPH20)，然后在约8:30AM时食用流食。在所有的给药就诊中，进行8小时的PK和PD评价直到约4:30PM，此时，患者进食并经判断安全后放行。

2.剂量探索就诊操作的准备

将18-标准规格导管插入相同手臂的肘静脉用于使用YSI STAT2300Glucose Analyzer进行血清胰岛素和血糖分析。通过用0.15mmol/L盐水冲洗来防止导管和线路中的血液凝固。将第二个18-标准规格PTFE导管置于对侧前臂的静脉中，用于在给药前阶段在认为适当时进行20％葡萄糖溶液、盐水和胰岛素的输注。给药前六十分钟，用YSI STAT2300 Glucose Analyzer在以下相对于给药的时间点测定血糖浓度：-60、-30、-20和-10min。用-30、-20和-10min的血糖读数的平均值来测定各剂量探索和给药就诊的各患者的空腹葡萄糖水平。对于起始空腹血糖值差异被认为太大的患者，重新安排就诊或使其退出本试验。

3.给药前阶段

在2小时的导入(run-in)阶段期间，视情况需要，监测血糖以将血糖稳定化在目标范围内。该2小时的导入阶段用于酌情通过精确的输注/注射泵，通过葡萄糖和/或胰岛素IV给药来调整血糖水平。在紧邻给药前30分钟内不给药胰岛素或葡萄糖输注。在给药时，患者的血糖浓度在80至140mg/dL的范围内(尽可能使数值接近100-120mg/dL的范围)。

4.给药和摄入标准流食

2小时导入阶段后，通过用注射器皮下注射到腹壁捏起的皮肤褶皱中，给药试验药物注射剂(时间点0)。如下制备受试品。通过用0.3cc容量胰岛素注射器从

R胰岛素(100U/mL；Eli Lilly)小瓶吸取正确的剂量(在就诊4确定)来制备仅

R胰岛素的剂量。通过首先用0.3cc容量胰岛素注射器从

R胰岛素(500U/mL；Eli Lilly)小瓶吸取0.3cc(150单位)并将其转移到包含1mL rHuPH20(20μg/mL；3000U/mL)的小瓶中来制备

R胰岛素/rHuPH20。通过轻轻涡旋将溶液混合。

通过用0.3cc容量胰岛素注射器从

赖脯胰岛素(100U/mL；Eli Lilly)小瓶吸取正确的剂量(在就诊2确定)来制备仅赖脯胰岛素的剂量。通过首先在室温下将rHuPH20(1mg/mL；约1200,000U/mL)的小瓶融化1至2小时来制备

赖脯胰岛素/rHuPH20。使用无菌的0.3cc容量胰岛素注射器，将0.27cc空气吸入注射器并推入rHuPH20小瓶的顶空，然后将0.27cc(0.27mg；约32400U)rHuPH20吸入注射器。然后将其缓慢转移(防止起泡)至Hylenex的小瓶中并轻轻涡旋。使用无菌的0.3cc胰岛素注射器，吸入1.1mL空气并推入Hylenex(包含另外的0.27mgrHuPH20；约32400U)的顶空，然后吸取1.1mL溶液并将其分配至

赖脯胰岛素(100U/mL；Eli Lilly)小瓶中。通过轻轻涡旋将溶液混合。

在有或无rHuPH20(0.2μg/U胰岛素)的情况下给药5.7(±3.0)

赖脯胰岛素平均剂量。在有或无rHuPH20(0.2μg/U胰岛素)的情况下给药6.2(±3.5)

R胰岛素平均剂量。与rHuPH20联合给药的胰岛素的注射部位如下：就诊2A的注射在左中腹部区域，下一次就诊(就诊2B或如果就诊2B不必要时为就诊3)使用右中腹部区域，下一次就诊使用做中腹部区域，后续的注射部位相应交替。将注射针保持45度角并在皮肤褶皱中保持10秒钟。

试验药物给药后10分钟内，患者食用提供60mg碳水化合物的流食(Ensure)。在10分钟内将流食完全摄入。在随后8小时的规定时间点测量血糖。视情况需要，进行用于安全性目的的另外的血糖测量。

5.取样和评价

在给药前阶段期间和给药后，通过使用STAT2300 Glucose Analyzer在规定时间点频繁测量血糖来监测血糖浓度，所述时间点为-60、-30、-20、-10、0、3、6、9、12、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、255、270、285、300、315、330、345、360、375、390、415、420、430、445、460、475和480分钟。在-30、-30、-10、0、3、6、9、12、15、20、30、45、60、90、120、150、180、210、240、300、360、420和480分钟取一系列血样用于血清胰岛素测定。

B.有和无rHuPH20的情况下

R胰岛素和

赖脯胰岛素的药动学

与各自在无rHuPH20的情况下相比，

赖脯胰岛素/rHuPH20和

R胰岛素/rHuPH20的药效学二者均显示加快的整体相当的暴露。表19a列出了12名患者的各种PK参数的总结。这是在收集来自所有患者的数据之前进行的中期分析。因此，仅21名患者中的12名的数据用于这一分析。也显示与rHuPH20联合给药的效力，其显示为％对照，通过[胰岛素和rHuPH20的平均(几何或算术)PK值]/[单独的胰岛素的平均(几何或算术)PK值]x100)来计算。C_max和AUC参数基于几何平均值和对数转化的数据的p-值，而t_max以及早期和后期t_50％基于算术平均数和未转化的值。赖脯胰岛素/rHuPH20的主要终点(primary endpoint)(最初1小时内的总胰岛素暴露(AUC_0-60))比单独的

赖脯胰岛素增加了135％(p＝0.0197)，

R胰岛素/rHuPH20的主要终点比单独的R胰岛素增加了304％(p＝0.0005)。

赖脯胰岛素的早期T_50％从19.9min减少到12.6min(p＝.0002)，R胰岛素的早期T_50％从40.1减少到14.8(p＝.033)。

赖脯胰岛素的t_max从43.8min减少到27.9min(p＝.002)，正规胰岛素从96.7减少到52.1(p＝.086)。

赖脯胰岛素的后期T_50％从98.6min减少到68.6min(p＝.0001)，

R胰岛素的后期T_50％从219.2减少到111.2(p＝.008)。

表19a.在流食试验中在有或无rHuPH20的情况下给药的胰岛素的药动学

^a使用对治疗具有固定效应的混合模型进行方差分析。对于AUC和C_max参数，基于对数转化的值进行重复测量值之间的非结构性协方差矩阵，对于t_max和t_50％参数基于未转化的数据进行重复测量值之间的非结构性协方差矩阵。对数转化前将0的值设置为1。

表19b列出了完成试验的全部21名患者的各种PK参数的总结，显示平均值和标准偏差。使用无房室法(non-compartmental approach)(AUC计算的线性梯形法则)，基于减去基线(其中基线为时间0时的测量值)的个体

赖脯胰岛素或

R胰岛素浓度对比时间的数据，进行表19b中的PK分析。使用WinNonlin用户选择标准测定消除速率常数λz，半衰期、AUC INF_obs、MRT、CL和Vz均基于λz。所有低于20.0pM的测量值均设置为0用于PK计算。

向

赖脯胰岛素或

R胰岛素注射剂添加rHuPH20增加了早期胰岛素暴露。向

赖脯胰岛素加入rHuPH20将平均剂量-标准化的减去基线的C_max从46.6pmol/L增加到81.2pmol/L，增加了74％，对于

R胰岛素则从25.4pmol/L增加到56.5pmol/L，增加了122％。对于主要的PK终点AUC_0-60min，相对于无酶的对照给药，与rHuPH20联合给药将早期

赖脯胰岛素暴露从1690min*pmol/L/IU增加到2950min*pmol/L/IU，增加了75％，将早期

R胰岛素暴露从649min*pmol/L/IU增加到2010min*pmol/L/IU，增加了210％。相对于单独

赖脯胰岛素的对照注射，与rHuPH20联合给药后的生物利用度未显著改变：AUC_0-inf为98％，AUC_0-最终为116％。相对于无酶的对照给药，

R胰岛素与rHuPH20联合给药的相对生物利用度为：AUC_0-inf为120％，AUC_0-最终为174％(将几何平均剂量-标准化的减去基线的数据用于这些计算；数据未显示)。相对于无rHuPH20的对照注射，将胰岛素与rHuPH20联合给药和赖脯胰岛素与rHuPH20联合给药加速了T_max以及早期和后期T_50％。

与rHuPH20一起的

赖脯胰岛素注射达到峰浓度的时间较快，算术平均值t_max为38.8分钟，对比不存在rHuPH20的情况下

赖脯胰岛素注射的47.1分钟。与rHuPH20一起的

R胰岛素皮下注射得到58.3分钟的t_max，对比无rHuPH20情况下的104分钟。

表19b.流食试验中有或无rHuPH20时给药的胰岛素的药动学

C.有和无rHuPH20的情况下正规人胰岛素和赖脯胰岛素给药后对食物负荷的血糖响应的比较

与单独给药胰岛素时相比，

赖脯胰岛素或

R胰岛素与rHuPH20一起给药时，改善了对食物负荷的血糖响应。表19c列出了从12名患者测定的药效学参数。赖脯胰岛素或

R胰岛素与rHuPH20联合给药相对于无rHuPH20情况下的对照注射引起餐后血糖水平降低。与单独的

赖脯胰岛素相比，当赖脯胰岛素与rHuPH20联合给药时，在4hr的餐后阶段内观察到的最大血糖从186mg/dL降低到154mg/dL(p＝0.0213)，与单独的

R胰岛素相比，当

R胰岛素与rHuPH20联合给药时，在4hr的餐后阶段内观察到的最大血糖从212mg/dL降低到166mg/dL(p＝0.0406)。2hr餐后葡萄糖(PPG)和大于140mg/dL的总波动面积(total excursion area)也相似地降低。小于70mg/dL的总波动面积为最小限度并且对于所有受试品都相似，与rHuPH20联合给药的情况下，

赖脯胰岛素具有很小的面积增加趋势，

R胰岛素具有很小的面积减少趋势。

表19c.流食试验中在有或无rHuPH20的情况下给药的胰岛素的药效学

^a双尾、成对t-检验

D.安全性

未报告严重不良事件(AE)。最常报告的AE为血糖降低/低血糖症(147例事件)。在这147例血糖降低/低血糖症事件中，认为21例可能或很可能与rHuPH20相关。将17例事件被评定为中度强度，认为其中4例可能与rHuPH20相关。将剩余的126例评定为轻度强度。本试验中所有其他AE的发生率小于5％。

在本试验中，所有的低血糖症发作(定义为所具有的血糖值＞70mg/dL)无论其症状都记录为AE。

E.总结

赖脯胰岛素或R胰岛素与rHuPH20联合给药相对于无rHuPH20情况下的对照注射，得到具有更早的t_max、早期t_50％和后期t_50％参数的更早的胰岛素暴露，以及更大的峰胰岛素浓度，生物利用度无显著变化。这一更早的胰岛素暴露导致更少的餐后高血糖症，减少的峰0-4hr葡萄糖水平、减少的2hr餐后葡萄糖水平以及更少的高血糖波动(测定为AUC＞140mg/dL)。低血糖波动(测定为AUC＜70mg/dL)为最小限度并且对于所有受试品都相似，与rHuPH20联合给药后，

赖脯胰岛素具有很小的面积增加趋势，正规人胰岛素(

R胰岛素)具有很小的面积减少趋势。

实施例1c.

在改变或不改变重组rHuPH20的剂量的情况下皮下给药的

R胰岛素或赖脯胰岛素在健康人个体中的药动学和药效学

作为用于测定药动学、药效学(或葡萄糖药效学；GD)、安全性、耐受性以及rHuPH20：胰岛素最佳比例的单中心、I期、开放性、单盲(个体不知道各注射剂的内容物)、4阶段试验的一部分，与正规胰岛素(

R胰岛素)或

赖脯胰岛素的剂量一起皮下给药(SC)一系列的rHuPH20剂量比例，并通过基于指定时间点采集的血清胰岛素浓度测定t_max、C_max、AUC_0→t以及相对生物利用度评价了药动学(PK)和rHuPH20：胰岛素的最佳比例。

通过采集血样测定胰岛素和葡萄糖水平评价了联合给药不同剂量的rHuPH20对皮下注射给药的

R胰岛素或

赖脯胰岛素的药动学和药效学(或葡萄糖药效学(GD))的作用。使用高血胰岛素-正常血糖钳操作(如实施例1所描述)将血浆葡萄糖水平维持在90-110mg/dL。评价胰岛素浓度以测定胰岛素PK参数：t_max、早期t_50％、后期t_50％、AUC_0→t和AUC_t→最终(其中t＝注射后30、60、90、120、180、240、360和480min)、AUC_0→所有、AUC_0→inf、C_max、相对生物利用度(与无rHuPH20时相比)，以及所有PK参数的基于变异系数的个体之间和个体自身差异。测定钳夹操作时维持正常血糖的葡萄糖输注速率(GIR)并用于测定以下GD参数：tGIR_max、早期tGIR_50％、后期tGIR_50％、GIR AUC_0→t和GIR AUC_t→最终(其中t＝注射后30、60、90、120、180、240、360和480min)、GIRAUC_0→所有和cGIR_max，以及所有GD参数基于变异系数的个体之间和个体自身差异。也评价了各SC注射的安全性和局部耐受性。

A.在改变或不改变rHuPH20的剂量的情况下给药

R胰岛素

向健康志愿者给药30μL或120μL

R胰岛素(稀释至100U/mL)，其中rHuPH20终浓度为0μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL或80μg/mL(分别约0U/mL、150U/mL、600U/mL、1200U/mL、2400U/mL或9600U/mL)。因此，向志愿者给药包含3U

R胰岛素和约0、4.5、18、36、72或288单位rHuPH20的30μL，或者包含12UR胰岛素和约0、18、72、144、288或1152单位rHuPH20的120μL。表19d列出了所测定的接收12U胰岛素的个体的药动学参数。与单独给药胰岛素时相比，对于试验的所有rHuPH20浓度，表明透明质酸酶联合给药的特征的PK参数(更早的t_max和t_1/2max，更大的C_max和早期全身暴露，例如AUC_0-60min)同等地增加。对于所有rHuPH20浓度，葡萄糖输注速率(GIR)曲线均与安慰剂(即0μg/mL)不同，具有特征性的早期速率增加和后期葡萄糖输注降低。在所有试验的剂量中，所有的rHuPH20浓度相似地有效，未观察到无效剂量。

表19d.在改变rHuPH20的剂量的情况下12U

R胰岛素的胰岛素PK参数

B.在改变或不改变rHuPH20的剂量的情况下给药

赖脯胰岛素

向健康志愿者30μL或120μL

赖脯胰岛素(稀释至50U/mL)，其中rHuPH20终浓度为0μg/mL、0.078μg/mL、0.3μg/mL、1.2μg/mL、5μg/mL或20μg/mL(分别约0U/mL、9.36U/mL、36U/mL、144U/mL、600U/mL或2400U/mL)。因此，向志愿者给药包含1.5U赖脯胰岛素和约0、0.28、1.08、4.32、18或72单位rHuPH20的30μL，或者包含6U

赖脯胰岛素和约0、1.12、4.32、17.28、72或288单位rHuPH20的120μL。表19e列出了所测定的接收6U

赖脯胰岛素的个体的药动学参数。在所有试验的剂量中，所有大于0.3μg/mL的rHuPH20浓度相似地有效。

表19e.在改变rHuPH20的剂量的情况下6U赖脯胰岛素的胰岛素PK参数

实施例2

可溶性rHuPH20表达细胞系的产生

用HZ24质粒(显示于SEQ ID NO：52)转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见，例如美国专利申请第10,795,095、11/065,716和11/238,171号)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体包含pCI载体骨架(Promega)、编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482(SEQ ID NO：49)的DNA、来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)、嵌合体内含子以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA包含在编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位点1处的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列，以及在编码对应于SEQ ID NO：1所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位点482的酪氨酸的DNA之后的终止密码子，之后为BamHI限制酶切位点。因此，构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)得到由CMV启动子驱动的单一mRNA个体(species)，其编码被内部核糖体进入位点(IRES)分隔开的人PH20的氨基酸1-482(列于SEQ ID NO：3)和小鼠二氢叶酸还原酶氨基酸1-186(列于SEQ ID NO：53)。

将生长在添加了4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的GIBCO改良CD-CHO培养基中的未转染DG44CHO细胞以0.5x10⁶细胞/ml接种至准备用于转染的摇瓶中。使细胞在加湿培养箱中于37℃、在5％CO₂中、120rpm的摇动下生长。在转染前试验指数生长的未转染DG44 CHO细胞的活力。

将未转染的DG44CHO细胞培养物的六千万个活细胞沉淀(pelleted)并在0.7mL 2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM HEPES、pH 7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na₂HPO₄、12mM右旋糖)中重悬至2×10⁷个细胞的密度。向每一等份重悬细胞中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化进行线性化)，然后将细胞/DNA溶液在室温下转移至0.4cm电极间距的BTX(Gentronics)电穿孔小槽中。用与细胞混合的无质粒DNA进行阴性对照电穿孔。以330V和960μF或350V和960μF的电容放电对细胞/质粒混合物进行电穿孔。

电穿孔后将细胞从小槽移出并转移至5mL添加了4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的改良CD-CHO培养基中，使细胞在加湿培养箱中在六孔组织培养板的孔中于37℃、在5％CO₂中生长2天而不进行筛选。

电穿孔后两天，从各孔除去0.5mL组织培养基并使用实施例5描述的微浊度测定法试验透明质酸酶活性的存在。结果显示于表20

从组织培养孔收集来自转染2(350V)的细胞、计数并稀释至1×10⁴至2×10⁴个活细胞每mL。将0.1mL的等份细胞悬浮液转移至五个96孔圆底组织培养板的每一个孔中。将一百微升包含4mM GlutaMAX^TM-1添加物(GIBCO^TM，Invitrogen Corporation)并且不含次黄嘌呤和胸苷添加物的CD-CHO培养基(GIBCO)加入包含细胞的孔中(终体积0.2mL)。

鉴定来自5个培养板的在无甲氨蝶呤的情况下生长的十个克隆(表21)。

在培养基中扩增六个HZ24克隆并以单细胞悬液形式转移至摇瓶中。使用二维无限稀释法将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10接种至96-孔圆底组织培养板中，其中相对于板从上到下1∶2且横向1∶3稀释细胞，从左上角的孔以5000个细胞起始。使稀释的克隆生长于每孔500个未转染DG44CHO细胞的背景中以提供在培养基中最初几天必要的生长因子。每个亚克隆制备10板，5个板包含50nM甲氨蝶呤，5个板不含甲氨蝶呤。

克隆3D3产生了24个可见的亚克隆(13个来自无甲氨蝶呤处理，11个来自50nM甲氨蝶呤处理)。在24个亚克隆中的8个的上清中测量到显著的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)并将这8个亚克隆扩增至T-25组织培养瓶中。在50nM甲氨蝶呤存在下扩增分离自甲氨喋呤处理方案的克隆。在摇瓶中在500nM甲氨喋呤中进一步扩增克隆3D35M得到产生超过1000单位/ml的克隆(克隆3D35M；或Gen1 3D35M)。然后制备3D35M细胞的原始细胞库(MCB)。

实施例3

可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的测定

使用浊度测定法测定样品例如细胞培养物、纯化组分和纯化溶液中的可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性，所述浊度测定法基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成不可溶的沉淀。通过将可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)温育预定的时间(10分钟)然后加入酸化的血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠来测量活性。30分钟形成时间后，在640nm测量所得样品的浊度。由对透明质酸钠底物的酶活性引起的浊度降低为可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。使用通过可溶性rHuPH20测定法工作参比标准的稀释液生成的校正曲线进行该方法，并相对于这一校正曲线进行样品活性的测定。

在酶稀释液中制备样品的稀释液。通过将33.0±0.05mg水解明胶溶解于25.0mL 50mM PIPES Reaction Buffer(140mM NaCl、50mM PIPES、pH5.5)和25.0mL SWFI中，并将0.2mL 25％Buminate溶液稀释至该混合物中并涡旋30秒，来制备酶稀释溶液。这在使用的2小时内进行并保存于冰上直到使用。将样品稀释至约1-2U/mL。通常，每一步的最大稀释不超过1∶100并且第一次稀释的起始样品体积不小于20μL。进行该测定所需的最小样品体积为：正在处理的样品、FPLC组分：80μL；组织培养物上清：1mL；浓缩材料80μL；纯化的或最后一步的材料：80μL。在低蛋白结合96孔板中一式三份进行稀释，将30μL的各稀释液转移至Optilux黑色/透明底平板中(BD BioSciences)。

在酶稀释溶液中制备浓度为2.5U/mL的已知可溶性的rHuPH20的稀释液以生成标准曲线并一式三份加入Optilux板中。稀释液包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。该板包括包含60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。然后将板子覆盖并在加热块上在37℃温热5分钟。去除覆盖物并将板子振摇10秒钟。振摇后，将板子放回加热块，并用温热的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg的透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解于20.0mL SWFI中制备。通过在2-8℃轻轻旋转和/或振摇2-4小时将其混合或直到完全溶解)使MULTIDROP 384 Liquid Handling Device做好准备。将反应板转移至MULTIDROP 384并通过按压启动键将30μL透明质酸钠分配至各孔来起始反应。然后将板子从MULTIDROP 384移出并振摇10秒钟，然后重新放上板盖转移至加热块上。将板子在37℃温育10分钟。

通过用血清工作溶液使仪器做好准备并将体积设置变为240μL，使MULTIDROP 384准备停止反应。(25mL血清储备液[用9体积的500mM醋酸盐缓冲液稀释1体积的马血清(Sigma)并用盐酸将pH调节至3.1]稀释于75mL 500mM醋酸盐缓冲液中)。将板子从加热块移除并放置于MULTIDROP 384上并将240μL血清工作溶液分配至孔中。移除板子并在读板仪上振摇10秒钟。又15分钟后，在640nm测量样品的浊度并通过拟合标准曲线测定各样品的透明质酸酶活性(以U/mL计)。

通过用透明质酸酶活性(U/ml)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算比活(单位/mg)。

实施例4.

Gen1人sPH20的产生和纯化

A.5L生物反应器法

溶解一小瓶3D35M并在添加了100nM甲氨喋呤和GlutaMAX^TM-1(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad Calif.)中通过1L旋转瓶从摇瓶扩增。以4×10⁵活细胞每mL的接种密度将细胞从旋转瓶转移到5L生物反应器(Braun)中。参数为温度设定点37℃、pH 7.2(起始设定点)、溶氧设定点25％以及0-100cc/min的空气覆盖(air overlay)。第168hr时，加入250ml Feed#1 Medium(含50g/L葡萄糖的CD CHO)。第216hr时加入250ml Feed#2 Medium(含50g/L葡萄糖和10mM丁酸钠的CD CHO)，以及第264小时加入Feed#2 Medium。这一方法得到1600单位每mL的终产率，最大细胞密度为6×10⁶细胞/ml。加入丁酸钠显著是为了在生产的最后阶段增加可溶性rHuPH20的产生。

通过深层过滤(depth filtration)和切线流透析过滤至10mM HEPES pH7.0中使来自3D35M克隆的条件培养液澄清。然后通过在Q Sepharose(Pharmacia)离子交换、Phenyl Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱、苯基硼酸酯(Prometics)和Hydroxapatite Chromatography(Biorad，Richmond，CA)的顺序色谱法纯化可溶性rHuPH20。

可溶性rHuPH20结合至Q Sepharose并在相同的缓冲液中以400mMNaCl洗脱。用2M硫酸铵稀释洗出液至500mM硫酸铵终浓度并通过PhenylSepharose(低取代)柱，然后在相同条件下结合至苯基硼酸酯树脂。于pH 9.0在不含硫酸铵的50mM N-二[羟乙基]甘氨酸中洗涤后，将可溶性rHuPH20从HEPES pH 6.9中的Phenyl Sepharose树脂洗脱。在5mM磷酸钾和1mMCaCl₂中于pH 6.9将洗出液上样至陶瓷羟基磷灰石树脂上，并用含0.1mMCaCl₂的80mM磷酸钾pH 7.4洗脱。

所得纯化的可溶性rHuPH20具有通过使用USP参比标准的微浊度测定法(实施例3)测定的超过65,000USP单位/mg蛋白的比活。用0.1％TFA/H₂O和0.1％TFA/90％乙腈/10％H₂O之间的梯度从Pharmacia 5RPC苯乙烯-二乙烯苯柱将纯化的sPH20在24至26分钟以单峰洗脱并通过SDS电泳分辨为61kDa的一条带，其经PNGASE-F处理后减小至清晰的51kDa条带。N-端氨基酸测序表明前导肽已被有效去除。

B.形成100L生物反应器细胞培养物的上游细胞培养扩增法

使用放大方法从四个不同的3D35M细胞小瓶中分别纯化可溶性rHuPH20以产生4个单独批次的sHuPH20；HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C和HUA0420C。分别扩增各小瓶并经125L生物反应器培养，然后使用柱色谱法纯化。在整个过程中取样以评价这些参数例如酶产率。下文提供的该方法的描述列出了代表性技术要求例如生物反应器起始和补料培养基体积、转移细胞密度以及洗涤和洗脱体积。每一批的具体数字略微变化并详细记录于表24-30。

在37℃的水浴中融化4瓶3D35M细胞，加入包含100nM甲氨喋呤和40mL/L GlutaMAX的CD CHO并将细胞离心。将细胞重悬于含20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37℃、7％CO₂培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩增至40mL。当细胞密度达到1.5-2.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至125mL旋转瓶中，培养物体积为100mL。将烧瓶于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到1.5-2.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至250mL旋转瓶中，培养物体积为200mL，并将烧瓶于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到1.5-2.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至1L旋转瓶中，培养物体积为800mL，并于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到1.5-2.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至6L旋转瓶中，培养物体积为5L，并于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到1.5-2.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至36L旋转瓶中，培养物体积为20L，并于37℃、7％CO₂温育。

将125L生物反应器用121℃、20 PSI蒸汽灭菌并加入65L CD CHO培养基。使用前，检查反应器是否被污染。当36L旋转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x10⁶细胞/mL时，将20L细胞培养物从36L旋转瓶转移到125L生物反应器中(Braun)，得到85L终体积和约4×10⁵细胞/mL的接种密度。参数为：温度设定点37℃；pH：7.2；溶氧：25％±10％；搅拌叶轮速度50rpm；发酵罐气压3psi；空气喷射(air sparge)1L/min.；空气覆盖：1L/min。每天从生物反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生和保留。在运行中加入营养物补料。第6天加入3.4L Feed#1 Medium(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAX^TM-1)，并将培养温度改变至36.5℃。第9天加入Feed#2(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAX^TM-1+1.1g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至36℃。第11天，加入3.7L Feed#3(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAX^TM-1+1.1g/L丁酸钠)并将培养温度改变至35.5℃。在14天或当细胞活力下降至低于50％时收获反应器。该方法得到具有1600单位/ml酶活性并具有8百万细胞/mL的最大细胞密度的可溶性rHuPH20的生产。收获时，取样培养物用于支原体、生物负载、内毒素、体外和体内病毒、用于病毒颗粒的透射电子显微术(TEM)以及酶活性。

将一百升的生物反应器细胞培养收获物通过一系列的具有聚醚砜介质(Sartorius)的一次性胶囊式滤器进行过滤：首先通过8.0μm厚的胶囊、0.65μm厚的胶囊、0.22μm胶囊，最后通过0.22μm Sartopore 2000cm²滤器并进入100L无菌储存袋。使用两个具有螺旋式聚醚砜30kDa MWCO滤器(Millipore)的TFF将培养物浓缩为10×，然后通过与10mM HEPES、25mMNa₂SO₄、pH 7.0的6×缓冲液交换进入0.22μm末端滤器进入20L无菌储存袋中。表22提供与细胞培养、收获、浓度和缓冲液交换步骤相关的监测数据。

表22.细胞培养、收获、浓度和缓冲液交换步骤的监测数据

制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(3L树脂，高＝20cm，直径＝14cm)。采集洗涤样品用于pH测定、电导率和内毒素(LAL)测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na₂SO₄、pH 7.5平衡柱子。将已浓缩的、透析过滤的收获物以100cm/hr的流速上样至Q柱。用5个柱体积的10mMTris、20mM Na₂SO₄、pH 7.5和10mM HEPES、50mM NaCl、pH 7.0洗涤柱子。用10mM HEPES、400mM NaCl、pH 7.0洗脱蛋白并过滤通过0.22μm末端滤器进入无菌袋。

接下来进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备Phenyl-Sepharose(PS)柱(9.1L树脂，高＝29cm，直径＝20cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl₂、pH 7.0平衡柱子。向来自上一步的蛋白洗出液中加入2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl₂储备液至终浓度分别为5mM、0.5M和0.1mM。以100cm/hr的流速将蛋白质上样至PS柱。以100cm/hr加入5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl₂pH 7.0。使流出液通过0.22μm末端滤器进入无菌袋。

将PS-纯化的蛋白质上样至用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡过的氨基苯基硼酸酯柱(ProMedics)(6.3L树脂，高＝20cm，直径＝20cm)。以100cm/hr的流速使蛋白质通过柱子并用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、pH 7.0洗涤柱子。然后用20mM N-二[羟乙基]甘氨酸、100mMNaCl、pH 9.0洗涤柱子，并用50mM HEPES、100mM NaCl、pH 6.9洗脱蛋白质，通过无菌滤器进入20L无菌袋。检测洗出液的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。

用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂ pH 7.0平衡羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad)(1.6L树脂，高＝10cm，直径＝14cm)。采集洗涤样品并检测pH、电导率和内毒素(LAL)。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质中加入磷酸钾和CaCl₂，得到5mM磷酸钾和0.1mM CaCl₂的终浓度，并以100cm/hr的流速上样至HAP柱。用5mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mMCaCl₂，然后用10mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂ pH洗涤柱子。用70mM磷酸钾pH 7.0洗脱蛋白并过滤通过0.22μm滤器进入5L无菌储存袋。检测洗脱液的生物负载、蛋白浓度和酶活性。

然后通过压力罐将HAP-纯化的蛋白泵过20nM病毒去除滤器。将蛋白质加入DV20压力罐和滤器(Pall Corporation)，通过具有20nm孔的UltiporDV20滤器(Pall Corporation)进入无菌20L储存袋。检测滤液的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征以及与方法相关的杂质。然后使用10kD分子量截留(MWCO)Sartocon Slice正切流动过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白浓缩至1mg/mL。首先通过用HEPES/盐水溶液(10mM HEPES、130mM NaCl、pH 7.0)洗涤制备滤器，取样渗透液检测pH和电导率。浓缩后，取样浓缩蛋白并检测蛋白质浓度和酶活性。对浓缩蛋白进行6×缓冲液交换进入终末缓冲液：10mM HEPES、130mM NaCl、pH 7.0。使浓缩蛋白通过0.22μm滤器至20L无菌储存袋。取样蛋白质并检测蛋白浓度、酶活性、游离巯基、寡糖特征和同渗浓度。

表23-29提供了各3D35M细胞批次的与上文所述各纯化步骤相关的监测数据。

表23.Q sepharose柱数据

表24.Phenyl Sepharose柱数据

表25.氨基苯基硼酸酯柱数据

表26.羟基石灰柱数据

表27.DV20过滤数据

表28.终浓度数据

表29.缓冲液交换至最终制备物数据

将经纯化和浓缩的可溶性rHuPH20蛋白无菌填充至无菌小瓶中，填充体积为5mL和1mL。使蛋白质通过0.22μm滤器进入由控制器控制的泵，其用于利用比重测定读出装置填充小瓶。用塞子将小瓶密闭并用波纹帽(crimped caps)保护。目视检查密闭小瓶是否包含外源性颗粒然后贴上标签。标记后，通过浸入液氮不超过1分钟将小瓶速冻并保存于≤-15℃(-20±5℃)。

实施例5

产生包含可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞

使实施例2描述的Gen1 3D35M细胞系适应更高的甲氨蝶呤水平以产生第2代(Gen2)克隆。从已建立的包含甲氨蝶呤的培养物中将3D35M细胞接种至包含4mM GlutaMAX-1^TM和1.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中。通过在37℃、7％CO₂加湿培养箱中在46天的时间里生长和传代9次使细胞适应更高的甲氨蝶呤水平。通过在包含含有2.0μM甲氨蝶呤的培养基的96-孔组织培养板中进行有限稀释克隆出已扩增的细胞群。约4周后，鉴定克隆并选择克隆3E10B用于扩增。使3E10B细胞在包含4mMGlutaMAX-1^TM和2.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。产生3E10B细胞系的原始细胞库(MCB)并冷冻，用于后续试验。

通过在包含4mM GlutaMAX-1^TM和4.0μM甲氨喋呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞继续进行细胞系的扩增。在第12次传代后，将细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。融化一小瓶RCB并培养在包含8.0μM甲氨蝶呤的培养基中。5天后，培养基中的甲氨蝶呤浓度增加到16.0μM，接着18天后增加到20.0μM。通过在包含含有4mM GlutaMAX-1^TM和20.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基的96孔组织培养板中进行有限稀释克隆出来自包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中的第8次传代的细胞。5-6周后鉴定克隆并选择克隆2B2用于在包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中扩增。第11次传代后，将2B2细胞冷冻在小瓶中用作研究细胞库(RCB)。

所得2B2细胞为可表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)的二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)DG44CHO细胞。可溶性PH20以约206拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20-特异性探针对Spe I-消化的、Xba I-消化的和BamH I/Hind III-消化的基因组2B2细胞DNA进行的DNA印记分析显示以下限制酶切消化特征：用Spe I消化的DNA具有～7.7kb的一条主要杂交带和四条小杂交带(～13.9、～6.6、～5.7和～4.6kb)；用Xba I消化的DNA具有～5.0kb的一条主杂交带和两条小杂交带(～13.9和～6.5kb)；用BamH I/Hind III消化的2B2 DNA观察到～1.4kb的一条单一杂交带。mRNA转录物的序列分析表明所得到的cDNA(SEQ ID NO：56)与参比序列(SEQID NO：49)一致，除了1311位处的一个碱基对差异，经观察其为胸苷(T)而不是预期的胞嘧啶(C)。这是沉默突变，不影响氨基酸序列。

实施例6

A.在300L生物反应器细胞培养物中产生Gen2可溶性rHuPH20

融化一瓶HZ24-2B2并通过36L旋转瓶在添加了20μM甲氨蝶呤和GlutaMAX-1^TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中从摇瓶扩增。简而言之，在37℃水浴中融化细胞小瓶，加入培养基并将细胞离心。将细胞重悬于包含20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37℃、7％CO₂培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩增至40mL。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至125mL旋转瓶中，培养物体积为100mL。将烧瓶在37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至250mL旋转瓶中，培养物体积为200mL，并将烧瓶在37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至1L旋转瓶中，培养物体积为800mL，并于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至6L旋转瓶中，培养物体积为5000mL，并于37℃、7％CO₂温育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至36L旋转瓶中，培养物体积为32L，并于37℃、7％CO₂温育。

将400L生物反应器灭菌并加入230mL CD-CHO培养基。使用前，检查是否污染。将约30L细胞从36L旋转瓶转移至400L生物反应器(Braun中，接种密度为4.0×10⁵活细胞每ml且总体积为260L。参数为：温度设定点，37℃；搅拌叶轮速度40-55 RPM；发酵罐压力3psi；空气喷射0.5-1.5L/Min.；空气覆盖：3L/min。每天从生物反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生和保留。而且，在运行期间加入营养物补料。第120hr(第5天)，加入10.4L Feed#1 Medium(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1^TM+83mL/L Yeastolate+33mg/L rHuInsulin)。第168小时(第7天)，加入10.8L Feed#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1^TM+167mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至36.5℃。第216小时(第9天)，加入10.8L Feed#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1^TM+250mL/L Yeastolate+1.80g/L丁酸钠)并将培养温度改变至36℃。第264小时(第11天)，加入Feed#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1^TM+250mL/LYeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至35.5℃。观察到加入补料培养基显著增加生产最后阶段可溶性rHuPH20的产生。在第14天或15天或当细胞活力下降至低于40％时收获生物反应器。该方法得到17,000单位每ml的终生产率并具有一千两百万细胞/mL的最大细胞密度。收获时，对培养物取样用于支原体、生物负载以及体外和体内病毒、透射电子显微术(TEM)和酶活性。

通过蠕动泵将培养物泵出通过四个并行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，各包含一层4-8μm级的硅藻土和一层1.4-1.1μm级的硅藻土，然后为纤维素膜，接着通过第二个单一的Millistak过滤床系统(Millipore)，其包含一层0.4-0.11μm级的硅藻土和一层＜0.1μm级的硅藻土，之后通过纤维素膜，然后通过0.22μm终端滤器进入具有350L容量的无菌一次性软袋。向收集的细胞培养液中添加10mM EDTA和10mM Tris至pH 7.5。使用四个Sartoslice TFF 30kDa分子量截留(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorious)通过正切流动过滤(TFF)设备将培养物浓缩10×，然后通过与10mM Tris、20mM Na₂SO₄、pH 7.5的10×缓冲液交换进入0.22μm终端滤器进入50L无菌储存袋。

将已浓缩和透析过滤的收获产物进行病毒灭活。病毒灭活前，制备10％Triton X-100、3％三(正丁基)磷酸酯(TNBP)的溶液。在临近Q柱纯化前在36L玻璃反应器中将已浓缩、透析过滤的收获产物暴露至1％Triton X-100、0.3％TNBP 1小时。

B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化

制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。采集洗涤样品用于pH、电导率和内毒素(LAL)测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5平衡柱子。病毒灭活后，将已浓缩、透析过滤的收获产物以100cm/hr的流速上样至Q柱。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5和10mM HEPES、50mM NaCl、pH 7.0洗涤柱子。用10mM HEPES、400mM NaCl、pH 7.0将蛋白质洗脱至0.22μm终端滤器进入无菌袋。检测洗出液样品的生物负载、蛋白质浓度和透明质酸酶活性。在交换开始和结束时读取A₂₈₀吸光度。

接下来进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备Phenyl-Sepharose(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素(LAL测定)测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl₂，pH 7.0平衡柱子。向来自Q sepharose柱的蛋白质洗出液中添加2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl₂储备液以分别得到5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。以100cm/hr的流速将蛋白质上样至PS柱并收集柱流出液。用5mM硫酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl₂pH 7.0以100cm/hr洗涤柱子，并将洗涤液加入收集的流出液中。与柱洗涤液合并，使流出液通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。对流出液进行取样用于生物负载、蛋白质浓度和酶活性检测。

制备氨基苯基硼酸酯柱(Prometics)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素(LAL测定)测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡柱子。以100cm/hr的流速将包含纯化的蛋白质的PS流出液上样至氨基苯基硼酸酯柱。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤柱子。用20mM N-二[羟乙基]甘氨酸、0.5M硫酸铵、pH 9.0洗涤柱子。用20mM N-二[羟乙基]甘氨酸、100m M氯化钠、pH 9.0洗涤柱子。用50mM HEPES、100mM NaCl、pH 6.9洗脱蛋白质并通过无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。

制备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液并检测pH、电导率和内毒素(LAL测定)。用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂、pH 7.0平衡柱子。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质中加入终浓度5mM磷酸钾和0.1mM CaCl₂并以100cm/hr的流速上样至HAP柱。用5mM磷酸钾、pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂洗涤柱子。接着用10mM磷酸钾、pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂洗涤柱子。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白质并通过0.22μm无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。

接着使HAP纯化的蛋白质通过病毒去除滤器。首先，通过用2L 70mM磷酸钾，pH 7.0洗涤制备无菌Virosart滤器(Sartorius)。使用前，对已过滤的缓冲液进行取样用于pH和导电率检测。通过蠕动泵将HAP纯化的蛋白质泵出通过20nM病毒去除滤器。将70mM磷酸钾、pH 7.0中的已过滤蛋白通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。检测已过滤病毒的样品的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征。也检测样品的与方法相关的杂质。

然后使用10kD分子量截留(MWCO)Sartocon Slice正切流动过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白质浓缩至10mg/mL。首先通过用10mM组氨酸、130mM NaCl，pH 6.0洗涤来制备滤器，并对渗透物进行取样用于pH和电导率检测。浓缩后，取样浓缩的蛋白质并检测蛋白质浓度和酶活性。对浓缩蛋白质进行6×缓冲液交换至终缓冲液：10mM组氨酸、130mMNaCl，pH 6.0。缓冲液交换后，使浓缩的蛋白质通过0.22μm滤器进入20L无菌储存袋。对蛋白质取样并检测蛋白质浓度、酶活性、游离巯基、寡糖特征和同渗浓度。

然后将无菌的、过滤的全部蛋白以20mL无菌分装至30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)中。然后将小瓶迅速冷冻并保存于20±5℃。

C.比较Gen1可溶性rHuPH20和Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化

与在100L生物反应器细胞培养物(描述于实施例4B)中的Gen1可溶性rHuPH20的生产和纯化相比，在300L生物反应器细胞培养物中的Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化包含一些变化。表30列出了除单纯的放大变化之外两种方法之间的示例性差异。

实施例7

唾液酸和单糖含量的测定

可通过三氟乙酸水解后的反相液相色谱法(RPLC)评价可溶性rHuPH20的唾液酸和单糖含量。在一个实例中，测定了纯化的透明质酸酶批号#HUB0701E(1.2mg/mL；基本如实施例6所述进行生产和纯化)中的唾液酸和单糖含量。简而言之，一式两份地用40％(v/v)三氟乙酸于100℃水解100μg样品4小时。水解后，将样品干燥并重悬于300μL水中。将各重悬样品的45μL等分试样转移至新的试管中并干燥，各加入10μL 10mg/mL醋酸钠溶液。通过加入50μL包含30mg/mL 2-氨基苯甲酸、20mg/mL氰基硼氢化钠、约40mg/mL醋酸钠和20mg/mL硼酸的甲醇溶液荧光标记释放的单糖。在暗处将该混合物在80℃温育30分钟。通过加入440μL流动相A(0.2％(v/v)正丁胺、0.5％(v/v)磷酸、1％(v/v)四氢呋喃)终止衍生化反应。如关于透明质酸酶样品所述，也将不含水的基质水解和衍生化作为阴性对照。使用十八烷基(C₁₈)反相柱(4.6x250mm，5μm粒径；J.T.Baker)通过RPLC分离释放的单糖，并通过荧光检测(360nm激发光，425nm发射光)进行监测。通过比较来自透明质酸酶样品的色谱图与包含N-D-葡糖胺(GlcN)、N-D-半乳糖胺(GalN)、半乳糖、果糖和甘露糖的单糖标准品的色谱图进行单糖含量的定量。表31显示了每透明质酸分子各单糖的摩尔比。

表31.可溶性rHuPH20的单糖含量

^*GalN结果低于检测限

实施例8

来自3D35M和2B2细胞的可溶性rHuPH20的C-端不均一性

对由100L生物反应器体积(批号HUA0505MA)中的3D35M细胞和300L生物反应器体积(批号HUB0701EB)的2B2细胞生产和纯化的两批sHuPH20进行C-端测序。用在N-端特异裂解门冬氨酸和半胱氨酸肽键的胞内蛋白酶Asp-N分别消化各批产品。这释放出SEQ ID NO：4第431位的门冬氨酸处的可溶性rHuPH20的C-端部分。分离并表征C-端片段以测定批号HUA0505MA和批号HUB0701EB中各片段群(population)的序列和丰度。

观察到来自3D35M细胞和2B2细胞的可溶性rHuPH20制备品显示不均一性并包含C-端序列互不相同的多肽(表27和28)。该不均一性很可能归因于在生产和纯化过程中存在于细胞培养基或其他溶液中的肽酶对已表达的447氨基酸多肽(SEQ ID NO：4)的C-端裂解。可溶性rHuPH20制备品中的多肽具有对应于SEQ ID NO：4所示可溶性rHuPH20序列的氨基酸1-447、1-446、1-445、1-444和1-443的氨基酸序列。这些多肽中每一个的全长氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：4-8。如表32和33所示，来自3D35M细胞和2B2细胞的可溶性rHuPH20制备品中每一种多肽的丰度不同。

表32.来自批号HUA0505MA的C-端片段的分析

表33.来自批号HUB0701EB的C-端片段的分析

实施例9

不同乙酰透明质酸降解酶的分散活性的比较

体内评价不同乙酰透明质酸降解酶作为分散剂的能力。使用在小鼠中进行的分散测定来评价不同乙酰透明质酸降解酶作为锥虫蓝分散剂的能力，并且也评价这些酶增强联合给药的胰岛素降低血糖水平的效力的能力。所测定的乙酰透明质酸降解酶包括rHuPH20、聚乙二醇化的PH20(PEGPH20)、Hyal 1、软骨素酶ABC、软骨素酶AC和Streptomyces hyalurolyticus裂解酶。将这些与锥虫蓝和

胰岛素在中性缓冲液(10mM磷酸钠、pH 7.4、145.5mM NaCl、1mg/ml人血清白蛋白)中混合并给予麻醉的小鼠。然后测量锥虫蓝的分散面积和血糖水平二者。单独的中性pH缓冲液和单独的胰岛素用作阴性对照。也检测了低pH缓冲液(pH 4.5)作为分散剂的能力。

通过腹膜注射氯胺酮/赛拉嗪(生理盐水中的10∶1混合物)麻醉九组约10周龄并且体重为21-25g的NCr nu/nu纯合小鼠。之后，通过在胸廓尾端中线的皮内注射，给药小鼠40μL乙酰透明质酸降解酶和5单位/mL

胰岛素以及0.4％锥虫蓝染料。也包括给药单独的

胰岛素、单独的缓冲液、或缓冲液和

胰岛素的对照组。具体而言，第1组小鼠为阴性对照并接受锥虫蓝和中性pH缓冲液；第2组小鼠接受低pH缓冲液中的锥虫蓝和5单位/mL

胰岛素；第3组小鼠接受含5单位/mL

胰岛素的锥虫蓝和10单位/mL rHuPH20；第4组小鼠接受含5单位/mL

胰岛素的锥虫蓝和10单位/mL PEGPH20(如下文实施例10所述生成)；第5组小鼠接受含5单位/mL

胰岛素的锥虫蓝和10单位/mL Hyal 1；第6组小鼠接受含5单位/mL胰岛素的锥虫蓝和10单位/mL软骨素酶ABC(Associates of Cape Cod，E.Falmouth，MA)；第7组小鼠接受含5单位/mL胰岛素的锥虫蓝和1单位/mL软骨素酶AC(Associates of Cape Cod，E.Falmouth，MA)；第8组小鼠接受含5单位/mL

胰岛素的锥虫蓝和100单位/mL Streptomyceshyalurolyticus裂解酶(Calbiochem)；第9组小鼠接受含5单位/mL

胰岛素的锥虫蓝。然后在注射后2.5、5、10、15和20分钟通过测径器测量锥虫蓝染料的分散。通过用¹/₄π乘以最长轴M1(染料前沿(front)长度)和M2(染料前沿宽度)(M1M2×¹/₄π)计算染料分散面积(mm²)。在第0、5、10、15和20分钟使用血糖测量仪测量血糖水平。

1.染料分散

表34列出了给药各受试品后的平均染料分散面积。中性pH缓冲液和低pH缓冲液中的锥虫蓝染料显示最小扩散，分散面积平均为从注射后2.5分钟时的约36mm²至注射后20分钟时的约51mm²。当将锥虫蓝与

胰岛素、Hyal 1或PEG PH20混合并递送时，与该染料仅与缓冲液混合时观察到的分散面积相比，分散面积无统计学显著的增加。相反，当与rHuPH20、软骨素ABC、软骨素AC或Streptomyces hyalurolyticus裂解酶混合并递送时，观察到染料分散的显著增加。当与rHuPH20混合并递送时锥虫蓝的平均分散面积在注射后2.5、5、10、15和20分钟时分别约为45mm²、66mm²、80mm²、86mm²和102mm²。当与软骨素酶AC混合并递送时锥虫蓝的平均分散面积在注射后2.5、5、10、15和20分钟时分别约为76mm²、107mm²、107mm²、110mm²和116mm²。当与软骨素酶ABC混合并递送时锥虫蓝的平均分散面积在注射后2.5、5、10、15和20分钟分别约为57mm²、75mm²、79mm²、81mm²和88mm²。当与Streptomyceshyalurolyticus裂解酶混合并递送时锥虫蓝的平均分散面积在给药后2.5、5、10、15和20分钟时分别约为74mm²、76mm²、101mm²、103mm²和130mm²。

表34.染料分散面积的组平均值总结(mm²)

2.血糖水平

表35列出了给药各受试品后的平均血糖水平(mg/dL)。仅给药染料和缓冲液的小鼠的血糖水平从注射前约212mg/dL的平均值增加道注射后5分钟约332mg/dL。之后，在注射后20分钟该水平逐渐升高到约367mg/dL。不存在胰岛素时的这一血糖增加归因于熟知的麻醉剂对啮齿动物血糖的作用(参见，例如Saha等人，(2005)Exp.Biol.Med.230：777-784)。当给药

胰岛素时，血糖水平短时间地升高至注射后5分钟时约292mg/dL的平均值(从注射前约226mg/dL的平均值)，之后在注射后10、15和20分钟分别降低至约171mg/dL、122mg/dL和97mg/dL的平均值。尽管当与胰岛素一起给药时所有的乙酰透明质酸降解酶均降低血糖水平，但是与rHuPH20、PEG PH20、软骨素酶ABC和Streptomyces hyalurolyticus裂解酶联合给药与单独的

胰岛素所观察到的相比显示更快地降低水平。

表35.血糖水平(mg/dL)的组平均值总结

实施例10

rHuPH20的聚乙二醇化

A.mPEG-SBA-30K与rHuPH20的缀合

为了生成聚乙二醇化的(PEG化的)可溶性人透明质酸酶，将rHuPH20(其大小约60KDa)共价缀合至具有约30kDa分子量的甲氧基聚(乙二醇)丁酸(mPEG-SBA-30K)的线性N-羟基琥珀酰亚胺酯。mPEG-SBA的结构显示于下图2

图2

制备用于PEG化rHuPH20的mPEG-SBA-30K所用的方法记载于例如U.S.5,672,662。简而言之，按照以下方法制备mPEG-SBA-30K：

将溶解于二噁烷的丙二酸二乙酯溶液(2当量)在氮气氛下逐滴加入氢化钠(2当量)和甲苯中。将mPEG甲磺酸酯(1当量，MW 30kDa，Shearwater)溶解于甲苯并加入上述混合物中。将所得混合物回流约18小时。将反应混合物浓缩至其原始体积的一半，用10％NaCl水溶液萃取，用1％盐酸水溶液萃取并将水相萃取物合并。用二氯甲烷(3x)萃取收集的水层并用硫酸镁干燥有机层，过滤并蒸干。将所得剩余物溶于包含氯化钠的1N氢氧化钠中并将该混合物搅拌1小时。通过加入6N氢氯酸将混合物的pH调节至约3。用二氯甲烷(2x)萃取该混合物。

在硫酸镁上干燥有机层、过滤、浓缩并倾倒至冰乙醚中。通过过滤收集沉淀并真空干燥。将所得化合物溶于二噁烷并回流8小时，接着浓缩至干燥。将所得剩余物溶于水并用二氯甲烷(2x)萃取，在硫酸镁上干燥，通过旋转蒸发浓缩该溶液，然后倾倒至冰乙醚中。通过过滤收集沉淀并真空干燥。将所得化合物(1当量)溶于二氯甲烷，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.1当量)。将该溶液冷却至0℃并逐滴加入二环己基碳二亚胺(2.1当量)的二氯甲烷溶液。室温下搅拌该溶液约18小时。将反应混合物过滤、浓缩并在乙醚中沉淀。通过过滤收集沉淀并真空干燥，得到mPEG-SBA-30K。

为了制备PEG化的rHuPH20，通过共价缀合将mPEG-SBA-30K与rHuPH20的氨基偶联，在rHuPH20和mPEG之间提供稳定的酰胺键，如图3所示。

图3

为了缀合，以粉末形式将mPEG-SBA-30K加入rHuPH20(于130mMNaCl/10mM HEPES中，浓度10mg/mL；pH 7)。PEG∶rHuPH20比为10∶1(摩尔比)。当PEG溶于缓冲液后，将溶液无菌过滤(Corning 50mL管顶滤器，聚苯乙烯，0.22μm醋酸纤维素膜)。在冷室中于4℃，在搅拌下过夜进行缀合。

缀合后，使用100,000MWCO TFF膜浓缩溶液并用pH 6.8的130mMNaCl/10mM HEPES进行缓冲液交换。所得物质(如上文实施例2所述检测其酶活性)用pH 6.8的130mM NaCl/10mM HEPES加以稀释，得到100,000U/mL(对应于约2.5mg肽/mL)的终酶活性。将1mL体积的这一PEG化的rHuPH20物质装入如具有溴丁基胶塞的13-mm 1型玻璃小瓶中，并冷冻保存(在-80℃冰箱中冷冻过夜，然后放入-20℃冰箱用于更长时间的保存)。

B.PEG化的rHuPH20的分析

通过凝胶电泳分析PEG化的rHuPH20物质。三批如上文实施例7A所述制备的PEG化的rHuPH20显示相同模式的多个条带，表示迁移不同距离的未反应的PEG和多种mPEG-rHuPH20缀合物。基于与分子量标记迁移的比较，表示所述多种的条带在约90KDa至300KDa的范围，有三条深色的条带迁移超过240KDa标记。这些数据表明通过mPEG-SBA-30K的共价缀合生成的PEG化的rHuPH20包含PEG化的rHuPH20种类的不均一混合物，很可能包含一、二和三PEG化的蛋白质。缺少可见的60KDa条带表明所有的蛋白质均已与PEG反应，并且混合物中无可检测的天然rHuPH20。

实施例11.

rHuPH20对胰岛素在皮下给药后在猪中的药动学的作用

为了测定猪模型是否适于模拟与重组透明质酸酶(例如，rHuPH20)联合给药的餐时胰岛素的药动学，评价了在有或无rHuPH20的情况下皮下注射后

赖脯胰岛素和

R胰岛素在猪中的药动学。然后将结果与在人中观察到的那些(见实施例1)比较，以确定猪模型是否可以准确反应在人中的观察结果。

简而言之，在随机、4-因素交叉试验中，向六只猪皮下给药包含或不含rHuPH20的

赖脯胰岛素和

R胰岛素。每一只动物接受所有四种受试品的三个治疗周期以辅助在一系列给药周期中比较胰岛素药动学重现性。采集血样并评价血清以测定免疫反应性胰岛素(IRI)的水平。然后测定包括t_max、C_max、早期t_50％、后期t_50％和AUC_max在内的各种药动学参数。

A.给药和取样

如下制备包含或不含4800U/mL rHuPH20的100U/mL

赖脯胰岛素或

R胰岛素的给药溶液(或受试品)。分别从商购的

赖脯胰岛素(100U/mL；批号A418976，Eli Lilly)和

R胰岛素(100U/mL；批号A393318，Eli Lilly，用无菌稀释剂(Eli Lilly)进行1∶5稀释)的若干批产品制备单独的100

赖脯胰岛素和

R胰岛素。为了制备

赖脯胰岛素/rHuPH20溶液，将910μL 100U/mL

赖脯胰岛素(Eli Lilly，批号A418976)、44.6mL HYLENEXrecombinant(透明质酸酶人注射剂)(Baxter，批号903646)和45.4μLrHuPH20API 1mg/mL(Halozyme Therapeutics，批号HUA0703MA)混合，得到91U/mL的终赖脯胰岛素浓度和5454U/mL的终透明质酸酶活性。为了制备

R胰岛素/rHuPH20，将200μL 500U/mLR胰岛素(Eli Lilly，批号A393318)和800μL rHuPH20药品6000U/mL(Halozyme，批号288004；rHuPH20药品包含在145mM NaCl、10mM磷酸氢二钠、2.7mM氯化钙、2.7mM EDTA二钠盐、1mg/mL人血清白蛋白、pH 7.4中的50μg rHuPH20)混合，得到100U/mL的终胰岛素浓度和4800U/mL的终rHuPH20透明质酸酶活性。

将包含rHuPH20的溶液无菌过滤并装入2mL I-型玻璃(Wheaton)小瓶并用13-mm橡胶塞(Stelmi)密封。接着将包含rHuPH20的溶液分成2组；一组作为冷藏对照保存直至被试验，另一组用于在本实验中向动物给药。所有给药溶液在所有时间均保持冷藏，然后返回用于进行试验。在配制的1-6天内，在相同的日期检测每一组溶液的rHuPH20酶活性。

给六只在试验开始时各自体重为21至25kg的成体雄性Yucatan猪(S&S Farms，Ramona，CA)安装经手术植入的颈静脉或颈动脉导管，该导管安装了外部血管通路方便在本试验全程中采血。在仪器操作和治疗前将动物隔离7天。将六只动物随机分成下表36所示的两个试验组。将动物分配至两组之一，每组包含3只动物，并且该分配持续周期1和2。对于第三个给药周期，两只动物由于插管不开放而被排除，将剩余的四只动物重新分配为每组仅2只动物。第1组动物ID编码为：周期1和2时为540、541和542，周期3时为542和544。第2组动物ID编码：周期1和2时为544、545和546；周期3时为545和546。

将给药溶液皮下(SC)给药至每一只猪身体中部之后的左腹。给予受试品前，获得治疗前血样。在每隔一天的方案中，动物接受单次SC剂量的适当受试品(0.2U/kg；每一次给药前测量动物以准确测定正确的剂量)。每一只动物接受0.2U/kg的单次SC推注剂量的指定胰岛素(即胰岛素或赖脯胰岛素)，该胰岛素在媒介物中或在与rHuPH20一起新鲜配制的制剂中。受试品给药后，在第3、6、9、12、15、20、25、30、45、60、90、120、180和240分钟时连续抽取至少0.7-1.0mL血液。给药前也进行治疗前采血(前采血(pre-bleed))。立即将血样置于不含抗凝剂的血清试管中，在冰上放置至少30分钟，然后于环境温度下以9500xg离心5分钟。然后将血清转移到预标记的试管中，冷冻并-80℃保存，直到所有样品被运输至Millipore用于免疫反应性胰岛素(IRI)水平的生物分析。

表36.猪模型验证的给药方案

B.血清胰岛素水平

使用

测定分析软件(Brendan Technologies，Carlsbad，CA)通过从标准曲线内插来测定每一血清样品的血清IRI浓度。表37提供了赖脯胰岛素、

赖脯胰岛素/rHuPH20、R胰岛素、或

R胰岛素/rHuPH20给药后的IRI浓度。表37列出了在前采血样品中测量的基线IRI水平。然后从各时间点测量的实际IRI浓度减去这些基线以测定基线调节的IRI浓度。

每一种治疗的平均血清IRI浓度-时间曲线(如当绘制以IRI浓度为Y轴对时间为X轴的图时所见到的)在多个周期中均相似。在所有给药周期中，当与rHuPH20制剂联合皮下给药时，

赖脯胰岛素和

R胰岛素的药动学被加速。任何观察到的治疗之间的差异在治疗周期之间基本相同，表明所观察到的差异由治疗引起并在约5周试验中的所有周期内是稳定的。

表37血清IRI浓度-时间曲线

C.胰岛素药动学

将减去基线胰岛素浓度后的胰岛素浓度-时间曲线(表37，上文)用于计算以下PK参数：包括t_max、C_max、早期t_50％、后期t_50％和AUC_间隔。使用WinNonlin Professional 5.2版(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)中的模型200，通过无房室分析得到PK参数。使用SAS 9.1.3版(SAS Institute，Cary，NC)进行统计学计算。使用对治疗具有固定效应的混合模型进行所有分析。采用每一只动物的重复观察之间的复合对称协方差矩阵。使用经对数转化的数值(在转化前用1代替零的值(0在对数标度上))进行C_max和所有AUC终点的分析。在原来的线性标度上分析基于时间的终点。

单独或与rHuPH20一起递送的

赖脯胰岛素或

R胰岛素皮下给药后的胰岛素药动学总结提供于表38。单独或与rHuPH20一起递送的各种胰岛素的各种PK参数显示为平均值±SD。各参数的％对照(％对照通过[与rHuPH20一起的胰岛素的平均(几何的或算术的)PK值]/[单独的胰岛素的平均(几何的或算术的)PK值]x100来计算)也提供于该表中。％对照计算：C_max和AUC参数基于几何平均值和对数转化的数据的p-值，而t_max以及早期和后期t_50％基于算术平均值和未转化的值。除非另外指明N＝16只猪。

表39显示了单独的

赖脯胰岛素与和rHuPH20一起的

R胰岛素的PK参数的比较。PK值提供为平均值±SD。也提供了％

赖脯胰岛素(即[和rHuPH20一起的

赖脯胰岛素的平均(几何的或算术的)PK值]/[单独的

赖脯胰岛素的平均(几何的或算术的)PK值]x100)。％对照计算：C_max和AUC参数基于几何平均值和对数转化的数据的p-值，或者t_max以及和早期和后期t_50％基于算术平均值和未转化的数值。除非另外指明N＝16。

表38.在与或不与rHuPH20一起的情况下皮下给药后胰岛素PK参数

aN＝15

bN＝4

cN＝13

表39单独的

赖脯胰岛素或与rHuPH20一起的

R胰岛素皮下给药后的胰岛素PK参数

aN＝15

bN＝13

D.总结

在猪中R胰岛素或

赖脯胰岛素与rHuPH20联合给药相对于对照注射(即，单独的

R胰岛素或

赖脯胰岛素)改变了特定的PK参数。具体而言，当与rHuPH20一起给药时相对于各自的对照，

赖脯胰岛素的最大暴露(C_max)增加了163％(p＝0.0251)，

R胰岛素增加了165％(p＝0.0218)。

赖脯胰岛素的起效(早期t_50％)从36分钟加速到11分钟(p＝0.0182)，

R胰岛素从61分钟加速到10分钟(p＜0.0001)。

赖脯胰岛素的最大效力时间(t_max)从58分钟加速到39分钟(p＝0.1963)，

R胰岛素从94分钟加速到38分钟(p＝0.0004)。

赖脯胰岛素的后期t_50％从110分钟加速到52分钟(p＝0.0002)，

R胰岛素从170分钟加速到70分钟(p＜0.0001)。

赖脯胰岛素(117％对照；p＝0.5176)或

R胰岛素(88％对照；p＝0.6118)的总暴露(AUC_inf)未发生有意义的变化。

赖脯胰岛素(与单独给药

赖脯胰岛素时相比AUC_0-30增加了763％；p＝0.0198)和

R胰岛素(与单独给药R胰岛素时相比AUC_0-30增加了1429％；p＝0.0027)二者的累积暴露转移至较早的时间窗。

R胰岛素与rHuPH20联合给药或赖脯胰岛素与rHuPH20联合给药都增加了胰岛素向血管腔隙的吸收速率(与单独递送相应的胰岛素相比)，这由与单独的

R胰岛素或

赖脯胰岛素相比，达到最大血清IRI浓度的时间(t_max、早期t_50％、后期t_50％)减少和峰暴露浓度(C_max)的增加证明。此外，当与rHuPH20联合给药时，与单独给药时相比，

赖脯胰岛素和

R胰岛素二者的早期累积暴露(AUC_0-30)均增加。

广泛观察到

赖脯胰岛素和

R胰岛素与透明质酸酶联合给药后的峰暴露增加和暴露加速对动物、顺序或周期无有意义的影响，并近似地模拟了之前的人体研究(见实施例1)。因此，猪为用于研究透明质酸酶对餐时胰岛素制剂的吸收的作用的合适模型。

实施例12.

以两个剂量与和不与rHuPH20一起皮下给药的正规胰岛素的药动学

在以上实施例10描述的猪模型中评价了以两个不同浓度(均单独或与rHuPH20联合给药)皮下给药时，正规胰岛素的药动学。进行多剂量4-因素交叉设计试验比较正规胰岛素以20和100U/mL的浓度单独给药时的PK和以同样的两个浓度与rHuPH20联合给药后的PK。在每一种情况下，总共给药0.2U/kg胰岛素。

A.给药和取样

制备四种受试品用于给药。两种受试品分别包含20U/mL和100U/mL正规胰岛素(R胰岛素；Eli Lilly)(分别命名为Insulin U20和Insulin U100)。剩余的两种受试品分别包含20U/mL和100U/mL正规胰岛素(Diosynth Biotechnologies(Schering-Plough的分支机构))和20μg/mL(约2400U/mL)rHuPH20(分别命名为Insulin-PH20U20和Insulin-PH20 U100)。通过用无菌稀释剂(Eli Lilly)1∶5稀释

R胰岛素(100U/mL；批号A390566A；Eli Lilly)制备Insulin U20受试品。Insulin U100受试品为未稀释的

R胰岛素(100U/mL；批号A509721；Eli Lilly)。Insulin-PH20U20受试品包含于25mM Tris、120mM NaCl、0.01％聚山梨酯80，pH 7.30中的74mg/mL(20U/mL)正规胰岛素(批号#SIHR107；DiosynthBiotechnologies)和20μg/mL(约2400U/mL)rHuPH20。Insulin-PH20 U100受试品包含于25mM Tris、120mM NaCl、0.01％聚山梨酯80，pH 7.3中的3.69mg/mL(100U/mL)正规胰岛素(批号#SIHR107；DiosynthBiotechnologies)和20μg/mL(约2400U/mL)rHuPH20。

给六只在试验开始时各自体重为21至25kg的成体雄性Yucatan猪(S&S Farms，Ramona，CA)在颈静脉或颈动脉经手术植入导管，使得可在本试验期间抽取系列血样。将动物随机分配至两个试验组，各包含3只动物，如表40所示。这样的组分配持续周期1和2。每一只动物接受所有四种受试品的两个治疗周期以辅助在一系列给药周期中比较胰岛素药动学重现性。

将受试品皮下给药(SC)至每一只猪身体中部之后的左腹。在每隔一天的方案中，每只动物接受0.2U/kg的指定胰岛素的单次SC推注剂量。对于Insulin U20和Insulin-PH20 U20受试品，给药10.0μL/kg。对于Insulin U100和Insulin-PH20 U100受试品，给药2.0μL/kg。给药前采集血样(体积为0.7-1.0mL)(前采血)，然后在给药后第3、6、9、12、15、20、25、30、45、60、90、120、180和240分钟采集血样(体积为0.7-1.0mL)。将血样置于不包含抗凝剂的血清试管中并在冰上放置至少30分钟，然后在环境温下以9500xg离心5分钟。然后将血清转移到预标记的试管中、冷冻并在-80℃保存，直到将样品运送至Millipore BioPharma Services(St.Charles，MO)用于测定免疫反应性胰岛素(IRI)的水平。

表40.给药方案

B.血清胰岛素水平

使用

测定分析软件(Brendan Technologies，Carlsbad，CA)通过从标准曲线内插来测定每一血清样品的血清IRI浓度。表41提供了InsulinU20、Insulin U100、Insulin-PH20 U20和Insulin-PH20 U100给药后的平均血清IRI浓度。表41列出了在前采血样品中测定的基线IRI水平。然后从各时间点测量的实际IRI浓度减去这些基线以测定基线调节的IRI浓度。

比较每一治疗组每一个给药周期后的胰岛素浓度-时间曲线。两个周期中，每一种受试品的平均血清IRI浓度-时间曲线是相似的(如当绘制以IRI浓度作为Y轴对时间为X轴的图时所观察到的)。在两个给药周期中，对于两个浓度而言，当与rHuPH20制剂联合皮下给药时胰岛素的PK加速。也针对来自周期1和2的数据构建了包括对治疗的固定效应、顺序、周期、周期治疗相互作用以及顺序内的动物的另外的统计学模型，用于主要和次要PK参数(主要PK参数包括：指定时间窗的曲线下面积(AUC)、C_max、t_max、早期t_50％和后期t_50％％；次要PK参数包括AUC更详细的时间窗、MRT(最终和无穷大)、λz、HLλz、消除以及分布体积)，并且所述统计学模型未显示顺序、周期或动物的系统影响，也未显示任何这些变量的周期和治疗间相互作用。

表41.血清IRI浓度-时间曲线

C.胰岛素药动学

将减去基线胰岛素浓度后的胰岛素浓度-时间曲线(表41，上文)用于计算以下PK参数：包括t_max、C_max、早期t_50％、后期t_50％和AUC_间隔。使用WinNonlin Professional模型200(5.2版，Pharsight Corp.，Mountain View，CA)通过无房室分析对血清IRI对时间数据建模并计算PK参数。使用SAS 9.1.3版(SAS Institute，Cary，NC)进行统计学计算和组间统计学比较。使用对治疗具有固定效应的混合模型进行所有的分析。采用每一只动物的重复观察之间的复合对称协方差矩阵。使用经对数转化的数值(在转化前用1代替零的值(0在对数标度上))进行C_max和所有AUC终点的分析。在原来的线性标度上分析基于时间的终点。

Insulin U20、Insulin U100、Insulin-PH20 U20和Insulin-PH20 U100皮下给药后的药动学总结提供于表42。单独或与rHuPH20一起给药的各种胰岛素的各种PK参数显示为平均值±SD。表中也提供了各参数的％对照(％对照＝[与rHuPH20一起的胰岛素的PK值]/[单独的胰岛素的PK值]x100)。C_max和AUC参数的％对照计算基于几何平均值和对数转化的数据的p-值，而t_max以及早期和后期t_50％的％对照计算基算术平均值和未转化的值。除非另外指明N＝16只猪。

表42.在与或不与rHuPH20一起的情况下皮下给药后胰岛素PK参数

_bN＝11只动物

_cN＝10只动物

_dN＝8只动物

_eN＝9只动物

D.总结

本试验检测了与和不与rHuPH20一起皮下给药不同浓度的相同总胰岛素剂量的作用。

在不与rHuPH20联合给药时，胰岛素浓度从100U/mL减少至20U/mL引起更快的胰岛素吸收和峰胰岛素浓度增加以及更大的早期和全部(程度更小)累积胰岛素暴露。相对于对照100U/mL注射，将浓度减少到20U/mL1)将C_max从几何平均值158pmol/L增加到302pmol/L，增加了91％；2)将平均早期t_50％从35分钟减少到23分钟，将t_max从63分钟减少到57分钟，并将后期t_50％从109分钟减少到84分钟；以及3)将几何平均AUC_0-15从20增加到80，增加了300％，将AUC_0-30从222增加到791，增加了256％，并将AUC_最终从9,021增加到20,820，增加了131％，所有单位均为pmol×min/L。

正规胰岛素以二者中任一浓度与rHuPH20联合给药也引起皮下注射后相对于单独的胰岛素更快的吸收。然而，在较低的20U/mL胰岛素浓度时，单独给药的胰岛素的相对增加没有以20U/mL在单独给药时已被较快地吸收的胰岛素那样显著。

与以100U/mL的浓度单独给药胰岛素相比，以100U/mL的浓度(更通常地为糖尿病患者使用)与rHuPH20一起注射1)将C_max从几何平均值158pmol/L增加到375pmol/L，增加了137％(p＝0.0095)；2)将平均早期t_50％从35分钟减少到12分钟(p＝0.0063)，而t_max和后期T_50％未显著变化；以及3)将几何平均AUC_0-15从20增加到1438，增加了70倍(p＜0.0001)，将AUC_0-30从222增加到5337，增加了23倍(p＝0.0015)，并将AUC_最终从9,021增加到31,905，增加了250％(p＝0.0038)，所有单位均为pmol×min/L。

与单独的胰岛素给药相比，以较低的20U/mL胰岛素浓度与rHuPH20联合给药引起以下对胰岛素PK的作用：1)C_max未显著变化，几何平均值从302pmol/L到322pmol/L(p＝0.84)；2)平均早期t_50％倾向于更低，从23分钟到12分钟(p＝0.16)，而t_max和后期t_50％未显著变化；以及3)几何平均AUC_0-15从80增加到1533，增加了18倍(p＝0.0045)，AUC_0-30从791增加到4934，增加了5倍(p＝0.0567)，AUC_最终未变化，为20,820和22,184(p＝0.88)，所有单位均为pmol×min/L。

相对于无rHuPH20的对照胰岛素注射，给药rHuPH20和100U/mL后峰暴露的增加和暴露的加速近似地模拟了之前的人类试验(实施例1)和猪试验(实施例10)。这些结果进一步证明，以较低浓度给药也可改变胰岛素动力学，这与速度限制性的胰岛素六聚体解离步骤一致，该步骤是浓度依赖型的(即，当单独皮下给药胰岛素时，当它从六聚体解离至单体时被吸收，这一过程发生在较低的胰岛素浓度)。当与rHuPH20联合给药时，这一对胰岛素浓度的依赖性大大降低甚至消除。因此，联合给药rHuPH20和胰岛素的透明质酸酶分散作用可减少以较高浓度注射胰岛素时观察到的胰岛素药动学中不期望的减缓。

实施例13

在尼泊金甲酯的存在下盐浓度对rHuPH20的作用

评价了在加速温度下(40℃)，在有或无防腐剂尼泊金甲酯的情况下NaCl对rHuPH20稳定性的作用。通过在有或无防腐剂尼泊金甲酯(Fluka)的情况下将rHuPH20(10mg/ml于组氨酸/HCl中，pH 6.5，130mM NaCl)与六个不同浓度的NaCl组合，制备了十二种不同的制剂。每一种制剂包含10μg/mL rHuPH20、25mM Tris、pH 7.3、0.01％Tween 80以及0，50mM、100mM、150mM、200mM或250mM NaCl，含有或不含0.2％尼泊金甲酯。将该溶液等分至2ml的具有橡胶塞的I型玻璃小瓶中并在试验中用铝盖密封。一组小瓶于40℃保存四天，另一组在冰箱内于2-8℃保存作为阳性对照。然后检测样品的透明质酸酶(酶)活性。为了评价聚集物的水平，使用G2000 SWXL柱(Tosoh Bioscience)在以下条件下进行尺寸排阻色谱法(SEC)：将1X PBS作为流动缓冲液并且将流速设定为1ml/min。

表43列出了该试验的结果，包括透明质酸酶(酶)活性、％主峰(即包含于主峰中的rHuPH20的百分比)以及％聚集物峰(即由聚集物导致的峰中包含的rHuPH20的百分比)。观察到rHuPH20的稳定性对NaCl浓度敏感。一般而言，当在40℃温育制剂时，随着NaCl浓度降低，rHuPH20酶活性降低。然而，当在冰箱中于2-8℃保存时，不论何种制剂，rHuPH20均保留酶活性。在升高的温度下，当从溶液中完全清除NaCl，rHuPH20损失全部活性，不论是否存在尼泊金甲酯。随着NaCl浓度增加酶活性的损失减少。包含和不含添加的尼泊金甲酯的样品之间存在酶活性的显著性差异(成对t-检验，P＝0.0228)。

观察到NaCl浓度和rHuPH20聚集物水平之间的相似关联。当样品保存在升高的温度下时，随着NaCl浓度降低，凝聚物水平增加。当保存于2-8℃时，在包含或不含添加的尼泊金甲酯的情况下，基本没有变化。包含尼泊金甲酯保存于-40℃的制剂比不包含尼泊金甲酯的那些制剂形成显著更多的聚集物(成对t-检验，P＝0.0058)。

因此，相对于不包含尼泊金甲酯的那些制剂，包含尼泊金甲酯的制剂中通过SEC测定的酶活性和rHuPH20单体百分数二者显著减少。而且，在试验的NaCl浓度范围内(0-250mM)，NaCl浓度和增加的rHuPH20稳定性之间存在直接关系。

表43.于40℃和4℃保存4天的样品的酶活性和SEC结果

LOD＝检测限

实施例14

胰岛素和rHuPH20的联合制剂

进行一系列的试验以评价各种条件例如各种温度和pH下rHuPH20和胰岛素的稳定性，以及制剂的稳定性。

1.同渗浓度和pH对rHuPH20的作用

在第一个试验中，通过制备具有不同盐浓度和pH值的制剂并评价在冷藏的(5℃)、加速的(25℃)和压力(stress)(25℃、35℃和40℃)条件下保存达3个月后的任何活性损失，来评价同渗浓度和pH对rHuPH20(配制为Hylenex recombinant(人透明质酸酶注射剂))的作用，Hylenex recombinant(人透明质酸酶注射剂)包含150U/mL rHuPH20、144mM NaCl、10mM磷酸氢二钠、1mg/mL人血清白蛋白、2.7mM依地酸二钠、2.7mM CaCl，并具有290至350mOsm的重量克分子渗透浓度以及7.4的pH。调节这一制剂以制备表44列出的8种制剂(和对照Hylenex)。如上文所述测定酶活性(即透明质酸酶活性)。也通过RP-HPLC测定rHuPH20含量。

对于在pH和重量克分子渗透浓度规定限度制备的四种溶液或在推荐保存条件下的对照溶液而言，在推荐的(5℃)或加速的(25℃或30℃)保存条件下未观察到有意义的变化。通过酶活性损失和rHuPH20含量损失进行评价，观察到rHuPH20在pH7.4时是稳定的并且一般在酸性而不是碱性条件下更稳定。离子强度的作用更轻微。在升高的温度下，包含较高离子强度的制剂显示出比具有较低离子强度的那些略微更稳定。在35℃到40℃之间存在显著的稳定性降低。

表44.rHuPH20制剂

2.pH对rHuPH20的作用

评价改变缓冲系统的pH对rHuPH20稳定性的作用。将rHuPH20(1,200,000U/mL，10mg/mL)配置于130mM NaCl、10mM组氨酸中，具有5.0、5.5、6.0、6.5或7.0的pH。然后将这些制剂在5℃保存0、3、6、9和12个月；在25℃、60％相对湿度下保存0、3、6、9和12个月，以及在35℃保存0、1、2、3和6个月。在冷藏温度下，所有制剂在所有时间段内均稳定。对于pH 6.0、6.5和7.0的受试品，在5℃下持续12个月rHuPH20保持在趋势限度内、在25℃下持续6个月rHuPH20保持在趋势限度内，而且在35℃下持续3个月rHuPH20保持在趋势限度内。于pH 5.0和5.5下制备的制剂对于升高的温度更敏感，引起酶活性的显著降低。

3.pH和防腐剂对与胰岛素类似物一起配制的rHuPH20的作用

为了评价pH和防腐剂对与胰岛素类似物一起配制的rHuPH20在冷藏(5℃)、加速(30℃和35℃)和搅拌(25℃)保存条件下达4周的影响，将rHuPH20与

赖脯胰岛素或

门冬胰岛素混合并评价酶活性和稳定性。通过RP-HPLC评价胰岛素稳定性。配制受试品：10μg/mLrHuPH20、100U/mL胰岛素类似物、140mM NaCl、20mM Tris HCl，与0.2％苯酚；0.2％间甲酚；0.2％对羟苯甲酸酯；0.2％苯酚和0.1％F68；或0.2％苯酚和1mM苯甲酸酯。于pH 7、7.25和7.5制备这些制剂中的每一种，得到总共30种受试品(15种

赖脯胰岛素/rHuPH20和15种

门冬胰岛素/rHuPH20受试品)。然后将受试品于5℃、30℃、35℃和在搅拌下于25℃保存4周。评价所有条件下的rHuPH20酶活性。通过RP-HPLC评价于5℃和在搅拌下于25℃保存的受试品的胰岛素溶解度。

观察到，在5℃4周后，rHuPH20活性不受防腐剂或pH的影响。在搅拌压力条件下(20℃)，当与

门冬胰岛素和任何防腐剂在任何试验的pH下一起配制时，rHuPH20活性不受影响。相反，在含有

赖脯胰岛素的一些制剂中，例如当与0.02％苯酚、间甲酚或苯酚/苯甲酸酯一起配制时，6小时后rHuPH20的活性最多减少了75％，当pH增加时最为典型。这一活性损失与

赖脯胰岛素的沉淀相关。

表45列出于30℃和35℃温育后每一种受试品保留的rHuPH20活性。在30℃下观察到rHuPH20活性轻微地减少至约为初始活性的85％的平均值。在35℃下，特别是在包含0.2％间甲酚或0.2％对羟苯甲酸酯的受试品中，随着pH增加观察到更大的损失。

门冬胰岛素在所有制剂中在所有保存条件下保持稳定和可溶。尽管在pH 7.5下于5℃保存4周后

赖脯胰岛素仍然保持溶解性，但是在这一温度下在较低的pH(7.0和7.25)时

赖脯胰岛素沉淀。在搅拌压力条件下6小时后也观察到沉淀。

表45.在30℃和35℃4周后胰岛素类似物/rHuPH20制剂中剩余的rHuPH20活性

由于修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，所以本发明仅由随附的权利要求的范围来限定。

Claims (192)

1.超速效胰岛素组合物，其包含：

用于控制血糖水平的治疗有效量的速效胰岛素；和

其量足以使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的乙酰透明质酸降解酶。

2.权利要求1的组合物，其中

所述速效胰岛素的量为10U/mL或约10U/mL至500U/mL或约500U/mL胰岛素；以及

使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL。

3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中使得所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少30至35单位透明质酸酶活性/mL或约30至35单位透明质酸酶活性/mL。

4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述组合物的体积为1mL、3mL、5mL、10mL、20mL或50mL或者约1mL、3mL、5mL、10mL、20mL或50mL。

5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素的量为10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL或者约10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL。

6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL。

7.权利要求1-6中任一项的组合物，其被配制用于多剂量给药。

8.权利要求1-6中任一项的组合物，其被配制用于单剂量给药。

9.权利要求1-6中任一项的组合物，其被配制用于使用闭环系统递送。

10.权利要求1-6中任一项的组合物，其被配制用于使用胰岛素笔递送。

11.权利要求1-6中任一项的组合物，其被配制用于使用胰岛素泵递送。

12.权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述血糖水平为餐时血糖水平。

13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中用于单次剂量的胰岛素的治疗有效量为0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位或者约0.05单位、0.06单位、0.07单位、0.08单位、0.09单位、0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或100单位。

14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中用于单次剂量的乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2,000单位、3,000单位、4,000单位或者约0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2,000单位、3,000单位、4,000单位或更多的透明质酸酶活性。

15.权利要求1-14中任一项的组合物，其进一步包含螯合剂。

16.权利要求15的超速效胰岛素组合物，其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺四乙酸盐。

17.权利要求15或权利要求16的组合物，其中将所述螯合剂作为与等摩尔浓度或约等摩尔浓度的金属形成的复合物提供。

18.权利要求17的组合物，其中所述螯合剂复合物为EDTA钙。

19.权利要求18的组合物，其中所述EDTA钙的浓度为0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或者约0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM或20mM。

20.权利要求1-19中任一项的组合物，其进一步包含锌。

21.权利要求20的组合物，其中所述锌的浓度为0.002微克每100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U或者约0.002mg/100U、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U。

22.权利要求1-21中任一项的组合物，其包含摩尔比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、300∶1或1000∶1或者约0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、300∶1或1000∶1的EDTA钙和锌。

23.权利要求22的组合物，其包含0.01mg或约0.01mg至0.02mg或约0.02mg锌和0.1mM或约0.1mM至50mM或约50mM EDTA钙每100U人胰岛素。

24.权利要求1-23中任一项的组合物，其包含与所述速效胰岛素的摩尔比为1∶3或约1∶3的锌和与所述速效胰岛素的摩尔比为1∶3至10∶1或约1∶3至10∶1的EDTA钙。

25.权利要求1-24中任一项的组合物，其进一步包含张力调节剂。

26.权利要求25的组合物，其中所述张力调节剂选自氨基酸、多元醇和盐。

27.权利要求25或权利要求26的组合物，其中所述张力调节剂为甘油和/或氯化钠。

28.权利要求1-27中任一项的组合物，其中所述组合物的同渗浓度为200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg或者约200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg。

29.权利要求1-28中任一项的组合物，其中所述组合物的pH为6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8或者约6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。

30.权利要求1-29中任一项的组合物，其进一步包含所述速效胰岛素的稳定剂、所述乙酰透明质酸降解酶的稳定剂或二者。

31.权利要求30的组合物，其中所述稳定剂为去污剂、多元醇、金属、盐、共溶剂和/或蛋白质。

32.权利要求31的组合物，其中所述稳定剂为血清白蛋白。

33.权利要求32的组合物，其包含浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL或者约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL的血清白蛋白。

34.权利要求30的组合物，其中所述蛋白质稳定剂为聚山梨醇酯。

35.权利要求34的组合物，其包含浓度为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％或者约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％的聚山梨醇酯。

36.权利要求1-35中任一项的组合物，其进一步包含除氧剂。

37.权利要求36的组合物，其中所述除氧剂选自抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、甲硫氨酸和白蛋白。

38.权利要求37的组合物，其包含浓度为1mM、2mM、3mM、5mM、10mM或20mM或者约1mM、2mM、3mM、5mM、10mM或20mM的甲硫氨酸。

39.权利要求1-38中任一项的组合物，其进一步包含防腐剂。

40.权利要求39的组合物，其中所述防腐剂包含芳香环。

41.权利要求39或权利要求40的组合物，其中所述防腐剂为间甲酚或苯酚。

42.权利要求1-41中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为单体、二聚体或六聚体。

43.权利要求1-42中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为速效人胰岛素。

44.权利要求1-43中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

45.权利要求44的组合物，其中所述正规胰岛素为人胰岛素或猪胰岛素。

46.权利要求44或权利要求45的组合物，其中所述正规胰岛素为具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：104所示的B链的胰岛素或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。

47.权利要求1-46中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为重组胰岛素。

48.权利要求1-46中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为合成的或部分合成的。

49.权利要求1-46中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为分离的。

50.权利要求1-43中任一项的组合物，其中所述速效胰岛素为胰岛素类似物。

51.权利要求50的组合物，其中所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素。

52.权利要求1-51中任一项的组合物，其进一步包含一种或多种另外的胰岛素。

53.权利要求1-52中任一项的组合物，其进一步包含基础作用胰岛素。

54.权利要求1-53中任一项的组合物，其中所述乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶。

55.权利要求1-54中任一项的组合物，其中所述透明质酸酶具有SEQID NO：1-39或67-96中任一所示的氨基酸序列、或截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体，其与SEQ ID NO：1所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性。

56.权利要求54或权利要求55的组合物，其中所述透明质酸酶为可溶性透明质酸酶。

57.权利要求56的组合物，其中所述可溶性透明质酸酶为PH20、或其截短形式。

58.权利要求57的组合物，其中所述PH20选自羊、牛或截短的人PH20。

59.权利要求58的组合物，其中所述截短的人PH20选自具有SEQ IDNO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或者其与SEQ ID NO：4-9中任一所示的多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性的等位基因变体或其他变体。

60.权利要求56-59中任一项的组合物，其中所述透明质酸酶为以命名为rHuPH20的组合物的形式提供的可溶性透明质酸酶。

61.权利要求1-53中任一项的组合物，其中所述乙酰透明质酸降解酶为软骨素酶。

62.权利要求61的组合物，其中所述软骨素酶选自软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。

63.权利要求62的组合物，其中所述软骨素酶具有SEQ ID NO：98-100中任一所示的氨基酸序列、或其截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体，其与SEQ ID NO：98-100中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留降解乙酰透明质酸的能力的。

64.注射器或小瓶，其包含权利要求1-63中任一项的组合物。

65.闭环系统，其包含权利要求1-63中任一项的组合物。

66.胰岛素泵，其包含权利要求1-63中任一项的组合物。

67.胰岛素笔，其包含权利要求1-63中任一项的组合物。

68.用于控制个体中血糖水平的闭环系统，其包含：

速效胰岛素；和乙酰透明质酸降解酶；其中

所述速效胰岛素和所述乙酰透明质酸降解酶在相同或不同的容器中。

69.权利要求68的闭环系统，其进一步包含葡萄糖传感器、用于递送所述乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素的递送系统以及程序化的用于整合泵药和监测功能的软件中的一个或多个，藉此递送乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素以达到模拟非糖尿病个体中血糖控制的血糖控制。

70.权利要求68或权利要求69的闭环系统，其中所述速效胰岛素为单体、二聚体、多聚体或六聚体。

71.权利要求68-70的闭环系统，其中所述速效胰岛素为速效人胰岛素。

72.权利要求68-71中任一项的闭环系统，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

73.权利要求72的闭环系统，其中所述正规胰岛素为人胰岛素或猪胰岛素。

74.权利要求72或权利要求73的闭环系统，其中所述正规胰岛素选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ IDNO：104所示的B链的胰岛素或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。

75.权利要求68-71中任一项的闭环系统，其中所述速效胰岛素为胰岛素类似物。

76.权利要求75的闭环系统，其中所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素。

77.权利要求68-76中任一项的闭环系统，其中所述胰岛素为重组胰岛素。

78.权利要求68-77中任一项的闭环系统，其进一步包含一种或多种另外的胰岛素。

79.权利要求78的闭环系统，其中一种所述另外的胰岛素为基础作用胰岛素。

80.权利要求68-79中任一项的闭环系统，其中所述乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶。

81.权利要求80的闭环系统，其中所述透明质酸酶为可溶性透明质酸酶。

82.权利要求81的闭环系统，其中所述可溶性透明质酸酶为PH20、或其截短形式。

83.权利要求82的闭环系统，其中所述PH20选自羊、牛或截短的人PH20。

84.权利要求83的闭环系统，其中所述截短的人PH20选自具有SEQID NO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或者其与SEQ ID NO：4-9中任一所示的多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性的等位基因变体或其他变体。

85.权利要求80-84中任一项的闭环系统，其中所述透明质酸酶为以命名为rHuPH20的组合物的形式提供的可溶性透明质酸酶。

86.权利要求68-79中任一项的闭环系统，其中所述乙酰透明质酸降解酶为软骨素酶。

87.权利要求86的闭环系统，其中所述软骨素酶选自软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。

88.权利要求87的闭环系统，其中所述软骨素酶具有SEQ IDNO：98-100中任一所示的氨基酸序列、或其截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体，其与SEQ ID NO：98-100中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留降解乙酰透明质酸的能力。

89.权利要求68-88中任一项的闭环系统，其中包含所述速效胰岛素的容器包含0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位、100单位、200单位、300单位、400单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、5000单位、6000单位、7000单位或者约0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位、100单位、200单位、300单位、400单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2000单位、5000单位、6000单位、7000单位或更多的胰岛素。

90.权利要求68-89中任一项的闭环系统，其中所述系统能够以0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或者约0.1单位、0.2单位、0.3单位、0.4单位、0.5单位、0.6单位、0.7单位、0.8单位、0.9单位、1单位、2单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、30单位、35单位、40单位、50单位或更多胰岛素的单独剂量增量递送所述速效胰岛素。

91.权利要求68-90中任一项的闭环系统，其中包含所述乙酰透明质酸降解酶的容器包含其量在功能上等价于0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2,000单位、3,000单位、4,000单位、5000单位、6,000单位、7,000单位、8,000单位、9,000单位、10,000单位、20,000单位或者约0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位、200单位、250单位、300单位、350单位、400单位、450单位、500单位、600单位、700单位、800单位、900单位、1000单位、2,000单位、3,000单位、4,000单位、5000单位、6,000单位、7,000单位、8,000单位、9,000单位、10,000单位、20,000单位或更多透明质酸酶活性的乙酰透明质酸降解酶。

92.权利要求68-91中任一项的闭环系统，其中所述系统能够以功能上等价于0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位或者约0.3单位、0.5单位、1单位、2单位、3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位、100单位、150单位或更多透明质酸酶活性的乙酰透明质酸降解酶量的单独剂量增量递送所述乙酰透明质酸降解酶。

93.制备超速效胰岛素组合物的方法，其包括：

选择速效胰岛素并将其与使所述组合物成为超速效胰岛素组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶组合。

94.权利要求93的方法，其中所述组合物包含10U/mL或约10U/mL至500U/mL或约500U/mL的胰岛素，和

其量在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL 30至35透明质酸酶单位/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL 30至35透明质酸酶单位/mL的乙酰透明质酸降解酶。

95.权利要求93或权利要求94的方法，其中所述组合物包含其量在功能上等价于至少30至35透明质酸酶单位/mL或约30至35透明质酸酶单位/mL的乙酰透明质酸降解酶。

96.权利要求95的方法，其进一步包括向所述组合物中加入螯合剂。

97.权利要求96的方法，其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺四乙酸盐。

98.权利要求93-97中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入锌。

99.权利要求98的方法，其中所述组合物中锌的终浓度为0.002毫克每100胰岛素单位(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U或者约0.002mg/100U、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U。

100.权利要求93-99中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入张力调节剂。

101.权利要求100的方法，其中所述张力调节剂选自氨基酸、多元醇和盐。

102.权利要求100或权利要求101的方法，其中所述张力调节剂为甘油和/或氯化钠。

103.权利要求93-102中任一项的方法，其中所述组合物的同渗浓度为200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg或者约200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg或400mOsm/kg。

104.权利要求93-103中任一项的方法，其中所述组合物的pH为6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8或者约6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。

105.权利要求93-104中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入所述速效胰岛素的稳定剂、所述乙酰透明质酸降解酶的稳定剂或二者。

106.权利要求105的方法，其中所述稳定剂为去污剂、多元醇、金属、盐、共溶剂和/或蛋白质。

107.权利要求93-106中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入除氧剂。

108.权利要求107的方法，其中所述除氧剂选自抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、甲硫氨酸和白蛋白。

109.权利要求93-108中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入防腐剂。

110.权利要求93-109中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为单体、二聚体或六聚体。

111.权利要求93-110中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为速效人胰岛素。

112.权利要求93-111中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

113.权利要求112的方法，其中所述正规胰岛素为具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：104所示的B链的胰岛素或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。

114.权利要求93-113中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为重组胰岛素。

115.权利要求93-113中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为合成的或部分合成的。

116.权利要求93-111中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为胰岛素类似物。

117.权利要求116的方法，其中所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素。

118.权利要求93-117中任一项的方法，其进一步包括向所述组合物中加入一种或多种另外的胰岛素。

119.权利要求93-118中任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶。

120.权利要求119的方法，其中所述透明质酸酶具有SEQ ID NO：1-39或67-96中任一所示的氨基酸序列、或者其截短形式或其等位基因变体、物种变体或其他变体。

121.权利要求120的方法，其中所述透明质酸酶为可溶性透明质酸酶。

122.权利要求121的方法，其中所述可溶性透明质酸酶为PH20或其截短形式。

123.权利要求122的方法，其中所述PH20选自羊、牛或截短的人PH20。

124.权利要求123的方法，其中所述截短的人PH20选自具有SEQ IDNO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或者其与SEQ ID NO：4-9中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性的等位基因变体或其他变体。

125.权利要求119-124中任一项的方法，其中所述透明质酸酶为以命名为rHuPH20的组合物的形式提供的可溶性透明质酸酶。

126.权利要求93-118中任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸降解酶为软骨素酶。

127.权利要求126的方法，其中所述软骨素酶选自软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。

128.用于控制个体中血糖水平的方法，其包括向所述个体给药权利要求1-63中任一项的组合物的剂量单位。

129.权利要求128的方法，其中所述剂量为餐时剂量。

130.权利要求128或129的方法，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

131.权利要求128-130中任一项的方法，其中在进餐前少于20、10或5分钟或者约20、10或5分钟至进餐后少于10分钟或约10分钟给药所述组合物，或者与食物一起给药所述组合物。

132.方法，其包括：

指示患者在进餐前少于20、10或5分钟或者约20、10或5分钟至进餐后少于30分钟或约30分钟给药速效胰岛素组合物，其中：

将所述速效胰岛素与使得所述速效胰岛素组合物成为超速效组合物的足量的乙酰透明质酸降解酶联合给药。

133.权利要求132的方法，其中指示所述患者在或约在进餐时给药所述速效胰岛素组合物。

134.权利要求133的方法，其中所述指示为书面的。

135.权利要求132的方法，其中所述指示为口头的。

136.权利要求132-135中任一项的方法，其中将所述速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶一起配制。

137.权利要求128-136中任一项的方法，其中通过注射器、胰岛素笔、胰岛素泵或闭环系统向所述个体给药所述组合物。

138.权利要求128-133中任一项的方法，其中皮下给药所述组合物。

139.权利要求128-138中任一项的方法，其中所述超速效胰岛素组合物中速效胰岛素的剂量小于无所述乙酰透明质酸降解酶时以相同途径给药的所述速效胰岛素的剂量。

140.权利要求128-139中任一项的方法，其中向所述个体给药的胰岛素的量为针对单次进食的餐时剂量，并为0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg或0.50U/kg或者约0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg或0.50U/kg。

141.权利要求128-140中任一项的方法，其中向所述个体给药的乙酰透明质酸降解酶的量用于与针对单次进食的餐时剂量的速效胰岛素联合给药，且所述酶的量为0.3U、0.5U、1U、2U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1,000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或者约0.3U、0.5U、1U、2U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1,000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或更多。

142.权利要求128-141中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为单体、多聚体、二聚体或六聚体。

143.权利要求128-142的方法，其中所述速效胰岛素为速效人胰岛素。

144.权利要求128-143中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

145.权利要求144的方法，其中所述正规胰岛素为具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：104所示的B链的胰岛素或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。

146.权利要求128-143中任一项的方法，其中所述速效胰岛素为胰岛素类似物。

147.权利要求146的方法，其中所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素。

148.权利要求128-147的方法，其中所述胰岛素为重组胰岛素。

149.权利要求128-147中任一项的方法，其中所述胰岛素为合成或部分合成产生的。

150.权利要求128-149中任一项的方法，其进一步包括一种或多种另外的胰岛素组合物。

151.权利要求128-147中任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶。

152.权利要求151的方法，其中所述透明质酸酶为可溶性透明质酸酶。

153.权利要求152的方法，其中所述可溶性透明质酸酶为PH20或其截短形式。

154.权利要求153的方法，其中所述PH20选自羊、牛或截短的人PH20。

155.权利要求154的方法，其中所述截短的人PH20选自具有SEQ IDNO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或者其与SEQ ID NO：4-9中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性的等位基因变体或其他变体。

156.权利要求151-155中任一项的方法，其中所述透明质酸酶为以命名为rHuPH20的组合物的形式提供的可溶性透明质酸酶。

157.权利要求128-147中任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸降解酶为软骨素酶。

158.权利要求157的方法，其中所述软骨素酶选自软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。

159.权利要求158的方法，其中所述软骨素酶具有SEQ ID NO：98-100中任一所示的氨基酸序列、或其截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体，其与SEQ ID NO：98-100中任一所示的多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留降解乙酰透明质酸的能力。

160.组合，其包含：

包含10U或约10U至500U或约500U胰岛素的第一组合物；和

包含当与所述胰岛素一起给药时使得所述速效胰岛素成为超速效胰岛素的足量的乙酰透明质酸降解酶的第二组合物；其中

所述足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL或25U透明质酸酶活性/mL。

161.权利要求160的组合，其中所述足量的乙酰透明质酸降解酶在功能上等价于至少30至35单位透明质酸酶活性/mL或约30至35单位透明质酸酶活性/mL。

162.权利要求160或权利要求161的组合，其中所述第一组合物中速效胰岛素的量为10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL或者约10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml或500U/mL。

163.权利要求160-162中任一项的组合，其中所述第二组合物中乙酰透明质酸降解酶的量在功能上等价于1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL或者约1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、37.5U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL或5000U/mL。

164.组合，其包含：

包含乙酰透明质酸降解酶的第一组合物；和

包含速效胰岛素的第二组合物，其中

这些组合物被配制用于肠胃外给药；并且

如果与所述第二组合物混合，乙酰透明质酸降解酶的量足以使所得组合物成为超速效胰岛素组合物；或

如果在给药所述第一组合物之前给药，乙酰透明质酸降解酶的量足以使所述速效胰岛素组合物成为超速效胰岛素组合物。

165.权利要求164的组合，其中向个体给药的胰岛素的量为针对单次进食的餐时剂量，并为0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg、1U/kg或2U/kg或者约0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg、1U/kg或2U/kg。

166.权利要求164或权利要求165的组合，其中向个体给药的乙酰透明质酸降解酶的量为针对单次进食的餐时剂量，并为0.3U，0.5U、1U、2U、3U、4U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或者约0.3U，0.5U、1U、2U、3U、4U、5U、10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或更多。

167.权利要求160-166中任一项的组合，其中所述组合物被配制用于皮下给药。

168.权利要求160-167中任一项的组合，其中所述速效胰岛素为单体、二聚体、六聚体或多聚体。

169.权利要求160-168的组合，其中所述速效胰岛素为速效人胰岛素。

170.权利要求160-169中任一项的组合，其中所述速效胰岛素为正规胰岛素。

171.权利要求170的组合，其中所述正规胰岛素选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：104所示的B链的胰岛素或具有氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO：123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。

172.权利要求160-169中任一项的组合，其中所述速效胰岛素为胰岛素类似物。

173.权利要求172的组合，其中所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ NO：103所示的A链和氨基酸序列如SEQ NO：147-149中任一所示的B链的胰岛素。

174.权利要求160-173中任一项的组合，其中所述胰岛素为重组胰岛素。

175.权利要求160-174中任一项的组合，其中所述胰岛素为合成或部分合成产生的。

176.权利要求160-175中任一项的组合，其进一步包含一种或多种另外的胰岛素组合物。

177.权利要求160-176中任一项的组合，其中所述乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶。

178.权利要求177的组合，其中所述透明质酸酶为可溶性透明质酸酶。

179.权利要求178的组合，其中所述可溶性透明质酸酶为PH20或其截短形式。

180.权利要求179的组合，其中所述PH20选自羊、牛或截短的人PH20。

181.权利要求180的组合，其中所述截短的人PH20选自具有SEQ IDNO：4-9中任一所示氨基酸序列的多肽、或者其与SEQ ID NO：4-9中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留透明质酸酶活性的等位基因变体或其他变体。

182.权利要求160-181中任一项的组合，其中所述透明质酸酶为以命名为rHuPH20的组合物的形式提供的可溶性透明质酸酶。

183.权利要求160-176中任一项的组合，其中所述乙酰透明质酸降解酶为软骨素酶。

184.权利要求183的组合，其中所述软骨素酶选自软骨素ABC裂解酶、软骨素AC裂解酶和软骨素C裂解酶。

185.权利要求184的组合，其中所述软骨素酶具有SEQ ID NO：98-100中任一所示的氨基酸序列、或其截短形式、或其等位基因变体、物种变体或其他变体，其与SEQ ID NO：98-100中任一所示多肽具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性并保留降解乙酰透明质酸的能力。

186.权利要求1-63中任一项的组合物，其用于控制个体的餐后血糖。

187.权利要求160-185中任一项的组合，其用于控制个体的餐后血糖。

188.权利要求1-63中任一项的组合物用于制备用于控制个体餐后血糖水平的药物的用途。

189.权利要求160-185中任一项的组合用于制备用于控制个体餐后血糖水平的药物的用途。

190.用于控制个体中血糖水平的方法，其包括向所述个体给药权利要求160-185中任一项的组合。

191.药盒，其包含权利要求1-63中任一项的组合物或权利要求160-185中任一项的组合和任选的使用说明。

192.制品，其包含包装材料和容纳于所述包装材料中的权利要求1-63中任一项的组合物或权利要求160-185中任一项的组合。

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