KR20110021818A - 초속효성 인슐린 조성물 - Google Patents

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Abstract

비경구 투여를 위해 제형화된 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소 조성물을 함유하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 제품은 인슐린-치료가능한 질병 또는 상태의 치료방법에서 사용될 수 있다. 또한 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 투여방법이 제공된다.

Description

초속효성 인슐린 조성물{SUPER FAST-ACTING INSULIN COMPOSITIONS}
비경구 투여를 위해 제형화된 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소 조성물을 함유하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 제품은 인슐린-치료가능 질병 또는 상태의 치료방법에서 사용될 수 있다. 또한 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 투여방법이 제공된다.
당뇨병은 적절한 양의 인슐린을 생성하는 췌장의 저하 또는 인슐린을 충분히 합성하고 방출하는 세포의 저하 때문에 만성적 고혈당을 일으킨다. 또한, 중증환자들은 고혈당을 앓고 사망율 및 이환율이 증가한다. 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병을 포함하는 당뇨병를 갖는 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 인슐린을 투여하면 정상인에게서 발생하는 내인성 인슐린 반응과 유사한 병상을 나타낸다. 또한, 고혈당의 중증환자에게 인슐린을 투여하여 혈당 수준을 조절한다.
일반적으로, 예를 들면 식후, 고혈당에 따라서 또는 고혈당을 예측하여 이러한 대상체내에 속효성 인슐린을 투여하여 혈당조절을 할 수 있다. 그러나 인슐린의 현재의 속효성 형태는 흡수 및 작용의 지연을 갖고 있으므로 신속한 내인성 인슐린 작용과 유사하지 않다. 따라서, 이러한 제형은 제1 상의 인슐린이 방출한 직후 발생하는 간의 글루코스 생성을 정지하기 위해서 충분히 빨리 작용하지 않는다. 약리학적 작용의 지연 때문에, 속효성 인슐린의 제제는 원하는 혈당조절을 달성하기 위해 식전에 투여될 필요가 있다. 또한, 투여될 투여량은 고혈당, 대부분의 경우에 비만에 기인한 작용의 지속기간을 연장시킨다.
따라서, 대상체에 투여하는 경우 내인성 인슐린 반응과 더욱 효과적으로 유사한 병상을 나타내어 더욱 유효한 혈당조절 및 인슐린 요법의 부정적인 부작용, 예를 들면 체중 증가를 감소시키는 대안의 인슐린 조성물이 필요하다.
관련출원
우선권의 이익은 Gregory Frost, Igor Bilinsky, Daniel Vaughn 및 Barry Sugarman의 "초속효성 인슐린 조성물"라는 제목의 2008.4.28.자 미국 가출원번호 61/125,835호, 및 Gregory Frost, Igor Bilinsky, Daniel Vaughn 및 Barry Sugarman의 "초속효성 인슐린 조성물"라는 제목의 2008.5.9자 미국 가출원번호 61/127,044호에 대해 주장된다.
본 출원은 미국 가출원번호 61/125,835호 및 미국 가출원번호 61/127,044호 에 대해 우선권을 주장하는, "초속효성 인슐린 조성물"라는 제목으로 동일한 일자에 출원된 미국 특허출원번호 12/387,225와 관련 있다. 상기 주지된 출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 삽입된다.
상기 관련 출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 삽입된다.
요약
속효성 조성물에 비해 미리 선택된 시간 동안 더 빠르게 작용하고 및/또는 전신 노출을 증가시킬 수 있는 초속효성 인슐린 조성물을 제공한다. 따라서, 초속효성 인슐린 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 치료적 유효량의 속효성 인슐린 및 조성물을 초속효성으로 만들기 위한 양의 히알루로난 분해효소를 함유한다. 상기 조성물은 비경구투여, 예를 들면 피하, 정맥내, 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다. 인슐린 투여량(투여되는 양)은 혈당 조절을 달성하는데 충분한 양에 의해 결정될 수 있고, 경험적으로, 예를 들면 글루코스 농도 검사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료의 목적은 혈당조절을 달성하고 고혈당 및/또는 저혈당 발병의 수를 줄이기 위해 가능한 적은 양의 인슐린을 투여하는 것이다. 초속효성 인슐린 조성물에서 사용된 인슐린의 투여량이 적을 수록 당뇨병 대상체에 체중증가 및 비만의 위험을 줄일 수 있다. 조성물은 임의의 적당한 용기 또는 비히클, 예를 들면 멸균 바이알, 주사기, 카트리지, 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 폐루프시스템 저장소내에 제공될 수 있다.
본원에서 혈당 수준을 조절하기 위한 치료적 유효량의 속효성 인슐린 및 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소를 함유하는 초속효성 인슐린 조성물이 제공된다. 또한, 속효성 인슐린을 선택하고 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만들기 위해 충분한 양의 히알루로난 분해효소와 속효성 인슐린을 혼합함으로써 초속효성 인슐린 조성물, 예를 들면 본원에 기재된 임의의 초속효성 인슐린 조성물을 만드는 방법을 제공한다. 조성물 및 조성물을 만드는 방법의 일부 예에서, 속효성 인슐린의 치료적 유효량은 약 또는 10 U/mL 내지 약 또는 500 U/mL 인슐린이고 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL 또는 25 U 히알루로니다제 활성/mL와 기능적으로 동등하다. 일부 예에서, 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 히알루로난 분해효소의 양은 적어도 또는 약 30 또는 35 유닛 히알루로니다제 활성/mL와 기능적으로 동등하다. 예를 들면, 조성물 중 속효성 인슐린의 양은 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml 또는 500 U/mL일 수 있고, 조성물 중 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37.5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL 또는 5000 U/mL와 기능적으로 동등하다. 조성물의 부피는 약 또는 1 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL 또는 50 mL일 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 폐루프시스템, 인슐린 펜, 또는 인슐린 펌프에 의한 전달을 위해 제형화되고 단일 용량 투여 또는 다중 용량 투여를 위해 제형화될 수 있다.
일부 예에서, 속효성 인슐린의 치료적 유효량은 히알로로난 분해효소 없이 동일한 치료적 효과를 달성하는데 필요한 속효성 인슐린의 치료적 유효량 보다 적다. 히알루로난 분해효소의 양은 히알루로난 분해효소 없이 동일한 속효성 인슐린의 비경구 투여후 동일한 시간에 걸친 전신 노출보다 비경구 투여후 처음 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 60 분에 걸쳐 적어도 또는 약 30% 초과하는 인슐린에 대한 전신 노출을 달성하는데 충분하고 및/또는 히알루로난 분해효소 없이 동일한 속효성 인슐린의 비경구 투여 후 동일한 기간에 걸친 전신 글루코스 대사보다 투여후 처음 30, 45, 60, 90, 120 또는 180 분에 걸쳐 적어도 또는 약 30% 초과하는 전신 글루코스 대사(본원에서 때때로 글루코스 제거로 칭함)를 달성하는데 충분하다. 본원에서 제공되는 모든 조성물 및 본원에서 제공되는 방법에서, 각 성분의 양은 조성물이 투여된 대상체 및/또는 제공된 특별한 속효성 인슐린(또는 그 혼합물)에 따라 변경될 수 있다. 필요에 따라서, 그 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
속효성 인슐린의 치료적 유효량 및 히알루로난 분해효소의 양을 함유하는 조성물을 제공한다. 히알루로난 분해효소의 양은 히알루로난 분해효소 없이 동일한 속효성 인슐린의 비경구 투여후 동일한 기간에 걸친 전신 노출보다 투여 후 처음 30분 내지 40분에 걸쳐 적어도 또는 약 30% 초과하는 인슐린에 대한 전신 노출을 달성하는데 충분하다.
히알루로난 분해효소의 양은 생성된 초속효성 인슐린 조성물이 히알루로난 분해효소 없이 동일한 속효성 인슐린의 비경구 투여 후 동일한 기간에 걸친 혈당 수준의 증가 보다 적어도 또는 약 20% 또는 30% 적은 비경구 투여 후 처음 30분, 45, 60, 90, 120 또는 180 분 후 혈당 수준을 증가시키는데 충분할 수 있다. 혈당수준의 증가는 히알루로난 분해효소 없이 속효성 인슐린의 비경구 투여후 혈당 수준의 증가보다 적어도 또는 약 30%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 낮을 수 있다.
또한, 치료적 유효량의 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소 없이 동일한 속효성 인슐린의 비경구 투여후 처음 60분에 걸친 전신 글리코스 제거(즉, 대사) 보다 적어도 또는 약 30% 초과하는 전신 글루코스 대사를 달성하는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소를 포함하는 초속효성 인슐린 조성물이 제공된다.
본원에서 제공된 초속효성 인슐린 조성물에서, 예시의 인슐린의 양 (즉, 조성물이 단일 투여량을 제공하는 양)은 약 또는 0.05 유닛, 0.06 유닛, 0.07 유닛, 0.08 유닛, 0.09 유닛, 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛 또는 100 유닛이다. 예시의 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 0.3 유닛, 0.5 유닛, 1 유닛, 3 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛, 200 유닛, 250 유닛, 300 유닛, 350 유닛, 400 유닛, 450 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2,000 유닛, 3,000 유닛, 4,000 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등한 양을 포함한다.
본원에서 제공된 초속효성 인슐린 조성물은 히알루로난 분해효소 없이 인슐린의 비경구 투여 후 전신 노출 보다 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 300% 또는 400% 초과하는 인슐린에 대한 식사 (예를 들면 투여 후 0-4 시간) 전신 노출을 달성할 수 있다. 본원에서 제공된 초속효성 인슐린 조성물은 히알루로난 분해효소 없이 인슐린의 비경구 투여 후 혈당의 대사 보다 적어도 또는 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350% 또는 400% 초과하는 전신 글루코스 대사(즉, 미리 결정된 기간 동안 속도(양/시간) 또는 총량 중의 하나로서 나타낸 혈액으로부터 글루코스의 제거의 정량화)를 달성할 수 있다.
본원에서 제공된 초속효성 인슐린 조성물은 임의로 킬레이트제, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 킬레이트제는 약 또는 등몰 농도로 금속과의 착체, 예를 들면, 킬레이트제 착체 칼슘 EDTA로서 제공할 수 있다. 칼슘 EDTA의 농도는 약 또는 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM이다.
본원에서 초속효성 인슐린 조성물은 일반적으로 아연을 포함한다. 일반적으로 아연의 농도는 인슐린 100 유닛 당 약 또는 0.002 밀리그램(mg/100U), 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.028 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U 또는 0.1 mg/100 U이다. 일반적으로, 속효성 인슐린은 아연과 함께 제형화되고; 본원에서의 사용량은 히알루로난 분해효소와 결합할 때 아연과 동일한 농도를 유지하는 양일 수 있다. 예시의 조성물은 칼슘 EDTA와 아연을 약 또는 0.5:1, 1 :1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 300:1 또는 1000:1의 몰비로 함유할 수 있고, 예를 들면 100 U 인간 인슐린 당 약 또는 0.010-0.50mg의 아연, 예를 들면 100 U 인간 인슐린 당 0.017 mg의 아연 및 0.1 내지 50 mM의 칼슘 EDTA를 함유할 수 있다. 다른 예시의 초속효성 인슐린 조성물은 속효성 인슐린에 대한 아연의 몰비 약 또는 1:3 및 속효성 인슐린에 대한 칼슘 EDTA의 몰비 약 또는 1:3 내지 10:1을 함유한다.
초속효성 인슐린 조성물은 또한 임의로 등장화제, 예를 들면, 아미노산, 폴리알콜, 예를 들면 글리세롤 및/또는 염, 예를 들면 염화나트륨을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 조성물의 오스몰 농도는 약 또는 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg 또는 400 mOsm/kg일 수 있다. pH는 약 또는 5.5 내지 8.5, 특히 6 내지 8, 예를 들면 약 또는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8이며 비경구 투여에 적당하다. 조성물은 임의로 속효성 인슐린의 안정화제, 히알루로난 분해효소의 안정화제 또는 둘다를 포함할 수 있다. 안정화제는 계면활성제, 폴리알콜, 금속, 염, 공용매 및/또는 단백질을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 예시의 안정화제는 조성물 및/또는 성분의 더 큰 안정성을 달성하는데 충분한 농도의 혈청 알부민 및/또는 폴리솔베이트를 들 수 있다. 혈청 알부민은 약 또는 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL 또는 1 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 폴리솔베이트는, 예를 들면 약 또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1%의 농도로 포함할 수 있다. 다른 임의의 성분은, 예를 들면 탈산소제, 예를 들면, 아스코르브산, 아스코르베이트, 시트르산, 시트레이트, 메티오닌을 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, 또는 20 mM의 농도로 포함하거나/하고 알부민 및/또는 보존제, 예를 들면 방향환, 예를 들면 m-크레솔 또는 페놀을 함유하는 화합물을 포함한다.
속효성 인슐린은, 예를 들면 단량체 또는 다량체, 예를 들면 2량체 또는 6량체일 수 있다. 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린, 예를 들면 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린, 예를 들면 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 B-사슬을 갖는 인슐린, 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 B-사슬을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 인슐린은 재조합 인슐린이거나 합성되거나 부분적으로 합성되거나 천연원으로부터 단리될 수 있다. 인슐린은 인슐린 유사체일 수 있다. 예시의 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 A-사슬 및 서열번호 147-149 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖거나 함유하는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 인슐린 유사체이다. 일부 예시의 초속효성 인슐린 조성물에서 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린이다. 또한, 초속효성 인슐린 조성물은 인슐린 혼합물을 함유할 수 있다. 혼합물은 속효성 인슐린, 또는 속효성 인슐린 및 또한 지효성 인슐린, 예를 들면 기초-작용 인슐린의 혼합물일 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 조합물에 함유된 히알루로난 분해효소는, 예를 들면 히알루로니다제, 예를 들면 인간을 포함한 동물, 히알루로니다제, 특히 그 가용성 형태를 포함한다. 예시의 히알루로난 분해효소는 히알루로니다제, 특히 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 PH20, 또는 말단절단된 형태을 들 수 있다. PH20은, 예를 들면 양, 소 또는 말단절단된 인간 PH20을 들 수 있다. 서열번호 1-39 및 67-96 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 및 그 말단절단된 형태 또는 그 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 함유하는 것을 들 수 있다. 말단절단 인간 PH20, 특히 가용성 말단절단된 형태는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 그 대립형질 변이체 및 다른 변이체 중에서 어느 것을 들 수 있다. 일반적으로 히알루로니다제의 변이체는 서열번호 1-39 및 67-96 중 어느 하나와 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성, 및 특히 가용성 형태를 갖고 히알루로니다제 활성을 유지한다. 가용성 히알루로니다제는 rHuPH20인 조성물일 수 있다.
히알루로난 분해효소는 콘드로이티나제, 예를 들면, 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시의 콘드로이티나제는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 말단 절단된 형태, 또는 대립형질 변이체, 종 변이체 및 다른 변이체를 갖거나 함유한다. 일반적으로 변이체는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는 야생형 콘드로이티나제와 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다.
본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물은 다중 용량 투여, 원하는 투여량으로 희석 또는 단일 용량 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예시의 인슐린의 치료적 유효량은 조성물이 투여된 대상체 및 조성물 중의 인슐린에 의존한다. 이러한 단일 용량 투여량은, 예를 들면 약 또는 0.05 유닛, 0.06 유닛, 0.07 유닛, 0.08 유닛, 0.09 유닛, 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛 또는 100 유닛을 들 수 있다. 이러한 조성물에서, 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 0.3 유닛, 0.5 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 3 유닛, 4 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛, 200 유닛, 250 유닛, 300 유닛, 350 유닛, 400 유닛, 450 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등할 수 있다.
초속효성 인슐린 조성물은 펌프에 의한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 혈당 수준을 조절하기 위해 폐루프시스템이 제공된다. 상기 시스템은 당업자에게 공지되어 있지만, 본원에 기재된 바와 같이 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소및 적절한 용량을 함유하거나, 또는 치료적 투여량의 속효성 인슐린의 및 히알루로난 분해효소를 전달하도록 프로그래밍함으로써 초속효성 인슐린 조성물을 생산하도록 변경된다. 폐루프시스템은 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소를 함유한 저장소를 포함하고, 히알루로난 분해효소는 생성된 조합물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 혈당 수준을 조절하기 위한 폐루프 시스템은 속효성 인슐린을 함유한 저장소 및 히알루로난 분해효소를 함유한 제2 저장소를 함유하는 것을 제공한다.
폐루프시스템은 임의로 글루코스 센서, 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린을 전달하기 위한 전달계 및 펌핑 기능과 모니터링 기능을 통합하도록 프로그램된 소프트웨어 중 하나 이상을 포함하고, 이에 의해서 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린은 비당뇨병 대상체내의 혈당조절과 유사한 병상을 나타내는 혈당조절을 달성하기 위해 전달된다. 폐루프시스템은 또한 속효성 인슐린 및/또는 히알루로난, 지효성 예를 들면 기초 인슐린을 별개의 저장소에 함유하거나 혼합합 수 있다. 상기 시스템은 상기 기재된 임의의 성분 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소는 상기 기재된 것 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
폐루프시스템에서, 속효성 인슐린을 함유하는 저장소는 반나절, 1일 또는 그 이상동안 혈당 조절을 유지하기 위해 충분한 수의 유닛을 함유할 수 있고 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 200 유닛, 300 유닛, 400 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 6000 유닛, 7000 유닛 또는 그 이상의 인슐린을 함유할 수 있다. 폐루프시스템은 인슐린 및/또는 히알루로난 분해효소의 원하는 양 또는 투여량 증가, 예를 들면 증분 당 0.05 유닛, 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛 또는 그 이상의 인슐린을 전달할 수 있다. 히알루로난 분해효소를 함유하는 저장소는 약 또는 1 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛, 200 유닛, 250 유닛, 300 유닛, 350 유닛, 400 유닛, 450 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2,000 유닛, 3,000 유닛, 4,000 유닛, 5000 유닛, 6,000 유닛, 7,000 유닛, 8,000 유닛, 9,000 유닛, 10,000 유닛, 20,000 유닛 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등한 히알루로난 분해효소를 포함하고, 약 또는 0.3 유닛. 0.5 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 3 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등한 히알루로난 분해효소의 양의 각 투여량 증가로서 히알루로난 분해효소를 전달할 수 있다.
약 또는 10 U 내지 약 또는 500 U 인슐린을 함유하는 제1 조성물 및 인슐린과 투여될 때 속효성 인슐린을 초속효성 인슐린으로 만드는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소를 함유하는 제2 조성물을 함유하는 조합물이 제공된다. 히알루로난 분해효소의 충분한 양은 적어도 또는 약 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL or 25 U 히알루로니다제 활성/mL와 기능적으로 동등하다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소의 충분한 양은 적어도 또는 약 35 U 히알루로니다제 활성/mL와 기능적으로 동등하다. 예를 들면, 제2 조성물 중에 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37.5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL 또는 5000 U/mL와 기능적으로 동등할 수 있다. 일부 예에서, 제1 조성물 중 속효성 인슐린의 양은 약 또는 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml 또는 500 U/mL이다.
히알루로난 분해효소를 함유하는 제1 조성물 및 속효성 인슐린을 함유하는 제2 조성물의 조합물이 제공된다. 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소의 양은 제2 조성물과 혼합하여 생성된 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는 것이면 충분하다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소의 양은 제1 조성물 투여전에 투여되어 속효성 인슐린 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는 것이면 충분하다.
본원에서 제공된 조합물에서, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소 및 다른 성분은 조성물에 대해 상기 기재된 바와 같다. 조합물을 함유하는 키트가 제공된다. 인슐린 조성물은 1회 식사를 위해 식사 투여량, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0.03 U/kg, 0.04 U/kg, 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg, 1 U/kg, 1.5 U/kg, 또는 2 U/kg을 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 히알루로난 분해효소의 양은 1회 식사를 위한 식사투여량, 예를 들면, 약 또는 0.3 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 4 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 U, 5,000 U 또는 그 이상을 대상체에 투여하기 위해 제형화된다. 조합물 중의 조성물은 피하투여를 위해 제형화될 수 있다.
본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물 및 조합물이 투여되는 방법을 제공한다. 일반적으로 이러한 투여는 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내, 피하 투여 또는 임의의 적당한 경로를 통한 투여이다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소는 별개의 조성물 중에 별개로, 간헐적으로 또는 함께 투여되거나 공동-제형화될 수 있다. 또한 본원에서 제공된 임의의 초속효성 인슐린 조성물 또는 조합물을 투여함으로써 대상체내에 글루코스 수준을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 조성물 또는 조합물은 예를 들면 식전 약 또는 20분, 10분, 5분 미만 내지 식후 10분 미만 또는 식사와 함께 투여되는 것과 같이 식사 투여로서 투여된다.
또한, 환자에게 속효성 인슐린 조성물을 식전 약 또는 20분, 10분, 5분 미만 내지 식후 30분 미만 투여할 것을 지시하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 속효성 인슐린은 속효성 인슐린 조성물을 초속효성 조성물로 만드는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소와 함께 공동-투여된다. 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소는 공동-제형화되거나 공동-투여하기 위해 별개로 제공될 수 있다. 이러한 방법에서, 환자에게 약 또는 식사섭취시에 속효성 인슐린 조성물을 투여하는 것을 지시할 수 있다. 일부 예에서, 지시가 기재되어 있다. 다른 예에서, 지시는 구두이다.
대상체에게 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린을 투여함으로써 대상체내의 혈당 수준을 조절하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린은:
a) 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 속효성 인슐린 투여 후 얻어진 혈액 중 인슐린 농도의 최대 증가 보다 적어도 또는 약 20% 내지 30% 더 큰 혈액 중 인슐린 농도의 최대 증가를 얻고; 및/또는
b) 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 속효성 인슐린이 투여될 때에 혈액 중 최대 인슐린 농도에 도달하는데 걸리는 시간의 80% 이하까지 혈액 중 최대 인슐린 농도에 도달하는데 걸리는 시간이 감소되고
c) 투여 15분 후 인슐린 농도를 적어도 또는 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 pmol/L까지 증가시키기 위한 충분한 양으로 투여된다.
상기 방법에 의해, 혈액 중 인슐린 농도의 최대 증가는 히알루로난 분해효소 없이 인슐린 농도의 최대 증가 보다 적어도 또는 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350% 또는 400% 더 크다. 혈액 중 최대 인슐린 농도에 도달하는데 걸리는 시간은 히알루로난 분해효소 없이 혈액 중 최대 인슐린 농도에 도달하는데 걸리는 시간의 80% 이하로 감소될 수 있다. 예를 들면, 투여 15분 후 인슐린 20 U 투여량을 투여한 후 인슐린 농도는 적어도 또는 약 60 pmol/L, 80 pmol/L, 100 pmol/L, 120 pmol/L, 140 pmol/L, 160 pmol/L, 180 pmol/L, 또는 200 pmol/L 까지 증가될 수 있다.
예시의 구현예에서, 당뇨병 대상체는 1형 또는 2형 당뇨병을 갖고 대상체에 투여된 속효성 인슐린의 양은 속효성 인슐린이 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 투여되는 경우에 비해 감소된다. 예를 들면, 1형 당뇨병 대상체에 투여된 속효성 인슐린의 양은 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 그 이상까지 감소될 수 있고 2형 당뇨병 대상체에 투여된 속효성 인슐린의 양은 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 까지 감소될 수 있다.
또한, 당뇨병 대상체내에 체중 증가 및/또는 비만, 예를 들면 식사 인슐린 요법과 연관된 체중 증가를 조절하거나 방지하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이것은 히알루로난 분해효소 존재없이 투여될 때 속효성 인슐린의 투여량 미만의 투여량으로 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린을 투여함으로써 달성된다. 당뇨병 대상체는 비만 또는 비만 위험성이 있고 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 다른 당뇨병을 가질 수 있다. 예시의 당뇨병 대상체는 2형 당뇨병 대상체이다. 일예에서, 당뇨병 대상체 내에 비만의 조절 또는 방지하는 히알루로난 분해효소와 병용하여 속효성 인슐린의 치료적으로 유효한 투여량을 비만 당뇨병 대상체 또는 비만 위험의 당뇨병 대상체에게 투여함으로써 달성된다. 조성물은 식사시간 또는 그 근처에 투여될 수 있고,
a) 히알루로난 분해효소의 양은 투여된 속효성 인슐린을 초속효성 인슐린으로 만드는데 충분하고;
b) 속효성 인슐린의 투여량은 실질적으로 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 투여된 동일한 속효성 인슐린의 더 많은 투여량으로 투여한 후 처음 40분 내에 식사 글루코스 제거와 동일한 정도를 달성한다. 더 많은 투여량의 속효성 인슐린과 비교되는, 초속효성 인슐린 조성물내에 속효성 인슐린의 투여량은 식후 저혈당 및 비만을 일으키는 위험을 경향을 감소시킨다. 예시의 구현예에서, 당뇨병 대상체는 2형 당뇨병을 갖고 대상체에 투여된 속효성 인슐린의 양은 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 속효성 인슐린이 투여되는 경우에 비해 감소된다. 예를 들면, 2형 당뇨병 대상체에 투여된 속효성 인슐린의 양은 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상까지 감소될 수 있다.
대상체내에 식후 고혈당을 치료하기 위해 투여된 속효성 인슐린의 양은 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 투여되는 경우 고혈당을 치료하는데 필요한 동일한 속효성 인슐린의 양에 비해 감소되도록, 식사시간 또는 그 근처에 식사 인슐린 요법으로부터 체중 증가 위험이 있는 당뇨병 대상체에 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소를 함유하는 인슐린 조성물을 피하에 투여함으로써, 식사 인슐린 요법에 연관된 체중 증가를 감소하거나 방지하기 위한 방법이 제공된다. 속효성 인슐린의 양을 감소시켜 대상체내의 체중 증가를 일으키는 경향이 적은 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물을 제조한다. 예를 들면, 2형 당뇨병 대상체는 히알루로난 분해효소 없이 동일한 방법으로 투여하는 경우 고혈당을 치료하는데 필요한 동일한 속효성 인슐린의 양 보다 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 낮은 속효성 인슐린의 양을 함유하는 상기 기재된 인슐린 조성물을 투여할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 조성물은 식사 인슐린 요법의 만성치료요법에서 투여된다.
식사 인슐린 요법으로부터 체중 증가 위험의 당뇨병 대상체에 적어도 30일의 기간에 걸쳐 피하 식사 인슐린 요법의 과정을 투여함으로써 당뇨병 대상체내에 체중 증가를 저하하거나 방지하는 방법이 제공된다. 요법 과정에서 투여된 식사 인슐린 투여량은 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 조합물을 함유한다. 각 투여량 내 히알루로난 분해효소의 양은 속효성 인슐린을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분하고 대상체의 식후 고혈당을 치료하기 위해 투여량내에 함유된 속효성 인슐린의 양이 히알루로난 분해효소 없이 고혈당을 치료하는데 필요한 동일한 속효성 인슐린의 양 보다 낮다. 이러한 식사 인슐린 치료의 과정은 히알루로난 분해효소 없이 더 많은 양의 속효성 인슐린을 사용한 유사한 요법 과정 보다 체중이 적게 증가된다.
또한, 대상체에 초속효성 인슐린 조성물의 식사투여량을 투여함으로써 대상체내에 글루코스 수준을 조절하는 방법을 제공하고, 여기서,
a) 초속효성 인슐린 조성물은 치료적 유효량의 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소를 포함하고
b) 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린이고;
c) 투여량이 히알루로난 분해효소 없이 동일한 투여경로로 투여된 동일하거나 더 많은 양의 동일한 속효성 레귤러 인슐린 보다 식사시간 가까이 식사시 또는 식전 투여를 위해 투여되거나 추천되고;
d) 초속효성 인슐린 조성물의 투여량은 히알루로난 분해효소 없이 속효성 레귤러 인슐린으로서 적어도 동일한 치료효과 갖는다.
초속효성 인슐린 조성물은, 예를 들면 식전 약 또는 20분 미만 내지 식후 약 또는 10 또는 20분 미만 투여를 위해 투여되거나 추천된다. 일반적으로, 초속효성 인슐린 조성물내에 속효성 인슐린의 투여량은 히알루로난 분해효소 존재없이 동일한 경로로 투여된 속효성 인슐린의 투여량보다 작거나 동일하다.
본원에 제공된 임의의 방법을 실시할 때에, 조성물은 임의의 적당한 경로를 통해 임의의 적당한 장치 또는 용기, 예를 들면 주사기, 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 폐루프시스템를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물 또는 조합물은 상기 기재된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소 중 어느 하나를 상기 기재된 추가의 시약과 함께 함유할 수 있다. 대상체에 투여된 조성물내의 인슐린의 양은 1회 식사 투여량이고 약 또는 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0.05 U/kg 내지 0.30 U/kg, 예를 들면 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg, 1.0 U/kg, 1.5 /kg 또는 2 U/kg이다. 대상체에 투여된 히알루로난 분해효소의 양은 1회 식사를 위한 속효성 인슐린의 식사투여량으로 공동-투여(별개의 조성물내에 별개로, 간헐적으로 또는 함께 투여 또는 공동-투여)된다. 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 0.3 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 유닛, 5,000 U 또는 그 이상일 수 있다.
포장재 및 당뇨병 대상체에 투여를 위한 임의의 지침서를 갖는 포장재내에 초속효성 인슐린 조성물 또는 조합물 중 어느 하나를 함유하는 제조품이 제공된다.
속효성 인슐린, 인슐린, 히알루로난 분해효소 및 다른 성분은 상기 기재된 것을 들 수 있다. 특히, 본원에 제공된 조성물 및 조합물이 투여된다
비경구 투여를 위해 제형화된 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소 조성물을 함유하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 제품은 인슐린-치료가능한 질병 또는 상태의 치료방법에서 사용될 수 있다. 또한 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 투여방법이 제공된다.
도 1은 rHuPH20의 공동-투여없이 또는 그와 함께 따라서 피하로 투여되는 경우 속효성 인슐린 유사체, 휴마로그(Humalog)® 인슐린 및 속효성 레귤러 인슐린, 휴뮤린(Humuline)® 인슐린의 약동학 프로파일를 나타낸다. 고인슐린혈-정상혈당 절차를 사용하여 건강한 정상 대상체에 투여 후 각 시점에서 혈장 인슐린 농도를 방사면역측정법(RIA)에 의해 결정하였다.
도 2는 혈당 클램프 검사 절차를 사용하여 rHuPH20의 공동-투여없이 또는 그와 함께 피하로 투여되는 경우 속효성 인슐린 유사체, 휴마로그(Humalog)® 인슐린 및 속효성 레귤러 인슐린, 휴뮤린(Humuline)® 인슐린의 약동학 프로파일을 나타낸다. 정상의 건강한 대상체에 인슐린 투여 후 90-110 mg/dL 사이의 혈당 수준을 유지하기 위해 필요로 되는 글루코스 주입속도를 결정하였다.
개요
A. 정의
B. 초속효성 인슐린 조성물
1. 인슐린, 당뇨병 및 기존의 속효성 인슐린 요법의 고찰
2. 초속효성 인슐린 조성물의 약력학 및 약동학
C. 인슐린 폴리펩티드 및 제형
D. 히알루로난 분해효소
1. 히알루로니다제
a. 포유류-계 히알루로니다제
b. 박테리아 히알루로니다제
c. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
2. 기타 히알루로난 분해효소
3. 가용성 히알루로난 분해효소
a. 가용성 인간 PH20
b. 재조합 가용성 인간 PH20 (rHuPH20)
4. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
5. 약동학적 성질을 개선하기 위한 히알루로난 분해 효소의 변형들
E. 인슐린 또는 히알루로난 분해효소 및 그 폴리펩티드를 코드화된 핵산을 제조하는 방법
1. 벡터 및 세포
2. 링커 잔기
3. 발현
a. 원핵세포
b. 효모 세포
c. 곤충세포
d. 포유류 세포
e. 식물
4. 정제기술
F. 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드의 제조, 제형화 및 투여
1. 제형화
동결건조 분말
2. 투여량 및 투여
투여 방식
a. 주사기
b. 인슐린 펜
c. 인슐린 펌프 및 다른 인슐린 전달 장치
d. 폐루프시스템
G. 활성, 약동학 및 약력학의 평가 방법
1. 약동학, 약력학 및 관용성
2. 생물학적 활성
a. 인슐린
b. 히알루로난 분해 효소
H. 치료 용도
1. 진성 당뇨병
a. 1형 당뇨병
b. 2형 당뇨병
c. 임신성 당뇨병
2. 중증의 환자를 위한 인슐린 요법
I. 병용 요법
J. 제품 및 키트
K. 실시예
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본원에 사용된 바와 같이, "인슐린"이란 글루코스 섭취 및 저장을 증가시키고 및/또는 내인성 글루코스 생성을 감소시키는 작용을 하는 호르몬, 전구체 또는 그 합성 또는 재조합 유사체를 말한다. 예시의 인간 인슐린은 110 아미노산 전구체 폴리펩티드, 단백질을 소포체(ER)로 지시하게 하는 24 아미노산 신호 펩티드를 함유하는 프레프로인슐린(서열번호 101)으로 번역되고, 여기서 신호 서열은 절단되어 프로인슐린(서열번호 102)을 생성한다. 프로인슐린이 더 처리되어 31 아미노산 C- 또는 결합 사슬 펩티드(서열번호 101에 기재된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 57 내지 87 및 서열번호 102에 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 33 내지 63에 상응)을 방출한다. 생성된 인슐린은 21 아미노산 A-사슬 (서열번호 101에 기재된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 90 내지 110 및 서열번호 102에 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 66 내지 86에 상응) 및 30 아미노산 B-사슬(서열번호 101에 기재된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 25 내지 54 및 서열번호 102에 기재된 프로인슐린 폴리펩티드 아미노산 잔기 1 내지 30)을 함유하고 이들은 이황화 결합에 의해 가교결합되어 있다. 적당하게 가교결합된 인간 인슐린은 3개의 이황화 가교를 포함한다: A-사슬의 7 위치와 B-사슬의 7 위치 사이의 하나의 가교, A-사슬의 20 위치 및 B-사슬의 19 위치 사이의 두번째 가교 및 A-사슬의 6 위치와 11 위치 사이의 세번째 가교. 인슐린에 대한 언급은 하나의 사슬 또는 2개의 사슬의 형태이고, 프레프로인슐린, 프로인슐린 및 인슐린 폴리펩티드, 활성을 갖는 말단절단된 형태를 포함하고 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체, 및 다른 변이체, 예컨대 서열번호 101에 기재된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체 또는 그 성숙한 형태를 포함한다. 예시의 인슐린 유사체는 서열번호 147-149, 152에 기재된 것 및 서열번호 150, 156, 158, 160, 162 및 164에 기재된 A-사슬 및/또는 서열번호 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 및 165에 기재된 B-사슬을 함유하는 것을 포함한다.
예시의 인슐린 폴리펩티드는 포유류, 예를 들면 인간 기원인 것을 들 수 있다. 예시의 인간 기원의 인슐린의 아미노산 서열은 서열번호 101-104에 기재되어 있다. 예시의 인슐린 유사체는 서열번호 147-149, 152에 기재된 것 및 서열번호 150, 156, 158, 160, 162 및 164에 기재된 A-사슬 및/또는 서열번호 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 및 165에 기재된 B-사슬을 함유한 것을 포함한다. 또한, 인슐린 폴리펩티드는 서열번호 105-146에 기재된 임의의 전구체 인슐린 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 임의의 비인간 기원를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 인슐린에 대한 언급은 단량체 인슐린 및 6량체 인슐린을 포함하는 다량체 인슐린 또한 인간화 인슐린를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "속효성 인슐린"은 속효성 인슐린 투여 후 약 4 시간내에 발생된 대상체에 실제의, 인식된 또는 예상된 고혈당 상태(예를 들면 음식물 소비에 기인해서 얻어지거나 예상되는 식사 고혈당 상태)에 반응하여 당뇨병 대상체에 신속히 투여하고, 이에 의해서 속효성 인슐린이 급성 고혈당 상태를 방지, 조절 또는 완화시킬 수 있는 임의의 인슐린 또는 속효성 인슐린 조성물을 말한다. 일반적으로 속효성 인슐린 조성물은 대상체에 피하 투여 후 약 또는 4시간 이하에 피크 인슐린 수준을 나타낸다. 속효성 인슐린 조성물은 재조합 인슐린 및 단리된 인슐린 (또한 "레귤러"라고 칭함), 예를 들면 휴뮤린(Humulin)® R로서 시판되는 인슐린, 돼지 인슐린 및 소 인슐린, 또한 아미노산 변화에 의해 급속히 작용하도록 설계된 인슐린 유사체를 포함한다. 예시의 레귤러 인슐린 제제는 인간 레귤러 인슐린, 예를 들면 휴뮤린(Humulin)® R, 노보린(Novolin)® R 및 벨로슐린(Velosulin)®로 시판되는 것들, 인슐린 휴먼, USP 및 인슐린 휴먼 주사액, USP, 또한 인슐린의 산성 제형, 예를 들면, 토론토 인슐린, 올드 인슐린 및 클리어 인슐린 및 레귤러 돼지 인슐린, 예를 들면 이렉틴 II(Iletin II)®(돼지 인슐린)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 예시의 속효성 인슐린 유사체는, 예를 들면 인슐린 리스프로(예를 들면 휴마로그(Humalog)® 인슐린), 인슐린 아스파르트(예를 들면, 노보로그(NovoLog)® 인슐린) 및 인슐린 글루리신(예를 들면 아피드라(Apidra)® 인슐린), 비아젝트(VIAject)® 및 비아텝(VIAtab)®로서 시판되는 속효성 인슐린 조성물 (예를 들면, 미국 특허번호 제7,279,457호 참조)를 포함한다. "속효성 인슐린"은 "기초작용 인슐린"을 포함하지 않지만 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 임의로 속효성 인슐린 이외에 하나 이상의 기초-작용 인슐린을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간 인슐린은 대립형질 변이체 및 그 유사체를 포함하는 인간 폴리펩티드에 기초하여 합성되거나 재조합 생성된 인슐린을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 속효성 인간 인슐린 또는 인간 속효성 인슐린 조성물은 임의의 인간 인슐린 또는 속효성인 인간 인슐린의 조성물을 포함하지만 비인간 인슐린, 예를 들면 레귤러 돼지 인슐린은 제외한다.
본원에 사용된 바와 같이, "기초-작용 인슐린" 또는 "기초 인슐린"이란 당뇨병과 같은 만성적 상태를 치료하기 위한 전체의 치료요법의 일부로서 기초 인슐린 수준을 유지하기 위해 투여되는 인슐린을 말한다. 일반적으로, 기초-작용 인슐린은 주기적으로(예를 들면, 1일 1회 또는 2회) 투여되는 경우 인슐린의 제어된 방출에 의하여 제어함으로써 대략 정상상태의 인슐린 수준을 유지하도록 제형화된다. 기초-작용 인슐린은 결정성 인슐린(예를 들면, NPH 및 렌테(Lente)®, 프로타민 인슐린, 서펜 인슐린), 기초 인슐린 유사체(인슐린 글라긴, HOE 901, NovoSol Basal) 및 레귤러 인슐린의 흡수속도를 지체시키는 다른 인슐린 화학 제형(예를 들면, 아라비아 검, 레시틴, 또는 오일 현탁액)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 지속형(일반적으로, 약 20-30 시간에 걸친 최대 작용 지속기간을 갖는 반면, 비교적 낮은 피크 농도에 도달하는 것) 또는 중간형 (일반적으로 투여후 약 4-12 시간에 피크 인슐린 농도를 일으키는 것)으로 이해되는 인슐린을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "초속효성 인슐린 조성물"은 대상체에 비경구 투여 후 처음 40분에 걸쳐 인슐린 조성물이 히알루로난 분해효소 없이 동일한 경로에 의해 동일한 투여량의 동일한 속효성 인슐린을 투여한 후 동일한 기간에 걸쳐 대상체에 제공된 누적 전신 인슐린 노출 보다 큰 대상체내의 누적 전신 인슐린 노출을 제공하도록 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소(예를 들면 rH2uPH20 제제를 포함하나 이에 국한되지 않는 가용성 히알루로니다제)를 함유하는 인슐린 조성물을 말한다. 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 임의로 기초-작용 인슐린을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "고혈당 상태" 또는 "고혈당"이란 바람직하지 않는 혈당 상승을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "저혈당 상태" 또는 "저혈당"이란 바람직하지 않는 혈당 강하를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전신 글루코스 제거" 또는 "전신 글루코스 대사"란 혈액으로부터 글루코스가 제거된 것을 말하고 속도(양/시간) 또는 양(시간에 걸친 양)으로 나타낼 수 있다. 전신 글루코스 제거는 당분야에 알려진 적당한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 전신 글루코스 제거는 본원에 예시되고 기재된 바와 같이 절식조건 하에서 고인슐린혈-정상혈당 절차를 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 일정한 혈당 수준, 예를 들면 90-110 mg/dL을 유지하기 위해 정맥내로 주입된 글루코스의 양 또는 속도는 전신 글루코스 제거와 동등하다. 다른 인슐린 조성물에 의해 달성된 전신 글루코스 제거의 차이, 예를 들면 속효성 인슐린에 의해 달성된 제거와 초속효성 인슐린 조성물의 투여에 의해 달성된 전신 글루코스 제거의 차이는 이러한 절차를 사용하여 결정될 수 있다. 대조 인슐린 중에서 전신 글리코스 제거의 차이는 글루코스 농도 검사 시험 후의 정해진 시점에서 대조 인슐린의 상대적 글루코스 저하 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 글로코스 농도 검사 시험(예를 들면, 당업자에게 알려진 75g 경구 글루코스 허용시험 또는 표준 시험 식사 제형)을 사용하여 다른 인슐린 제제와 비교할 수 있다. 이러한 농도 검사 시험에서, 글루코스 또는 다른 탄수화물의 양을 대상체에 투여한 후 즉시 인슐린 조성물을 비정맥내 비경구 투여한다. 혈당 수준(즉, 대상체 혈액내의 글루코스의 농도)은 정해진 시간에 측정되어 인슐린의 혈당 저하 효과를 결정한다. 각종 인슐린 제제 사이의 이들 경구 농도 검사 비교에 있어서, 혈당 수준을 측정한 후의 경과된 시간이 전신 글루코스를 섭취를 허용하기에 적합해야 한다. 전신 글루코스 제거를 결정하는데 상기 기재된 연구는 동물 모델 및/또는 인간 대상체를 사용하여 실시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 혈당 조절 또는 "혈당 수준을 조절하는 것"이란 혈당 농도를 원하는 수준, 일반적으로 70-130 mg/dL 또는 90-110 mg/dL로 유지하는 것을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이 "누적 전신 인슐린 노출" 또는 "인슐린에 대한 누적 전신 노출"이란 인슐린의 비경구 투여 후 혈액내에 흡수된 인슐린의 양을 말한다. 인슐린에 대한 누적 전신 노출은 특정 기간의 시간동안 곡선하 면적을 계산함으로써 결정될 수 있고, 곡선은 혈액, 혈청 또는 혈장에서 인슐린의 농도를 시간의 함수로서 플롯팅하여 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폐루프시스템은 연속적인 혈당 조절을 제공하기 위한 통합된 시스템이다. 폐루프시스템은 혈당을 측정하는 메카니즘, 인슐린 조성물을 포함한 하나 이상의 조성물을 전달하는 메카니즘, 및 혈당 조절을 달성하기 위해 전달될 필요가 있는 인슐린의 양을 결정하는 메카니즘을 포함한다. 따라서, 일반적으로 폐루프시스템은 글루코스 센서, 인슐린 전달 장치, 예를 들면 인슐린 펌프, 및 글루코스 센서로부터 정보를 받고 인슐린 전달 장치에 명령을 제공하는 콘트롤러를 포함한다. 명령은 콘트롤러내의 소프트웨어에 의해 생성될 수 있다. 소프트웨어는 일반적으로 글루코스 센서에 의해 검출되거나 사용자에 의해 예상되는 혈당 수준에 기초하여 혈당 조절을 달성하기 위해 전달될 필요가 있는 인슐린의 양을 결정하는 알고리즘을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 요법(투약요법)이란 인슐린의 투여량 및 투여주기를 말한다. 투여 요법은 치료될 질병 또는 상태의 함수이므로 변경될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해효소(hyaluronan degrading enzyme)는 히알루로난 폴리머(또한 히알루론산 또는 HA라 언급됨)을 더 작은 분자량의 절편으로 절단하는 것을 촉매하는 효소를 나타낸다. 히알루로난 분해효소의 예는 히알루로니다제, 및 히알루로난을 탈중합하는 능력을 가지는 특정 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해효소인 예시적인 콘드로이티나제는 콘드로이틴 ABC 리아제(또한 콘드로이티나제 ABC로 공지), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 설페이트 리아제 또는 콘드로이틴 설페이트 엘리미나제로 공지) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함한다. 예시적인 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum) (프로테우스 불가리스 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있다; Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소는 서열번호 99에 기재된 프라보박테리움 헤파리넘 빅티발리스 바덴시스(Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 아우레스켄스(Arthrobacter aurescens (Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 C 효소는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) (Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제는 히알루로난 분해 효소의 한 분류이다. 히알루로니다제는 박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리, 다른 기생동물, 및 갑각류 동물 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36), 및 포유류-형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다제는 쥣과(murine), 개, 고양이과, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아, 및 거머리, 다른 기생충 및 갑각류 유래의 어느 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-인간 기원의 임의의 것을 포함한다. 비인간 히알루로니다제의 예는 젖소 (서열번호 10, 11, 64 및 BH55(미국특허번호 5,747,027호, 및 5,827,721호), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17-19, 32), 돼지(서열번호 20-21), 랫트(서열번호 22-24, 31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 26, 27, 63 및 65), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 30), 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp.) (균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73), 스타피로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소 RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Staphylococcus aureus)(서열번호 82); 균주 ACTT BAA-255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) (균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96) 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 설페이트를 절단하지 않는 스트렙토마이세스 히알루로니티쿠스 히알루로니다아제 효소 (Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함한다. 히알루로니다제는 또한 기원의 것들을 포함한다. 인간 히알루로니다제의 예는 HYAL1(서열번호 36), HYAL2(서열번호 37), HYAL3(서열번호 38), HYAL4(서열번호 39) 및 PH20(서열번호 1)를 들 수 있다. 또한, 히알로니다제 중에서 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 등의 가용성 히알로니다제를 들 수 있다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알로니다제로서는 비트라제®(Vitrase)(양 히알루로니다제) 및 암파다제®(Amphadase)(소 히알로니다제)를 들 수 있다.
히알루로난 분해효소에 대한 언급은 전구체 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 및 성숙한 히알루로난 분해효소 폴리펩티드(예를 들면, 신호 서열이 제거된 것들), 활성을 가지는 이들의 말단절단된 형태를 포함하며, 서열번호 1 및 10-48, 63-65, 67-100 에 기재된 전구체 폴리펩티드 또는 이의 성숙한 형태에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소에 대한 언급은 또한 서열번호 50-51에 기재된 인간 PH20 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로난 분해효소는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형은 페길화(pegylation), 알부민화(albumination), 글리코실화(glycosylation), 파르네실화(farnesylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 인산화(phosphorylation) 및 다른 당업계에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 가용성 히알루로니다제란 생리학적 조건하에서 그 가용성을 특징으로 갖는 폴리펩티드를 말한다. 가용성 히알루로니다제는, 예를 들면 37℃까지 가온한 수성상의 트리톤 X-114 용액을 분별함으로써 분리할 수 있다 (Bordier 등 (1981) J.Biol. Chem.,256:1604-7). 막-부착, 예를 들면 지질-부착 히알루로니다제는 계면활성제-풍부 상으로 분리되지만 포스포리파제-C 로 처리한 후의 계면활성제-부족 상 또는 수성상 내로 분리된다. 가용성 히알로니다제 중에는 막에 히알로니다제를 고정하는 것과 관련한 하나 이상의 영역이 제거되거나 변형되고, 가용성 형태가 히알로니다제 활성을 갖는 막-부착 히알로니다제가 포함되어 있다. 가용성 히알로니다제는 재조합 가용성 히알로니다제 및 천연 자원,예를 들면, 양(sheep) 또는 젖소로부터의 고환 추출물에 함유되거나 정제된 것을 포함한다. 이러한 가용성 히알로니다제로서는 가용성 인간 PH20을 들 수 있다. 다른 가용성 히알로니다제는 양(ovine)(서열번호 27, 63, 65) 및 소(서열번호 11, 64) PH20 을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20는 발현시 폴리펩티드가 가용성이도록 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부를 결여한 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 sHuPH20 폴리펩티드는 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 가지는 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 상기 예시적 sHuPH20 폴리펩티드를 위한 전구체 폴리펩티드는 아미노산 신호 서열을 포함한다. 전구체의 예는 서열번호 3 및 40-46에 기재되어 있으며, 이는 1-35번 아미노산 위치에 35개 아미노산 신호 서열을 포함한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 또한 본원에 기재된 제조 및 정제 방법 동안 또는 이후에 분해되는 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary(CHO)) 세포에서 재조합적으로 발현된 인간 PH20의 가용성 형태를 나타낸다. 가용성 rHuPH20는 신호 서열을 포함하고, 서열번호 49에 기재된 핵산에 의해 코딩된다. 또한 이의 대립형질 변이체 및 다른 가용성 변이체인 DNA 분자가 포함된다. 가용성 rHuPH20를 코딩하는 핵산은 성숙한 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포 내에서 발현된다. 배양 배지에서 생산되는 것과 같이, C-말단에 불균일성(heterogeneity)이 있기 때문에 산물은 서열번호 4-9 중 어느 하나를 풍부하게 포함할 수 있는 종들의 혼합물을 포함한다. 상응하는 대립형질 변이체 및 다른 변이체가 또한 포함되고, 서열번호 50-51에 기재된 인간 PH20 폴리펩티드 전구체에 상응하는 것을 포함한다. 다른 변이체는 이들이 히알루로니다아제 활성을 유지하고, 가용성인 한 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 활성이란 전장(완전한) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 그의 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 말한다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 활성이란 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 능력을 말한다. 히알루로니다제에 대한 미국약전(The United State Pharmacopeia; USA) XXII 분석법은 효소를 HA와 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 잔류하는 더 높은 분자량의 히알루론산, 또는 히알루로난, (HA) 기질의 양을 측정함으로써 간접적으로 히알루로니다제 활성을 결정한다 (USP XXII-NF XVII(1990), 644-645, United Strate Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 기준 표준용액은 임의의 히알루로니다제의 상대적인 활성을 유닛으로 결정하기 위한 평가에 사용될 수 있다. 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 결정하기 위한 시험관내 분석은 당 분야에 공지되고 본원에 기재되어 있다. 예시의 분석은 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때에 형성된 불용성 침전물을 검출함으로써 히알루로니다제에 의한 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정한 하기 기재된 미세탁도 분석을 들 수 있다 (예를 들면, 실시예 3 참조). 예를 들면 시험되는 히알루로니다제의 유닛 활성을 결정하기 위한 표준곡선을 만들기 위해 기준 표준물을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해효소에 대해 "기능적으로 동등한 양" 또는 그 문법적인 변형은 기준 효소, 예컨대, 히알루로니다제의 양 (예컨대, 알려진 수의 히알루로니다제 활성 유닛)과 동일한 효과를 달성한 히알루로난 분해효소의 양을 말한다. 예를 들면, 임의의 히알루로난 분해효소의 활성은 rHuPH20의 활성과 비교하여 공지의 rHuPH20의 양과 동일한 효과를 달성하는 히알루로난 분해효소의 기능적으로 동등한 양을 결정한다. 예를 들면, 산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해효소의 능력은 트리판 블루를 갖는 마우스의 측면에 효소를 주입함으로써 분석할 수 있고 (예를 들면 미국특허 공개 제 20050260186호 참조), 예를 들면 100 유닛의 히알루로니다제 기준 표준물과 동일한 확산량을 달성하는데 필요한 히알루로난 분해효소의 양을 결정할 수 있다. 필요한 히알루로난 분해효소의 양은 100 유닛과 기능적으로 동등하다. 다른 예에서, 공동-투여된 인슐린의 흡수 수준 및 속도를 증가시키기 위한 히알루로난 분해 효소의 능력은 인간 대상체에서, 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가될 수 있고, 예를 들어 rHuPH20 의 투여량과 동일한 인슐린의 흡수 수준 및 속도의 증가를 달성하기 위하여 요구되는 히알루로난 분해 효소의 양은 예컨대 혈액 내 최대 인슐린 농도 (Cmax), 혈액 내 최대 인슐린 농도를 달성하기 위해 요구되는 시간 (tmax), 및 주어진 기간의 시간에 대한 누적적 전신 인슐린 노출 (AUC)을 평가함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연적으로 발생하는 α-아미노산 잔기들은 인간에서 동질(cognate) mRNA 코돈으로 충전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질 내에 삽입되는, 자연계에서 발견되는 20 α-아미노산들 잔기들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 이들의 유사체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능한 표지로 선택적으로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 전형적으로 그들의 표적이 통계적으로 고유하거나, 라이브러리의 탐지 또는 프라이밍을 위하여 낮은 카피수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이도록 하는 길이를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 14, 16 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 2 아미노산 길이 이상 및 40 이하의 아미노산 길이인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 절편 내 존재하는 뉴클레오티드들은 당 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에서 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 간주된다. "D" 이성체 형태 내 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol. Chem., 243:3557-3559(1968)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
대응 표
기호
1-문자 3-문자 아미노산
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소루이신
L Leu 루이신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 미지 또는 기타
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가지는 것을 유의해야 한다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응 표(표 1)에 기재된 아미노산 및 변형된 아미노산 및 희귀 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 넓게 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타내는 것임을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드 내에 존재하는 20개의 L-아미노산을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지나 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 흉내내도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 예를 들면 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산의 예는 본원에 기재되고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절(segment)은 특이한 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 자연 출처로부터 분리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 본원에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자를 위해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 전체 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이들의 말단이 엇갈려 있을 수 있고, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 것이다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 동일성을 나타내는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열, 및 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열의 배열(alignment)은 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보전적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보전적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함한, 비교되는 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 지역 또는 지역들 만을 포함한 서열의 부분의 배열)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체로 기술로-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예컨대: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분률이 특정될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 지시된바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분률 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 최고 수준 매칭이 얻어지도록 서열을 배열한다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 동일성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의하여 결정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalties)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이 전부를 따라 전형적으로 보통의 엄격성(stringency)으로, 또는 높은 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 축퇴성 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, Pearson 등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 매개변수들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분률 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman (1970) J. Mol. Biol. 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv. Appl. Math. 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 매개변수는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0 의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 기준 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분률의 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 기준 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 매개변수 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2 이상의 서열을 의미하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예컨대, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 평가될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들면, PCR에 의해)증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드)가 표적 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의한 어닐링하는 것을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관내 및 생체내 매개변수, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 시험관내 혼성화에 특히 관련된 매개변수는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격성(stringency)에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 보통 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위하여 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 매개변수들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 상보적인은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분률은 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 이들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 산물에 실질적으로 동일한은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체"는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 지시하기 위하여 본원에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 코딩한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 좌우된다. 일반적으로, 이종간 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립형질"은 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립형질은 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 대상이 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 상이한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA 형태를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생성되는 변이체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형은, 아미노산 서열의 변형과 관련하여 사용시, 폴리펩티드, 또는 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 변형을 묘사하기 위하여 사용되며, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자에게 통상적인 일이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-코딩 지역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.
용어 세포 물질로부터 실질적으로 유리된은 상기 단백질이 그것이 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 세포 물질로부터 실질적으로 유리된은 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질로서 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리된 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 다른 화학물질의 실질적 부재는 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원 (heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위한 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 절편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 지역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 부분은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 서열 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외래 유전자를 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절을 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 분절이 그들의 의도된 목적, 예컨대, 전사가 프로모터의 하류 및 임의의 전사된 서열 하류에서 개시하는 기능을 갖도록 배열되어 있다. 상기 프로모터는 일반적으로 전사기구가 전사를 개시하기 위해 결합하고 코딩 분절을 거쳐 터미네이터까지 진행되는 도메인인 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가(assessing)는 시료 내 존재하는 프로테아제 또는 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 예를 들면 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 보완 단백질의 절단 산물의 검출.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 초래되는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 치료적 효과 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적을 위하여, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드를 가수분해하는 그의 촉매 활성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 동등한은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 코딩하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 변형만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. "동등한"이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예컨대, 2개의 펩티드가 동일한 종류의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 의미한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성의 감소(즉, 하향조절 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 매개변수의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 종류 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합은 2개 이상의 항목 간의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 항목, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 항목의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 개체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 관심 있는 질환 및 장애는 ECM의 성분을 수반하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상을 "치료하는 것"은 대상의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다. 치료는 또한 본원에서 제공되는 변형된 히알루로니다제 및 조성물의 임의의 약제학적 이용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약제학적으로 유효한 작용제는 임의의 치료제 또는 생물활성제, 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상에 투여 후 치료 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 사람을 포함한 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 질병 또는 장애의 증상을 나타내는 인간 대상체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대, 약제학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련할 수 있는 징후의 영구적 또는 일시적인, 지속적 또는 일시적인, 임의의 경감을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량(투여량)"은 치료 효과를 생성하기에 최소한 충분한 양으로 화합물을 포함하는 작용제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다. 따라서, 질병 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료적으로 효과적인 인슐린 용량은 혈당 조절을 달성하기 위하여 요구되거나 충분한 양이다. 이러한 양은 예컨대 글루코스 또는 식사 시험(challenge)에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물은 치료적으로 효과적인 용량이 투여되기 위한 치료적으로 효과적인 양 또는 농도의 인슐린을 포함한다.
본원에 사용된바와 같이, 단위 제형(복용 형태)는 인간 및 동물 대상체에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일 복용 제형은 직접 투여를 위한 제형을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이,"제조품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 동일 또는 별개의 포장 물품 내 포함된 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소 조성물을 포괄하는 의도이다.
본원에 사용된 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트"는 본원에서 제공되는 조성물과, 재구성, 활성화, 전달 기구/장치, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하나 이에 국한되지 않는 목적의 다른 물품의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려된 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 효소는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵 및 진균 유래이다. 대부분 효소들은 포유류 기원을 포함한 동물 기원이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 매개변수로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태로 병게 걸리지 않은 정상적 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다((1972), Biochemistry. 11:1726 참조).
B. 초속효성 인슐린 조성물
본원에서 초속효성 인슐린 조합물 및 조성물이 제공된다. 초속효성 인슐린 조성물은 투여전 또는 투여시 속효성 인슐린과 히알루로난 분해효소를 결합하여 얻어진다. 또한, 속효성 인슐린을 나타내는 동일한 질병 및 상태, 예를 들면 고혈당 및 다른 질병 및 상태를 조절하기 위한 당뇨병을 치료하기 위한 방법 및 초속효성 인슐린 조성물의 용도가 제공된다. 속효성 인슐린(예를 들면, 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린)은 제1 상 식사 인슐린 방출의 내인성 인슐린 급증과 유사한 병상을 적절하게 나타내지 않는다. 속효성 인슐린을 히알루로난 분해효소와 함께 결합함으로써 본원에 기재된 방법, 조성물 및 조합물은 비당뇨병 대상체의 내인성(즉, 천연) 식후 인슐린 방출과 더욱 유사한 병상을 나타내는 초속효성 인슐린 조성물을 제공한다.
1. 인슐린, 당뇨병 및 기존의 속효성 인슐린 요법의 고찰
인슐린은 췌장에 의해 분비된 자연 발생 폴리펩티드 호르몬이다. 인슐린은 혈액으로부터 글루코스를 효과적으로 섭취해서 사용하기 위해 생체의 세포에 의해 필요로 된다. 글루코스는 세포 기능을 수행하기 위한 현저한 에너지 물질이다. 인슐린은 탄수화물의 항상성의 주요한 조절자인 것 이외에, 지방 대사에 영향을 미친다. 간 및 지방 조직의 능력을 변화시켜 다른 조직 중에 지방 축적을 방출한다. 인슐린은 지질의 합성 증가, 지질 분해 감소, 단백질 합성 증가, 핵심 효소 조절 및 글루코스 대사의 진행 (글루코스 섭취 자극, 글루코스 산화 자극, 글리코겐 합성 증가 및 글리코겐 분해 감소를 포함)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 생체를 통한 다양한 약력학적 효과를 갖는다.
인슐린은 기본적으로 1 시간 당 0.5 내지 1.0 유닛 범위에서 분비되지만, 그 수준은 식사후에 증가된다. 식사 후, 췌장은 글루코스의 증가에 따라서 인슐린을 분비한다. 인슐린은 세포내로 글리코스의 섭취를 촉진하고 간에 신호를 보내 글루코스 생성을 감소시키고; 이 결과 혈당이 정상 수준으로 돌아간다. 정상 성인은 식사에 반응하여 2상의 인슐린을 방출한다. 초기 상은 섭취 후 2-15분 내에 발생하는 인슐린 방출의 급증이다. 후기 상의 방출은 약 2 시간 연장된다. 초기 상은 간의 글루코스 생성을 차단하여 혈당 수준을 감소시키고 주변의 조직에 대해 민감하게 하거나 신호를 보내 글루코스 섭취를 증가시키는 역활을 한다. 근육에서 대량의 글루코스는 글리코겐으로 저장된다. 일부의 글리코겐은 락테이트로 분해되고, 간으로 순환되고 글루코스로 변환되어 글리코겐으로 저장된다. 식사 사이에 간은 상기 글리코겐을 분해하고 저장하여 뇌 및 다른 조직으로 글루코스를 제공한다.
당뇨병은 적절한 양의 인슐린을 생성하는 췌장 능력이 불능 또는 저하에 기인하거나 필요한 인슐린을 합성 및/또는 방출하는 세포의 능력의 불능 또는 저하에 기인한 만성적 고혈당을 일으킨다. 당뇨병에 있어서, 상술한 제1 상 반응의 효율성이 감소하거나 없어져 식후 글루코스의 수준이 증가한다. 예를 들면, 식후 4시간 (섭취 후 처음 4시간) 동안 곡선하 혈당 면적(AUC)은 비당뇨병의 영역에서 보다 당뇨병에서 2.5 내지 3.0배 더 크다. 식후 글루코스 변동은 전체의 고혈당 및 HbAlc 수준의 증가에 기여하고 이러한 변동은 2형 당뇨병의 초기 단계에서 보여지는 HbAlc 증가에 주요한 공헌자이다.
많은 당뇨병 환자들은 췌장이 부적절한 양의 인슐린을 생성하거나 적절한 혈당 조절을 유지하는데 췌장이 생성한 인슐린을 사용할 수 없을 때에 인슐린으로 치료될 필요가 있다. 예를 들면 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병을 포함하는 당뇨병을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 인슐린을 투여하여 정상인에게 발생하는 내인성 인슐린 반응과 유사한 병상을 나타내도록 하였다. 인슐린은 고혈당의 중증환자에게 투여되어 혈당 수준을 조절한다. 다른 인슐린원은 필요한 환자에 따라 사용된다. 시판되는 인슐린 제제는 활성의 지속시간에 따라 분류될 수 있다(예를 들면, DeFelippis 등 (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 예를 들면, 인슐린은 속효성 제형 뿐만 아니라 중간형 또는 지속형 제형으로 제공되고, 후자의 2개의 분류는 기초-작용 인슐린으로서 본원에 참조된다. 속효성 형태는 빠른 개시를 갖고 일반적으로 2-3 시간 이하, 및 4시간 이하에 피크 인슐린 수준을 나타낸다. 따라서, 인슐린의 속효성 형태는 식사 글루코스 조절에서 사용된다. 다른 인슐린의 형태는 피하 투여 후 대략 4-12 시간에 피크 인슐린 농도에 도달하는 중간형, 비교적 완만한 피크에 도달하고 20-30 시간의 최대 작용 지속시간을 갖는 지속형 인슐린을 포함한다. 중간형 및 지속형 형태는 종종 무정형 및/또는 결정성 인슐린 제제로 이루어지고 기초 요법에서 주로 사용된다.
속효성 인슐린 조성물의 식사 투여의 목표는 식사 전, 식사 도중, 식사 직후에 속효성 인슐린의 식사 투여에 의해 시간 경과에 따라 안정한 혈당 수준을 달성하는 것이다. 이와 같이, 인슐린의 혈당수준이 일시적으로 증가되어 (a) 간의 글루코스 생성을 저지하고 (b) 글루코스 섭취를 증가시키므로; 음식물 섭취와 연관된 혈당 상승 중 혈당 조절을 유지한다.
재조합 인간 인슐린 (예를 들면, 휴뮤린(Humuline)® R 인슐린)은 식사 시간전 주사에 의한 자가 투여를 위해 사용된다. 유감스럽게도 혈당상승이 외인성 인슐린 수준에 의해 상반해서 발생하지 않는 것을 보장하기 위해, 재조합 인간 인슐린은 식사시간 약 30분 이상 전에 주사에 의해 투여될 필요가 있다. 재조합 인간 인슐린의 느린 흡수 이유 중 하나는 생체내 및 시험관내에서 아연 이온의 존재에 의해 인슐린이 6량체 착체를 형성하기 때문이다. 이러한 6량체 아연 함유 착체는 아연을 결여한 단량체 인슐린 보다 안정하다. 피하 주사시에 이들 인슐린 6량체는 모세혈관계를 통해 흡수되어 전신 순환되기 전에 더 작은 2량체 또는 단량체로 해리될 필요가 있다. 6량체의 2량체 및 단량체로의 해리는 농도에 의존하고 인슐린이 주사 부위로부터 확산됨에 따라 더 낮은 농도에서만 발생한다. 따라서, 국부의 인슐린 디폿은 인슐린의 피하 투여 후의 주사 부위에 존재하고 인슐린 농도가 감소될 때까지 흡수될 수 없는 주사 부위에 초기의 높은 농도의 6량체 인슐린을 제공한다(Soeborg 등, (2009) Eur.J.Pharm. Sci. 36:78-90). 인슐린은 주사 위치로부터 느리게 확산하기 때문에 인슐린 농도는 주사위치로부터 거리가 증가할수록 낮아지고 6량체의 해리 및 인슐린 단량체 및 2량체의 흡수를 일으킨다. 따라서, 6량체 인슐린 착체의 분산이 생체에서 자연적으로 발생하지만, 발생하는데 몇시간 걸려서 인슐린의 전신 이용성을 지연시킨다. 또한, 농도-의존 흡수 때문에, 인슐린 농도가 더 높고 투여량이 더 많아지면 더 느리게 흡수된다(Soeborg 등, (2009) Eur.J.Pharm. Sci. 36:78-90).
단량체 형태의 인슐린이 더 빠르게 흡수되기 때문에, 6량체 상태의 인슐린이 더 안정하지만, 피하 투여시 6량체로부터 단량체로의 더 빠른 해리를 나타내는 인슐린의 속효성 유사체 형태가 개발되어 왔다. 이러한 인슐린은 예를 들면 아미노산 변경에 의해 변형되어 해리율을 증가시키고 주사시에 급속한 약력학 활성을 부여한다. 섹션 C에 기재된 바와 같이, 인슐린의 속효성 유사체 형태는 인슐린 글루리신, 인슐린 아스파르트, 및 인슐린 리스프로를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
속효성 유사체를 포함하는 인슐린의 속효성 형태는 흡수 및 작용의 지연을 가지므로 식후 약10분에 발생하는 초기 상을 갖는 내인성 인슐린과 유사하지 않다. 따라서, 이러한 제형은 인슐린의 제1 상이 방출한 직후에 발생하는 간의 글루코스 생성을 충분히 빨리 저지하지 못한다. 이러한 이유로, 원하는 혈당 조절을 달성하기 위해, 속효성 인슐린 유사체 제제조차 식사전에 제공될 필요가 있다. 레귤러 인슐린에 필요한 30-60분 이내 보다 15분 이내에 섭취 시간을 측정하는 것이 쉽지만, 환자가 너무 빨리 섭취하거나 너무 늦게 섭취해서 양호한 혈당 조절을 제공할 수 없을 우려가 있다.
또한, 속효성 인슐린 요법을 포함한 임의의 인슐린 요법으로의 치료에서 주요한 부작용 중 하나는 저혈당이다. 저혈당은 낮은 혈당으로 정의되고 배고픔으로부터 떨림, 발한, 착란 또는 발작, 혼수상태 및 사망과 같은 더욱 심각한 증상까지의 범위에 이르는 다양한 증상에 연관된다. 저혈당은 충분한 음식 섭취 실패, 식사 거르기, 보통 이상의 운동 또는 너무 많은 인슐린 섭취, 또는 부적절하게 장기간의 지속시간의 노출 및 작용을 갖는 식사 인슐린 제제의 사용에 의해 발생할 수 있다. 예를 들면, 많은 속효성 인슐린 요법은 식사전에 행해질 필요가 있기 때문에 환자가 식사를 미루거나 걸러 저혈당을 일으킬 우려가 있다. 또한, 속효성 인슐린의 투여시에 혈청 인슐린 수준 및 인슐린 작용(예를 들면, 글루코스 주입율(GIR)로서 측정된)은 일반적으로 식사 글루코스 부하를 약하게 한 후 증가된 채로 유지되어 저혈당을 위협받는다. 인슐린의 투여량을 증가시켜 조절 피크 글루코스 부하를 더 양호하게 하려는 시도가 이 위험을 더욱 증가시킨다. 또한, 식후 저혈당은 인슐린 요법의 일반적인 결과이기 때문에, 이는 종종 환자가 식사 사이에 스낵류를 섭취할 것을 야기하거나 필요로 한다. 이것은 인슐린 요법에 연관된 체중증가 및 비만에 기여한다.
2. 초속효성 인슐린 조성물의 약력학 및 약동학
속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 결합은 속효성 인슐린의 흡수를 증가시켜 혈청 인슐린 농도를 (즉, 더 빠른 흡수속도) 및 약리학적인 작용의 더 빠른 상승을 초래한다. 따라서, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 결합은 비경구 (즉, 비정맥내) 1회 투여, 예를 들면, 피하(SC), 근육내(IM), 복강내(IP) 또는 피부내(ID) 투여 경로를 통한 비경구 투여 후 혈당의 신속한 상승을 달성할 수 있는 초속효성 인슐린 조성물을 제공한다.
어떠한 이론에 구속되지 않지만, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 조합물은 피하 투여 후 분산 메카니즘의 변화 때문에 인슐린만 투여하는 경우에 비해 속효성 인슐린의 흡수를 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 고분자량 히알루로난의 존재는 인슐린만을 피하 투여한 후 벌크 유체의 흐름에 장벽을 제공한다. 따라서, 상기 논의된 바와 같이, 인슐린은 확산 매개 메카니즘에 의해 주사 부위로부터 분산된다. 주사 부위로부터 인슐린이 분산하면 농도가 감소하고 인슐린 6량체의 모세혈관계로 흡수되기에 충분히 작은 단량체 및 2량체로 해리가 용이해진다 . 따라서, 인슐린이 피하주사후 흡수되기 위해 인슐린은 최초 주사 부위로부터 느리게 분산되어 충분히 낮은 인슐린 농도로 만들어 해리 및 따라서 흡수를 용이하게 한다. 그러나, 인슐린이 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히아루로니다제와 공동-투여되면 히알루로난은 히알루로난 분해효소에 의해 분해되고 벌크 유체의 흐름을 가능하게 하고 압력 구배(또는 유압전도도)에 비례하여 빠르게 분산된다. 생리적인 압력에서 예를 들면 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 rHuPH20은 유압전도도의 대략 20배 증가를 발생시킨다. 따라서, 인슐린이 히알루로난 분해효소와 공동-투여되면, 히알루로난 장벽의 분해 후 환류 매개 방법으로 인슐린이 빠르게 분산된다. 인슐린이 히알루로난 분해효소와 피하로 공동-투여될 때의 이러한 인슐린의 신속한 흡수는 인슐린만 투여된 경우에 비해 인슐린의 약력학 및 약동학 특성들을 향상시킬 수 있다.
예를 들면, 본원에 제공된 바와 같이, 초속효성 인슐린 조성물은 tmax의 감소 및 Cmax의 증가 및 처음 40분에 걸쳐 특히 현저한 누적 전신 인슐린 노출에 의해 입증된 바와 같이 더 빠르게 흡수된다. 이러한 향상된 약동학 프로파일은 인슐린 영향의 개시 및 지속시간을 단축하는데에 반영된다. 이것은 실시예 1에 기재된 바와 같은 정상혈당 클램프 실험에서 글루코스 주입속도에 의한 약력학 측정을 들 수 있다. 따라서, 초속효성 인슐린 조성물은 상응하는 속효성 인슐린 보다 빠르게 흡수된다. 흥미롭게도, 도1 및 도2에 기재된 바와 같이, 속효성 인슐린 유사체가 히알루로난 분해효소가 없는 속효성 레귤러 인슐린 보다 빠르더라도 실질적으로 히알루로난 분해효소를 함유한 초속효성 인슐린 조성물은, 속효성 레귤러 인슐린 및 속효성 인슐린 유사체의 흡수를 촉진해서 유사한 약력학(PD) 및 약동학(PK) 프로파일을 제공한다. 따라서, 초속효성 인슐린 조성물은 속효성 인슐린 유사체 또는 속효성 레귤러 인슐린이 조성물에 포함되는지의 여부에 관계없이 유사한 약력학(PD) 및 약동학(PK) 프로파일을 나타낸다. 유사성은 투여 후 처음 40분 내지 60분에 특히 급증한다(예를 들면 도1 및 2 참조). 따라서, 초속효성 인슐린 조성물의 추가적인 이점은 속효성 인슐린이 속효성 레귤러 인슐린(예를 들면 휴뮤린® 인슐린) 또는 속효성 유사체(예를 들면 휴마로그® 인슐린 리스프로, 노바로그® 인슐린 아스파르트 또는 아피드라® 인슐린 글루리신)인지 여부에 관계없이 투여 후 처음 40분 내지 60분에 동등한 약동학 및 약력학 프로파일을 달성하는 능력이 있다. 초속효성 인슐린 조성물 중에 속효성 인슐린이 레귤러 인슐린에 비해 신속한 작용의 인슐린 유사체인 일부 예에서, 히알루로난 분해효소와 함께 투여될 때의 속효성 인슐린(즉, 초속효성 인슐린 조성물)의 흡수는 속효성 인슐린 단독의 최대 속도 보다 더 빠르다. 이것은 감소된 tmax 및 증가된 누적 전신 인슐린 노출로서 특히 처음 40분에 걸쳐 나타낼 수 있다.
초속효성 인슐린 조성물의 약동학는 여러 중요한 점에서 상응하는 속효성 인슐린과 다르다. 우선, 시간의 함수로서 인슐린 혈액 농도의 프로파일은 더 빠른 시간에 더 높은 농도 중의 하나로 이동된다(예를 들면, 도 1 참조). 인슐린이 전신 순환에 발현율은 흡수율로서 기재되어 있고, 전신 순환으로부터 제거율과 구분하고, 이것은 제거율로서 기재되어 있다. 초속효성 인슐린 조성물은 더 큰 흡수 율을 갖고, 상응하는 속효성 인슐린 보다 더 빠른 노출을 제공한다. 더욱이, 히알루로난 분해효소가 투여 부위에서 일시적으로 및 국부적으로 작용하기 때문에 전신순환에서 초속효성 인슐린 조성물의 제거율 및 그 효능은 상응하는 속효성 인슐린과 크게 다르지 않다. 동일한 제거율을 유지하면서 흡수율을 증가시키면, 인슐린의 최대 혈액농도(Cmax)는 상응하는 속효성 인슐린에 비하여 초속효성 인슐린 조성물에 대해서 증가된다. 따라서, 전신 이용가능한 인슐린의 동일한 총량은 초속효성 인슐린 조성물의 비경구 투여 후, 단지 속효성인 인슐린에 비해, 더 큰 분율의 누적 전신의 인슐린 노출 분율은 더 이른 시점에 걸쳐 발생하고 의 더 작은 분율의 누적 전신 인슐린 노출은 더 늦은 시점에 걸쳐 발생하도록, 상응하는 속효성 인슐에 비하여 초속효성 인슐린 조성물에 대한 시간의 함수로서 다르게 분포되어 있다. 흡수율에서의 이동은 초속효성 인슐린 조성물이 음식물 소비 후 발생하는 혈당 수준의 급증에 대한 생체의 내인성 인슐린 반응과 더 유사한 병상을 나타내는 것을 가능하게 한다.
제2 및 독립적인 약동학 매개변수, 전신 순환에 도달하는 투여량 분율이 또한 상응하는 속효성 인슐린에 대해 초속효성 인슐린 조성물과 다를 수 있다. 특정 속효성 인슐린에 대해, 상당한 투여량이 전신으로 생체 이용가능하므로 상응하는 초속효성 조성물에 대해 서서히 증가될 수 있다. 그러나, 레귤러 인슐린(예를 들면 휴마린® R 인슐린)과 같은 다른 속효성 인슐린에 대해, 생체 이용률의 증가가 현저하다. 상응하는 속효성 인슐린에 대해 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물의 상대적인 생체이용률은 동일한 비IV 비경구 투여 후 2개의 조성물의 총 전신 노출(AUC0-infinity)의 비율에 의해 기재된다.
초속효성 인슐린 조성물의 추가의 중요한 양상은 전신에 이용가능한 인슐린에 대한 생리적인 반응을 측정하는 약력한 매개변수에서 개량을 달성하기 위한 능력에 관련된다. 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 상응하는 속효성 인슐린으로서 전신 순환에 도달할 때 동일한 약리학적인 효능을 갖기 때문에, 초속효성 인슐린 조성물(상기 기재된)에 의해 제공된 향상된 약동학 프로파일은 전신에 이용가능한 인슐린에 대한 생리학적 반응을 측정하는 약력학 매개변수의 이로운 변화를 제공한다. 예를 들면, 인슐린이 정상혈당 클램프 절차에서 대상체에 투여될 때 측정된 글루코스 주입율(GIR)은 정상적 목표 혈당농도를 유지하는데 필요한 시간의 함수로서 정맥내 글루코스 투여의 속도를 측정할 때 약력학 매개변수를 나타낸다. 상응하는 속효성 인슐린과 비교하여 초속효성 인슐린 조성물에 의해 달성된 더 큰 흡수율의 약동학의 이점에 의해, 초속효성 인슐린 조성물은 더 큰 시간에 더 큰 주입율(즉 더 큰 생리학적 반응)를 향해 GIR 프로파일(인슐린에 대한 생릭학적 반응의 측정)을 이동시킬 수 있다. 상기 초속효성 인슐린 조성물에 대해 상대적 전신 생체이용률의 유의미한 증가가 또한 있는 경우, 총 GIR은 전신 투여량 및 시간의 함수로서 인슐린 수준의 분포의 함수이지만, GIR 반응의 추가의 증가가 관찰될 수 있다.
본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물에 의해 제공된 약동학 및 약력학적 이점은 많은 중요한 용도를 제공한다. 우선, PK 및 PD 반응을 더 이른 시간으로 이동함으로써, 상응하는 속효성 인슐린 조성물만으로 가능한 것보다 초속효성 조성물에 대한 자연 인슐린 반응이 더욱 생성되어 식후 글루코스 수준을 조절할 수 있다. 생체의 자연 인슐린 반응은 (a) 간의 글루코스 방출 저지 신호를 보내고 식사 사이의 최소의 글루코스 혈액 농도를 제공하는 처음 10분-15분내에 인슐린의 초기 방출, 및 (b) 장관이 영양소의 존재에 감지한 경우 인슐린 분비를 촉진하는 전신 대사산물 (주로 글루코스) 수준 및 인크레틴 호르몬에 대한 베타 세포 반응을 포함하는 호르몬 반응의 복합 상호작용을 통해 글루코스 수준의 함수로서 전신 순환내에 인슐린 방출을 조절함으로써 음식물의 탄수화물 조성물에 어울리는 약 2 시간에 걸친 총인슐린의 노출 모두를 포함한다. 처음 10-15분에 걸쳐 발생하는 전신 이용가능한 인슐린 노출의 더 큰 분율을 가짐으로써, 초속효성 조성물은 상응하는 속효성 인슐린 조성물에 비해 간의 글루코스 방출(생체의 내인성 식사 인슐린 반응과 유사)의 저지 신호를 더 양호하게 보낼 수 있다. 또한, 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 처음 2시간에 걸쳐 전신으로 이용가능한 인슐린 노출의 더 큰 분율 및 2시간 후 인슐린 노출에 상응하는 저감을 가짐으로써 식후 글루코스의 자연 조절과 유사한 병상을 더 양호하게 나타낼 수 있다. 투여 2 시간 초과 후 발생하는 인슐린 수준의 증가는 식후 글루코스 흡수가 완전한 때, 저혈당 수준 또는 저혈당을 야기하는 상황인 글루코스 대사 증가를 초래할 수 있다. 또한, 초속효성 인슐린 조성물은 자연 인슐린 반응과 유사한 작용의 개시 갖기 때문에 이들 조성물은 식사시간에 투여될 수 있는 반면, 많은 속효성 인슐린 조성물(예를 들면, 휴뮤린® R 인슐린)은 식사 30-60분 전에 투여되며 이는 대상체가 계획된 식사를 지연시키거나 건너뛰면 저혈당의 위험이 있다. 따라서, 처음 15분에 걸쳐 인슐린 노출 증가 및 2시간 후 인슐린 노출 감소의 조합을 통해, 초속효성 인슐린 조성물은 상응하는 속효성 인슐린 조성물보다 식사후 글루코스 수준을 더 양호하게 조절할 수 있다.
속효성 인슐린은 일반적으로 실제의 글루코스 수준, 대상체, 당뇨병의 형태 및 음식물의 조성을 포함한 많은 요소에 따라서 의사 또는 다른 자격을 갖춘 건강관리 담당자에 의해 결정된 넓은 범위의 투여량으로 투여된다. 일반적으로, 이러한 속효성 인슐린의 투여량은 0.05 유닛/kg 내지 2 유닛/kg의 범위에 존재한다. 약동학 및 약력학에 의해 초속효성 인슐린 조성물은 히알루로난 분해효소 없이 투여된 속효성 인슐린에 비해 더 적은 투여량으로 투여될 수 있다. 속효성 인슐린의 양이 초속효성 인슐린 조성물로서 그것을 투여함으로써 저하될 수 있는 정도는 환자의 당뇨병 형태에 따라 변화된다. 일반적으로, 초속효성 인슐린 조성물로서 투여될 때 2형 당뇨병 환자에 투여되는 속효성 인슐린의 양의 감소는 초속효성 인슐린 조성물로서 투여될 때 1형 당뇨병 환자에 투여되는 속효성 인슐린 양의 감소 보다 크다. 예를 들면, 1형 당뇨병 환자 및 2형 당뇨병 환자에게 각각 속효성 인슐린 0.20 U/kg을 투여하여 식후 글루코스 수준을 조절하는 예에서, 1형 당뇨병 환자에게 초속효성 인슐린 조성물 중 0.15 U/kg의 속효성 인슐린을 투여하여 동일한 또는 더 양호한 혈당 조절을 달성하고, 2형 당뇨병 환자에게 초속효성 인슐린 조성물 중 0.10 U/kg의 속효성 인슐린을 투여하여 동일한 또는 더 양호한 혈당 조절을 달성할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 혈당 조절을 달성하기 위해 2형 당뇨병 환자에게 투여되는 속효성 인슐린의 양은 히알루로난 분해효소 없이 투여될 때에 혈당조절에 필요한 양에 비해 초속효성 인슐린 조성물로서 히알루로난 분해효소와 함께 투여될 때 예를 들면 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 그 이상 까지 감소될 수 있고, 혈당조절을 달성하기 위해 1형 당뇨병 환자에게 투여되는 속효성 인슐린의 양은 히알루로난 분해효소 없이 투여되는 경우의 혈당 조절에 필요한 양에 비해 초속효성 인슐린 조성물로서 히알루로난 분해효소와 함께 투여될 때 예를 들면 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 그 이상까지 감소될 수 있다.
어떠한 이론에 구속되지 않지만, 인슐린이 초속효성 인슐린 조성물로서 히알루로난 분해효소와 함께 투여될 때 1형 당뇨병 환자에 비해 2형 당뇨병 환자에 대한 속효성 인슐린 투여량의 더 큰 감소는 1형 및 2형 환자의 다른 식후 혈당 프로파일의 반영이고 건강한 대상체내에 제 1 상의 자연 인슐린 방출과 더욱 가깝게 유사한 병상을 나타내는 초속효성 인슐린의 능력이다. 2형 당뇨병은 손상된 β 세포 기능, 인슐린 저항성 및/또는 손상된 인슐린 분비의 결과로서 진행한다. 이들 환자는 글루코스 농도 검사, 예를 들면 식사의 수분 내에 발생하는 초기 상의 인슐린 방출이 결여되지만 시간 경과에 따라서 인슐린이 서서히 방출된다. 반면에, 1형 당뇨병 환자는 어떤 인슐린도 생성되지 않고, 따라서, 제1 및 제2 상의 인슐린 방출 모두가 결여되고, 후자는 건강한 대상체에서 혈당조절을 달성할 때까지 유지되는 것이다. 따라서, 2형 당뇨병은 일반적으로 식후 고혈당을 치료하기 위해 주로 인슐린 요법만을 필요로 하기 때문에, 이러한 당뇨병의 식사 인슐린 요법에서 극복해야 할 문제는 저혈당의 발생이다. 대상체의 자신의 지연 및/또는 기초 인슐린 분비가 식사 급증이 경감된 후 남아있는 과잉의 외인성 인슐린의 글루코스 저하 효과와 함께 결합되면 저혈당이 발생된다. 시간 경과에 따라, 이러한 식후 저혈당 에피소드의 반복적인 발생은 체증 증가 및 비만에 기여한다. 속효성 인슐린의 약동학 및 약력학은 음식물 소화 직후 글루코스 수준을 충분히 빨리 저하시키기 위해 혈액내에 인슐린의 적당한 농도를 달성할 필요가 있는 투여량(즉, 자연적인 초기 상의 인슐린 방출을 보상하는 투여량)은 소화 후 혈액내에 과잉의 인슐린 순환 및 식사 후 글루코스 수준의 저하시키는 것이다. 따라서, 2형 당뇨병 환자는 초기 상의 인슐린의 방출 이상을 보상하는 인슐린 투여량을 수용한다. 본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물은 내인성 인슐린 반응과 더욱 가깝게 유사한 병상을 나타낸다. 따라서, 2형 당뇨병은 제 1 상의 인슐린의 방출만을 커버하는 투여량으로 초속효성 인슐린 조성물을 투여하는 반면, 1형 당뇨병은 모든 상의 인슐린 방출을 보상하는 투여량으로 초속효성 인슐린 조성물을 투여할 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물의 다른 용도는 속효성 인슐린 요법에 연관된 체중 증가와 비만의 부작용을 감소시키는 것이다. 부작용의 정도는 약 또는 인슐린의 투여량에 비례한다. 상술한 바와 같이, 초속효성 인슐린 조성물은 예를 들면 투여후 처음 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 또는 2시간에 걸쳐 누적 전신의 인슐린 노출의 더 큰 분율 및 더 큰 생체이용률의 조합을 통해 상응하는 속효성 조성물로서의 속효성 인슐린의 더 작은 투여량으로 동등한 혈당조절을 제공할 수 있다. 1형 및 2형 당뇨병 환자는 인슐린 요법의 결과로서 체증 증가를 경험할 수 있고, 2형 당뇨병 환자는 특히 체중증가의 위험이 있어서 비만이 발생할 수 있다. 2형 당뇨병은 제1 상 인슐린 방출이 결여되지만, 여전히 시간 경과에 따라서 서서히 인슐린을 방출한다. 그 결과, 질병의 초기단계에서 2형 당뇨병의 내인성 인슐린 수준은 식사 초기에는 너무 낮고 음식물 소화 후에는 너무 높다. 제 1 상 인슐린 방출 없이, 간은 글루코스 만드는 것을 멈추기 위한 신호를 받지 않는다. 간은 생체가 음식물 소화를 거쳐 새로운 글루코스를 생성하기 시작할 때에 계속해서 글루코스를 생산하여 고혈당을 일으킨다. 식사 후 2-3 시간 사이에 치료되지 않는 당뇨병의 혈당은 너무 상승되어 췌장은 다량의 인슐린을 분비하라는 신호를 받는다. 초기 2형 당뇨병 환자에서, 여전히 췌장이 반응하여 다량의 인슐린을 분비한다. 이것은 소화가 거의 끝나서 혈당이 수준이 떨어지기 시작하여야 때 발생한다. 다량의 인슐린은 2개의 유해한 효과를 갖는다. 첫째, 이미 장애가 발생된 췌장에 과도한 요구가 있어, 급속히 악화되고 결국, 췌장에서 인슐린을 생성할 수 없다. 둘째, 소화 후 너무 많은 인슐린이 체중 증가에 기여하여 질병 상태를 더욱 악화시킨다. 2형 당뇨병 환자에게 속효성 인슐린을 투여하여 상기 논의된 바와 같이 식후 고혈당을 조절할 때, 소화 후 과잉의 인슐린이 존재할 수 있다. 따라서, 인슐린 요법을 받는 2형 당뇨병 환자는 소화 후 너무 많은 인슐린을 갖고, 저혈당 및 체중증가를 일으킬 수 있다. 식후 고혈당을 조절하기 위해 본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물의 투여가 당뇨병 환자에게 체중 증가 및 비만의 위험을 줄인다. 초속효성 인슐린 조성물은 속효성 인슐린의 낮은 투여량을 함유할 수 있다.
혈당 조절을 달성하기 위해, 초속효성 인슐린 조성물 중 속효성 인슐린은 히알루로난 분해효소가 존재하지 않으면 속효성 인슐린이 투여되어야 하는 수준의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 초속효성 조성물내에 투여되는 속효성 인슐린의 양은 일반적으로 또는 약 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 1.0 U/kg, 1.1 U/kg, 1.2 U/kg, 1.3 U/kg, 1.4 U/kg, 1.5 U/kg, 1.6 U/kg, 1.7 U/kg, 1.8 U/kg, 1.9 U/kg, 또는 2.0 U/kg이다. 더 적은 투여량에 의해, 이러한 인슐린의 작용 지속시간이 단축되어 수 시간에 걸쳐서 연장된 상승된 혈장의 인슐린 농도 때문에 발생하는 늦은 저혈당의 잠재성을 최소화한다. 따라서, 초속효성 인슐린 조성물의 작용의 더 빠른 개시는, 제1 상 식사 인슐린 방출의 내인성 인슐린의 급증과 더욱 가깝게 유사한 병상을 나타내고 당뇨병 환자에게 양호한 혈당 조절 및 더 적은 체중 증가와 관련한 임상적 이점을 제공할 것으로 기대된다.
또한, 흡수율의 증가를 제공함으로써, 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 상응하는 속효성 인슐린 조성물 보다 투여된 인슐린의 효과 및 관찰된 글루코스 수준의 효과 사이에 더 짧은 피드백 사이클을 제공할 수 있고, 따라서, 식사 후 글로코스 수준의 자연 조절과 더욱 유사한 병상을 나타낼 수 있다. 따라서, 초속효성 인슐린 조성물의 변형된 약동학는 기존의 '인슐린 펌프'의 성능 및 연속된 글루코스 모니터링 (GCM) 기법에 이점을 제공한다. 식사후 인슐린 1회 주사 및 전신 혈당 반응 사이의 시간을 줄임으로써, GCM과 인슐린의 반복된 더 작은 피하 주사로부터 글루코스 수준의 더 엄격한 조절이 결합된 인슐린 펌프/글루코스 모니터링 장치의 "루프를 닫는다"할 수 있다(즉, 폐루프시스템 또는 인공췌장).
초속효성 인슐린 조성물이 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 단일 혼합물 또는 별도의 제제로서 제공되는 여부에 따라서 원하는 물리적 또는 화학적 특성을 제공하기 위한 부가적 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 용액은 하나 이상의 등장화제를 함유하여 대략 등장용액 및 중성 pH까지 산 또는 염기로, 가능하게는 pH완충성분으로 적정된 수성 용매를 제공한다. 속효성 인슐린 제형은 Zn 및 페놀성 항균 보존제, 예를 들면 m-크레솔을 포함하여 이들을 더 안정한 6량체 상태로 구조적으로 안정화시킨다. 금속 킬레이트제, 예를 들면 EDTA를 사용하여 이들 6량체의 해리율을 조절하고 다른 2가의 금속, 예를 들면 칼슘이 존재하여 킬레이트 용량을 완충한다. 히알루로난 분해효소는 물리적 및 화학적 안정성을 제공하기 위해 추가의 성분을 필요로 하고, 추가의 성분은 계면활성제, 탈산소제, 염, 아미노산 및 폴리알콜을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
초속효성 인슐린 조성물은 순차(임의의 순서로) 또는 동시 공동-투여를 위한 2개의 별개의 용기, 속효성 인슐린 조성물을 함유하는 것과 히알루로난 분해효소 조성물을 함유하는 것의 키트; 또는 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소조성물의 혼합물을 함유하는 하나의 용기를 함유하는 키트로서 제공될 수 있다. 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소가 공동-투여되면, 상기 공동-투여는 임의의 순서로 순차적으로 될 수 있고(예를 들면, 히알루로난 분해효소는 속효성 인슐린 투여 전에 투여됨으로써 히알루로난 분해효소는 속효성 인슐린을 투여하기 전에 주사 부위에서 히알루로난을 분해한다); 또는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 공동-투여는 동시에 투여된다. 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해효소 조성물은 주사가능한 용액 또는 주사가능한 현탁액으로서 적당한 희석액으로 재구성한 후 주사용 고형분으로서 (함께 또는 별개로) 제형화될 수 있다.
하기의 부분은 본원에 제공된 초속효성 인슐린 조성물에 사용되는 예시의 속효성 인슐린 및 가용성 히알루로난 분해효소, 그 제조방법 및 이를 사용하여 현재의 속효성 인슐린이 사용되는 질병 및 상태를 치료하는 방법이 기재되어 있다.
C. 인슐린 폴리펩티드 및 제형
인슐린은 5808 달톤의 분자량을 갖는 51 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드이다. 인슐린은 췌장에 랑게르한스의 베타 세포 섬에서 생성된다. 예시의 인간 인슐린은 110 아미노산 전구체 폴리펩티드, ER에 대한 24 아미노산 신호 펩티드를 함유하는 프레프로인슐린(서열번호 101)으로 번역되고, 상기 신호 서열이 절단되어 프로인슐린(서열번호 102)을 생성한다. 프로인슐린 분자는 프로호르몬 전환효소 (PC1 및 PC2)로서 알려진 단백질 분해효소의 작용 및 엑소프로테아제 카르복시펩티다제 E의 작용에 의해 성숙한 인슐린으로 전환된다. 이는 4 개의 염기성 아미노산 잔기 및 잔여 31 아미노산 C-펩티드 또는 연결 사슬(서열 번호 101에 기재된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 57 내지 87에 상응)을 제거를 초래한다. 생성된 인슐린은 21 아미노산 A-사슬(서열번호 102에 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 90 내지 110에 상응) 및 30 아미노산 B-사슬(서열번호 102에 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 30에 상응)을 함유하고 이것은 이황화 결합에 의해 가교된다. 일반적으로 성숙 인슐린은 3개의 이황화 가교:A-사슬의 7 위치와 B-사슬의 7 위치 사이의 하나 가교, A-사슬의 20 위치와 B-사슬의 19 위치 사이의 두번째 가교, 및 A-사슬의 6 및 11 위치 사이의 세번째 가교를 포함한다. 성숙한 인슐린의 A-사슬의 서열은 서열번호 103에 기재되고 B 사슬의 서열은 서열번호 104호 기재되어 있다.
인슐린이 글루코스 섭취 및 저장 증가 및/또는 내인성 글루코스 생성 감소를 일으키는 시그널링 캐스케이드를 개시하는 인간 인슐린 수용체에 결합하는 것이면, 인슐린에 대한 언급은 하나의 사슬 또는 2개의 사슬 형태 및 활성을 갖는 말단절단된 형태의 프레프로인슐린, 프로인슐린 및 인슐린 폴리펩티드를 포함하고 대립형질 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 변이체 및 다른 변이체, 예를 들면 서열번호 101에 기재된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체 또는 다른 유도된 형태, 또는 그 성숙한 형태를 포함한다 . 예를 들면, 인슐린은 그 종 변이체를 포함한다. 이들은 소(서열번호 133) 및 돼지(서열번호 123)로부터 유도된 인슐린을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 소 인슐린은 A-사슬의 아미노산 8 및 10 및 B-사슬의 아미노산 30에서 인간 인슐린과 다르다. 돼지 인슐린은 소의 서열과 같이 트레오닌 대신에 알라닌 치환이 있는 B-사슬내에서 아미노산 30에서 인간 인슐린과 다르다. 다른 예시의 인슐린의 종 변이체는 서열번호 105-146에 기재된다. 또한, 인슐린 변이체 중에서 서열번호 103 및 104(A 및 B-사슬)에 기재된 인간 인슐린과 비교해서 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 인슐린 유사체가 포함된다. 속효성 및 지효성 유사체 형태를 포함하는 예시의 인슐린 유사체(A 및 B-사슬)는 서열번호 147-165 및 182-184에 기재된다. 예를 들면, 인슐린 유사체는 글루리신(LysB3, GluB29; 서열번호 103 (A-사슬) 및 서열 번호 149 (B-사슬)에 기재), HMR-l 153 (LysB3, IleB28; 서열번호 103 (A-사슬) 및 서열번호 182 (B-사슬)에 기재), HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32; 서열번호 183 (A-사슬) 및 서열번호 184 (B-사슬)에 기재), 인슐린 아스파르트 (AspB28; 서열번호 103 (A-사슬) 및 서열번호 147 (B-사슬)에 기재), 및 인슐린 리스프로 (LysB28, ProB29; 서열번호 103 (A-사슬) 및 서열번호 148 (B-사슬)에 기재)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 상기 모든 예에서, 유사체의 명명법은 사슬의 N-말단으로부터 번호를 매긴 인슐린의 A 또는 B-사슬의 특정 위치에서 아미노산 치환의 설명에 기초하고 서열의 나머지는 천연 인간 인슐린의 것이다.
임의의 상기 인슐린 폴리펩티드는 임의의 종, 예를 들면 인간 유래 췌장에 의해 생성된 것을 포함하고 합성적으로 또는 재조합 기술을 사용하여 생성된 인슐린을 또한 포함한다. 예를 들면, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 인슐린은 인슐린의 A 및 B-사슬에 대한 합성 유전자를 발현하고, 전체의 프로인슐린을 발현하고 이것을 적당한 효소 방법 및 화학적 방법에 노출하여 성숙한 인슐린을 생성하거나 결합 펩티드에 의해 결합된 A 및 B-사슬을 발현함으로써 생합성적으로 생성될 수 있다 (DeFelippis 등 (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조).
인슐린은 단량체 및 올리고머 형태, 예를 들면 6량체 형태를 포함한다. 인슐린이 혈장에서 순환될 때 단량체로서 존재할 수 있고, 또한 단량체의 형태인 동안에 수용체와 결합한다. 그러나, 인슐린은 2량체로 자기연합될 가능성이 있고, 금속 이온, 예를 들면 Zn2 +의 존재하에서 더 고차 구조, 예를 들면 6 량체로 쉽게 연합한다. 다른 약한 아연 결합 부위가 보고되고 있지만 Zn2 +에 대한 2개의 대칭적인 높은 친화성 결합부위가 있다 (DeFelippis 등. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 자기-연합은 화학적 분해 및 물리적 변성을 방지하기 위한 분자의 안정성을 위하여 중요하다. 따라서, 췌장 베타 세포내의 저장 비히클에서 인슐린은 6량체로서 존재한다. 그러나, 세포외 공간으로 방출할 때에, 인슐린 6량체는 pH가 더욱 중성 상태로 변화하는 것을 경험할 수 있고 아연 이온-함유 6량체는 희석되어 6량체를 불안정하게 하는 것으로 생각된다. 세포외 공간에 인슐린 6량체의 불안정화에 기여하는 다른 이유가 있을 수 있다. 따라서, 인슐린은 현저하게 단량체로서 혈액내에서 발견된다. 안정화 효과를 이용하기 위해, 인슐린의 대부분의 시판 제형은 아연 이온을 충분한 양으로 함유하여 6량체로의 자기-연합을 촉진한다. 그러나, 6량체 구조는 피하 투여시 이들 제형의 흡수율을 느리게 한다.
섹션 B에 논의된 바와 같이, 인슐린은 예를 들면 당뇨병 환자의 혈당 조절을 위한 치료제로 사용된다. 인슐린이 기본 요법, 식사 요법 또는 이의 조합에 대하여 글루코스를 조절하기 위해 투여되는 지의 여부에 따라서 존재하는 다양한 종류의 인슐린 제형이 있다. 인슐린 제형은 단독으로 속효성 제형으로서, 단독으로 기초-작용 제형(즉, 중간형 및/또는 지속형) 또는 그 혼합물로서 제공될 수 있다(표 2 참조). 일반적으로, 혼합물은 속효성 및 중간형 또는 지효성 인슐린을 함유한다. 예를 들면, 속효성 인슐린은 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 및 50:50을 포함하는 각종 혼합비로 NPH 인슐린(하기 기재된 바와 같이 예시의 중간형 인슐린)과 결합될 수 있다. 이러한 미리혼합된 제제는 금속 관련 및 기초 인슐린 요건을 단일 제형으로 편리하게 제공함으로써 매일 인슐린의 주사 횟수를 줄일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물 제형은 임의로 기초-작용 인슐린을 제공하는 것을 포함한다.
일반적으로, 임의의 인슐린의 제제는 인슐린 폴리펩티드 또는 그 변이체(즉, 유사체)를 포함하고 제형을 구성하는 다른 물질에서만 다르다. 따라서, 다른 인슐린형의 작용의 지속시간에 영향을 미칠 수 있는 제형의 종들이다. 인슐린 제제에 포함된 물질로는 안정화제, 예를 들면, 아연, pH 버퍼, 등장화제, 예를 들면 글리세린; 보존제/항균제, 예를 들면 m-크레솔; 및 프로타민 또는 다른 침전제 또는 제어방출제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 본원에 제공된 바와 같이, 인슐린 제제는 칼슘 및 금속 킬레이트제, 예를 들면 EDTA 또는 EGTA를 함유하여 제조할 수 있다. 임의의 하나 이상의 상기 성분은 인슐린 폴리펩티드, 예를 들면 초속효성 인슐린 조성물에 첨가될 수 있다. 첨가된 특정 성분 및 그 양은 인슐린의 형태, 그 작용의 지속시간, 그 흡수 및 생체이용률, 및 따라서 적용에 영향을 미친다.
예를 들면, 대부분의 인슐린 제제는 금속 이온, 예를 들면 아연을 제형내에 함유하고 분자의 자기-연합을 촉진함으로써 인슐린을 안정화한다. 6량체 형태로의 자기-연합은 투여시에 인슐린의 흡수에 영향을 미친다. 따라서, 이러한 안정화제의 비율 및 인슐린에 EDTA 또는 EGTA의 첨가는 예를 들면 폴리펩티드내에 존재하는 더 고차의 구조의 우세에 영향을 미침으로써 인슐린의 흡수 및 생체이용률의 추가의 조절 및 통제를 허용한다. 일반적으로, 속효성 레귤러 인슐린 제제는 아연을 약 또는 0.01-0.04 mg/100유닛의 양으로 함유한다. 화학적 연구는 인슐린의 용해도가 현탁된 버퍼의 성질 및 아연함량에 의해 대부분 결정되는 것을 밝혀냈다. 따라서, 일부 지효성 기본 인슐린 제제는 아연 첨가에 의해 아세테이트 버퍼(포스페이트 대신)로부터 인슐린을 침전시킴으로써 제조된다. 높은 아연 함량을 갖는 인슐린의 거대 결정이 아세트산 나트륨-염화 나트륨의 용액(pH 7.2 내지 7.5)의 용액에서 수집되고 재현탁되어 피하주사후 느리게 흡수되고 긴 지속시간의 작용을 발휘한다. 이 결정 제제는 연장된 인슐린 아연 현탁액 (울트라렌테(ultralente) 인슐린)이라고 한다. 다른 아연 함유 인슐린 제제는, 예를 들면 세미렌테(semilente) 인슐린(프롬프트 인슐린 아연 현탁액) 및 렌테(lente) 인슐린(인슐린 아연 현탁액)을 포함하고 이들은 사용된 아연 농도가 현저하게 다르다. 아연 함유 인슐린 제제는 프로타민, 예를 들면 NPH 인슐린에 의해 변형된 것을 또한 포함한다.
다른 예에서, 침전제, 예를 들면 프로타민은 인슐린 폴리펩티드에 첨가하여 미세결정 현탁액을 생성한다. 일반적으로 결정성 인슐린은 결정성 형태가 존재하지 않는 인슐린에 비해 연장된 작용 지속시간을 갖는다. 프로타민 아연 인슐린은 수성 현탁액에 피하에 주사되면 침적 부위에서 느리게 용해되고 인슐린은 지체된 속도로 흡수된다. 프로타민 아연 현탁액 인슐린은 대부분 NPH 인슐린으로서 알려진 이소판 인슐린 현탁액으로 대체되었다. 이는 결정성을 갖는 변형된 프로타민 아연 인슐린 현탁액이다. 인슐린, 프로타민 및 아연의 농도는 제제가 레귤러 인슐린과 프로타민 아연 인슐린 현탁액 사이의 중간의, 작용 개시 및 지속시간을 갖도록 정해진다.
또한, 제제의 pH 차이는 인슐린의 종류 및 특성에 영향을 미친다. 원래의 레귤러 인슐린 제제는 pH 2.8 내지 3.5에서 제조되었고, 그렇지 않으면 더 높은 pH 범위에서 입자를 형성하게 될 것이다. 그러나, 매우 정제된 인슐린 제제는 pH 값의 범위에서 제조될 수 있다. 또한, 인슐린 제제의 완충하여 인슐린이 더 넓은 범위의 pH 용액에서 제조되도록 한다. 일반적으로, 중성 pH에서 제조된 인슐린은 산성 pH에서 제조된 것보다 더 큰 안정성을 갖는다. 따라서, 대부분의 인슐린은 중성 pH에서 제형화된다. 예외로는 인슐린 글라르긴으로 pH 4.0에서 시판된 제형으로서 제공된다. 2개의 아르기닌을 B-사슬의 C 말단에 첨가하여, 글라르긴 인슐린의 등전위 점이 이동하여 산성 pH에서 더 가용성이도록 만든다. 추가의 아미노산 변화는 A-사슬(N21G)에 존재하여 산 민감 아스파라긴에 기인한 탈아민화 및 이량체화를 방지한다. 글라르긴 인슐린의 A-사슬의 서열은 서열번호 150에 기재되고 B-사슬은 서열번호 151에 기재되어 있다. 생리적인 pH에 노출이 투여시에 발생하기 때문에, 미세침전물이 형성되어 글라르긴을 결정성, 지속성 인슐린과 유사하게 만든다.
아래 표 2는 다양한 형태의 인슐린, 작용의 개시 및 그 적용을 요약한 것이다.
표 2: 인슐린의 형태
형태 상품명 개시 피크 지속시간 적용
속효성 인슐린 유사체 리스프로 (예를 들면, 휴마로그®); 아스파르트 (예를 들면, 노보로그®); 글루리신 5-15 분 45-90 분 3-4 시간 식후 글루코스 조절
속효성 레귤러 인슐린 레귤러 인슐린(예를 들면., 휴뮤린® R; 노보린® R; 베로슈린® 휴먼) 30 분-1 시간 2-5 시간 5-8 시간 식후 글루코스 조절
중간형 렌테® (예를 들면, 휴뮤린® L, 노보린® L); NPH (예를 들면, 휴뮤린® N, 노보린® N); 1-3 시간 6-12 시간 20-24 시간 기초 인슐린 보충
지효성 울트라렌테 (예를 들면, 휴뮤린® U); 글라르긴; 디테미르 (유사체) 4-6 시간 18-28 시간 28 시간 기초 인슐린 보충
혼합물 휴뮤린® 50/50; 휴뮤린® 70/30; 노보린® 70/30; 휴마로그® 혼합물 75/25 가변적임 가변적임 가변적임
가장 통상적으로 사용되는 인슐린은 속효성 인슐린이 사용되고, 레귤러 인슐린(즉, 천연영 또는 야생형 인슐린, 대립형질 및 종 변이체를 포함) 및 속효성 인슐린 유사체를 포함한다. 이를 위해서, 인슐린에 대한 언급은 달리 기재되어 있지 않으면 속효성 인슐린이다.
속효성 인슐린
본원에 속효성 인슐린 및 가용성 히알루로난 분해효소를 함유하는 초속효성 인슐린 조성물이 제공된다. 일반적으로, 이들 초속효성 인슐린 조성물은 피하 투여 후 흡수되어 감지할 수 있고 30분 이하내에 혈액에서 작용 개시를 갖는다. 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 얻기 위해서 사용될 수 있는 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린을 포함하고, 이는 야생형 또는 천연형 인슐린이다. 속효성 인슐린은 또한 인슐린 유사체를 포함한다. 기초-작용 인슐린에 비해 빠른 흡수율에 의해 속효성 인슐린은 주로 식후 조절 목적으로 사용된다. 예시의 속효성 인슐린은 하기 표3에 기재되어 있다. 속효성 인슐린은 또한 당분야에 공지된 것, 예를 들면 미국 특허 7279457호 및 미국 특허공개 20070235365호, 20080039368호, 20080039365호, 20070086952호, 20070244467호, 및 20070191757호에 개시된 임의의 인슐린 제제 및 장치를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 임의의 속효성 인슐린은 히알루로난 분해효소와 공동-제형 및/또는 공동-투여에 의해 초속효성으로 만들 수 있다. 초속효성 인슐린 조성물 제형은 또한 히알루로난 분해효소 이외에, 중간형 또는 지속형 인슐린과 속효성 인슐린의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
표3 지효성 인슐린
명칭 종 A-사슬
(서열번호) 		B-사슬(서열번호)
시판명
레귤러 인슐린 인간 서열번호 103 서열번호 104 예를 들면 휴뮤린®; 노보린® R; 벨로슈린®
레귤러
인슐린 		돼지 서열번호 123의 88-108 서열번호123의 25-54 일레틴II®;
아스파르트 인슐린 인간 유사체 서열번호 103 서열번호 147 노보로그®
리스프로 인슐린 인간 유사체 서열번호 103 서열번호 148 휴마로그®
글루리신 인슐린 인간 유사체 서열번호 103 서열번호 149 아피드라®
a. 레귤러 인슐린
레귤러 인슐린은 천연형 또는 야생형 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 제형을 포함한다. 이들은 인간 인슐린 뿐만 아니라 소, 돼지 및 다른 종 유래의 인슐린을 포함한다. 이러한 인슐린은 산성 pH(예를 들면, 2.5-3.5)에서 제조되거나 중성 pH(예를 들면, 7.0-7.8)에서 제조될 수 있다. 레귤러 인슐린은 또한 아연을 함유하는 것을 포함한다. 일반적으로 레귤러 인슐린 제제의 아연 함량은 약 또는 0.01-0.04mg/100유닛의 범위에 있다. 레귤러 인간 인슐린은 휴뮤린(Humulin)® R, 노보린(Novolin)® R 및 벨로슐린(Velosulin)®으로서 시판되고 있다. 돼지 인슐린은 이레틴 II(Iletin II)®으로서 시판되었다. 일반적으로, 레귤러 인슐린은 피하투여후 30분의 작용 개시를 갖는다. 최대 혈장 수준은 1-3 시간에서 보여지고 투여량과 함께 강도 증가의 지속시간에 나타낸다. 피하 투여후 혈장 반감기는 약 1.5시간이다.
b. 속효성 유사체
속효성 인슐린 유사체는 일반적으로 하나 이상의 아미노산 변화를 함유하는 인슐린의 변형된 형태이다. 유사체는 레귤러 인슐린에 비해 작용 개시 및 흡수율 증가를 목적으로 인슐린 분자의 자기-연합을 감소하도록 설계된다. 일반적으로 이러한 유사체는 아연의 존재하에서 제형화되어 안정한 아연 6량체로서 존재한다. 그러나, 변형에 의해 이들은 레귤러 인슐린에 비해 피하 투여 후 6량체 상태로부터 더 빠른 해리를 갖는다.
i. 인슐린 리스프로
인간 인슐린 리스프로는 서열번호 104에 기재된 야생형 인슐린 B-사슬에서 28 및 29이 위치에 Pro-Lys가 Lys-Pro로 전환되도록 B-사슬의 28 및 29 위치에서 아미노산 변경를 함유하는 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 리스프로의 서열은 서열번호 103 (A-사슬) 및 서열번호 148 (B-사슬)에 기재되어 있다. 이는 휴마로그(Humalog)®라는 이름으로 시판된다. 이들 2개의 아미노산의 전환의 결과는 자기-연합의 경향이 감소된 폴리펩티드이며, 이는 더 빠른 작용 개시를 가능하게 한다. 구체적으로, B-사슬에서 서열 역위는 2개의 소수성 상호작용을 제거하고 2량체를 안정화시키는 2개의 베타 플리트 시트의 수소 결합을 약화시킨다(예를 들면, DeFelippis 등. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 폴리펩티드는 제형내에 제공된 부형제, 예를 들면 항균제(예를 들면, m-크레솔) 및 안정화용 아연의 결과로서 자기-연합하여 6량체를 형성한다. 그럼에도 불구하고, 아미노산 변형 때문에 인슐린 리스프로는 레귤러 인슐린을 더 빠르게 작용시킨다.
ii . 인슐린 아스파르트
인간 인슐린 아스파르트는 프롤린으로부터 아스파르트산까지 서열번호 104에 기재된 인간 인슐린의 B-사슬의 28 위치에 아미노산 치환을 함유하는 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 아스파르트의 서열은 서열번호 103(A-사슬) 및 서열번호 147(B-사슬)에 기재되어 있다. 이는 노보로그(Novolog)®라는 이름으로 시판되고 있다. 인슐린 아스파르트의 변형은 전하 반발을 일으키고 단량체-단량체 상호작용을 불안정화시키기 위해 음으로 대전된 측쇄 카르복실기를 부여한다. 또한, 프롤린의 제거는 단량체 사이의 핵심 소수성 상호작용을 제거한다(예를 들면, DeFelippis 등. (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 유사체는 대부분 단량체로서 존재하고 리스프로와 같은 다른 속효성 유사체에 비해 응집하는 경향이 적다. 일반적으로, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로는 각각의 약동학 및 약력학 특성과 유사하다.
iii . 인슐린 글루리신
인간 인슐린 글루리신은 서열번호 104에 기재된 인간 인슐린의 B-사슬의 서열에 비해 아스파라긴로부터 리신까지 B3 위치 및 리신으로부터 글루탐산까지 아민노산 B29에서 B-사슬내 아미노산 치환을 함유하는 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 글루리신의 서열은 서열번호 103(A-사슬) 및 서열번호 149(B-사슬)에 기재되어 있다. 이는 아피드라(Apidra)®라는 이름으로 시판된다. 변형에 의해 인간 인슐린에 비해 자기-연합하는 경향이 적은 폴리펩티드 분자로 만든다. 다른 인슐린 유사체와 달리, 폴리펩티드는 6량체 촉진 아연(Becker et al. (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20)참조) 없이 상업적으로 제형화된다. 따라서, 인슐린 글루리신은 인슐린 리스프로 및 인슐린 아스파르트 보다 더 빠른 개시 속도를 갖는다.
D. 히알루로난 분해효소
본원에서 속효성 인슐린 및 히알루로난(히알루론산) 분해효소의 조합물에 기인한 초속효성 인슐린 조성물 및 조합물, 및 인슐린 매개 질병 및 상태를 치료하기 위해 이러한 조성물 및 조합물을 사용하는 방법이 제공된다. 히알루로난 분해효소는 히알루로난을 분해하는 임의의 효소를 포함한다. 예시의 히알루로난 분해효소는 히알루로난을 절단하는 능력을 갖는 히알루로니다제 및 특별한 콘드로이티나제 및 리아제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 본원에 제공된 방법 및 용도는 인슐린과 함께 히알루로니다제의 사용을 기재하며 임의의 히알루로난 분해효소가 사용될 수 있다. 본원에 제공된 조성물, 조합물 및 방법에서 예시의 히알루로난 분해효소는 가용성 히알루로난 분해효소이다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제의 세포외 기질내에서 히알루론산 분해능에 의해, 이러한 효소가 치료제의 투여를 용이하게 한다. 예를 들면, 피하 투여에 의해 히알루로난 분해효소와 공동-투여된 치료제의 흡수 및 분산이 증가된다.
히알루론산 또는 히알루로네이트로도 불리우는 히알루로난은 결합, 상피 및 신경 조직에 걸쳐 널리 분포하는 비-황산화(non-sulfated) 글리코사미노글리칸이다. 히알루로난은 세포외 기질의 필수요소이자 간질 장벽의 주요 구성성분이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해효소는 히알루로난의 점도를 낮추고, 이에 의해 조직 투과성을 증가시키고, 비경구적으로 투여된 유체의 흡수속도를 증가시킨다. 따라서, 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다제는, 예를 들어 다른 작용제, 약물 및 단백질과 함께 산포제 또는 분산제로서 사용되어 이들의 분산 및 전달을 개선한다.
히알루로난 분해효소는 히알루로난 폴리머를 절단함으로써 히알루로난을 분해하며, 상기 폴리머는 교대하는 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통하여 함께 연결된, 반복되는 이당류 단위, D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)으로 구성되어 있다. 히알루로난 사슬은 길이가 약 25,000 이당류 반복(repeats) 이상에 달하고, 히알루로난의 폴리머는 생체내 크기가 약 5,000 내지 20,000,000Da 범위에 이른다. 따라서, 제공되는 용도 및 방법을 위한 히알루로난 분해효소는 히알루로난 이당류 사슬 또는 폴리머의 절단 촉매능을 가지는 임의의 효소를 포함한다. 어떤 예에서 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→3 글리코시드 결합의 절단을 촉매한다.
하기에 기재된 바와 같이, 히알루로난-분해 효소는 막-결합 또는 가용성 형태로 존재한다. 본원에서의 목적을 위해, 가용성 히알루로난-분해 효소가 본원에서의 방법, 용도, 조성물 또는 조합물에서 사용을 위해 제공된다. 따라서, 히알루로난-분해 효소가 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)을 포함하고/하거나 그렇지 않으면 막-고정 또는 불용성인 경우, 히알루로난-분해 효소는 본원에서 가용성 형태로 제공된다. 따라서, 히알루로난-분해 효소에는 말단절단된 변이체, 예를 들어, GPI 앵커의 전부 또는 일부가 제거되도록 말단절단된 변이체가 포함된다. 본원에서 제공되는 히알루로난-분해 효소는 또한 가용성 히알루로난-분해 효소의 대립형질 또는 종 변이체 또는 기타 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 그의 1 차 서열에 하나 이상의 변이, 예컨대 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 히알루로난-분해 효소의 변이체는 일반적으로, 해당 변이를 포함하지 않는 히알루로난-분해 효소에 대해 적어도 또는 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 본원의 목적을 위해 임의의 변이가 히알루로난 분해 효소에 포함될 수 있고, 상기 효소는, 히알루로니다제 활성, 예컨대 해당 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소의 활성의, 예컨대 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성을 보유한다 (당업계에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있는 시험관내 및/또는 생체내 검정으로 측정).
1. 히알루로니다제
히알루로니다제는 히알루로난 분해효소의 거대 패밀리의 구성원이다. 히알루로니다제는 3개의 일반적 클래스: 포유류-계 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제, 및 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제가 있다. 상기 효소는 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 이용될 수 있다.
a. 포유류-계 히알루로니다제
포유류-계 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)는 히알루로난의 β1→4 글리코시드 결합을 다양한 길이의 올리고당류, 예컨대, 4당류 및 6당류로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다제이다. 상기 효소는 가수분해 및 트랜스글리코시다제 활성을 모두 가지며, 히알루로난 및 콘드로이틴 설페이트(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 상기 유형의 히알루로니다제는 암소(소) 히알루로니다제(서열번호 10, 11 및 64 및 BH55 (미국특허번호 5,747,027호 및 5,827,721호), 양(면양)(서열번호 26, 27, 63 및 65), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 말벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(paper wasp)(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19, 32), 돼지(서열번호 20 내지 21), 랫트(서열번호 22 내지 24, 31), 토끼(서열번호 25), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 30) 및 인간 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다제의 예는 가용성 히알루로니다제이다.
포유류 히알루로니다제는 고환 추출물에서 우세하게 발견되는, 중성 활성인 것들 및 간 등의 기관에서 우세하게 발견되는 산성 활성인 것들로 추가로 하위분류될 수 있다. 중성 활성인 히알루로니다제의 예는 양(서열번호 27), 소(서열번호 11) 및 인간(서열번호 1)과 같은 다른 종 유래 PH20 을 포함하나 이에 국한되지 않는 PH20 을 포함한다. 인간 PH20 (SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20로도 공지)은 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 원형질 막에 부착된다. 이는 정자-난자 부착에 자연적으로 관여하고, 히알루론산을 소화하여 정자의 난구세포 층의 침투를 돕는다.
인간 PH20 (SPAM1 로도 지칭됨) 이외에도, 5 가지 히알루로니다제-형 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1 가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 는 슈도유전자 (pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호 38) 은 임의의 공지된 기질에 대한 활성을 보유하는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호 39 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 콘드로티나아제이고, 히알루로난에 대한 활성은 거의 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호 36 에 기재된 전구체 폴리펩티드)은 전형적인 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 전형적 중성-활성 효소이다. 산성-활성 히알루로니다제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호 37 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결여되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 초과에서 시험관내 촉매 활성이 거의 없다 (Frost 등 (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 는 시험관내에서 매우 낮은 비활성도를 가진 산성-활성 효소이다. 히알루로니다제-형 효소는 또한, 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 형질막에 결합되어 있는 것, 예컨대 인간 HYAL2 및 인간 PH20 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), 및 일반적으로 가용성인 것, 예컨대 인간 HYAL1 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 할 수 있다.
PH20
PH20 는, 다른 포유류 히알루로니다제와 마찬가지로, 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 각종 길이의 다당류, 예컨대 4당류 및 6당류로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 활성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. PH20 는 본래 정자-난자 결합에 수반되고, 히알루론산 소화에 의해, 정자에 의한 난구세포층의 침투를 보조한다. PH20 는 정자 표면 및 라이소좀-유도성 첨체에 위치해 있으며, 여기서 내첨체막에 결합되어 있다. 형질막 PH20 는 중성 pH 에서만 히알루로니다제 활성을 갖는 반면, 내첨체막 PH20 는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다제에 추가하여, PH20 도 또한 HA-유도성 세포 신호전달에 대한 수용체, 및 난자를 둘러싼 투명층에 대한 수용체인 것으로 나타난다.
예시 PH20 단백질에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드), 침팬지 (서열번호 185), 붉은털원숭이 (서열번호 186), 소 (서열번호 11 및 64), 토끼 (서열번호 25), 양 PH20 (서열번호 27, 63 및 65), 사이노몰거스 원숭이 (서열번호 29), 기니피그 (서열번호 30), 랫트 (서열번호 31) 및 마우스 (서열번호 32) PH20 폴리펩티드가 포함된다.
소 PH20 는 553 개 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호 11) 이다. 소 PH20 와 인간 PH20 의 정렬은 오직 약한 상동성 만을 보여주는데, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카르복시 말단까지에는 다중적인 갭들이 존재한다 (참고문헌은, 예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). 사실, 명백한 GPI 앵커는 인간을 제외한 다수의 기타 PH20 종들에서는 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 생산된 PH20 폴리펩티드는 본래 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20 는 원형질막에 매우 느슨하게 결합되어 존재하나, 이는 포스포리파아제 감수성 앵커를 통해 고정되어 있지는 않다 (Lalancette 등 (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). 소 히알루로니다제의 이러한 독특한 특성은, 가용성 소 고환 히알루로니다제 효소의 임상 용도를 위한 추출물로서의 이용을 가능케 한다 (Wydase®, Hyalase®).
인간 PH20 mRNA 전사물은 정상적으로 번역되어 N-말단에 35 개의 아미노산 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 및 C-말단에 19 개의 아미노산 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 결합 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509)를 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호 1; 하기 복제됨) 를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 은 서열번호 2 에 기재된 474 아미노산 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 ER 로의 수송 및 신호 펩티드의 제거 후, C-말단 GPI-결합 신호 펩티드는 절단되어, 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 490 에 해당하는 아미노산 위치에서 새롭게 형성된 C-말단 아미노산에 대한 GPI 앵커의 공유결합성 결합을 촉진한다. 따라서, 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 GPI-고정 성숙형 폴리펩티드가 생산된다.
인간 PH20 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 1; 509 아미노산):
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSATMFIVSILFLIISSVASL
인간 PH20 은 중성 및 산성 pH 의 모두에서 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 한 국면에서, 인간 PH20 는 일반적으로 GPI 앵커를 통해 원형질막에 고정되어 있는 전형적 중성-활성 히알루로니다제이다. 또다른 국면에서, PH20 은 중성 및 산성 pH 모두에서 히알루로니다제 활성을 갖는 내첨체막 상에 발현된다. PH20이 폴리펩티드의 서로 떨어진 영역에 2 개의 촉매 부위를 포함하는 것으로 보인다: 펩티드 1 및 펩티드 3 영역 (Cherr 등, (2001) Matrix Biology 20:515-525). 증거는, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 107 내지 137 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 142 내지 172 에 해당하는데, PH20 펩티드 1 영역이 중성 pH 에서의 효소 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 상기 영역 내 위치 111 및 113 의 아미노산 (서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당)은 활성에 중요한 것으로 나타나는데, 이는 그의 아미노산 치환에 의한 돌연변이가, 야생형 PH20 에 비해, 각각 3% 히알루로니다제 활성을 갖거나 히알루로니다제가 검출되지 않는 PH20 폴리펩티드를 제공한다는 것으로 뒷받침된다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
펩티드 3 영역은, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 242 내지 262, 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 277 내지 297 에 해당하는데, 산성 pH 에서의 효소 활성에 중요한 것으로 나타난다. 상기 영역 내에서, 성숙형 PH20 폴리펩티드의 위치 249 및 252 에서의 아미노산은 활성에 핵심적인 것으로 나타나고, 이들 중 하나에서라도 돌연변이가 발생하면 활성이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 제공한다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
촉매 부위에 추가하여, PH20 은 또한 히알루로난-결합 부위를 포함한다. 실험적인 증거는, 상기 부위가 펩티드 2 영역에 위치하고 있음을 시사하며, 이는 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 205 내지 235 및, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 위치 170 내지 200 에 해당한다. 상기 영역은 히알루로니다제 간에 고도로 보존적이고, 헤파린 결합 모티프와 유사하다. 위치 176 (서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당) 에서의 아르기닌 잔기의 글리신으로의 돌연변이는, 야생형 폴리펩티드에 비해 히알루로니다제 활성이 오직 약 1% 만 있는 폴리펩티드를 제공한다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
서열번호 1 로 예시되는 인간 PH20 의 폴리펩티드의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 에는 7 개의 잠재적인 N-연결형 글리코실화 부위가 있다. 서열번호 1 의 아미노산 36 내지 464 는 최소 활성 인간 PH20 히알루로니다제 도메인을 포함하는 것으로 나타나기 때문에, N-연결형 글리코실화 부위 N-490 는 적절한 히알루로니다제 활성에는 필요하지 않다. 인간 PH20 에는 6 개의 이황화결합이 있다. 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C60 및 C351 사이, C224 및 C238 사이에 2 개의 이황화결합이 있다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C25 및 C316, 및 C189 및 C203 에 해당됨). 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376 및 C387 사이; C381 및 C435 사이; C437 및 C443 사이; 및 C458 및 C464 사이에는 추가로 4 개의 이황화결합이 형성된다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C341 및 C352 사이; C346 및 C400 사이; C402 및 C408 사이; 및, C423 및 C429 사이에 해당됨).
b. 박테리아 히알루로니다제
박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 설페이트 및 데르마탄 설페이트를 분해한다. 박테리아에서 분리된 히알루로난 리아제는 작용방식에 의해 히알루로니다제(다른 출처 유래, 예컨대, 히알루로노글루코사미니다제, EC 3.2.1.35)와 다르다. 이들은 히알루로난 내의 N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기 사이의 β1→4-글리코시드결합의, 가수분해보다는, 제거반응을 촉매하여, 3-(4-디옥시-β-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민 4- 및 6-당류, 및 이당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다제이다. 상기 반응으로 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기를 가지는 올리고당이 형성된다.
제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 아르쓰로박터(Arthrobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 클로스트리듐(Clostridium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이드(Bacteroides) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 균주를 포함한, 미생물 내 히알루로난 분해효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효소의 특정 예는 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp.)(균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73), 스트렙토코커스 아우레우스(Streptococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 보바인 RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC 7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96)), 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 설페이트를 절단하지 않는, 스트렙토마이세스 히알루로노리티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
c. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36)는 4- 및 6-당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다제이다. 상기 효소는 히알루로네이트 내 β-D-글루쿠로네이트와 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이에 β1→3-결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리 유래 히알루로니다제의 예는 거머리과(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis)), 돌거머리과(Erpobdellidae)(예를 들어, 네펠롭시스 옵스쿠라(Nephelopsis obscura) 및 에르포브델라 펀타타(Erpobdella punctata)), 넙적거머리과(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데쎄로브델라 픽타(Desserobdella picta), 헤로브델라 스타그날리스(Helobdella stagnalis), 그로씨포니아 콤플란타(Glossiphonia complanata), 플라코브델라 오르나타(Placobdella ornata) 및 테로마이존속(Theromyzon sp.)) 및 말거머리과(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Hovingh 등(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). 거머리 히알루로니다제와 동일한 작용기전을 가지는 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 시아노박테리아(cyanobacteria), 시네코코커스속(Synechococcus sp.)의 히알루로니다제(균주RCC307, 서열번호 97)이다.
2. 기타 히알루로난 분해효소
상기 히알루로니다제 패밀리에 추가로, 다른 히알루로난 분해효소가 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 속효성 인슐린과 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 콘드로이티나제 및 리아제를 포함한, 히알루로난 절단능을 가지는 효소가 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해할 수 있는 콘드로이티나제의 예는 콘드로이틴 ABC 리아제 (또한 콘드로이티나제 ABC로서 공지), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 설페이트 리아제 또는 콘드로이틴 설페이트 엘리미나제로서 공지) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 상기 효소의 생산 및 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국특허번호 6,054,569호; Yamagata, 등(1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang 등(1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857).
콘드로이틴 ABC 리아제는 두개의 효소, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함하고(Hamai 등(1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30), 이들은 콘드로이틴-설페이트 및 데르마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해한다. 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴-설페이트 프로테오글리칸 및 데르마탄 설페이트는 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제의 바람직한 기질이나, 상기 효소는 더 낮은 속도로 히알루로난에 작용할 수도 있다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-설페이트- 및 데르마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해하여, 궁극적으로 Δ4-불포화 4- 및 2-당류로 분해되는 다른 크기의 Δ4-불포화 올리고당의 혼합물을 생성한다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질특이성을 가지나, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 폴리머 콘드로이틴-설페이트 및 이들의 올리고당 절편 모두의 비-환원 말단으로부터 이당류 잔기를 제거한다(Hamai, A. 등(1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제의 예는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 황산-콘드로이틴-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있음(Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 콘드로이틴 설페이트 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이나, 데르마탄 설페이트(콘드로이틴 설페이트 B)에 대해 불활성이다. 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소의 예는 서열번호 99 및 100에 각각 기재된, 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 및 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 이리시스(Arthrobacter aurescens) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
콘드로이티나제 C 는 콘드로이틴 설페이트 C를 절단하여, 4당류와 불포화 6-황산화 이당류(delta Di-6S)를 생성한다. 이는 또한 히알루론산을 절단하여 불포화 비-황산화 이당류(delta Di-OS)를 생성한다. 박테리아의 콘드로이티나제 C 효소의 예는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium)의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
3. 가용성 히알루로난 분해효소
가용성 히알루로니다제를 포함한, 가용성 히알루로난 분해효소가 본원의 상기 조성물, 조합물 또는 방법에서 제공된다. 가용성 히알루로난 분해효소는 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해효소를 포함하고, 가용성 히알루로니다제, 예컨대, 비-인간 동물 가용성 히알루로니다제, 박테리아 가용성 히알루로니다제 및 인간 히알루로니다제, Hyal1, 소의 PH20 및 양의 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 다른 변이체를 포함한 비-인간 가용성 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 가용성 히알루로난 분해 효소 중에는 미국 가출원번호 61/201,384 (그 전체로 참조로써 포함됨)의 임의의 기재내용을 포함하여, 가용성이도록 만들어진 임의의 히알루로난 분해 효소가 포함된다. 예를 들어, GPI 앵커를 포함하는 히알루로난 분해효소는 GPI 앵커의 모두 또는 일부를 말단절단(truncation)하거나 제거하여 가용성으로 만들어질 수 있다. 하나의 예에서, GPI 앵커를 통해 정상적으로 막에 고정된, 인간 히알루로니다제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 모두 또는 일부의 말단절단 및 제거에 의해 가용성으로 만들어질 수 있다.
가용성 히알루로난 분해효소는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제를 포함한다. 투여후 효소활성의 원하는 수준의 효소 활성 및/또는 투여부위와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 요인들에 따라, 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제가 선택될 수 있다. 특정 예에서, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해효소는 가용성 중성 활성 히알루로니다제이다.
히알루로니다제가 가용성이고 히알루로니다제 활성을 유지하는 한, 가용성 히알루로니다제의 예는 임의의 종 유래 PH20, 예컨대 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 185 내지 186 중 어느 하나에 기재된 임의의 것, 또는 C-말단 GPI 앵커의 모두 또는 일부가 결여된 이들의 절단된 형태이다. 가용성 히알루로니다제 중에는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 185 내지 186 중의 어느 하나의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 또한 포함된다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 185 내지 186 중 어느 하나 또는 이들의 절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 변형은 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 히알루로니다제의 활성을 위하여 중요하거나, 그렇지 않으면 요구되는 잔기들, 예컨대 상기 기재되거나 당 분야의 기술에서 알려진 임의의 것들이 일반적으로 불변인 것으로 이해된다. 이들은 예를 들면 활성 부위 잔기들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 인간 PH20 폴리펩티드 또는 이의 가용성 형태의 아미노산 잔기 111, 113 및 176 (서열번호 2에 기재된 성숙한 PH20 폴리펩티드 내 잔기들에 상응)가 일반적으로 불변이고, 변경되지 않는다. 글리코실화 및 적절한 폴딩을 위하여 요구되는 이황화결합의 형성을 제공하는 다른 잔기들이 또한 불변일 수 있다.
일부 예에서, 가용성 히알루로난 분해효소는 정상적으로 GPI 부착되고 (예를 들면, 인간 PH20), C 말단절단에 의해 가용성을 제공한다. 이러한 말단 절단은 GPI 앵커 부착 신호 서열의 모두를 제거하거나, GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부만을 제거할 수 있다. 그러나, 생성된 폴리펩티드는 가용성이다. 가용성 히알루로난 분해효소가 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 예에서, 폴리펩티드가 가용성이면 GPI 앵커 부착 신호 서열 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 아미노산 잔기를 유지할 수 있다. GPI 앵커의 하나 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소라고 한다. 당업자는 폴리펩티드가 당업계에 알려진 방법을 사용하여 GPI-부착되었는지를 결정할 수 있다. 이러한 방법은 공지의 알고리즘을 사용하여 GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω-부위의 존재 및 위치를 예상하고 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C(PI-PLC) 또는 D(PI-PLD)로 소화 전후의 용해도 분석을 실시하는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
연장된 가용성 히알루로난 분해효소는 얻어진 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하도록 천연 GPI 앵커 히알루로난 분해효소에 C-말단 절단함으로써 제조될 수 있다. C-말단절단되지만 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소의 예는 영장류 기원인 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드, 예를 들면 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, esPH20 폴리펩티드는 활성 단편을 포함하는, 서열번호 1, 2 또는 185에 기재된 성숙 또는 전구체 폴리펩티드 또는 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중 어느 하나의 C-말단 절단에 의해 만들어질 수 있는데, 얻어진 폴리펩티드는 가용성이고 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 유지한다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 얻어진 esPH20 폴리펩티드가 가용성이고 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 유지하는 것이면, 본원에서 제공된 esPH20 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1,2, 또는 185에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다.
전형적으로, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위하여, 가용성 인간 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 인간 PH20이 사용된다. 다른 동물 유래 히알루로난 분해효소, 예를 들면 PH20이 이용될 수 있으나, 그러한 제제는 동물 단백질이므로, 잠재적으로 면역원성이 있다. 예를 들어, 유의적 비율의 환자가 사전에 섭취된 음식물에 대해 이차적인 민감화(sensitization)를 보여주고, 이들은 동물 단백질이기 때문에, 모든 환자는 차후에 민감화의 위험을 가진다. 따라서, 비-인간 제제는 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제를 원한다면, 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 가지도록 제조될 수 있음이 본원에서 고려된다. 그러한 변형은 당업자의 수준 내에 있으며, 예를 들어 분자에서 하나 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
본원의 방법에서 사용된, 히알루로니다아제(예를 들면, PH20)를 포함한, 히알루로난 분해효소는 재조합적으로 생산되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 출처로부터 정제되거나 부분적으로-정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해효소를 포함한, 재조합 단백질의 생산방법은 본원의 다른 곳에서 제공되며, 당업자에게 잘 알려져 있다.
a. 가용성 인간 PH20
가용성 히알루로니다제의 예는 가용성 인간 PH20을 들 수 있다. 재조합 인간 PH20의 가용성 형태가 제조되어 왔고 본원에 기재된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 PH20의 가용성 형태의 제조는 미국출원 공개번호 20040268425호; 20050260186호 및 20060104968호 (그 전체로 참조로써 포함됨), 및 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들면, 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1에 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1에 포함된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% 서열 동일성을 갖고, 히알루로니다제 활성을 유지하고 가용성인 C-말단 절단된 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드 중에는, GPI-앵커 부착 신호 서열의 전부 또는 일부가 완전히 결실된 가용성 PH20 폴리펩티드가 포함되어 있다. 또한, GPI 앵커의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드가 포함되어 있다. 따라서, ER내에 단백질의 C-말단에 GPI 앵커가 공유결합되고 원형질 막의 세포외 소엽(leaflet)에 고정되는 것 대신에, 이들 폴리펩티드는 분비되고 가용성이다. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 전장의 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열을 갖는 전장의 야생형 폴리펩티드 또는 그의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5, 60 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다.
본원에 제공된 C-말단절단된 인간 PH20 폴리펩티드의 예는 서열번호 1에 기재된 아미노산의 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 또는 그의 대립형질 또는 종 변이체에서 상응하는 위치를 함유하는 폴리펩티드를 생생하기 위해 C-말단 절단된 것을 포함한다. 포유류 세포 내에서 발현시, 상기 35 아미노산 N 말단 신호 서열은 프로세싱 중에 절단되고 성숙한 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 예시의 성숙한 C-말단 절단된 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 또는 그의 대립형질 또는 종 변이체에서 상응하는 위치를 함유한다. 표 4는 C-말단절단 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하는 예시의 C-말단 절단 PH20 폴리펩티드의 비제한적 예를 제공한다. 하기 표 4에서 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 길이(아미노산) 및 C-말단 절단된 PH20 단백질의 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 예시의 아미노산 서열이 기재된 서열 식별기호(서열번호)를 제공한다. 또한, 야생형 PH20 폴리펩티드가 비교를 위해 표 4에 포함되어 있다.
예시적 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드
폴리펩티드 전구체
(아미노산) 		전구체
서열번호 		성숙형
(아미노산) 		성숙형
서열번호
야생형 509 1 474 2
SPAM1-FIVS 497 191 462 235
SPAM1-MFIV 496 225 461 269
SPAM1-TMFI 495 192 460 236
SPAM1-ATMF 494 226 459 270
SPAM1-SATM 493 193 458 237
SPAM1-LSAT 492 227 457 271
SPAM1-TLSA 491 194 456 238
SPAM1-PSTL 489 195 454 239
SPAM1-SPST 488 228 453 272
SPAM1-STLS 490 196 455 240
SPAM1-ASPS 487 197 452 241
SPAM1-NASP 486 229 451 273
SPAM1-YNAS 485 198 450 242
SPAM1-FYNA 484 199 449 243
SPAM1-IFYN 483 46 448 48
SPAM1-QIFY 482 3 447 4
SPAM1-PQIF 481 45 446 5
SPAM1-EPQI 480 44 445 6
SPAM1-EEPQ 479 43 444 7
SPAM1-TEEP 478 42 443 8
SPAM1-ETEE 477 41 442 9
SPAM1-METE 476 200 441 244
SPAM1-PMET 475 201 440 245
SPAM1-PPME 474 202 439 246
SPAM1-KPPM 473 203 438 247
SPAM1-LKPP 472 204 437 248
SPAM1-FLKP 471 205 436 249
SPAM1-AFLK 470 206 435 250
SPAM1-DAFL 469 207 434 251
SPAM1-IDAF 468 208 433 252
SPAM1-CIDA 467 40 432 47
SPAM1-VCID 466 209 431 253
SPAM1-GVCI 465 210 430 254
가용성 형태는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 함유하는 폴리펩티드를 생성시키기 위해 C-말단 절단된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 포유류 세포에서 발현되는 경우, 35 아미노산 N-말단 신호 서열이 프로세싱 중에 절단되고, 성숙한 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 성숙한 가용성 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 36 내지 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 함유한다. 아미노산 위치 477 내지 483에서 종결하는 결실 변이체(서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드에 상응)는 전장 GPI 앵커 형태 보다 높은 분비된 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 따라서, 가용성 히알루로니다제의 예는, 예를 들면 서열번호 4 내지 9에 기재된 것과 같은, 442, 443, 444, 445, 446 또는 447 아미노산 길이인 가용성 인간 PH20 폴리펩티드 또는 그의 대립형질 또는 종 변이체 또는 다른 변이체를 들 수 있다.
촉매활성 및 히알루로니다제의 안정성을 위해 글리코실화가 중요하기 때문에 일반적으로 PH20의 가용성 형태는 폴리펩티드의 활성 유지를 보장하도록 정확한 N-글리코실화를 용이하게 하는 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 이러한 세포는, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한다(예를 들면, DG44 CHO 세포).
b. rHuPH20
인간 PH20의 재조합 가용성 형태가 만들어지고, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 상기 재조합 인간 PH20의 가용성 형태의 생성은 미국 공개번호 20040268425호; 20050260186호 및 20060104968호 및 하기 실시예 2-6에 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 (서열번호 3에 기재된) 아미노산 1 내지 482를 코딩하는 핵산분자로부터 생성되는 것들이다. 이러한 핵산 분자의 예는 서열번호 49에 기재되어 있다. 번역후 프로세싱은 35 아미노산 신호 서열을 제거하고 447 아미노산 가용성 재조합 인간 PH20(서열번호 4)를 남긴다. 배양 배지에서 생산되기 때문에, C-말단에서 불균일(heterogeneity)이 있으며, 따라서 rHuPH20으로 명명된 제품은 서열번호 4-9 중 어느 하나 이상을 다양하고 풍부하게 포함할 수 있는 종의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, rHuPH20은 활성을 유지하기 위해 정확한 N-글리코실화를 용이하케 하는 세포, 예를 들면 CHO 세포(예를 들면 DG44 CHO 세포)내에서 생성된다.
4. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
촉매활성 및 안정성을 위해, 히알루로니다제를 포함하는 일부의 히알루로난 분해효소의 N-결합 및 O-결합 글리코실화를 포함하는 글리코실화가 중요할 수 있다. 당단백질을 변형한 글리칸의 형태를 변경하하는 것은 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 용해도 및 안정성에 대한 현저한 영향을 가질 수 있지만, 대부분의 효소는 최적의 효소활성을 위하여 글리코실화가 필요하다고 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다제에 대해, N-결합 글리코실화를 제거하여 히알루로니다제 활성의 거의 완전한 불활성화를 초래할 수 있다. 따라서, 이러한 히알루로니다제에 대해, 활성 효소를 생성시키기 위해 N-결합 글리칸의 존재가 중요하다.
N-결합 올리고당류는 여러 주요한 형태(올리고만노스, 복합체, 하이브리드, 술페이트 형태)로 분류되고, 모두 Asn-Xaa-Thr/Ser 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아니다)내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc 코어를 갖는다. Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화가 응고단백질 C에 대해 보고되었다. 일부 예에서, 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해효소는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합을 함유할 수 있다. 예를 들면, PH20은 O-결합 올리고당류 뿐만 아니라 N-결합 올리고당류를 갖는다. 서열번호 1에 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에서 7개의 잠재 N-결합 글리코실화 부위가 있다. 상기 인식된 바와 같이, 히알루로니다제 활성을 위해서 N490에서 N-결합 글리코실화가 필요하지 않다.
일부 예에서, 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 글리코실화 부위들 중 하나 또는 전부에서 글리코실화된다. 예를 들면, 인간 PH20 또는 가용성 형태에 대해, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393에 상응하는 2, 3, 4, 5 또는 6의 N 글리코실화 부위가 글리코실화된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 천연 글리코실화 부위에서 글리코실화된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 비천연 글리코실화 부위에서 변형되어 하나 이상의 부가적인 부위에서 폴리펩티드의 글리코실화를 제공한다. 이러한 예에서, 부가적인 당 잔기의 부착은 분자의 약동학 특성, 예를 들면 반감기 및/또는 활성을 향상시킬 수 있다.
다른 예에서, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 부분적으로 탈글리코실화(또는 N-부분적으로 글리코실화 폴리펩티드)된다. 예를 들면, 부분적으로 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 히알루로니다제 활성의 전부 또는 일부를 유지하고 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용될 수 있다. 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로니다제의 예는 임의의 종, 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 및 186에 기재된 것 또는 대립형질 변이체, 말단절단된 변이체, 또는 다른 변이체 유래의 부분적으로 탈글리코실화된 PH20 폴리펩티드의 가용성 형태를 포함한다. 이러한 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 185 및 186 중 어느 하나 또는 그 말단절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로니다제는 하이브리드, 융합 및 키메릭 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제 및 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제 접합체를 포함한다.
글리코시다제 또는 글리코시드 가수분해효소는 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매작용하여 2개의 더 작은 당을 생성하는 효소이다. 척추동물에서 N-글리칸의 주요한 형태는 고 만노스 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 복합체의 글리칸을 포함한다. 고 만노스 글리칸, 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 2분기(biantennary) 복합체형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 2분기 이상의 분지쇄 복합체 글리칸을 절단하는 EndoF3; 및 고 만노스 및 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoH를 포함하는 부분적인 단백질 탈글리코실화 만을 일으키는 여러개의 글리코시다제가 있다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 PH20의 하나 또는 모든 글리코시다제로의 처리는 부분적인 탈글리코실화만을 일으키고, 따라서 히알루로니다제 활성을 유지한다.
부분적으로 탈글리코실화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 부분적으로 탈글리코실화 가용성 히알루로니다제는 하나 이상의 글리코시다제, 일반적으로 모든 N-글리칸을 제거하지 않으나 부분적으로만 단백질을 탈글리코실화하는 글리코시다제로의 소화에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, PH20(예를 들면, rHuPH20라고 명명되는 재조합 PH20)을 하나 또는 모든 상기 글리코시다제(예를 들면, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3)로 처리는 부분 탈글리코실화를 일으킨다. 이들 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드와 동등한 히알루로니다제 효소 활성을 나타낼 수 있다. 반면, PH20을 PNGaseF, 모든 N-글리칸을 절단하는 글리코시다제로의 처리는 모든 N-글리칸의 완전한 제거를 초래하며, 이에 의해 PH20은 효소적으로 비활성이 된다. 따라서, 모든 N-결합 글리코실화 부위 (예를 들면, 서열번호 1에서 예시된 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393의 것들)가 글리코실화될 수 있지만, 하나 이상의 글리코시다제로의 처리는 하나 이상의 글리코시다제로 소화되지 않은 히알루로니다제에 비해 감소된 글리코실화의 정도를 제공할 수 있다.
부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적으로 탈글리코실화 히알루로난 분해효소는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%를 가질 수 있다. 일반적으로, 부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로난 분해효소는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드에 의해 나타낸 히알루로니다제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
5. 약동학적 성질을 개선하기 위한 히알루로난 분해 효소의 변형들
히알루로난 분해 효소는 그의 약동학적 성질을 개선하기 위하여, 예컨대, 생체내 반감기 및/또는 활성 증가를 위하여 변형될 수 있다. 제공되는 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해 효소의 변형은 직접적 또는 링커를 통해 간접적으로, 예컨대 공유적으로 또는 다른 안정한 연결에 의하여, 중합체, 예컨대, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 (페길화(PEG)) 또는 시알릴 잔기 또는 다른 그러한 폴리머, 예컨대 천연 또는 당 폴리머에 부착하는 것을 포함한다.
치료제의 페길화는 단백질 분해에 대한 저항을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 폴리머 분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 히알루로난 분해 효소에의 공유결합 또는 다른 안정한 부착 (접합)은 생성된 효소-폴리머 조성물에 유리한 특성들을 부여할 수 있다. 그러한 특성들은 증가된 생체적합성, 대상체의 혈액, 세포 및/또는 다른 조직 내 단백질 (및 효소 활성) 반감기의 확장, 단백질 분해효소 및 가수분해로부터 단백질의 효과적인 보호, 개선된 생체분포성, 향상된 약동학 및/또는 약력학, 및 증가된 수 용해도를 포함한다.
히알루로난 분해효소에 접합될 수 있는 폴리머의 예는 천연 및 합성 호모폴리머, 예를 들면 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, poly-COOH), 및 추가의 헤테로폴리머, 즉 하나 이상의 다른 커플링기, 예를 들면 하이드록실기 및 아민기를 포함하는 폴리머를 포함한다. 적당한 폴리머 분자로는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 카르복시메틸-덱스트란, 헤파린, 동종 알부민을 포함하는 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스 카르복시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산 가수분해산물, 전분, 예를 들면 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알기닌산 가수분해물 및 생폴리머 중에서 선택되는 폴리머 분자를 포함한다.
일반적으로, 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드, 예를 들면 PEG, 일반적으로 mPEG이고 이것은 덱스트란 및 풀루란과 같은 다당류에 비해 가교결합할 수 있는 반응성기를 거의 갖고 있지 않다. 일반적으로, 폴리머는 비독성 폴리머 분자, 예를 들면 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이고, 이것은 상대적으로 단순화학을 이용하여 히알루로난 분해효소(예를 들면 단백질 표면에 부착된 기에 대한)에 공유결합될 수 있다.
히알루로난 분해효소에 부착하기 위한 적당한 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들면 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEG 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다(예컨대 Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004 참조). 폴리머 분자는 일반적으로 약 3kDa 내지 약 60kDa의 범위의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질, 예를 들면 rHuPH20에 접합된 폴리머 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
PEG 또는 PEG 유도체를 공유결합(접합)함으로써 폴리펩티드를 변형하는 각종 방법(즉, "페길화(PEG화)")이 당업계에 알려져 있다 (예를 들면, 미국 2006/0104968호; 미국 5,672,662호; 미국 6,737,505호; 및 미국 2004/0235734호). 페길화 기술은 특별한 링커 및 커플링 화학(Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 접합부위에 다중 PEG 잔기의 부착(예컨대 분지 PEG 의 이용을 통해; Veronese 등., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002 참조), 부위-특이적 페길화 및/또는 모노-페길화 (Chapman 등., Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조) 및 부위-지정 효소 페길화(예를 들면, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002 참조) (또한, 예컨대, Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S 참조)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 당 분야에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생성할 수 있다(미국 2006/0104968호 참조).
페길화용 수많은 시약은 당 분야에 기재되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐-카르보네이트-PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 5,672,662호; 미국 5,932,462호; 미국 6,495,659호; 미국 6,737,505호; 미국 4,002,531호; 미국 4,179,337호; 미국 5,122,614호; 미국 5,183,550호; 미국 5,324,844호; 미국 5,446,090호; 미국 5,612,460호; 미국 5,643,575호; 미국 5,766,581호; 미국 5,795,569호; 미국 5,808,096호; 미국 5,900,461호; 미국 5,919,455호; 미국 5,985,263호; 미국 5,990,237호; 미국 6,113,906호; 미국6,214,966호; 미국 6,258,351호; 미국 6,340,742호; 미국 6,413,507호; 미국 6,420,339호; 미국 6,437,025호; 미국 6,448,369호; 미국 6,461,802호; 미국 6,828,401호; 미국 6,858,736호; 미국 2001/0021763호; 미국 2001/0044526호; 미국 2001/0046481호; 미국 2002/0052430호; 미국 2002/0072573호; 미국 2002/0156047호; 미국 2003/0114647호; 미국 2003/0143596호; 미국 2003/0158333호; 미국 2003/0220447호; 미국 2004/0013637호; 미국 2004/0235734호; 미국 2005/000360호; 미국 2005/0114037호; 미국 2005/0171328호; 미국 2005/0209416호; 유럽 01064951 호; 유럽 0822199호; WO 00176640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
한 예에서, 제공되는 방법, 조성물 및 조합물에서 사용을 위한 히알루로난 분해 효소는 PEG화된 가용성 히알루로니다제이다. 특별한 예에서, 가용성 히알루로니다제는 PEG화된 PH20 히알루로니다제이다. 다른 특별한 예에서, 가용성 히알루로니다제는 PEG화된 rHuPH20, 예컨대 실시예 10에 기재된 것이다.
E. 인슐린 또는 히알루로난 분해효소 및 그 폴리펩티드를 코드화된 핵산을 제조하는 방법
본원에 기재된 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현를 위해 당 분야에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 인슐린의 A-사슬 및 B-사슬은 화학적으로 합성되고 예를 들면, 환원-재산화 반응을 통해 이황화 결합에 의해 가교결합될 수 있다. 폴리펩티드가 재조합 수단에 의해 제조되는 경우, 원하는 유전자를 코드화하는 핵산의 식별을 위해 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 당 분야에서 이용가능한 방법을 사용하여 예를 들면 세포 또는 조직 출처로부터 히알루로니다제를 코드화하는 전장(즉, 전체의 코딩영역을 포함) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 얻을 수 있다 변형된 또는 변이체 인슐린 또는 히알루로난 분해효소는 예를 들면 부위 특이적 돌연변이 생성에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 조작할 수 있다.
폴리펩티드는 핵산 분자를 클로닝하고 단리하기 위해 당분야에서 공지된 임의의 이용가능한 방법을 사용하여 클로닝되거나 단리될 수 있다. 이러한 방법은 핵산 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함하는 핵산의 PCR 증폭 및 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함하는 핵산의 증폭방법을 사용하여 예를 들면 원하는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 단리할 수 있다. 핵산 함유 물질은 원하는 폴리펩티드-코드화 핵산 분자가 단리된 출발물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물, 유체 시료(예를 들면, 혈액, 혈청, 타액), 건강한 및/또는 병에 걸린 대상체로부터의 시료는 증폭방법에 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리가 또한 출발물질원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 발생되는, 발현 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 프라이머는 폴피펩티드 아미노산 서열의 역번역에 기초하여 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성된 핵산 분자를 서열분석하여 원하는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 확인할 수 있다.
추가의 뉴클레오타이드 서열은 합성 유전자를 벡터, 예를 들면 단백질 발현 벡터 또는 DNA 서열을 코드화하는 코어 단백질의 증폭을 위해 설계된 벡터로 클로닝하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커 서열을 포함한 폴리펩티드-코드화 핵산 분자에 결합될 수 있다. 또한, 기능성 DNA 요소를 특정하는 추가의 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 코드화 핵산 분자에 작동가능게 결합될 수 있다. 이러한 서열로는 세포내 단백질 발현이 용이하도록 설계된 프로모터 서열 및 분비 서열, 예를 들면 단백질 분비가 용이하도록 설계된 이종의 신호 서열을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 서열은 당업자에게 알려져 있다. 추가의 뉴클레오티드 잔기 서열, 예를 들면 단백질 결합 영역을 특정하는 염기 서열은 효소-코드화 핵산 분자에 결합될 수 있다. 이러한 영역은 효소의 특정한 목표 세포로의 섭취를 촉진하거나 촉진된 단백질을 코드화하거나, 그렇지 않으면 합성 유전자의 생성물의 약력학을 변경하는 잔기 서열을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 효소는 PEG 잔기에 결합될 수 있다.
또한, 태그 또는 다른 잔기는 예를 들면 폴리펩티드의 감지 또는 친화성 정제를 돕기 위해서 첨가될 수 있다. 예를 들면, 에피토프 태그 또는 다른 감지성 마커를 특정하는 염기의 서열과 같은 추가의 뉴클레오티드 잔기 서열은 효소 코드화 핵산 분자에 결합될 수 있다. 이러한 서열로는 His 태그(예를 들면, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 54) 또는 플래그 태그 (DYKDDDDK; 서열번호 55)를 포함한다.
상기 확인되고 단리된 핵산은 이어서 충분한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 당분야에서 공지된 많은 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하지만 이들로 한정되지 않지만, 벡터 시스템은 사용된 숙주 세포와 양립되어야만 한다. 이러한 벡터는 박테리오파지, 예를 들면 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예를 들면 pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 Bluescript 벡터 (Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 다른 발현 벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현벡터를 포함한다. 클론 벡터에 삽입은, 예를 들면 DNA 단편을 상보성 점착성 말단을 갖는 클로닝 벡터에 결합하여 달성될 수 있다. TOPO 클론 벡터(INVITROGEN, Carlsbad, CA)를 사용하여 삽입될 수 있다. DNA를 절단하는데 사용되는 상보성 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않으면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 원하는 부위는 DNA 말단에 뉴클레오티드 서열(링커)를 결합하여 생성될 수 있고; 이들 결합된 링커는 제한 엔도뉴클레라제 인식 서열을 코드화한 특정한 화학적으로 합성되는 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안의 방법으로, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 호모폴리머 테일링에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 예를 들면 형질변환, 형질감염, 감염, 전기천공법 및 초음파천공법을 통해 숙주주세포에 도입되어 많은 카피의 유전자 서열이 발생된다.
인슐린은 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들면, Ladisch 등 (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478). 일부 예에서, 프레프로인슐린 또는 프로인슐린 폴리펩티드를 코드화하는 핵산이 발현 벡터에 삽입된다. 발현시에 프레프로인슐린 또는 프로인슐린 폴리펩티드가 신호 서열 및/또는 C 펩티드를 절단하는 효소 또는 화학적 방법에 의해 인슐린으로 전환되어, 예를 들면 환원-재산화 반응을 통해 이황화 결합에 의해 가교된 A-사슬 및 B-사슬이 발생된다(Cousens et al., (1987) Gene 61 :265-275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154 참조). 다른 예에서, 인슐린의 A-사슬 및 B-사슬을 코드화하는 핵산이 하나의 발현벡터로부터 하나의 폴리펩티드로서 공동 발현 또는 하나 또는 2개의 발현벡터로부터 2개의 폴리펩티드로서 발현을 위해 하나 또는 2개의 발현 벡터에 삽입된다. 따라서, A 및 B-사슬 폴리펩티드가 C 사슬 없이 별개로 발현된 후 인슐린을 생성하기 위해 결합되거나 공동 발현될 수 있다. A-사슬 및 B-사슬이 하나의 폴리펩티드로서 공동 발현되는 예에서, 서브유닛을 코드화하는 핵산은 또한 B-사슬과 A-사슬 사이에 링커 또는 스페이서, 예를 들면 하기에 기재된 링커 또는 스페이서를 코드화할 수 있다. 발현벡터에 삽입된 핵산은, 예를 들면 인슐린 B-사슬을 코드화 하는 핵산, 링커, 예를 들면 알라닌-알라닌-리신 링커 및 A-사슬을 포함하여 예를 들면 "인슐린 B-사슬-Ala-Ala-Lys-인슐린 A-사슬"을 발현시킨다.
특정한 구현예에서, 단리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 통합한 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 혈질변환하여 유전자의 다중 복제를 발생시킬 수 있다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 단리하고, 필요에 따라서 단리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수이동함으로써 다량의 유전자를 얻을 수 있다.
1. 벡터 및 세포
예를 들면 본원에 기재된 하나 이상의 원하는 단백질의 재조합 발현을 위해, 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산이 적당한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코드화 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터에 삽입될 수 있다. 필요한 전사 및 번역 신호가 또한 효소 유전자의 고유 프로모터 및/또는 그 인접영역에 의해 공급될 수 있다.
또한, 효소를 코드화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 제공된다. 세포는 진행생물 및 원핵생물 세포를 포함하고 벡터가 본원에 사용하는데 적절한 임의의 것이다.
벡터를 함유하는 내피세포를 포함한 원행생물 및 진핵생물 세포가 제공된다. 이러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세균, 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 세포는 코드화된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기 기재된 세포를 성장시키고 발현된 단백질을 회수함으로써 단백질을 생산하는데 이용할 수 있다. 이를 위해서, 예를 들어 효소는 배지에 분비될 수 있다.
자연 또는 이종 신호 서열에 결합된 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 벡터, 뿐만아니라 다중 복제물이 제공된다. 벡터는 효소 단백질을 분비된 단백질로서 발현되도록 세포에 효소 단백질의 발현을 위해 선택될 수 있다.
다양한 숙주 백터 시스템이 서열을 코드화하는 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예를 들면, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 다른 바이러스)에 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예를 들면, 바큐로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효모 등의 미생물; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA에 의해 변형된 박테리아를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 벡터의 발현요소는 길이 및 특이성에서 다양하다. 사용된 숙주벡터 시스템에 따라서, 많은 적당한 전사 및 번역 요소 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터 삽입하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법은 적당한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 함유하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성방법 및 생체내의 재조합(유전자 재조합)을 포함할 수 있다. 단백질, 또는 도메인, 유도체, 단편 또는 그 유사체를 코드화하는 핵산 서열의 발현은 유전자 또는 그 단편이 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된 숙주에서 발현되도록 두번째 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 발현은 당분야에 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정한 구현예에서, 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 대해 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 (Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 사르코마 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 함유된 프로모터 (Yamamoto 등. Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster 등, Nature 296:39-42 (1982)); 원핵생물 발현벡터, 예를 들면 β-락타마제 프로모터 (Jay 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); "재조합 박테리아로부터 유용한 단백질" :in Scientific American 242:79-94 (1980) 참조); 노파린 합성효소 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터 (Herrara-Estrella 등, Nature 303:209- 213 (1984)) 또는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (Garder 등, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 프로모터 (Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120 (1984)); 효모 및 다른 진균류 유래 프로모터 요소, 예를 들면 Gal4 프로모터, 알콜 탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에 사용되는 하기의 동물 전사 조절 영역: 췌장 선방세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift 등, Cell 35:639-646 (1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan 등, Nature 315:115-122 (1985)), 임파구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절영역 (Grosschedl 등, Cell 38:647-658 (1984); Adams 등, Nature 375:533-538 (1985); Alexander 등, MoI. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 임파구 및 비만 세포에서 활성인 마우스의 유방 종양 바이러스 조절 영역 (Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinckert 등, Genes andDevel. 7:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-페트로프로테인 유전자 조절 영역(Krumlauf 등, MoI. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer 등, Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 안티트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey 등, Genes andDevel. 7:161-171 (1987)), 골수세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Magram 등, Nature 375:338-340 (1985); Kollias et al, Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead 등, Cell 48:103-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Shani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 성선자극세포에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason 등, Science 234:1372-1378 (1986))을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 원하는 단백질 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 임의적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS II), 6XHis 태그 코딩서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 상기 플라스미드는 세개의 판독프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허 4,952,496 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 상기 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-TagTM 리더서열, 및 컬럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 부위 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
포유류 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.
2. 링커 잔기
일부 예에서, 인슐린은 예를 들면 B-사슬의 C 말단이 A-사슬의 N 말단에 짧은 링커로 결합되도록 A-사슬 및 B-사슬 폴리펩티드를 링커와 함께 생성시킴으로써 제조된다. A-사슬 및 B-사슬은 링커를 함유하는 하나의 폴리펩티드로부터 발현될 수 있고, 별개로 발현된 후 링커에 결합될 수 있다. 링커 잔기는 원하는 특성에 따라서 선택된다. 링커 잔기는 A-사슬 및 B-사슬이 인슐린의 고유 형태와 유사하도록 하기 위해서 충분히 길고 충분히 유연해야 한다. 링커는 인슐린 A-사슬 및 B-사슬에 적당한 임의의 잔기이다. 이러한 잔기는 펩티드 연결; 일반적으로 하나 내지 약 60 아미노산 사이를 함유하는 아미노산 및 펩티드 연결; 화학적 링커, 예를 들면 이종 2관능성 절단 가교제, 광절단 링커 및 산절단 링커를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
링커 잔기는 펩티드일 수 있다. 펩티드는 일반적으로 약 2 내지 약 60 아미노산 잔기, 예를 들면 약 5 내지 약 40, 약10 내지 약 30 아미노산 잔기를 갖는다. 편의에 따라서, 펩티드 링커는 숙주세포, 예를 들면 E.coli에 발현시에 핵산에 의해 코드화되고 융합 단백질에 통합될 수 있다. 일예에서, 알라닌-알라닌-리신(AAK)(서열번호 178)링커는 발현시 "인슐린 B 세포-AAK-인슐린 A-사슬" 폴리펩티드가 생성되도록 인슐린 B-사슬을 코드화하는 핵산과 A-사슬을 코드화하는 핵산 사이의 핵산에서 코드화된다. 펩티드 링커는 신축성 스페이서 아미노산 서열, 예를 들면 단일 사슬 항체 연구에서 알려진 것일 수 있다. 이러한 공지의 링커 잔기로는 RPPPPC (서열번호 166) 또는 SSPPPPC (서열번호 167), GGGGS (서열번호 168), (GGGGS)n (서열번호 169), GKSSGSGSESKS (서열번호 170), GSTSGSGKSSEGKG (서열번호 171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (서열번호 172), GSTSGSGKSSEGKG (서열번호 173), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 174), EGKSSGSGSESKEF (서열번호 175), SRSSG (SEQ. ID NO: 176) 및 SGSSC (서열번호 177)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
대안적으로, 펩티드 링커 잔기는 VM(서열번호 179) 또는 AM(서열번호 180)일 수 있고, 또는 하기 식으로 기재된 구조를 갖는다:AM(G2 내지 4S)XAM , 여기서, X는 1 내지 11의 정수이다(서열번호 181). 추가의 결합 잔기가, 예를 들면, Huston 등.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Whitlow, M., 등. (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton 등. (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber 등. (1992) Bioconj. Chem. 3:397- 401; Ladurner 등. (1997) J. MoI. Biol. 273:330-337; 및 미국특허 4,894,443호에 기재되어 있다.
일부 예에서, 펩티드 링커는 숙주세포, 예를 들면 E.coli 또는 S.cerevisiae에서 발현시 핵산에 의해 코드화되고 B-사슬과 A-사슬 사이에 통합된다. 다른 예에서, 펩티드 링커는 화학적인 방법에 의해 합성된다. 이것은 성분이 결합된 후 A-사슬와 B-사슬 중 하나 이상의 합성에 대해 예를 들면 이종 2관능성 링커를 사용하여 별개의 프로토콜로 실시될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 링커는 하나의 인슐린 사슬 중 하나의 N 또는 C 말단에서 합성되고, 펩티드 링커, 예를 들면 이종 2관능성 링커를 통해 다른 사슬에 결합될 수 있다.
본원에서 당업자에게 알려진 링커를사용하여 인슐린 A-사슬 및 B-사슬을 결합할 수 있다. 사슬을 화학적으로 결합하는데 적당한 링커 및 연결은 이황화 결합, 티오에테르 결합, 힌더드 이황화 결합 및 유리 반응성기, 예를 들면 아민기 및 티올기 사이의 공유결합을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 이들 결합은 이종 관능성 시약을 사용하여 하나 또는 2개의 폴리펩티드에 반응성 티올기를 생성한 후 하나의 폴리펩티드의 티올기와 반응성 티올기 또는 아민기를 반응시켜 반응성 말레이미도기 또는 티올기가 다른 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 다른 링커는 산절단 링커, 예를 들면 더욱 산성인 세포간 구획에서 절단될 수 있는 비스말레이미도에톡시 프로판, 산 불안정한-트랜스페린 콘쥬게이트 및 아디프산 디히드라지드; UV 또는 가시광에 노출시에 절단되는 크로스 링커; 및 링커, 예를 들면 인간 IgGl의 불변 영역으로부터 각종 도메인, 예를 들면 CH1, CH2, 및 CH3를 포함한다(Batra 등 (1993) Molecular Immunol. 30:379-386 참조). 일부 구현예에서, 각각의 링커의 원하는 특성을 이용하기 위해서 여러개의 링커가 포함될 수 있다. 화학적 링커 및 펩티드 링커는 인슐린 A-사슬 및 B-사슬에 링커를 공유결합함으로써 삽입될 수 있다. 하기에 기재된 이종 2관능성제는 이러한 공유 결합에 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 B-사슬과 A-사슬 사이에 링커를 코드화하는 DNA 를 발현함으로써 결합될 수 있다.
인슐린의 A-사슬 및 B-사슬을 결합하는데 사용될 수 있는 다른 링커는 효소 기질, 예를 들면 카텝신 B 기질, 카텝신 D 기질, 트립신 기질, 트롬빈 기질, 서브틸리신 기질, 제 Xa인자 기질 및 엔테로키나제 기질을 포함하고; 용해도, 유연성, 및/또는 세포간 절단성을 증가시킨 링커는 링커들, 예를 들면 (glymser)n 및 (sermgly)n를 포함하고, 여기서 m은 1 내지 6이고, 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2 내지 4이고 n은 1 내지 30, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 4이다(예를 들면 국제 PCT 출원번호 WO96/06641, 여기서 예시의 링커를 제공한다). 일부 구현예에서, 각각의 링커의 원하는 특성을 이용하기 위해 여러 개의 링커가 포함될 수 있다.
3. 발현
인슐린 및 히알루로난 분해효소 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내 방법을 포함한 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 원하는 단백질은 예를 들면 투여 및 치료에 필요로 되는 단백질의 필요한 양 및 형태를 생성하는데 적당한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주는 원핵생물 및 진핵생물 유기체, 예를 들면, E.coli, 효모, 식물, 곤충 세포, 사람 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한 포유류 세포를 포함한다. 발현숙주는 단백질 생성 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역후 변형의 형태와 다르다. 발현 숙주의 선택은 이들 및 다른 요소, 예를 들면 규제 및 안전성 고려 사항 및 생산비용 및 정제의 필요성 및 방법에 기초하여 행해질 수 있다.
많은 발현벡터들이 시판되고 당업자에게 알려져 있으며 단백질 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받을 것이다. 일반적으로, 전사 프로모터 및 임의의 인핸서, 번역 신호 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전화에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지하게 하는 선별 마커를 갖는다. 일부 경우에, 벡터의 카피수를 증폭시키기 위해 클로닝 기점이 이용될 수 있다.
가용성 히알루로니다제 폴리펩티드는 단백질 융합으로서 이용되거나 발현될 수 있다. 예를 들면, 효소 융합은 효소에 추가적인 기능을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소 융합 단백질로는 신호 서열, 국소화를 위한 태그, 예를 들면, his6 태그 또는 myc 태그 또는 정제용 태그, 예를 들면 GST 융합 및 단백질 분비 및/또는 멤브레인 연합을 지시하는 서열을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고, 그러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터, 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레오톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사의 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 초래할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자 유래 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우 단백질은 불용성이 되며, 재용해 및 리폴딩을 촉진하기 위해 변성화제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코실화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 그러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 대개 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 대개 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와 공동-발현은 발현수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단부위는 분비경로를 탈출시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로니다제 폴리펩티드의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 규제 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.
곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 슈나이더 2(Schneider 2, S2) 및 Kc 세포(노랑 초파리 (Drosophila melanogaster)) 및 C7 세포(흰줄숲모기 (Aedes albopictus))가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드를 포함한, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 전달할 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(코작 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 부위가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 부위의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특정배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 사이에서 나뉜다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스 이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 히알루로니다제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
4. 정제기술
숙주세포로부터, 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 우유 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 분야의 표준 방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 인슐린 폴리펩티드 또는 히알루로니다제 분해 효소 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 히알루로니다제 효소에 결합하는 다른 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔 전기영동, 직교 HPLC 방법, 염색 및 분광광도기법을 포함한, 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다.
F. 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드의 제조, 제형화 및 투여
속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 약제학적 조성물이 투여를 위하여 본원에서 제공된다. 히알루로난 분해 효소는 흡수 속도를 증가시키고 인슐린의 생체이용률을 증가시킴으로써 혈액으로의 속효성 인슐린의 전달을 향상시키기 위하여 속효성 인슐린의 약제학적 조성물과 공동-제형화 또는 공동-투여된다. 흡수 속도와 생체이용률의 증가는 예를 들면 일시적으로 (일반적으로 24시간 미만의 기간 동안) 피하 공간의 유압 전도도를 증가시키는, 히알루로난 분해 효소에 의한 히알루로난의 가역적 탈중합화에 의하여 달성될 수 있다. 따라서, 히알루로난 분해 효소를 이용하여 비경구, 예컨대, 피하 투여 후 상승되고/되거나 더욱 빠르게 달성되는 인슐린의 농도를 달성하여, 통상적인 방법의 피하 투여와 비교하여, 예컨대 주어진 용량에 대한 더욱 강력하고/하거나 더욱 빠른 반응을 제공할 수 있다. 따라서, 속효성 인슐린과 히알루로난 분해 효소의 공동-투여는 속효성 인슐린을 초속효성 인슐린으로 만들 수 있다. 또한 히알루로난 분해 효소를 이용하여 투여 인슐린의 더 낮은 용량으로 혈당 조절을 달성할 수 있다. 주사 또는 주입 부위에서 또는 그 근처에서 벌크 유체 흐름을 향상시키는 히알루로난 분해 효소의 능력은 또한 연관된 약리 전달의 다른 국면을 개선할 수 있다. 예를 들면, 벌크 유체 흐름의 증가는 주사된 유체의 부피가 더욱 쉽게 주사 부위로부터 분산되도록 하는 것을 돕는다 (주사의 잠재적인 통증 또는 다른 불리한 결과를 감소시킴). 이는 피하 주입이 더 많은 용량을 투여되도록 한다는 점에서 특히 중요하다.
따라서, 흡수 속도의 증가에 의하여, 비경구로-투여된 속효성 인슐린은 히알루로난 분해 효소와 투여시 초속효성 인슐린이 될 수 있다. 히알루로난 분해 효소가 없는 인슐린 투여에 대한 장점은 공동-투여되거나 공동-제형화된 히알루로난 분해효소/인슐린이 더욱 우호적인 투약요법, 예컨대, 더 낮은 인슐린 용량 및/또는 더욱 효과적인 폐루프시스템의 이용, 및 개선된 치료 효과, 예컨대, 더욱 효율적인 혈당 조절 및/또는 과잉의 인슐린 감소를 제공할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 용량을 낮춤으로써, 과잉의 순환 인슐린과 관련된, 예컨대 더 고 용량의 인슐린에서 관찰되는 부작용이 감소될 수 있다. 상기 부작용은 저혈당증 및 비만을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
상기 조성물은 동결건조 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다. 조성물이 동결건조 형태로 제공되는 경우, 그들은 적절한 용액, 예컨대, 주사용 멸균 식염수 용액 또는 멸균수에 의한 이용 직전에 재구성될 수 있다. 조성물은 함께 또는 별개로 제공될 수 있다. 예를 들어, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소는 단일 조성물 내에 공동-제형화되거나, 별개의 조성물로써 제공될 수 있다. 별개의 조성물로써 제공되는 경우, 히알루로난 분해 효소 및 인슐린은 함께, 순차적으로, 또는 간헐적 투여를 위하여 포장될 수 있다. 상기 조합물은 키트로써 포장될 수 있다.
1. 제형화
상기 화합물은 비경구 투여를 위한 임의의 적절한 약제학적 제제, 예컨대, 용액, 현탁액, 지속방출 제형 또는 분말 내에 제형화될 수 있다. 전형적으로, 상기 화합물은 당 분야에서 잘 알려진 기법 및 절차를 이용하여 약제학적 조성물 내에 제형화될 수 있다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조). 약제학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관에 대한 승인을 고려하여 제조된다. 제형은 투여 방식에 적합하여야 한다.
약제학적 조성물은 히알루로난 분해 효소 및 인슐린과 함께 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 그러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 상기 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체 담체로써 활용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 함께 다음을 함유할 수 있다: 증량제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 인산이칼슘, 또는 카르복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검(gums), 예컨대 검 아카시아젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 알려진 다른 그와 같은 결합제. 적절한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크(chalk), 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세린, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 소디움 시트레이트, 글리세린, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소디움 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 다른 그와 같은 제제를 포함할 수 있다.
약제학적 치료용 활성 화합물 및 그의 유도체는 일반적으로 단위 제형(unit dosage form) 또는 다중 제형(multiple dosage form)으로 제형화 및 투여된다. 각각의 단위 투여량은, 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 예정된 양의 치료용 활성 화합물을 포함한다. 단위 제형의 예는 앰플 및 주사기 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위 제형은 분획으로 또는 그의 다중으로 투여될 수 있다. 다중 제형은, 분리된 단위 제형으로 투여될 단일 용기에 포장되어 있는 여러개의 동일한 단위 제형이다. 다중 제형의 예는 바이알, 카트리지, 정제 또는 캡슐의 병, 또는 파인트(pint) 또는 갤론(gallon)의 병이 포함된다. 따라서, 다중 제형은 포장에서 분리되어 있지 않은 복수의 단위 용량이다. 일반적으로, 무독성 담체로 나머지를 채워, 0.005% 내지 100% 범위의 활성 성분을 포함하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
본원에서 제공되는 조성물은 비록 다른 투여 경로, 예컨대, 근육내, 복강내, 정맥내, 진피내, 병변내, 복강내 주사, 경막외, 질, 직장, 국부, 귀, 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함한, 당업자에게 알려진 임의의 경로가 고려되지만, 전형적으로 피하 경로에 의한 투여를 위하여 제형화된다. 그러한 경로에 적합한 제형은 당업자에게 알려져 있다. 투여는 치료 위치에 따라 국부(local), 국소(topical) 또는 전신일 수 있다. 치료를 요하는 지역에 국부투여는 예컨대, 수술중 국부주입, 국소적용, 예를 들어, 수술후 상처드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물 내에 투여될 수 있다.
임의의 주어진 경우의 가장 적절한 경로는 다양한 요인들, 예컨대 질환의 성질, 특정 투여 경로에 대한 대상체의 관용성, 질환의 중증도 및 사용되는 특정 조성물에 좌우된다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 조성물은 비경구적으로 투여된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해 효소는 피부 또는 조직의 간질에 도달하여 뒤이은 인슐린의 전달을 위하여 간질 공간을 분해하도록 투여된다. 따라서, 일부 예에서, 피하 투여 방법에 의하는 것과 같은, 피부 하 직접 투여가 고려된다. 따라서, 한 예에서, 국부 투여는 예컨대, 주사기 또는 인슐린 펜 또는 바늘과 같은 주사 장치를 포함하는 다른 제조품으로부터 주사에 의하여 달성될 수 있다. 다른 예에서, 국부 투여는 주입에 의해 달성될 수 있으며, 이는 펌프 또는 기타 유사 장치를 이용하여 촉진될 수 있다. 다른 방식의 투여가 또한 고려된다. 약제학적 조성물은 개별 투여 경로에 적합한 제형으로 제형화될 수 있다.
일반적으로 주사 또는 주입을 특징으로 하는 피하 투여가 본원에서 고려된다. 주사가능물질(injectables)은 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체 내 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로써, 또는 에멀젼으로써 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤 또는 에탄올이다. 약제학적 조성물은 다른 소량의 비-독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증진제, 및 다른 그와 같은 작용제, 예컨대 소디움 아세테이트, 소디움 포스페이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로덱스트린을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아연, 칼슘, 혈청 알부민, EDTA, 염화칼슘 및/또는 페놀성 보존제가 조성물 내에 포함될 수 있다. 그러한 조성물 내 포함되는 활성 화합물의 백분율은 그의 특이적 성질뿐 아니라 화합물의 활성 및 대상의 필요에 크게 좌우된다.
주사가능물질은 국부 및 전신투여를 위하여 설계된다. 본원의 목적을 위해, 국부투여는 환부인 간질에 직접 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액; 주사정(hypodermic tablets)을 포함한, 사용직전 용매와 결합되도록 준비된 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조 분말; 주사용으로 준비된 멸균 현탁액; 사용 직전에 비히클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품; 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산완충식염수(PBS), 및 가용화제와 증점제(thickening agents), 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한 용액을 포함한다.
비경구 제제에서 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충액, 항산화제, 국소마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제(sequestering agents) 또는 킬레이트제, 및 다른 약제학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로즈 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로즈 및 락테이티드(Lactated) 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 채소 기원의 고정유(fixed oils), 면실유, 옥수수기름, 참기름 및 낙화생유를 포함한다. 항미생물제는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도로 복수-투여 용기로 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있고, 페놀 또는 크레솔, 수은제(mercurials), 벤질알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로즈를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨(sodium bisulfate)을 포함한다. 국소마취제는 염산프로카인을 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리솔베이트 80(TWEEN 80)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약제학적 담체는 또한 수-혼화성(water miscible) 비히클로 에틸알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과, pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.
주사 또는 주입이 원하는 약리 효과, 예컨대 혈당 조절을 나타내는 유효량을 제공하도록 약제학적으로 활성인 화합물의 농도가 조정된다. 정확한 투여량은 당 분야에 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 좌우된다. 단위-용량 비경구 제제는 예컨대 앰플, 카트리지, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기 내에 포장될 수 있다. 약리학적으로 활성인 화합물을 함유하는, 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는 치료할 질환과 포장을 위해 선택된 특정 제조품의 함수이다. 당업계에 알려지고 실행되는 바와 같이, 비경구 투여를 위한 모든 제제는 멸균되어야 한다.
한 예에서, 약제학적 제제는 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 액체 형태로 제공된다면, 약제학적 제제는 사용 전에 치료적 유효 농도로 희석될 수 있는 농축된 제제로써 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 약제학적으로 허영가능한 첨가제, 예를 들어, 현탁화제 (예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예컨대, 아몬드유, 오일 에스테르, 또는 분획화 채소유); 및 보존제 (예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)을 가지고 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 다른 예에서, 약제학적 제제는 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클과 함께 재구성하기 위한 동결건조 형태로 제공될 수 있다.
속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 조성물은 단일 조성물로써 공동-제형화되거나, 2개의 별개의 조성물로써 제공될 수 있다. 2개의 조성물로써 제공되는 경우, 조성물은 공동-투여되는 투여 전에 혼합되거나, 분리되어 유지되고 이어서 함께, 순차적으로 또는 간헐적으로 공동-투여될 수 있다. 일부 예에서, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소는 초속효성 인슐린 조성물로써 공동-제형화된다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 조성물은 단일 또는 복수의 투여량을 위하여 제형화될 수 있으며, 여기서 투여량은 투여되는 인슐린에 대한 히알루로난 분해 효소의 양의 비로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 1 히알루로니다제 U/인슐린 U(1:1) 내지 50:1 이상, 예를 들어, 약 또는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 이상으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 예를 들어, 1 히알루로니다제 U/ 2 인슐린 U (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 또는 1:20 을 포함한, 히알루로난 분해 효소 대 인슐린의 더 낮은 비로 투여될 수 있다. 속효성 인슐린은 약 또는 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml 또는 500 U/mL의 농도로 공동-제형화된 또는 별개의 조성물 내에 존재할 수 있다. 전형적으로, 공동-제형화된 또는 별개의 조성물 내 히알루로난 분해 효소의 양은 적어도 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL 또는 25 U/mL 의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등하다. 일부 예에서, 공동-제형화된 또는 별개의 조성물 내 히알루로난 분해효소의 양은 적어도 또는 30 또는 35 U/mL 의 히알루로니다제 활성, 예컨대 또는 30 U/mL, 35 U/mL, 37.5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL 또는 5000 U/mL의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등하다.
본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물은 하나 이상의 pH 완충액(예컨대, 히스티딘, 인산, 트리스 또는 다른 버퍼), 또는 산성 완충액 (예컨대, 아세테이트, 시트레이트, 피루베이트, Gly-HCl, 숙시네이트, 락테이트, 말레이트 또는 다른 버퍼), 등장화제 (예컨대, 아미노산, 폴리알콜, 글리세롤, NaCl, 트레할로스, 다른 염 및/또는 당), 안정화제 (예컨대, 인슐린을 안정화하는 소디움 벤조에이트), 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세테이트 또는 칼슘 EDTA와 같은 킬레이트제, 메티오닌, 아스코르브산/아스코르베이트, 시트르산/시트레이트, 또는 알부민과 같은 탈산소제, 및/또는 방향환을 포함하는 보존제 (예, 페놀 또는 크레솔)와 같은 보존제를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물에 유용한 보존제의 예는 m-크레솔, 페놀 및 파라벤 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 예에서, m-크레솔은 약 또는 0.05% 내지 0.2%, 예컨대 0.1% 내지 0.15% (예컨대, 약 또는 0.1%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0.14% 또는 0.15%)로 첨가된다. 페놀 또는 파라벤의 적절한 농도는 0.05-0.25%, 예를 들면 0.1% 내지 0.2% (예컨대, 약 또는 0.1%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.18%, 0.19% 및 0.2%)를 포함한다. 전형적으로, NaCl 또는 다른 염이 히알루로난 분해 효소를 포함하는 조성물 내에 제공된다. NaCl 의 농도의 예는 50 mM 내지 200 mM, 예컨대, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM 및 150 mM NaCl 를 포함한, 50 mM 내지 150 mM 를 포함한다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 조성물의 안정성을 유지하기 위하여, 조성물 내 염 농도가 증가되면, pH 역시 증가된다. 글리세롤이 또한 등장화제로써 및/또는 조성물의 점성을 증가시키기 위하여 포함될 수 있다.
히알루로난 분해 효소를 포함하는 조성물에 유용한 안정화제의 예는 세제 또는 계면활성제, 예컨대 폴리솔베이트 및 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 계면활성제 (예컨대, 플루로닉 F68)가 조성물 내에, 예컨대 약 또는 0.001% 내지 0.1%, 전형적으로 약 또는 0.005% 내지 0.03% (예, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.012%, 0.014%, 0.016%, 0.018%, 0.02% 또는 0.03%)로 포함된다. 본원의 조성물 내에 유용한 혈청 알부민의 농도의 예는 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL 또는 1 mg/mL 을 포함하나, 더 많거나 더 적을 수 있다. 또한 폴리솔베이트는 조성물 내에, 예컨대 약 또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 00.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 의 농도로 존재할 수 있다. 인슐린을 포함하는 조성물에 유용한 안정화제의 예는 아연 및 m-크레솔을 포함한다. 예를 들어, 아연은 인슐린 헥사머를 안정화하는 기능을 할 수 있다. 아연은 예를 들어 산화아연, 아세테이트산 아연 또는 염화아연으로써 제공될 수 있다. 아연은 본원에서 제공되는 조성물 내에 인슐린 100 유닛 당 약 또는 0.001 내지 0.1 mg 사이, 예컨대 인슐린 100 유닛 당 0.002 밀리그램 (mg/100 U), 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.28 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U 또는 0.1 mg/100 U 로 존재할 수 있다. 한 예에서, 아연은 100U 인슐린 당 0.017mg 존재한다. 금속 킬레이트제, 예컨대 칼슘 EDTA (CaEDTA)는 또한 예컨대 약 0.02 mM 내지 20 mM 사이, 예컨대 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 또는 그 이상으로 존재할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 조성물 내에 킬레이트제와 아연 둘다가 존재하는 경우, 킬레이트제는 아연과 대략 동일한 양으로 (즉, 0.6 내지 1.4 몰비), 또는 몰 초과로, 예컨대, 약 또는 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 또는 그 이상의 킬레이트제:아연의 비율로 존재한다. 염화칼슘은 또한 조성물 내에 예를 들어 약 0.2 mM 내지 20 mM 사이로 포함될 수 있다.
일부 예에서, 상기 기재된 성분들 중 임의의 하나 이상은 2개의 조성물이 공동-제형화되거나, 초속효성 인슐린 조성물로써 대상체에 전달될 때까지 속효성 인슐린 조성물 또는 히알루로난 분해 조성물 둘 중 하나에만 존재한다. 예를 들어, 속효성 인슐린 조성물은 EDTA와 같은 킬레이트제 없이 아연을 인슐린 100 유닛 당 약 또는 0.001 내지 0.1 mg, 예컨대 인슐린 100 유닛 당 0.002 밀리그램(mg/100 U), 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.28 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U 또는 0.1 mg/100 U 으로 포함하는 반면, 히알루로난 분해 조성물은 킬레이트제, 예컨대 EDTA를 약 또는 0.02 mM 내지 20 mM, 예컨대 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 또는 그 이상으로 포함하나 아연은 포함하지 않는다. 따라서, 인슐린을 포함하는 조성물이 또한 EDTA 도 포함하고, 히알루로난 분해 효소를 포함하는 조성물이 또한 아연도 포함하는 것은 2개 조성물이 혼합되었을 때, 예컨대 공동-제형화되거나, 공동-투여되는 때 뿐이다. 일부 경우에서, 초기 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해 효소 조성물은 공동-제형화 또는 공동-투여를 위한 혼합시 킬레이트제가 대략 몰당량 (즉, 0.6 내지 1.4 몰비)으로, 또는 아연에 대하여 몰 초과로, 예컨대, 약 또는 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 또는 그 이상의 킬레이트제:아연의 비로 존재하는 충분한 양의 아연 또는 킬레이트제를 각각 포함한다.
조성물의 pH 및 오스몰 농도는 조성물의 원하는 활성 및 안정성을 위한 조건을 최적화하도록 당업자에 의해 조정될 수 있다. 예를 들어, 상기 인식된 바와 같이, 일부 경우, 염 농도가 증가한다면, pH 가 또한 조성물의 안정성을 유지하기 위해 증가될 수 있다. 또한, 당업자는 pH 를 변경하여 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린에 이용되는 특정 속효성 인슐린의 용해도를 증가시킬 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 조성물은 약 또는 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 또는 그 이상의 mOsm/kg 의 오스몰 농도, 및 약 또는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8 의 pH 를 가진다. 일부 예에서, 약 또는 6.5 내지 약 또는 7.5, 예컨대 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 의 pH.
투여방법은 분해적 과정, 예컨대 단백질가수분해적 분해, 및 항원성 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 개입에 대한 선택된 화합물의 노출을 감소시키도록 채택될 수 있다. 상기 방법의 예는 치료 부위에의 국부 투여를 포함한다. 치료제의 페길화가 단백질가수분해에 대한 저항성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 페길화 방법론의 예는 당 분야에 알려져 있다 (예컨대, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S 참조). 페길화는 또한 생체내 핵산 분자의 전달에 이용될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (예컨대, Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51 참조).
동결건조 분말
용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로써 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조 분말이 본원의 관심이 된다. 이들은 또한 고체 또는 겔로써 재구성되고 제형화될 수 있다.
멸균되고 동결건조된 분말은 완충용액 내에 활성 화합물을 용해시켜 제조될 수 있다. 완충용액은 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말로부터 제조된, 분말 또는 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 그다음 용액의 멸균 여과후, 당업자에게 알려진 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 요약하면, 동결건조된 분말은 적절한 완충액, 예컨대 시트레이트, 트리스, 히스티딘, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 당업자에게 알려진 기타 그와 같은 완충액에 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 또는 기타 적절한 작용제를 용해시켜 제조된다. 그다음, 선택된 효소를 생성된 혼합물에 첨가하고, 용해될까지 교반한다. 생성된 혼합물을 멸균 여과하거나, 미립자를 제거하고 무균성을 보장하기 위해 처리하여, 동결건조를 위한 바이알 내로 배분한다. 각각의 바이알은 화합물의 단일용량 또는 복수용량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다. 완충용액과 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여로 사용하기 위한 제형을 제공한다.
2. 투여량 및 투여
본원에서 제공되는 히알루로난 분해 효소는 단일 투여량 또는 다중 투여량 투여를 위한 약제학적 조성물로써 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 조성물은 히알루로난 분해 효소를 1 히알루로니다제 U/인슐린 U (1:1) 내지 50:1 또는 그 이상, 예컨대, 약 또는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 또는 그 이상으로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 예를 들어, 1 히알루로니다제 U/2 인슐린 U(1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 또는 1:20 을 포함하여, 히알루로난 분해 효소 대 인슐린의 더 낮은 비율이 상기 조성물 내에 제공된다. 선택된 히알루로난 분해 효소는 치료되는 환자에 바람직하지 않은 부작용이 없이 치료적으로 유용한 효과를 달성하기에 충분한 양으로 포함된다. 치료적 유효 농도는 알려진 시험관내 및 생체내 시스템에서 폴리펩티드를 시험하여, 예컨대, 본원에서 제공되거나 당 분야에 알려진 검정법(예컨대, Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; see also e.g, Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 참조) 을 이용하여 경험적으로 결정되고, 이어서 그로부터 인간에 대한 투여량에 대하여 외삽될 수 있다.
속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소를 포함하는 초속효성 인슐린 조성물에 대한 치료적 유효 투여량은, 예를 들어 하기 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 약동학(PK) 데이터 및 약력학(PD) 데이터, 및 히알루로난 분해 효소 없이 전달되는 경우 속효성 인슐린의 알려진 치료적 용량에 기초하여 결정될 수 있다. 시간에 따른 혈액 또는 혈장 또는 혈청 내 인슐린 농도의 변화는 생체내 인슐린의 (1) 비경구 투여에 대한 흡수; (2) 분포, 및 (3) 제거에 대한 정보를 제공한다. 약동학 모델은 인슐린 농도의 이러한 생리학적 변화를 시간의 함수(즉, (dX)/(dt))로써 정의하며, 속도와 부피를 이용하여 수학적으로 이들을 특징짓는다. 따라서, 인슐린에 대하여 도출된 모델 매개변수는 작은 변화가 발생할 때까지 상대적으로 일정하게 유지될 것이다. 인슐린에 대하여 잘 확립된 PK 모델은 (과대 약리학에 기인한 효능 및 약물 안전성에 밀접하게 관련된) 노출의 합리적인 예측을 제공한다. 인슐린의 투여량 선택 및 투여량 스케쥴에 대한 임상적 결정은 PK 모델링 및 모의실험을 이용하여 용이해지고, 정당화될 수 있다. 약력학 모델은 임상적 결과의 예측을 위한 유사한 목적을 제공한다.
전형적으로, 히알루로난 분해 효소의 치료적 유효 용량은 약 또는 0.3 유닛 (U) 내지 5,000 U 의 히알루로난 분해 효소이다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 약 또는 0.3 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 유닛, 5,000 U 또는 그 이상으로 피하로 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여량은 투여되는 인슐린에 대한 히알루로난 분해 효소의 양의 비로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 1 히알루로니다제 U/인슐린 U (1:1) 내지 50:1 또는 그 이상, 예를 들어 약 또는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 예컨대 1 히알루로니다제 U/ 2 인슐린 U (1:2), 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 또는 1:20 을 포함하여, 인슐린에 대한 히알루로난 분해 효소의 더 낮은 비로 투여될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 고려되는 히알루로난 분해 효소의 주사 또는 주입 부피는 약 또는 0.01 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 ml, 10 ml 또는 그 이상 부터이다. 히알루로난 분해 효소는 원액 용액으로써 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/mL, 600 U/mL, 800 U/mL 또는 1000 U/mL 로 제공되거나, 또는 직접 사용하거나, 사용 전에 유효 농도로 희석하기 위하여 예컨대 약 또는 2000 U/ml, 3000 Units/ml, 4000 U/ml, 5000 U/ml, 8000 U/ml, 10,000 U/mL 또는 20,000 U/mL 의 더욱 농축된 형태로 제공될 수 있다. 히알루로난 분해 효소는 액체 또는 동결건조 제형으로써 제공될 수 있다.
본원에서 제공되는 인슐린 제제는 단일 또는 다중 용량 사용을 위한 약제학적 조성물로써 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, 인슐린 제제는 식후 혈당 조절을 제공하기에 충분한 양으로 단일 용량 투여를 위하여 제형화된다. 다른 예에서, 인슐린 제제는 다중 투여량 투여, 또는 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 다른 연속적 인슐린 전달 장치와 같은 복수 사용 바이알, 또는 폐루프시스템을 위하여 제형화된다. 인슐린 제제는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 동결건조 또는 액체 형태로 제공될 수 있다.
인슐린은 치료적 유효 용량으로 제공될 수 있다. 치료적 유효 용량은 화합물을 공지된 시험관내 및 생체내 시스템, 예컨대, 본원에서 제공된 검정법으로 시험하여 경험적으로 결정될 수 있으며, 또한 대사, 음식물 섭취 및 질병의 중증도와 같은 인자에 기초하여 각 대상체에 대해 개별화될 수 있다. 조성물 내 선택된 인슐린의 농도는 예를 들어 착체의 흡수, 불활성화 및 배출 속도, 착체의 물리화학적 특성, 투여량 스케쥴 및 투여되는 양 뿐 아니라 당업자에게 알려진 기타 인자에 좌우된다. 예를 들어, 치료의 정확한 투여량은 대상체 내 혈당 수준의 함수이며, 알려진 알고리즘을 이용하거나, 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터, 대상체의 과거 경험, 식사 내 탄수화물 함량을 결정하는 탄수화물 계산 및 따라서 평가된 식사 혈당 증가 및 뒤이은 인슐린의 요구로부터의 외삽에 의해 경험적으로 결정될 수 있다고 이해된다. 농도 및 투여량 값은 치료되는 각 대상체에 따라 달라질 수 있음을 유의해야 한다. 어떤 특정 대상체에 대하여, 특이적 투약요법은 개별적 필요 및 상기 제형을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하며, 본원에 기재된 농도 범위는 단지 예시일 뿐이며, 그의 범위를 제한하려는 의도는 아니라는 것이 추가로 이해되어야 한다. 당뇨병 상태의 치료를 위하여 투여되는 선택된 인슐린 제제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검정법 및 동물 모델을 채택하여 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 도울 수 있다.
따라서, 경험적으로 결정될 수 있는 정확한 투여량은 특정 인슐린 제제, 히알루로난 분해 효소와의 요법 및 투여 스케쥴, 투여경로, 치료되는 당뇨병의 종류, 질병의 심각성 및 치료되는 대상체에 의존적일 수 있다. 일반적으로, 인슐린은 혈당 조절을 달성하는 양으로 제공된다. 예를 들어, 식후 혈당 조절을 달성하기 위하여, 당뇨병 대상체는 인슐린이 히알루로난 분해 효소 없이 전달되는 경우 전형적으로 식사 30분 내지 5분 전에 체중 kg 당 속효성 인슐린 약 또는 0.05 U (U/kg) 내지 1.0 U/kg의 1회분 주사로 투여된다. 상기 용량은 예를 들어 특정 대상체의 대사, 식사의 내용 및 혈당 수준에 기초하여 적절하게 증가 또는 감소될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 인슐린이 식후 혈당 조절을 위하여 전달되는 시간은 식사의 소화 시점에 더 가깝거나 또는 더 멀도록 변경될 수 있으며, 일부 경우, 인슐린이 식사시 또는 식사 후에 전달되도록 변경될 수 있다고 이해된다. 따라서, 인슐린이 단독으로 및/또는 인슐린 단독 투여량이 일반적으로 투여되는 시간과 비교하여 식사의 소화에 더 가까운 시점에 투여되는 것보다 더 낮은 용량으로 인슐린, 예컨대 속효성 인슐린을 히알루로난 분해 효소와 병용하여 투여함으로써 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물이 대상체에 투여된다.
속효성 인슐린은 비록 특정 용량은 다를 수 있지만 전형적으로 0.05 유닛/kg 내지 0.25 U/kg, 예컨대, 0.10 유닛/kg의 용량으로 투여된다. 초속효성 인슐린 조성물은 히알루로난 분해 효소 없이 투여되는 속효성 인슐린 조성물과 비교하여 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 속효성 인슐린의 양이 그것을 초속효성 인슐린 조성물로써 투여함으로써 낮추어질 수 있는 정도는 예를 들어, 환자의 당뇨병의 종류에 따라 변한다. 전형적으로, 초속효성 인슐린 조성물로써 투여시 2형 당뇨병 환자에 대해 투여되는 속효성 인슐린의 양의 감소는 초속효성 인슐린 조성물로써 투여시 1형 당뇨병 환자에 대해 투여되는 속효성 인슐린의 양의 감소 보다 더 크다. 예를 들어, 1형 당뇨병 환자 및 2형 당뇨병 환자에 모두 식후 혈당 수준 조절을 위하여 0.20 U/kg 의 속효성 인슐린을 투여하는 경우, 1형 당뇨병 환자에 동일하거나 더 나은 혈당 조절을 달성하기 위하여 초속효성 인슐린 조성물 내 0.15 U/kg 의 속효성 인슐린이 투여될 수 있고, 2형 당뇨병 환자에 동일하거나 더 나은 혈당 조절을 달성하기 위하여 초속효성 인슐린 조성물 내 0.10 U/kg 의 속효성 인슐린이 투여될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 혈당 조절을 달성하기 위하여 2형 당뇨병 환자에 초속효성 인슐린으로써 히알루로난 분해 효소와 함께 투여되는 속효성 인슐린의 양은 예를 들어 히알루로난 분해 효소 없이 투여시 혈당 조절을 위하여 요구되는 양과 비교하여 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 그 이상까지 감소될 수 있고, 혈당 조절을 달성하기 위하여 1형 당뇨병 환자에 초속효성 인슐린 조성물로써 히알루로난 분해 효소와 함께 투여되는 속효성 인슐린의 양은 예를 들어 히알루로난 분해 효소 없이 투여시 혈당 조절을 위하여 요구되는 양과 비교하여 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 그 이상까지 감소될 수 있다.
식후 혈당 수준을 조절하기 위한 본원에서 제공되는 방법 및 조성물을 이용한 인슐린의 비경구, 예컨대, 피하 투여를 위한 투여량 범위의 예는 약 또는 0.05 U/kg 내지 0.50 U/kg, 예컨대 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg 또는 1.0 U/kg 이다. 특정 투여량 및 이의 제형은 질병 및 개체에 종속한다. 필요하다면, 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 그러한 투여량을 달성하기 위하여, 식후 글루코스 수준을 조절하기 위하여 피하로 투여되는 인슐린 제제의 부피는 약 또는 10 ㎕, 20 ㎕, 30 ㎕, 40 ㎕, 50 ㎕, 75 ㎕, 100 ㎕, 150 ㎕, 200 ㎕, 250 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1000 ㎕ 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 적응증에 대한 100 U/mL 인슐린 제형은 70 kg 대상체에 35 ㎕ 내지 350 ㎕ 의 부피로 피하 투여되어 0.05 U/kg 내지 0.50 U/kg 의 인슐린의 투여량을 달성할 수 있다. 본원에 제공되는 조성물 및 방법은 또한 당뇨병 대상체에 투여되어 식후 혈당 조절 뿐 아니라 낮과 밤에 걸친 혈당 조절을 달성할 수 있다. 전형적으로, 연속적 혈당 조절을 제공하기 위하여 투여되는 인슐린의 투여량은 식후 혈당 조절을 달성하기 위하여 요구되는 것 보다 더 적다. 그러나, 투여량은 혈당 수준에 기초하여 증가 또는 감소될 수 있다. 연속적 혈당 조절을 제공하기 위한 본원에서 제공되는 방법 및 조성물을 이용한 인슐린의 비경구, 예컨대, 피하 투여를 위한 투여량 범위의 예는 약 또는 0.001 U/kg 내지 0.30 U/kg, 예컨대, 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0.05 U/kg 내지 0.30 U/kg, 예컨대 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg 또는 1.0 U/kg 이다. 특정 투여량 및 이의 제형은 질병, 투여 시간 및 개체에 의존적이다. 필요하다면, 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 개체에 대한 투여량은 전형적으로 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 최소 투여량, 예컨대, 혈당 조절을 달성하기 위해 요구되는 최소 투여량까지 적정될 수 있다. 혈당 조절을 달성하기에 충분한 인슐린의 양은 경험적으로, 예컨대, 글루코스 농도검사(glucose challenge)에 의해 결정될 수 있다.
히알루로난 분해 효소는 인슐린 제제 투여 전에, 그 이후에, 간헐적으로 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 일반적으로, 히알루로난 분해 효소는 인슐린 제제의 투여 전에 또는 그와 동시에 투여되어 히알루로난 분해 효소가 간질 공간의 히알루론산을 분해하도록 한다. 한 예에서, 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해 효소 조성물은 공동-제형화되어, 따라서, 동시에 투여된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해 효소 조성물은 인슐린 조성물 투여 전, 예컨대, 인슐린 제제의 투여 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 그 이상 전에 투여된다. 일부 예에서, 히알루로니다제는 인슐린 제제와 함께 투여된다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 공동-투여의 바람직한 근접성은 적절한 모델, 예컨대 적절한 동물 모델에서 다양한 시간에 작용제 투여의 효과를 시험함으로써 쉽게 최적화될 수 있다.
인슐린 제제 및 히알루로난 분해 효소 제제 모두는 한번에 투여될 수 있거나, 시간 간격으로 투여되는 수회의 더 적은 용량으로 나뉠 수 있다. 선택된 인슐린 제제는 예를 들어 수분, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월에 걸친 치료 시간의 과정에 걸쳐 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우, 연속적 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여 과정은 적응증 및 환자의 관용성에 좌우되는 것으로 이해된다.
또한, 정확한 투여량 및 치료 지속시간은 치료되는 당뇨병의 함수이며, 알려진 시험 프로토콜을 이용하여, 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽에 의하여 경험적으로 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 당뇨병의 중증도 및 다른 인자들, 예컨대, 대사, 음식물 섭취 및 대상체의 체중에 따라 변할 수 있음을 유의해야 한다. 어떤 특정 대상체에 대하여, 특이적 투약요법은 개별적 필요 및 상기 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하며, 본원에 기재된 농도 범위는 단지 예시일 뿐이며, 조성물 및 이를 포함하는 조합물의 범위 또는 사용을 제한하려는 의도는 아니라는 것이 추가로 이해되어야 한다. 조성물은 대상체 및 당뇨병 상태에 의존하여 매분, 매 수분, 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 또는 한번 투여될 수 있다. 일반적으로, 투약요법은 독성 및/또는 다른 부정적 효과, 예컨대, 인슐린 과잉을 제한하기 위해 선택된다. 담당의는 치료법의 종료, 중단 또는 더 낮은 투여량으로 조정하는 방법 및 시기를 알 수 있음을 유의해야 한다. 역으로, 담당의는 또한 임상 반응이 적절하지 않다면 (독성 부작용은 배제하고), 더 높은 수준으로 치료를 조정할 방법 및 시기를 알 수 있음을 유의해야 한다.
투여 방식
a. 주사기
본원에서 제공되는 조성물은 주사기, 인슐린 펜, 인슐린 펌프, 또는 폐루프시스템의 내용물 내 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는 여러 투여 방식 중 하나 이상을 이용하여 대상체에 비경구적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 인슐린 주사기를 포함한 1회용 주사기는 조성물의 별개의 1회분 주사를 투여하기 위하여 이용될 수 있다. 조성물은 예컨대 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 제제가 공동-제형화되는 경우 동일한 주사기를 이용하여 투여되거나, 다른 주사기를 이용하여 순차적으로 투여될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물의 투여를 위하여 유용한 주사기는 인슐린 주사기를 포함하며, 이는 100 U/ml 농도의 인슐린 제제를 포함한 인슐린 제제의 표준 농도를 유지하고, 투여의 용이를 위한 인슐린 단위의 표시를 가지도록 설계될 수 있다. 다른 예에서, 인슐린 주사기 또는 인슐린 펌프 또는 유사한 장치 중 임의의 하나 이상은 인슐린 제제 및 히알루로난 분해 효소 제제의 하나 또는 둘다를 투여하기 위하여 이용된다.
b. 인슐린 펜
인슐린 펜은 본원에서 제공되는 조성물을 투여하기 위하여 이용될 수 있는 전달 시스템이다. 인슐린 펜은 투여되는 조성물로 채워진 교체가능한 카트리지를 갖는 것들 및 교체불가한 카트리지를 갖는 것들을 포함한다. 교체불가한 카트리지를 갖는 인슐린 펜은 전형적으로 카트리지가 비워지면 처분된다. 인슐린 펜은 예를 들어 절반 단위, 1개 단위 또는 2개 단위 증분으로 투약을 가능하게 하며, 이는 일반적으로 투약 다이알 또는 투여량을 설정하기 위한 다른 기계장치를 이용하여 측정된다 (예컨대, 미국특허번호 5947934호, 6074372호, 6110149호, 6524280호, 6582404호 참조). 그 후, 조성물은 펜에 부착된 미세한 바늘에 의하여 전달된다. 인슐린 펜은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국특허번호 5947934호, 4973318호, 5462535호, 5599323호, 5626566호, 5984906호, 6074372호, 6110149호, 6302869호, 6379339호 및 7241278호에 기재된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재된 것들을 포함한다. 다른 유사한 투약 장치는 예컨대 미국특허번호 5947394호, 6074372호, 6110149호 및 6379339호에 기재된 것들이 또한 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 공동-제형으로써, 또는 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해 효소 조성물로써 별개로 중 어느 하나로 본원에서 제공되는 조성물을 투여하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 펜 또는 유사한 장치가 또한 대상체의 혈당 수준을 측정할 수 있는 센서 또는 모니터를 포함한다 (예컨대, WO2003047426호 참조).
본원에서 제공되는 인슐린 조성물을 전달하기 위하여 이용가능한 또는 이용되기 위하여 변형가능한 인슐린 펜 및 유사한 장치는 당업계에 널리 알려져 있으며, 상표 오토펜® (오웬 뭄포드 사), 디세트로닉 펜 (디세트로닉 메디컬 ㅅ시싯시스템스), 휴마로그® 펜 (엘리 릴리 사), 휴마로그® 믹스 75/25 펜 (엘리 릴리 사), 휴미린® 70/30 펜 (엘리 릴리 사), 휴미린® N 펜 (엘리 릴리 사), 노보로그® 플렉스펜 (노보 노르디스크), 노보펜® 3 (노보 노르디스크), 노보펜® 4 (노보 노르디스크), 노보펜® 4 (노보 노르디스크), 노보펜® 주니어 (노보 노르디스크), 노보펜® 믹스 70/30 플렉스펜 (노보 노르디스크), 인듀오® (노보 노르디스크), 노보린® 인노렛® (노보 노르디스크), 인노보® (노보 노르디스크), 옵티펜® (사노피-아벤티스), 옵티펜® 프로2 (사노피-아벤티스), 옵티셋® (사노피-아벤티스) 및 솔로스타® (사노피-아벤티스) 아래 시판되는 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
c. 인슐린 펌프 및 다른 인슐린 전달 장치
본원에서 제공되는 조성물은 인슐린 전달 장치, 예컨대, 인슐린 펌프 또는 다른 유사한 연속적 주입 장치를 이용하여 당뇨병 대상체에 전달될 수 있다. 인슐린 전달 장치는 전형적으로 인슐린 조성물을 포함한 하나 이상의 1회용 저장소, (임의의 조절, 소프트웨어, 처리 모듈 및/또는 배터리를 포함한) 펌프 및 피하 주사용 캐뉼라 또는 바늘을 포함한 1회용 주입 세트, 및 캐뉼라 또는 바늘을 인슐린 저장소에 연결하는 튜브를 포함한다. 초속효성 인슐린 조성물을 이용한 사용을 위하여, 인슐린 전달 장치는 공동-제형화된 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 조성물을 포함하는 1개의 저장소를 포함하거나, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 조성물이 동일 또는 별개의 저장소 내에 포함되도록 하나 이상의 저장소를 포함한다. 그러한 예에서, 인슐린 전달 장치는 각 조성물을 동시에 또는 서로 순차적으로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 장치는 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물을 투여하기 위하여 이용될 수 있다. 조성물은 연속적으로 또는 1회 주사로 투여될 수 있다. 추가로, 인슐린 전달 장치 사용자는 1회분을 정하여 인슐린의 프로파일에 영향을 줄 수 있는 능력을 가진다. 예를 들어, 투여량의 전부가 즉시 펌핑된다는 점에서 별개의 주사에 유사한 주입인 표준 1회분이 투여될 수 있다. 확장된 1회분은 높은 초기 투여량을 피하고 조성물의 작용을 연장하는 시간에 걸친 느린 주입이다. 표준 1회분 및 확장된 1회분 모두를 포함하는 조합 1회분이 또한 인슐린 펌프 또는 다른 연속적 전달 시스템을 이용하여 투여될 수 있다. 인슐린 전달 장치는 당업계에 알려져 있고, 미국특허번호 6554798호, 6641533호, 6744350호, 6852104호, 6872200호, 6936029호, 6979326호, 6999854호, 7025713호 및 7109878호를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재되어 있다. 인슐린 전달 장치는 또한 글루코스 모니터 또는 센서에 연결될 수 있거나/있고, 혈당 수준, 식사의 탄수화물 함량 또는 다른 입력에 기초한 바람직한 인슐린 투여량을 계산하는 수단을 포함할 수 있다. 추가로 인슐린 전달 장치는 대상체에 이식되거나, 외용될 수 있다.
d. 폐루프시스템
때때로 인공 췌장이라 언급되는 폐루프시스템은 본원에서 제공되는 조성물 및 방법의 이용을 위한 특별한 관심이 된다. 폐루프시스템은 통합된 연속적 글루코스 모니터, 인슐린 펌프 또는 다른 전달 시스템, 및 혈당 수준의 실시간 측정에 기초한 혈당 조절을 위한 필요한 인슐린 주입을 일정하게 계산하는 수학적 알고리즘을 포함하는 콘트롤러를 갖는 시스템을 지칭한다. 최적화된 경우, 그러한 시스템은 건강한 비-당뇨병 대상체에서 관찰되는 천연 인슐린 반응 및 혈당 조절과 유사한, 일정하고 매우 엄격한 혈정 조절을 용이하게 할 수 있다. 그러나, 효과적이기 위하여, 폐루프시스템은 신뢰할 수 있고 정확한 연속적 글루코스 모니터 및 매우 빠른 작용을 갖는 인슐린 전달 모두를 필요로 한다. 예를 들어, 속효성 인슐린의 피하 전달과 관련된 인슐린 흡수 및 작용의 지연은 큰 식후 혈당 변동을 야기할 수 있다 (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). 인슐린 흡수, 인슐린 작용, 간질 글루코스 역학 및 생체외-기초 모니터링 시스템, 예컨대 미세투석 기법에 기초한 것들에 대한 수송 시간 때문에 지연은 인슐린 전달 시점부터 그의 탐지가능한 글루코스-저하 효과의 정점까지 전체 100 분 또는 그 이상의 시간 지체를 초래할 수 있다 (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). 따라서, 일단 투여되면, 인슐린은 거의 2시간 동안 측정가능한 효과를 계속해서 증가시킬 것이다. 이는 폐루프시스템을 이용하여 식사 소화 후 글루코스 농도의 효과적인 저하를 복잡하게 할 수 있다. 최초, 글루코스 증가는 탐지되어야 한다. 그러나, 이는 전형적으로 약 10 내지 40 분 지체 후에만 발생한다. 상기 시스템은 식사가 소화되었음을 결정하고 적절한 인슐린 투여량을 투여하여야 한다. '오판단된' 인슐린 투여량에 대한 뒤이은 보상을 위한 시스템의 능력은 장기간 지연 및 일단 투여된 인슐린을 '회수하는' 불능에 의하여 절충된다. 그러한 문제는 최소한 부분적으로 증가된 흡수 속도 및 수준, 및 약력학에 관련된 개선(아래 실시예 1에 기재된 바와 같은)을 나타내는 초속효성 인슐린 조성물, 예컨대, 본원에서 제공되는 것들을 이용하여 극복될 수 있다. 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물은 속효성 인슐린 보다 감소된 tmax (즉, 더 빨리 최대 농도를 달성함)를 가지고, 속효성 인슐린 보다 더 빠른 혈당 수준 조절을 시작한다. 이러한 증가된 흡수 속도 및 작용 개시는 인슐린 작용과 글루코스 모니터링 사이의 지체 및 입력을 감소시키고, 혈당 수준을 더욱 엄격하게 조절할 수 있는 더욱 효과적인 폐루프시스템을 제공하며, 혈당 변동을 감소시킨다.
폐루프시스템은 당 분야에 널리 알려져 있으며, 본원에 참조로써 포함되는 미국특허번호 5279543호, 5569186호, 6558351호, 6558345호, 6589229호, 6669663호, 6740072호, 7267665호 및 7354420호를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재되어 있다. 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있는, 이러한 및 유사한 시스템은 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물을 전달하기 위하여 이용될 수 있다. 폐루프시스템은 혈당 수준을 측정하는 센서 시스템, 콘트롤러 및 전달 시스템을 포함한다. 이러한 통합된 시스템은 췌장 베타 세포(β-세포)를 모델로 설계되며, 따라서, 이는 주입 장치가 체내 혈당 농도 농도의 변화에 응답시, 충분히 기능하는 인간 β-세포에 의하여 생성될 것인 바와 같은 유사한 농도 프로파일로 대상체에 인슐린을 전달하는 것을 조절한다. 따라서, 인슐린은 물질대사 및 분열촉진 효과 모두를 가지기 때문에 상기 시스템은 혈당 수준에 대한 신체의 자연 인슐린 반응을 시뮬레이션하며, 인슐린의 효율적인 이용을 만들 뿐 아니라 다른 신체 기능을 또한 설명한다. 추가로, 폐루프시스템을 이용하여 달성되는 혈당 조절은 식사의 규모 및 시기 또는 다른 인자들에 대한 어떤 정보도 요구 없이 달성된다. 상기 시스템은 실시간 혈당 측정에 단독으로 의존적일 수 있다. 글루코스 센서는 체내 혈당 수준의 대표적인 센서 신호를 생성하고, 콘트롤러에 센서 신호를 제공한다. 콘트롤러는 센서 신호를 받아, 인슐린 전달 시스템으로 통신되는 명령을 생성한다. 인슐린 전달 장치는 명령을 받아, 그 명령에 반응하여 인슐린을 체내로 주입한다. 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있는 폐루프시스템의 예시적인 요소들에 관한 기재가 아래 제공된다. 당업자는 본원에서 사용을 위한 적절한 폐루프시스템을 쉽게 확인할 수 있다. 그러한 시스템은 이에 국한되지 않으나 미국특허번호 5279543호, 5569186호, 6558351호, 6558345호, 6589229호, 6669663호, 6740072호, 7267665호 및 7354420호에 기재된 것들을 포함하여 당 분야에 기재되어 있다. 상기 시스템의 개별적 요소들은 또한 당 분야에 개별적으로 및 혈당 조절을 달성하는데 사용을 위한 폐루프시스템의 내용에 기재되어 있다. 본원에서 제공되는 예는 단지 예시일 뿐이며, 다른 폐루프시스템 또는 개별적 요소들이 본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물을 전달하기 위하여 이용될 수 있다고 이해된다.
폐루프시스템은 연속적으로 작동하는 글루코스 센서 또는 모니터를 포함한다. 그러한 장치는 피부 아래 삽입되고, 글루코스 데이터를 무선주파수 원격측정기에 의하여 무선으로 글루코스 데이터를 소형 수신기로 통신하는 소형 송신기에 부착된 바늘-형 센서를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 센서는 일단 센서가 피하 조직에 위치하면 제거되고 폐기되는 삽입 바늘을 이용하여 대상체의 피부를 통해 삽입된다. 삽입 바늘은 예리한 끝 및 피부 내로 삽입 동안 센서를 유지하기 위한 개방된 구멍을 가진다 (예컨대, 미국특허번호 5,586,553호 및 5,954,643호 참조). 폐루프시스템에서 사용되는 센서는 임의적으로 피하 조직 내 간질 유체 (ISF)로 노출된 3개의 전극을 포함할 수 있다. 상기 3개의 전극은 회로를 형성하는데 이용되는 시험 전극(working electrode), 기준 전극(reference electrode) 및 상대 전극(counter electrode)을 포함한다. 적절한 전압이 시험 전극과 기준 전극을 가로질러 공급시, ISF는 전극들 간에 임피던스를 제공한다. 아날로그 전류 신호는 시험 전극으로부터 신체를 거쳐 상대 전극으로 흐른다. 시험 전극의 전압은 일반적으로 그라운드로 지지되고, 기준 전극의 전압은 설정 전압 V 세트, 예컨대 300 내지 700 mV 사이에서 지지될 수 있다. 전극들 간의 전압 차에 의해 시뮬레이션되는 가장 현저한 반응은 최초 글루코스 옥시다제 효소 (GOX)와 반응하여 글루콘산 및 과산화수소 (H2O2)를 생성함에 따른 글루코스의 환원이다. 이어서, H2O2 는 시험 전극의 표면에서 물(H2O) 및 (O-)로 환원된다. 상기 O-는 센서 전기적 요소들로부터 양 전하를 이끌고, 따라서 전자를 반발하고 전기적 전류 흐름을 야기한다. 이는 센서 전극과 접촉하고 있는 ISF 내 글루코스의 농도에 비례하는 아날로그 전류 신호를 초래한다 (예컨대, 미국특허번호 7,354,420호 참조).
일부 예에서, 하나 초과의 센서가 혈당을 측정하기 위하여 이용된다. 예를 들어, 중복되는 센서들이 이용될 수 있으며, 한 센서가 실패시 원격측정된 특성 모니터 전송기 전자장치에 의하여 대상체에 알려질 수 있다. 계기장치는 또한 대상체에 어느 센서가 여전히 작동하는지 및/또는 여전히 작동하는 센서의 수를 알릴 수 있다. 다른 예에서, 센서 신호는 평균 또는 다른 수단을 통해 결합된다. 추가로, 다른 종류의 센서가 이용될 수 있다. 예를 들어, 내부 글루코스 센서 및 외부 글루코스 센서가 동시에 혈당을 측정하기 위하여 이용될 수 있다.
본원에서 제공되는 초속효성 인슐린 조성물을 전달하는 폐루프시스템에서 이용될 수 있는 글루코스 센서가 널리 알려져 있고, 쉽게 확인될 수 있으며, 임의적으로 당업자에 의해 변형될 수 있다. 내부 글루코스 센서의 예는 미국특허번호 5,497,772호, 5,660,163호, 5,791,344호, 5,569,186호, 6,895,265호에 기재된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 형광을 이용하는 글루코스 센서의 예는 미국특허번호 6,011,984호에 기재된 것이 있다. 글루코스 센서 시스템은 또한 광선, 전도도, 제트 샘플링, 미세 투석, 미세-천공, 초음파 샘플링, 역 이온영동법, 또는 다른 방법(예컨대, 미국특허번호 5,433,197호 및 5,945,676호, 및 국제특허공개 WO199929230호)을 포함한 다른 센싱 기술을 이용할 수 있다. 일부 예에서, 시험 전극 만이 피하 조직 내에 그리고 ISF 와 접촉하여 위치하고, 상대 및 기준 전극은 신체의 외부에 그리고 피부와 접촉하여 위치한다. 상대 전극 및 기준 전극은 모니터 하우징의 표면에 위치하고, 원격측정 특성 모니터의 일부로써 피부에 지지될 수 있다. 추가의 예에서, 상대 전극 및 기준 전극은 다른 장치를 이용하여 예컨대 전선을 전극으로 전개하고, 전극을 피부에 테이프로 묶고 전극을 시계 접촉 피부의 아래에 통합시켜 피부에 지지된다. 여전히 또한, 하나 초과의 시험 전극이 중복하여 피하 조직 내로 위치될 수 있다. 간질 유체는 또한 대상체의 신체로부터 수확되어 신체에 이식되지 않은 외부 센서를 거쳐 흐를 수 있다.
콘트롤러는 글루코스 센서로부터 입력을 받는다. 콘트롤러는 췌장 베타 세포(β-세포)를 모델로 하고, 인슐린 전달 장치가 혈당 조절을 위하여 요구되는 양의 인슐린을 주입하도록 하는 명령을 제공하도록 설계된다. 콘트롤러는 글루코스 센서에 의해 탐지된 글루코스 수준에 기초한 인슐린의 요구량을 계산하는 알고리즘을 가지는 소프트웨어를 이용한다. 체내 글루코스 변동을 최소화하기 위해 설계된 알고리즘은, 얼마나 많은 인슐린이 전달되는지와 무관하게, 과도한 체중 증가, 고혈압 및 아테롬성 동맥경화증을 야기할 수 있기 때문에, 알고리즘의 예는 β-세포를 가깝게 모델로 하는 것들을 포함한다. 전형적으로, 상기 시스템은 생체내 인슐린 분비 패턴을 모방하고, 정상의 건강한 개체에 의해 경험된 생체내 β-세포 적응과 일치하는 상기 패턴을 조정하려는 의도이다. 폐루프시스템에 유용한 조절 알고리즘은 비례-적분-미분 (PID) 콘트롤러에 의해 이용되는 것들을 포함한다. 비례 미분 콘트롤러 및 모델 예측 제어 (MPC) 알고리즘은 또한 일부 시스템에서 이용될 수 있다 (Hovorka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). 알고리즘의 예는 Hovorka 등 (Diabetic Med. (2006) 23:1-12), Shimoda 등, (Front Med Biol Eng (1997) 8:197-211), Shichiri 등 (Artif. Organs (1998) 22:32-42), Steil 등 (Diabetes Technol Ther(2003) 5: 953-964), Kaletz 등, (Acta Diabetol. (1999) 36:215) 및 미국특허번호 5279543호, 5569186호, 6558351호, 6558345호, 6589229호, 6740042호, 6669663호, 6740072호, 7267665호, 7354420호 및 미국특허공개번호 20070243567호에 기재된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
한 예에서, PID 콘트롤러가 폐루프시스템에서 이용된다. PID 콘트롤러는 3개 관점: 표적 글루코스로부터 시작 (비례 요소), 주위 및 표적 글루코스 간의 곡선하 면적 (적분 요소), 및 주위 글루코스의 변화 (미분 요소)로부터 글루코스 변동을 평가함으로써 인슐린 주입을 연속적으로 조정한다. 일반적으로, 글루코스 변화에 대한 생체내 β-세포 반응은 "제1" 및 "제2" 상 인슐린 반응을 특징으로 한다. β-세포의 2-상 인슐린 반응은 비례, 추가로 적분, 추가로 미분 (PID) 콘트롤러의 요소들을 이용하여 모델로 될 수 있다 (예컨대, 미국특허번호 7,354,420호 참조).
콘트롤러는 원하는 인슐린 전달을 위한 명령을 생성한다. 인슐린 전달 시스템, 예컨대, 인슐린 펌프는 당 분야에 알려져 있고, 폐루프시스템에 이용될 수 있다. 인슐린 전달 장치의 예(예컨대 상기 기재된 것들)는 미국특허번호 4562751호, 467840호, 4685903호, 4373527호, 4573994호, 6554798호, 6641533호, 6744350호, 6852104호, 6872200호, 6936029호, 6979326호, 6999854호, 7025713호 및 7109878호에 기재된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 인슐린 전달 장치는 전형적으로, 일반적으로 폐기가능한, 인슐린 제제, 예컨대 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 포함하는, 하나 이상의 저장소를 포함한다. 저장소는 공동-제형화되어 단일의 저장소에 포함되거나, 또는 2개 이상의 저장소 내에 별개로 포함되된 것 중 어느 하나로 하나 초과의 인슐린, 예컨대, 기초-작용 인슐린 및 속효성 인슐린을 포함할 수 있다. 초속효성 인슐린 조성물을 이용한 사용을 위하여, 인슐린 전달 장치는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 조성물을 포함하나 1개의 저장소를 포함하거나, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 조성물이 별개의 저장소 내에 별개로 포함되도록 2 이상의 저장소를 포함할 수 있다. 그러한 경우, 인슐린 전달 장치는 각 조성물을 동시에 또는 서로 순차적으로 전달할 수 있다. 일부 예에서, 상기 조성물들은 주입 튜브 및 캐뉼라 또는 바늘을 이용하여 전달된다. 다른 예에서, 주입 장치는 피부에 직접 부착되며, 조성물은 주입 장치로부터 캐뉼라 또는 바늘을 거쳐 직접 튜브의 이용 없이 신체로 흐른다. 추가 예에서, 주입 장치는 신체에 내부적이며, 주입 튜브는 임의적으로 조성물들을 전달하기 위하여 이용될 수 있다. 폐루프시스템은 또한 필터, 보정기 및 전송기를 포함하나 이에 국한되지 않는 추가의 요소들을 포함할 수 있다.
G. 활성, 약동학 및 약력학의 평가 방법
검정은 인슐린 단독 또는 히알루로난 분해 효소와 병용하여 시험관내 및 생체내 활성의 평가를 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정 중에는 생체이용률 및 관용성을 포함하여, 피하로 또는 복강내로-투여되는 인슐린의 약동학적 및 약력학적 성질들을 평가하는 것들이 포함된다. 인슐린 및 히알루로난 분해 효소 모두의 생물학적 활성은 또한 당 분야에 널리 알려진 검정법을 이용하여 평가될 수 있다. 상기 평가는 예를 들어 인슐린, 예컨대 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 적절한 투여량 및 치료를 위한 투여 빈도를 결정하기 위하여 이용될 수 있다.
1. 약동학, 약력학 및 관용성
약동학 (PK), 약력학 (PD) 및 관용성 연구, 예컨대, 아래 실시예 1에 기재된 것들은 실시예 11 및 12에 기재된 것들과 같은 돼지 모델을 포함한 동물 모델을 이용하여 수행되거나, 환자에 임상 연구 동안 수행될 수 있다. 동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 필리핀 원숭이 또는 히말라야 원숭이가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 약동학 및 관용성 연구는 건강한 동물 또는 인간 대상체를 이용하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 연구는 당뇨병의 동물 모델, 예컨대 하기 기재된 것들을 이용하여 또는 당뇨병 인간 대상체에서 수행된다. 상기 연구를 수행하기 위하여 유용한 예시적 절차는 글루코스 클램프 기법을 포함한다 (Brehm et al (2007) in Clin Diabetes Res: Methods and Techniques. Ed Michael Rosen, pp 43-76, 실시예 1). 고인슐린혈 정상 혈당 클램프 절차에서, 외인성 인슐린이 주입되어 고인슐린혈 혈장 인슐린 농도를 생성하는 반면, 혈장 글루코스 농도는 가변적인 외인성 글루코스 주입에 의하여 정상혈당 수준으로 일정하게 유지된다. 고인슐린혈의 기간 동안 일정한 글루코스 수준을 유지하기 위하여 요구되는 글루코스 주입 속도 (GIR)는 글루코스 대사에 대한 주입된 인슐린의 효과의 척도를 제공한다. GIR은 신체에 의해 이용되는 글루코스의 양 (즉, 신체가 더 많은 글루코스를 이용하는 경우, 더 많은 외인성 글루코스가 정상 혈당 수준, 즉 90 내지 110 mg/dL 을 유지하기 위해 주입될 필요가 있다), 및 따라서, 투여되는 인슐린의 활성 (즉, 인슐린 활성 증가는 내인성 글루코스 출력의 감소 및 혈당 이용 증가를 초래하며, 혈당의 전체적 감소를 초래한다)의 반영이다. 따라서, 대상체 내 인슐린 분비 및 인슐린 저항성을 평가하는데 이용되는 것에 추가로, 상기 절차는 또한 인슐린, 예컨대 히알루로난 분해 효소와 공동-투여되는 인슐린의 약동학 및 약력학 성질을 안전하게 평가하는데 이용될 수 있다.
피하로 또는 복강내로 투여되는 인슐린의 약동학은 인슐린의 시간-농도 프로파일을 측정하고, 투여 후 임의의 주어진 시간 간격에 대하여 최대 (피크) 혈청 인슐린 농도 (Cmax), 피크 시간 (즉, 최대 혈청 인슐린 농도가 발생한 시간; tmax), 및 곡선하면적 (즉, 시간 대 혈액 인슐린 농도를 플롯팅하여 생성된 곡선하면적; AUC)과 같은 매개변수를 계산하여 평가될 수 있다. 피하로 투여된 인슐린의 절대 생체이용률은 피하 전달 후 인슐린의 곡선하면적 (AUCsc)을 정맥내 전달 후 인슐린의 AUC (AUCiv)와 비교하여 결정된다. 절대 생체이용률 (F)은 다음의 식을 이용하여 계산될 수 있다: F = [([AUC]sc × 용량sc) / ([AUC]iv × 용량iv)] × 100. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소와의 공동-투여 없이 또는 이와 함께 인슐린 투여의 동일한 경로를 통한 2개의 처치의 상대적 생체이용률 (Frel) 은 또한 실시예 1에서와 같이 계산될 수 있다. 예를 들어, rHuPH20과 공동-투여되는, 피하로 투여되는 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 피하로 투여되는 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독의 상대적 생체이용률(Frel) 은 {[AUC (휴마로그® 인슐린 리스프로 / rHuPH20)] / [AUC (휴마로그® 인슐린 리스프로 단독]} × 100 으로 계산될 수 있고, 여기서, 휴마로그® 인슐린 리스프로의 각 투여량은 동일하며, AUC 는 동일한 시간 간격에 걸쳐 계산된다. 피하 투여 후 혈장 내 인슐린의 농도는 혈액 시료 내 인슐린의 농도를 평가하기에 적절한 당 분야에 알려진 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예시적인 방법은 ELISA 및 RIA 를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
피하로 또는 복강내로 투여되는 인슐린의 약력학 성질은 글루코스 주입 속도 (GIR) (mg/kg/분), 최대 효과까지 시간 (tGIRmax)(분); 후기 최대-절반 효과까지 시간 (tGIRlate50%)(분); 초기 최대-절반 효과까지 시간 (tGIRearly50%)(분); 최대 대사 효과 (GIRmax) (mg/kg/분); AUC-GIR0-60min(g/kg); AUC-GIR0-120min(g/kg); AUC-GIR0-180min(g/kg); AUC-GIR0-240min(g/kg); AUC-GIR0-300min(g/kg); 및 AUC-GIR0-360min(g/kg)과 같은 매개변수에 의해 평가될 수 있다.
일정 범위의 투여량 및 상이한 투약 빈도가 투여량 내 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소의 농도를 증가시키거나 감소시키는 효과를 평가하기 위한 약동학 연구에서 투여될 수 있다. 피하로 또는 복강내로 투여되는 인슐린의 약동학 및 약력학 성질, 예컨대, 생체이용률은 또한 히알루로난 분해 효소의 공동-투여 없이 또는 이와 함께 평가될 수 있다. 예를 들어, 동물 또는 인간 대상체에 고인슐린혈 정상 혈당 클램프 절차 동안 인슐린을 피하로 단독으로 또는 히알루로난 분해 효소와 병용하여 투여할 수 있다. 이어서, 혈액 시료를 다양한 시점에 취하여, 예컨대, 방사 면역 검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착제 검정 (ELISA)에 의하여 혈청 내 인슐린의 양이 결정된다. 상기 절차에 걸친 글루코스 주입 속도가 또한 계산될 수 있다. 이어서, 히알루로난 분해 효소 없이 또는 이와 함께 투여되는, 피하로 투여되는 인슐린의 약동학 및 약력학 성질은 임의의 인슐린의 상기 성질에 대한 히알루로난 분해 효소와의 공동-투여의 효과를 평가하기 위하여 결정될 수 있다.
안전성 및 관용성을 평가하는 연구는 또한 당 분야에 알려져 있고, 본원에서 사용될 수 있다. 인슐린의 피하 투여 후, 히알루로난 분해 효소의 공동-투여 없이 또는 이와 함께, 임의의 불리한 반응의 진행이 모니터링될 수 있다. 불리한 반응은 주사 부위 반응, 예컨대, 부종 또는 부기, 두통, 열, 피로, 오한, 홍조, 현기증, 두드러기, 천명 또는 흉부 긴장감, 구역, 구토, 경축, 등통, 흉통, 근육 경련, 발작 또는 경련, 혈압 변화 및 아나필락시스 또는 중증 과민 반응을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 일정 범위의 투여량 및 다른 투약 빈도가 투여량 내 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소의 농도를 증가시키거나 감소시키는 효과를 평가하기 위한 안전성 및 관용성 연구에서 투여된다.
2. 생물학적 활성
a. 인슐린
치료제로써 작용하는 인슐린, 예컨대 인슐린 유사체의 능력은 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 당 분야에 널리 알려진 시험관내 검정법은 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린 능력을 평가하기 위하여 수행될 수 있다. 한 예에서, 인간 태반 세포 막이 인슐린 수용체의 공급원으로써 준비되고, 표지되지 않은 인슐린 유사체 없이 또는 이와 함께 방사성동위원소표지 인간 인슐린과 함께 인큐베이션되는 경쟁적 결합 검정법이 수행된다. 이어서, 결합된 방사성동위원소표지 인슐린의 양을 탐지하여 결합에 경쟁하는 인슐린 유사체의 능력을 결정하고, 태반 인슐린 수용체에 대한 인슐린 유사체의 상대적 친화력을 계산한다 (예컨대, Weiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024 참조). 자연적으로 또는 재조합적으로 인슐린 수용체를 발현하는 다른 세포들을 포함하여, 인슐린 수용체의 다른 공급원들이 또한 상기 경쟁적 결합 검정법에서 이용될 수 있다 (Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).
글루코스 흡수를 자극하거나 또는 임의의 다른 그의 일반적 대사 결과에 영향을 주는 인슐린의 능력은 시험관내에서 평가될 수 있다. 인슐린-자극 글루코스 흡수를 측정하기 위하여, 지방세포를 인슐린 없이 또는 그와 함께, 표지된 글루코스, 예컨대 2-디옥시-D-[2,63-H] 글루코스 또는 D-[U-14C]글루코스와 인큐베이션한다. 이어서, 혼입된 방사성을 측정하여 인슐린의 존재 또는 부재하에서 글루코스 흡수의 양을 결정한다 (Louveau et al., (2004) J Endocrin. 181:271-280, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258). 인슐린 유사체의 활성을 평가시, 인간 인슐린의 활성이 또한 평가되어 비교를 위하여 이용된다. 인슐린의 존재 하 H4IIE 세포 내 글루코스 생산을 평가하기 위하여 시험관내 검정법이 또한 수행될 수 있다 (Wang et al., (2000) J. Bioche, 275:14717-14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258).
당뇨병 또는 건강한 동물 모델 또는 인간 대상체을 이용한 생체내 연구가 또한 인슐린의 치료 활성을 평가하기 위하여 수행될 수 있다. 인슐린은 예를 들어 혈당 수준, 순환하는 인슐린 수준 및 헤모글로빈 A1c(HbA1c)에 대한 효과를 평가하기 위하여 당뇨병의 동물 모델에 투여될 수 있다. 헤모글로빈 A1c 는 글루코스가 헤모글로빈에 부착시 형성되며, 이는 혈당 수준 상승시 발생한다. 혈액 시료 내 HbA1c 수준은 예를 들어 HPLC, ELISA, RIA 또는 다른 면역검정법에 의하여 평가될 수 있다. 건강한 대상체에 대한 정상 HbA1c 값은 약 4.0 내지 6.2 퍼센트이다. 미국 당뇨병 협회는 당뇨병으로부터의 합병증을 방지하는 것을 돕기 위하여 당뇨병을 갖는 환자에 대하여 7% 미만 (또는 특정 개인에서 6% 미만)이어야 한다고 추천한다. 인슐린 수준은 예를 들어 ELISA 또는 RIA에 의해 측정될 수 있다. 글루코스 수준은 전형적으로 글루코스 센서 또는 분석기를 이용하여 측정된다.
I형 당뇨병에 대한 동물 모델은 비당뇨(NOD) 마우스 및 바이오브리딩(BB) 랫트를 포함한다 (Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601-604). 2형 당뇨병에 대한 동물 모델은 각각 렙틴 유전자 또는 렙틴 수용체 내 돌연변이를 가지는 ob/ob 마우스 및 db/db 마우스, KK 마우스, 나고야-시바타-야수다(NSY) 마우스, 쥬커 당뇨병 지방(ZDF) 랫트 및 가토-카타자키(GK) 랫트 (Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198) 를 포함하나 이에 국한되지 않다. 다른 예에서, 건강한 동물은 히알루로난 분해 효소 없이 또는 이와 함께, 인슐린의 활성을 시험하기 위하여 이용될 수 있다.
b. 히알루로난 분해 효소
히알루로난 분해 효소의 활성은 당 분야에 널리 알려진 모델을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제에 대한 USP XXII 검정법은 효소를 30분 동안 37℃에서 HA와 반응시킨 후 남은 분해되지 않은 히알루론산 또는 히알루로난, (HA) 기질의 양을 측정함으로써 활성을 간접적으로 결정한다 (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 미국 약전 협회(United States Pharmacopeia Convention, Inc), 미국 메릴랜드주 락빌 소재). 히알루로니다제 기준 표준물(USP) 또는 국가 의약품집(NF) 표준 히알루로니다제 용액이 임의의 히알루로니다제의 활성을 유닛으로 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 활성은 미세탁도 검정을 사용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물의 형성을 기초로 한다. 상기 활성은 히알루로니다제를 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산)와 설정된 기간의 시간 동안 (예를 들어, 10분) 인큐베이션한 후 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 침전시켜 측정된다. 생성된 시료의 탁도는 추가 현상 기간 후 640 nm에서 측정된다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다제 활성으로부터 생성된 탁도의 감소는 히알루로니다제 효소 활성의 척도이다. 다른 예에서, 히알루로니다제 활성은 히알루로니다제와의 인큐베이션 후 잔류 바이오티닐화된 히알루론산을 측정하는 미세적정 검정을 이용하여 측정된다 (예를 들어, Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, 미국 특허 공개 제20050260186호 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리 카르복실기를 바이오티닐화시키고, 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 미세적정 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 히알루로니다제와의 인큐베이션 후, 잔류 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다제 반응을 이용하여 검출하고, 공지된 활성의 히알루로니다제 표준물과의 반응 후 얻어지는 것과 비교한다. 히알루로니다제 활성을 측정하기 위한 다른 검정법이 또한 당 분야에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263 참조).
산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 또한 평가할 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 염료를 히알루로난 분해 효소와 함께 또는 없이 피하로 누드 마우스의 각 측면 상의 가측 피부로 주사할 수 있다. 그 후, 염료 면적을 예컨대 마이크로캘리퍼로 측정하여, 산포제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 결정한다 (예를 들어, 미국 공개 특허 제20060104968호 참조). 다른 작용제, 예컨대, 인슐린과 히알루로니다제의 공동-투여의 약동학 및 약력학 특성에 대한 효과는 또한 동물 모델 및/또는 인간 대상체를 사용하여, 예컨대 상기 논의되고 하기 실시예 1에 나타낸 바와 같은 임상 시험의 세팅에서 생체내에서 평가될 수 있다. 히알루로니다제가 아닌 히알루로난 분해 효소의 기능적 활성은 임의의 이들 검정법을 이용하여 히알루로니다제와 비교될 수 있다. 이는 히알루로난 분해 효소의 기능적 등가량이 얼마인가를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력은 이를 트립판 블루와 함께 마우스의 가측 피부로 주사하여 평가할 수 있고, 예를 들어 히알루로니다제 표준물 100 단위와 동일량의 확산을 달성하는데 필요한 양을 결정할 수 있다. 그러므로, 필요한 히알루로난 분해 효소의 양은 100 히알루로니다제 유닛과 기능적으로 등가이다.
H. 치료 용도
본원에 기재된 방법은 속효성 인슐린이 사용되는 임의의 상태의 치료에 사용될 수 있다. 인슐린은, 히알루로난 분해 효소와 함께, 인슐린을 처치할 수 있는 임의의 상태를 치료하기 위해 피하 투여될 수 있다. 전형적으로, 히알루로난 분해 효소는 속효성 인슐린과 공동-투여된다. 본 섹션은 속효성 인슐린의 예시적 치료 용도를 제공한다. 아래 기재되는 치료 용도는 예시적인 것으로, 본원에 기재된 방법의 적용을 제한하지 않는다. 치료 용도는 제1형 진성 당뇨병, 제2형 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병을 위한 치료, 및 중증의 환자에서의 혈당 조절을 위한 치료를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 속효성 인슐린은 혈당 조절을 달성하기 위해 당뇨병 대상에서 식후 인슐린 요법으로서 식사 전에, 예컨대 주사기 또는 인슐린 펜을 통해 별개의 투여로 히알루로난 분해 효소와 함께 피하 투여될 수 있다. 또한, 속효성 인슐린은 주야간 전반에 걸친 혈당 수준의 연속적인 조절 및/또는 식후 혈당 변동의 조절을 위한 폐루프시스템의 맥락에서 또는 인슐린 펌프를 사용하여 히알루로난 분해 효소와 함께 피하 또는 복강내 투여될 수 있다. 이러한 질병 또는 상태를 확인하는 것은 주치의의 기술 범위에 포함된다.
앞서 논의된 바와 같이, 특정 용량 및 치료 프로토콜은 전형적으로 각각의 대상에 대해 개별화된다. 필요한 경우, 특정 용량 및 기간 및 치료 프로토콜은 경험에 의거하여 결정하거나 추정할 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소 없이 속효성 인슐린의 예시적 투여량을 출발 지점으로 사용하여 본원에 제공되는 방법에 적절한 용량을 결정할 수 있다. 용량 수준은 개별 체중, 일반적인 건강 상태, 연령, 사용되는 특정 화합물의 활성, 성별, 식이요법, 대사 활성, 혈당 농도, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 질병의 중증도 및 경과, 및 질병에 대한 환자의 기질 및 주치의의 판단과 같은 다양한 요인에 기초하여 결정할 수 있다. 특히, 혈당 센서에 의해 측정되는 바와 같이 혈당 수준을 측정하여, 혈당 조절을 달성하기 위해 투여될 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 양을 결정하는데 사용할 수 있다. 본원에 제공된 초속효성 조성물의 흡수 속도 및 흡수 수준에 기초하고, 또한 혈당 수준에 기초하여 투여량을 결정하는데 사용될 수 있는 연산법이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 식후 혈당 조절을 위한 인슐린의 용량은, 예를 들어 식사의 탄수화물 함량을 결정함으로써, 계산하거나 조정할 수 있다 (Bergenstal et al., (2008) Diabetes Care, Lowe et al., (2008) Diabetes Res. Clin. Pract., Chiesa et al., (2005) Acta Biomed. 76:44-48).
1. 진성 당뇨병
진성 당뇨병(diabetes mellitus)(또는 당뇨병)은 손상된 글루코스 대사가 특징이다. 혈당은 소화관에서 흡수된 탄수화물로부터 유래되고, 간에서 생성된다. 혈당 수준의 증가는 인슐린 방출을 자극한다. 식후 글루코스 유입은 식사 사이에 관찰되는 글루코스의 간 생성보다 20배 내지 30배 더 높을 수 있다. 초기 단계 인슐린 방출은 10분 또는 약 10분간 지속되며, 간 글루코스 생성을 저해하고, 2시간 이상 지속되는 보다 긴 (후기) 단계의 방출에 선행되며, 식사시간 탄수화물 유입을 포함한다. 식사 사이에, 지속적으로 낮은 수준의 인슐린 (기저 인슐린)은, 특히 지방 조직, 근육 조직 및 다른 표적 부위에 의한 글루코스 사용 뿐만 아니라 간 글루코스 생산량을 조절하기 위한, 상시적인 대사적 요구를 만족시킨다. 당뇨병 환자는 상승된 혈당 수준을 나타낸다 (고혈당증). 당뇨병은 2 가지 주요 군으로 분류할 수 있다: 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병. 1형 당뇨병, 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)은 췌장에서 랑게르한스섬의 인슐린-생성 β-세포 손실로 인해 인슐린이 결핍되는 것이 특징이다. β-세포 결핍의 주요 원인은 T-세포 매개성 자가면역이다. 2형 당뇨병, 또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 (NIDDM)은 β-세포 기능이 손상된 환자에서 발생한다. 이들 환자는 감소된 인슐린 분비와 함께, 인슐린 내성 또는 감소된 인슐린 감수성을 나타낸다. 2형 당뇨병은 결국 1형 당뇨병으로 발전한다. 또한, 당뇨병에는 임신성 당뇨병이 포함된다. 당뇨병 환자에게는, 기저 인슐린 수준을 유지하고 혈당 변동을 방지하기 위해, 예컨대 식사 후에 인슐린을 투여할 수 있다.
a. 1형 당뇨병
1형 당뇨병은 췌장의 내분비 구성 단위인 랑게르한스 섬의 침윤 및 β-세포의 파괴를 특징으로 하는 T-세포 의존성 자가면역 질환으로, 인슐린 생성 결핍 및 고혈당증을 유발한다. 1형 당뇨병은 어린이 및 청소년에서 가장 흔하게 진단되나, 어느 연령에서도 진단될 수 있다. 1형 당뇨병 환자에서는, 낮은 인슐린 수준 및 높은 혈당 수준 이외에도, 다뇨, 폴리디스피아(polydispia), 다식, 안구 충혈 및 피로가 나타날 수 있다. 예컨대 글루코스 허용성 시험에서 75 g의 글루코스를 경구 주입하고 2시간 후에 126 mg/dL (7.0 mmol/l) 이상의 공복 혈장 글루코스 수준, 200 mg/dL (11.1 mmol/l) 이상의 혈장 글루코스 수준, 및/또는 200 mg/dL (11.1 mmol/l) 이상의 무작위적인 혈장 글루코스 수준이 나타날 때 환자로 진단될 수 있다.
1형 당뇨병 환자에 대한 1차 치료법은 대체 요법으로 인슐린을 투여하는 것으로, 이는 전형적으로 혈당 모니터링과 병행된다. 충분한 대체 인슐린 없이는 당뇨병 케톤산증이 발생할 수 있고, 이는 혼수상태 또는 사망을 초래할 수 있다. 속효성 인슐린을 환자에게 예를 들어 주사기 또는 인슐린 펜 또는 인슐린 펌프를 사용하여 피하 주사에 의해 투여하여, 종일 적절한 혈당 수준을 유지하고 또한 식후 글루코스 수준을 조절할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 펌프 (폐루프시스템의 내용 포함)는 인슐린을 복강내 전달하는데 사용될 수 있다. 따라서, 1형 당뇨병 환자에게 혈당 및 인슐린 수준을 보다 신속하게 제어하기 위해 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 본원에 기재된 방법을 사용하여 주사기, 인슐린 펜 또는 인슐린 펌프, 또는 인슐린 전달에 유용한 임의의 다른 수단을 통해 피하 또는 복강내 투여할 수 있다.
b. 2형 당뇨병
2형 당뇨병은 인슐린 내성과 연관이 있고, 일부 집단에서는 또한 인슐리노페니아(insulinopenia) (β-세포 기능 손실)과 연관이 있다. 2형 당뇨병에서, 인슐린의 단계 1 방출이 일어나지 않고, 단계 2 방출은 지연되고 불충분하다. 식사 중 및 식사 후에 건강한 대상에서 발생하는 인슐린 방출의 급격한 증가가 2형 당뇨병 환자에서는 지연되고, 연장되고, 양이 불충분하여, 고혈당증을 초래한다. 2형 당뇨병 환자에게 혈당 수준을 제어하기 위해 인슐린을 투여할 수 있다 (Mayfield et al (2004) Am Fam Physican 70:489-500). 이는 식이요법, 운동 및 다른 항-당뇨병 요법 (예를 들면, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드, 티아졸리딘디온 및 알파-글루코시다제 억제제)을 비롯한 다른 치료법 및 치료 처방과 함께 수행할 수 있다. 따라서, 2형 당뇨병 환자에게 혈당 및 인슐린 수준을 보다 신속하게 제어하기 위해 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 본원에 기재된 방법을 사용하여 주사기, 인슐린 펜 또는 인슐린 펌프, 또는 인슐린 전달에 유용한 임의의 다른 수단을 통해 피하 또는 복강내 투여할 수 있다. 본원에 논의되는 바와 같이, 2형 당뇨병 환자에게 초속효성 인슐린 조성물을 투여하는 것은, 상응하는 속효성 인슐린에 비해 보다 우수한 혈당 조절을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 2형 당뇨병 환자에서 종종 인슐린 요법과 연관되는 비만 및 체중 증가의 위험을 감소시킬 수 있다.
c. 임신성 당뇨병
이전에 당뇨병을 앓은 적은 없으나 임신 동안 혈당 수준이 높은 임산부는 임신성 당뇨병으로 진단받는다. 이러한 유형의 당뇨병은 연구된 집단에 따라 모든 임산부의 대략 1-14％에서 발생한다 (Carr et al., (1998) Clinical Diabetes 16). 근본적인 원인은 여전히 알려져 있지 않으나, 아마도 임신 중에 생성되는 호르몬이 임산부의 인슐린에 대한 감수성을 감소시키기 때문인 것으로 보인다. 인슐린 내성의 기제는 수용체후 결함일 수도 있는데, 이는 인슐린-감수성 세포에 의한 정상적인 인슐리 결합이 입증되었기 때문이다. 췌장은 결과적인 인슐린 내성의 증가에 반응하기 위해 1.5 내지 2.5시간 더 인슐린을 방출한다. 췌장 기능이 정상인 환자는 이러한 요구를 만족시킬 수 있다. 췌장 기능이 경계선 상에 있는 환자는 인슐린 분비를 증가시키고 어렵고, 그 결과 부족한 수준의 인슐린을 생성한다. 따라서, 말초 인슐린 내성이 증가하면서 지연된 또는 불충분한 인슐린 분비가 있는 경우에 임신성 당뇨병이 발생한다.
임신성 당뇨병 환자에게 혈당 수준을 제어하기 위해 인슐린을 투여할 수 있다. 따라서, 임신성 당뇨병 환자에게 혈당 및 인슐린 수준을 보다 신속하게 제어하기 위해 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 본원에 기재된 방법을 사용하여 주사기, 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 인공 췌장, 또는 임의의 다른 수단을 통해 피하 투여할 수 있다.
2. 중증의 환자를 위한 인슐린 요법
고혈당증 및 인슐린 내성은 내과적으로 및/또는 외과적으로 중증인 환자에서 빈번하게 발생하고, 당뇨병 및 비-당뇨병 환자 모두에서, 그리고 외상성 손상, 졸중, 무산소성 뇌 손상, 급성 심근 경색, 심장수술후 환자에서 증가하는 이환률 및 사망률, 및 다른 중대한 질병의 원인과 관련이 있다 (McCowen et al. (2001) Crit Clin. Care 17:107-124). 고혈당증이 있는 중증의 환자는 혈당 수준을 제어하기 위해 인슐린으로 치료한다. 이러한 치료법은 상기 군 중에서 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있다 (Van den Berghe et al. (2006) N. Eng. J Med. 354:449-461). 인슐린은 전형적으로 환자에게 정맥내 투여되며, 예컨대 전문의에 의한 주사기를 사용한 주사, 또는 인슐린 펌프를 사용한 주입에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, 투여량을 계산하기 위해 연산법 및 소프트웨어가 사용된다. 따라서, 고혈당증이 있는 중증의 환자에게 혈당 수준을 제어하기 위해 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물을 투여함으로써, 고혈당증을 완화시키고 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있다.
I. 병용 요법
본원에 기재된 임의의 초속효성 인슐린 조성물은 다른 생물학적 물질 및 소분자 화합물 등을 비롯한 다른 치료 물질 또는 절차와 함께, 그 이전에, 그와 교대로 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 속효성 인슐린이 처방 또는 사용된 임의의 질병 또는 상태 및 다른 물질 및 치료법이 사용될 수 있는 임의의 질병 또는 상태 (상기 예시된 모든 것 포함)를 위해, 초속효성 인슐린 조성물이 이와 함께 사용될 수 있다. 치료될 질병 또는 상태에 따라, 예시적 조합물은, 이에 한정되지는 않지만, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드, 티아졸리딘디온, 알파-글루코시다제 억제제, 펩티드 유사체 (글루카곤-유사 펩티드 (GLP) 유사체 및 위 억제 펩티드 (GIP) 유사체 포함) 및 DPP-4 억제제 등을 비롯한 항-당뇨병 약물과의 조합물을 포함한다. 다른 예에서, 본원에 기재된 초속효성 인슐린 조성물은 1종 이상의 다른 인슐린 (속효성 인슐린 및 기저형 인슐린 포함)과 함께, 이전에, 간헐적으로 또는 이후에 투여될 수 있다.
J. 제품 및 키트
본원에 제공되는 초속효성 인슐린 조성물, 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소 조성물의 약제학적 화합물은 포장 재료, 예컨대 당뇨병 또는 중증의 대상에서 혈상 수준의 제어에 효과적인 약제학적 조성물, 및 초속효성 인슐린 조성물, 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소 조성물이 혈당 수준의 제어에 사용됨을 보여주는 라벨을 함유하는 제품으로 포장될 수 있다.
본원에 제공되는 제품은 포장 재료를 함유한다. 약품 포장에 사용하기 위한 포장 재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,352호 (이들은 각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 약제학적 포장 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제제 및 의도한 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 재료를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본원에 제공되는 화합물 및 조성물의 제제의 광범위한 집단이 임의의 울혈성 질병 또는 장애에 대한 다양한 치료법으로 고려된다.
초속효성 인슐린 조성물, 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소 조성물은 또한 키트로 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 투여용 물품을 포함할 수 있다. 키트는 또한 추가의 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 한 예에서, 키트는 본원에 제공되는 1종 이상의 초속효성 인슐린 조성물, 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소 조성물 및 1종 이상의 다른 인슐린 조성물, 예를 들어 지효성 또는 중간형 인슐린 (결정질 인슐린 포함), 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 초속효성 인슐린 조성물, 인슐린 및/또는 히알루로난 분해 효소 조성물 및/또는 다른 약제학적 조성물은 투여용 장치, 예컨대 주사기, 인슐린 펜, 펌프, 또는 인슐린 펜, 펌프 또는 다른 전달 장치에 삽입되는 저장용기와 함께 공급될 수 있다. 키트는 임의로는 용량, 투약법을 비롯한 적용을 위한 설명서 및 투여 방식에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 진단용 물품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 글루코스 모니터 또는 센서를 포함할 수 있다.
예를 들어, 키트는 또한 별도의 용기에 다양한 용량으로 제공되는, 다양한 속효성 인슐린 조성물, 또는 다른 인슐린 조성물 (1종 이상의 기저형 인슐린 포함)을 함유할 수 있으며, 이로 인해 사용자는 고혈당증의 실제 발생 또는 예상되는 발생과 관련된 특정 상황에 주어진 인슐린 용량, 예컨대 식후 용량을 선택할 기회를 갖는다.
K. 실시예
아래 실시예는 단지 예시 목적으로 포함되며, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1
재조합 인간 PH20 (rHuPH20) 및 속효성 인슐린의 공동-투여는 개선된 약동학 및 약력학을 용이하게 한다.
인슐린 (인슐린 유사체 포함)을 고혈당증의 제어를 위해 진성 당뇨병을 앓고 있는 대상에게 투여하였다. 건강한 대상에서 관찰되는 정상적인 생리적 식후 인슐린 방출을 보다 효과적으로 반복하기 위한 노력으로, 재조합 인간 PH20 (rHuPH20)의 공동-투여가 투여된 속효성 인슐린의 초기 흡수 속도 및 흡수량을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위한 임상 연구를 수행하였다. 속효성 인슐린 (심지어 더 빠른 속효성 인슐린)의 흡수를 증가시켜 건강한 대상에서 관찰되는 내인성 인슐린 농도-시간 프로파일을 보다 근접하게 모방할 수 있다. 이는 진성 당뇨병을 앓고 있는 대상에서 보다 우수한 혈당 조절 및 감소된 체중 증가와 관련하여 임상 이점을 제공할 수 있다. 단독으로 또는 rHuPH20과 함께 피하 투여된 휴뮤린c R 인슐린 및 휴마로그® 인슐린 리스프로 (모두 본원에 기재된 속효성 인슐린임)의 안전성, 허용성, 약동학 (PK) 및 약력학 (PD)을 평가하기 위한 임상 연구를 설계하였다.
실시예 1a
건강한 (비-당뇨병) 대상에서 rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린 ® R 인슐린의 약동학 및 약력학
rHuPH20과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 20 유닛(U)의 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 피하 투여를 평가하기 위한 무작위적인, 이중-맹검, 교차, 2-단계, 순차적 2-아암 연구를 수행하였다. 25명의 건강한 성인 남성 대상이 연구에 등록하였다. 단계 1에서, 12명의 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20을 피하 주사하고, 별도로 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 피하 주사하였다. 보통 7일 간격으로, 대상의 절반에게는 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20을 주사한 후에 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 주사하고, 나머지 대상의 절반에게는 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 주사한 다음 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20을 주사하였다. 단계 2에서, 13명의 대상에게 휴뮤린® R 인슐린 및 rHuPH20을 피하 주사하고, 별도로 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 피하 주사하였다. 보통 7일 간격으로, 대상의 대략 절반에게는 우선 휴뮤린® R 및 rHuPH20을 주사한 후에 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 주사하고, 나머지 대상의 절반에게는 우선 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 주사한 다음 휴뮤린® R 인슐린 및 rHuPH20을 주사하였다. 각각의 주사 대략 14시간 전에, 각각의 대상에게 60 g 탄수화물이 포함된 미국 당뇨병 협회 2000-칼로리 식사 계획에 기초하여 저녁 식사를 제공하였다. 30 g 탄수화물의 스낵이 또한 제공되었다. 저녁시간 대략 6시간 후에, 대상은 적어도 8시간 동안 금식 (물 배제)을 시작하고, 이어서 8시간 기간 동안 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 절차를 시작하였다. 처치전 혈액 샘플을 수집하고, 생명 징후 및 체중을 측정하고, 이어서 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 절차를 개시하고 2시간 후에 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로, 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20, 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 주사하였다. 혈액 샘플을 아래 기재되는 바와 같이 미리 정해진 간격으로 수집하고, 글루코스 및 인슐린 수준을 6시간 기간 동안 정량하였다. A. 투여
앞서 기재된 바와 같이, 연구의 제1 단계에서 12명의 대상에게 복부 사분면의 하부 좌측에 20 U 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 300 U rHuPH20 220 ㎕ 및 20 U 휴마로그® 인슐린 리스프로 200 ㎕를 피하 투여하였다. rHuPH20 (1 mg/mL, pH 약 7.0에서, 10 mM HEPES/130 mM NaCl 중 약 120,000 U/mL에 등량)을 실온에서 1시간 동안 해동시키고, 0.153cc (18,360 U에 등량) rHuPH20을 0.3cc 용량 인슐린 주사기에 무균 흡인시켜 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 투여량을 제조하였다. 이어서, 0.153cc rHuPH20를 150 U/mL 하일레넥스 (rHuPH20) 1.17 mL를 함유하는 바이알에 서서히 옮겼다. 이 바이알로부터, 1.1 mL를 흡인하여 바이알로부터 흡인된 100 U/mL 휴마로그® 인슐린 리스프로 약 10.2 mL를 함유하는 바이알로 옮겼다. 이어서, 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 혼합물 220 마이크로리터를 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 흡인하고, 4시간 이내에 단일 대상에게 피하 투여하는데 사용하였다.
이에 따라, 전달된 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 혼합물은 220 ㎕이고, 300 U rHuPH20 (2.5 ㎍), 20 U 휴마로그® 인슐린 리스프로, 0.02 mg 인간 혈청 알부민 (하일레넥스 제제로부터, 흡착성 손실에 대해 rHuPH20을 안정화시키는 기능을 하고, 또한 인슐린에 대해 안정화 성질을 가질 수 있고/있거나 산화 스캐빈저로서 작용할 수 있음); 3 mg 글리세린 (휴마로그® 인슐린 리스프로 제제로부터; pH 완충제, 인슐린 안정화제 및/또는 긴장성 개질제로 존재함); 0.6 mg m-크레졸 (휴마로그® 인슐린 리스프로 제제로부터; 인슐린 6량체 형태를 안정화시키기 위해 상승된 농도로 존재하는 항미생물 성장 방지제); 0.004 mg 아연 (휴마로그® 인슐린 리스프로 제제로부터; 인슐린 6량체 형태를 안정화시키기 위해 사용됨); 0.18 mg NaCl (하일레넥스 제제 및 rHuPH20 API로부터, 긴장성 개질제로서); 0.4 포스페이트, 이염기성 나트륨 (하일레넥스 제제로부터, pH 완충제로서); 0.017 mg EDTA, 이나트륨 (하일레넥스 제제로부터, Zn2+ 및 Ca2+ 이온과 결합할 가능성이 있는 금속 킬레이터로서); 0.006 mg 염화칼슘 (하일레넥스 제제로부터, EDTA와 착체를 형성하고, 피하 주사 편의성을 개선시킬 수 있음); 0.006 mg HEPES (rHuPH20 API 제제로부터, pH 완충제로서); 물 (용매로서) 및 NaOH 및/또는 HCl (pH 조정용)을 함유한다.
단계 2에서, 앞서 기재된 바와 같이, 13명의 대상에게 복부 사분면 하부 좌측에 20 U 휴뮤린 R 인슐린 및 240 U rHuPH20 200 ㎕ 및 20 U 휴뮤린® R 인슐린 200 ㎕ 둘 모두를 피하 투여하였다. 우선 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 휴뮤린® R 인슐린의 바이알로부터 0.3cc (150 U)를 흡인하고, 이를 1500 U/mL rHuPH20 (하일레넥스의 10X 조성물로 제제화됨) 1.2 mL를 함유하는 바이알로 옮겨 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 투여량을 제조하였다. 혼합물을 부드럽게 혼합하고, 바이알로부터 공기 0.3cc를 제거하고, 이어서 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 200 ㎕ (20 U 휴뮤린® R 인슐린 및 240 U rHuPH20 함유)를 흡인하였다. 이를 4시간 이내에 단일 대상에게 피하 투여하는데 사용하였다. 단일 주사기를 사용하여 20 U 휴뮤린® R 인슐린 200 ㎕ 피하 투여량을 제조하였다.
이에 따라, 전달된 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 혼합물은 200 ㎕이고, 240 USP U rHuPH20 (2 ㎍), 20 U 휴뮤린® R 인슐린, 0.16 mg 인간 혈청 알부민 (10X 하일레넥스 제제로부터, 흡착성 손실에 대해 rHuPH20을 안정화시키는 기능을 하고, 또한 인슐린에 대해 안정화 성질을 제공할 수 있고/있거나 산화 스캐빈저로서 작용할 수 있음); 3 mg 글리세린 (휴뮤린® R 제제로부터, pH 완충제, 인슐린 안정화제 및/또는 긴장성 개질제로서 작용함); 0.4 mg m-크레졸 (휴뮤린® R 제제로부터, 인슐린 6량체 형태를 안정화시키기 위해 상승된 농도로 존재하는 항미생물 성장 방지제로서 작용함); 0.34 mg 아연 (휴뮤린® R 제제로부터, 인슐린 6량체 형태를 안정화시키는 작용을 함); 1.36 mg NaCl (10X 하일레넥스 제제 및 rHuPH20 API로부터, 긴장성 개질제로서 작용함); 0.224 포스페이트, 이염기성 나트륨 (10X 하일레넥스 제제로부터, pH 완충제로서); 0.161 mg EDTA, 이나트륨 (10X 하일레넥스 제제로부터, Zn2+ 및 Ca2+ 이온과 결합할 가능성이 있는 금속 킬레이터로서); 0.048 mg 염화칼슘 (10X 하일레넥스 제제로부터, EDTA와 착체를 형성하고, 피하 주사 편의성을 개선시킬 수 있음); 물 (용매로서) 및 NaOH 및/또는 HCl (pH 조정용)을 함유한다. B. 고인슐린혈증 -정상혈당 클램프 절차
피하 투여된 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 약동학 및 약력학에 대한 rHuPH20의 공동-투여의 효과를 혈액 샘플을 채취하여 인슐린 (즉, 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린) 및 글루코스 수준을 측정함으로써 평가하였다. 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 절차를 사용하여 인슐린 제제가 저혈당증을 유발하지 않고 투여될 수 있도록 혈장 글루코스 수준을 90 내지 110 mg/dL로 유지시켰다.
절차는 처음에 대상의 체중 및 신장을 재고, 5분 동안 좌석에서 휴식을 취한 후에 생명 징후를 측정하는 것으로 이루어진다. 양팔을 가열 패드에 놓아 정맥을 팽창시킨 후에 IV 카테터를 삽입하였다. 2개의 별개의 조절판을 통한 덱스트로스 20％의 주입을 위해 한 팔의 상완 정맥에 카테터를 넣었다. 다른 동맥내 카테터를 글루코스 측정을 위한 동맥혈로 변화된 혈액의 샘플링을 위해 다른 팔에 넣었다. 가열 패드를 글루코스 주입 부위로부터 치울 수 있으나, 역행 카테터 부위는 65℃로 유지하였다. 초기 혈액 샘플을 얻어 기준선 글루코스를 측정하고, 30분 후에 인슐린 제제를 주사하였다. 혈액을 휴마로그® 인슐린 리스프로, 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20, 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 주사하기 10분 및 1분 전에 샘플링하고, 이어서 처음 60분 동안 3분 마다, 60 분부터 3 시간까지 15분 마다, 이어서 6시간 이후에는 1시간 마다 샘플링하였다. 각각의 대상의 글루코스 수준을 YSI 2300 글루코스 분석기 (YSI Inc.)를 사용하는 절차를 통해 분석하고, 글루코스 주입 속도 (GIR)를 혈장 글루코스를 90 내지 110 mg/dL로 유지하는데 필요한 정도로 조정하였다. 인슐린의 순환 수준은 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린 (밀리포어 바이오파마 서비시즈 디비젼(Millipore BioPharma Services Division), St. Charles MO)을 정량하는 방사면역흡착 분석 (RIA)을 사용하여 분석하였다.
C. 속효성 인슐린의 약동학에 대한 rHuPH20 의 공동-투여의 효과
속효성 인슐린 조성물 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약동학에 대한 rHuPH20의 공동-투여의 효과를 결정하기 위해 여러 매개변수를 측정하였다. 이들에는 선택된 투여 간격 동안 측정된 최대 인슐린 농도 (Cmax); Cmax까지의시간 (tmax); 및 농도 대 시간 곡선하면적 (AUC) (다양한시간 간격 동안 평가됨)이 포함된다.
1. 인슐린 약동학에 대한 rHuPH20 및 휴마로그 ® 인슐린의 공동-투여의 효과
휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20의 투여 후에 각각의시간 간격 동안의 인슐린 농도를 RIA에 의해 평가하고, 각각 표 5 및 6에 나열하였다. 또한, 상이한시간 간격 (0분에서 x분; 예를 들어 AUC0 -3분, AUC0-6분, AUC0 -9분 등) 동안의 AUC가 상대적인 생물학적 사용가능성 (Frel)로 제공되고, 이는 [AUC0-x(휴뮤린® R 인슐린 + rHuPH20)]/[AUC0-x (휴뮤린® R 인슐린 단독)]*100으로 계산된다. 시간 간격에 걸친 기하 평균 인슐린 수준의 변화를 계산함으로써 결정되는 증분 기울기가 평균 기울기 변화로 주어지고, 이는 증분 기울기의 3개의 값의 평활된 평균이다.
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 투여 후의 혈중 인슐린 농도
면역반응성 인슐린 ( pmol /L)
시간
(분)		 평균 중앙값 SD SE 기하평균 증분 기울기 AUC(0-x) 기울기 변화 (avg)
(분) (pmol/L) (pmol/L.분) (pmol.분/L) (pmol/L.분)
0 72.4 64.8 35.2 10.2 65.2 　 　 　
3 78.7 67.8 31.8 9.6 73.2 2.67 208 　
6 82.3 84.8 24.9 7.5 79.0 1.93 436 2.85
9 96.9 86.3 36 10.8 90.8 3.94 691 2.72
12 108.0 102.0 54.2 16.4 97.7 2.28 973 3.63
15 126.3 110.6 75.5 21.8 111.7 4.67 1287 5.16
18 160.9 146.1 116 33.5 137.2 8.52 1661 6.71
21 194.0 143.6 175.8 50.7 158.1 6.95 2104 8.21
24 233.9 172.0 228.5 66.0 185.6 9.17 2619 7.25
27 273.4 198.7 296.5 85.6 202.5 5.63 3201 10.1
30 324.9 242.3 332.9 96.1 249.0 15.51 3879 13.47
33 388.1 302.3 359.2 108.3 306.8 19.26 4712 15.43
36 417.0 325.4 343.8 103.6 341.3 11.51 5685 16.68
39 485.4 355.2 419.7 121.2 399.1 19.26 6795 12.2
42 495.2 354.7 381.9 110.3 416.6 5.83 8019 13.93
45 552.6 430.4 408.6 118.0 466.7 16.71 9344 9.11
48 553.6 451.4 387.3 111.8 481.1 4.78 10766 9.9
51 576.7 483.9 384.9 111.1 505.7 8.2 12246 9.83
54 612.8 504.7 306.3 88.4 555.2 16.5 13837 3.27
57 594.1 476.6 400.1 115.5 510.5 -14.9 15436 -0.47
60 551.3 460.1 258.5 74.6 501.4 -3.03 16954 　
75 596.4 595.1 214.5 64.7 561.1 3.98 24923 　
90 573.6 556.5 193.1 55.8 541.6 -1.3 33193 　
105 584.8 575.7 131.4 37.9 571.8 2.01 41543 　
120 566.4 558.9 92.2 26.6 559.3 -0.83 50026 　
135 530.3 536.4 76.1 22.0 525.4 -2.26 58162 　
150 533.6 515.7 92.3 26.6 526.6 0.08 66052 　
165 491.6 486.8 96.9 28.0 482.8 -2.92 73623 　
180 463.1 467.1 93.3 26.9 454.2 -1.9 80650 　
240 348.6 332.3 97.8 28.2 335.7 -1.98 104350 　
300 261.1 255.5 81.6 23.6 248.7 -1.45 121882 　
360 190.4 181.9 49.5 14.3 184.2 -1.08 134867 　
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20 의 공동-투여 후의 혈중 인슐린 농도
면역반응성 인슐린 ( pmol /L)
시간
(분)		 평균 중앙값 SD SE 기하-평균 증분 기울기 AUC (0-x) 기울기 변화 (avg) Frel
(분) (pmol/L) (pmol/L.분) (pmol.분/L) (pmol/L.분) (％)
0 70.5 66.3 32.8 9.5 64.3 　 　 　 　
3 97.0 80.7 36.6 11.0 91.5 9.09 234 　 113
6 144.7 112.2 92.4 27.8 126.7 11.73 561 9.68 129
9 183.9 117.3 156.9 45.3 151.4 8.22 978 11.91 142
12 254.4 161.1 252.9 73.0 198.7 15.78 1503 15.21 154
15 354.6 216.8 391.1 112.9 263.6 21.63 2197 20.13 171
18 442.8 293.2 475.4 137.2 332.5 22.97 3091 28.43 186
21 539.4 387.6 400.5 115.6 454.6 40.7 4271 33.51 203
24 651.7 489.4 426.4 123.1 565.2 36.86 5801 40.17 221
27 759.8 621.2 390.2 112.6 694.0 42.94 7690 35.71 240
30 839.7 705.4 414.5 119.7 775.9 27.31 9895 37.81 255
33 958.2 791.4 360.4 104.0 905.4 43.17 12417 33.44 263
36 1040.5 890.4 352.4 101.7 994.9 29.83 15267 30.15 269
39 1118.0 940.3 445.8 128.7 1047.3 17.47 18331 18.89 270
42 1138.7 991.1 431.6 124.6 1075.5 9.38 21515 20.93 268
45 1239.1 1181.6 408.6 118 1183.3 35.93 24903 12.26 267
48 1234.0 1128.7 497.1 143.5 1157.6 -8.53 28414 6.46 264
51 1173.8 1124.0 326.9 94.4 1133.6 -8.01 31851 -12.3 260
54 1095.6 1070.5 236.6 68.3 1072.6 -20.34 35160 -57.21 254
57 924.7 961.4 433.0 125.0 642.7 -143.29 37733 -16.71 244
60 1055.0 1006.7 363.8 105.0 983.2 113.48 40172 　 237
75 926.2 890.4 218.2 63.0 905.2 -5.2 54335 　 218
90 818.2 788.9 212.1 61.2 793.7 -7.43 67077 　 202
105 689.7 667.7 175.3 50.6 666.6 -8.47 78029 　 188
120 586.5 571.2 145.3 41.9 569.5 -6.48 87300 　 175
135 492.5 482.9 124.2 35.8 478.0 -6.1 95157 　 164
150 423.0 432.4 127.4 36.8 405.3 -4.85 101781 　 154
165 371.6 363.2 114.8 33.1 354.7 -3.37 107481 　 146
180 342.0 339.6 95.4 27.5 329.3 -1.69 112610 　 140
240 232.4 248.8 83.0 24.0 218.1 -1.85 129033 　 124
300 178.3 146.6 75.0 21.7 164.1 -0.9 140501 　 115
360 148.7 135.1 62.6 18.1 136.6 -0.46 149523 　 111
휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20과 공동-투여된 휴마로그® 인슐린 리스프로에 대한 Cmax (pmol/L), tmax (분) 및 AUC0-360 (분*pmol/L)이 표 7에 제공되어 있다. 상이한 시간 간격 동안의 AUC는 표 8에 제공되어 있다. 그 결과는 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여받은 대상이 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여받은 대상보다 초기시간 간격에서 휴마로그® 리스프로 인슐린에 더 많이 노출된다는 것을 나타낸다. 표 9는 각각의 투여 순서에 대한 특정 PK 매개변수 (예를 들어, 첫번째 (1) 또는 두번째 (2) 및 둘(모두) 투여된 휴마로그 인슐린 리스프로/rHuPH20에 대한 PK)의 요약, 및 투여 순서가 관찰된 약동학에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 통계학적 요약을 제공한다. 통계학적 분석은 상이한 처치군 (즉, 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 대 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20)을 사용하여 관찰된 PK의 차이, 및 상이한 투여 순서 (즉, 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여한 후에 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여하는 순서, 대 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여한 후에 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하는 순서)를 사용하여 관찰된 PK의 차이의 p-값을 결정하였다. 또한 이 표에는 상대적인 생물학적 사용가능성 (Frel)이 제공되어 있고, 이는 [AUC0-360 (휴마로그® 인슐린/rHuPH20)]/[AUC0-360 (휴마로그® 인슐린 단독)]*100으로 계산된다.
인슐린 PK의 경우, 중앙 tmax는 rHuPH20과 공동-투여시 105분에서 48분으로 (p=0.0006) 54％ 감소하였고, 12명의 모든 대상에서 효과가 관찰되었다. 평균 Cmax는 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때의 697 pmol/L에서 rHuPH20과 공동-투여시 1,300 pmol/L로 (p=0.0003) 87％ 증가하였다. AUC0-360분은 134,867 분*pmol/L에서 149,523 분*pmol/L로 11％ 증가한 한편, 보다 이른시간 간격에서 차이는 보다 분명하였다 (즉, AUC0-30분 및 AUC0-60분은 각각 155％ 및 140％ 증가함). tmax의 대상간 가변성 (SD/평균)은 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때의 34％에서 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 rHuPH20과 함께 투여하였을 때 17％로 개선되었다. 이 실시예는 휴마로그® 인슐린 리스프로가 히알루로난 분해 효소 (rHuPH20)와의 공동-투여에 의해 여기서 기재된 초속효성 인슐린이 된다는 것을 입증한다.
rHuPH20 과 공동 투여된 및 공동 투여되지 않은 피하 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 주사 후의 인슐린의 약동학
처치 대상_ID Cmax
(pmol/L)		 tmax
(분)		 AUC0-360
(분*pmol/L)		 Frel
휴마로그® 단독
　
　		 1 590 105 136000
2 496 57 126000
3 562 105 106000
4 721 90 150000
5 972 54 154000
6 449 150 105000
7 1770 39 174000
8 795 75 156000
9 672 120 138000
10 502 120 113000
11 851 105 183000
12 631 150 160000 　
N 12 12 12
평균 751 98 142000
SD 357 36 25600
중앙값 652 105 144000
기하 평균 697 91 139000
CV％ 기하 평균 38.8 44 18.8 　
휴마로그® + rHuPH20 대상_ID Cmax
(pmol/L)		 tmax
(분)		 AUC0-360
(분*pmol/L)		 Frel (％)
1 1090 54 192000 141
2 1310 57 161000 128
3 1640 48 172000 162
4 853 48 146000 97
5 1140 45 130000 84
6 971 57 139000 132
7 2000 30 152000 87
8 2420 48 186000 119
9 1320 45 135000 98
10 930 57 123000 109
11 1590 39 189000 103
12 1080 48 179000 112
N 12 12 12 12
평균 1360 48 159000 114
SD 473 8 24500 23
중앙값 1230 48 157000 110
기하 평균 1300 47 157000 112
CV％ 기하 평균 32.8 19 15.7 　
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 단독 또는 rHuPH20 과 공동-투여된 휴마로그 ® 인슐린 리스프로의 기하 평균 인슐린 농도에 대한시간 간격 AUC
시간 간격
 AUC (분*pmol/L)
휴마로그® 단독 휴마로그® + rHuPH20 차이(백분율)a
0-15 1287 2197 70.7
0-21 2104 4271 103.0
0-30 3879 9895 155.1
0-45 9344 24903 166.5
0-60 16954 40172 136.9
0-75 24923 54335 118.0
0-90 33193 67077 102.1
0-120 50026 87300 74.5
0-150 66052 101781 54.1
0-180 80650 112610 39.6
0-360 134867 149523 10.8
a 차이 (백분율): (AUC0-x [rHuPH20] - AUC0-x [rHuPH20 없음])/(AUC0-x [rHuPH20 없음])
관찰된 약동학에 대한 휴마로그 ® 인슐린 리스프로의 투여 순서의 효과
처치 투여 순서 Cmax tmax AUCall
휴마로그® 1 평균 688 94 140000
SD 172 38 21000
SE 70 16 8600
2 평균 814 102 143500
SD 491 37 31600
SE 200 15 12900
All 평균 751 98 141800
SD 357 36 25700
SE 103 10 7400
휴마로그® + rHuPH20 1 평균 1239 48 156800
SD 456 11 27800
SE 186 4 11400
2 평균 1485 49 160500
SD 498 4 23300
SE 203 2 9500
All 평균 1362 48 158700
SD 473 8 24500
SE 137 2 7100
처치 차이 p-값 0.0003 0.0006 0.0760
순서 군 효과 p-값 0.7889 0.7783 0.9948
2. 인슐린 약동학에 대한 rHuPH20 및 휴뮤린 ® R 인슐린의 공동-투여의 효과
단계 2에서, 환자에게 보통 7일 간격으로 우선 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여한 후에 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여하거나, 또는 우선 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여한 후에 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여하였다. 휴뮤린® R 인슐린의 투여 또는 rHuPH20과 휴뮤린® R 인슐린의 공동-투여 이후 각각의 시점에서의 인슐린의 농도가 각각 표 10 및 11에 제공되어 있다. 상이한시간 간격 동안의 AUC (즉 0분에서 x분까지 동안의 AUC (AUC(0-x)); 예를 들어 AUC0-3분, AUC0-6분, AUC0-9분 등) (표 10, 11 및 12)가 상대적 생물학적 사용가능성 (Frel)로 제공되고, 이는 [AUC0-x (휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20)]/[AUC0-x (휴뮤린® R 인슐린 단독)]*100으로 계산된다. 또한시간 간격에 걸친 기하 평균 인슐린 수준의 변화를 계산함으로써 결정되는 증분 기울기가 평균 기울기 변화로 주어지고, 이는 증분 기울기의 5개의 값의 평활된 평균이다.
휴뮤린 ® R 인슐린 투여 후의 혈중 인슐린 농도
면역반응성 인슐린 ( pmol /L)
시간(분) 평균 중앙값 SD SE 기하평균 증분 기울기 AUC (0-x) 기울기 변화 (avg)
0 67.4 59.2 29.8 8.3 62.4 　 　 　
3 62.3 59.5 26.9 7.5 58.3 -1.38 181 　
6 70.3 62.8 29.7 8.2 65.4 2.37 366 　
9 70.1 64.9 26.1 7.2 66.0 0.22 564 0.75
12 71.1 66.3 28.8 8.0 66.5 0.15 762 1.72
15 79.2 74.8 32.3 9.0 73.6 2.38 973 2.18
18 89.8 86.8 34.2 9.5 84.1 3.47 1209 3.29
21 104.2 103.4 36.5 10.1 98.1 4.68 1482 4.92
24 123.3 130.5 46.1 13.9 115.3 5.75 1802 6.39
27 149.8 143.2 57.6 16.0 140.2 8.3 2186 7.59
30 179.4 171.3 59.6 16.5 169.5 9.75 2650 7.45
33 208.9 202.8 69.9 19.4 198.0 9.5 3202 8.02
36 223.9 238.6 79.6 22.1 209.9 3.97 3813 7.30
39 248.3 231.6 78.7 21.8 235.6 8.57 4482 6.12
42 261.4 265.9 79.7 22.1 249.8 4.74 5210 4.57
45 272.3 274.1 78.1 21.7 261.2 3.81 5976 3.90
48 279.8 280.0 87.6 24.3 266.6 1.78 6768 3.00
51 278.6 262.5 77.2 21.4 268.4 0.59 7570 3.04
54 292.2 255.0 84.3 23.4 280.5 4.06 8394 2.49
57 313.7 278.3 110.6 30.7 295.4 4.95 9258 　
60 316.2 280.3 111.2 30.8 298.6 1.05 10149 　
75 349.0 320.4 132.7 36.8 325.5 1.79 14829 　
90 358.0 298.9 152.1 42.2 329.5 0.27 19741 　
105 364.8 363.6 128.5 35.6 344.9 1.03 24798 　
120 372.9 339.6 111.2 30.8 358.8 0.92 30076 　
135 400.8 402.8 123.6 34.3 382.6 1.59 35636 　
150 423.1 490.9 165.2 45.8 391.9 0.62 41445 　
165 423.9 424.9 164.1 45.5 392.6 0.04 47329 　
180 412.6 447.9 148.0 41.1 386.2 -0.43 53169 　
240 336.0 309.9 90.4 26.1 325.8 -1.01 74528 　
300 308.6 292.8 77.0 21.4 299.7 -0.43 93292 　
360 242.9 238.7 64.5 17.9 234.5 -1.09 109319 　
휴뮤린 ® R 인슐린 및 rHuPH20 의 공동-투여 후의 혈중 인슐린 농도
면역반응성 인슐린 ( pmol /L)
시간(분) 평균 중앙값 SD SE 기하-평균 증분 기울기 AUC (0-x) 기울기 변화 (avg) Frel
0 55.0 56.9 14.6 4.1 53.2 　 　 　
3 94.7 95.6 20.3 5.6 92.5 13.08 219 　 121
6 148.3 142.9 40.6 11.3 141.7 16.42 570 　 156
9 194.2 174.7 43.7 12.1 189.9 16.07 1067 13.2 189
12 223.1 227.3 66.1 18.3 213.2 7.76 1672 16.3 219
15 262.2 250.1 75.6 21.0 251.3 12.69 2369 16.67 244
18 352.8 331.6 108.1 30.0 336.9 28.54 3251 17.25 269
21 402.0 381.5 96.6 26.8 391.7 18.27 4344 18.16 293
24 463.7 437.6 126.5 38.1 448.6 18.97 5605 10.86 311
27 504.5 506.6 135.6 37.6 485.6 12.33 7006 17.39 321
30 492.0 477.1 210.5 58.4 414.3 -23.79 8356 17.64 315
33 614.5 620.5 146.8 40.7 597.8 61.16 9874 14.5 308
36 675.7 676.6 167.1 46.3 656.3 19.51 11755 19.13 308
39 690.4 649.8 194.2 53.9 666.1 3.28 13739 21.57 307
42 805.2 786.4 244.9 67.9 772.6 35.49 15897 12.53 305
45 772.3 741.5 235.2 65.2 737.9 -11.57 18162 11.13 304
48 809.8 811.3 204.4 56.7 785.7 15.95 20448 10.65 302
51 847.7 822.0 209.2 58.0 823.2 12.5 22861 6.13 302
54 854.1 800.2 222.3 61.6 825.9 0.88 25335 5.77 302
57 894.5 840.2 242.6 67.3 864.5 12.87 27870 　 301
60 852.3 818.3 229.2 63.6 824.4 -13.37 30404 　 300
75 916.8 937.5 226.5 62.8 890.9 4.44 43268 　 292
90 835.2 858.4 269.4 74.7 796.4 -6.3 55923 　 283
105 774.9 692.0 314.6 87.2 703.0 -6.23 67169 　 271
120 666.1 650.6 248.7 69.0 620.1 -5.53 77092 　 256
135 599.7 557.3 233.7 64.8 550.2 -4.66 85868 　 241
150 573.9 514.9 185.5 51.5 549.5 -0.05 94116 　 227
165 522.3 452.2 166.8 46.3 500.2 -3.29 101988 　 215
180 446.2 445.7 100.7 27.9 435.6 -4.31 109007 　 205
240 250.5 255.7 61.2 17.7 243.1 -3.21 129369 　 174
300 172.7 161.0 62.8 17.4 161.3 -1.36 141501 　 152
360 115.5 123.6 36.9 10.2 109.2 -0.87 149614 　 137
휴뮤린 ® R 인슐린 단독 또는 rHuPH20 과 공동-투여된 휴뮤린 ® R 인슐린에 대한 기하 평균 인슐린 농도에 대한 시간 간격 AUC
시간 간격 AUC (분*pmol/L)
휴뮤린® R 단독 휴뮤린® R + rHuPH20 차이 (백분율)
0-15 973 2369 143.5
0-21 1482 4344 193.1
0-30 2650 8356 215.3
0-45 5976 18162 203.9
0-60 10149 30404 199.6
0-75 14829 43268 191.8
0-90 19741 55923 183.3
0-120 30076 77092 156.3
0-150 41445 94116 127.1
0-180 53169 109007 105.0
0-360 109319 149614 36.9
a 차이 (백분율): (AUC0-x [rHuPH20] - AUC0-x [rHuPH20 없음])/(AUC0-x [rHuPH20 없음])
3. rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴마로그 ® 인슐린 및 휴 뮤린 ® R 인슐린의 약동학의 비교
rHuPH20과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약동학을 비교하였다. 도 1은 각각의 시간 간격에서의 기하 평균 (각각의 조성물에 대한 모든 대상에 있어서) 인슐린 농도의 플롯을 도시한다. 휴마로그® 및 휴뮤린® R 둘 모두의 경우, 농도-시간 곡선이 위로 (보다 높은 인슐린 농도) 및 좌측으로 (보다 빠른 시간) 이동하였다. 예를 들어, rHuPH20의 존재하에 기하 평균 최대 인슐린 농도 (Cmax)는 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (697 pmol/L에서 1200 pmol/L로) 거의 2배가 되고, 휴뮤린® R의 경우 (433 pmol/L에서 967 pmol/L) 2배가 넘었다. 이와 유사하게, rHuPH20의 존재하에 상기 최대 농도에 도달하는데 소요되는시간 (tmax) 중앙값은 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (105분에서 48 분으로) 감소하고 휴뮤린® R의 경우 (165분에서 60 분으로) 감소하였다. 이와 같은 보다 이른 시점에서의 보다 높은 농도로의 이동은 증가된 흡수 속도 및 일정한 제거 속도와 일치한다. 이와 같이, rHuPH20의 공동-투여는 휴마로그® 인슐린 리스프로 (속효성 인슐린 유사체) 및 휴뮤린® R 인슐린 (속효성 레귤러 인슐린) 둘 모두의 흡수 속도는 증가시킨다.
자연적인 식후 인슐린 반응은 식사 후 처음 10 내지 15분에 걸쳐 발생하는 즉각적인 볼루스를 포함한다. 이러한 인슐린 수준의 급격한 상승은 순환계로의 간 글루코스 방출을 막는 중요한 생리적 신호를 제공한다. 따라서, 15 분에 걸친 인슐린 농도의 상승이 특히 중요한 매개변수이다. 상기 제시된 데이타는 휴마로그® 투여 15분 후에 기하 평균 인슐린 리스프로 농도가 이들이 rHuPH20 없이 사전투여된 수준으로부터 (65 pmol/L에서 112 pmol/L로) 70％ 증가하였으나, rHuPH20과 공동-투여시에 상기 농도가 (64 pmol/L에서 264 pmol/L로) 4배가 넘었음을 입증한다. 심지어 보다 극적으로는, rHuPH20 없이 투여된 휴뮤린® R의 경우 기하 평균 인슐린 농도가 (62 pmol/L에서 74 pmol/L로) 약간만 증가하였으나, rHuPH20과 공동-투여시 다시 (53 pmol/L에서 251 pmol/L로) 4배가 넘게 증가하였다. 이와 같이, rHuPH20과의 공동-투여는 인슐린 농도의 급격한 상승을 제공하고, 이는 건강한 개체에서의 초기 생리적 식후 인슐린 반응을 보다 잘 보여준다.
자연적인 식후 반응은 대략 2시간 동안 지속되고, 식사시간 탄수화물에 대한 혈당 조절을 제공하므로, 처음 대략 2시간에 걸쳐 누적된 인슐린 체노출이 특히 중요한 다른 매개변수이다. 본원에 제공된 데이타에 따라, 처음 2시간 동안의 기하 평균 인슐린 곡선 아래 누적된 면적 (AUC0-120)가 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (50,000 분*pmol/L에서 87,000 분*pmol/L로) 증가하고, 휴뮤린® R의 경우 (30,000 분*pmol/L에서 77,000 분*pmol/L로) 증가하였다. 이와 유사하게, 자연적인 식후 반응은 식사후 약 4 시간까지 효과적으로 완료되고, 식후시간 인슐린 노출은 저혈당 변동을 일으킬 수 있다. 4시간 부터 6시간에 마지막으로 관찰할 때까지의 상응하는 노출 (AUC240-360)은 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (31,000 분*pmol/L에서 20,000 분*pmol/L로) 감소하고, 휴뮤린® R의 경우 (35,000 분*pmol/L에서 20,000 분*pmol/L로) 감소하였다. 이와 같이, rHuPH20과의 공동-투여는, rHuPH20과 공동-투여한 경우 대조군에 비해 각각 바람직한 인슐린 노출을 175％ 및 256％ 증가시키고, 바람직하지 않은 인슐린 노출을 67％ 및 58％ 감소시켰다.
인슐린 투여의 약동학에서 환자간 가변성은 전문의가 환자에게 치료 수준 아래에서의 인슐린 요법을 도입하고, 환자로의 과다투여 및 저혈당 사건의 위험을 방지하기 위해 투여량을 점진적으로 증가시킬 것을 필요로 한다. 약동학에서의 가변성은 주요 매개변수에 대한 변동 계수 (CV; 표준 편차/평균으로 정의, 전형적으로 백분율로 표시)로 표현할 수 있다. 대상들 간에 비교한 최대 농도 (Cmax)의 CV는 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (48％에서 35％로) 감소하고, 휴뮤린® R의 경우 (34％에서 26％로) 감소하였다. 최대 농도까지의시간 (tmax)의 CV는 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (48％에서 35％로) 감소하고, 휴뮤린® R의 경우 (32％에서 28％로) 감소하였다. 상기 데이타는 투여후 처음 15 분에 걸친 인슐린 농도 변화의 CV가 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (147％에서 141％로) 감소하고, 휴뮤린® R의 경우 (165％에서 40％로) 감소하였음을 입증한다. 처음 2시간에 걸친 누적 인슐린 노출 (AUC0-120)의 CV는 rHuPH20의 존재하에 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 (41％에서 22％로) 감소하고, 휴뮤린® R의 경우 (34％에서 26％로) 감소하였다. 이와 같이, 인슐린 약동학의 환자간 가변성은 인슐린이 rHuPH20과 공동-투여되었을 때 대조군에 비해 감소하였다.
휴뮤린® R 인슐린에 대한 약동학은 rHuPH20의 공동-투여에 의해 개선되었으며, 이에 의해 상기 약동학은 rHuPH20과 공동-투여되었을 때 휴마로그® 인슐린 리스프로의 약동학 프로파일과 실질적으로 비슷하였다. 특히, rHuPH20과 공동-투여된 경우 2개의 상이한 유형의 인슐린 사이에서 처음 20 분에 걸친 인슐린 흡수 속도 및 인슐린 혈청 수준은 대등하였다 (표 9 및 13 참조). 반면, rHuPH20 없이 투여된 경우, 휴뮤린® R 인슐린은 초기시간 간격에서 휴마로그® 인슐린 리스프로에 비해 훨씬 더 느린 흡수 속도 및 감소된 흡수 수준을 나타내었다. 이와 같이, rHuPH20 (히알루로난 분해 효소) 및 속효성 인슐린의 조합은 보다 빠르고, 속효성 인슐린 단독에 비해 더 큰 정도로, 초기시간 (즉, 투여후 20분 미만) 동안 속효성 인슐린의 유형과 실질적으로 무관하게 작용하는 조성물을 제공한다.
D. 글루코스 주입 속도 ( GIR ) 약력학에 대한 rHuPH20 의 공동-투여의 효과 rHuPH20과의 공동-투여의 약력학 효과가 글루코스 주입 속도 (GIR)에 대해 나타나는지 평가하기 위해, 다양한 약력학 (또는 당역학 (GD)) 매개변수를 rHuPH20과 함께 또는 rHuPH20 없이 휴뮤린® R을 투여한 대상에 대해 결정하였다. 이들은 최대 효과까지의시간 (tGIRmax) (분); 후기 절반-최대 효과까지의시간 (tGIR후기 50％) (분); 초기 절반-최대 효과까지의시간 (tGIR초기 50％) (분); 최대 대사 효과 (GIRmax) (mL/hr); AUC-GIR0-60분; AUC-GIR0-120분; AUC-GIR0-180분; AUC-GIR0-240분; AUC-GIR0-300분; 및 AUC-GIR0-360분을 포함한다. GIR을 시간 당 주입된 덱스트로스의 밀리리터 (mL/hr)로 표현하였고, 이는 다음 식을 사용하여 mg/kg/분으로 전환시킬 수 있다:
GIR (mg/kg/분) = [IV 주입 속도 (mL/hr) × 덱스트로스 농도 (g/dL) × 0.0167/대상의 질량 (kg), 여기서 덱스트로스 농도 = 190.6 mg/mL.
1. GIR 약력학에 대한 휴마로그 ® 인슐린과 rHuPH20 의 공동-투여의 효과 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여한 후 각각의시간 간격에 대한 글루코스 주입 속도를 계산하고, 각각 표 13 및 14에 나타내었다. 또한, AUC (누적 글루코스 투여에 비례) 및 상대적 AUC (Frel)를 계산하였다. 또한,시간 간격에 걸쳐 GIR의 변화를 계산함으로써 결정된 증분 기울기를 나타내었다.
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 투여 후의 글루코스 주입 속도
GIR (IV 주입 속도, mL/hr)
시간 평균 중앙값 SD SE 증분 기울기 AUC(0-x)
(분) (mL/hr) (mL/hr*분) (분*mL/hr)
0 3.1 0 7.4 2.1 　 　
3 8.4 0 13.6 3.9 1.78 17
6 9.8 0 16.3 4.7 0.44 45
9 10.8 0 16.0 4.6 0.36 75
12 10.8 0 16.0 4.6 0 108
15 11.0 0 16.4 4.7 0.06 141
18 11.3 0 17.1 4.9 0.08 174
21 14.1 9.0 16.3 4.7 0.94 212
24 15.9 13.0 15.9 4.6 0.61 257
27 20.9 20.5 19.7 5.7 1.67 312
30 24.3 22.0 20.4 5.9 1.11 380
33 29.7 29.5 16.2 4.7 1.81 461
36 35.8 37.5 18.0 5.2 2.03 559
39 42.0 39.5 20.3 5.9 2.08 676
42 50.1 46.0 27.3 7.9 2.69 814
45 55.7 48.0 32.9 9.5 1.86 972
48 63.0 55.5 37.2 10.7 2.44 1150
51 68.3 57.5 42.0 12.1 1.75 1347
54 76.6 69.0 53.2 15.4 2.78 1565
57 85.7 75.5 69.4 20.0 3.03 1808
60 97.7 82.5 90.0 26.0 4 2083
75 112.3 80.0 77.2 22.3 0.97 3657
90 130.7 93.0 77.3 22.3 1.23 5479
105 142.3 114.0 73.0 21.1 0.78 7527
120 155.3 122.0 79.7 23.0 0.86 9759
135 166.4 143.5 76.1 22.0 0.74 12171
150 170.7 148.0 75.4 21.8 0.28 14699
165 175.8 151.5 74.6 21.5 0.34 17297
180 178.4 162.5 73.8 21.3 0.18 19954
240 184.9 167.0 88.3 25.5 0.11 30854
300 141.3 130.0 67.4 19.4 -0.73 40641
360 110.3 105.0 50.8 14.7 -0.52 48191
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20 의 공동-투여 후의 글루코스 주입 속도
GIR (IV 주입 속도)
시간 평균 중앙값 SD SE 증분 기울기 AUC(0-x) Frel
(분) (mL/hr) (mL/hr*분) (분*mL/hr) (％)
0 5.4 0 9 2.6 　 　
3 8.8 0 13.5 3.9 1.15 21 124
6 15.8 10 18.1 5.2 2.31 58 131
9 11.8 0 14.8 4.3 -1.31 100 132
12 13.6 0 17.2 5.0 0.58 138 128
15 17.0 10 18.6 5.6 1.14 184 131
18 20.9 25 19.1 5.8 1.3 240 138
21 26.3 27 23.6 7.1 1.79 311 147
24 33.8 29.5 27.1 7.8 2.52 401 156
27 43.9 40 32.7 9.4 3.36 518 166
30 53.8 49.5 36.2 10.5 3.31 665 175
33 68.1 59 43.5 12.6 4.75 847 184
36 82.1 68.5 49.4 14.3 4.67 1073 192
39 104.0 80 64.5 18.6 7.31 1352 200
42 115.5 89 64.7 18.7 3.83 1681 207
45 127.9 96.5 64.1 18.5 4.14 2046 210
48 134.8 104 66.8 19.3 2.31 2440 212
51 142.6 107.5 72.1 20.8 2.58 2856 212
54 145.8 112 70.6 20.4 1.08 3289 210
57 146.8 121 60.7 17.5 0.31 3728 206
60 159.2 124.5 71.1 20.5 4.14 4187 201
75 174.6 138.5 84.8 24.5 1.03 6690 183
90 186.3 176 77.0 22.2 0.78 9397 172
105 182.3 147 78.9 22.8 -0.27 12162 162
120 180.2 131.5 83.5 24.1 -0.14 14881 152
135 183.8 132 88.8 25.6 0.24 17611 145
150 184.8 139 87.1 25.2 0.06 20375 139
165 185.0 143.5 88.8 25.6 0.02 23148 134
180 181.8 139.5 85.1 24.6 -0.22 25899 130
240 139.7 129.5 75.1 21.7 -0.7 35541 115
300 98.6 85 61.2 17.7 -0.68 42689 105
360 87.7 65 62.6 18.1 -0.18 48276 100
또한 다양한시간 간격 동안의 GIRmax, tmax, 및 AUC-GIR을 이들 대상에 대해 결정하고, 표 15 및 16에 나타내었다. 표 17은 각각의 투여 순서에 대한 PD 매개변수 (예를 들어 첫번째 (1) 또는 두번째 (2) 및 둘(모두) 투여된 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20에 대한 GIR PD), 및 투여 순서가 관찰된 약력학에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위한 통계학적 분석의 요약을 제공한다. 통계학적 분석으로 상이한 처치군 (즉, 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 대 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20)을 사용하여 관찰된 PD의 차이, 및 상이한 투여 순서 (즉, 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여한 후에 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여하는 순서, 대 우선 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 투여한 후에 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하는 순서)를 사용하여 관찰된 PK의 차이의 p-값을 결정하였다.
rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 피하 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 주사 후의 인슐린의 약력학
처치 대상_ID GIRmax 50％GIRmax tGIR초기50％
(분)		 tGIR후기50％
(분)
휴마로그®
단독		 1 137 68.5 83 NC
2 326 163 98 NC
3 247 124 68 NC
4 178 89.0 83 NC
5 119 59.5 68 330
6 158 79.0 98 NC
7 350 175 53 270
8 90.0 45.0 47 NC
9 115 57.5 83 330
10 180 90.0 68 330
11 132 66.0 56 NC
12 382 191 68 330
N 12 12 12 5
평균 201 101 72 318
SD 100 50.2 17 27
SE 29.0 14.5 5 12
중앙값 168 84.0 68 330
기하 평균 181 90.4 70 317
CV％ 기하 평균 50.5 50.5 24 9
휴마로그® + rHuPH20 1 126 63.0 44 270
2 320 160 32 270
3 385 193 44 270
4 200 100 83 360
5 149 74.5 50 270
6 260 130 NC NC
7 223 112 26 330
8 109 54.5 29 210
9 154 77.0 42 210
10 257 129 38 270
11 138 69.0 38 NC
12 336 168 47 330
N 12 12 11 10
평균 221 111 43 279
SD 91.1 45.6 15 49
SE 26.3 13.2 5 16
중앙값 212 106 42 270
기하 평균 205 102 41 275
CV％ 기하 평균 43.8 43.8 32 18
NC = 계산되지 않음
rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 피하 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 주사 후의 인슐린의 약력학 - 간격 GIR - AUC .
처치 대상 ID GIRmax tmax GIR AUC (분*mL/hr)
0-60 분 0-120 분 0-180 분 0-240 분 0-360 분
휴마로그®
1 137 240 1040 5400 13200 21400 33800
2 326 150 3300 14000 33100 52200 82800
3 247 240 1770 13500 27100 41400 66500
4 178 240 1940 8570 18600 29200 46500
5 119 180 1050 5340 11400 18500 28700
6 158 240 752 4780 12600 21800 39200
7 350 60 4920 22100 37600 50900 68900
8 90.0 135 1490 5390 10500 15500 23100
9 115 165 590 4200 10500 17100 25800
10 180 180 2030 9090 18700 29400 44400
11 132 240 2880 8070 14600 22000 35600
12 382 240 3240 16700 31600 50800 83000
N 12 12 12 12 12 12 12
평균 201 193 2080 9760 20000 30900 48200
SD 100 58 1280 5640 9800 14200 21600
SE 29.0 17 371 1630 2830 4090 6250
중앙값 168 210 1850 8320 16600 25600 41800
범위 292 180 4330 17900 27100 36800 59900
기하 평균 181 181 1740 8470 18000 28100 44000
CV％ 기하 평균 50.5 42.5 71.9 59.1 50.1 47.3 46.9
휴마로그® + rHuPH20
　		 1 126 60 2180 8600 15400 21200 28500
2 320 135 7800 24500 43400 58800 72300
3 385 75 5330 25800 43500 58100 77000
4 200 90 3020 11400 19300 28100 43200
5 149 165 1990 9250 17600 24100 31400
6 260 360 2100 9780 16300 22200 36400
7 223 135 6590 19300 32200 42400 55500
8 109 57 3670 10200 15900 19900 24200
9 154 75 2250 10300 16500 21300 27300
10 257 150 6070 18800 34000 48100 62600
11 138 165 3640 10600 18700 26000 36800
12 336 165 5610 19900 38200 56300 84100
N 12 12 12 12 12 12 12
평균 221 136 4190 14900 25900 35500 48300
SD 91.1 82 2010 6350 11400 15900 21200
SE 26.3 24 582 1830 3290 4600 6120
중앙값 212 135 3650 11000 19000 27000 40000
범위 276 303 5810 17200 28100 38900 59800
기하 평균 205 118 3750 13700 23800 32500 44200
CV％ 기하 평균 43.8 57.5 52.9 42.8 44.6 46.1 46.0
관찰된 약력학에 대한 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 투여 순서의 효과
처치 투여
순서		 Cmax tmax GIR AUC (분*mL/hr)
0-60 분 0-120 분 0-180 분 0-240 분 0-360 분
휴마로그® 단독 1 평균 213 185 1910 9860 20700 32580 51650
SD 123 45 1130 5470 11030 17460 28930
SE 50 18 460 2230 4500 7130 11810
2 평균 189 200 2260 9670 19220 29120 44730
SD 81 73 1510 6340 9380 11300 12810
SE 33 30 620 2590 3830 4610 5230
모두 평균 201 193 2080 9760 19960 30850 48190
SD 100 58 1280 5640 9790 14140 21630
SE 29 17 370 1630 2830 4080 6250
휴마로그® 및 rHuPH20 1 평균 201 160 3930 13080 22650 31330 43830
SD 58 105 1950 4720 8240 11210 12870
SE 24 43 800 1930 3370 4580 5260
2 평균 242 112 4440 16660 29180 39750 52720
SD 118 49 2230 7650 13860 19760 27830
SE 48 20 910 3120 5660 8070 11360
모두 평균 221 136 4190 14870 25920 35540 48280
SD 91 82 2010 6340 11390 15940 21190
SE 26 24 580 1830 3290 4600 6120
처치 차이 p-값 0.3502 0.0627 0.0002 0.0011 0.0044 0.0484 0.9746
순서 군 효과 p-값 0.5517 0.3445 0.9365 0.5879 0.5219 0.5075 0.5403
글루코스 주입 속도 PD 데이타는 최대 효과까지의시간 (tGIRmax)이 환자에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 rHuPH20과 함께 투여하였을 때 (중앙값 135분) 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때 (중앙값 210분)에 비해 36％ 단축되고, 최대 대사 효과 (GIRmax)가 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때의 평균 181 mL/hr에서 대상에게 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20을 투여하였을 때의 205 mL/hr (p=0.35)로 13％로 증가함을 보여주는 PK 결과를 뒷받침한다. 초기 절반-최대 효과까지의시간 (tGIR초기 50％)은 환자에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때의 중앙값 68분에서 환자에게 휴마로그® 인슐린 리스프로를 rHuPH20를 함께 투여하였을 때의 42분 (p=0.0006)으로 38％ 감소하였다.
2. GIR 약력학에 대한 휴뮤린 ® R 인슐린과 rHuPH20 의 공동-투여의 효과 단계 2에서, 환자에게 보통 7일 간격으로 우선 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여한 후에 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여하거나, 또는 우선 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여한 후에 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여하였다. 휴뮤린® R 인슐린 단독 또는 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여한 후에 각각의시간 간격 동안의 글루코스 주입 속도를 계산하고, 각각 표 18 및 19에 나타내었다. 또한, 다양한시간에 걸쳐 주입된 글루코스의 상대적 양 (Grel) 및 AUC를 계산하였다. 또한,시간 간격에 걸친 GIR의 변화를 계산함으로써 결정된 증분 기울기를 나타내었다.
휴뮤린 ® R 인슐린 투여 후의 글루코스 주입 속도
GIR
시간(분) 평균 중앙값 SD SE 증분 기울기 AUC(0-x)
(분) (mL/hr) (mL/hr*분) (분*mL/hr)
0 8.5 0 11 3.1 　 　
3 15.0 7 17 4.7 2.17 35
6 15.7 12 17.4 4.8 0.23 81
9 18.0 21 17.8 4.9 0.77 132
12 18.8 21 17.8 4.9 0.28 187
15 20.4 21 18.9 5.3 0.51 246
18 20.5 21 19 5.3 0.05 307
21 22.2 21 18.5 5.1 0.56 371
24 22.9 27 18.2 5 0.23 439
27 24.1 30 18.5 5.1 0.38 510
30 28.4 30 21 5.8 1.44 588
33 29.3 32 20 5.5 0.31 675
36 30.9 32 19.6 5.4 0.54 765
39 32.7 32 19.8 5.5 0.59 861
42 34.8 34 20.4 5.7 0.72 962
45 40.2 37 21.6 6 1.77 1075
48 42.2 40 19.4 5.4 0.67 1198
51 44.3 39 19.3 5.4 0.72 1328
54 47.8 47 17.5 4.8 1.18 1466
57 51.5 49 17.6 4.9 1.23 1615
60 56.9 63 19.3 5.3 1.79 1778
75 72.5 77 27.4 7.6 1.04 2749
90 83.6 85 41.7 11.6 0.74 3920
105 92.8 97 47.3 13.1 0.62 5243
120 102.6 99 50.1 13.9 0.65 6709
135 119.4 105 55.1 15.3 1.12 8374
150 127.5 109 57.2 15.9 0.54 10226
165 138.9 136 55.8 15.5 0.76 12223
180 146.2 147 61.5 17.1 0.48 14362
240 178.9 193 61.2 17 0.55 24114
300 172.0 176 59.1 16.4 -0.12 34642
360 150.3 164 45.4 12.6 -0.36 44311
휴뮤린 ® R 인슐린 및 rHuPH20 투여 후의 글루코스 주입 속도
GIR
시간 평균 중앙값 SD SE 증분 기울기 AUC(0-x) Grel
(분) (mL/hr) (mL/hr*분) (분*mL/hr) (％)
0 7.4 0 12.5 3.5 　 　
3 16.0 12 15 4.2 2.86 35 100
6 17.5 19 15.2 4.2 0.51 85 105
9 20.1 24 15.3 4.3 0.85 142 108
12 21.8 24 14.7 4.1 0.59 205 109
15 24.8 26 14.4 4 1 275 112
18 30.6 32 13.2 3.7 1.92 358 116
21 36.4 35 15.7 4.4 1.92 458 123
24 48.2 45 13.4 3.7 3.95 585 133
27 54.8 47 16.2 4.5 2.21 740 145
30 65.9 66 21.6 6 3.69 921 157
33 74.3 74 25.8 7.2 2.79 1132 168
36 82.1 78 28.4 7.9 2.59 1366 179
39 91.8 87 28.2 7.8 3.26 1627 189
42 99.8 91 33.1 9.2 2.67 1915 199
45 110.5 109 36.8 10.2 3.56 2230 208
48 121.5 124 42.4 11.8 3.67 2578 215
51 133.7 134 49.7 13.8 4.05 2961 223
54 143.4 145 54.4 15.1 3.23 3377 230
57 153.5 162 62.8 17.4 3.38 3822 237
60 164.6 172 73.8 20.5 3.69 4299 242
75 184.8 178 99 27.5 1.34 6920 252
90 179.7 194 62.1 17.2 -0.34 9653 246
105 183.9 211 60.5 16.8 0.28 12380 236
120 191.1 220 64.1 17.8 0.48 15193 226
135 206.5 216 66 18.3 1.03 18174 217
150 215.5 206 64 17.8 0.6 21339 209
165 202.9 214 62.4 17.3 -0.84 24477 200
180 197.4 214 57.1 15.8 -0.37 27479 191
240 181.5 183 64.2 17.8 -0.26 38847 161
300 117.5 116 44.6 12.4 -1.07 47819 138
360 86.5 80 28.7 8 -0.52 53939 122
3. rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린 ® R 인슐린의 약력학의 비교
rHuPH20과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약력학을 비교하였다. 각각의 유형의 인슐린의 약력학에 대한 rHuPH20의 공동-투여의 상대적 효과를 평가하였다. 도 2는 각각의시간 간격에서의 글루코스 주입 속도의 플롯을 보여준다. rHuPH20 및 휴마로그® 또는 휴뮤린® R의 공동-투여는 인슐린을 rHuPH20 없이 투여하였을 때에 비해 시간의 함수에서 글루코스 주입 속도를 위로 및 좌측으로 현저하게 이동시키는 것이 관찰되었고, 이는시간 플롯의 함수에서 인슐린 농도의 이동과 유사하다. 최대 주입 속도는 rHuPH20과 공동-투여시 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 평균 201 mL/hr에서 221 mL/hr로 및 휴뮤린® R의 경우 187 mL/hr에서 203 mL/hr로 약간 증가하였다. 이와 유사하게, 최대 GIR의 시간은 rHuPH20과 공동-투여시 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 193분에서 136분으로 및 휴뮤린® R의 경우 253분에서 206분으로 감소하였다. 작용 개시는, 초기 절반-최대 GIR까지의시간 (tGIR초기 50％)으로 측정된 바, rHuPH20과 공동-투여시 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 72분에서 43분으로 및 휴뮤린® R의 경우 113분에서 83분으로 감소하였다.
식사시간 탄수화물은 탄수화물의 유형에 따라 식사 후 처음 몇 (예를 들어 2 내지 4 시간)시간 동안 대체로 분해되어 체순환에 도입되고, 이에 따라 처음 2 또는 3시간 (예를 들어 0 내지 120분)에 걸친 누적 GIR이 특히 유의하다. 처음 2시간에 걸쳐 전달된 190.6 mg/mL 글루코스 용액의 누적 체적은 rHuPH20과 공동-투여시 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 163 mL에서 248 mL로, 휴뮤린® R의 경우 112 mL에서 226 mL로 증가하였다. 식사시간 탄수화물 분해가 완료된 후의 과량의 글루코스 대사는 불리한 저혈당 사건을 일으킬 수 있다. 4 내지 6시간에 전달된 글루코스 용액의 누적 체적은 rHuPH20과 공동-투여시 대조군에 비해 휴마로그®의 경우 289 mL에서 212 mL로, 휴뮤린® R의 경우 337 mL에서 252 m로 감소하였다. 따라서, 속효성 인슐린 유사체 또는 속효성 레귤러 인슐린 제제의 rHuPH20과의 공동-투여는 글루코스를 증가시켜 초기 용량을 저하시킴으로써 식후 분해를 용이하게 하고, 글루코스를 감소시켜 저혈당 변동을 일으킬 수 있는 활성을 저하시킨다.
GIR은 신체가 사용할 글루코스의 양을 반영하고 (즉, 신체가 보다 많은 글루코스를 사용하는 경우 90 내지 110 mg/dL의 혈당 수준을 유지하기 위해 보다 많은 외인성 글루코스가 주입될 필요가 있음), 이에 따라 투여된 인슐린의 약리학적 활성을 반영한다 (즉, 인슐린 활성은 내인성 글루코스 배출을 감소시키고/거나 혈당 사용을 증가시켜 혈당의 전반적인 감소를 일으킴). 따라서, 이들 데이타는 rHuPH20 (히알루로난 분해 효소)과 공동-투여된 경우 각각의 인슐린의 생물학적 작용이 인슐린이 rHuPH20 없이 투여되었을 때에 비해 속도 (글루코스 대사의 개시) 및 정도 모두에서 실질적으로 증가하였음을 입증한다.
이 연구에서, rHuPH20과 공동-투여하였을 때 휴뮤린® R 인슐린의 약력학 성질이 개선되며, 이에 의해 상기 약력학은 rHuPH20의 존재하에 투여된 휴마로그® 인슐린 리스프로에 비해 실질적으로 지연된 휴뮤린® R 인슐린 투여의 약력학 성질과는 달리, rHuPH20과 공동-투여하였을 때 휴마로그®의 약력학 프로파일과 실질적으로 유사해진다. GIR은 처음 60분에 걸쳐 혈당 수준을 90 내지 110 mg/dL로 유지할 것을 필요로 하고, 연장에 의해, 인슐린의 약리학적 활성은, 특히 주사후 처음 60 내지 90 분에, rHuPH20과 공동-투여된 2가지 상이한 유형의 인슐린 사이에서 본질적으로 동일하다. 반면, 휴뮤린® R 인슐린 (속효성 레귤러 인슐린)은 rHuPH20 없이 투여하였을 때 GIR 프로파일을 갖고, 이는 rHuPH20 없이 투여하였을 때의 휴마로그® 인슐린 리스프로 인슐린에 비해 인슐린 작용의 속도가 느려짐을 나타낸다. 따라서, rHuPH20 (히알루로난 분해 효소) 및 속효성 인슐린의 조합은, 예를 들어 이 연구에 기재된 바와 같은 조건하에, 속효성 인슐린 단독의 경우 보다 더 빠르고 더 큰 정도로, 초기시간 동안 (즉, 투여후 60분 미만) 속효성 인슐린의 유형과는 실질적으로 무관하게 작용하는 초속효성 인슐린 조성물을 제공한다.
실시예 1b
제1형 진성 당뇨병 환자에게 유동식을 제공한 후 rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 피하 주사된 휴마로그 ® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린 ® R 인슐린의 약동학 및 식후 혈당 반응
rHuPH20과 공동-주사된 및 공동-주사되지 않은 피하 주사된 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약동학 (PK) 및 식후 혈당 반응 (즉, 약력학 (PD))을 평가하는 연구를 제1형 진성 당뇨병 환자에게 유동식을 제공한 후에 수행하였다. 연구는 투여전 2시간 및 투여후 8시간에 PK 및 PD 매개변수에 대해 투여후 혈액 샘플링된 1형 당뇨병 환자에서의 일련의 표준화된 유동식 제공으로 구성되는, 단일-맹검 (환자에게만 알리지 않음), 단일-중심, 교차, 유동식 시험이다.
각각의 대상에 대해 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 rHuPH20 (방문 2A-C; 3회 이하의 주사)에 대한 일련의 투여량-발견 방문을 수행하여 rHuPH20과 공동-주사하였을 때 최적의 혈당 조절 (환자의 식후 혈당을 60 mg/dL 및 160 mg/dL의 범위 이내로 유지하는 것으로 정의됨)에서 유동식을 커버하기에 적절한 개별 인슐린 투여량을 결정하였다. 결정되면, 이와 동일한 최적화된 투여량을 rHuPH20 없이 휴마로그® 인슐린 리스프로에 의해 커버되는 시험 식사에 사용하였다 (방문 3). 이어서, 대상에 대해 레귤러 인간 인슐린 (휴뮤린® R 인슐린)을 사용하여 동일한 일련의 조사 (방문 4A-B; 2회 이하의 주사)를 수행하여, 최적의 혈당 조절을 위해 rHuPH20을 갖는 적절한 개별 레귤러 인슐린 투여량을 결정하였다. 동일한 최적화된 투여량을 rHuPH20 없이 휴뮤린® R 인슐린에 의해 커버되는 시험 식사에 사용하였다 (방문 5).
연구에서 식후 인슐린을 rHuPH20과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여하여을 때 PK 프로파일 및 식후 글루코스 변동을 비교하였다. 또한, 식사후 저혈당증을 평가하여 임의의 관찰된 PK 차이의 임상적 관련성을 확인하였다. 1차 목적은 재조합 인간 히알루로니다제 (rHuPH20)를 포함하는 및 포함하지 않는 유동식 제공 전에 피하 (SC) 주사된 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 AUC0-60의 1차 약동학 (PK) 종말점에 의해 측정된 초기 인슐린 노출을 비교하는 것이다. 측정된 다른 인슐린 PK 매개변수는 Cmax; tmax; 초기 t50％ (초기 절반 최대 혈청 농도까지의 시간), 후기 t50％ (후기 절반 최대 혈청 농도까지의 시간, AUClast (0시간 부터 마지막 관찰시 (프로토콜에 따라 투여후 480분)까지의 농도-시간 곡선하면적); AUC(0-inf) (0 시간에서 무한대까지의 총 AUC); 간격 AUC (0-15, 0-30, 0-45, 0-60, 0-90, 0-120, 0-180, 0-240, 0-360, 0-480, 15-480, 30-480, 45-480, 60-480, 90-480, 120-480, 180-480 및 240-480분)를 포함한다. λz (말단 제거 속도 상수; 로그-선형 혈청 농도-시간 곡선의 말단 지점의 선형 회귀법에 의해 결정됨); t1/2 (제거 반감기, 0.693/λz로 정의됨); CL/F (생물학적 사용가능성의 함수로서 제거; 투여량/AUC(0-inf)로 계산됨); MRT(last) (0시간부터 마지막 관찰시 (프로토콜에 따라 투여후 480분)까지의 평균 체류 시간); MRT(0-inf) (0시간부터 무한대까지의 평균 체류 시간), 및 Vz/F (생물학적 사용가능성의 함수로서 분포 체적)를 포함한다.
약력학 (PD) 종말점은 식후 혈당 반응 매개변수, 예컨대 AUCBG 0-4시간 (여기서 BG는 혈당을 나타냄), 및 다른 PD 종말점, 예컨대 특정시간 간격에서의 AUCBG, BGmax, tBGmax, 초기 tBG 50％, 후기 tag 50％, 특정시간 간격에서의 저혈당 에피소드 (HE), 저혈당증을 치료하기 위한 20％ 글루코스 용액의 주입 (양 및 기간), 응급 소생술 (즉, 심각한 징후의 존재 및/또는 혈당 <36 mg/dL) 및 저혈당 변동 (혈당 36 mg/dL 초과 70 mg/dL 미만의 AUC로 정량됨)을 위한 50％ 글루코스 용액이다. 안전성 매개변수, 예컨대 부작용, 혈액학, 생화학, 요검사, 신체 검사, 생명 징후, ECG, 혈당, 주사 부위의 국부적 허용성, 및 인슐린 제제 및 rHuPH20에 대한 항체 형성을 또한 평가하였다.
A. 환자 선별
12 개월 이상 동안 인슐린을 처치한 남녀 제1형 진성 당뇨병 환자가 연구에 참여하기에 적임자였다. 환자는 18 내지 65세 연령일 필요가 있었다. 연구 기간 동안 가임기 여성은 산아 제한의 표준적이고 효과적인 수단을 사용할 필요가 있었다. 다른 포함 기준은: BMI 18.0 내지 29.0 kg/m2 (양 끝값 포함); 지역 실험실 결과에 기초한 HbA1c (글리코실화된 헤모글로빈 A1c) ≤ 10％; 공복 C-펩티드 < 0.6 ng/mL; 인슐린 < 1.2 U/kg/일을 사용한 최근의 치료를 포함한다. 또한, 환자는 연구 약물 주사의 완료 및 이 프로토콜에서 필요한 평가를 방해할 수도 있는 의학적 상태가 나타나지 않고, 병력 및 신체 검사에 기초하여 양호한 일반적인 건강 상태를 가질 필요가 있었다.
다양한 연구 배제 기준은 다음을 포함한다: 시험에서 임의의 연구 약물의 임의의 성분에 대해 알려진 또는 의심되는 알레르기; 이전의 시험 등록; 증식성 망막병증 또는 황반병증, 및/또는 중증의 신경병증, 특히 자율 신경병증 환자; 위장, 심혈관의 임상적으로 중요한 활동 질환 (부정맥 또는 ECG에서의 전도 지연의 병력 포함), 간, 신경, 신장, 비뇨생식기, 또는 조혈계, 또는 제어되지 않는 고혈압 (확장기 혈압 ≥ 100 mmHg 및/또는 수축기 혈압 ≥ 160 mmHg, 누운 자세에서 5분 후); 시험의 결과에 혼동을 줄 수 있거나 환자에게 연구 약물을 투여하는데 추가의 위험을 야기할 수 있는 임의의 질병 또는 질환 병력; 일상적인 실험실 데이타에서의 임상적으로 중요한 발견; 스크리닝에서 정상의 하한보다 낮은 헤모글로빈을 갖는 빈혈이 특히 배제됨; 시험 결과의 해석을 방해할 수 있는 약물 또는 인슐린 작용, 글루코스 사용, 또는 저혈당증으로부터의 회복을 임상적으로 유의하게 방해하는 것으로 알려진 약물의 사용; 조사원에 의해 판단된, 재발 주요 저혈당증 또는 저혈당무감지증; 최근의 알콜 중독 또는 물질 남용; 연구에서 방문 2A (아래 섹션 B 참조)에 앞서 이전 9 주 이내의 헌혈 (> 500 mL); 임신, 수유, 임신 시도, 또는 충분한 피임약 측정을 사용하지 않음 (충분한 피임약 측정은 멸균, 자궁내 장치 [IUD], 경구 또는 주사가능한 피임약 또는 장벽 방법으로 이루어짐); 정신적 무력감, 거부감, 또는 언어 장벽 (충분한 이해 또는 협의 배제); 징후성 위마비; 이 연구에서 방문 2A (아래 섹션 B 참조) 4주 이내의 임의의 조사 약물 수용; 시험 참여 또는 데이타 평가를 방해할 수 있는 임의의 조건 (내재적 또는 외재적); 시험 기간 동안 속효성 인슐린과 함께 란투스로의 변화에 대한 거부감 및 인슐린 펌프 요법의 현재 용도.
21명의 평가가능한 환자가 시험을 완료하였다: 14명 남성; 7명 여성; 연령 = 41.6 ± 10.6세; BMI = 24.4 ± 286 kg/m2). 평가가능한 환자는 방문 3 및 방문 5가 완료되고, 종말점 분석에 충분한 혈액 샘플링 및 안전성 평가를 받은 환자이다. 모든 프로토콜-특정 연구 약물 주사를 완료하지 않고/거나 방문 5를 통해 충분한 혈액 샘플링 및 안전성 평가를 받지 않은 임의의 환자는 추가의 환자를 등록시켜 대체하였다.
B. 연구 방법
1. 방문 절차
각각의 환자에 대해 스크리닝 방문 (방문 1)을 시도하여 시험에 참여하기에 적임자인지 결정하였다. 등록하면, 각각의 환자에 대해 적어도 1회 및 3회 이하의 투여량-발견 방문 2A-C (휴마로그® 인슐린 리스프로 + rHuPH20), 1회 투여량 방문 3 (휴마로그® 인슐린 리스프로 단독), 적어도 1회 및 2회 이하의 투여량-발견 방문 4A-B (휴뮤린® R 인슐린 + rHuPH20), 1회 투여량 방문 5 (휴뮤린® R 인슐린 단독), 및 후속 방문 (방문 6)을 수행하였다.
연구에 참여하는, 인슐린 펌프, NPH, 또는 임의의 다른 지효성 인슐린 상의 환자를 연구 기간 동안 란투스로 전환시켰다. 이러한 전환은 대상이 첫번째 투여량 방문전 적어도 36시간에 스크리닝 평가를 통과하면 수행하였다.
각각의 투여량-발견 방문 및 각각의 투여량 방문을 하루에 완료하였다. 이른 오전 체크-인 후에, 환자를 관찰하고, 혈당을 100 mg/dL의 목적하는 값으로 올리는데 필요한 정맥내 글루코스 및/또는 인슐린을 사용하여 대략 2시간 동안 안정화시켰다. 투여전 바로 30분 동안 인슐린 또는 글루코스를 주입하지 않았다. 이어서, 시험 물품 (즉, 휴마로그® 인슐린 리스프로, 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20, 휴뮤린® 인슐린 또는 휴뮤린® 인슐린/rHuPH20)을 투여한 후에, 대략 8:30 AM에 유동식을 섭취시켰다. 모든 투여 방문시, PK 및 PD 평가를 대략 4:30 PM까지 8시간 동안 진행하고, 상기 시간에 환자에게 식사를 제공하고, 안전한 것으로 판단되면 돌려보냈다.
2. 투여량-발견 방문 절차를 위한 제제
18-게이지 카테터를 YSI STAT2300 글루코스 분석기를 사용하여 혈청 인슐린 및 혈당 분석에 사용된 팔과 동일한 팔의 팔꿈치에 삽입하였다. 0.15 mmol/L 염수로 플러슁하여 카테터 및 선에서의 혈액 응고를 방지하였다. 제2 18-게이지 PTFE 카테터를 투여전 기간 동안에 적절한 것으로 여겨지는 20％ 글루코스 용액, 염수, 및 인슐린의 주입에 사용되는 반대편 상완의 정맥에 넣었다. 투여전 60분에, YSI STAT2300 글루코스 분석기를 사용하여 투여에 대해 다음과 같은 시점: -60, -30, -20 및 -10분에 혈당 농도를 결정하였다. -30, -20 및 -10분으로부터의 혈당 판독값의 평균을 사용하여 각각의 투여량-발견 및 투여 방문에 사용되는 개별 환자의 공복 혈당 수준을 결정하였다. 초기 공복 혈당 값 사이의 차이가 너무 큰 것으로 여겨지는 환자는 다시 스케쥴을 계획하거나 또는 연구에서 배제하였다.
3. 투여전 기간
2 시간의 런-인(run-in) 기간 동안, 필요에 따라 혈당을 모니터링하여 목적하는 범위로 혈당을 안정화시켰다. 2시간 런-인 기간을 사용하여 정확한 주입/주사기 펌프에 의한 글루코스 및/또는 인슐린의 IV 투여에 적절하게 혈당 수준을 조정하였다. 투여 직전 30분 동안 인슐린 또는 글루코스를 주입하지 않았다. 약물 투여 시간에서, 환자의 혈당 수준은 80 내지 140 mg/dL의 범위였다 (가능한 한 100 내지 120 mg/dL의 범위에 근접한 값을 목적으로 함).
4. 표준 유동식 섭취 및 투여
2-시간 런-인 기간 후에, 연구 약물 주사를 복막의 들리운 피하 지방에 주사기로 피하 주사하여 투여하였다 (시점 0에). 시험 물품을 다음과 같이 제조하였다. 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 휴뮤린® 인슐린 (100 U/mL; 일라이 릴리)의 바이알로부터 정확한 투여량 (방문 4에서 결정됨)을 흡인시켜 휴뮤린® R 인슐린 단독 투여량을 제조하였다. 우선 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 휴뮤린® R 인슐린 (500 U/mL; 일라이 릴리)의 바이알로부터 0.3cc (150 유닛)를 흡인시키고, 1 mL rHuPH20 (20 ㎍/mL; 3000 U/mL)을 함유하는 바이알로 옮겨 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 제조하였다. 용액을 부드럽게 회전시키면서 혼합하였다.
0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여 휴마로그® 인슐린 리스프로 (100 U/mL; 일라이 릴리)의 바이알로부터 정확한 투여량 (방문 2에서 결정됨)을 흡인시켜 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 투여량을 제조하였다. 우선 실온에서 1 내지 2시간 동안 rHuPH20 (1 mg/mL; 대략 1200,000 U/mL)의 바이알을 해동시켜 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20을 제조하였다. 멸균 0.3cc 용량 인슐린 주사기를 사용하여, 0.27cc의 공기를 주사기에서 빼내 rHuPH20 바이알에 넣어 상부 공간을 만들고, 이어서 0.27cc (0.27 mg; 대략 32400 U) rHuPH20을 주사기에서 빼냈다. 이어서, 이를 하일레넥스의 바이알에 거품이 생기지 않도록 서서히 옮기고, 부드럽게 회전시켰다. 멸균 3.3cc 인슐린 주사기를 사용하여, 1.1 mL 공기를 빼내 하일레넥스 (여분의 0.27 mg rHuPH20 함유; 대략 32400 U) 바이알에 넣어 상부 공간을 만들고, 이어서 용액 1.1 mL를 흡인시키고, 휴마로그® 인슐린 리스프로 (100 U/mL; 일라이 릴리)의 바이알에 분배하였다. 용액을 부드럽게 회전시키면서 혼합하였다.
5.7 (± 3.0) 휴마로그® 인슐린 리스프로의 평균 투여량을 rHuPH20 (0.2 ㎍/U 인슐린)과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여하였다. 6.2 (± 3.5) 휴뮤린® R 인슐린의 평균 투여량을 rHuPH20 (0.2 ㎍/U 인슐린)과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여하였다. rHuPH20과 공동-투여된 인슐린의 주사 부위는 다음과 같다: 방문 2A에서의 주사는 좌측 중앙-복부 영역이었고, 다음 방문 (방문 2B 또는 방문 2B가 필요하지 않은 경우 방문 3)에서는 우측 중앙-복부 영역을 사용하고, 다음 방문에서는 좌측 중앙-복부 영역을 사용하였다 (이에 따라 이후의 주사 부위 변경). 주사 바늘을 45도 각도로 놓고, 10초 동안 피하 지방에서 유지시켰다.
연구 약물 투여후 10분 이내에, 환자는 60 gm의 탄수화물을 제공하는 유동식 (Ensure)을 소비하였다. 유동식은 10분 이내에 완전하게 섭취되었다. 특정 시점에서 다음 8시간 동안 혈당을 측정하였다. 안정성 목적을 위한 추가의 혈당 측정을 필요에 따라 수행하였다.
5. 샘플링 및 평가
투여전 기간 및 투여 이후 동안, -60, -30, -20, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, 415, 420, 430, 445, 460, 475 및 480 분의 특정 시점에 YSI STAT2300 글루코스 분석기를 사용하여 자주 혈당을 측정함으로써 혈당 농도를 모니터링하였다. 혈청 인슐린의 결정에 사용되는 일련의 혈액 샘플을 -30, -30, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 및 480 분에 수득하였다.
B. rHuPH20 과 공동-투여된 및 공동-투여되지 않은 휴뮤린 ® R 인슐린 및 휴마로그 ® 인슐린 리스프로의 약동학
휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 및 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 둘 모두에 대한 약동학은 각각 rHuPH20이 없는 경우에 비해 가속되지만 전반적으로 대등한 노출을 나타내었다. 표 19a는 12명의 환자에 대한 다양한 PK 매개변수의 요약을 나열하고 있다. 이는 모든 환자로부터 데이타를 수집하기 전에 수행되는 중간 분석이다. 따라서, 21명의 환자 중 12명으로부터의 데이타만이 이 분석에 기여하였다. rHuPH20과의 공동-투여의 효과는 [인슐린 + rHuPH20에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]/[인슐린 단독에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]×100)으로 계산된 제어율(％)로 나타내고, 이를 또한 포함시켰다. 기하 평균 및 p-값은 Cmax 및 AUC 매개변수의 경우 로그 전환된 데이타에 기초하고, 또한 tmax 및 초기 ＆ 후기 t50％의 경우 산술 평균 및 전환되지 않은 값에 기초한다. 1차 종말점인 처음 1시간에 걸친 총 인슐린 노출 (AUC0-60)은 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20의 경우 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독에 비해 135％ (p=0.0197) 증가하고, 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20의 경우 휴뮤린® R 인슐린 단독 보다 304％ (p=0.0005) 증가하였다. 초기 T50％는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 19.9분에서 12.6분으로 (p=.0002), 휴뮤린® R 인슐린의 경우 40.1분에서 14.8분으로 (p=.033) 감소하였다. tmax는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 43.8분에서 27.9분으로 (p=.002), 레귤러의 경우 96.7분에서 52.1분으로 (p=.086) 감소하고; 후기 T50 ％는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 98.6분에서 68.6분으로 (p=.0001), 휴뮤린® R 인슐린의 경우 219.2분에서 111.2분으로 (p=.008) 감소하였다.
[표 19a]
유동식 연구에서 rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여된 인슐린의 약동학
Figure pct00001
19b는 연구가 완료된 21명의 모든 환자에 대한 다양한 PK 매개변수의 요약 (평균 및 표준 편차 나타냄)을 나열하고 있다. 표 19b의 PK는 비-구획 접근법 (AUC 계산을 위한 선형 사다리꼴 공식)을 사용하여 기준선을 감한 (여기서, 기준선은 0 시간에서 측정) 개별 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린 농도 대 시간 데이타 상에서 수행하였다. 윈논린 사용자 선별 기준을 사용하여 제거 속도 상수인 람다z를 결정하고, 이는 반감기, AUC INFobs, MRT, CL, 및 Vz의 기초가 된다. 20.0 pM보다 낮은 모든 측정값은 PK 계산을 위한 목적으로 0으로 설정하였다.
휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린 주사에 rHuPH20을 첨가하면 초기 인슐린 노출이 증가하였다. 평균 투여량-정규화된 기준선을 감한 Cmax는 휴마로그® 인슐린 리스프로에 rHuPH20을 첨가한 경우 46.6 pmol/L에서 81.2 pmol/L로 74％, 휴뮤린® R 인슐린의 경우 25.4 pmol/L에서 56.5 pmol/L로 122％ 증가하였다. 1차 PK 종말점 AUC0-60분에서, rHuPH20과의 공동-투여는 효소가 없는 대조군 투여에 비해 초기 휴마로그® 인슐린 리스프로 노출을 1690 분*pmol/L/IU에서 2950 분*pmol/L/IU로 75％ 증가시키고, 초기 휴뮤린® R 인슐린 노출을 649 분*pmol/L/IU에서 2010 분*pmol/L/IU로 210％ 증가시켰다. rHuPH20과의 공동-투여시 생물학적 사용가능성은 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독의 대조군 주사에 비해 유의하게 변경되지 않았다; AUC0-inf에서 98％ 및 AUC0-last에서 116％. 휴뮤린® R 인슐린과 rHuPH20의 공동 투여의 경우 상대적 생물학적 사용가능성이 효소가 없는 대조군 투여에 비해 AUC0-inf에서는 120％ 및 AUC0-last에서는 174％이었다 (기하 평균 투여량-정규화된 기준선을 감한 데이타가 이 계산에 사용되고, 데이타는 나타내지 않음). 인슐린 및 리스프로 둘 모두의 rHuPH20과의 공동-투여는 rHuPH20이 없는 대조군 주사에 비해 Tmax 및 초기 및 후기 T50％를 가속시켰다.
피크 인슐린 농도까지의 시간은 rHuPH20과 함께 주사한 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 더 빨랐다 (산술 평균 tmax 38.8 분, rHuPH20 없이 주사된 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 47.1분). rHuPH20과 함께 피하 주사된 휴뮤린® R 인슐린의 tmax는 58.3분이고, 이에 비해 rHuPH20가 없는 경우에는 104분이었다.
[표 19b]
유동식 연구에서 rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여된 인슐린의 약동학
Figure pct00002
Figure pct00003

C. rHuPH20 과 함께 및 rHuPH20 없이 레귤러 인간 인슐린 및 인슐린 리스프로를 투여한 후의 식사 제공에 대한 혈당 반응의 비교
식사 제공에 대한 혈당 반응은 rHuPH20과 함께 투여된 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린에서 인슐린을 단독으로 투여하였을 때에 비해 개선되었다. 표 19c는 12명의 환자로부터 측정된 약력학 매개변수를 나열하고 있다. 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 rHuPH20과의 공동-투여는 rHuPH20이 없는 대조군 주사에 의해 식후 혈당 수준을 감소시켰다. 식후 4시간 기간 내에 관찰된 최대 혈당은 휴마로그® 인슐린 리스프로를 rHuPH20과 함께 투여하였을 때 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여하였을 때에 비해 186 mg/dL에서 154 mg/dL로 (p=0.0213) 감소하고, 휴뮤린® R 인슐린을 rHuPH20과 함께 투여하였을 때 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여하였을 때에 비해 212 mg/dL에서 166 mg/dL로 (p=0.0406) 감소하였다. 식후 2 시간에서의 글루코스 (PPG) 및 140 mg/dL의 총 변동 영역이 유사하게 감소하였다. rHuPH20과 공동-투여시, 70 mg/dL 미만의 총 변동 영역은 최소이고, 모든 시험 물품의 경우 유사하고, 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 면적이 증가하고, 휴뮤린® R 인슐린의 경우 면적이 감소하는 작은 경향이 있었다.
[표 19c]
유동식 연구에서 rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 투여된 인슐린의 약동학
Figure pct00004
D. 안전성
심각한 부작용 (AE)은 보고되지 않았다. 가장 흔히 보고되는 AE는 감소된 혈당/저혈당증이다 (147개 사례). 감소된 혈당/저혈당증의 147개의 사례 중, 21개는 rHuPH20과 관련이 있을 가능성이 있거나 관련이 있을 것으로 추정된다. 17개 사례는 강도가 중간 정도이고, 이들 중 4개 사례가 rHuPH20과 관련이 있을 가능성이 있을 것으로 생각된다. 나머지 126개 사례는 강도가 가벼운 정도이다. 이 연구에서 모든 다른 AE는 5％ 미만의 빈도로 일어났다. 증상과 관계없이 모든 저혈당증 (>70 mg/dL의 혈당 값을 갖는 것으로 정의됨) 에피소드를 이 연구에서 AE로 포착하였다.
E. 요약
휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 rHuPH20과의 공동-투여는 rHuPH20이 없는 대조군 주사에 비해 보다 이른 인슐린 노출, 보다 이른 tmax, 초기 t50％ 및 후기 t50％ 매개변수 뿐만 아니라, 보다 큰 피크 인슐린 농도을 나타내었고, 생물학적 사용가능성에는 유의한 차이가 없었다. 이러하 보다 이른 인슐린 노출은 식후 고혈당증을 저하시키고, 피크 0-4 시간 글루코스 수준을 감소시키고, 2 시간 식후 글루코스 수준을 감소시키고, 고혈당 변동 (AUC > 140 mg/dL로 측정됨)을 저하시킨다. rHuPH20 공동-투여시, 저혈당 변동 (AUC < 70 mg/dL로 측정됨)은 최소이고, 모든 시험 물품의 경우 유사하였고, 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 면적이 증가하고, 레귤러 인간 인슐린 (휴뮤린® R 인슐린)의 경우 면적이 감소하는 작은 경향이 있었다.
실시예 1c.
건강한 인간 대상에서 다양한 투여량의 재조합 rHuPH20과 함께 또는 재조합 rHuPH20 없이 피하 투여된 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 약동학 및 약력학
단일 중심, I상, 개방-표지, 단일-맹검 (대상에게 각각의 주사 함량을 알려주지 않음)의 일부로서, 4 단계 연구로 약동학, 약력학 (또는 당역학; GD), 안전성, 허용성, 및 최적의 rHuPH20:인슐린 비 (레귤러 인슐린 (휴뮤린® R 인슐린) 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 투여량과 (SC) 피하 투여된 rHuPH20 투여량 비의 범위), 및 약동학 (PK) 및 최적의 rHuPH20:인슐린 비 (tmax, Cmax, AUC0→t를 결정하여 평가됨), 및 상대적 생물학적 사용가능성 (특정 시점에 수집된 혈청 인슐린 농도에 기초함)을 결정하였다.
피하 투여된 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 약동학 및 약력학 (또는 당역학 (GD))에 대한 다양한 농도의 rHuPH20의 공동-투여의 효과를 혈액 샘플을 채취하여 인슐린 및 글루코스 수준을 측정하여 평가하였다. 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 절차 (실시예 1에 기재됨)를 사용하여 혈장 글루코스 수준을 90 내지 110 mg/dL로 유지하였다. 인슐린 농도를 평가하여 인슐린 PK 매개변수를 결정하였다: tmax, 초기 t50％, 후기 t50％, AUC0→t 및 AUCt→종말점 (주사후 t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 및 480분), AUC0→all, AUC0→inf, Cmax, 상대적 생물학적 사용가능성 (rHuPH20이 없는 경우와 비교), 및 대상간 및 대상내 가변성 (모든 PK 매개변수에 대한 변동 계수에 기초함). 글루코스 주입 속도 (GIR) (상기 클램프 동안 정상 혈당을 유지하는 속도)를 측정하고, 이를 사용하여 다음 GD 매개변수를 결정하였다: tGIRmax, 초기 tGIR50％, 후기 tGIR50％, GIR AUC0→t 및 GIR AUCt→종말점 (주사후 t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 및 480분), GIR AUC0→all, 및 cGIRmax, 및 대상간 및 대상내 가변성 (모든 GD 매개변수에 대한 변동 계수에 기초함). 각각의 SC 주사의 안정성 및 국부적 허용성을 또한 평가하였다.
A. 다양한 투여량의 rHuPH20 과 공동-투여된 또는 공동-투여되지 않은 휴뮤린 ® R 인슐린의 투여
건강한 지원자에게 30 ㎕ 또는 120 ㎕의 휴뮤린® R 인슐린 (100 U/mL로 희석)을 최종 농도 0 ㎍/mL, 1.25 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 20 ㎍/mL 또는 80 ㎍/mL의 rHuPH20 (각각 대략 0 U/mL, 150 U/mL, 600 U/mL, 1200 U/mL, 2400 U/mL 또는 9600 U/mL)과 함께 투여하였다. 이에 따라, 지원자에게 3 U 휴뮤린® R 인슐린을 함유하는 30 ㎕를 대략 0, 4.5, 18, 36, 72 또는 288 유닛 rHuPH20과 함께, 또는 12 U 휴뮤린® R 인슐린을 함유하는 120 ㎕를 대략 0, 18, 72, 144, 288 또는 1152 유닛 rHuPH20과 함께 투여하였다. 표 19d는 12 U 인슐린을 투여한 대상에 대해 측정된 약동학 매개변수를 나열하고 있다. 히알루로니다제 공동-투여의 PK 매개변수 특징 (보다 이른 tmax 및 t1/2max, 보다 큰 Cmax 및 초기 체노출, 예를 들어 AUC0-60분)은 인슐린을 단독으로 투여하였을 때에 비해 모든 시험된 rHuPH20 농도에서 대등하게 증가하였다. 모든 rHuPH20 농도에서의 글루코스 주입 속도 (GIR) 프로파일은 위약 (즉, 0 ㎍/mL)과 상이하였고, 초기 속도가 증가하고, 후기 글루코스 주입이 감소하는 특징이 있다. 시험된 투여량에서, 모든 rHuPH20 농도는 유사하게 효과적이고, 비-효과적 투여량은 관찰되지 않았다.
[표 19d]
12 U 휴뮤린 ® R 인슐린과 다양한 투여량의 rHuPH20 에 대한 인슐린 PK 매개변수
Figure pct00005
B. 다양한 투여량의 rHuPH20 과 공동-투여된 또는 공동-투여되지 않은 휴마로그 ® 인슐린 리스프로의 투여
건강한 지원자에게 30 ㎕ 또는 120 ㎕의 휴마로그® 인슐린 리스프로 (50 U/mL로 희석)를 최종 농도 0 ㎍/mL, 0.078 ㎍/mL, 0.3 ㎍/mL, 1.2 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 또는 20 ㎍/mL의 rHuPH20 (각각 대략 0 U/mL, 9.36 U/mL, 36 U/mL, 144 U/mL, 600 U/mL 또는 2400 U/mL)과 함께 투여하였다. 이에 따라, 지원자에게 1.5 U 휴마로그® 인슐린 리스프로를 함유하는 30 ㎕를 대략 0, 0.28, 1.08, 4.32, 18 또는 72 유닛 rHuPH20과 함께, 또는 6 U 휴마로그® 인슐린 리스프로를 함유하는 120 ㎕를 대략 0, 1.12, 4.32, 17.28, 72 또는 288 유닛 rHuPH20과 함께 투여하였다. 표 19e는 6 U 휴마로그® 인슐린 리스프로를 투여한 대상에 대해 측정된 약동학 매개변수를 나열하고 있다. 시험된 투여량에서, 0.3 ㎍/mL를 초과하는 모든 rHuPH20 농도는 유사하게 효과적이었다.
[표 19e]
6 U 휴마로그 ® 인슐린 리스프로와 다양한 투여량의 rHuPH20 에 대한 인슐린 PK 매개변수
Figure pct00006
실시예 2
가용성 rHuPH20-발현 세포주의 제조
HZ24 플라스미드 (서열번호 52에 기재)를 이용하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들면, 미국 특허출원번호 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171 참조)를 형질감염시켰다. 가용성 rHuPH20의 발현용 HZ24 플라스미드는 pCI 백터 골격(Promega), 인간 PH20 히알루로니다제(서열번호 49)의 아미노산 1-482를 코딩하는 DNA, ECMV 바이러스(Clontech) 유래 내부 리보솜성 부착 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 함유한다. 또한, pCI 벡터 골격은 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 즉시-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV), 키메라 인트론(chimeric intron) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐화 신호(SV40)를 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 코딩하는 DNA는 인간 PH20 의 고유의 35 아미노산 신호 서열의 아미노산 위치 1의 메티오닌을 코딩하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 공통서열, 및 인간 PH20 히알루로니다제(서열번호 1에 기재)의 아미노산 위치 482에 상응하는 타이로신을 코딩하는 DNA 뒤에 정지코돈(stop codon), 이어서 BamHI 제한 위치를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)는 내부 리보솜성 부착 부위(IRES)에 의해 분리된, 인간 PH20의 아마노산 1-482(서열번호 3에 기재) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제의 아마노산 1-186(서열번호 53에 기재)를 코딩하는, CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종(species)을 제공한다.
4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장하는 형질감염되지 않은 DG44 CHO 세포를 형질감염을 위해 준비된 진탕 플라스크에 0.5x106 세포/ml로 접종하였다. 세포들을 120rpm으로 진탕하면서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 대수적으로(exponentially) 성장하는 형질감염되지 않은 DG44 CHO 세포의 생존력을 형질감염 이전에 측정하였다.
형질전환되지 않은 DG44 CHO 세포배양물의 6천만개 생존세포를 펠렛화하고, 2x 형질감염 완충액(2x HeBS: 40mM HEPES, pH 7.0, 274mM NaCl, 10mM KCl, 1.4mM Na2HPO4, 12mM 덱스트로즈) 0.7mL 에 2×107 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)으로 하룻밤 동안 소화시켜 선형화됨) 0.09 mL(250μg)을 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm 갭 BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 옮겼다. 음성 대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 수행하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 또는 350V 및 960μF에서 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 세포를 제거하여, 4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 변형 CD-CHO 배지 5mL 내로 옮겨서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 선별하지 않고 6-웰 조직배양 플레이트의 웰에서 성장하도록 하였다.
전기천공 후 2일에, 조직배양 배지 0.5 mL을 각 웰로부터 제거하여, 실시예 5에 기재된 미세탁도 분석법을 이용하여 히알루로니다제 활성이 있는지를 측정하였다. 결과를 표 20에 나타내었다.
표 20. 형질감염 40시간 후, HZ24 형질감염 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다제 활성
희석 활성 유닛/ml
형질감염 1
330V		 1 대 10 0.25
형질감염 2
350V		 1 대 10 0.52
음성
대조군		 1 대 10 0.015
형질감염 2(350V)로부터 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1 mL 분액을 5개의 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 하이포크산틴 및 티미딘 보충물 부재의 4mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함한 CD-CHO 배지(GIBCO) 100 마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL).
10개의 클론이 메토트렉세이트 부재에서 성장된 5개의 플레이트로부터 확인되었다(표 21).
표 21. 확인된 클론의 히알루로니다제 활성
플레이트/웰 ID 상대적
히알루로니다제
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 형질감염되지 않은 DG44 CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내 초기 몇일 동안 필수적인 성장인자들을 제공하였다. 서브클론당 50nM 메토트렉세이트를 함유하는 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트의 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론(메토트렉세이트 미처리의 13개 및 50nM 메토트렉세이트 처리의 11개)을 생산하였다. 24개의 서브클론 중 8개의 상청액에서 유의적인 히알루로니다제 활성이 측정되었고(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리한 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재 하에서 확장시켰다. 클론 3D35M 을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 진탕 플라스크에서 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생산하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 이어서, 3D35M 세포의 마스터 세포 은행(MCB)을 제조하였다.
실시예 3
가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성 측정
세포배양물, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 시료내 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 탁도 분석을 이용하여 측정하였고, 상기 분석은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한다. 가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10분) 동안 히알루로네이트(히알루론산) 나트륨과 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루로네이트 나트륨을 침전시킴으로써 활성을 측정하였다. 생성된 시료의 탁도를 30분의 현상 기간 후에 640nm에서 측정하였다. 히알루로네이트 나트륨 기질에 대한 효소활성에서 유래된 탁도감소는 가용성 rHuPH20 효소활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 분석 시험 기준 표준물(working reference standard)의 희석물로 만들어진 검정곡선을 이용하여 수행하고, 검정곡선과 비교하여 시료활성을 측정하였다.
효소희석용액으로 시료 희석물을 제조하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05mg을 50mM PIPES 반응 완충액(140mM NaCl, 50mM PIPES, pH 5.5) 25.0mL 및 SWFI 25.0mL에 용해하고, 25% 부미네이트 용액 0.2mL을 상기 혼합물 내로 희석하고 30초간 볼텍싱(vortexing)하여 효소희석용액을 준비하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관하였다. 시료를 약 1 내지 2 U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20μL 이상이었다. 분석을 수행하는데 필요한 최소 시료부피는: 공정 중 시료, FPLC 분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1mL; 농축된 재료 80μL; 정제된 또는 최종단계의 재료: 80μL이었다. 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 3반복적으로(triplicate)로 희석하고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5 U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액으로 준비하여 검정곡선을 작성하고, Optilux 플레이트에 3반복적으로 첨가하였다. 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL 및 2.5 U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60μL를 포함한“공시약(Reagent blank)”웰을 음성 대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 그리고 나서 플레이트를 덮고, 37℃에서 5분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕후, 플레이트를 열블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장비를 가온한 0.25 mg/mL 히알루로네이트 나트륨 용액(SWFI 20.0mL 내 100mg 히알루로네이트 나트륨(LifeCore Biomedical)을 용해함으로써 제조됨. 이는 2 내지 4시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합하였다)으로 프라이밍하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 옮기고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루로네이트 나트륨 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그 다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 덮개가 교체된 플레이트를 갖는 열블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다.
혈청 시험 용액(serum working solution)으로 기계를 프라이밍하고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다(500mM 아세테이트 완충용액 75mL내 혈청 원액 용액 25mL[1부피의 말 혈청(Sigma)을 9부피의 500mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]). 플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 시험 용액 240μL를 웰로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분 후에, 시료의 탁도를 640nm에서 측정하고, 각 시료의 효소활성(U/mL로)을 표준곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나누어 비활성도(U/mg)를 계산하였다.
실시예 4
Gen1 인간 sPH20의 생산 및 정제
A. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 매개변수는 용존산소 설정점 25% 및 0 내지 100 cc/분의 공기오버레이를 갖는 온도설정점 37℃, pH 7.2(시작 설정점)이었다. 168시간에서, 피드#1 배지(50g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하였다. 216시간에서, 피드#2 배지(50g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하고, 264시간에서 피드#2 배지 250ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대세포밀도와 ml당 1600유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론 유래 조건배지를 10mM pH 7.0 HEPES 내로 심층여과 및 접선유동여과에 의해 정화하였다. 그리고 나서 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)에서 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액으로 400mM NaCl에서 용출시켰다. 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 설페이트가 되도록 2M 암모늄 설페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 설페이트 부재의 50mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후에, pH 6.9 HEPES로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2로 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 80mM pH 7.4 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조 표준(reference standard)을 이용한 미세탁도 분석법(실시예 3)에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성도(specific activity)를 보유하였다. 정제된 sPH20는 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
B. 100L 생물반응기 세포배양으로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업(규모확대) 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별개로 정제하여 sHuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별개로 확장시키고, 125L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 그 과정 동안 시료를 취하여 효소 수득률과 같은 매개변수를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 개시와 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척과 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 24 내지 30에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 40mL/L GlutaMAX가 함유된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL을 함유한 125mL 진탕 플라스크에서 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20PSI에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 매개변수는 온도설정점, 37℃; pH:7.2; 용존산소:25%±10%; 임펠러(Impeller) 속도 50rpm; 용기압력 3psi; 공기분사 1L/분; 공기오버레이: 1L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 가동 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일에서 또는 세포의 생존률이 50% 미만으로 감소됐을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도와 1600유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마(mycoplasma), 미생물부하도(bioburden), 내독소(endotoxin), 및 바이러스, 바이러스 입자에 대한 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 먼저 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과시켜 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 10mM HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 22는 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
세포배양, 수확, 농축 및 완충액 -교환 단계와 관련된 모니터링 데이터
매개변수 HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C
해동부터 100L 생물반응기 접종까지 시간 (일) 21 19 17 18
100 L 접종 밀도
(× 106 세포/mL)		 0.45 0.33 0.44 0.46
대수적 성장에서 배가시간 (hr) 29.8 27.3 29.2 23.5
최대 세포 밀도
(× 106 세포/mL)		 5.65 8.70 6.07 9.70
수확물 생존률 (%) 41 48 41 41
수확물 역가 (U/ml) 1964 1670 991 1319
100-L 생물반응기 내 시간
(일)		 13 13 12 13
정화된 수확물 부피 (mL) 81800 93300 91800 89100
정화된 수확물 효소 분석 (U/mL) 2385 1768 1039 1425
농축 효소 분석 (U/mL) 22954 17091 8561 17785
완충액 교환 농축 효소 분석 (U/mL) 15829 11649 9915 8679
여과된 완충액 교환 농축 효소 분석 (U/mL) 21550 10882 9471 8527
완충액 교환 농축 부피 (mL) 10699 13578 12727 20500
비율 효소 유닛
농축물/수확물		 0.87 0.96 1.32 1.4
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도(conductivity) 및 내독소(LAL) 분석을 측정하기 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼을 컬럼 부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 정용여과(diafiltered)된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM HEPES, 400mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 컬럼 부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 상기 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 원액 용액으로, 최종농도가 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트 및 0.1mM CaCl2 pH 7.0을 100cm/시간으로 첨가하였다. 통과물(flow through)을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다.
컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 컬럼을 통과시키고, 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 그리고 나서 20mM 비신, 100mM NaCl, pH 9.0으로 컬럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50mM HEPES, 100mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수확하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 측정하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도가 5mM 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2를 수득하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척한 다음, 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20nm 구멍이 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 시알산(sialic acid) 프로파일 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그다음 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. HEPES/식염수 용액(10mM HEPES, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척함으로써 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축 후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM HEPES, 130mM NaCl, pH 7.0으로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
표 23 내지 29는 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
Q 세파로즈 컬럼 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 10647 13524 12852 20418
로딩 부피/레진 부피 비 3.1 4.9 4.5 7.3
컬럼 부피 (mL) 2770 3840 2850 2880
용출물 부피 (mL) 6108 5923 5759 6284
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 2.8 3.05 2.80 2.86
용출물 효소 분석 (U/mL) 24493 26683 18321 21052
효소 수득률 (%) 65 107 87 76
페닐 세파로즈 컬럼 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
원액 용액 첨가 전
부피 (mL)		 5670 5015 5694 6251
로딩 부피 (mL) 7599 6693 7631 8360
컬럼 부피 (mL) 9106 9420 9340 9420
로딩 부피/레진 부피 비 0.8 0.71 0.82 0.89
용출물 부피 (mL) 16144 18010 16960 17328
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.4 0.33 0.33 0.38
용출물 효소 분석 (U/mL) 8806 6585 4472 7509
단백질 수득률 (%) 41 40 36 37
효소 수득률 (%) 102 88 82 96
아미노 페닐 보로네이트 컬럼 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 16136 17958 16931 17884
로딩 부피/레진 부피 비 2.99 3.15 3.08 2.98
컬럼 부피 (mL) 5400 5700 5500 5300
용출물 부피 (mL) 17595 22084 20686 19145
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.0 0.03 0.03 0.04
여과된 용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 미시험됨 0.03 0.00 0.04
용출물 효소 분석 (U/mL) 4050 2410 1523 4721
단백질 수득률 (%) 0 11 11 12
효소 수득률 (%) 미결정됨 41 40 69
히드록시아파타이트 컬럼 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
원액 용액 첨가전 부피 (mL) 16345 20799 20640 19103
로딩 부피/레진 부피 비 10.95 13.58 14.19 12.81
컬럼 부피 (mL) 1500 1540 1462 1500
로딩 부피 (mL) 16429 20917 20746 19213
용출물 부피 (mL) 4100 2415 1936 2419
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 미시험됨 0.24 0.17 0.23
여과된 용출물의 단백질 농도 (mg/mL) NA NA 0.17 NA
용출물 효소 분석 (U/mL) 14051 29089 20424 29826
단백질 수득률 (%) 미시험됨 93 53 73
효소 수득률 (%) 87 118 140 104
DV20 여과 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 4077 2233 1917 2419
여과물 부피 (mL) 4602 3334 2963 3504
여과물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.1 NA 0.09 NA
여과된 용출물의 단백질 농도 (mg/mL) NA 0.15 0.09 0.16
단백질 수득률 (%) not tested 93 82 101
최종농도 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 4575 3298 2963 3492
농축물 부피 (mL) 562 407 237 316
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73
단백질 수득률 (%) 111 102 103 98
최종제형으로 완충액 -교환 데이터
매개변수 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 562 407 237 316
최종 부피 완충액 교환 농축물 (mL) 594 516 310 554
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 1.00 0.97 0.98 1.00
여과된 농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.95 0.92 0.95 1.02
단백질 수득률 (%) 118 99 110 101
정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5mL 및 1mL 충전부피(fill volume)의 멸균 바이알에 무균적으로 충전하였다. 단백질을 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용되는 조작자-조절 펌프로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 바이알의 마개(stoppers)를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외부입자를 육안으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에 담가 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 보관하였다.
실시예 5
가용성 인간 PH20(rHuPH20)을 함유하는 Gen2 세포의 생산
실시예 2에 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4mM GlutaMAX™-1 및 1.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0μM 메토트렉세이트를 갖는 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 약 4주후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX™-1 및 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(master cell bank: MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결해서 사용하였다.
4mM GlutaMAX™-1 및 4.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대 후, 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일 후, 배지 내 메토트렉세이트 농도는 16.0μM로 증가되었고, 18일 후에는 20.0μM로 증가되었다. 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지 내 8번째 계대 유래 세포를 4mM GlutaMAX™-1 및 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대 후, 2B2 세포를 연구세포은행(research cell bank: RCB)으로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈(genomic) 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소 분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 상기 유도된 cDNA(서열변호:56)가 예상된 시토신(C) 대신 티미딘(T)인 것으로 관찰된 위치 1131에서 한개의 염기쌍 차이를 제외하고는 참조서열(서열번호 49)과 동일함을 지시하였다. 이는 아미노산 서열상에 영향이 없는 침묵 돌연변이이다.
실시예 6
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 36L 스피너 플라스크를 통하여 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL이 있는 125mL 진탕 플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용 전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 mL당 4.0x105 개 생존세포의 접종밀도 및 260L의 총부피로, 400L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 매개변수는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40 내지 55rpm; 용기압력 3 psi; 공기분사 0.5 내지 1.5L/분; 공기오버레이: 3L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 작동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 160 mL/L GlutaMAX™-1 + 83 mL/L 이스톨레이트 + 33 mg/L rHuInsulin) 10.4 L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 (2×CD-CHO + 33 g/L 글루코스 + 80 mL/L GlutaMAX™-1 + 167 mL/L 이스톨레이트 + 0.92 g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 (1×CD-CHO + 50 g/L 글루코스 + 50 mL/L GlutaMAX™-1 + 250 mL/L 이스톨레이트 + 1.80 g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 (1×CD-CHO + 33 g/L 글루코스 + 33 mL/L GlutaMAX™-1 + 250 mL/L 이스톨레이트 + 0.92 g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에서, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도와, ml당 17,000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4 내지 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4 내지 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행의 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈 (Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 셀룰로오스 막을, 그다음 0.4 내지 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후, 그다음 셀룰로오스 막을, 그다음 350L 용량의 멸균 일회용 신축성 백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 전 즉시 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9L 레진, H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화 후, 농축되고 정용여과된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM HEPES, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM HEPES, 400mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 판독하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(19 내지 21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, 0.1mM CaCl2, pH7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 원액 용액으로 보충하여, 최종농도 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM 를 수득하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과물(flow thru)을 수집하였다. 컬럼을 100cm/시간으로 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트 및 0.1mM CaCl2 pH7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과물에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과물을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과물을 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(Promtics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과물을 100cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 0.5M 암모늄 설페이트, pH 9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 100mM 염화나트륨, pH 9.0으로 세척하였다. 단백질을 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 최종농도 5mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2로 보충하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 2L로 세척하여 준비하였다. 사용 전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP-정제된 단백질을 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
다음으로 여과물 내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10 mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축 후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 완충액-교환 후, 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
그리고 나서 멸균여과된 벌크 단백질을 30 mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20 mL씩 무균적으로 분주하였다. 그다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 보관하였다.
C. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물 내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제(실시예 4.B에 기술됨)와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화가 있다. 표 30은 상기 방법 간에 단순한 규모확대 변화뿐만 아니라 실시예의 차이를 기재하고 있다.
표 30
공정 차이 Gen1 가용성 rHuPH20 Gen2 가용성 rHuPH20
세포주 3D35M 2B2
세포 접종물의 확장에 이용된 배지 0.10 μM 메토트렉세이트 (0.045 mg/L) 함유 20 μM 메토트렉세이트 (9 mg/L) 함유
6L 배양물 내 배지
계속		 0.10 μM 메토트렉세이트 함유 메토트렉세이트 미함유
36 L 스피너 플라스크 기계 없음




20 L 작동 부피.		 pH, 용존 산소, 분사 및 오버레이 가스 유속을 모니터링하고 조절하는 기구 장착

32 L 작동 부피
생물반응기 내 최종 작동 부피 125 L 생물반응기 내 약 100 L
(초기 배양물 부피 + 65 L)		 400 L 생물반응기 내 약 300 L
(초기 배양물 부피 + 260 L)
최종 생물반응기 내 배양물 배지 rHuInsulin 없음 5.0 mg/L rHuInsulin
배지 피드 부피 생물반응기 세포배양물 부피의 4%, 즉, 3.4, 3.5 및 3.7 L 로 조정하여, ~92 L의 목적 생물반응기 부피 생산. 생물반응기 세포배양물 부피의 4%, 즉, 0.4, 10.8, 11.2 및 11.7 L 로 조정하여, ~303 L의 목적 생물반응기 부피 생산.
배지 피드 피드 #1 배지: CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8mM GlutaMAX™-1

피드 #2 (CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8 mM GlutaMAX + 1.1 g/L 부티르산 나트륨

피드 #3: CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8 mM GlutaMAX + 1.1 g/L 부티르산 나트륨		 피드 #1 배지: 4× CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 32 mM Glutamax + 16.6 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin

피드 #2: 2× CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 16 mM Glutamax + 33.4 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 부티르산 나트륨

피드 #3: 1× CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 10 mM Glutamax + 50 g/L Yeastolate + 1.80 g/L Sodium Butyrate

피드 #4:1× CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 6.6 mM Glutamax + 50 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 부티르산 나트륨
생물반응기 세포 배양물의 여과 일련의 4개의 폴리에테르설폰 필터 (8.0 μm, 0.65 μm, 0.22 μm 및 0.22 μm)














100 L 저장 백		 1st 단계 - 4-8 μm 등급의 규조토층 및 1.4-1.1 μm 등급의 규조토층을 각각 함유한, 평행의 4개의 모듈, 이어서 셀룰로오스 막.
2nd 단계 - 0.4-0.11 μm 등급의 규조토 층 및 0.1 μm 미만의 규조토 층을 함유한 단일 모듈, 이어서 셀룰로오스 막.
3rd 단계 - 0.22 μm 폴리에테르설폰 필터

300L 저장 백

수확된 세포 배양물을 10 mM EDTA, 10 mM 트리스로 pH 7.5까지 보충.
크로마토그래피 전 농축 및 완충액-교환 밀리포어 스피랄 폴리에테르설폰 30K MWCO 필터를 갖는 2TFF로 농축

10 mM HEPES, 25 mM NaCl, pH 7.0 로 농축물 6×를 완충액 교환

20L 멸균 저장 백		 4개의 Sartorius Sartoslice TFF 30K MWCO 필터를 이용하여 농축

10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 로 농축물 10× 를 완충액 교환

50L 멸균 저장 백
크로마토그래피 전 바이러스 불활성화 없음 1% 트리톤 X-100, 0.3% 트리부틸 포스페이트, pH 7.5 로 바이러스 불활성화 수행
1st 정제 단계 (Q 세파로스) 흡광도 판독 안함 시작 및 끝에 A280 측정
크로마토그래피 후 바이러스 여과 Pall DV-20 필터 (20 nm) Sartorius Virosart 필터 (20 nm)
크로마토그래피 후 농축 및 완충액-교환 HEPES/식염수 pH 7.0 완충액

1 mg/ml로 단백질 농축		 히스티딘/식염수, pH 6.0 완충액

10 mg/ml로 단백질 농축
실시예 7
시알산 및 단당류 함량 결정
가용성 rHuPH20의 시알산 및 단당류 함량은 트리플루오로아세트산으로 가수분해한 후에 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)에 의해 평가하였다. 한 실시예에서, 정제된 히알루로니다제 lot # HUB0701E (1.2 mg/mL; 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 생성 및 정제됨)의 시알산 및 단당류 함량을 결정하였다. 요컨대, 100 ㎍ 샘플을 100℃에서 4시간 동안 40％ (v/v) 트리플루오로아세트산으로 가수분해하였다 (2회). 가수분해 후에, 샘플을 건조시켜 가라앉히고, 물 300 ㎕에 재현탁시켰다. 각각의 재현탁된 샘플로부터의 분취액 45 ㎕를 새로운 튜브에 옮기고, 건조시켜 가라앉히고, 각각에 10 mg/mL 나트륨 아세테이트 용액 10 ㎕를 첨가하였다. 방출된 단당류를 메탄올 중 30 mg/mL 2-아미노벤조산, 20 mg/mL 나트륨 시아노보로히드라이드, 대략 40 mg/mL 나트륨 아세테이트 및 20 mg/mL 붕산을 함유하는 용액 50 ㎕를 첨가하여 형광 표지하였다. 혼합물을 암실에서 30분 동안 80℃에서 인큐베이션하였다. 유도체화 반응물을 이동상 A (0.2％ (v/v) n-부틸아민, 0.5％ (v/v) 인산, 1％ (v/v) 테트라히드로푸란) 440 ㎕를 첨가하여 켄칭하였다. 또한, 물의 매트릭스 블랭크를 음성 대조군으로서 히알루로니다제 샘플에 대해 기재된 바와 같이 가수분해시키고, 유도체화시켰다. 방출된 단당류를 옥타데실 (C18) 역상 컬럼 (4.6×250 mm, 5 μm 입자 크기; J.T. Baker)을 사용하여 RPLC에 의해 분리하고, 형광 검출 (360 nm 여기, 425 nm 방출)에 의해 모니터링하였다. 히알루로니다제 샘플로부터의 크로마토그램을 N-D-글루코사민 (GlcN), N-D-갈락토사민 (GalN), 갈락토스, 푸코스 및 만노스를 포함하는 단당류 표준의 크로마토그램과 비교하여 단당류 함량을 정량하였다. 표 31은 히알루로니다제 분자 당 각각의 단당류의 몰비를 보여준다.
가용성 rHuPH20 의 단당류 함량
로트 회차 GlcN GalN 갈락토스 만노스 푸코스
HUB0701E

 1 14.28 0.07* 6.19 25.28 2.69
2 13.66 0.08* 6.00 24.34 2.61
평균 13.97 0.08* 6.10 24.81 2.65
* GaIN 결과는 검출 한계 미만임
실시예 8.
3 D35M 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 의 C-말단 이종성
100 L 생물학적 반응기 체적에서의 3D35M 세포 (Lot HUA0505MA) 및 300L 생물학적 반응기 체적에서의 2B2 세포 (Lot HUB0701EB)로부터 생성 및 정제된 sHuPH20의 2개의 로트에 대한 C-말단 서열분석을 수행하였다. 이들 로트를 아스파르트산 및 시스테인산에서의 펩티드 결합을 N-말단적으로 특이적으로 절단하는 엔도프로테이나제 Asp-N으로 별도로 분해하였다. 이는 서열 4의 431 위치의 아스파르트산에서 가용성 rHuPH20의 C-말단 부분을 방출한다. C-말단 단편을 분리하고, 특성화하여 Lot HUA0505MA 및 Lot HUB0701EB에서 각각의 집단의 풍부도 및 서열을 결정하였다.
3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제가 이종성을 나타내고, 이들의 C-말단 서열이 서로 상이한 폴리펩티드를 함유하는 것으로 관찰되었다 (표 27 및 28). 이 이종성은 생성 및 정제 과정 동안 세포 배양 배지 또는 다른 용액에 존재하는 펩티다제에 의한 발현된 447개 아미노산 폴리펩티드 (서열 4)의 C-말단 절단의 결과일 수 있다. 가용성 rHuPH20 제제에서의 폴리펩티드는 서열 4에 나열된 가용성 rHuPH20 서열의 아미노산 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 및 1-443에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이를 폴리펩티드 각각의 전체 아미노산 서열은 각각 서열 4 내지 8에 나열되어 있다. 표 32 및 33에서 언급된 바와 같아, 3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제에서의 각각의 폴리펩티드의 풍부도는 상이하였다.
로트 HUA0505MA 로부터의 C-말단 단편 분석
단편 아미노산 위치
(서열 4에 대함)		 순서 이론적 질량 실험적 질량 오차 용출 시간 풍부도
D28a 431-447 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열57)		 2053.97 2054.42 0.45 99.87 0.2％
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열58)		 1890.91 1891.28 0.37 97.02 18.4％
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열59)		 1743.84 1744.17 0.33 86.4 11.8％
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열60)		 1630.70 1631.07 0.32 74.15 56.1％
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열61)		 1502.70 1502.98 0.28 77.36 13.6％
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열62)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0％
로트 HUB0701EB 로부터의 C-말단 단편 분석
단편 아미노산 위치
(서열 4에 대함)		 순서 이론적 질량 실험적 질량 오차 용출 시간 풍부도
D28a 431-477 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열57)		 2053.97 2054.42 0.45 99.89 1.9％
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열58)		 1890.91 1891.36 0.45 96.92 46.7％
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열59)		 1743.84 1744.24 0.40 85.98 16.7％
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열60)		 1630.70 1631.14 0.39 73.9 27.8％
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열61)		 1502.70 1503.03 0.33 77.02 6.9％
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열62)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0％
실시예 9
상이한 히알루로난 분해 효소의 분산 활성의 비교
상이한 히알루로난 분해 효소가 분산제로서 작용하는 능력을 생체내에서 평가하였다. 마우스에서 분산 분석을 사용하여 상이한 히알루로난 분해 효소가 트리판 블루의 분산제로 작용하는 능력을 평가하고, 또한 상기 효소가 혈당 수준 감소에 있어 공동-투여된 인슐린의 효능을 향상시키는 능력을 평가하였다. 분석된 히알루로난 분해 효소에는 rHuPH20, peg화 PH20 (PEG PH20), Hyal 1, 콘드로이티나제 ABC, 콘드로이티나제 AC 및 스트렙토마이세스 히알루롤리티쿠스 리아제가 포함된다. 이들을 중성 완충제 (10 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 145.5 mM NaCl, 1 mg/ml 인간 혈청 알부민) 중에서 트리판 블루 및 휴뮤린® 인슐린과 혼합하고, 마취된 마우스에 전달하였다. 이어서, 트리판 블루의 분산 면적 및 혈당 수준을 모두 측정하였다. 중성 pH 완충제를 단독으로 및 휴뮤린® 인슐린을 단독으로 음성 대조군으로 사용하였다. 낮은 pH 완충제 (pH 4.5)가 분산제로 작용하는 능력을 시험하였다. NCr nu/nu 동종 마우스의 9개의 군 (대략 10주령된 마우스, 체중 21-25 g, 군 당 마우스 3 마리)에게 케타민/크실라진 (염수 중 10:1 혼합물)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 이후에, 마우스에게 리비케이지(ribcage)의 꼬리 말단 위의 중선에서 피내 주사에 의해 40 ㎕의 히알루로난 분해 효소 및 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 (0.4％ 트리판 블루 염료 포함)을 투여하였다. 대조군에게 휴뮤린® 인슐린 단독, 완충제 단독 또는 완충제를 투여하였고, 휴뮤린® 인슐린이 또한 포함되었다. 특히, 1군 마우스는 음성 대조군이고, 트리판 블루를 중성 pH 완충제와 투여하고; 2군 마우스는 트리판 블루를 낮은 pH 완충제 중 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린과 투여하고; 3군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 10 유닛/mL rHuPH20과 투여하고; 4군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 10 유닛/mL PEG PH20 (아래 실시예 10에 기재된 바와 같이 생성됨)과 투여하고; 5군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 10 유닛/mL Hyal 1과 투여하고; 6군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 10 유닛/mL 콘드로이티나제 ABC (어소시에이츠 오브 케이프 코드(Associates of Cape Cod), E. Falmouth, MA)와 투여하고; 7군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 1 유닛/mL 콘드로이티나제 AC (어소시에이츠 오브 케이프 코드, E. Falmouth, MA)와 투여하고; 8군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린 및 100 유닛/mL 스트렙토마이세스 히알루롤리티쿠스 리아제 (칼바이오켐(Calbiochem))와 투여하고; 9군 마우스는 트리판 블루를 5 유닛/mL 휴뮤린® 인슐린과 투여하였다. 이어서, 주사후 2.5, 5, 10, 15 및 20 분에 트리판 블루 염료의 분산을 캘리퍼로 측정하였다. 최장축 M1 (염료 정면의 길이) 및 M2 (염료 정면의 폭)을 ¼ π (M1M2 × ¼π)와 곱하여 염료 분산 면적 (mm2)을 계산하였다. 0, 5, 10, 15 및 20 분에 글루코미터를 사용하여 혈당 수준을 측정하였다.
1. 염료 분산
표 34는 각각의 시험 물품을 투여한 후의 평균 염료 분산 영역을 나열하고 있다. 중성 pH 완충제 및 낮은 pH 완충제에서의 트리판 블루 염료는 최소 확산을 나타내고, 분산 면적은 주사후 2.5 분에 평균 약 36 mm2 내지 주사후 20 분에 약 51 mm2 범위이다. 트리판 블루 염료를 휴뮤린® 인슐린, Hyal 1, 또는 PEG PH20과 혼합하여 전달하였을 때, 분산 면적은 염료를 완충제하고만 혼합하였을 때 관찰된 것에 비해 통계학적으로 유의하게 증가하지 않았다. 반면, rHuPH20, 콘드로이티나제 ABC, 콘드로이티나제 AC 또는 스트렙토마이세스 히알루롤리티쿠스 리아제와 혼합하여 전달하였을 때 염료 분산에서 상당한 증가가 관찰되었다. rHuPH20과 혼합하여 전달하였을 때 트리판 블루 염료의 평균 분산 면적은 주사후 2.5, 5, 10, 15 및 20분에 각각 약 45 mm2, 66 mm2, 80 mm2, 86 mm2 및 102 mm2였다. 콘드로이티나제 AC와 혼합하여 전달하였을 때 트리판 블루 염료의 평균 분산 면적은 주사후 2.5, 5, 10, 15 및 20 분에 각각 약 76 mm2, 107 mm2, 107 mm2, 110 mm2 및 116 mm2였다. 콘드로이티나제 ABC와 혼합하여 전달하였을 때 트리판 블루 염료의 평균 분산 영역은 주사후 2.5, 5, 10, 15 및 20 분에 각각 약 57 mm2, 75 mm2, 79 mm2, 81 mm2 및 88 mm2였다. 스트렙토마이세스 히알루롤리티쿠스 리아제와 혼합하여 전달하였을 때 트리판 블루 염료의 평균 분산 영역은 주사후 2.5, 5, 10, 15 및 20 분에 각각 약 74 mm2, 76 mm2, 101 mm2, 103 mm2 및 130 mm2였다.
염료 분산 면적( mm 2 )의 군 평균 요약
군
 시험 물품
 염료 분산 면적 (mm2)
2.5 분 5 분 10 분 15 분 20 분
1 중성 pH 완충제 비히클/대조군 36.11 41.63 47.19 52.47 51.34
2 낮은 pH 완충제 33.34 34.47 41.88 44.91 51.18
3 PEG PH20 (10 U/mL) 37.28 47.08 52.40 54.94 58.17
4 rHuPH20 (10 U/mL) 44.58 66.02 79.46 86.24 101.90
5 Hyal I (10 U/mL) 31.53 36.27 39.60 46.41 48.21
6 콘드로이티나제 ABC (10 U/mL) 56.85 75.06 78.60 81.44 87.85
7 콘드로이티나제 AC (1 U/mL) 75.67 106.56 106.49 110.43 115.82
8 Strep 리아제 (100 U/mL) 73.97 75.58 101.03 102.69 129.56
9 휴뮤린 R 38.22 43.94 50.76 52.49 58.41
2. 혈당 수준
표 35는 각각의 시험 물품을 투여한 후의 평균 혈당 수준 (mg/dL)을 나열하고 있다. 염료 및 완충제를 단독으로 투여한 마우스에서의 혈당 수준은 평균 주사전 대략 212 mg/dL에서 주사후 5 분에 대략 332 mg/dL로 증가하였다. 이후에, 이 수준은 주사후 20 분에 점차적으로 대략 367 mg/dL까지 상승하였다. 이러한 인슐린 부재하에서의 혈당의 증가는 설치류에서의 혈당에 대한 마취제의 공지의 효과 때문이다 (예를 들어 문헌 [Saha et al., (2005) Exp. Biol. Med. 230:777-784] 참조). 휴뮤린® 인슐린을 투여하였을 때, 혈당 수준은 요컨대 (주사전 평균 약 226 mg/dL에서) 주사후 5 분에 평균 약 292 mg/dL로 상승하고, 이어서 주사후 10, 15 및 20 분에 각각 평균 약 171 mg/dL, 122 mg/dL 및 97 mg/dL로 떨어진다. 모든 히알루로난 분해 효소는 휴뮤린® 인슐린과 투여하였을 때 혈당 수준을 낮추는 한편, rHuPH20, PEG PH20, 콘드로이티나제 ABC 및 스트렙토마이세스 히알루롤리티쿠스 리아제의 공동-투여는 휴뮤린® 인슐린을 단독으로 투여한 경우에 관찰되는 것보다 훨씬 더 빠르게 혈당 수준을 감소시키는 것으로 나타났다.
혈중 글루코스 수준( mg / dL )의 군 평균 요약
군 시험 물품 혈중 글루코스 수준(mg/dL)
0 분 5 분 10 분 15 분 20 분
1 중성 pH 완충제 비히클/대조군 212.00 332.00 344.00 3.61.33 367.67
2 낮은 pH 완충제 196.67 259.67 249.33 231.33 220.67
3 PEG PH20 (10 U/mL) 170.00 196.67 110.00 68.33 46.67
4 rHuPH20 (10 U/mL) 165.67 173.00 96.00 63.67 39.00
5 Hyal I (10 U/mL) 155.67 201.33 144.33 77.00 52.67
6 콘드로이티나제 ABC (10 U/mL) 129.67 123.67 65.00 44.67 21.00
7 콘드로이티나제 AC (1 U/mL) 174.33 248.67 204.67 165.33 133.67
8 Strep 리아제 (100 U/mL) 140.33 120.67 68.67 41.00 27.67
9 휴뮤린 R 226.33 292.00 171.33 122.33 96.67
실시예 10
rHuPH20의 PEG화
A. rHuPH20에 mPEG-SBA-30K의 접합
PEG화된 가용성 인간 히알루로니다제를 생성시키기 위해, rHuPH20 (크기가 대략 60 KDa임)을 대략 30 kDa의 분자량을 갖는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)에 공유결합으로 접합시켰다. mPEG-SBA의 구조는 하기 반응식 2에 나타낸다.
반응식 2:
Figure pct00007

rHuPH20을 PEG화하는데 사용된 mPEG-SBA-30K를 제조하기 위해 사용된 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,672,662호에 기재되어 있다. 요약하면, mPEG-SBA-30K를 하기 절차에 따라 제조한다:
디옥산에 용해된 에틸 말로네이트 (2 당량)의 용액을 질소 분위기 하에 수소화나트륨 (2 당량) 및 톨루엔에 적가하였다. mPEG 메탄 술포네이트 (1 당량, MW 30 kDa, Shearwater)를 톨루엔에 용해시키고, 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 대략 18시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 원래 부피의 절반으로 농축시키고, 10% 수성 NaCl 용액으로 추출하고, 1% 수성 염산으로 추출하고, 수성 추출물을 혼합하였다. 수집된 수성층을 디클로로메탄 (3x)으로 추출하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 건조물로 증발시켰다. 생성된 잔류물을 염화나트륨을 함유하는 1N 수산화나트륨에 용해시키고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 6N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 대략 3으로 조정하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (2x)으로 추출하였다.
유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물을 디옥산에 용해시키고, 8시간 동안 환류시킨 후, 건조물로 농축시켰다. 생성된 잔류물을 물에 용해시키고, 디클로로메탄 (2x)으로 추출하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용액을 회전식 증발에 의해 농축시킨 후, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물 (1 당량)을 디클로로메탄에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드 (2.1 당량)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 디클로로메탄 중 디시클로헥실카르보디이미드 (2.1 당량)의 용액을 적가하였다. 용액을 실온에서 대략 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켜, mPEG-SBA-30K를 수득하였다.
PEG화된 rHuPH20을 제조하기 위해, 반응식 3에 나타낸 바와 같이 mPEG-SBA-30K를 공유결합 접합에 의해 rHuPH20의 아미노기(들)에 커플링시켜, rHuPH20과 mPEG 사이에 안정한 아미드 결합을 제공하였다.
반응식 3:
Figure pct00008
페길화 rHuPH20
접합을 위해, mPEG-SBA-30K를 분말 형태로 rHuPH20에 첨가하였다 (130 mM NaCl/10 mM HEPES 중 10 mg/mL의 농도; pH 7). PEG:rHuPH20 비율은 10:1 (몰비)이었다. PEG를 완충액에 용해시킨 후, 용액을 멸균-여과하였다 (코닝(Corning) 50 mL 튜브 탑 필터, 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트 0.22 ㎛ 막). 접합을 저온실에서 4℃에서 밤새 교반하면서 수행하였다.
접합 후, 100,000 MWCO TFF 막을 사용하여 용액을 농축시키고, 완충액을 130 mM NaCl/10 mM HEPES pH 6.8에 대해 교환하였다. 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 효소 활성에 대해 시험한 생성 물질을 pH 6.8 로 130 mM NaCl/10 mM HEPES 를 사용하여 희석시켜, 100,000 U/mL (대략 2.5 mg 펩티드/mL에 상응함)의 최종 효소 활성을 얻었다. 이 PEG화된 rHuPH20 물질을 1 mL 부피로 13-mm 유형-1 유리 바이알에 충전하고, 브롬부틸 밀봉하고, 동결된 상태로 저장하였다 (더 오래 저장하기 위해 -80℃ 냉동실에서 밤새 동결한 다음 -20℃ 냉동실에 두었다).
B. PEG화된 rHuPH20의 분석
PEG화된 rHuPH20 물질을 겔 전기영동에 의해 검정하였다. 상기 실시예 7A에서와 같이 제조된 PEG화된 rHuPH20의 3개의 배치(batch)는 상이한 거리로 이동한 미반응 PEG 및 mPEG-rHuPH20 접합체의 다양한 종을 나타내는 복수의 밴드의 동일한 패턴을 나타내었다. 분자량 마커의 이동과의 비교를 기초로 하여, 종을 나타내는 밴드는 대략 90 KDa 내지 300 KDa 범위였으며, 3개의 어두운 밴드는 240 KDa 마커 위로 이동하였다. 이들 데이터는, mPEG-SBA-30K의 공유결합 접합에 의해 생성된 PEG화된 rHuPH20이 일-, 이- 및 삼-PEG화된 단백질을 포함할 가능성이 있는 PEG화된 rHuPH20 종들의 불균질 혼합물을 함유하였다는 것을 나타내었다. 60 KDa에서의 가시적 밴드의 결핍은 모든 단백질이 PEG와 반응하였고, 검출가능한 천연 rHuPH20이 혼합물에 존재하지 않았다는 것을 시사하였다.
실시예 11
돼지에서 피하 투여한 후의 인슐린의 약동학에 대한 rHuPH20 의 효과
돼지 모델이 재조합 히알루로니다제 (예를 들어 rHuPH20)와 공동-투여된 식후 인슐린의 약동학을 모델링하는데 적합한지 여부를 결정하기 위해, rHuPH20과 함께 또한 rHuPH20 없이 피하 주사한 후의 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약동학을 평가하였다. 이어서, 그 결과를 인간에서 관찰된 결과와 비교하여 (실시예 1 참조), 돼지 모델이 인간에서 관찰되는 것을 정확하게 반영하는지 여부를 결정하였다.
요컨대, 무작위적인, 4-원 교차 연구에서 6 마리 돼지에게 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린을 rHuPH20과 함께 또는 rHuPH20 없이 피하 투여하였다. 각각의 동물에게 모든 4개의 시험 물품으로 3 주기 처치를 시행하여 일련의 투여 주기에 걸쳐 인슐린 약동학의 재현가능성의 비교를 용이하게 하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 면역반응성 인슐린 (IRI)의 수준을 결정하기 위해 혈청을 평가하였다. 이어서, 다양한 약동학 매개변수 (tmax, Cmax, 초기 t50％, 후기 t50％, 및 AUCmax 포함)을 결정하였다.
A. 투여 및 샘플링
4800 U/mL rHuPH20을 포함하는 또는 포함하지 않는 100 U/mL 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 투여 용액 (또는 시험 물품)을 다음과 같이 제조하였다. 100 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 및 휴뮤린® R 인슐린 단독 용액을 각각 휴마로그® 인슐린 리스프로 (100 U/mL; Lot A418976, 일라이 릴리) 및 휴뮤린® R 인슐린 (100 U/mL; Lot A393318, 일라이 릴리, 멸균 희석제와 1:5로 희석 (일라이 릴리))의 시판되는 로트로부터 제조하였다. 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 용액을 제조하기 위해, 100 U/mL 휴마로그® 인슐린 리스프로 (일라이 릴리, Lot A418976) 910 ㎕, 하일레넥스 재조합 제제 (히알루로니다제 인간 주사) (백스터(Baxter), Lot 903646) 44.6 mL 및 rHuPH20 API 1 mg/mL (할로자임 테라퓨틱스(Halozyme Therapeutics), Lot HUA0703MA) 45.4 ㎕를 최종 휴마로그® 인슐린 리스프로 농도가 91 U/mL가 되고 히알루로니다제 활성이 5454 U/mL가 되도록 혼합하였다. 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 용액을 제조하기 위해, 500 U/mL 휴뮤린® R 인슐린 (일라이 릴리, Lot A393318) 200 ㎕ 및 rHuPH20 약품 6000 U/mL (할로자임(Halozyme), Lot 288004; rHuPH20 약품 - 145 mM NaCl 중 50 ㎍ rHuPH20, 10 mM 이염기성 나트륨 포스페이트, 2.7 mM 염화칼슘, 2.7 mM EDTA 이나트륨 염, 1 mg/mL 인간 혈청 알부민 (pH 7.4) 함유) 800 ㎕를 최종 인슐린 농도가 100 U/mL이고, rHuPH20 히알루로니다제 활성이 4800 U/mL가 되도록 혼합하였다.
rHuPH20을 함유하는 용액을 멸균 여과하고, 2 mL I형 유리 (비톤(Wheaton)) 바이알에 채우고, 13-mm 고무 (스텔미(Stelmi)) 마개로 밀폐시켰다. 이어서, rHuPH20을 함유하는 용액을 2개의 세트로 나누었다; 하나는 시험될 때까지 냉각 대조군으로 유지하고, 다른 하나는 이 연구에서 동물에게 투여하는데 사용하였다. 모든 투여 용액을 모든 시간에 냉각 상태로 유지시킨 후에, 시험에 다시 사용하였다. 용액의 각각의 세트를 제제화시키고 1 내지 6 일 이내에 같은 날에 rHuPH20 효소 활성에 대해 시험하였다.
6 마리 성숙한 수컷 유카탄 피그 (S＆S 팜스(Farms), Ramona, CA) (각각 연구 시작시 체중이 21 내지 25 kg임)에게, 연구 전반에 걸쳐 용이한 혈액 샘플링을 위해 설치된 외부 혈관 접근 출구가 있는 경정맥 또는 경동맥 카테터 (수술에 의해 이식됨)를 장착시켰다. 동물을 계측 및 처치 전 7일 동안 격리시켰다. 6 마리의 동물을 아래 표 36에 나타낸 바와 같이 무작위적으로 2개의 연구군으로 나누었다. 군 당 각각 3 마리 동물을 함유하도록 2개 군 중 하나에 동물을 배정하고, 이러한 배정을 1 및 2 주기 동안 유지하였다. 제3 투여 주기에서, 2 마리 동물이 캐뉼라의 비-개방성 때문에 누락되고, 나머지 4 마리 동물을 군 당 2 마리만의 동물로 다시 배정하였다. 1군 동물 ID 번호는 1 및 2 주기에서 540, 541 및 542이고; 3 주기에서 542 및 544이다. 2군 동물 ID 번호는 1 및 2 주기에 544, 545, 및 546이고; 3 주기에서 545 및 546이다.
투여 용액을 몸체의 중선 뒤로 각각의 돼지의 왼쪽 옆구리에 피하 (SC) 투여하였다. 시험 물품을 투여하기 전에, 처치전 혈액 샘플을 수득하였다. 동물에게 적절한 시험 물품 (0.2 U/kg; 정확한 투여량을 정확하게 결정하기 위해 각각의 투여전에 측정된 동물 사용)을 격일 프로토콜에서 단일 SC 투여하였다. 각각의 동물에게 비히클 또는 신선한 rHuPH20의 공동-제제 중 0.2 U/kg로 지시된 인슐린 (즉, 인슐린 또는 리스프로)을 단일 SC 볼루스 투여하였다. 시험 물품을 투여한 후에, 적어도 0.7 내지 1.0 mL의 혈액을 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 및 240분에 순차적으로 방출시켰다. 또한, 투여 전에 처치전 혈액을 얻었다 (채혈). 혈액 샘플을 즉시 항응고제를 함유하지 않는 혈청 튜브에 넣고, 최소 30분 동안 얼음에 올려놓고, 이어서 주변 온도에서 5분 동안 9500×g에서 원심분리하였다. 이어서, 혈청을 미리 표지된 튜브로 옮기고, 냉동시키고, 모든 샘플이 면역반응성 인슐린 (IRI) 수준에 대한 생물학적 분석을 위해 밀리포어에 배송될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
피그 모델 평가를 위한 투여 프로토콜
주기 투여일 연구일 군 #1 처치 군 #2 처치
1 1 0 휴마로그® 인슐린 리스프로 휴뮤린® R 인슐린
2 2 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20
3 4 휴뮤린® R 인슐린 휴마로그® 인슐린 리스프로
4 6 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20
2 5 8 휴마로그® 인슐린 리스프로 휴뮤린® R 인슐린
6 10 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20
7 12 휴뮤린® R 인슐린 휴마로그® 인슐린 리스프로
8 14 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20
3 9 26 휴마로그® 인슐린 리스프로 휴뮤린® R 인슐린
10 28 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20
11 30 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20
12 32 휴뮤린® R 인슐린 휴마로그® 인슐린 리스프로
B. 혈청 인슐린 수준
각각의 혈청 샘플에 대한 혈청 IRI 농도를 StatLIA® 검정 분석 소프트웨어 (브렌단 테크놀로지스(Brendan Technologies), Carlsbad, CA)를 사용하여 표준 곡선으로부터의 보간법에 의해 결정하였다. 표 37은 휴마로그® 인슐린 리스프로, 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20, 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20을 투여한 후의 IRI 농도를 제공한다. 표 37은 사전-채혈 샘플에서 측정된 기준선 IRI 수준을 나열하고 있다. 이어서, 이들 기준선을 각각의 시점에서 측정된 실제 실제 IRI 농도에서 감하여 기준선-조정된 IRI 농도를 결정하였다.
각각의 처리에 대한 평균 혈청 IRI 농도-시간 프로파일 (나타낸 바와 같이, Y축 상의 IRI 농도 대 X축 상의 시간의 그래프로 플롯팅)은 여러 주기에 걸쳐 유사하였다. 모든 투여 주기에서, 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 약동학은 rHuPH20 제제로 피하 공동-투여되었을 때 가속되었다. 처치 사이에 관찰되는 임의의 차이는 처치 주기 사이에 실질적으로 동일하였고, 이는 관찰된 차이가 처치 때문이고, 대략 5 주의 시험 동안 주기 전반에 걸쳐 안정함을 나타낸다.
혈청 IRI 농도-시간 프로파일
Time
(분)
 평균 IRI 농도 (pM) 및 표준 편차 (SD)
휴마로그® 인슐린 리스프로 휴마로그® 인슐린 리스프로/ rHuPH20 휴뮤린® R 인슐린 휴뮤린® R 인슐린/rHuPH20
평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
0 (사전-채혈 기준선) 37.0 52.3 45.0 37.5 20.9 27.3 19.2 23.8
기준선-조정된 IRI 농도s
0 0 0 0 0 0 0 0
3 8.1 25.2 65.5 79.3 0.7 3.0 113.0 109.7
6 20.6 46.1 110.3 84.6 2.9 7.1 161.6 119.4
9 21.5 40.9 166.0 122.5 3.7 10.9 168.1 136.2
12 40.6 71.6 143.0 99.0 7.3 20.7 166.0 118.0
15 52.3 78.4 262.2 215.5 11.2 32.8 155.6 114.8
20 80.4 125.6 265.3 169.2 22.6 33.7 210.8 172.4
25 93.6 92.5 263.3 190.0 40.7 48.2 253.0 171.9
30 119.7 116.7 335.2 220.4 61.3 55.1 224.1 146.5
45 193.9 139.7 296.1 183.3 105.6 103.8 253.1 188.1
60 164.0 106.8 206.5 150.3 107.0 91.4 172.4 115.3
90 115.2 76.4 101.8 74.4 100.4 95.4 137.0 110.0
120 95.7 68.9 72.3 63.6 105.5 57.6 93.9 63.4
180 24.6 23.6 38.5 45.4 105.5 81.7 50.5 49.7
240 15.2 21.7 65.8 106.5 81.8 126.3 33.8 50.9
C. 인슐린 약동학
기준선 인슐린 농도를 감한 후의 인슐린 농도-시간 프로파일 (상기 표 37)을 사용하여 하기 PK 매개변수를 계산하였다: tmax, Cmax, 초기 t50％, 후기 t50％, 및 AUC간격 포함. PK 매개변수를 윈논린 프로페셔널 버젼 5.2 (파사이트 코포레이션(Pharsight Corp.), Mountain View, CA)의 모델 200을 사용하여 비-구획 분석에 의해 유도하였다. 통계학적 계산을 SAS 버젼 9.1.3 (SAS 인스티튜트, Cary, NC)을 사용하여 수행하였다. 모든 분석은 처치에 고정된 효과를 갖는 혼합 모델을 사용하여 수행하였다. 각각의 동물에 대한 반복된 관찰 사이의 화합물 대칭 공분산 행렬을 추정하였다. Cmax 및 모든 AUC 종말점에 대한 분석은 로그 전환 전에 1이 0의 값을 갖는 (로그 스케일 상 0) 로그-전환 값을 사용하여 수행하였다. 시간 기재의 종말점은 원래 선형 스케일 상에서 분석하였다.
단독으로 (대조군) 또는 rHuPH20과 함께 전달된, 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 휴뮤린® R 인슐린의 피하 투여 후의 인슐린의 약동학에 대한 요약이 표 38에 제공된다. 단독으로 또는 rHuPH20과 함께 전달된 각각의 인슐린에 대한 다양한 PK 매개변수는 평균 ± SD로 나타낸다. 각각의 매개변수에 대한 제어율(％) ([인슐린 + rHuPH20에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]/[인슐린 단독에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]×100로 계산된 제어율(％))가 또한 표에 제공된다. 제어율(％) 계산은 Cmax 및 AUC 매개변수에 대해 로그 전환된 데이타에 대한 기하 평균 및 p-값에 기초하고, 또한 tmax 및 초기 ＆ 후기 t50％에 대한 산술 평균 및 전환되지 않은 값에 기초하였다. 달리 언급되지 않는 한, 돼지는 N = 16이다.
표 39는 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독 대 휴뮤린® R 인슐린 + rHuPH20의 PK 매개변수의 비교 결과를 나열하고 있다. PK 값은 평균 ± SD로 제공된다. 또한, ％ 휴마로그® 인슐린 리스프로 (즉, [휴마로그® 인슐린 리스프로 + rHuPH20에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]/[휴마로그® 인슐린 리스프로 단독에 대한 평균 (기하 또는 산술) PK 값]×100)가 제공된다. 제어율(％) 계산은 Cmax 및 AUC 매개변수에 대해 로그 전환된 데이타에 대한 기하 평균 및 p-값에 기초하거나, 또는 tmax 및 초기 ＆ 후기 t50％에 대한 산술 평균 및 전환되지 않은 값에 기초하였다. 달리 언급되지 않는 한, N은 16이다.
rHuPH20 과 함께 또는 없이 피하 투여한 후의 인슐린 PK 매개변수
휴마로그® 인슐린 리스프로 휴뮤린® R 인슐린
단독 + rHuPH20 ％ 대조군 P-값 단독 + rHuPH20 ％ 대조군 P-값
Cmax (pmol/L) 250 ± 140 417 ± 229 163 0.0251 214 ± 122 360 ± 180 165 0.0218
초기 t50％
(분)		 36 ± 20 a 11 ± 6a 32 0.0182 61 ± 49 10 ± 8a 17 <0.0001
tmax (분) 58 ± 26 39 ± 39 67 0.1963 94 ± 61 38 ± 41 40 0.0004
후기 t50％
(분)		 110 ± 42 a 52 ± 24a 47 0.0002 170 ± 49 b 70 ± 41 a 42 <0.0001
AUC 간격 (분 x nmol/L)
0-15 분 0.35 ± 0.64 1.77 ± 1.24 1961 0.0004 0.06 ± 0.17 2.06 ± 1.28 43542 <0.0001
0-30 분 1.65 ± 2.07 5.84 ± 3.59 763 0.0198 0.56 ± 0.73 5.33 ± 3.30 1429 0.0027
0-1 시간 6.7 ± 4.8 14.2 ± 8.6 214 0.2776 3.4 ± 2.5 12.1 ± 7.3 246 0.2003
0-last 18.0 ± 8.8 26.6 ± 4.6 146 0.1195 21.3 ± 12.1 26.9 ± 6.0 116 0.5312
0-inf 24.3 ± 8.6 c 32.2 ± 17.1a 117 0.5176 45.0 ± 41.2c 32.6 ± 16.7a 88 0.6118
1-4 시간 12.2 ± 6.8 12.9 ± 7.8 106 0.8410 18.2 ± 10.3 15.0 ± 10.1 72 0.2259
2-4 시간 4.9 ± 3.2 6.0 ± 4.9 215 0.3763 12.0 ± 7.8 6.8 ± 5.4 32 0.1930
a N = 15
b N = 4
c N = 13
휴마로그 ® 인슐린 리스프로 단독 또는 휴뮤린 ® R 인슐린 + rHuPH20 의 피하 투여 후의 인슐린 PK 매개변수
휴마로그® 인슐린 리스프로 휴말린® R 인슐린 + rHuPH20 ％ 휴마로그® 인슐린 리스프로 P-값
Cmax (pmol/L) 250±140 360±180 143 0.0944
초기 t50％
(분)		 36±20a 10±8a29 0.0141
tmax (분) 58±26 38±41 64 0.1631
후기 t50％
(분)		 110±42a 70±41a 64 0.0092
AUC 간격 (분xnmol/L)
0-15 분 0.35±0.64 2.06±1.28 2698 <0.0001
0-30 분 1.65±2.07 5.33±3.32 744 0.0212
0-1 시간 6.7±4.8 12.1±7.3 189 0.3646
0-last 18.0±8.8 26.9±16.0 146 0.1196
0-inf 24.3±8.6b 32.6±16.6a 128 0.3179
1-4 시간 12.2±6.8 15.0±10.1 121 0.4801
2-4 시간 4.9±3.2 6.9±5.4 290 0.2203
a N = 15
b N = 13
D. 요약
돼지에서 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로와 rHuPH20의 공동-투여는 대조군 주사 (즉, 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독)에 비해 특정 PK 매개변수를 유의하게 변경시켰다. 특히, 최대 노출 (Cmax)은 rHuPH20과 함께 투여하였을 때 각각의 대조군에 비해 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 163％ (p = 0.0251) 및 휴뮤린® R 인슐린의 경우 165％ (p = 0.0218) 증가하였다. 작용 개시 (초기 t50％)는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 36분에서 11분으로 (p = 0.0182) 및 휴뮤린® R 인슐린의 경우 61분에서 10분으로 (p <0.0001) 빨라졌다. 최대 효과시간 (tmax)는 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 58분에서 39분으로 (p = 0.1963) 및 휴뮤린® R 인슐린의 경우 94분에서 38분으로 (p = 0.0004) 빨라졌다. 후기 t50％은 휴마로그® 인슐린 리스프로의 경우 110분에서 52분으로 (p = 0.0002) 및 휴뮤린® R 인슐린의 경우 170분에서 70분으로 (p <0.0001) 빨라졌다. 총 노출 (AUCinf)은 휴마로그® 인슐린 리스프로 (117 제어율(％); p = 0.5176) 또는 휴뮤린® R 인슐린 (88 제어율(％); p = 0.6118) 어느 것도 의미있게 변경되지 않았다. 누적 노출은 휴마로그® 인슐린 리스프로 (AUC0-30 휴마로그® 인슐린 리스프로를 단독으로 투여했을 때에 비해 763％ 증가; p = 0.0198) 및 휴뮤린® R 인슐린 (AUC0-30 휴뮤린® R 인슐린을 단독으로 투여하였을 때에 비해 1429％ 증가; p = 0.0027) 둘 모두의 경우 보다 빠른 시간 창으로 이동하였다. 휴뮤린® R 인슐린과 rHuPH20 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로와 rHuPH20의 공동-투여는 휴뮤린® R 인슐린 또는 휴마로그® 인슐린 리스프로 단독에 비해 최대 혈청 IRI 농도까지의 시간 (tmax, 초기 t50％, 후기 t50％)이 감소하고 피크 노출 농도 (Cmax)가 증가함으로써 입증되는 바와 같이 혈관 구획에서의 인슐린의 흡수 속도를 (각각의 인슐린을 단독으로 전달하였을 때에 비해) 증가시켰다. 또한, 초기 누적 노출 (AUC0-30)은 rHuPH20과 공동-투여된 경우 단독으로 투여되었을 때에 비해 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린 둘 모두에서 증가하였다.
히알루로니다제와 공동-투여되는 휴마로그® 인슐린 리스프로 및 휴뮤린® R 인슐린의 투여시 피크 노출의 증가 및 노출의 가속화가 동물, 서열, 또는 주기에 의미있는 영향을 미치지 않으면서 광범위하게 관찰되었고, 이전의 인간 연구를 근접하게 반영하였다 (실시예 1 참조). 따라서, 돼지는 식후 인슐린 제제의 흡수에 대한 히알루로니다제의 효과를 연구하는데 적합한 모델이다.
실시예 12
rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 피하 투여된 2 가지 투여량에서의 레귤러
인슐린의 약동학
2 가지 상이한 농도로 단독으로 및 rHuPH20과의 공동-투여로 피하 투여된 경우 모두의 레귤러 인슐린의 약동학 (PK)을 상기 실시예 10에 기재된 돼지 모델에서 평가하였다. 다중 투여 4-원 교차 설계 연구를 수행하여 20 및 100 U/mL의 농도에서 단독으로 투여되었을 때의 레귤러 인슐린의 PK을 rHuPH20과 공동 투여된 후에 2 가지 동일한 농도와 비교하였다. 각각의 경우에, 총 0.2 U/kg의 인슐린이 투여되었다.
A. 투여 및 샘플링
투여를 위해 4개의 시험 물품을 제조하였다. 2개의 시험 물품은 각각 20 U/mL 및 100 U/mL 레귤러 인슐린 (휴뮤린® R 인슐린; 일라이 릴리)을 함유하였다 (각각 인슐린 U20 및 인슐린 U100으로 지칭됨). 나머지 2개의 시험 물품은 20 ㎍/mL (대략 2400 U/mL) rHuPH20과 함께 각각 20 U/mL 및 100 U/mL 레귤러 인슐린 (디오신쓰 바이오테크놀로지스(Diosynth Biotechnologies) (쉐링-플로우(Schering-Plough) 지사)을 함유하였다 (각각 인슐린-PH20 U20 및 인슐린-PH20 U100으로 지칭됨). 인슐린 U20 시험 물품은 휴뮤린® R 인슐린 (100 U/mL; Lot A390566A; 일라이 릴리)을 멸균 희석제 (일라이 릴리)로 1:5 희석하여 제조하였다. 인슐린 U100 시험 물품은 희석되지 않은 휴뮤린® R 인슐린 (100 U/mL; Lot A509721; 일라이 릴리)이다. 인슐린-PH20 U20 시험 물품은 25 mM Tris, 120 mM NaCl, 0.01％ 폴리소르베이트 80 (pH 7.3) 중에 0.74 mg/mL (20 U/mL) 레귤러 인슐린 (Lot # SIHR107; 디오신쓰 바이오테크놀로지스) 및 20 ㎍/mL (대략 2400 U/mL) rHuPH20을 함유하였다. 인슐린-PH20 U100 시험 물품은 25 mM Tris, 120 mM NaCl, 0.01％ 폴리소르베이트 80 (pH 7.3) 중에 3.69 mg/mL (100 U/mL) 레귤러 인슐린 (Lot # SIHR107; 디오신쓰 바이오테크놀로지스) 및 20 ㎍/mL (대략 2400 U/mL) rHuPH20을 함유하였다.
6 마리의 성숙한 수컷 유카탄 미니 피그 (S＆S 팜스, Ramona, CA) (연구 시작시 각각의 체중이 21 내지 25 kg임)는 연구 기간 동안 혈액 샘플을 연속적으로 채취할 수 있도록 경정맥 또는 경동맥에 수술에 의해 이식된 카테터를 갖는다. 동물을 표 40에 나타낸 바와 같이 무작위적으로 2 개의 연구군으로 나누었다 (각각 3 마리 동물/군 함유). 군 배정은 1 및 2 주기 동안 유지하였다. 각각의 동물에게 모든 4개의 시험 물품으로 2 주기의 처치를 시행하여 일련의 투여 주기 동안 인슐린 약동학의 재현가능성의 비교를 용이하게 하였다.
시험 물품을 몸체의 중선 뒤로 각각의 돼지의 왼쪽 옆구리에 피하 (SC) 투여하였다. 각각의 동물에게 격일 프로토콜로 0.2 U/kg의 지시된 인슐린을 단일 SC 볼루스 투여하였다. 인슐린 U20 및 인슐린-PH20 U20 시험 물품의 경우, 10.0 ㎕/kg을 투여하였다. 인슐린 U100 및 인슐린-PH20 U100 시험 물품의 경우, 2.0 ㎕/kg을 투여하였다. 혈액 샘플 (0.7-1.0 mL 체적)을 투여 전에 수집하고 (사전-채혈), 이어서 투여후 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 및 240 분에 수집하였다. 혈액 샘플을 항응고제를 함유하지 않는 혈청 튜브에 넣고, 최소 30분 동안 얼음 상에 올려놓고, 이어서 주변 온도에서 5분 동안 9500×g에서 원심분리하였다. 이어서, 혈청을 미리 표지된 튜브로 옮기고, 냉동시키고, 샘플이 면역반응성 인슐린 (IRI)의 수준을 결정하기 위해 밀리포어 바이오파마 서비시즈(BioPharma Services) (St. Charles, MO)로 배송될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
투여 프로토콜
주기 투여 일 1 군 2 군
1 1 0 인슐린-PH20 U100 인슐린 U20
2 2 인슐린-PH20 U20 인슐린 U100
3 4 인슐린 U100 인슐린-PH20 U20
4 6 인슐린 U20 인슐린-PH20 U100
2 5 8 인슐린-PH20 U20 인슐린 U100
6 10 인슐린 U20 인슐린-PH20 U100
7 12 인슐린-PH20 U100 인슐린 U20
8 14 인슐린 U100 인슐린-PH20 U20
B. 혈청 인슐린 수준
각각의 혈청 샘플에 대한 혈청 IRI 농도를 StatLIA® 검정 분석 소프트웨어 (브렌단 테크놀로지스, Carlsbad, CA)를 사용하여 표준 곡선으로부터 보간법에 의해 결정하였다. 표 41은 인슐린 U20, 인슐린 U100, 인슐린-PH20 U20 및 인슐린-PH20 U100을 투여한 후의 평균 혈청 IRI 농도를 제공한다. 표 41은 사전-채혈 샘플에서 측정된 기준선 IRI 수준을 나열하고 있다. 이어서, 이들 기준선을 각각의 시점에서 측정된 실제 IRI 농도로부터 감하여 기준선-조정된 IRI 농도를 결정하였다.
각각의 투여 주기 이후의 인슐린 농도-시간 프로파일을 각각의 처치군에 대해 비교하였다. 각각의 시험 물품에 대한 평균 혈청 IRI 농도-시간 프로파일은 Y축 상의 IRI 농도 대 X축 상의 시간의 그래프로 플롯팅하였을 때 관찰되는 바와 같이 두 주기 동안 유사하였다. 두 투여 주기에서, 인슐린의 PK는 rHuPH20 제제와 피하로 공동-투여되었을 때 둘 모두의 농도에서 빨라졌다. 추가의 통계학적 모델 (1 및 2 주기로부터의 데이타에 대한 순서 내에서 처치, 순서, 주기, 처치-대-주기 상호작용, 및 동물에 대해 고정된 효과 포함)을 1차 및 2차 PK 매개변수 (1차 PK 매개변수는 시간의 할당된 창에 대한 곡선하면적 (AUC), Cmax, tmax, 초기 t50％, 및 후기 t50％를 포함하고; 2차 PK 매개변수는 AUC에 대해 보다 자세한 시간 창, MRT (마지막 및 무한대), 람다 z, HL 람다 z, 제거율, 및 분포 체적을 포함한다)에 대해 구축하였으며, 순서, 주기 또는 동물의 체계적인 효과가 없을 뿐만 아니라 임의의 이들 변수에 대해 주기와 처치 사이의 상호작용이 없는 것으로 나타났다.
혈청 IRI 농도-시간 프로파일
시간 (분)
 평균 IRI 농도 (pM) 및 표준 편차(SD)
인슐린 U20 인슐린 U100 인슐린-PH20 U20 인슐린-PH20 U100
평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
0 (사전-채혈 기준선)
 91.6 53.0 89.0 49.6 114.3 55.8 71.8 48.4
기준선-조정된IRI 농도
0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
3 139.7 472.2 63.1 73.4 2.2 5.6 49.4 41.3
6 74.2 234.6 178.7 269.3 8.1 17.6 88.8 73.7
9 206.3 594.2 122.0 101.3 12.9 30.9 144.5 85.0
12 93.0 166.7 181.5 150.5 36.9 58.0 182.1 138.6
15 83.1 116.2 214.4 151.5 58.6 76.9 225.3 165.6
20 136.3 180.8 367.1 590.3 85.1 109.6 251.8 133.3
25 139.1 147.7 247.3 161.1 174.5 262.2 285.7 142.8
30 238.0 292.2 294.1 183.9 169.2 224.9 357.3 199.9
45 203.3 117.5 249.0 133.5 134.3 147.6 234.7 115.8
60 185.5 127.6 174.8 101.8 102.5 65.1 252.1 169.1
90 106.1 67.7 131.2 128.1 85.4 87.8 222.7 144.7
120 70.8 71.9 73.0 47.0 70.9 61.7 153.7 54.8
180 78.0 92.3 64.2 119.3 87.4 101.3 69.4 59.1
240 25.7 32.2 26.0 44.7 23.0 36.9 23.3 26.5
C. 인슐린 약동학
기준선 인슐린 농도를 감한 후의 인슐린 농도-시간 프로파일 (상기 표 41)을 사용하여 다음과 같은 PK 매개변수를 계산하였다: tmax, Cmax, 초기 t50％, 후기 t50％, 및 AUC간격 포함. 혈청 IRI 대 시간 데이타를 윈논린 프로페셔널 모델 200 (버젼 5.2, 파사이트 코포레이션, Mountain View, CA)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 모델링하고, PK 매개변수를 계산하였다. 통계학적 계산 및 군들 사이의 통계학적 비교를 SAS 버젼 9.1.3 (SAS 인스티튜트, Cary, NC)을 사용하여 수행하였다. 모든 분석은 처치에 대해 고정된 효과를 갖는 혼합 모델을 사용하여 수행하였다. 각각의 동물에 대한 반복된 관찰 사이의 화합물 대칭 공분산 행렬을 추정하였다. Cmax 및 모든 AUC 종말점에 대한 분석은 로그 전환 전에 1이 0의 값을 갖는 (로그 스케일 상 0) 로그-전환 값을 사용하여 수행하였다. 시간 기재의 종말점은 원래 선형 스케일 상에서 분석하였다.
인슐린 U20, 인슐린 U100, 인슐린-PH20 U20 및 인슐린-PH20 U100을 피하 투여한 후의 인슐린의 약동학의 요약이 표 42에 제공된다. 단독으로 또는 rHuPH20과 함께 전달된 각각의 인슐린에 대한 다양한 PK 매개변수는 평균 ± SD로 나타낸다. 각각의 매개변수에 대한 제어율(％) (제어율(％) = [인슐린 + rHuPH20에 대한 PK 값]/[인슐린 단독에 대한 PK 값]×100)가 또한 표에 제공된다. 제어율(％) 계산은 Cmax 및 AUC 매개변수에 대해 로그 전환된 데이타에 대한 기하 평균 및 p-값에 기초하고, 또한 tmax 및 초기 ＆ 후기 t50％에 대한 산술 평균 및 전환되지 않은 값에 기초하였다. 달리 언급되지 않는 한, 돼지는 N = 16이다.
rHuPH20 과 함께 또는 rHuPH20 없이 피하 투여된 후의 인슐린 PK 매개변수
인슐린 20 U/ml 인슐린 100 U/ml
인슐린 20U 인슐린-
rHuPH20 20U		 ％
대조군		 P-값 인슐린 100U 인슐린-
rHuPH20 100U		 ％
대조군		 P-값
Cmax (pmol/L) 429±508 462±567 106 0.8439 238 ±237 420±208 237 0.0095
초기 t50％
(분)		 23±14b 12±5 52 0.1622 35 ±38c 12±7 34 0.0063
tmax (분) 57±42 39±21 68 0.2462 64 ±49 47±29 74 0.2775
후기 t50％
(분)		 84±38b 77±45 92 0.7689 109 ±64c 112±53 103 0.9315
AUC 간격 (분 * nmol/L)
0-15 분 1.61±4.37 1.95±1.73 1920 0.0045 0.27 ±0.40 1.75±1.02 7104 <0.0001
0-30 분 .79±6.24 6.35±5.90 623 0.0567 2.14 ±2.83 5.89±2.89 2400 0.0015
0-1 시간 10.02±8.60 13.75±8.92 179 0.2073 6.19 ±6.78 13.98±6.0 489 0.0012
0-last 24.4±11.6 27.5±20.5 107 0.8777 18.5 ±16.0 34.7±14.6 354 0.0038
0-inf 30.1±10.3d 29.8±22.1 89 0.7027 27.8 ±19.1e 44.8±13.2c 214 0.0161
1-4 시간 14.6±9.6 14.2±12.2 97 0.9436 13.2 ±11.3 22.2±11.2 270 0.0204
2-4 시간 7.6±6.5 6.5±9.1 104 0.9720 8.1 ±8.2 9.5±5.4 398 0.1832
b N = 11 동물
c N = 10 동물
d N = 8 동물
e N = 9 동물
D. 요약
이 연구는 rHuPH20과 함께 및 rHuPH20 없이 상이한 농도에서의 동일한 총 인슐린 투여량을 피하 투여한 효과를 조사하였다.
rHuPH20과 공동-투여하지 않은 경우, 인슐린 농도는 100 U/mL에서 20 U/mL로 감소하였고, 이에 따라 초기 및 전체 기간 (보다 적은 정도로) 모두에서 인슐린 흡수가 보다 빨라지고, 피크 인슐린 농도가 증가하고, 누적 인슐린 노출이 보다 커졌다. 대조군 100 U/mL 주사에 비해, 농도를 20 U/mL로 감소시키면, 1) Cmax가 기하 평균 158 pmol/L에서 302 pmol/L로 91％ 증가하고; 2) 평균 초기 t50％가 35분에서 23 분으로, tmax가 64분에서 57 분으로, 후기 t50％가 109분에서 84분으로 감소하고; 및 3) 기하 평균 AUC0-15가 20에서 80으로 300％, AUC0-30이 222에서 791로 256％, AUClast가 9,021에서 20,820으로 131％ 증가하였다 (모든 단위는 pmol × 분/L임).
어느 하나의 농도에서의 레귤러 인슐린과 rHuPH20의 공동-투여는 또한 피하 주사 후에 인슐린 단독 투여에 비해 흡수를 보다 빠르게 하였다. 그러나, 20 U/mL의 보다 낮은 인슐린 농도에서, 단독으로 투여된 인슐린 상에서의 상대적인 증가는 인슐린이 단독으로 전달되었을 때 20 U/mL에서 이미 보다 빠르게 흡수된 것처럼 현저하지는 않았다 (앞서 기재된 바와 같이).
당뇨병 환자에게 보다 전형적으로 사용되는 100 U/mL 농도에서, rHuPH20과의 공동-주사는 100 U/mL 농도에서의 인슐린 단독 투여에 비해 1) Cmax를 기하 평균 158 pmol/L에서 375 pmol/L로 137％ (p=0.0095) 증가시키고; 2) 평균 초기 t50％를 35분에서 12분으로 (p=0.0063) 감소시킨 반면, tmax 및 후기 T50％는 유의하게 변하지 않았고; 및 3) 기하 평균 AUC0-15를 20에서 1438로 70-배 (p<0.0001), AUC0-30을 222에서 5337로 23-배 (p=0.0015), 및 AUClast를 9,021에서 31,905로 250％ (p=0.0038) 증가시켰다 (모든 단위는 pmol × 분/L임).
20 U/mL의 보다 낮은 인슐린 농도에서, rHuPH20과의 공동-투여는 인슐린 단독 투여에 비해 다음과 같은 인슐린 PK에 대한 효과를 나타내었다: 1) Cmax는 302 및 322 pmol/L (p=0.84)의 기하 평균으로 유의하게 변경되지 않았다; 2) 평균 초기 t50％는 23분에서 12분으로 (p=0.16) 낮아지는 경향이 있는 반면, tmax 및 후기 t50％는 유의하게 변하지 않았다; 3) 기하 평균 AUC0-15는 80에서 1533으로 18-배 (p=0.0045), AUC0-30은 791에서 4934로 5-배 (p=0.0567) 증가하고, AUClast는 20,820 및 22,184 (p=0.88)로 변하지 않았다 (모든 단위는 pmol × 분/L임).
rHuPH20 및 레귤러 인슐린 (100 U/mL)의 투여시 rHuPH20이 없는 대조군 인슐린 주사에 비해 증가된 피크 노출 및 가속화된 노출은 이전 인간 연구 (실시예 1) 돼지 연구 (실시예 10)를 근접하게 반영한다. 또한, 이러한 결과는 인슐린 동역학이 또한 보다 낮은 농도에서의 투여에 의해 가속화될 수 있음을 입증하고, 이는 농도 의존성인 속도-제한 인슐린 6량체 분리 단계와 일치한다 (즉, 인슐린이 단독으로 피하 투여되었을 때, 이는 인슐린이 6량체로부터 단량체로 분리될 때 (보다 낮은 농도의 인슐린에서 일어나는 과정임) 흡수된다). rHuPH20과 공동-투여된 경우, 이 인슐린 농도에 대한 의존성은 크게 감소하거나 또는 심지어 없어진다. 따라서, 인슐린과 rHuPH20의 공동-투여의 효과를 분산시키는 히알루로니다제는 보다 높은 농도에서의 인슐린 주사에서 관찰되는 인슐린 약동학의 원치않는 속도 저하를 감소시킬 수 있다.
실시예 13
메틸파라벤의 존재하에 rHuPH20 에 대한 염 농도의 효과
가속 온도 (40℃)에서 보존제인 메틸파라벤을 포함하는 및 메틸파라벤을 포함하지 않는 rHuPH20의 안정성에 대한 NaCl의 효과를 평가하였다. rHuPH20 (히스티딘/HCl (pH 6.5) 중 10 mg/ml, 130 mM NaCl)을 메틸파라벤 (Fluka)과 함께 또는 메틸파라벤 없이 6 가지 상이한 농도의 NaCl과 배합하여 12개의 상이한 제제를 제조하였다. 각각의 제제는 10 ㎍/mL rHuPH20, 25 mM Tris (pH 7.3), 0.01％ Tween 80 및 0, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM 또는 250 mM NaCl을 0.2％ 메틸파라벤과 함께 또는 0.2％ 메틸파라벤 없이 함유하였다. 용액을 고무 마개가 있는 2 ml I형 유리 바이알에 분취하고, 연구 동안 알루미나 캡으로 밀폐시켰다. 바이알 한 세트는 4일 동안 40℃에서 보관하고, 다른 세트는 2-8℃의 냉각기에서 유지시켜 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 샘플을 히알루로니다제 (효소) 활성에 대해 시험하였다. 축적 수준을 평가하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 G2000 SWXL 컬럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 사용하여 1× PBS (러닝 완충제로서) 및 1 ml/분으로 설정된 유속의 조건하에 수행하였다.
표 43은 히알루로니다제 (효소) 활성, ％ 주요 피크 (즉, 주요 피크에 함유된 rHuPH20의 백분율) 및 ％ 축적 피크 (즉, 축적의 결과로 피크에 함유된 rHuPH20의 백분율)을 비롯한 연구 결과를 나열하고 있다. rHuPH20의 안정성은 NaCl의 농도에 민감한 것으로 관찰되었다. 일반적으로, 제제를 40℃에서 인큐베이션하였을 때, NaCl 농도가 감소할수록 rHuPH20의 효소 활성이 감소하였다. 그러나, 2-8℃의 냉각기에서 보관하였을 때, rHuPH20은 제제에 상관없이 효소 활성을 유지하였다. 승온에서, 용액으로부터 NaCl이 완전하게 제거되었을 때, 메틸파라벤의 유무에 관계없이 rHuPH20의 전체 활성이 손실되었다. NaCl 농도가 증가할수록 효소 활성의 손실이 감소하였다. 메틸파라벤을 첨가한 샘플과 메틸파라벤을 첨가하지 않은 샘플 사이에 효소 활성에 유의한 차이가 있었다 (페어링 t-검정, P=0.0228).
NaCl 농도 및 rHuPH20의 축적 수준의 유사한 상관관계가 관찰되었다. 샘플을 승온에서 보관하였을 때 축적 수준은 NaCl 농도가 감소함에 따라 증가하였다. 2-8℃에서 보관하였을 때 메틸파라벤을 첨가하거나 첨가하지 않은 경우 본질적으로 변화가 없었다. 메틸파라벤을 함유하는 -40℃에서 보관된 제제에서 메틸파라벤을 함유하지 않는 제제보다 유의하게 더 많이 축적되었다 (페어링 t-검정, P=0.0058).
따라서, SEC에 의해 평가된 바와 같이 rHuPH20의 효소 활성 및 단량체 백분율은 둘 모두 메틸파라벤을 함유하지 않는 제제에 비해 메틸파라벤을 함유하는 제제에서 유의하게 감소하였다. 또한, 시험된 NaCl 농도 범위 (0-250 mM)에서, NaCl 농도 및 증가된 rHuPH20 안정성 사이에는 직접적인 관련이 있었다.
40℃ 및 4℃에서 4일 보관된 샘플의 효소 활성 및 SEC 결과
제제 효소 활성 (U/mL) ％ 주요 피크 ％ 축적 피크
4℃ 40℃ 4℃ 40℃ 4℃ 40℃
NaCl 없음, 0.2％ MP 12410 <LOD 99.65 0 0.35 100
50mM NaCl, 0.2％ MP 12470 2990 99.22 2.86 0.78 97.14
100mM NaCl, 0.2％ MP 12380 3530 100 13.32 0 86.68
150mM NaCl, 0.2％ MP 13510 6200 100 26.31 0 73.69
200mM NaCl, 0.2％ MP 11250 6220 99.49 51.84 0.51 48.16
250mM NaCl, 0.2％ MP 10740 7340 100 65.55 0 34.45
NaCl 없음, MP 없음 10430 <LOD 99.4 0 0.6 100
50mM NaCl, MP 없음 12370 3070 99.34 22.05 0.66 77.95
100mM NaCl, MP 없음 12580 9930 99.47 72.81 0.53 27.19
150mM NaCl, MP 없음 12750 11180 99.48 88.16 0.52 11.84
200mM NaCl, MP 없음 13660 13340 99.64 96.22 0.36 3.78
250mM NaCl, MP 없음 11370 11090 100 98.05 0 1.95
LOD = 검출 한계
실시예 14
인슐린 및 rHuPH20 의 공동-제제
다양한 조건, 예컨대 다양한 온도 및 pH, 및 제제 하에서 rHuPH20 및 인슐린의 안정성을 평가하기 위해 일련의 연구를 수행하였다.
1. rHuPH20 에 대한 삼투압 농도 및 pH 의 효과
첫번째 연구에서, rHuPH20 (하일레넥스 재조합 제제로 제제화됨 (히알루로니다제 인간 주사)) 안정성에 대한 삼투압 농도 및 pH의 효과를, 여러 염 농도 및 pH 값에서 제제를 제조하고, 냉각 (5℃), 가속 (25℃), 및 스트레스 (25℃, 35℃ 및 40℃) 조건하에 3 개월까지 보관한 후에 활성 손실을 평가함으로써 평가하였다. 하일레넥스 재조합 제제 (히알루로니다제 인간 주사)는 150 U/mL rHuPH20, 144 mM NaCl, 10 mM 이염기성 나트륨 포스페이트, 1 mg/mL 인간 알부민 인간, 2.7 mM 에데테이트 이나트륨, 2.7 mM CaCl을 함유하고, 삼투압 농도 범위는 290 내지 350 mOsm이고, pH는 7.4이다. 이 제제를 조정하여 표 44에 나열된 8 가지 제제 (및 대조군 하일레넥스)를 제조하였다. 효소 활성 (즉, 히알루로니다제 활성)을 앞서 기재된 바와 같이 결정하였다. 또한, rHuPH20 함량을 RP-HPLC에 의해 결정하였다.
pH 및 삼투압 농도 규격 한계에서 제조된 4 가지 용액 또는 권장 보관 조건에서의 대조군 용액의 경우 권장 (5℃) 또는 가속 (25℃ 또는 30℃) 보관 조건에서 의미있는 변화가 관찰되지 않았다. 효소 활성의 손실 및 rHuPH20 함량의 손실을 측정한 바, rHuPH20은 pH 7.4에서 안정하고, 일반적으로 염기성 조건 보다는 산성 조건하에서 보다 안정한 것으로 관찰되었다. 이온 농도의 효과는 보다 온화하였다. 승온에서, 보다 높은 이온 농도를 함유하는 제제는 보다 낮은 이온 농도를 갖는 제제보다 약간 더 안정한 것으로 나타났다. 35℃와 40℃ 사이에서 안정성이 상당히 감소하였다.
rHuPH20 제제화
제제화 (조정가능) NaCl ％하일레넥스
 삼투압 농도 (mOsm/kg)
 pH
mM mg/mL
+ 21％ 체적 H20 120 7.0 83 267 7.5
+ 10％ 체적 H20 132 7.7 91 290 7.5
+ 19 mM NaCl 164 9.6 100 350 7.4
+ 91 mM NaCl 236 13.8 98 450 7.3
대조군 145 8.5 100 325 7.4
+ 5 mM HCl 150 8.8 100 328 6.5
+ 8 mM HCl 153 8.9 99 331 5.5
+ 1.9 mM NaOH 145 8.5 100 324 8.6
+ 2.2 mM NaOH 145 8.5 100 323 9.5
2. rHuPH20 에 대한 pH 의 효과
rHuPH20의 안정성에 대한 여러 pH의 완충제 시스템의 효과를 평가하였다. rHuPH20 (1,200,000 U/mL, 10 mg/mL)을 130 mM NaCl, 10 mM 히스티딘 중에서 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0의 pH에서 제제화하였다. 이어서, 제제를 0, 3, 6, 9 및 12 개월 동안 5℃에서; 0, 3, 6, 9 및 12 개월 동안 60％ 상대 습도 및 25℃에서, 및 0, 1, 2, 3 및 6 개월 동안 35℃에서 보관하였다. 모든 냉각 온도에서, 모든 제제는 모든 시간 기간에 걸쳐 안정하였다. rHuPH20은 pH 6.0, 6.5, 및 7.0에서 시험 물품에 대해 5℃에서 12 개월, 25℃에서 6 개월, 및 35℃에서 3 개월 동안 추세 제한 이내에서 유지되었다. pH 5.0 및 5.5에서 제조된 제제는 승온에 대해 보다 민감하여, 효소 활성이 상당히 감소하였다.
3. 인슐린 유사체와 제제화된 rHuPH20 에 대한 pH 및 보존제의 효과
냉각 (5℃), 가속 (30℃ 및 35℃) 및 교반 (25℃) 보관 조건에서 4주 이하 동안 인슐린 유사체와 제제화된 rHuPH20 안정성에 대한 pH 및 보존제의 영향을 평가하기 위해, rHuPH20을 휴마로그® 인슐린 리스프로 또는 노보로그® 인슐린 아스파르트와 조합하고, 효소 활성 및 안정성을 평가하였다. 인슐린 안정성은 RP-HPLC에 의해 평가하였다. 10 ㎍/mL rHuPH20, 100 U/mL 인슐린 유사체, 140 mM NaCl, 20 mM Tris HCl (0.2％ 페놀; 0.2％ m-크레졸; 0.2％ 파라벤; 0.2％ 페놀 및 0.1％ F68; 또는 0.2％ 페놀 포함) 및 1 mM 벤조에이트를 사용하여 시험 물품을 제조하였다. 이들 제제를 각각 pH 7, 7.25 및 7.5에서 제조하고, 총 30개의 시험 물품 (15 휴마로그® 인슐린 리스프로/rHuPH20 및 15 노보로그® 인슐린 아스파르트/rHuPH20 시험 물품)이 제조되었다. 이어서, 시험 물품을 4주 동안 교반하면서 5℃, 30℃, 35℃ 및 25℃에서 보관하였다. rHuPH20 효소 활성을 모든 조건하에서 평가하였다. 교반하면서 5℃ 및 25℃에서 보관된 시험 물품에 대한 인슐린 용해도를 RP-HPLC에 의해 평가하였다.
5℃에서 4주 후에 rHuPH20 활성이 보존제 또는 pH에 의해 영향을 받지 않는 것이 관찰되었다. 교반 스트레스 조건 (20℃) 하에서, rHuPH20의 활성은 노보로그® 인슐린 아스파르트 및 임의의 보존제와 공동-제제화되었을 때 임의의 시험된 pH에서 영향을 받지 않았다. 반면, 휴마로그® 인슐린 리스프로를 포함하는 몇몇 제제에서는, 예컨대 0.02％ 페놀, m-크레졸 또는 페놀/벤조에이트와 제제화되었을 때, 6시간 후에 rHuPH20의 활성이 75％까지, 가장 전형적으로 pH가 증가함에 따라 감소하였다. 이러한 활성의 손실은 휴마로그® 인슐린 리스프로의 침전과 관련된다.
표 45는 30℃ 및 35℃에서 인큐베이션한 후에 각각의 시험 물품에서 유지된 rHuPH20 활성을 나열하고 있다. 30℃에서 rHuPH20 활성이 원래 활성의 평균 약 85％로 약간 손실된 것이 관찰되었다. 35℃에서, 특히 예를 들어 0.2％ m-크레졸 또는 0.2％ 파라벤을 함유하는 시험 물품에서 pH가 증가할수록 보다 큰 손실이 관찰되었다.
노보로그® 인슐린 아스파르트는 모든 보관 조건하에 모든 제제에서 안정하고 가용성으로 남아있었다. 5℃에서 4주 후에 pH 7.5에서의 휴마로그® 인슐린 리스프로의 용해도는 유지되었으나, 이 온도에서 보다 낮은 pH (7.0 및 7.25)에서는 휴마로그® 인슐린 리스프로가 침전되었다. 또한 6시간 후에 교반 스트레스 조건하에서 침전이 관찰되었다.
인슐린 유사체/ rHuPH20 제제에, 30℃ 및 35℃에서 4 주 후에 남아있는 rHuPH20 활성
제제 pH 남아있는 rHuPH20 활성 (％)
30℃ 35℃
휴마로그® 인슐린 리스프로 노보로그® 인슐린 아스파르트 휴마로그® 인슐린 리스프로 노보로그® 인슐린 아스파르트
페놀 7.0 92 92 77 74
7.25 89 92 71 69
7.5 91 92 69 60
m-크레졸 7.0 82 78 40 29
7.25 85 81 29 21
7.5 77 71 11 9
파라벤 7.0 90 89 29 34
7.25 90 89 20 22
7.5 81 79 8 10
페놀/F68 7.0 93 94 81 68
7.25 91 92 75 61
7.5 90 73 63 13
페놀/벤조에이트 7.0 90 88 73 67
7.25 91 87 71 63
7.5 88 86 64 58
변형은 당업자에게 명백하기 때문에 본 발명은 청구범위만으로 한정되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. <120> Super Fast-Acting Insulin Compositions <130> P10-093-INP-KNL <150> US 61/125,835 <151> 2008-04-28 <150> US 61/127,044 <151> 2008-05-09 <160> 273 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn 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Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 450 455 460 Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 465 470 <210> 3 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor soluble rHuPH20 <400> 3 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys 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<212> PRT <213> Apis mellifera <220> <223> hyaluronidase <400> 14 Met Ser Arg Pro Leu Val Ile Thr Glu Gly Met Met Ile Gly Val Leu 1 5 10 15 Leu Met Leu Ala Pro Ile Asn Ala Leu Leu Leu Gly Phe Val Gln Ser 20 25 30 Thr Pro Asp Asn Asn Lys Thr Val Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn 35 40 45 Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val 50 55 60 Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Leu Gln Asn Trp Met Asp Lys Phe Arg Gly 65 70 75 80 Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu 85 90 95 Lys Asp Pro Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln 100 105 110 Leu Gly Asn Leu Thr Lys His Leu Gln Val Phe Arg Asp His Leu Ile 115 120 125 Asn Gln Ile Pro Asp Lys Ser Phe Pro Gly Val Gly Val Ile Asp Phe 130 135 140 Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Ala Ser Leu Gln Pro 145 150 155 160 Tyr Lys Lys Leu Ser Val Glu Val Val Arg Arg Glu His Pro Phe Trp 165 170 175 Asp Asp Gln Arg Val Glu Gln Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr 180 185 190 Gly Gln Leu Phe Met Glu Glu Thr 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gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446 <210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 variant P48A <400> 50 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 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tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta 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vadensis ATCC BAA-548 <220> <223> chondroitin AC lyase <400> 100 Met His Arg Lys Ile Val Phe Pro Leu Phe Val Leu Leu Phe Thr Ala 1 5 10 15 Phe Ala Ala Phe Ala Ala Ser Gln Pro Gln Trp Lys Trp Arg Gln Ser 20 25 30 Lys Tyr Cys Arg Ile Thr Glu His Ala Gly Lys Lys Leu Leu Thr Val 35 40 45 Ala Ile Pro Ala Asp Ala Pro Glu Ile Ser Arg Arg Asn Thr Ala Asp 50 55 60 Thr Pro Val Gly Leu Thr Cys Phe Glu Gly Gln Pro Ile Glu Phe Ser 65 70 75 80 Ile Arg Leu Arg Asn Ser Gly Ile Ser Arg Pro Asp Asn Leu His Asn 85 90 95 Gly Ile Lys Phe Gln Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Asn Gly Thr Glu Arg 100 105 110 Trp Thr Gln Ala Glu Ile Pro His Glu Pro Phe Pro Trp Arg Arg Phe 115 120 125 Arg Phe Ser Glu Arg Ile Pro Ala Asp Ala Thr Ser Gly Thr Leu Arg 130 135 140 Leu Gly Leu Gln Gly Ser Ser Gly Asn Val Glu Phe Asp Leu Asp Ser 145 150 155 160 Leu Gln Ile Arg Pro Leu Asp Pro Glu Leu Ser Pro Val Pro Pro Thr 165 170 175 Pro Glu Gln Ile Arg Glu Cys Glu Leu Ile Glu Ser Arg Leu Arg Ala 180 185 190 Gly Leu Pro Ala Gln Gln Pro Pro 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113 Met Ala Leu Trp Met His Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Glu Pro Ala Pro Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Ala Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Ser Ile Thr Gly Ser Leu Pro Pro Leu 65 70 75 80 Glu Gly Pro Met Gln Lys Arg Gly Val Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gln Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 114 <211> 110 <212> PRT <213> Apodemus semotus <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 114 Met Ala Leu Cys Val Arg Phe Leu Ser Leu Leu Ile Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Glu 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ala Pro Gly Thr Gly Asp Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 115 <211> 110 <212> PRT <213> Apodemus semotus <220> <223> Preproinsulin 2 <400> 115 Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Val Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 116 <211> 110 <212> PRT <213> Cricetulus longicaudatus <220> <223> Preproinsulin <400> 116 Met Thr Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Thr Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Asp Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Gln Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 117 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 117 Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 118 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> Preproinsulin 2 <400> 118 Met Ala Leu Trp Ile Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 119 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus losea <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 119 Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg 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123 Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Ala Glu Asn Pro Gln Ala Gly 50 55 60 Ala Val Glu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Gly Pro Pro Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 124 <211> 110 <212> PRT <213> Meriones unguiculatus <220> <223> Preproinsulin <400> 124 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Phe Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Thr Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Phe Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gln Met Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Ala Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Gly Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 125 <211> 110 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <220> <223> Preproinsulin <400> 125 Met Ala Ser Leu Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Cys Arg Leu Asp Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Glu Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Ala Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Gln Pro Ser 65 70 75 80 Ala Leu Glu Leu Ala Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 126 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 126 Met Ala Leu Leu Val His Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Thr Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 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Chinchilla brevicaudata <220> <223> Proinsulin <220> <221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 64 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 65 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 138 Phe Val Asn Lys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Asp Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Met Ala Xaa Xaa 20 25 30 Glu Leu Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Ala Asp Pro Gly Val Val Pro 35 40 45 Glu Ala Gly Arg Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Met Thr Leu Gln Xaa 50 55 60 Xaa Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Thr Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <223> Preproinsulin <400> 139 Met Ala Leu Trp Ile Arg Ser Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe 1 5 10 15 Ser Gly Pro Gly Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala 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Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Phe Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Val Lys Arg Asp Met Glu Gln Ala Leu Val Ser Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Leu Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105 <210> 142 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus laevis <220> <223> Preproinsulin 2 <400> 142 Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Ile Lys Arg Asp Ile Glu Gln Ala Gln Val Asn Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Phe Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 143 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus tropicalis <220> <223> Preproinsulin <400> 143 Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Ile Lys Arg Asp Ile Glu Gln Ala Met Val Asn Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Leu Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105 <210> 144 <211> 106 <212> PRT <213> Rana pipiens <220> <223> Preproinsulin <400> 144 Met Ala Leu Trp Ile Gln Cys Leu His Ile Ala Val Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Phe Thr Pro Thr Leu Lys Thr Phe Asp Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Met Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Ser Pro Arg Ser Arg Arg Asp Leu Glu Gln Pro Leu Val Asn Gly 50 55 60 Leu Gln Gly Ser Glu Leu Asp Glu Met Gln Val Gln Ser Gln Ala Phe 65 70 75 80 Gln Lys Arg Lys Pro Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Asn Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Tyr Asp Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 145 <211> 81 <212> PRT <213> Anas platyrhynchos <220> <223> Preproinsulin <220> <221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 59 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 60 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 145 Ala Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ser Pro Lys Thr Xaa Xaa 20 25 30 Asp Val Glu Gln Pro Leu Val Asn Gly Pro Leu His Gly Glu Val Gly 35 40 45 Glu Leu Pro Phe Gln His Glu Glu Tyr Gln Xaa Xaa Gly Ile Val Glu 50 55 60 Gln Cys Cys Glu Asn Pro Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 65 70 75 80 Asn <210> 146 <211> 51 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <223> Preproinsulin <400> 146 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Gly Ile 20 25 30 Val Glu Gln Cys Cys Ala Gly Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Asn 50 <210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Aspart insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 147 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 148 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Lispro insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 148 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glulisine insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 149 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30 <210> 150 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glargine insulin <220> <223> Insulin A chain analog <400> 150 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 151 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glargine insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 151 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 <210> 152 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Detemir insulin <220> <223> Proinsulin analog <220> <221> CHAIN <222> (33)...(53) <223> A Chain <220> <221> CHAIN <222> (1)...(29) <223> B chain <400> 152 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys 20 25 30 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 35 40 45 Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=Pro, Lys, Leu, Val or Ala <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=Lys or Pro <400> 153 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 <210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog (des 28-30) <400> 154 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 20 25 <210> 155 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog (des 27) <400> 155 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Lys Thr 20 25 <210> 156 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Thr or Ser <400> 156 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 157 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe, Asp or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Val or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Asn or Asp <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Ser or Asp <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=His or Asp <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=L-Pro, D-Pro, D-hydroxypro, L-hydroxypro, L-(N-methyllysine), D-Lysine, L-(N-methyl arginine) or D-arginine <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa=Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg or none <400> 157 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 158 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=His, Phe, Gly, Gln, Glu, Ser, Asn, Asp, or Pro <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gln, Asn, Ala or Pro <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Leu, Pro, Val, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gln or Asn <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa=Pro, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gly, Gln or Asn <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asp or Glu <400> 158 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 159 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe, Glu, Asp, Thr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gln, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=His, Ala, Glu, Aps, Thr, Ser, Gln, or Asn <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Ser, Leu, Asp, Pro, Glu, Ile, Val, His, Thr, Gln, Asn, Met, Tyr, Trp or Phe <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=His, Asn, Leu, Asp, Arg, Glu, Ser, Thr, Ile or Gln <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa=Val, Asn, His, Ile or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa=Ala, Glu, Asp, Asn, Gln, Ser, Thr, Gly <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa=Tyr, Asp, Glu, Gln, Asn, Ser, Thr, His or Arg <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa=Leu, Ser, Thr, Asn, Gln, Glu, Asp or His <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa=Val, Ser, Thr, Asn, Gln or His <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa=Gly, Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, His or Arg <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa=Tyr, Ala, Asp, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa=Thr, Asp, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=Pro, Asp or Glu <400> 159 Xaa Xaa Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Glu Xaa Leu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Cys Xaa Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30 <210> 160 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp or Glu <400> 160 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=Ly, Ala, Thr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Thr, Arg, Lys, Hyl, Orn or Cit <400> 161 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa 20 25 30 <210> 162 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <400> 162 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 163 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <400> 163 Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 20 25 30 <210> 164 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Asp, Gly, Ser, Thr or Ala <400> 164 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Xaa Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 165 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Thr or none <400> 165 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 20 25 30 <210> 166 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 166 Arg Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 167 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 168 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 168 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)...(5) <223> Repeating linker peptide <400> 169 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 170 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 171 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 172 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 173 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 174 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 175 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 176 Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 <210> 177 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 177 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 178 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 178 Ala Ala Lys 1 <210> 179 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 179 Val Met 1 <210> 180 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 180 Ala Met 1 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <220> <221> REPEAT <222> (3)...(5) <223> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 repeats <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=Gly, Gly-Gly or Gly-Gly-Gly <400> 181 Ala Met Gly Xaa Ser Ala Met 1 5 210> 182 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 153 B-chain <400> 182 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr 20 25 30 <210> 183 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 1423 A-chain <400> 183 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 184 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 1423 B-chain <400> 184 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 20 25 30 <210> 185 <211> 510 <212> PRT <213> Pan troglodytes <220> <223> Chimpanzee PH20 <400> 185 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Val Thr Gly Gln Asp Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu 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Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile 450 455 460 <210> 269 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> esHuPH20 36-496 <400> 269 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 450 455 460 <210> 270 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> esHuPH20 36-494 <400> 270 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe 450 455 <210> 271 <211> 457 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> esHuPH20 36-492 <400> 271 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr 450 455 <210> 272 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature HuPH20 36-488 <400> 272 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr 450 <210> 273 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature HuPH20 36-486 <400> 273 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro 450

Claims (192)

  1. 혈당 수준을 조절하기 위한 치료적 유효량의 속효성 인슐린; 및
    조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 히알루로난 분해효소의 양을 포함하는 초속효성 인슐린 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 속효성 인슐린의 양은 약 또는 10 U/mL 내지 약 또는 500 U/mL 인슐린이고;
    조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만들기에 충분한 히알루로난 분해효소의 양은 적어도 또는 약 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL 또는 25 U 히알루로니다제 활성/mL과 기능적으로 동등한 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 히알루로난 분해효소의 양은 적어도 또는 약 30 내지 35 유닛 히알루로니다제 활성/mL과 기능적으로 동등한 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 부피는 약 또는 1 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL 또는 50 mL인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린의 양은 약 또는 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml 또는 500 U/mL인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37.5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL 또는 5000 U/mL와 기능적으로 동등한 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량 투여를 위해 제형화된 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여를 위해 제형화된 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폐루프시스템을 사용한 전달을 위해 제형화된 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펜을 사용한 전달을 위해 제형화된 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펌프를 사용한 전달을 위해 제형화된 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 혈당수준은 식사 혈당수준인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여하기 위한 인슐린의 치료적 유효량은 약 또는 0.05 유닛, 0.06 유닛, 0.07 유닛, 0.08 유닛, 0.09 유닛, 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛 또는 100 유닛인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여하기 위한 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 0.3 유닛, 0.5 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛, 200 유닛, 250 유닛, 300 유닛, 350 유닛, 400 유닛, 450 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2,000 유닛, 3,000 유닛, 4,000 유닛 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성에 기능적으로 동등한 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제를 더 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 킬레이트제가 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트인 초속효성 인슐린 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 킬레이트제가 약 또는 등몰 농도로 금속과의 착체로서 제공되는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 킬레이트제 착체가 칼슘 EDTA인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 칼슘 EDTA의 농도가 약 또는 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 아연을 더 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 아연의 농도가 인슐린 100 유닛 당 약 또는 0.002 mg(mg/100U), 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.028 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U 또는 0.1 mg/100 U인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 EDTA와 아연을 약 또는 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1의 몰비로 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 100 U 인간 인슐린 당 약 또는 0.01 mg 내지 약 또는 0.02 mg의 아연 및 약 또는 0.1 mM 내지 약 또는 50 mM의 칼슘 EDTA를 함유하는 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린에 대한 아연의 몰비 약 또는 1:3 및 속효성 인슐린에 대한 칼슘 EDTA의 몰비 약 또는 1:3 내지 10:1을 갖는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 등장화제를 더 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 등장화제가 아미노산, 폴리알콜 및 염 중에서 선택되는 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 등장화제가 글리세롤 및/또는 염화나트륨인 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 오스몰 농도가 약 또는 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg 또는 400 mOsm/kg인 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 약 또는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8인 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린의 안정화제, 히알루로난 분해효소의 안정화제 또는 둘다를 더 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 안정화제는 계면활성제, 폴리알콜, 금속, 염, 공용매 및/또는 단백질인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 안정화제가 혈청 알부민인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 혈청 알부민을 약 또는 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL 또는 1 mg/mL의 농도로 포함하는 조성물.
  34. 제30항에 있어서, 단백질 안정화제가 폴리솔베이트인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 폴리솔베이트를 약 또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1%의 농도로 포함하는 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 탈산소제를 더 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 탈산소제가 아스코르브산, 아스코르베이트, 시트르산, 시트레이트, 메티오닌 및 알부민 중에서 선택되는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 메티오닌을 약 또는 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, 또는 20 mM의 농도로 포함하는 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제를 더 포함하는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 보존제는 방향환을 함유하는 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 보존제가 m-크레솔 또는 페놀인 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 단량체, 2량체 또는 6량체인 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린인 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 레귤러 인슐린은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린인 조성물.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 레귤러 인슐린은 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린인 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 재조합 인슐린인 조성물.
  48. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린이 합성되거나 부분적으로 합성된 것인 조성물.
  49. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린이 단리된 것인 조성물.
  50. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 147-149 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인슐린을 더 포함하는 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 기초-작용 인슐린을 더 포함하는 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제인 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 서열번호 1-39 또는 67-96 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 서열번호 1에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 그 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 조성물.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 히알루로니다제가 가용성 히알루로니다제인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 가용성 히알루로니다제가 PH20, 또는 그 말단절단된 형태인 조성물.
  58. 제57항에 있어서, PH20이 양, 소, 또는 말단절단된 인간 PH20으로부터 선택되는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 말단절단된 인간 PH20이 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 조성물.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 rHuPH20으로 지칭되는 조성물로서 제공된 가용성 히알루로니다제인 조성물.
  61. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 콘트로이티나제인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 콘트로이티나제가 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 콘트로이티나제가 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로난을 분해하는 능력을 유지하는 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함한 주사기 또는 바이알.
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는 폐루프시스템.
  66. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함한 인슐린 펌프.
  67. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함한 인슐린 펜.
  68. 속효성 인슐린; 및 히알루로난 분해효소를 포함하고
    속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소가 동일 또는 상이한 저장소내에 존재하는, 대상체내의 혈당수준을 조절하는 폐루프시스템.
  69. 제68항에 있어서, 글루코스 센서, 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린을 전달하기 위한 전달계 및 펌핑 기능과 모니터링 기능을 통합하도록 프로그램된 소프트웨어 중 하나 이상을 더 포함하고, 이에 의해서 히알루로난 분해효소 및 속효성 인슐린은 비당뇨병 대상체내의 혈당조절와 유사한 병상을 나타내는 혈당조절을 달성하기 위해 전달되는 폐루프시스템.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 속효성 인슐린은 단량체, 2량체, 다량체 또는 6량체인 폐루프시스템.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린이 속효성 인간 인슐린인 폐루프시스템.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린이 레귤러 인슐린인 폐루프시스템.
  73. 제72항에 있어서, 레귤러 인슐린은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린인 폐루프시스템.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 레귤러 인슐린은 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린, 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택된 폐루프시스템.
  75. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 폐루프시스템.
  76. 제75항에 있어서, 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 147-149 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 폐루프시스템.
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린은 재조합 인슐린인 폐루프시스템.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인슐린을 더 포함하는 폐루프시스템.
  79. 제78항에 있어서, 하나의 추가의 인슐린은 기초-작용 인슐린인 폐루프시스템.
  80. 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제인 폐루프시스템.
  81. 제80항에 있어서, 히알루로니다제가 가용성 히알루로니다제인 폐루프시스템.
  82. 제81항에 있어서, 가용성 히알루로니다제가 PH20 또는 그 말단절단된 형태인 폐루프시스템.
  83. 제82항에 있어서, PH20이 양, 소, 또는 말단절단된 인간 PH20으로부터 선택되는 폐루프시스템.
  84. 제83항에 있어서, 말단절단된 인간 PH20이 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 폐루프시스템.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 rHuPH20으로 지칭되는 조성물로서 제공된 가용성 히알루로니다제인 폐루프시스템.
  86. 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 콘트로이티나제인 폐루프시스템.
  87. 제86항에 있어서, 콘트로이티나제가 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 폐루프시스템.
  88. 제87항에 있어서, 콘트로이티나제가 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로난을 분해하는 능력을 유지하는 그의 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 폐루프시스템.
  89. 제68항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린을 함유하는 저장소는 약 또는 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 200 유닛, 300 유닛, 400 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 6000 유닛, 7000 유닛 또는 그 이상의 인슐린을 함유하는 폐루프시스템.
  90. 제68항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 속효성 인슐린을 약 또는 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.7 유닛, 0.8 유닛, 0.9 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 15 유닛, 20 유닛, 25 유닛, 30 유닛, 35 유닛, 40 유닛, 50 유닛 또는 그 이상의 인슐린으로부터 각각의 투여량 증가로 전달할 수 있는 폐루프시스템.
  91. 제68항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소를 함유하는 저장소는 약 또는 0.3 유닛, 0.5 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛, 200 유닛, 250 유닛, 300 유닛, 350 유닛, 400 유닛, 450 유닛, 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 800 유닛, 900 유닛, 1000 유닛, 2,000 유닛, 3,000 유닛, 4,000 유닛, 5000 유닛, 6,000 유닛, 7,000 유닛, 8,000 유닛, 9,000 유닛, 10,000 유닛, 20,000 유닛 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등한 히알루로난 분해효소의 양을 함유하는 폐루프시스템.
  92. 제68항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 히알루로난 분해효소를 약 또는 0.3 유닛, 0.5 유닛, 1 유닛, 2 유닛, 3 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛, 100 유닛, 150 유닛 또는 그 이상의 히알루로니다제 활성과 기능적으로 동등한 히알루로난 분해효소의 양의 각각의 투여량 증가로 전달할 수 있는 폐루프시스템.
  93. 속효성 인슐린을 선택하고 속효성 인슐린과 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만드는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소를 혼합하는 것을 포함하는 초속효성 인슐린 조성물을 제조하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 조성물은 약 또는 10 U/mL 내지 약 또는 500 U/mL 인슐린 및
    적어도 또는 약 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL 또는 25 U 히알루로니다제 활성/mL, 30 내지 35 히알루로니다제 유닛/mL과 기능적으로 동등한 히알루로난 분해효소의 양을 함유하는 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 조성물은 적어도 또는 약 30 내지 35 히알루로니다제 유닛/mL와 기능적으로 동등한 양의 히알루로난 분해효소를 함유하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 조성물에 킬레이트제를 더 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트인 방법.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 아연을 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 조성물 내에 아연의 최종농도가 인슐린 100 유닛 당 약 또는 0.002 밀리그램 (mg/100 U), 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.028 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U 또는 0.1 mg/100 U인 방법.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 등장화제를 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 등장화제가 아미노산, 폴리알콜 및 염 중에서 선택되는 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 등장화제가 글리세롤 및/또는 염화나트륨인 방법.
  103. 제93항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 오스몰농도가 약 또는 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg 또는 400 mOsm/kg인 방법.
  104. 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 약 또는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8인 방법.
  105. 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린의 안정화제, 히알루로난 분해효소의 안정화제 또는 둘다를 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 안정화제는 계면활성제, 폴리알콜, 금속, 염, 공용매 및/또는 단백질인 방법.
  107. 제93항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 탈산소제를 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 탈산소제가 아스코르브산, 아스코르베이트, 시트르산, 시트레이트, 메티오닌 및 알부민 중에서 선택되는 방법.
  109. 제93항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 보존제를 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  110. 제93항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 단량체, 2량체 또는 6량체인 방법.
  111. 제93항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 방법.
  112. 제93항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 레귤러 인슐린은 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린, 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린인 방법.
  114. 제93항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 재조합 인슐린인 방법.
  115. 제93항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린이 합성되거나 부분적으로 합성된 것인 방법.
  116. 제93항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 147-149에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 방법.
  118. 제93항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 하나 이상의 추가의 인슐린을 더 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  119. 제93항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제인 방법.
  120. 제119항에 있어서, 히알루로니다제가 서열번호 1-39 또는 67-96 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 그의 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 히알루로니다제가 가용성 히알루로니다제인 방법.
  122. 제121항에 있어서, 가용성 히알루로니다제가 PH20, 또는 그 말단절단된 형태인 방법.
  123. 제122항에 있어서, PH20이 양, 소, 또는 말단절단된 인간 PH20으로부터 선택되는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 말단절단된 인간 PH20이 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 방법.
  125. 제119항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 rHuPH20으로 지칭되는 조성물로서 제공된 가용성 히알루로니다제인 방법.
  126. 제93항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 콘트로이티나제인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 콘트로이티나제가 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  128. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 투여량 유닛을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체내의 혈당 수준을 조절하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 투여량은 식사 투여량인 방법.
  130. 제128항 또는 제129항에 있어서, 속효성 인슐린이 레귤러 인슐린인 방법.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 식전 약 또는 20분, 10분 또는 5분 미만 내지 식후 약 또는 10분 미만 또는 식사와 함께 투여되는 방법.
  132. 환자에게 식전 약 또는 20분, 10분 또는 5분 미만 내지 식후 약 또는 30분 미만에 속효성 인슐린 조성물을 투여하도록 지시하고,
    속효성 인슐린 조성물을 초속효성 조성물로 만드는데 충분한 히알루로난 분해효소의 양과 속효성 인슐린을 공동-투여하는 것을 포함하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 환자에게 대략 또는 식사섭취시에 속효성 인슐린 조성물을 투여할 것을 지시하는 방법.
  134. 제133항에 있어서, 지시가 기재된 방법.
  135. 제133항에 있어서, 지시가 구두인 방법.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해효소가 공동-제형화된 방법.
  137. 제128항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주사기, 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 폐루프시스템을 통해 대상체에 투여되는 방법.
  138. 제128항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 피하로 투여되는 방법.
  139. 제128항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 초속효성 인슐린 조성물내에 속효성 인슐린의 투여량은 히알루로난 분해효소 없이 동일한 경로로 투여된 속효성 인슐린의 투여량 미만인 방법.
  140. 제128항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여된 인슐린의 양은 1회 식사를 위한 식사투여량이고, 약 또는 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0.03 U/kg, 0.04 U/kg, 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20 U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg 또는 0.50 U/kg인 방법.
  141. 제128항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여된 히알루로난 분해효소의 양은 1회 식사를 위한 속효성 인슐린의 식사투여량과 공동-투여를 위한 것이고 효소의 양은 약 또는 0.3 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1,000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 유닛, 5,000 U 또는 그 이상인 방법.
  142. 제128항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 단량체, 다량체, 2량체 또는 6량체인 방법.
  143. 제128항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 방법.
  144. 제128항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린인 방법.
  145. 제144항에 있어서, 레귤러 인슐린은 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린, 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린인 방법.
  146. 제128항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 방법.
  147. 제146항에 있어서, 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 147-149에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 방법.
  148. 제128항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린은 재조합 인슐린인 방법.
  149. 제128항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린이 합성되거나 부분적으로 합성된 것인 방법.
  150. 제128항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인슐린 조성물을 더 포함하는 방법.
  151. 제128항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제인 방법.
  152. 제151항에 있어서, 히알루로니다제가 가용성 히알루로니다제인 방법.
  153. 제152항에 있어서, 가용성 히알루로니다제가 PH20, 또는 그 말단절단된 형태인 방법.
  154. 제153항에 있어서, PH20이 양, 소, 또는 말단절단된 인간 PH20으로부터 선택되는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 말단절단된 인간 PH20이 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 방법.
  156. 제151항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 rHuPH20으로 지칭되는 조성물로서 제공된 가용성 히알루로니다제인 방법.
  157. 제128항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 콘트로이티나제인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 콘트로이티나제가 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  159. 제158항에 있어서, 콘트로이티나제가 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로난을 분해하는 능력을 유지하는 그의 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 방법.
  160. 약 또는 10 U 내지 약 또는 500 U 인슐린을 함유하는 제1 조성물; 및
    인슐린과 투여될 때 속효성 인슐린을 초속효성 인슐린로 만드는데 충분한 양의 히알루로난 분해효소를 함유하는 제2 조성물을 포함하고, 여기서
    충분한 양의 히알루로난 분해효소는 적어도 또는 약 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL 또는 25 U 히알루로니다제 활성/mL과 기능적으로 동등한 조합물.
  161. 제160항에 있어서, 충분한 양의 히알루로난 분해효소는 적어도 또는 약 30 내지 35 유닛 히알루로니다제 활성/mL과 기능적으로 동등한 조합물.
  162. 제160항 또는 제161항에 있어서, 제1 조성물내에 속효성 인슐린의 양은 약 또는 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml 또는 500 U/mL인 조합물.
  163. 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물내에 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 1 U/mL, 2 U/mL, 3 U/mL, 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 15 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 37.5 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL, 3000 U/mL 또는 5000 U/mL과 기능적으로 동등한 조합물.
  164. 히알루로난 분해효소를 함유하는 제1 조성물; 및
    속효성 인슐린을 함유하는 제2 조성물을 포함하고;
    상기 조성물들은 비경구투여를 위해 제형화되고;
    히알루로난 분해효소의 양은 제2 조성물과 혼합되어 생성된 조성물을 초속효성 인슐린 조성물로 만들기에 충분하거나; 또는
    히알루로난 분해효소의 양은 제1 조성물 투여전에 투여되어 속효성 인슐린 조성물을 초즉효소성 인슐린 조성물로 만들기에 충분한 것인 조합물.
  165. 제164항에 있어서, 대상체에 투여된 인슐린의 양은 1회 식사를 위한 식사 투여량이고 약 또는 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0.03 U/kg, 0.04 U/kg, 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 U/kg, 1 U/kg 또는 2 U/kg인 조합물.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, 대상체에 투여되는 히알루로난 분해효소의 양은 1회 식사에 대한 식사 투여량이고 약 또는 0.3 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 3 U, 4 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 유닛, 5,000 U 또는 그 이상인 조합물.
  167. 제160항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물들은 피하 투여를 위해 제형화된 조합물.
  168. 제160항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 단량체, 2량체, 6량체 또는 다량체인 조합물.
  169. 제160항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 조합물.
  170. 제160항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린인 방법.
  171. 제170항에 있어서, 레귤러 인슐린은 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 104에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린, 또는 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 88-108에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 123의 아미노산 잔기 위치 25-54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택된 조합물.
  172. 제160항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 조합물.
  173. 제172항에 있어서, 인슐린 유사체는 서열번호 103에 기재된 아미노산 서열을 갖는 A-사슬 및 서열번호 147-149에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B-사슬을 갖는 인슐린 중에서 선택되는 조합물.
  174. 제160항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린은 재조합 인슐린인 조합물.
  175. 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린이 합성되거나 부분적으로 합성된 것인 조합물.
  176. 제160항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인슐린 조성물을 더 포함하는 조합물.
  177. 제160항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제인 조합물.
  178. 제177항에 있어서, 히알루로니다제가 가용성 히알루로니다제인 조합물.
  179. 제178항에 있어서, 가용성 히알루로니다제가 PH20, 또는 그 말단절단된 형태인 조합물.
  180. 제179항에 있어서, PH20이 양, 소, 또는 말단절단된 인간 PH20으로부터 선택되는 조합물.
  181. 제180항에 있어서, 말단절단된 인간 PH20이 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하는 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 조합물.
  182. 제160항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 rHuPH20으로 지칭되는 조성물로서 제공된 가용성 히알루로니다제인 조합물.
  183. 제160항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난 분해효소가 콘트로이티나제인 조합물.
  184. 제183항에 있어서, 콘트로이티나제가 콘드로이틴 ABC 리아제, 콘트로이틴 AC 리아제 및 콘트로이틴 C 리아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조합물.
  185. 제184항에 있어서, 콘트로이티나제가 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 말단절단된 형태, 또는 서열번호 98-100 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고 히알루로난을 분해하는 능력을 유지하는 대립형질 변이체, 종 변이체 또는 다른 변이체를 갖는 조합물.
  186. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체내에 식후 혈당을 조절하기 위한 조성물.
  187. 제160항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 내에 식후 혈당을 조절하기 위한 조합물.
  188. 대상체내에 식후 혈당 수준을 조절하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 용도.
  189. 대상체내에 식후 혈당 수준을 조절하기 위한 의약의 제조를 위한 제160항 내지 제185항 중 어느 한 항에 기재된 조합물의 용도.
  190. 제160항 내지 제185항 중 어느 한 항에 기재된 조합물을 대상체에 투여하는 것을, 대상체내의 혈당 수준을 조절하는 방법.
  191. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물 또는 제160항 내지 제185항 중 어느 한 항에 기재된 조합물 및 임의의 지침서를 포함하는 키트.
  192. 포장재 및 포장재내에 함유된 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 조성물 또는 제160항 내지 제185항 중 어느 한 항에 기재된 조합물을 포함하는 제조품.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2298874A1 (en) 2002-12-16 2011-03-23 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (CHASEGP), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
SG177008A1 (en) 2003-03-05 2012-01-30 Halozyme Inc Soluble hyaluronidase glycoprotein (shasegp), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP2229407B1 (de) 2008-01-09 2016-11-16 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil
EP4269578B1 (en) 2008-03-06 2024-06-05 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase composition
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
EP3192525A1 (en) * 2008-04-14 2017-07-19 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases for use in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TWI451876B (zh) * 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
US7959598B2 (en) 2008-08-20 2011-06-14 Asante Solutions, Inc. Infusion pump systems and methods
KR101939557B1 (ko) 2008-10-17 2019-01-17 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 인슐린과 ｇｌｐ－1 효능제의 병용물
EP3037529B1 (en) * 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
US20110250273A1 (en) * 2008-12-11 2011-10-13 Melford Scientific, LLC Compositions of proton pump inhibitors, kits and methods of their use to treat diabetes
US9060927B2 (en) * 2009-03-03 2015-06-23 Biodel Inc. Insulin formulations for rapid uptake
CN103690958A (zh) * 2009-07-06 2014-04-02 赛诺菲-安万特德国有限公司 含有甲硫氨酸的水性胰岛素制备物
MX2012003282A (es) 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
CN107308442B (zh) * 2009-11-13 2022-10-18 赛诺菲-安万特德国有限公司 包含glp-1激动剂、胰岛素和甲硫氨酸的药物组合物
PT3345593T (pt) 2009-11-13 2023-11-27 Sanofi Aventis Deutschland Composição farmacêutica compreendendo despro36exendina- 4(1-39)-lys6-nh2 e metionina
US10842951B2 (en) 2010-01-12 2020-11-24 Aerami Therapeutics, Inc. Liquid insulin formulations and methods relating thereto
US8950394B2 (en) 2010-01-12 2015-02-10 Dance Biopharm Inc. Preservative-free single dose inhaler systems
WO2012161670A2 (en) 2010-04-07 2012-11-29 Incube Labs, Llc Method for treating diabetes and other glucose regulation disorders using stem cells
WO2012006283A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Biodel Inc. Compositions and methods for modulating the pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin
JP2013540103A (ja) 2010-07-20 2013-10-31 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤の投与に関連する有害副作用の処置
LT2611458T (lt) 2010-08-30 2016-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Ave0010 panaudojimas gaminant vaistą, skirtą 2 tipo cukrinio diabeto gydymui
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
JP2014518216A (ja) * 2011-06-17 2014-07-28 ハロザイム インコーポレイテッド ヒアルロナン分解酵素の安定な製剤
JP5890516B2 (ja) * 2011-06-17 2016-03-22 ハロザイム インコーポレイテッド ヒアルロナン分解酵素を用いる連続的皮下インスリン注入方法
EP2543725A1 (en) * 2011-07-08 2013-01-09 Biomay Ag Polysaccharide lyases
EP2741765B9 (fr) * 2011-08-10 2016-09-28 Adocia Solution injectable d'au moins une insuline basale
MX370264B (es) 2011-08-29 2019-12-09 Sanofi Aventis Deutschland Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2.
AR087744A1 (es) 2011-09-01 2014-04-16 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa
WO2013040501A1 (en) * 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
SG11201403714TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Halozyme Inc Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
CN104114155B (zh) 2012-01-09 2019-02-15 阿道恰公司 Ph为7并且至少包含pi为5.8至8.5之基础胰岛素和经取代共聚(氨基酸)的可注射溶液
SI2833905T1 (en) 2012-04-04 2018-08-31 Halozyme, Inc. Combination therapy with hyaluronidase and tumane-directed taxane
US9381247B2 (en) * 2012-04-16 2016-07-05 Biodel Inc. Magnesium compositions for modulating the pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin and insulin analogs, and injection site pain
US9399065B2 (en) 2012-04-16 2016-07-26 Biodel Inc. Magnesium compositions for modulating the pharmacokinetics and injection site pain of insulin
US20150314003A2 (en) 2012-08-09 2015-11-05 Adocia Injectable solution at ph 7 comprising at least one basal insulin the isoelectric point of which is between 5.8 and 8.5 and a hydrophobized anionic polymer
US9897565B1 (en) 2012-09-11 2018-02-20 Aseko, Inc. System and method for optimizing insulin dosages for diabetic subjects
US9171343B1 (en) 2012-09-11 2015-10-27 Aseko, Inc. Means and method for improved glycemic control for diabetic patients
MX360107B (es) 2012-11-13 2018-10-23 Adocia Formulación de acción rápida de insulina que comprende un compuesto aniónico sustituido.
US9486578B2 (en) * 2012-12-07 2016-11-08 Animas Corporation Method and system for tuning a closed-loop controller for an artificial pancreas
NZ707160A (en) * 2012-12-19 2016-08-26 Wockhardt Ltd A stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof
TWI641381B (zh) 2013-02-04 2018-11-21 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
UA117480C2 (uk) 2013-04-03 2018-08-10 Санофі Лікування цукрового діабету за допомогою складу інсуліну тривалої дії
WO2014179344A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Injectable nano-network gels for diabetes treatment
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
US9561324B2 (en) 2013-07-19 2017-02-07 Bigfoot Biomedical, Inc. Infusion pump system and method
WO2015057622A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Sialylated glycoproteins
AR098168A1 (es) * 2013-10-25 2016-05-04 Sanofi Sa Formulación estable de insulina glulisina
US10569015B2 (en) 2013-12-02 2020-02-25 Bigfoot Biomedical, Inc. Infusion pump system and method
JP6735674B2 (ja) 2014-01-09 2020-08-05 サノフイＳａｎｏｆｉ インスリンアスパルトの安定化された医薬製剤
BR112016013832A2 (pt) 2014-01-09 2017-08-08 Sanofi Sa Uso de análogo e/ou derivado de insulina, formulação farmacêutica e processo para a preparação da mesma, kit e dispositivo médico
EP3091995B1 (en) 2014-01-09 2024-03-20 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin aspart
GB2523989B (en) 2014-01-30 2020-07-29 Insulet Netherlands B V Therapeutic product delivery system and method of pairing
US9898585B2 (en) 2014-01-31 2018-02-20 Aseko, Inc. Method and system for insulin management
US9486580B2 (en) 2014-01-31 2016-11-08 Aseko, Inc. Insulin management
US11039620B2 (en) 2014-02-19 2021-06-22 Corning Incorporated Antimicrobial glass compositions, glasses and polymeric articles incorporating the same
US9622483B2 (en) 2014-02-19 2017-04-18 Corning Incorporated Antimicrobial glass compositions, glasses and polymeric articles incorporating the same
US11039621B2 (en) 2014-02-19 2021-06-22 Corning Incorporated Antimicrobial glass compositions, glasses and polymeric articles incorporating the same
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
EP3006045B3 (en) 2014-10-07 2021-03-17 Cyprumed GmbH Pharmaceutical formulations for the oral delivery of peptide or protein drugs
US11081226B2 (en) 2014-10-27 2021-08-03 Aseko, Inc. Method and controller for administering recommended insulin dosages to a patient
AU2015339576B2 (en) 2014-10-27 2020-02-06 Aseko, Inc. Subcutaneous outpatient management
CR20170208A (es) * 2014-11-21 2017-07-17 Merck Sharp & Dohme Agonistas parciales del receptor de insulina
SI3229828T1 (sl) 2014-12-12 2023-06-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Formulacija s fiksnim razmerjem inzulin glargin/liksisenatid
TW201630622A (zh) 2014-12-16 2016-09-01 美國禮來大藥廠 速效胰島素組合物
JP2018505756A (ja) 2015-02-18 2018-03-01 インシュレット コーポレイション 流体送達及び注入装置並びにその使用方法
CA3011902C (en) 2015-02-25 2023-08-15 Dance Biopharm, Inc. Liquid insulin formulations and methods relating thereto
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
US9981021B1 (en) * 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
US9878097B2 (en) 2015-04-29 2018-01-30 Bigfoot Biomedical, Inc. Operating an infusion pump system
DE102015107307B3 (de) * 2015-05-11 2016-09-08 Labor L + S Aktiengesellschaft Optisches Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure
EP3337402A4 (en) 2015-08-20 2019-04-24 Aseko, Inc. THERAPY ADVISER FOR THE MANAGEMENT OF DIABETES
JO3749B1 (ar) 2015-08-27 2021-01-31 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
MA53356B1 (fr) 2015-11-03 2022-05-31 Janssen Biotech Inc Formulations sous-cutanées d'anticorps anti-cd38 et leurs utilisations
CN114053517A (zh) 2016-01-05 2022-02-18 比格福特生物医药公司 操作多模式药物输送系统
US10449294B1 (en) 2016-01-05 2019-10-22 Bigfoot Biomedical, Inc. Operating an infusion pump system
EP3374905A1 (en) 2016-01-13 2018-09-19 Bigfoot Biomedical, Inc. User interface for diabetes management system
EP3374004B1 (en) 2016-01-14 2023-06-28 Bigfoot Biomedical, Inc. Adjusting insulin delivery rates
GB201607918D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
WO2017210242A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-07 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-nuclear hormone conjugates
WO2018058041A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Insulet Corporation Fluid delivery device with sensor
US11033682B2 (en) 2017-01-13 2021-06-15 Bigfoot Biomedical, Inc. Insulin delivery methods, systems and devices
JP6874155B2 (ja) 2017-05-05 2021-05-19 イーライ リリー アンド カンパニー 生理的グルコースの閉ループ制御
IL270975B2 (en) 2017-06-01 2024-02-01 Lilly Co Eli Fast-acting insulin preparations
EP3758008A1 (en) * 2017-06-15 2020-12-30 Novo Nordisk A/S Basal titration with adaptive target glucose level
CA3079242A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
JP7133625B2 (ja) 2017-12-21 2022-09-08 イーライ リリー アンド カンパニー 生理的グルコースの閉ループ制御
USD928199S1 (en) 2018-04-02 2021-08-17 Bigfoot Biomedical, Inc. Medication delivery device with icons
US11158413B2 (en) * 2018-04-23 2021-10-26 Medtronic Minimed, Inc. Personalized closed loop medication delivery system that utilizes a digital twin of the patient
AU2019263490A1 (en) 2018-05-04 2020-11-26 Insulet Corporation Safety constraints for a control algorithm-based drug delivery system
WO2019243627A1 (fr) 2018-06-23 2019-12-26 Adocia Dispositif pour injecter une solution d'insuline(s)
FR3083985A1 (fr) 2018-07-23 2020-01-24 Adocia Dispositif pour injecter une solution d'insuline(s)
FR3083984A1 (fr) 2018-07-23 2020-01-24 Adocia Dispositif pour injecter une solution d'insuline(s)
WO2020069406A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Insulet Corporation Activity mode for artificial pancreas system
WO2020092546A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
USD920343S1 (en) 2019-01-09 2021-05-25 Bigfoot Biomedical, Inc. Display screen or portion thereof with graphical user interface associated with insulin delivery
US11986629B2 (en) 2019-06-11 2024-05-21 Medtronic Minimed, Inc. Personalized closed loop optimization systems and methods
US11801344B2 (en) 2019-09-13 2023-10-31 Insulet Corporation Blood glucose rate of change modulation of meal and correction insulin bolus quantity
US11935637B2 (en) 2019-09-27 2024-03-19 Insulet Corporation Onboarding and total daily insulin adaptivity
WO2021065768A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 テルモ株式会社 空間形成剤、皮下投与製剤および空間形成方法
BR112022007593A2 (pt) 2019-10-25 2022-08-23 Cercacor Lab Inc Compostos indicadores, dispositivos que compreendem compostos indicadores e métodos de fabricação e uso dos mesmos
EP4069082B1 (en) 2019-12-06 2024-06-05 Insulet Corporation Techniques and devices providing adaptivity and personalization in diabetes treatment
US11833329B2 (en) 2019-12-20 2023-12-05 Insulet Corporation Techniques for improved automatic drug delivery performance using delivery tendencies from past delivery history and use patterns
US11551802B2 (en) 2020-02-11 2023-01-10 Insulet Corporation Early meal detection and calorie intake detection
US11986630B2 (en) 2020-02-12 2024-05-21 Insulet Corporation Dual hormone delivery system for reducing impending hypoglycemia and/or hyperglycemia risk
CN114929261A (zh) 2020-02-17 2022-08-19 生物测试股份公司 凝血因子viii的皮下施用
US11607493B2 (en) 2020-04-06 2023-03-21 Insulet Corporation Initial total daily insulin setting for user onboarding
US11684716B2 (en) 2020-07-31 2023-06-27 Insulet Corporation Techniques to reduce risk of occlusions in drug delivery systems
US20220096603A1 (en) 2020-09-30 2022-03-31 Cercacor Laboratories, Inc. Insulin formulations and uses in infusion devices
EP4240389A1 (en) * 2020-11-04 2023-09-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Viral vectors encoding canine insulin for treatment of metabolic diseases in dogs
US11904140B2 (en) 2021-03-10 2024-02-20 Insulet Corporation Adaptable asymmetric medicament cost component in a control system for medicament delivery
US11738144B2 (en) 2021-09-27 2023-08-29 Insulet Corporation Techniques enabling adaptation of parameters in aid systems by user input
WO2023168293A2 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Viral vector genome encoding an insulin fusion protein
WO2023168288A2 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 Scout Bio, Inc. Insulin fusion protein
WO2023178158A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Mannkind Corporation Optimization of dosing and prescribing of medication
CN114634920B (zh) * 2022-03-24 2024-02-27 江南大学 一种产人源透明质酸酶ph20的重组毕赤酵母及其构建方法
CN114632092B (zh) * 2022-05-17 2022-08-23 北京第一生物化学药业有限公司 睾丸片在制备具有降糖活性的药物中的应用
CN115227724B (zh) * 2022-09-21 2023-03-24 首都医科大学附属北京友谊医院 缓慢葡萄球菌在制备组合物中的应用

Family Cites Families (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US467840A (en) 1892-01-26 Water-wheel
US3837339A (en) * 1972-02-03 1974-09-24 Whittaker Corp Blood glucose level monitoring-alarm system and method therefor
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4573994A (en) 1979-04-27 1986-03-04 The Johns Hopkins University Refillable medication infusion apparatus
US4373527B1 (en) 1979-04-27 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Implantable programmable medication infusion system
JPS5951355A (ja) 1982-09-17 1984-03-24 Fujirebio Inc 抗ウイルス抗体検出用試薬
US4685903A (en) 1984-01-06 1987-08-11 Pacesetter Infusion, Ltd. External infusion pump apparatus
US4562751A (en) 1984-01-06 1986-01-07 Nason Clyde K Solenoid drive apparatus for an external infusion pump
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
EP0162007A1 (de) * 1984-04-18 1985-11-21 Geriaco AG Stabiles, lagerungsfähiges Insulinpräparat zur Behandlung von Akne vulgaris
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
KR970011449B1 (ko) 1988-01-29 1997-07-11 더 리전트 오브 디 유니버시티 오브 캘리포니아 이온전기 영동형 비침입 검체 채취 또는 이송 장치 및 방법
US4973318A (en) 1988-02-10 1990-11-27 D.C.P. Af 1988 A/S Disposable syringe
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
US5514646A (en) 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5721348A (en) 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
DK134691D0 (da) 1991-07-12 1991-07-12 Novo Nordisk As Apparat
DK175491D0 (da) 1991-10-18 1991-10-18 Novo Nordisk As Apparat
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5433197A (en) 1992-09-04 1995-07-18 Stark; Edward W. Non-invasive glucose measurement method and apparatus
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5791344A (en) 1993-11-19 1998-08-11 Alfred E. Mann Foundation For Scientific Research Patient monitoring system
US5497772A (en) 1993-11-19 1996-03-12 Alfred E. Mann Foundation For Scientific Research Glucose monitoring system
TW565568B (en) 1994-03-31 2003-12-11 Amgen Inc Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US5569186A (en) 1994-04-25 1996-10-29 Minimed Inc. Closed loop infusion pump system with removable glucose sensor
US6093563A (en) 1994-07-08 2000-07-25 Ibex Technologies R And D, Inc. Chondroitin lyase enzymes
US5657947A (en) * 1994-08-24 1997-08-19 Loral Corp. Precision guidance system for aircraft launched bombs
AU3374795A (en) 1994-08-29 1996-03-22 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5586553A (en) 1995-02-16 1996-12-24 Minimed Inc. Transcutaneous sensor insertion set
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
WO1997019188A1 (en) 1995-11-22 1997-05-29 Minimed, Inc. Detection of biological molecules using chemical amplification and optical sensors
US6828431B1 (en) 1999-04-09 2004-12-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US5747806A (en) 1996-02-02 1998-05-05 Instrumentation Metrics, Inc Method and apparatus for multi-spectral analysis in noninvasive nir spectroscopy
US5866538A (en) 1996-06-20 1999-02-02 Novo Nordisk A/S Insulin preparations containing NaCl
US5958750A (en) 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
HUP9904152A3 (en) 1996-07-05 2000-05-29 Novo Nordisk As Flexible piston rod
US5665069A (en) 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US5783556A (en) * 1996-08-13 1998-07-21 Genentech, Inc. Formulated insulin-containing composition
US5947934A (en) 1996-09-13 1999-09-07 Novo Nordisk A/S Dose display for an injection syringe
US6379339B1 (en) 1996-09-13 2002-04-30 Nova Nordisk A/S Syringe
US6110149A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Novo Nordisk A/S Syringe
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6123938A (en) 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6558351B1 (en) 1999-06-03 2003-05-06 Medtronic Minimed, Inc. Closed loop system for controlling insulin infusion
US5954643A (en) 1997-06-09 1999-09-21 Minimid Inc. Insertion set for a transcutaneous sensor
US7267665B2 (en) 1999-06-03 2007-09-11 Medtronic Minimed, Inc. Closed loop system for controlling insulin infusion
US6074372A (en) 1997-06-09 2000-06-13 Novo Nordisk A/S Dose setting mechanism and an injection syringe having such a dose setting mechanism
ZA984697B (en) 1997-06-13 1999-12-01 Lilly Co Eli Stable insulin formulations.
US6093167A (en) 1997-06-16 2000-07-25 Medtronic, Inc. System for pancreatic stimulation and glucose measurement
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
EP1021248B1 (en) 1997-10-09 2005-12-28 Kadant Black Clawson Inc. Paper pulp refiner control system and method
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6579690B1 (en) 1997-12-05 2003-06-17 Therasense, Inc. Blood analyte monitoring through subcutaneous measurement
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
CN1314992A (zh) 1998-07-03 2001-09-26 奈勒斯菲尔德控制有限公司 流体测量的方法和装置
US6554798B1 (en) 1998-08-18 2003-04-29 Medtronic Minimed, Inc. External infusion device with remote programming, bolus estimator and/or vibration alarm capabilities
US6558320B1 (en) 2000-01-20 2003-05-06 Medtronic Minimed, Inc. Handheld personal data assistant (PDA) with a medical device and method of using the same
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6669663B1 (en) * 1999-04-30 2003-12-30 Medtronic, Inc. Closed loop medicament pump
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
TW453884B (en) 1999-09-16 2001-09-11 Novo Nordisk As Dose setting limiter
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030212021A1 (en) 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
WO2001054757A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Novo Nordisk A/S A dose setting limiter
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6442413B1 (en) 2000-05-15 2002-08-27 James H. Silver Implantable sensor
ATE367398T1 (de) 2000-05-16 2007-08-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten
US6663602B2 (en) 2000-06-16 2003-12-16 Novo Nordisk A/S Injection device
US6589229B1 (en) 2000-07-31 2003-07-08 Becton, Dickinson And Company Wearable, self-contained drug infusion device
DE60144439D1 (de) 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6740042B1 (en) 2001-09-05 2004-05-25 Biomedix, Inc. Bilateral simultaneous doppler measurement of segmented sphygmomanometry
US6740072B2 (en) 2001-09-07 2004-05-25 Medtronic Minimed, Inc. System and method for providing closed loop infusion formulation delivery
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US7026440B2 (en) 2001-11-07 2006-04-11 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
WO2003045980A2 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
US7317000B2 (en) 2001-12-02 2008-01-08 Novo Nordisk A/S Glucose-dependent insulins
WO2003047426A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Eli Lilly And Company Medication delivery device having communication capability with glucose monitor
US6744350B2 (en) 2002-02-28 2004-06-01 Smiths Medical Md, Inc. Insulin pump having missed meal bolus alarm
US6852104B2 (en) 2002-02-28 2005-02-08 Smiths Medical Md, Inc. Programmable insulin pump
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
US20040158232A1 (en) 2002-08-07 2004-08-12 Schetky Laurence Macdonald Implantable artificial pancreas
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
EP2298874A1 (en) 2002-12-16 2011-03-23 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (CHASEGP), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
EP1596887B1 (en) 2003-02-26 2022-03-23 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii moiety conjugates
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
SG177008A1 (en) 2003-03-05 2012-01-30 Halozyme Inc Soluble hyaluronidase glycoprotein (shasegp), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
US7025713B2 (en) 2003-10-13 2006-04-11 Icon Ip, Inc. Weight lifting system with internal cam mechanism
CA2558835C (en) 2004-03-12 2011-06-28 Biodel, Inc. Rapid acting drug delivery compositions
US6999854B2 (en) 2004-05-28 2006-02-14 International Business Machines Corporation Medical infusion pump capable of learning bolus time patterns and providing bolus alerts
US7572613B2 (en) 2004-06-25 2009-08-11 Klein Jeffrey A Drug delivery system for accelerated subcutaneous absorption
JP3912395B2 (ja) * 2004-07-12 2007-05-09 セイコーエプソン株式会社 半導体集積回路、検査装置および半導体集積回路の検査方法
WO2007038773A1 (en) 2005-09-28 2007-04-05 Biodel, Inc. Self-filling two chamber injectable device
WO2007041481A1 (en) 2005-09-29 2007-04-12 Biodel, Inc. Rapid acting and prolonged acting insulin preparations
US7713929B2 (en) * 2006-04-12 2010-05-11 Biodel Inc. Rapid acting and long acting insulin combination formulations
AU2006304757A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Intranasal administration of rapid acting insulin
US20070191757A1 (en) 2006-02-16 2007-08-16 Biodel Inc. Method and Device for Sublingual Drug Delivery Using Iontophoresis
WO2007098479A2 (en) * 2006-02-21 2007-08-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Localized insulin delivery for bone healing
AU2007238114B2 (en) 2006-04-12 2010-10-14 Biodel, Inc. Rapid acting and long acting insulin combination formulations
US20070243567A1 (en) 2006-04-13 2007-10-18 Syhhong Chang Beta cell mimicking control algorithm for artificial pancreas
CA2660029A1 (en) * 2006-08-04 2008-02-07 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions for intranasal delivery of human insulin and uses thereof
RU2471867C2 (ru) 2007-06-19 2013-01-10 Тамара П. Уваркина Гиалуронидаза и способ ее применения
IL186598A0 (en) * 2007-10-11 2008-11-03 Mohammad Abdulrazik Composition and method for the treatment or prevention of glaucoma and ocular hypertension
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
EP4269578B1 (en) 2008-03-06 2024-06-05 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase composition
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
EP3192525A1 (en) 2008-04-14 2017-07-19 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases for use in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
US20090311237A1 (en) 2008-04-14 2009-12-17 Frost Gregory I Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TWI532497B (zh) 2008-08-11 2016-05-11 曼凱公司 超快起作用胰島素之用途
EP3037529B1 (en) 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
JP2013540103A (ja) 2010-07-20 2013-10-31 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤の投与に関連する有害副作用の処置
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
JP5890516B2 (ja) 2011-06-17 2016-03-22 ハロザイム インコーポレイテッド ヒアルロナン分解酵素を用いる連続的皮下インスリン注入方法
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
SG11201403714TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Halozyme Inc Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
SI2833905T1 (en) 2012-04-04 2018-08-31 Halozyme, Inc. Combination therapy with hyaluronidase and tumane-directed taxane

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme

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HK1195728A1 (zh) 2014-11-21
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