KR101874401B1 - 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 포함하는, 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형 또는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형인 조성물이 제공된다.

Description

히알루로난 분해 효소의 안정한 제형{STABLE FORMULATIONS OF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME}

본 발명에서는 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 포함하는, 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형 또는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형인 조성물이 제공된다.

관련 출원서

"히알루로난 분해 효소 및 인슐린의 안정한 복합제형(STABLE FORMULATIONS OF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME)"이란 표제로 2011년 06월 17일자로 출원된 미국 가출원 제 61/520,962 호에 대해 우선권 이익을 주장한다.

본 출원은 미국 가출원 제 61/520,962 호에 대해 우선권을 주장하는 "히알루로난 분해 효소의 안정한 제형(STABLE FORMULATIONS OF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME)"이란 표제로 동일자로 함께 출원된 미국 가출원 제 13/507,263 호에 관한 것이다. 본 출원은 또한 미국 출원 제 61/520,962 호에 대해 우선권을 주장하는 "히알루로난 분해 효소의 안정한 제형"이란 표제로 동일자도 함께 출원된 미국 출원 제 13/507,262 호에 관한 것이다. 상기 인용된 관련 출원서들의 주제는 그 전체가 참고로 포함된다.

또한 본 출원은 각각 "히알루로난 분해 효소를 이용한 연속적인 인슐린 피하 주입 방법(Continuous Subcutaneous Insulin Infusion Methods with a Hyaluronan-Degrading Enzyme)"이란 표제로 2011년 06월 17일자로 출원된 미국 가출원 제 61/520,940 호, 2011년 10월 27일자로 출원된 미국 가출원 제 61/628.389 호, 및 2012년 06월 08일자로 출원된 미국 가출원 제 61/657,606 호에 관한 것이다. 본 출원은 또한 "히알루로난 분해 효소를 이용한 연속적인 인슐린 피하 주입 방법"이란 표제로 본원에서 동일자로 출원된 미국 출원 제 13/507,261 호에 관한 것으로, 이는 미국 가출원 제 61/520,940 호, 제 61/628,389 호 및 제 61/657,606 호에 대한 우선권을 주장한다. 또한 본 출원은 "히알루로난 분해 효소를 이용한 연속적인 인슐린 피하 주입 방법"이란 표제로 본원에서 동일자로 출원된 PCT 국제출원 PCT/US2012/042818 호에 관한 것으로, 이는 미국 가출원 제 61/520,940 호, 제 61/628,389 호 및 제 61/657,606 호에 대한 우선권을 주장한다.

또한 본 출원은 2009년 04월 28일자로 출원된 "초속효성 인슐린 조성물(Super Fast-Acting Insulin Compositions)"이란 표제로 발명자 그레고리 프로스트(Gregory Frost), 이고르 블린스키(Igor Blinsky), 다니엘 본(Daniel Vaughn) 및 배리 슈가맨(Barry Sugarman)에 의해 미국 공개공보 제 US2009-0304665 호로 공개된 미국 출원 제 12/387,225 호에 관한 것으로, 이는 2008년 04월 28일자로 출원된 미국 가출원 제 61/125,835 호에 대한 우선권을 주장한다.

상기 인용된 출원서의 주제는 그 전체가 참고로 포함된다.

전자적으로 제공된 서열목록의 참조로서의 포함

서열목록의 전자 버전이 함께 출원되며, 이의 내용은 이들 전체가 참고로 포함된다. 전자 파일은 그 크기가 860 킬로바이트이고, 그 표제는 3085seqPCl.txt이다.

당뇨병은 적절한 양의 인슐린을 생성하는데 있어서 췌장의 불능 또는 인슐린을 적절히 합성하고 방출하는데 있어서 세포의 무능력으로 인해 만성적인 고혈당증을 초래한다. 고혈당증은 또한 중환자가 경험할 수 있으며, 그 결과 사망률 및 이병률을 증가시킨다. 인슐린은, 정상적인 개인에서 나타나는 내인성 인슐린 반응을 모방하기 위해, 예를 들어 I형 당뇨병, II형 당뇨병 및 임신성 당뇨병을 포함하는 당뇨병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 치료제로서 투여되어 왔다. 또한 인슐린은 혈당치를 제어하기 위해 고혈당증을 앓는 중환자에게 투여되어 왔다.

일반적으로, 속효성 인슐린은 음식의 소화 이후와 같이 고혈당증에 반응하거나 고혈당증을 예상하여 이러한 대상체에 투여되며, 그 결과 혈당 제어를 야기할 수 있다. 그러나 현재의 인슐린의 속효성 형태는 흡수 및 작용에서의 지연을 가지며, 따라서 신속한 내인성 인슐린 작용과 비슷하지 않다. 따라서 이러한 제형들은 이 제 1 인슐린 방출 단계 직후에 발생하는 간장에서의 글루코오스 생성을 차단할 수 있을 정도로 충분히 빠르게 작용하지 않는다. 약리학적 작용에서의 지연으로 인해, 속효성 인슐린 제제는 목적하는 혈당 제어를 달성하기 위해 식사에 앞서 투여되어야 한다. 게다가, 투여되어야 하는 복용량은 저혈당증 및 많은 경우에 비만에 기여하는 작용의 연장된 기간을 초래한다.

히알루로난 분해 효소는 단독으로 치료 활성을 나타내고 및/또는 인슐린과 같은 치료제 없이 복합투여되는 효소이다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소 및 속효성 인슐린(예를 들어, 신속 작용 인슐린 유사체)을 함유하는 초속효성 인슐린 조성물이 개발되었으며, 이는 대상체에 투여되는 경우에 속효성 인슐린이 단독으로 사용되는 경우에 비해 비당뇨병 환자 대상체의 내인성(즉, 천연) 식후 인슐린 방출을 더욱 밀접하게 모방하도록 한다(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 US2009-0304665 호 참조).

히알루로난-분해 효소의 개선된 제형 및 복합제형이 필요하다. 또한, 예를 들어, 당뇨병 대상체 내 혈당치를 조절하기 위해, 대상체를 치료하기 위한 개선된 안정한 인슐린 제형에 대한 필요가 있다.

본원에서는 속효성 인슐린의 치료학적으로 유효한 양 및 초속효성인 조성물을 제공하기 위한 충분한 양으로 히알루로난 분해 효소를 함유하는 안정한 복합제형 조성물이 제공된다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 다중 약물 주사(multiple drug injection, MDI)를 위해 제형화되거나, 연속적인 피하 인슐린 주입(continuous subcutaneous insulin infusion, CSII)을 위해 제형화되며, 이들 각각은 안정성에 대한 상이한 요건을 갖는다. 특히, CSII용 복합제형은 승온 및 교반 하에서도 안정하도록 제형화되는 반면, MDI용 복합제형은 냉장 온도 또는 주위 온도에서 저장되는 경우에 안정하도록 제형화된다.

본원에서는 속효성 인슐린의 치료학적으로 유효한 양, 초속효성인 조성물을 제공하기 위한 충분한 양의 히알루로난 분해 효소, 50mM 내지 200mM의 농도 또는 약 50mM 내지 200mM 농도의 NaCl, 보존제 또는 보존제들의 혼합물의 항미생물적으로 유효량, 및 안정화제 또는 제제들을 함유하는 안정한 복합제형 조성물이 제공된다. 본원에서 제공된 복합제형은 6.8 내지 7.8의 pH 또는 약 6.8 내지 7.8의 pH를 가지며, 상기 조성물이 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 안정하도록 제형화된다.

일부 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 내 히알루로난 분해 효소는 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 유지하고, 및/또는 상기 인슐린은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 상기 조성물 내 인슐린의 초기 수준의 적어도 90%의 효능 또는 회복을 유지하고, 및/또는 상기 인슐린은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 초기 인슐린 순도의 적어도 90%를 유지하고, 및/또는 상기 인슐린은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 고분자량(high molecular weight, HMWt) 인슐린의 종을 2%미만으로 유지한다. 예를 들어, 상기 안정한 복합제형 내 히알루로난 분해 효소는 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상을 유지하고, 상기 인슐린의 순도 또는 효능은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 조성물의 pH는 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6이다. 예를 들어, 안정한 복합제형의 pH는 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2, 또는 약 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형 조성물 중의 NaCl 농도는 80mM 내지 200mM, 80mM 내지 140mM, 50mM 내지 100mM, 80mM 내지 100mM, 50mM 내지 80mM, 100mM 내지 140mM 또는 120mM 내지 140mM, 또는 약 80mM 내지 200mM, 80mM 내지 140mM, 50mM 내지 100mM, 80mM 내지 100mM, 50mM 내지 80mM, 100mM 내지 140mM 또는 120mM 내지 140mM이다. 예를 들어, 안정한 복합제형의 NaCl 농도는 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM이거나, 적어도 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM이거나, 약 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM이다. 이러한 실시예에서, 100mM 미만의 조성물에서 NaCl의 상한량(upper amount)은 최대 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM이다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 6.8 내지 7.8의 pH 범위 또는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH 범위를 유지하기 충분한 양의 완충제를 함유한다.

일 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도(상기 수치를 포함함)에서 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월 또는 30개월 동안 안정하다. 예를 들어, 상기 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도(상기 수치를 포함함)에서 적어도 18개월 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도(상기 수치를 포함함)에서 적어도 15일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 35일, 40일, 45일 또는 50일 동안 안정하다. 예를 들어, 상기 복합제형은 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도(상기 수치를 포함함)에서 적어도 1개월 동안 안정하다.

또한 본원에서는 속효성 인슐린의 치료학적으로 유효한 양, 초속효성인 조성물을 제공하기 위한 충분한 양의 히알루로난 분해 효소, 120mM 내지 200mM의 농도 또는 약 120mM 내지 약 200mM의 농도의 NaCl, 보존제 또는 보존제들의 혼합물의 항미생물적으로 유효량, 및 안정화제 또는 제제들을 함유하는 안정한 복합제형 조성물이 제공된다. 본원에서 제공된 복합제형은 6.5 내지 7.5의 pH, 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며, 상기 조성물은 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 안정하거나, 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하다.

일부 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 단백질들, 글리코사미노글리칸(GAG), 다당류, 지방산, 라노스타노이드(lanostanoid)류, 항생제, 항네마토드제, 합성 유기 화합물들 및/또는 식물-유래 생리활성 성분과 같은 히알루로니다아제 억제제의 유효량을 추가로 함유하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물 유래 생리 활성 성분의 예는 알칼로이드, 항산화제, 폴리페놀, 플라보노이드류, 테르펜류 및/또는 항염증성 약물들이 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 내 히알루로니다아제 억제제는 히알루로난 분해 효소 또는 인슐린과 공유성 복합체를 형성하지 않는다. 예시적인 히알루로니다아제 억제제로는 혈청 히알루로니다아제 억제제, 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 당단백질(WSG), 헤파린, 헤파린 설페이트, 데르마탄 설페이트, 키토산, β-(1,4)-갈락토-올리고당, 황산화 베르바스코스(verbascose), 황산화 플란테오스(planteose), 펙틴, 폴리(스티렌-4-설포네이트), 덱스트란 설페이트, 소듐 알기네이트(sodium alginate), 미역(Undaria pinnatifida) 유래 다당류, 만델산 축합 폴리머, 에이코사트리엔 산(eicosatrienoic acid), 네르본 산(nervonic acid), 올레아놀 산(oleanolic acid), 아리스토로크 산(aristolochic acid), 아즈말린(ajmaline), 레서핀(reserpine), 플라본, 데스메톡시센타우레딘(desmethoxycentauredine), 케르세틴(quercetin), 아피게닌(apigenin), 캠프페롤(kaempferol), 실리빈, 루테올린, 루테오린-7-글루코사이드, 프롤레틴(phloretin), 아피인(apiin), 헤스페리딘, 설폰화 헤스페리딘, 칼리코신-7-O-β-D-글루코피라노사이드, 소듐 플라본-7-설페이트, 플라본 7-플루오로-4'-히드록시플라본, 4'-클로로4,6-디메톡시칼콘, 소듐 5-히드록시플라본-7-설페이트, 미리세틴, 루틴, 모린, 글리시리진(glycyrrhizin), 비타민 C, D-이소아스코르브 산, D-사카린 1,4-락톤, L-아스코르빈 산-6-헥사데카노에이트(Vcpal), 6-O-아실화 비타민 C, 카테킨, 노르디히드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid), 커큐민(curcumin), N-프로필 갈레이트, 탄닌 산, 엘라그 산, 갈산, 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A), 디에콜(dieckol), 8,8'-비에콜, 프로시아니딘(procyanidine), 고시폴, 셀레콕시브, 니메설라이드, 덱사메타손, 인도메스신(indomethcin), 페노프로펜(fenoprofen), 페닐부타존, 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 살리실레이트(salysylates), 디소듐 크로모글리케이트, 소듐 오로싸이오말레이트(aurothiomalate), 트랜실리스트(transilist), 트랙사녹스(traxanox), 이베르멕틴(ivermectin), 린코마이신(lincomycin) 및 스펙티노마이신(spectinomycin), 설파메톡사졸 및 트리머토프림(trimerthoprim), 네오마이신 설페이트, 3α-아세틸폴리포레닉 산 A (acetylpolyporenic acid A), (25S)-(+)-12α히드록시-3α-메틸카복시아세테이트-24-메틸라노스타-8,24(31)-디엔-26-오익 산, 라노스타노이드(lanostanoid), 폴리포레닉 산 c, PS53(히드로퀴논-술폰산-포름알데히드 폴리머), 폴리(스티렌-4-설포네이트)의 폴리머, VERSA-TL 502, 1-테트라데칸 술폰산, 만델산 축합 폴리머(SAMMA), 1,3-디아세틸벤즈이미다졸-2-티온, N-모노아실화 벤즈이미다졸-2-티온, N,N'-디아실화 벤즈이미다졸-2-티온, 알킬-2-페닐인돌 유도체, 3- 프로판오일벤즈옥사졸-2-티온, N-알킬화 인돌 유도체, N-아실화 인돌 유도체, 벤조 티아졸 유도체, N-치환된 인돌-2- 및 3-카복스아미드 유도체, N-치환된 인돌-2- 및 3-카복스아미드 유도체의 할로겐화 유사체(클로로 및 플루오), 2-(4-히드록시페닐)-3-페닐인돌, 인돌 카르복사미드, 인돌 아세트아미드, 3-벤조일-1-메틸-4-페닐-4-피페리디놀, 벤조일 페닐 벤조에이트 유도체, L-아르기닌 유도체, 구아니듐 HCL , L-NAME, HCN, 리나마린(linamarin), 아미그달린, 헤데라게닌, 에스신, CIS-히노키레시놀(CIS-hinokiresinol) 및/또는 1,3-디-p-히드록시페닐-4-펜텐-1-온이 있지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 1㎎/㎖ 내지 20㎎/㎖의 농도, 또는 약 1㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖의 농도로 히알루로난(HA) 올리고당인 히알루로니다아제 억제제를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 HA 올리고당은 이당류(disaccharide) 또는 사당류(tetrasaccharide)이다. 다른 실시예에서, 상기 HA 올리고당은 반응한 환원 말단을 갖는다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 상기 복합제형 내 히알루로난 분해 효소가 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 유지하거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하고, 및/또는 상기 조성물 중의 인슐린이 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 상기 조성물 중의 인슐린의 초기 수준의 적어도 90% 효능 또는 회복을 유지하거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하고, 및/또는 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 초기 인슐린 순도의 적어도 90%를 유지하거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하고, 및/또는 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 고분자량(HMWt) 인슐린의 종을 2%미만으로 유지하거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하도록 제형화된다. 일 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 상기 조성물 중의 히알루로난 분해 효소가 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상을 유지하거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하도록 제형화된다. 다른 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 상기 인슐린의 순도 또는 효능이 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이거나 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정하되도록 제형화된다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형의 pH는 6.3±0.2, 6.4±0.2, 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2, 또는 약 6.3±0.2, 6.4±0.2, 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2이다. 다른 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형 조성물의 NaCl 농도는 150mM 내지 200mM 사이 또는 160mM 내지 180mM, 또는 약 150mM 내지 200mM 또는 약 160mM 내지 180mM이다. 예를 들어, 상기 NaCl 농도는 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM, 또는 약 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM이다. 일부 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형은 37℃ 또는 약 37℃에서 적어도 3일 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형은 적어도 4일, 적어도 5일 또는 적어도 6일 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형은 6.5 내지 7.5의 pH 범위 또는 약 6.5 내지 7.5의 pH 범위를 유지하기에 충분한 양의 완충제를 함유한다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형 조성물에 함유된 히알루로난 분해 효소들은, 예를 들어 인간을 포함한 동물의 히알루로니다아제와 같은 히알루로니다아제, 특히 이의 가용성 형태, 및/또는 콘드로이티나아제(chondroitinase)를 포함한다. 예시적인 히알루로난 분해 효소들은 히알루로니다아제 및/또는 콘드로이티나아제이다. 일부 실시형태에서, 상기 히알루로난 분해 효소로는 중성 pH에서 활성인 히알루로니다아제이다. 다른 실시형태에서, 상기 히알루로난 분해 효소에는 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol, GPI) 앵커(anchor)가 없거나, 세포에서 발현되는 경우에 멤브레인에 결합되어 있지 않다. 예를 들어, 상기 히알루로난 분해 효소는 GPI 앵커의 전체 또는 일부를 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기의 C-말단 절단(truncation)를 함유한다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 히알루로난 분해 효소는 PH20인 히알루로니다아제이다. PH20 히알루로니다아제의 예시적인 예로는 비인간 또는 인간 PH20 히알루로니다아제가 있다. 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖거나, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산들의 서열을 갖고, 히알루로니다아제 활성을 보유하는 PH20 히알루로니다아제들이 포함되어 있다. 예를 들어, 상기 PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 히알루로니다아제 활성을 보유한다. 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖는 PH20 폴리펩티드들이 포함되어 있다. 변이체들은 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 나타내고 히알루로니다아제 활성을 보유하는 PH20 폴리펩티드들을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 PH20은 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 히알루로니다아제 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 서열번호 4 내지 9 중 어느 하나로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 폴리펩티드들 중 임의의 폴리펩티드, 또는 이의 대립 형질 변이체들 및 다른 변이체들을 포함하는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드인 절단된 PH20이다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 PH20의 양은 0.1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖ 또는 1㎍/㎖ 내지 20㎍/㎖, 또는 약 0.1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖ 또는 약 1㎍/㎖ 내지 20㎍/㎖이다. 예를 들어, 상기 PH20의 양은 5㎍/㎖ 또는 약 5㎍/㎖이다. 다른 실시형태에서, 상기 PH20의 특정 활성은 75유닛(U)/g 내지 120U/㎍이거나 약 75U/g 내지 120U/㎍이거나, 적어도 75유닛(U)/㎍, 80U/㎍, 85U/㎍, 90U/㎍, 100U/㎍, 110U/㎍ 또는 120U/㎍이거나 약 75U/㎍, 80U/㎍, 85U/㎍, 90U/㎍, 100U/㎍, 110U/㎍ 또는 120U/㎍이거나 75U/㎍, 80U/㎍, 85U/㎍, 90U/㎍, 100U/㎍, 110U/㎍ 또는 120U/㎍이다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 히알루로난 분해 효소의 양은 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 또는 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 또는 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 이다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소의 양은 적어도 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이거나, 약 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이거나, 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 히알루로난 분해 효소의 양은 600U/㎖ 또는 약 600U/㎖이다.

예를 들어, 상기 속효성 인슐린은 단량체성이거나, 이량체성 또는 육량체성과 같이 다량체성일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린이다. 다른 실시형태에서, 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린(regular insulin), 예를 들어, 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린이다. 일 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린이고, 본원에서 제공된 안정한 복합제형의 NaCl 농도는 50mM 내지 80mM이다. 상기 속효성 인슐린 중에는 서열번호 103으로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬, 및 서열번호 104로 제시된 아미노산들의 서열을 B 사슬을 구비한 인슐린, 또는 서열번호 123의 88 내지 108번째 아미노산 잔기 위치로서 개시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬, 및 서열번호 123의 25 내지 54번째 아미노산 잔기 위치로서 개시된 아미노산들의 서열을 갖는 B 사슬을 구비한 인슐린과 같은 레귤러 인슐린이다. 상기 인슐린은 재조합 인슐린일 수 있거나, 천연 공급원으로부터 합성되거나 부분적으로 합성되거나, 상기 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 상기 속효성 인슐린은 인슐린 유사체일 수 있다. 인슐린 유사체들의 예시적인 예로는 서열번호 103으로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬, 및 서열번호 147 내지 149 중 어느 하나의 서열번호로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 B 사슬을 구비한 인슐린 중에서 선택된 인슐린 유사체가 있다. 본원에서 제공된 일부 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 147(B사슬)로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린 아스파르트(insulin aspart)이고, 상기 NaCl 농도는 80mM 내지 160mM, 또는 약 80mM 내지 160mM이다. 본원에서 제공된 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 149(B 사슬)로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린 글루리신(insulin glulisine)이고, 상기 NaCl 농도는 80mM 내지 200mM, 또는 약 80mM 내지 200mM이다. 본원에서 제공된 또 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 148(B 사슬)로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린 리스프로(insulin lispro)이고, 상기 NaCl 농도는 50mM 내지 120mM, 또는 약 50mM 내지 120mM이다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 내 인슐린은 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 500U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 500U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)으로 존재한다. 예를 들어, 상기 속효성 인슐린의 양은 적어도 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖ 또는 1,000U/㎖이거나, 약 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖ 또는 1,000U/㎖이거나, 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖ 또는 1,000U/㎖이다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린의 양은 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖이다. 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 인슐린 유사체이고, 상기 히알루로난 분해 효소는 PH20이다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 비금속 결합제 또는 금속 결합제와 같은 완충제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 완충제는 트리스, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트 중에서 선택된다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 완충제는 트리스이다. 상기 완충제의 농도는 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM, 또는 약 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM이다. 예를 들어, 상기 완충제의 농도는 1mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 31mM, 32mM, 33mM, 34mM, 35mM, 36mM, 37mM, 38mM, 39mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 또는 75mM 이상이거나, 약 1mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 31mM, 32mM, 33mM, 34mM, 35mM, 36mM, 37mM, 38mM, 39mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 또는 75mM 이상이거나, 적어도 1mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 31mM, 32mM, 33mM, 34mM, 35mM, 36mM, 37mM, 38mM, 39mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 또는 75mM 이상이다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 완충제의 농도는 30mM 또는 약 30mM이다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형 조성물은 박테리아 유기체에서 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 7일째 날에 일어나도록 상기 조성물의 시료 내 미생물 유기체를 죽이거나 증식을 억제하는 항미생물적 유효량의 보존제를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 보존제의 항미생물적으로 유효량은, 항미생물적 보존제 유효성 시험(antimicrobial preservative effectiveness test, APET)에서 시험되는 경우에 미생물 접종물로 상기 조성물을 접종한 이후에는 접종 후 7일째 날에 박테리아 유기체에서 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소, 접종 후 14일째 날에 박테리아 유기체에서 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 일어나고, 접종 후 28일째 날에 박테리아 유기체에서 적어도 추가적인 증가는 없고, 접종 7일 이후에 균류 유기체에서 적어도 추가적인 증가가 없도록 미생물 유기체를 죽이거나 이의 증식을 억제한다. 다른 실시예에서, 상기 보존제의 항미생물적으로 유효량은, 항미생물적 보존제 유효성 시험(APET)에서 시험되는 경우에 미생물 접종물로 상기 조성물을 접종한 이후에는 접종 후 24시간 정도에 박테리아 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소, 접종 후 7일째 날에 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 있고, 접종 후 28일째 날에 박테리아 유기체에서의 추가적인 증가는 없고, 접종 후 14일째 날에 균류 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소 있으며, 접종 후 28일째 날에 균류 유기체에서의 추가적인 증가는 없도록 미생물 유기체를 죽이거나 이의 증식을 억제한다. 또 다른 실시예에서, 상기 보존제의 항미생물적으로 유효량은, 항미생물적 보존제 유효성 시험(APET)에서 시험되는 경우에 미생물 접종물로 상기 조성물을 접종한 이후에는 접종 후 6시간 정도에는 박테리아 유기체의 적어도 2.0의 log₁₀ 유닛의 감소, 접종 후 24시간 정도에는 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 있고, 미생물 접종물에 의한 상기 조성물의 접종 후 28일 이후에는 박테리아 유기체의 회복이 없으며, 접종 후 7일째 날에는 균류 유기체의 적어도 2.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 있고, 접종 후 28일 이후에는 균류 유기체에서 적어도 추가적인 증가가 없도록 미생물 유기체를 죽이거나 이의 증식을 억제한다.

상기 안정한 복합제형 중의 보존제(들)는 페놀성 보존제(들) 및 비페놀성 보존제(들) 중 하나 이상, 또는 페놀성 보존제(들) 및 비페놀성 보존제(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 보존제(들)는 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 벤질 알코올, 티메로살(thimerosal), 벤잘코늄 클로라이드, 4-클로로-1-부탄올, 클로르헥시딘 디하이드로클로라이드, 클로르헥시딘 디글루코네이트, L-페닐알라닌, EDTA, 브로노폴(bronopol), 페닐머큐릭 아세테이트, 글리세롤, 이미드우레아, 클로르헥시딘, 소듐 디히드로아세테이트, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 세트리미드, 벤제토늄 클로라이드, 에틸 파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤 및 임의의 이의 조합으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 2개, 3개 또는 4개의 상이한 보존제를 함유하는 보존제 혼합물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형은 적어도 하나의 페놀성 보존제를 함유한다. 특정 실시형태에서, 상기 하나 이상의 보존제(들)는 페놀, m-크레졸 또는 페놀 및 m-크레졸이다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서 상기 하나 이상의 보존제의 총량은 0.1% 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.3%, 0.15% 내지 0.325%, 0.15% 내지 0.25%, 0.1% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3% 또는 0.3% 내지 0.4%이거나, 0.1% 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.3%, 0.15% 내지 0.325%, 0.15% 내지 0.25% , 0.1% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3% 또는 0.3% 내지 0.4%(상기 수치를 포함함)이다. 일부 실시예에서, 상기 보존제들은 페놀 및 m-크레졸이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 양은 페놀의 경우 0.1% 내지 0.25%, 또는 약 0.1% 내지 0.25%이고, m-크레졸의 경우 0.05% 내지 0.2%, 또는 약 0.05% 내지 0.2%이거나, 페놀의 경우 0.10% 내지 0.2%, 또는 약 0.10% 내지 0.2%이고, m-크레졸의 경우 0.6% 내지 0.18%, 또는 약 0.6% 내지 0.18%이거나, 페놀의 경우 0.1% 내지 0.15%, 또는 약 0.1% 내지 0.15%이고, m-크레졸의 경우 0.8% 내지 0.15%, 또는 약 0.8% 내지 0.15%이거나, 페놀의 경우 0.10% 내지 0.15%, 또는 약 0.10% 내지 0.15%이고, m-크레졸의 경우 0.06% 내지 0.09%, 또는 약 0.06% 내지 0.09%이거나, 페놀의 경우 0.12% 내지 0.18%, 또는 약 0.12% 내지 0.18%이고, m-크레졸의 경우 0.14% 내지 0.22%, 또는 약 0.14% 내지 0.22%이다. 예시적인 복합제형에서, 상기 보존제(들)는 페놀 및 m-크레졸이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 양은 페놀의 경우 0.1% 또는 약 0.1%이고, m-크레졸의 경우 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀의 경우 0.1% 또는 약 0.1%이고, m-크레졸의 경우 0.15% 또는 약 0.15%이거나, 페놀의 경우 0.125% 또는 약 0.125%이고, m-크레졸의 경우 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀의 경우 0.13% 또는 약 0.13%이고, m-크레졸의 경우 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀의 경우 0.13% 또는 약 0.13%이고, m-크레졸의 경우 0.08% 또는 약 0.08%이거나, 페놀의 경우 0.15% 또는 약 0.15%이고, m-크레졸의 경우 0.175% 또는 약 0.175%이거나, 페놀의 경우 0.17% 또는 약 0.17%이고, m-크레졸의 경우 0.13% 또는 약 0.13%이다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올류, 염 또는 계면활성제 중에서 선택된 안정화제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 단일 안정화제를 함유한다. 다른 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 상이한 안정화제들을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 안정화제는 L-아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 리신, 메티오닌, 프롤린, Lys-Lys, Gly-Gly, 트리메틸아민 옥사이드(Trimethylamine oxide, TMAO), 베타인 또는 이의 염 중에서 선택된 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아민이다. 특정 실시예에서, 상기 아미노산은 글리신 또는 프롤린이다. 상기 아미노산의 농도는 0.01M 내지 1M, 0.01M 내지 0.1M , 0.1M 내지 0.75M 또는 0.2M 내지 0.5M, 또는 약 0.01M 내지 1M, 0.01M 내지 0.1M, 0.1M 내지 0.75M이 또는 0.2M 내지 0.5M(상기 수치를 포함함)이다. 일부 실시예에서, 상기 안정화제는 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 수크로스 및 트레할로오스 중에서 선택되는 당 또는 폴리올이지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.005% 내지 1.0%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05% 또는 0.01% 내지 0.02%, 또는 약 0.005% 내지 1.0%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05% 또는 0.01% 내지 0.02%이다. 예를 들어, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이거나, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.015%, 약 0.02%, 약 0.025%, 약 0.03%, 약 0.035%, 약 0.04%, 약 0.045%, 약 0.05%, 약 0.055%, 약 0.06%, 약 0.065%, 약 0.07%, 약 0.08% 또는 약 0.9%이다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 계면활성제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트 중에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 중에서 선택된다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 안정화제는 폴록사머 188인 계면활성제이고, 질량 농도(w/v) 비율(%)로서 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 양으로 제공된다. 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 안정화제는 폴리소르베이트 20인 계면활성제이고, 질량 농도(w/v) 비율(%)로서 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 양으로 제공된다. 또 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 안정화제는 폴리소르베이트 80인 계면활성제이고, 질량 농도(w/v) 비율(%)로서 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 양으로 제공된다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 245mOsm/㎏ 내지 305mOsm/㎏ 또는 약 245mOsm/㎏ 내지 305mOsm/㎏의 삼투성을 유지하기 위해 글리세린, 염, 아미노산, 폴리알코올 또는 트레할로오스 중에서 선택되는 등장화제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 등장화제는 상기 제형의 삼투성을 약 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 300mOsm/㎏ 또는 305mOsm/㎏, 또는 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 300mOsm/㎏ 또는 305mOsm/㎏ 정도로 유지한다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 등장화제는 상기 제형의 삼투성을 275mOsm/㎏ 또는 약 275mOsm/㎏으로 유지한다. 일 실시형태에서, 상기 등장화제는 60mM 미만, 55mM 미만, 50mM 미만, 45mM 미만, 40mM 미만, 35mM 미만, 30mM 미만, 25mM 미만, 20mM 미만, 15mM 미만, 또는 10mM 미만의 농도로 복합제형에 존재하는 글리세린이다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 인슐린 아스파르트인 인슐린 유사체이고, 상기 제형은 글리세린을 20mM 내지 50mM 또는 약 20mM 내지 약 50mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 함유한다. 다른 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린 또는 인슐린 리스프로이고, 상기 제형은 글리세린을 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 60mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 항산화제를 함유한다. 다른 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 계면활성제 및/또는 히알루로난 올리고당류를 함유하고, 또한 항산화제를 포함한다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형에 포함된 항산화제는 시스테인, 트립토판 및 메티오닌 중에서 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 항산화제는 메티오닌이다. 상기 안정한 복합제형 중의 항산화제는 5mM 내지 50mM, 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도, 또는 약 5mM 내지 50mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 20mM 또는 약 10mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 존재한다. 예시적인 실시형태에서, 상기 항산화제는 메티오닌이고, 상기 메티오닌의 농도는 10mM 내지 20mM, 또는 약 10mM 내지 20mM이다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 아연을 함유한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린, 인슐린 리스프로 또는 인슐린 아스파르트이고, 상기 제형은 아연을 함유한다. 상기 안정한 복합제형 중의 아연은 아연 옥사이드, 아연 아세테이트 또는 아연 클로라이드 중에서 선택되지만 이에 제한되지 않으며, 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.001 내지 0.1㎎, 0.001 내지 0.05㎎/100U, 또는 0.01 내지 0.05㎎/100U의 농도, 또는 약 0.001 내지 0.1㎎/100U, 0.001 내지 0.05㎎/100U, 또는 0.01 내지 0.05㎎/100U의 농도로 존재한다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 니코틴아미드, 니코틴산, 니아신(niacin), 니아신아미드, 비타민 B3 및/또는 이의 염 및/또는 이의 임의의 조합 중에서 선택되는 니코틴성 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 니코틴성 화합물(들)은 1mM 내지 150mM, 10mM 내지 150mM, 또는 50mM 내지 100mM의 농도, 약 1mM 내지 150mM, 10mM 내지 150mM, 또는 50mM 내지 100mM의 농도, 또는 약 80mM의 농도로 존재한다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 선택적으로 아르기닌, 글루탐산, 및/또는 이의 염 및/또는 이의 조합 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산(들)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 아미노산들은 1mM 내지 100mM, 또는 10mM 내지 100mM의 농도, 약 1mM 내지 약 100mM, 또는 약 10mM 내지 약 100mM의 농도, 또는 약 30mM, 50mM 또는 80mM의 농도로 존재한다.

본원에서 제공된 예시적인 안정한 복합제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 7.6의 pH를 가지며, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 속효성 인슐린 유사체; 10mM 내지 50mM, 또는 약 10mM 내지 50mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 트리스 완충제; 50mM 내지 200mM, 또는 약 50mM 내지 200mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 NaCl; 5mM 내지 50mM, 또는 약 5mM 내지 50mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 0mM 내지 50mM, 또는 약 0mM 내지 50mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 글리세린; 0.01% 내지 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 0.5%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 계면활성제; 및 0.1% 내지 0.25%, 또는 약 0.1% 내지 0.25%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 페놀 및 0.05% 내지 0.2%, 또는 약 0.05% 내지 0.2%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 이러한 예시적인 안정한 복합제형은 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.001 내지 0.1㎎의 농도로 아연을 더 함유한다. 일 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형 중의 보존제들은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸이거나, 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸이거나, 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸이다.

본원에서 제공된 예시적인 안정한 복합제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 7.6의 pH를 가지며, 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 인슐린 리스프로인 속효성 인슐린; 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 25mM 내지 35mM, 또는 약 25mM 내지 35mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 트리스 완충제; 50mM 내지 120mM, 또는 약 50mM 내지 120mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 NaCl; 10mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 40mM 내지 60mM, 또는 약 40mM 내지 60mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 글리세린; 0.01% 내지 0.05%, 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 계면활성제; 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.017 내지 0.024㎎의 농도의 아연; 및 0.08% 내지 0.17%, 또는 약 0.08% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 페놀 및 0.07% 내지 0.17%, 또는 약 0.07% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)를 함유한다. 일 실시형태에서, 상기 NaCl 농도는 70mM 내지 100mM, 또는 약 70mM 내지 100mM이다. 다른 실시형태에서, 상기 pH는 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2 또는 7.4±0.2, 또는 약 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2 또는 7.4±0.2이다. 일 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형 중의 보존제들은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸이거나, 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸이거나, 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸이다.

본원에서 제공된 예시적인 안정한 복합제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 7.6의 pH를 가지며, 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 인슐린 아스파르트인 속효성 인슐린; 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 25mM 내지 35mM 또는 약 25mM 내지 35mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 트리스 완충제; 80mM 내지 160mM 또는 약 80mM 내지 160mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 NaCl; 10mM 내지 30mM 또는 약 10mM 내지 30mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 20mM 내지 50mM 또는 약 20mM 내지 50mM 의 농도(상기 수치를 포함함)의 글리세린; 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 계면활성제; 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.017 내지 0.024㎎의 농도의 아연; 및 0.08% 내지 0.17%, 또는 약 0.08% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 페놀 및 0.07% 내지 0.17%, 또는 약 0.07% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)를 함유한다. 일 실시형태에서, 상기 NaCl 농도는 70mM 내지 100mM, 또는 약 70mM 내지 100mM이다. 다른 실시형태에서, 상기 pH는 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2, 또는 약 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2이다. 일 실시형태에서, 상기 안정한 복합제형 중의 보존제들은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸이거나, 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸이거나, 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸이거나, 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸이다.

본원에서 제공된 예시적인 안정한 복합제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 7.6의 pH를 가지며, 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 인슐린 글루리신인 속효성 인슐린; 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 25mM 내지 35mM 또는 약 25mM 내지 35mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 트리스 완충제; 80mM 내지 200mM 또는 약 80mM 내지 200mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 NaCl; 10mM 내지 30mM 또는 약 10mM 내지 30mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 60mM 의 농도(상기 수치를 포함함)의 글리세린; 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 폴록사머 188인 계면활성제; 및 0.08% 내지 0.17%, 또는 약 0.08% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 페놀 및 0.07% 내지 0.17%, 또는 약 0.07% 내지 0.17%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)를 함유한다. 일 실시형태에서, 상기 NaCl 농도는 100mM 내지 150mM, 또는 약 100mM 내지 150mM이다. 다른 실시형태에서, 상기 pH는 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2, 또는 약 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2이다.

일 실시형태에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖거나, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있는 인간 PH20이다. 예를 들어, 상기 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖거나, 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체이며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 다른 실시예에서, 상기 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 482번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열을 가지거나, 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 482번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체이며, 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 예시적인 안정한 복합제형에서, 상기 PH20 폴리펩티드는 서열번호 4 내지 9 중 어느 하나의 서열번호로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중의 히알루로난 분해 효소 또는 PH20은 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 생성되거나 발현될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 PH20은 rHuPH20로 명명된다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 다중 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 안정한 복합제형의 부피는 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖ 내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 또는 3㎖ 내지 10㎖, 또는 약 0.5㎖ 내지 50㎖, 약 1㎖ 내지 40㎖, 약 1㎖ 내지 20㎖, 약 1㎖ 내지 10㎖ 또는 약 3㎖ 내지 10㎖(상기 수치를 포함함)일 수 있다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소 또는 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 전달용으로 제형화될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 안정한 복합제형은 폐쇄 루프 시스템에 의해 제공되는 연속적인 피하 인슐린 주입을 이용하여 전달용으로 제형화된다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 주사기 또는 바이알, 폐쇄 루프 시스템, 인슐린 펌프, 및/또는 인슐린 펜에 제공될 수 있다.

안정한 복합제형이 투여되는 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 복합제형을 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에 투여함으로써 당뇨병을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 치료될 당뇨병으로는 I형 당뇨병, II형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병을 들 수 있다. 본원에서는 또한 본원에서 제공된 안정한 복합제형을 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에 투여함으로써 대상체에서의 혈당치를 조절하기 위한 방법이 제공된다. 본원의 방법을 실시하는 경우, 상기 안정한 복합제형은, 예를 들어 주사기 또는 인슐린 펜을 통해 또는 연속적인 피하 주입에 의해 피하 또는 복강 내에 투여된다. 본원의 방법을 실시하는 경우, 상기 안정한 복합제형은 식전 인슐린 요법으로서 식사 전에 투여될 수 있다. 본원에서 제공된 방법에서, 상기 안정한 복합제형은 인슐린 펌프 또는 폐쇄 루프 시스템 경유하는 것과 같은 연속적인 피하 인슐린 주입을 달성하기 위한 전달 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공된 방법들은 설포닐우레아류, 비구아나이드류, 메글리티나이드(meglitinide)류, 티아졸리딘디온류, 알파-글루코시다아제 억제제들, 글루카곤 유사 펩티드(glucagon-like peptide, GLP) 유사체들 및 위 억제 펩티드(gastric inhibitory peptide, GIP) 유사체들을 포함한 펩티드 유사체들, 및 DPP-4 억제제들 중에서 선택되지만 이에 제한되지 않는 다른 당뇨병 치료 약물을 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 상기 히알루로난 분해 효소에 안정성을 부여하는 양의 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 Lys-Lys의 농도는 5mM 내지 120mM, 10mM 내지 100mM, 10mM 내지 50mM, 30mM 내지 110mM, 30mM 내지 80mM, 50mM 내지 100mM 또는 100mM 내지 120m, 또는 약 5mM 내지 120mM, 10mM 내지 100mM, 10mM 내지 50mM, 30mM 내지 110mM, 30mM 내지 80mM, 50mM 내지 100mM 또는 100mM 내지120mM이다. 다른 실시예에서, 상기 Lys-Lys의 농도는 적어도 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 또는 120mM이거나, 적어도 약 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 또는 120mM 이거나, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 또는 120mM이다. 본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 상기 히알루로난 분해 효소가 37℃에서 적어도 3일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 유지하도록 하기에 충분한 양의 리실 리신(Lys-Lys)를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 적어도 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 동안 37℃에서 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 유지한다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 37℃에서 적어도 1개월 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 유지한다. 다른 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다.

본원에서 제공된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 제형의 pH는 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.4, 6.8 내지 7.8, 7.0 내지 7.6 또는 6.8 내지 7.2, 또는 약 6.5내지 8.0, 6.5 내지 7.4, 6.8 내지 7.8 사이, 7.0 내지 7.6 또는 6.8 내지 7.2(상기 수치를 포함함)이다. 예를 들어, 상기 제형의 pH는 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이거나, 약 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이거나, 적어도 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 본원에서 제공된 임의의 조성물은 안정화제를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염 및 계면활성제 중에서 선택되는 안정화제를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.0005% 내지 1.0%, 0.0005% 내지 0.005%, 0.001% 내지 0.01%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.01% 내지 0.02%, 또는 약 0.0005% 내지 1.0%, 0.0005% 내지 0.005%, 0.001% 내지 0.01%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 또는 0.01% 내지 0.02%(상기 수치를 포함함)이다. 다른 실시예에서, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이거나, 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이거나, 적어도 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이다. 상기 계면활성제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트 중에서 선택될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된다.

일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 또한 항산화제를 함유한다. 예를 들어, 상기 조성물은 시스테인, 트립토판 및 메티오닌 중에서 선택되는 항산화제를 함유한다. 특정 실시예에서, 상기 항산화제는 메티오닌이다. 일부 실시예에서, 상기 항산화제는 5mM 내지 50mM, 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도, 또는 약 5mM 내지 50mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 20mM 또는 약 10mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 존재한다. 다른 실시예에서, 상기 항산화제는 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 농도, 약 5mM, 약 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 농도, 또는 적어도 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 농도로 존재한다.

일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 또한 245mOsm/㎏ 내지 500mOsm/㎏의 삼투성 또는 약 245mOsm/㎏ 내지 500mOsm/㎏의 삼투성(상기 수치를 포함함)을 유지하기 위해 등장화제를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 제형의 삼투압을 약 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 300mOsm/㎏, 350mOsm/㎏, 400mOsm/㎏, 450mOsm/㎏ 또는 500mOsm/㎏, 또는 적어도 약 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 300mOsm/㎏, 350mOsm/㎏, 400mOsm/㎏, 450mOsm/㎏ 또는 500mOsm/㎏로 유지하기 위해 등장화제를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 등장화제는 글리세린, NaCl, 아미노산, 폴리알코올류 또는 트레할로오스 중에서 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 등장화제는 NaCl이고, 상기 NaCl의 농도는 20mM 내지 200mM, 40mM 내지 160mM, 80mM 내지 120mM, 20mM 내지 80mM 또는 50mM 내지 150mM, 또는 약 20mM 내지 200mM, 약 40mM 내지 160mM, 약 80mM 내지 120mM, 약 20mM 내지 80mM 또는 50mM 내지 150mM(상기 수치를 포함함)이다. 다른 실시예에서, 상기 등장화제는 NaCl이고, 상기 NaCl의 농도는 0mM 내지 150mM, 10mM 내지 50mM, 50mM 내지 100mM 및 100mM 내지 130mM 사이, 또는 약 0mM 내지 150mM, 10mM 내지 50mM, 50mM 내지 100mM 및 100mM 내지 130mM이다. 일부 실시예에서, 상기 NaCl은 150mM 미만, 140mM 미만, 130mM 미만, 120mM 미만, 110mM 미만, 100mM 미만, 90mM 미만, 80mM 미만, 70mM 미만, 60mM 미만, 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만, 10mM 미만, 또는 그 미만으로 존재한다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 본원에서 제공된 임의의 조성물은 또한 6.5 내지 8.0, 6.8 내지 7.8, 또는 7.0 내지 7.6, 6.5 내지 7.2, 6.8 내지 7.4의 pH 범위, 또는 약 6.5 내지 8.0, 6.8 내지 7.8, 또는 약 7.0 내지 7.6, 6.5 내지 7.2, 6.8 내지 7.4의 pH 범위(상기 수치를 포함함)를 유지하기에 충분한 양의 완충제를 함유할 수도 있다. 일부 실시예에서, 상기 완충제는 트리스, 히스티딘, 포스페이트 및 시트레이트 중에서 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 완충제는 소듐 포스페이트인 포스페이트이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 완충제는 트리스이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물 중의 완충제의 농도는 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 80mM, 5mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM, 또는 약 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 80mM, 5mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM(상기 수치를 포함함)이다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 본원에서 제공된 임의의 조성물 내 히알루로난 분해 효소는 히알루로니다아제 또는 콘드로이티나아제일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 중성 pH에서 활성인 히알루로니다아제이다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소에는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커가 없으며, 세포에서 발현될 때 멤브레인에 결합되어 있지 않다. 다른 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 GPI 앵커 전체 또는 일부를 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기들의 C-말단 절단을 함유하는 히알루로난 분해 효소이다.

본원에서 제공된 조성물의 다른 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 PH20인 히알루로니다아제 또는 이의 C-말단 절단된 단편이다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 비인간 또는 인간 PH20인 PH20이다. 일부 실시예에서, 상기 PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖거나, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산들의 서열을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 예를 들어, 상기 PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 상기 조성물의 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열을 갖는 PH20 폴리펩티드이거나, 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체이며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 서열번호 4 내지 9 중 임의의 서열번호로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 C-말단 절단된 PH20이다.

본원에서 제공된 조성물의 일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 양은 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 200U/㎖ 내지 800U/㎖, 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 150U/㎖ 내지 300U/㎖, 또는 약 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 200U/㎖ 내지 800U/㎖, 100U/㎖ 내지 500U/㎖, 또는 150U/㎖ 내지 300U/㎖(상기 수치를 포함함)이다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소의 양은 적어도 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이거나, 약 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이거나, 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖이다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 조성물의 일부 실시예에서, Lys-Lys의 농도는 5mM 내지 50mM(상기 수치를 포함함) 이다. 예를 들어, Lys-Lys의 농도는 적어도 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM 또는 50mM이고, 및/또는 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만 또는 10mM 미만이다.

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 리실 리신(Lys-Lys)을 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물의 pH는 6.5 내지 7.2 , 또는 약 6.5 내지 7.2 이고, 상기 조성물은 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 500U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 히알루로난 분해 효소; 5mM 내지 30mM 또는 약 5mM 내지 30mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 Lys-Lys; 140mM NaCl 미만의 농도의 NaCl; 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴리소르베이트 80인 계면활성제; 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 및 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 50mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 소듐 포스페이트를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 PH20 또는 이의 C-말단 절단된 단편이다.

일부 실시예에서, 본원에서 제공된 조성물의 부피는 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖ 내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖, 또는 3㎖ 내지 10㎖, 또는 약 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖ 내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖, 또는 3㎖ 내지 10㎖(상기 수치를 포함함)이다. 상기 조성물은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소, 또는 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 전달용으로 제형화될 수 있다. 본원에서는 또한 본원에서 제공된 조성물 중 임의의 조성물을 함유하는 주사기 또는 바이알이 제공된다.

본원에서는 또한 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 히알루로난 분해 효소에 안정을 제공하는 양의 리실 리신(Lys-Lys), 및 속효성 인슐린을 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, Lys-Lys의 농도는 30mM 내지 120mM, 50mM 내지 105mM 또는 80mM 내지 100mM이다(상기 수치를 포함함). 본원에서 제공된 조성물에서, 상기 속효성 인슐린은 단량체성, 이량체성 또는 육량체성일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 속효성 인간 인슐린이다. 다른 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린이다. 특정 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린인 레귤러 인슐린이다. 일부 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 서열번호 103으로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬 및 서열번호 104로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 B 사슬을 구비한 인슐린, 또는 서열번호 123의 88 내지 108번째 아미노산 잔기 위치로서 개시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬 및 서열번호 123의 25 내지 54번째 아미노산 잔기 위치로서 개시된 아미노산들의 서열을 갖는 B 사슬을 구비한 인슐린인 레귤러 인슐린이다. 본원에서 제공된 조성물의 또 다른 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 재조합 인슐린이다. 상기 속효성 인슐린은 합성되거나 부분적으로 합성될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 인슐린은 단리된다.

본원에서 제공된 조성물의 다른 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 인슐린 유사체이다. 일부 실시예에서, 상기 인슐린 유사체는 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로 및 인슐린 글루리신 중에서 선택된다. 예를 들어, 상기 인슐린 유사체는 서열번호 103으로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 A 사슬 및 서열번호 147 내지 149 중 어느 하나의 서열번호로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 B 사슬을 구비한 인슐린 중에서 선택된다. 본원에서 제공된 임의의 조성물에서, 상기 속효성 인슐린은 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 20U/㎖ 내지 500U/㎖, 50U/㎖ 내지 300U/㎖ 또는 200U/㎖ 내지 800U/㎖의 양, 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 20U/㎖ 내지 500U/㎖, 50U/㎖ 내지 약 300U/㎖ 또는 200U/㎖ 내지 800U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 속효성 인슐린의 양은 적어도 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖ 또는 1,000U/㎖이거나, 약 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖ 또는 1,000U/㎖이거나, 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖ 또는 1,000U/㎖이다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 히알루로난 분해 효소에 안정성을 제공하는 양의 리실 리신(Lys-Lys) 및 속효성 인슐린을 함유하는 본원에서 제공된 조성물의 특정 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 인슐린 유사체이고, 상기 히알루로난 분해 효소는 PH20 또는 이의 C-말단 절단된 단편이다. 특정 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 글루리신인 인슐린 유사체이고, Lys-Lys의 농도는 50 내지 105mM이다. 다른 실시예에서, 상기 속효성 인슐린은 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로인 인슐린 유사체이고, Lys-Lys의 농도는 80 내지 100mM이다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 히알루로난 분해 효소에 안정성을 제공하는 양의 리실 리신(Lys-Lys) 및 속효성 인슐린을 함유하는 본원에서 제공된 임의의 조성물은 단일회 투여용이거나, 다중 투여용일 수 있다. 상기 조성물이 다중 투여용인 실시예에서, 상기 조성물은 보존제 또는 보존제들의 혼합물의 항미생물학적 유효량을 함유한다. 상기 제형 내 보존제(들)는 페놀성 보존제(들) 및 비페놀성 보존제(들) 중 하나 이상, 또는 페놀성 보존제(들) 및 비페놀성 보존제(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 보존제(들)는 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 벤질 알코올, 티메로살(thimerosal), 벤잘코늄 클로라이드, 4-클로로-1-부탄올, 클로르헥시딘 디하이드로클로라이드, 클로르헥시딘 디글루코네이트, L-페닐알라닌, EDTA, 브로노폴(bronopol), 페닐머큐릭 아세테이트, 글리세롤, 이미드우레아, 클로르헥시딘, 소듐 디히드로아세테이트, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 세트리미드, 벤제토늄 클로라이드, 에틸 파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤 및 임의의 이의 조합 중에서 선택된다. 본원에서 제공된 다중 투여용 조성물의 일부 실시예에서, 상기 제형은 단일 보존제를 함유한다. 본원에서 제공된 다중 투여용 조성물의 다른 실시예에서, 상기 제형은 2개, 3개 또는 4개 상이한 보존제들을 함유하는 보존제들의 혼합물을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 페놀성 보존제를 함유한다. 다른 실시예에서, 상기 보존제(들)는 페놀, m-크레졸, 또는 페놀 및 m-크레졸이다.

본원에서 제공된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 제형 내 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 상기 하나 이상의 보존제의 총량은 0.1% 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.3%, 0.15% 내지 0.325%, 0.15% 내지 0.25%, 0.1% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3% 또는 0.3% 내지 0.4%이거나, 0.1%와 0.4% 사이, 0.1%와 0.3% 사이, 0.15%와 0.325% 사이, 0.15%와 0.25% 사이, 0.1%와 0.2% 사이, 0.2%와 0.3% 사이 또는 0.3%와 0.4% 사이(상기 수치를 포함함)이다. 상기 보존제들이 페놀 및 m-크레졸인 본원에서 제공된 조성물의 특정 실시예에서, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 양은 페놀이 0.1% 내지 0.25%, 또는 약 0.1% 내지 0.25%이고, m-크레졸이 0.05% 내지 0.2%, 또는 약 0.05% 내지 0.2%이거나, 페놀이 0.10% 내지 0.2%, 또는 약 0.10% 내지 0.2%이고, m-크레졸이 0.06% 내지 0.18%, 또는 약 0.06% 내지 0.18%이거나, 페놀이 0.1% 내지 0.15%, 또는 약 0.1% 내지 0.15%이고, m-크레졸이 0.08% 내지 0.15%, 또는 약 0.08% 내지 0.15%이거나, 페놀이 0.10% 내지 0.15%, 또는 약 0.10% 내지 0.15%이고, m-크레졸이 0.06% 내지 0.09%, 또는 약 0.06% 내지 0.09%이거나, 페놀이 0.12% 내지 0.18%, 또는 약 0.12% 내지 0.18%이고, m-크레졸이 0.14% 내지 0.22%, 또는 약 0.14% 내지 0.22%(상기 수치를 포함함)이다. 상기 보존제들이 페놀 및 m-크레졸인 본원에서 제공된 조성물의 다른 특정 실시예에서, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 양은 페놀이 0.1% 또는 약 0.1%이고, m-크레졸이 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀이 0.1% 또는 약 0.1%이고, m-크레졸이 0.15% 또는 약 0.15%이거나, 페놀이 0.125% 또는 약 0.125%이고, m-크레졸이 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀이 0.13% 또는 약 0.13%이고, m-크레졸이 0.075% 또는 약 0.075%이거나, 페놀이 0.13% 또는 약 0.13%이고, m-크레졸이 0.08% 또는 약 0.08%이거나, 페놀이 0.15% 또는 약 0.15%이고, m-크레졸이 0.175% 또는 약 0.175%이거나, 페놀이 0.17% 또는 약 0.17%이고, m-크레졸이 0.13% 또는 약 0.13%이다.

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 히알루로난 분해 효소에 안정성을 제공하는 양의 리실 리신(Lys-Lys) 및 속효성 인슐린을 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물의 pH는 6.8 내지 7.4, 또는 약 6.8 내지 7.4 이고, 상기 조성물은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 인슐린 글루리신인 속효성 인슐린 유사체; 50mM 내지 105mM 또는 약 50mM 내지 105mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 Lys-Lys; 100mM 미만의 농도의 NaCl; 0.0005% 내지 0.005% 또는 약 0.0005% 내지 0.005%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴리소르베이트 20인 계면활성제; 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 및 0.1% 내지 0.25% 또는 약 0.1% 내지 0.25%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 페놀, 및 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 0.2%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 함유하는 보존제(들)를 함유한다.

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 히알루로난 분해 효소에 안정성을 제공하는 양의 리실 리신(Lys-Lys), 및 속효성 인슐린을 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물의 pH는 6.8 내지 7.4, 또는 약 6.8 내지 7.4이고, 상기 조성물은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 PH20인 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 약 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로인 속효성 인슐린 유사체; 80mM 내지 100mM 또는 약 80mM 내지 100mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 Lys-Lys; 30mM 미만의 농도의 NaCl; 0.0005% 내지 0.005% 또는 약 0.0005% 내지 0.005%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴리소르베이트 20인 계면활성제; 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 및 0.1% 내지 0.25% 또는 약 0.1% 내지 0.25%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 페놀, 및 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 0.2%의 질량 농도(w/v) 비율(%)의 m-크레졸을 함유하는 보존제(들)를 함유한다.

일부 실시예에서, 본원에서 제공된 조성물의 부피는 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖ 내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 또는 3㎖ 내지 10㎖, 또는 약 0.5㎖ 내지 50㎖, 약 1㎖ 내지 40㎖, 약 1㎖ 내지 20㎖, 약 1㎖ 내지 10㎖ 또는 3㎖ 내지 10㎖(상기 수치를 포함함)이다. 상기 조성물은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소 또는 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 전달용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 연속적인 피하 인슐린 주입을 이용하여 전달용으로 제형화된다. 또한 본원에서는 본원에서 제공된 임의의 조성물을 함유하는 주사기 또는 바이알이 제공된다.

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양, 및 상기 히알루로난 분해 효소가 37℃에서 적어도 3일 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 보유하기에 충분한 양의 MgCl₂를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 50mM 내지 150mM, 75mM 내지 125mM 또는 80mM 내지 100mM의 농도, 또는 약 50mM 내지 150mM, 75mM 내지 125mM 또는 80mM 내지 100mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 MgCl₂를 함유한다. 예를 들어, 상기 조성물은 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM 또는 150mM의 농도, 또는 약 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM 또는 150mM의 농도, 또는 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM 또는 150mM의 농도로 MgCl₂를 함유한다. 상기 조성물의 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 37℃에서 적어도 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%를 보유한다. 예를 들어, 상기 히알루로난 분해 효소는 37℃에서 적어도 1개월 동안 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 50%, 예를 들어 초기 히알루로니다아제 활성의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 보유한다.

히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 MgCl₂를 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.4, 6.8 내지 7.8, 7.0 내지 7.6 또는 6.8 내지 7.2, 또는 약 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.4, 6.8 내지 7.8, 7.0 내지 7.6 또는 6.8 내지 7.2의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 조성물의 pH는 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이거나, 약 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이거나, 적어도 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2, 7.6±0.2, 7.7±0.2 또는 7.8±0.2이다. 상기 조성물은 아미노산, 아미노산 유도체, 아민, 당, 폴리올, 염 및 계면활성제 중에서 선택되는 안정화제를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.0005% 내지 1.0%, 0.0005% 내지 0.005%, 0.001% 내지 0.01%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05% 또는 0.01% 내지 0.02%, 또는 약 0.0005% 내지 1.0%, 0.0005% 내지 0.005%, 0.001% 내지 0.01%, 0.01% 내지 0.5%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05% 또는 0.01% 내지 0.02%(상기 수치를 포함함)이다. 예를 들어, 상기 안정화제는 계면활성제이고, 상기 제형에서 질량 농도(w/v) 비율(%)로서의 계면활성제의 양은 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이거나, 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이거나, 적어도 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.9%이다. 일부 실시예에서, 상기 계면활성제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트 중에서 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택된다.

일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 MgCl₂를 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 시스테인, 트립토판 및 메티오닌 중에서 선택되는 항산화제를 함유한다. 특정 실시예에서, 상기 항산화제는 메티오닌이다. 일부 실시예에서, 상기 항산화제는 5mM 내지 50mM, 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도, 또는 약 5mM 내지 50mM, 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)로 존재한다. 예를 들어, 상기 항산화제는 메티오닌이고, 그 농도는 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM이거나, 약 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM이거나, 적어도 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 6.5 내지 8.0, 6.8 내지 7.8, 7.0 내지 7.6, 6.5 내지 7.2 또는 6.8 내지 7.4의 pH 범위, 또는 약 6.5 내지 8.0, 6.8 내지 7.8, 7.0 내지 7.6, 6.5 내지 7.2 또는 6.8 내지 7.4의 pH 범위를 유지하기에 충분한 양으로 완충제를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 완충제는 트리스, 히스티딘, 포스페이트 및 시트레이트 중에서 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 완충제는 히스티딘 염산염이다. 본원에서 제공된 조성물 중의 완충제의 농도는 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 80mM, 5mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM, 또는 약 1mM 내지 100mM, 10mM 내지 80mM, 5mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM일 수 있다.

일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 MgCl₂를 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 히알루로니다아제 또는 콘드로이티나아제인 히알루로난 분해 효소를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 중성 pH에서 활성인 히알루로니다아제이다. 다른 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소에는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커가 결여되거나, 세포에서 발현될 때 멤브레인에 결합되지 않는다. 예를 들어, 상기 히알루로난 분해 효소는 GPI 앵커 전체 또는 일부를 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기들의 C-말단 절단을 함유하는 히알루로난 분해 효소이다.

다른 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 PH20 또는 이의 C-말단 절단된 단편인 히알루로니다아제이다. PH20은 비인간 또는 인간 PH20일 수 있다. 본원에서 제공된 조성물의 일부 실시예에서, PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열을 가지거나, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산들의 서열을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 예를 들어, PH20은 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 다른 실시예에서, 상기 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열을 가지거나, 서열번호 1로 제시된 아미노산들의 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C-말단 절단을 함유하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체이며 히알루로니다아제 활성을 보유하고 있다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소는 서열번호 4 내지 9 중 어느 하나의 서열번호로 제시된 아미노산들의 서열을 갖는 C-말단 절단된 PH20이다.

일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 MgCl₂를 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 히알루로난 분해 효소를 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 200U/㎖ 내지 800U/㎖, 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 150U/㎖ 내지 300U/㎖의 양, 또는 약 10U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 50U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 200U/㎖ 내지 800U/㎖, 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 150U/㎖ 내지 300U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)으로 함유한다. 예를 들어, 상기 조성물은 히알루로난 분해 효소를 적어도 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖의 양, 또는 약 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖의 양, 또는 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 45U/㎖, 50U/㎖, 55U/㎖, 60U/㎖, 65U/㎖, 70U/㎖, 75U/㎖, 80U/㎖, 85U/㎖, 90U/㎖, 95U/㎖, 100U/㎖, 105U/㎖, 110U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 170U/㎖, 180U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖ 또는 2,000U/㎖의 양으로 함유한다.

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 치료학적으로 유효한 양 및 MgCl₂를 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물의 pH는 6.5 내지 7.2, 또는 약 6.5 내지 7.2이고, 상기 조성물은 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 500U/㎖의 양(상기 수치를 포함함)의 히알루로난 분해 효소; 50mM 내지 150mM 또는 약 50mM 내지 150mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 MgCl₂; 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 비율(%)(상기 수치를 포함함)의 폴리소르베이트 80인 계면활성제; 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 20mM의 농도(상기 수치를 포함함)의 메티오닌; 및 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 50mM 의 농도(상기 수치를 포함함)의 히스티딘/HCl을 함유한다.

일부 실시예에서, 본원에서 제공된 조성물의 부피는 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 또는 3㎖ 내지 10㎖, 또는 약 0.5㎖ 내지 50㎖, 1㎖ 내지 40㎖, 1㎖ 내지 20㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 또는 3㎖ 내지 10㎖이다. 상기 조성물은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소 또는 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 전달용으로 제형화될 수 있다. 본원에서는 또한 본원에서 제공된 임의의 조성물을 함유하는 주사기 또는 바이알이 제공된다.

레귤러 인슐린 또는 신속 작용 인슐린 유사체(예를 들어, 아스파르트, 리스프로 또는 글루리신 또는 기타 인슐린 유사체)와 같은 인슐린을 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 당뇨병을 치료하기 위한 방법 및 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서는 본원에서 제공된 임의의 상기 안정한 조성물을 대상체에 치료학적으로 유효한 양으로 투여함으로써 당뇨병을 치료하는 방법들이 제공된다. 치료될 당뇨병은 I형 당뇨병, II형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병을 포함한다. 또한 본원에서는 속효성 인슐린을 함유하는 본원에서 제공된 안정한 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에 투여함으로써 대상체에서 혈당치를 조절하기 위한 방법이 제공된다. 본원의 방법을 실시하는 경우, 상기 안정한 조성물은 주사기 또는 인슐린 펜을 경유하여 또는 연속적인 피하 주입에 의해 피하 또는 복강 내 투여된다. 본원의 방법을 실시하는 경우, 상기 안정한 조성물은 식전 인슐린 요법으로서 식사 이전에 투여될 수 있다. 본원에서 제공된 방법들에서, 상기 안정한 조성물은 인슐린 펌프 또는 폐쇄 루프 시스템을 경유하는 것과 같이 연속적인 피하 인슐린 주입을 달성하기 위한 전달 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 어떤 경우, 본원에서 제공된 방법들은 설포닐우레아류, 비구아나이드류, 메글리티나이드류, 티아졸리딘디온류, 알파-글루코시다아제 억제제들, 글루카곤 유사 펩티드(GLP) 유사체들 및 위 억제 펩티드(GIP) 유사체들을 포함하는 펩티드 유사체들, 및 DPP-4 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 당뇨병 치료 약물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에서는 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 포함하는, 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형 또는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형인 조성물이 제공된다.

A. 정의

B. 히알루로난 분해 효소 제형 및 인슐린 복합제형의 생성

1. 히알루로난 분해 효소 제형

2. 속효성 인슐린 제형

3. 히알루로난 분해 효소 및 인슐린 복합제형

a. 안정성에 대한 반대 요건

i. 보존제

ii. NaCl 및 pH

b. 호환성 복합제형

C. 히알루로난 분해 효소

1. 히알루로니다아제

a. 포유동물형 히알루로니다아제

PH20

b. 박테리아 히알루로니다아제

c. 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제

2. 기타 히알루로난 분해 효소

3. 절단된 히알루로난 분해 효소 또는 기타 가용성 형태

a. C-말단 절단된 인간 PH20

b. rHuPH20

4. 히알루로난 분해 효소의 글리코실화

5. 약물 동력학적 특성을 개선하기 위한 히알루로난 분해 효소의 변형

D. 안정한 히알루로난 분해 효소 제형

1. 히알루로난 분해 효소

2. 2가 양이온

3. pH 및 완충액

4. 계면활성제

5. 항산화제

6. 등장화제

7. 기타 약제 또는 부형제

8. 예시적인 안정한 히알루로난 분해 효소 제형

E. 인슐린 폴리펩티드

속효성 인슐린

a. 레귤러 인슐린

b. 속효성 유사체(소위 신속 작용 인슐린으로도 지칭됨)

i. 인슐린 리스프로

ii. 인슐린 아스파르트

iii. 인슐린 글루리신

F. 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형

1. 안정한 복합제형의 구성성분

a. 속효성 인슐린

b. 히알루로난 분해 효소

c. 보존제

d. NaCl

e. pH

f. 완충액

g. Lys-Lys

h. 추가의 예시적인 부형제 또는 안정화제

i. 계면활성제

ii. 등장화제

iii. 글리세린

iv. 항산화제

v. 아연

vi. 아미노산 안정화제

vii. 히알루로니다아제 억제제

viii. 니코틴성 화합물

ix. 기타 부형제 또는 약제

2. 예시적인 안정한 복합제형

a. 예시적인 다중 주사(MDI) 복합제형

b. 예시적인 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII) 복합제형

c. 예시적인 Lys-Lys 복합제형

G. 용량 및 투여

투여 형태

a. 주사기

b. 인슐린 펜

c. 인슐린 펌프 및 기타 인슐린 전달 장치

d. 연속적인 주입 펌프 시스템

i. 개방 루프 시스템

ii. 폐쇄 루프 시스템

H. 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소 및 이의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 생성하는 방법

1. 벡터 및 세포

2. 링커 일부분

3. 발현

a. 원핵세포

b. 효모 세포

c. 곤충 세포

d. 포유동물 세포

e. 식물

4. 정제 기법

I. 안정성 및 활성의 평가 방법

1. 인슐린

2. 히알루로난 분해 효소

J. 치료용 용도

1. 당뇨병

a. I형 당뇨병

b. II형 당뇨병

c. 임신성 당뇨병

2. 중환자용 인슐린 요법

K. 조합 요법

L. 제조 물품 및 키트

M. 실시예

A. 정의

본원에서 달리 한정하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명(들)이 속하는 당해 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 설명을 통해 언급된 모든 특허, 특허 출원서, 공개된 출원서 및 공개공보, GENEBANK 서열, 웹사이트, 및 기타 출판물은 달리 알려진 바가 없다면 그 전체가 참조로서 포함된다. 본원에 사용된 용어에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변동할 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷을 통하여 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용 가능성 및 공적인 보급을 증명한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인슐린"이란 글루코오스 흡수 및 저장을 증가시키고, 및/또는 내인성 글루코오스 생성을 감소시키도록 작용하는 호르몬, 전구체 또는 이의 합성 또는 재조합 유사체를 말한다. 예시적인 인간 인슐린은 110개 아미노산의 전구체 폴리펩티드 , 단백질을 소포체(endoplasmic reticulum, ER)로 유도하는 24개 아미노산의 신호 펩티드를 함유하는 프레프로인슐린(preproinsulin)(서열번호 101)으로서 번역되고, 여기서 신호 서열은 절단되어 프로인슐린(서열번호 102)을 생성한다. 프로인슐린이 더 처리되어 31개 아미노산의 C- 또는 결합 사슬 펩티드(서열번호 101로 제시된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 57 내지 87 및 서열전호 102로 제시된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 33 내지 63에 상응)를 방출한다. 생성된 인슐린은 21개 아미노산의 A-사슬(서열번호 101로 제시된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 90 내지 110 및 서열번호 102로 제시된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 66 내지 86에 상응), 및 30개 아미노산의 B-사슬(서열번호 101로 제시된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 25 내지 54 및 서열번호 102로 제시된 프로인슐린 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 30에 대응)을 함유하며, 이들은 이황화 결합에 의해 가교 결합되어 있다. 적절히 가교 결합된 인간 인슐린은 3개의 이황화 가교를 포함한다: 첫 번째 가교는 A-사슬의 7 위치와 B-사슬의 7 위치 사이에 있고, 두 번째 가교는 A-사슬의 20 위치와 B-사슬의 19 위치 사이에 있고, 세 번째 가교는 A-사슬의 6와 11 위치 사이에 있다. 인슐린에 대한 언급은 단일 사슬 형태 또는 이중 사슬 형태인 프레프로인슐린, 프로인슐린 및 인슐린 폴리펩티드들, 및 활성을 갖는 말단 절단 형태를 포함하고 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체들에 의해 암호화된 변이체들, 및 다른 변이체, 예를 들어 서열번호 101로 제시된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드들을 포함하는 인슐린 유사체 또는 그의 성숙한 형태를 포함한다. 예시적인 인슐린 유사체들로는 서열번호 147 내지 149 및 152로 제시된 인슐린 유사체들, 및 서열번호 150, 156, 158, 160, 162 및 164로 제시된 A-사슬 및/또는 서열번호 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 및 165로 제시된 B 사슬을 함유하는 인슐린 유사체들을 들 수 있다.

예시적인 인슐린 폴리펩티드들은 포유류, 예를 들면 인간 기원인 것을 들 수 있다. 예시의 인간 기원의 인슐린의 아미노산 서열들은 서열번호 101 내지 104로 개시되어 있다. 예시적인 인슐린 유사체들은 서열번호 147 내지 149 및 152로 제시된 것 및 서열번호 150, 156, 158, 160, 162 및 164로 제시된 A-사슬 및/또는 서열번호 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 및 165로 제시된 B-사슬을 함유하는 것을 포함한다. 인슐린 폴리펩티드들은 또한 서열번호 105 내지 146로 제시된 임의의 전구체 인슐린 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 비인간 기원을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 인슐린에 대한 언급은 단량체성 및 다량체성 인슐린, 예를 들면 육량체 인술린 또한 인간화 인슐린을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "속효성(fast-acting) 인슐린"은 속효성 인슐린의 투여 후 4시간 또는 약 4시간 이내에 발생된 대상체에 실제의, 인식된 또는 예견된 고혈당 상태(예를 들어, 음식의 소비에 기인해서 얻어지거나 예상되는 식사 고혈당 상태)에 반응하여 당뇨병 대상체에 신속히 투여하고, 이에 의해 급성 고혈당 상태를 예방하거나, 조절 또는 완화시킬 수 있는 임의의 인슐린 또는 속효성 인슐린 조성물을 말한다. 일반적으로, 속효성 인슐린 조성물은 대상체에 대해 피하 투여 이후 4시간 정도 또는 약 4시간 이내에 최고 인슐린 수준을 나타낸다. 속효성 인슐린은 재조합 인슐린 및 단리된 인슐린("레귤러" 인슐린으로도 지칭됨), 예를 들면 Humulin^® R로서 판매되는 인슐린, 돼지 인슐린, 및 소 인슐린, 또한 아미노산 변화로 인해 신속히 작용하도록 설계된 신속 작용 인슐린 유사체들(본원에서 또한 속효성 인슐린 유사체들로 지칭됨)을 포함한다. 예시적인 레귤러 인슐린 제제들로는 인간 레귤러 인슐린, 예를 들어 Humulin^® R, Novolin^® R 및 Velosulin^®로 시판되는 것들, 인슐린 휴먼 USP 및 인슐린 휴먼 주사액 USP, 또한 인슐린의 산성제형, 예를 들면 토론토 인슐린, 올드 인슐린 및 클리어 인슐린 및 레귤러 돼지 인슐린, 예를 들면 이렉틴 II(Iletin II)^®(돼지 인슐린)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 레귤러 인슐린은 일반적으로 30분과 1시간 사이의 작용 개시점을 가지며, 투여 후 2 내지 5시간 정도에 최고 인슐린 수준을 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 신속 작용(rapid acting) 인슐린 유사체들(속효성 인슐린 유사체들로도 지칭됨)은 신속한 작용 개시점을 갖는 인슐린이다. 신속한 인슐린은 일반적으로 레귤러 인슐린보다 보다 신속 작용성을 갖도록 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해서와 같이 조작(engineering)되었던 인슐린 유사체들이다. 신속 작용 인슐린 유사체들은 일반적으로 주사 후 10 내지 30분의 작용 개시점을 가지며, 최고 인슐린 수준은 주사 후 30 내지 90분에 관측된다. 예시적인 신속 작용 인슐린 유사체들로는, 예를 들어 인슐린 리스프로(예를 들어, Humalog^® 인슐린), 인슐린 아스파르트(예를 들어, NovoLog^® 인슐린), 인슐린 글루리신(예를 들어, Apidra^® 인슐린), 및 VIAject^® 및 VIAtab^®로서 판매되는 속효성 인슐린 조성물(예를 들어, 미국 특허 제 7,279,457 호 참조)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 주사 후 30분 이하의 작용 개시점 및 90분 이전, 일반적으로는 30 내지 90분의 최고 수준을 갖는 임의의 기타 인슐린이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 인간 인슐린은 대립형질 변이체 및 그 유사체를 포함하는 인간 폴리펩티드에 기초하여 합성되거나 재조합 생성된 인슐린을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 속효성 인간 인슐린(fast-acting human insulin) 또는 인간 속효성 인슐린(human fast-acting insulin) 조성물은 임의의 인간 인슐린 또는 속효성인 인간 인슐린을 포함하지만 비인간 인슐린, 예를 들면 레귤러 돼지 인슐린은 제외한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "기초-작용(basal-acting) 인슐린" 또는 "기초 인슐린"이란 용어는 당뇨병과 같은 만성적인 상태를 치료하기 위한 종합적인 치료 요법의 일부로서 기초 인슐린 수준을 유지하기 위해 투여되는 인슐린을 말한다. 일반적으로, 기초-작용 인슐린은 주기적으로(예를 들어, 1일 1회 또는 2회) 투여되는 경우 인슐린의 제어된 방출에 의해 제어됨으로써 대략적으로 정상 상태의 인슐린 수준을 유지하도록 제형화된다. 기초-작용 인슐린으로는 결정성 인슐린(예를 들어, NPH 및 Lente^®, 프로타민 인슐린, 서펜(surfen) 인슐린), 기초 인슐린 유사체들(인슐린 글라르긴(glargine), HOE 901, NovoSol Basal) 및 레귤러 인슐린의 흡수 속도를 지연시키는 다른 인슐린의 기타 화학적 제형들(예를 들어, 아라비아검, 레시틴, 또는 오일 현탁액들)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기초-작용 인슐린은 일반적으로는 장기간 작용성(일반적으로는 약 20 내지 30시간에 걸친 최대 작용 기간을 가지면서 비교적 낮은 최고 농도에 도달함) 또는 중간 작용성(일반적으로는 투여 후 약 4 내지 12시간 정도에 최고 인슐린 농도를 초래함)으로 이해되는 인슐린을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "고혈당 상태(hyperglycemic condition)" 또는 "고혈당증(hyperglycemia)"이란 용어는 바람직하지 않은 혈당 상승을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "저혈당 상태(hypoglycemic condition)" 또는 "저혈당증(hypoglycemia)"이란 용어는 바람직하지 않는 혈당 강하를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 혈당 조절 또는 "혈당치를 조절"란 용어는 혈당 농도를 바람직한 수준, 일반적으로는 70 내지 130㎎/㎗ 또는 90 내지 110㎎/㎗로 유지하는 것을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폐쇄 루프 시스템은 연속적인 혈당 조절을 제공하기 위한 통합된 시스템이다. 폐쇄 루프 시스템들은 혈당을 측정는 메커니즘, 인슐린 조성물을 포함한 하나 이상의 조성물을 전달하기 위한 메커니즘, 및 혈당 조절을 달성하기 위해 전달되어야 할 필요가 있는 인슐린의 양을 결정하는 메커니즘을 포함한다. 따라서 일반적으로 폐쇄 루프 시스템들은 글루코오스 센서, 인슐린 전달장치 예를 들면 인슐린 펌프, 및 글루코오스 센서로부터 정보를 수신하고 인슐린 전달 장치에 명령을 제공하는 콘트롤러를 포함한다. 명령은 콘트롤러 내의 소프트웨어에 의해 생성될 수 있다. 소프트웨어는 일반적으로 글루코오스 센서에 의해 검출되거나 사용자에 의해 예상되는 혈당수준에 기초하여 혈당 조절을 달성하기 위해 전달될 필요가 있는 인슐린의 양을 결정하기 위한 알고리즘을 포함한다. 개방 루프 시스템은 글루코오스 수준을 자동적으로 측정하여 이에 반응하지 않는 장치들을 제외한 유사한 장치들을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 투약 요법(dosing regime)은 투여된 인슐린의 양 및 투여 주기를 말한다. 투약 요법은 치료될 질병 또는 상태의 함수이므로 변경될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 폴리머(히알루론산 또는 HA라 언급됨)을 더 작은 분자량의 단편들로 절단하는 것을 촉매하는 효소를 나타낸다. 히알루로난 분해 효소의 예는 히알루로니다아제, 및 히알루론난을 탈중합하는 능력을 갖는 콘드로이티나아제 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해 효소인 예시적인 콘드로이티나아제는 콘드로이틴 ABC 리아제(콘드로이티나아제 ABC로도 공지됨), 콘드로이틴 AC 리아제 (황산 콘드로이틴 리아제 또는 황산 콘드로이틴 엘리미나아제(eliminase)로도 공지됨) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 즉 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 함유한다. 예시적인 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)로부터 유래한 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98로 개시됨: 문헌[Sato 등, (1994) Appl . Microbiol . Biotechnol . 41(1):39-46]). 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나아제 AC 효소는 서열번호 99로 제시된 플라보박테리움 헤파리눔 유래 효소, 서열번호 100으로 제시된 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis) 유래 효소, 및 아스로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens) 유래 효소(문헌[Tkalec 등, (2,000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35]; 문헌[Ernst 등 (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5): 387-444])를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 유래 예시적인 콘드로이티나아제 C 효소들로는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 플라보박테리움 유래 효소(문헌[Hibi 등, (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2): 121-4]; 문헌[Michelacci 등, (1976) J. Biol . Chem . 251: 1154-8]; 및 문헌[Tsuda 등 (1999) Eur . J. Biochem . 262:127-133])를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루로난 분해 효소의 한 분류이다. 히알루로니다아제는 박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제들(EC 3.2.1.36), 및 포유류형 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35)르 포함한다. 히알루로니다아제는 쥐, 개, 고양이, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아 기원, 및 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 기원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 비인간 기원을 포함한다. 비인간 히알루로니다아제의 예는 젖소(서열번호 10, 11 및 64 및 BH55(미국 특허 제 5,747,027 호 및 제 5,827,721 호), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰 얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19 및 32), 돼지(서열번호 20 내지 21), 래트(서열번호 22 내지 24 및 31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 26, 27, 63 및 65), 오랑우탄(서열번호 28), 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey; 서열번호 29), 기니아 피그(서열번호 30), 침팬지(서열번호 185), 시나몰거스원숭이(서열번호 186), 아스토박터 종(FB24 균주)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보루스(Bdellovibrio bacteriovorus: 서열번호 68), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes: 서열번호 69), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(S. agalactiae: 서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus: COL 균주)(서열번호 74); MRSA252 균주(서열번호 75 및 76); MSSA476 균주(서열번호 77); NCTC 8325 균주(서열번호 78); 소 RF122 균주(서열번호 79 및 80); USA300 균주(서열번호 81), 스트렙토코쿠스 뉴모니에(S. pneumoniae: 서열번호 82); ATCC BAA-255/R6 균주(서열번호 83); 혈청형 2, D39/NCTC 7466 균주(서열번호 84), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(S. pyogenes: 혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, MGAS10270 균주(서열번호 86); 혈청형 M4, MGAS10750 균주(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, MGAS2096 균주(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, MGAS9429 균주(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코쿠스 수이스(S. suis: 서열번호 93 내지 95); 및 비브리오 피세리(Vibrio fischeri: ATCC 700601/ESI 14 균주(서열번호 96)) 유래 히알루로니다아제, 및 히알루론산에 대해 특이적이지만 콘드로이틴 또는 황산 콘드로이틴을 절단하지 않는 스트렙토마이세스 히알루로노라이티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다아제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y. (1970) Biochim . Biophys . Acta 198:607)를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 인간 기원의 것을 포함한다. 인간 히알루로니다아제의 예는 HYAL1(서열번호 36), HYAL2(서열번호 37), HYAL3(서열번호 38), HYAL4(서열번호 39) 및 PH20(서열번호 1)을 들 수 있다. 또한 히알루로니다아제 중에는 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20을 포함하는 가용성 히알루로니다아제를 들 수 있다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알루로니다아제의 예로는 Vitrase^®(양 히알루로니다아제) 및 Amphadase^®(소 히알루로니다아제)가 있다.

히알루로난 분해 효소, 히알루로니다아제 또는 PH20 대한 언급은 전구체 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드들 및 성숙한 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드들(예를 들어, 신호 서열이 제거된 것들), 및 말단 절단된(truncated) 형태로 활성을 가지는 형태를 포함하며(예를 들어, C-말단 절단된 형태들), 서열번호 1, 10 내지 48, 63 내지 65, 및 67 내지 100으로 제시된 전구체 폴리펩티드들과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드들을 포함한, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소(예를 들어, PH20)에 대한 참조로는 서열번호 2로 제시된 성숙한 인간 PH20 및 그의 말단 절단 형태로서 활성을 갖는 형태, 서열번호 2로 제시된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드들을 포함한, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소에 대한 참조로는 또한 서열번호 50 및 51로 제시된 인간 PH20 전구체 폴리펩티드 변이체들을 들 수 있다. 히알루로난 분해 효소는 또한 화학적 또는 번역 후 변형(modification)을 포함하는 것들 또는 화학적 또는 번역 후 변형을 포함하지 않는 것을 포함한다. 이러한 변형으로는 페길화(PEGylation), 알부민화(알부민ation), 글리코실화, 파르네실화(farnesylation), 카르복실화, 하이드록실화, 인산화, 및 당업계에 공지된 다른 폴리펩티드 변형을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, PH20은 정자에 존재하고 중성 활성(neural-active)인 히알루로니다아제의 유형을 지칭한다. PH-20은 정자의 표면에 존재하고, 라이조좀 유래 아크로좀에 존재하며, 아크로좀의 내부 맴브레인에 결합해 있다. PH20은 인간, 침팬지, 필리핀 원숭이, 붉은털원숭이, 쥐, 소, 양, 기니아 피그, 토끼 및 래트 기원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 기원을 포함한다. 예시적인 PH20 단백질로는 인간(서열번호 1로 제시된 전구체 폴리펩티드, 및 서열번호 2로 제시된 성숙한 폴리펩티드), 소(서열번호 11 및 64), 토끼(서열번호 25), 양 PH20(서열번호 27, 63 및 65), 필리핀 원숭이(서열번호 29), 기니아 피그(서열번호 30), 래트(서열번호 31), 마우스(서열번호 32), 침팬지(서열번호 185) 및 붉은털원숭이(서열번호 186) PH20 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. PH20에 대한 참조로는 전구체 PH20 폴리펩티드 및 성숙한 PH20 폴리펩티드(예를 들어, 신호 서열이 제거되어 있는 성숙한 PH20 폴리펩티드), 말단 절단된 형태로 활성을 갖는 형태들, 서열번호 1, 10, 25, 27, 30 내지 31, 63-65, 및 185 내지 186로 제시된 전구체 폴리펩티드들 또는 이의 성숙한 형태들에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 변이체, 및 기타 변이체를 포함한다. PH20 폴리펩티드는 또한 화학적 또는 번역 후 변형을 함유하는 PH20 폴리펩티드들, 및 화학적 또는 번역 후 변형을 함유하지 않는 PH20 폴리펩티드들을 포함한다. 이러한 변형으로는 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파네실화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화, 및 당업계에 공지된 기타 폴리펩티드 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알루로니다아제의 예로는 Vitrase^® 히알루로니다아제(양 히알루로니다아제) 및 Amphadase^® 히알루로니다아제(소 히알루로니다아제)가 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 가용성 히알루로니다아제는 세포로부터 분비되고 멤브레인에 고정되어(anchored) 있지 않거나 연합되어 있지 않은 것이며, 따라서 생리학적 조건 하에서 그 가용성에 의해 특징지어질 수 있다. 가용성 히알루로니다아제들은, 예를 들어 37℃까지 가온된 트리톤 X-114 용액에서 수성상 내로 분배(partition)되는 것에 의해 구분될 수 있다(문헌[Bordier 등, (1981) J. Biol . Chem., 256: 1604-7]). 지질-고정과 같이 멤브레인에 고정된 히알루로니다아제들은 세제가 풍부한 상 내로 분배될 것이지만, 포스포리파아제 C로 처리한 이후에는 세제가 결여된 상 또는 수성 상 내로 분배될 것이다. 가용성 히알루로니다아제들 중에는 멤브레인에 대한 히알루로니다아제의 고정과 연관된 하나 이상의 영역이 제거었거나 변형되고, 가용성 형태가 히알루로니다아제 활성을 보유하하고 있는 멤브레에 고정된 히알루로니다아제가 있다. 따라서 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 가용성 PH20 폴리펩티드는 이의 말단 절단된 형태들, 예를 들어 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커의 하나 이상의 아미노산들이 결여된 C-말단 절단된 형태가 포함된다. 가용성 히알루로니다아제는 재조합 가용성 히알루로니다아제, 및 예를 들어 양 또는 소의 고환(testes) 추출물과 같은 천연 공급원에 포함되거나 이로부터 정제된 히알루로니다아제를 포함한다. 이러한 가용성 히알루로니다아제의 예시로 가용성 인간 PH20이 있다. 다른 가용성 히알루로니다아제는 양(서열번호 27, 63 및 65) 및 소(서열번호 11 및 64) PH20을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 rHuPH20는, C-말단의 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 부위의 전부 또는 일부를 결여한 성숙 PH20 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 발현 후 생성되고 분비된 숙주세포의 맴브레인에 고정되지 않게 되어 세포배양 배지에서 가용성이다. 따라서 가용성 인간 PH20은 C-말단이 절단된 인간 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 가용성 또는 C-말단이 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 4 내지 9, 47 내지 48, 234 내지 254, 및 267 내지 273 중 임의의 서열번호로 제시된 아미노산들 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드, 또는 서열번호 4 내지 9, 47 내지 48, 234 내지 254, 및 267 내지 273 중 임의의 서열번호에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 sHuPH20 폴리펩티드들은 서열번호 4 내지 9 및 47 내지 48 중 임의의 하나의 서열번호로 제시된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드들을 포함한다. 이러한 예시적인 sHuPH20 폴리펩티드들에 대한 전구체 폴리펩티드들은 신호 서열을 포함한다. 상기 전구체의 예시적인 예로는 서열번호 3 및 40 내지 46로 제시된 전구체들이 있으며, 이들 각각은 1 내지 35번째 아미노산 위치에서 35개 아미노산의 신호 서열을 함유한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드들은 또한 본원에서 개시된 제조 및 정제 방법들 도중 또는 그 이후에 분해되는 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, rHuPH20로서 지칭된 재조합 인간 PH20은 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 재조합에 의해 발현된 인간 PH20의 분비된 가용성 형태를 지칭한다. 가용성 rHuPH20은 신호 서열을 코딩하는 핵산에 의해 생성된 산물이며, 36 내지 482 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이에 대한 예시적인 서열이 서열번호 49로 개시되어 있는 고유 신호 서열을 코딩하는 핵산을 포함을 포함한다. 또한 이의 대립형질 변이체들 및 기타 가용성 변이체들인 DNA 분자들이 포함된다. 가용성 rHuPH20을 코딩하는 핵산은 성숙한 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 생성되는 것과 같이, C 말단에 불균일성(heterogeneity)이 존재하기 때문에 산물이 서열번호 4 내지 9 중 임의의 하나 이상을 매우 많이 포함할 수 있는 종들의 혼합물을 포함한다. 상응하는 대립형질 변이체 및 다른 변이체가 포함되고, 서열번호 50 및 51로 제시된 전구체 인간 PH20 폴리펩티드들에 상응하는 것을 포함한다. 다른 변이체들은 히알루로니다아제 활성을 보유하고, 가용성인 한 서열번호 4 내지 9 및 47 내지 48 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "초속효성(super fast-acting) 인슐린 조성물"은, 신속 작용(fast-action) 인슐린 유사체, 특히, 보다 신속한 작용개시 인슐린을 갖는 인슐린 유사체와 같은 신속 작용 인슐린 유사체, 및 대상체에 대해 비경구 투여 이후에 첫 40분에 걸쳐 인슐린 조성물이 히알루로난 분해 효소의 부재 하에 동일한 경로에 의해 속효성 인슐린의 동일한 용량을 투여한 이후에 동일한 기간에 걸쳐 상기 대상체에 제공된 누진적인 전신 인슐린 노출보다 큰 누진적인 전신 인슐린 노출을 대상체에 제공하는 히알루로난 분해효소(rHuPH20 제제들: 이에 제한되지 않음)를 함유하는 인슐린 조성물을 말한다. 초속효성 인슐린 조성물은 선택적으로 기초-작용 인슐린을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 제형은 적어도 하나의 활성제 또는 약제 및 하나 이상의 부형제들을 함유하는 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 복합제형은 2개 이상의 활성제 또는 약제, 및 하나 이상의 부형제들을 함유하는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 속효성 인슐린, 히알루로난 분해 효소, 및 하나 이상의 부형제들을 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 그 내부의 활성 성분들이 초기 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수(recovery)와 비교 시에 적어도 필요한 수준의 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수를 보유하는 경우에 한정된 조건 하에서 안정한 것을 말한다. 본원에서의 목적을 위해, 조성물은 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 보유하고, 및/또는 인슐린 효능 또는 회수의 적어도 90% 및/또는 인슐린 순도의 적어도 90%를 보유하는 경우에 안정하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 적어도 2개의 활성 성분들을 함유하는 안정한 복합제형은 각각이 초기 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수와 비교 시에 적어도 필요한 수준의 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수를 보유하는 경우에 안정하다. 본원에서의 목적을 위해 복합제형은 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 보유하고, 인슐린 효능 또는 회수의 적어도 90% 및/또는 인슐린 순도의 적어도 90%를 보유하는 경우에 안정하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 한정된 조건은 저장 및/또는 사용 조건을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "저장"은 제형이 일단 제조된 경우에 대상체에 즉시 투여되지 않지만, 사용 이전에 특정 조건(예를 들어, 특정 온도; 시간, 액체 또는 동결 건조된 형태) 하에서 일정 기간 동안 보관된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 액체 제형은 냉장 온도(0℃ 내지 10℃, 예를 들어 2℃ 내지 8℃), 실온(예를 들어, 32℃의 온도까지, 예를 들어 18℃ 내지 약 32℃ 또는 32℃), 또는 승온(예를 들어, 30℃ 내지 42℃, 예를 들어 32℃ 내지 37℃ 또는 35℃ 내지 37℃)과 같이 다양한 온도 하에서 대상체에 투여 이전에 수일, 수주, 수개월 또는 수년 동안 보관될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 안정성과 연관된 조건과 관련된 "사용"은 특정한 목적을 위해 제형을 이용하는 행위를 지칭한다. 특정한 적용은 단백질 또는 약제의 활성 또는 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 특정한 적용은 상기 제형을 특정 기간 동안 특정 온도에 적용하거나, 온도의 변동 및/또는 교반(agitation), 진탕(shaking), 휘저음(stirring), 또는 활성제의 안정성(예를 들어, 활성 및/또는 용해도)에 영향을 미칠 수 있는 기타 유사한 동작에 적용되는 것을 필요로 할 수 있다. 조건의 예로는 연속적인 주입 방법들이고, 이로 인해 활성제는 사용자 연결 펌프 또는 주입기로부터 수일의 기간에 걸쳐 대상체에 연속적으로 주입된다. 이러한 조건은 교반 및 온도의 변동과 연관될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 안정성이 측정되는 저장 또는 사용을 위한 한정된 조건은 온도 조건, 저장 시간 조건 및/또는 사용 조건을 포함한다. 예를 들어, 한정된 온도 조건은 2℃ 내지 8℃의 저온 또는 냉장 온도, 20℃ 내지 30℃의 주위 온도, 또는 32℃ 내지 40℃의 승온을 포함한다. 다른 실시예에서, 한정된 시간 조건은, 수일(적어도 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일), 수주(적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 수주) 또는 수개월(적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 12개월, 18개월, 24개월 또는 그 이상) 동안의 저장과 같은 다양한 온도 조건 하에서의 저장 기간을 의미한다. 또 다른 실시예에서, 한정된 사용 조건은 교반 조건과 같은 조성물 혼합물을 교란시키거나 변경하는 조건을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단일 용량 제형(single dosage formulation)은 직접적인 투여를 위한 제형 또는 복합제형을 의미한다. 일반적으로, 단일 용량 제형은 직접적인 투여를 위해 단일 용량의 치료제를 함유하는 제형이다. 단일 용량 제형은 일반적으로 임의의 보존제들을 함유하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 다중 용량 제형(multi-dose formulation)은 다회 용량의 치료제를 함유하고, 단일 용량 치료제를 수회 제공하기 위해 직접 투여될 수 있는 제형을 지칭한다. 상기 용량은 수분, 수시간, 수주, 수일 또는 수개월에 걸쳐 투여될 수 있다. 다중 용량 제형은 용량 조절, 용량 풀링(dose-pooling) 및/또는 용량 스플리팅(splitting)을 허용할 수 있다. 다중 용량 제형은 시간에 걸쳐 사용되기 때문에 이들은 일반적으로 미생물 성장을 차단하는 하나 이상의 보존제들을 함유한다. 다중 투여 제형은 주사 또는 주입(예를 들어, 연속적인 주입)을 위해 제형화될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "안정한 다중 용량 주사(MDI) 복합제형"은, 필요한 수준의 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수가 초기 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수와 비교 시에 한정된 시간 및 온도에서 보유되도록 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 안정성을 갖는 안정한 복합제형을 의미한다. 예를 들어, 안정한 다중 용량 주사 제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 6개월 및/또는 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 14일 동안 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 보유하고, 인슐린 효능 또는 회수의 적어도 90% 및/또는 인슐린 순도의 적어도 90%를 보유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "안정한 연속적인 인슐린 주입 제형"은 상기 필요한 수준의 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수가 초기 활성 및/또는 순도 및/또는 효능 또는 회수와 비교 시에 한정된 시간 및 온도에서 보유되도록 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 안정성을 갖는 안정한 복합제형을 지칭한다. 예를 들어, 안정한 연속적인 인슐린 주입 제형은 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 보유하고, 인슐린 효능 또는 회수의 적어도 90% 및/또는 인슐린 순도의 적어도 90%를 보유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 연속적인 피하 인슐린 주입 요법(CSII)은 인슐린이 소형 주입기 또는 펌프로부터 상기 펌프에 연결된 주입 세트를 경유하여 수일에 걸쳐 프로그래밍된 속도로 피하 투여되는 인슐린 투약 요법을 지칭한다. 일반적으로, CSII 요법은 주입 세트 및 펌프 저장소가 교체되기 전에 2 내지 4일 동안 지속된다. 상기 치료는 연속적인 기준선 인슐린 방출(기저 속도) 및 식사 이전과 고 혈당치(즉, 보정 볼루스(correction bolus))에 대응하는 부가적인 인슐린 볼루스 용량을 조합한다. CSII 요법은 일반적으로 투약 요법에 따라 속효성 인슐린, 특히 인슐린 유사체를 전달하기 위해 전지식 주사기 드라이버, 인슐린 펌프 또는 기타 유사한 장치를 이용한다. 일반적으로, 연속적인 기준선 인슐린 방출 계획은 각 환자에 대해 내과의사에 의해 설정된다. 볼루스 용량은 식전 필요성 및 혈당 반응에 기초하여 결정된다. 따라서 CSII 요법은 환자 특이적이다. 환자의 요구, 및 환자의 체중, 나이, 운동, 식이요법 및 임상적 증상들과 같은 기타 환자 특이적 매개 변수들에 따라 각 환자에 대한 특정 인슐린 투약 요법을 결정하는 것이 충분히 숙련된 내과의사 및 환자의 수준에 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 안정화제는 히알루로난 분해 효소 또는 인슐린 또는 이들 모두가 본원에서의 복합제형들이 저장되거나 사용되는 염, pH 및 온도의 조건 하에서와 같이 분해되는 것을 방지하기 위해 상기 제형에 첨가된 화합물을 지칭한다. 따라서 조성물 중의 다른 구성성분들로부터 단백질들이 분해되는 것을 방지하는 약제들이 포함된다. 이러한 약제의 예시적인 예로는 아미노산들, 아미노산 유도체들, 아민류, 당류, 폴리올류, 염류 및 완충액류, 계면활성제들, 억제제들 또는 기질들, 및 본원에서 개시된 바와 같은 다른 약제들이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 리실 리신(Lys-Lys 또는 디리신)은 Lys-Lys 디펩티드, 또는 이의 염, 유도체, 유사체 또는 모방체를 의미한다. 예를 들어, Lys-Lys에 대한 참조로는 Lys-Lys의 디하이드로클로라이드 염, 즉 Lys-Lys 디하이드로 클로라이드(또는 디리신 디하이드로클로라이드; H-Lys-Lys-OH HCl)와 같은 이의 염을 포함한다. Lys-Lys 디하이드로클로라이드는 하기 화학식으로 표시된다.

또한 Lys-Lys에 대한 참조로는 Fmoc-, Noc-또는 Cbz과 같은 보호기들을 함유하는 유도체와 같은 이의 유도체를 포함한다. 시판 중인 Lys-Lys 디하이드로클로라이드의 예로는 시그마 알드리히(Sigma Aldrich), 알엔디 켐(RnD Chem.), 엠피 바이오(MP Bio), 테트라히드론 사이언티픽 인코포레이션(Tetrahedron Scientific Inc.), 및 크레센트 케미칼 컴파니(Crescent Chemical Company)로부터 이용 가능한 디하이드로클로라이드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 시판 중인 예시적인 Lys-Lys 디하이드로클로라이드는 시그마 알드리히(제품 번호 제 L5502 호) 또는 알엔디 켐(제품 번호 제 G-2675 호)으로부터 이용 가능한 Lys-Lys 디하이드로클로라이드이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항미생물적 유효성 시험(antimicrobial effectiveness test)은 생성물에서 보존제 시스템의 유효성을 나타낸다. 생성물은 특정 유기체의 제어된 양으로 접종된다. 이어, 상기 시험에서는 28일의 기간에 걸쳐 시험용 시료에 대해 대조군 시료 상에서 발견된 미생물의 수준이 비교된다. 항미생물적 유효성 시험을 수행하기 위한 매개 변수들은 본원에서 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 보존제의 항미생물적 유효량 또는 항미생물적 양은 저장 또는 사용으로부터 도입될 수 있는 시료 중의 미생물 유기체를 살해하거나 이의 증식을 억제하는 보존제의 양을 의미한다. 예를 들어, 다중 용량 컨테이너들에 있어서, 보존제의 항미생물적 유효량은 개별 용량을 반복적으로 취소함으로써 도입될 수 있는 미생물의 성장을 억제한다. USP 및 EP(EPA 및 EPB)는 보존제 유효성을 결정하고, 엄격성이 서로 다른 항미생물적 요건들을 갖는다. 예를 들어, 보존제의 항미생물적 유효량은 박테리아 유기체에서 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 항미생물적 보존제 유효성 시험(APET)에서 접종 후 7일 정도에 일어나도록 하는 양이다. 특정 실시예에서, 보존제의 항미생물적 유효량은 박테리아 유기체에서 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 7일 정도에 일어나고, 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 14일 정도에 일어나고, 박테리아 유기체에서 추가적인 증가가 접종 28일 이후에는 일어나지 않으며, 진균류(fungal) 유기체에서 적어도 어떠한 증가도 접종 7일 이후에는 일어나지 않도록 하는 양이다. 또 다른 실시예에서, 보존제의 항미생물적 유효량은 박테리아 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 24시간 정도에 일어나고, 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 7일 정도에 일어나고, 박테리아 유기체에서 추가적인 증가가 접종 28일 이후에는 일어나지 않으며, 진균류 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 14일 정도에 일어나고, 진균류 유기체에서의 적어도 추가적인 증가가 접종 28일 이후에는 일어나지 않도록 하는 양이다. 부가적인 실시예에서, 보존제의 항미생물적 유효량은 박테리아 유기체의 적어도 2.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 6시간 정도에 일어나고, 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 24시간 정도에 일어나고, 박테리아 유기체의 회수가 상기 조성물을 미생물 접종물로 접종한지 28일 이후에 일어나지 않고, 진균류 유기체의 적어도 2.0의 log₁₀ 유닛의 감소가 접종 후 7일 정도에 일어나며, 진균류 유기체에서의 적어도 추가적인 증가가 접종 28일 이후에는 일어나지 않도록 하는 양이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "부형제"는 활성제의 부재 시에 투여되는 경우에 활성제의 생물학적 효과를 제공하지 못하는 활성제 제형 내 화합물을 지칭한다. 예시적인 부형제들로는 염류, 완충액들, 안정화제들, 등장화제들, 금속류, 중합체들, 계면활성제들, 보존제들, 아미노산들 및 당류를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "완충액"은 강산 또는 강염기의 첨가, 및 온도, 압력, 부피 또는 산화환원 전위의 외부 영향에도 불구하고 완충액의 pH를 일정하게 유지할 수 있는 물질, 일반적으로는 용액을 지칭한다. 완충액은 다른 화학 물질,예를 들어 수소 이온 농도(pH)에서의 현저한 변화를 방지하는 양성자 공여체 및 수용체 시스템들의 농도의 변화를 방지한다. 모든 완충액들의 pH값은 온도 및 농도 의존적이다. pH값 또는 그 범위를 유지하기 위한 완충액의 선택은 공지된 완충액들의 공지된 완충 능력에 기초하여 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 완충액들로는 중탄산 완충액, 카코딜산 완충액, 포스페이트 완충액 또는 트리스 완충액을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 트리스 완충액(트로메타민(tromethamine))은 아민계 완충액으로 8.06의 pKa를 갖고 7.9과 9.2 사이의 유효 pH 범위를 갖는다. 트리스 완충액에 있어서, pH는 1℃의 온도 감소 당 약 0.03 유닛 정도 증가하고, 10배 희석 당 0.03 내지 0.05 유닛 감소한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 활성이란 전장(완전한) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 이의 일부분의 기능적 활성 또는 활성들을 의미한다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성(항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체 형성 능력 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제 활성이란 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매하는 능력을 의미한다. 히알루로니다아제에 대한 미국약전(USP) XXII 분석법에 따르면, 효소를 37℃에서 30분 동안 HA와 반응시킨 후, 잔류하는 더욱 고분자량 히알루론산 또는 히알루로난, (HA) 기질의 양을 측정함으로서 간접적으로 히알루로니다아제 활성을 결정한다(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 참고용 표준 용액은 임의의 히알루로니다아제의 상대적인 활성을 유닛으로 확인하기 위한 평가에 사용될 수 있다. 예를 들면, 가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성을 결정하기 위한 시험관 내 분석은 당 분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다. 예시적인 분석으로 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합하는 경우에 형성되는 불용성 침전물을 검출함으로써 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정한 하기 기재된 미세 탁도 분석(microturbidity assay)(예를 들어, 실시예 2 참조)을 들 수 있다. 참고용 표준물질은, 예를 들어 표준 곡선을 생성하여 시험된 히알루로니다아제의 유닛에서 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해 효소와 관련해서 "기능적 동등량" 또는 이의 문법상 변화량은 히알루로니다아제와 같은 참고용 효소의 양(예를 들어, 히알루로니다아제 활성의 유닛의 공지된 수치)으로서 동일한 효과를 달성하는 히알루로난 분해 효소의 양을 지칭한다. 예를 들어, 임의의 히알루로난 분해 효소의 활성은 rHuPH20의 활성과 비교하여 rHuPH20의 공지된 양으로서 동일한 효과를 달성할 수 있는 히알루로난 분해 효소의 기능적으로 동등한 양을 결정한다. 예를 들어, 확산 또는 분산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력은 트리판 블루(trypan blue)와 함께 이를 마우스의 측부 피부 내로 주사함으로써 평가될 수 있고(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 200-50260186 호 참조), 예를 들어 히알루로니다아제 참고용 표준물질의 100 유닛과 동일한 확산량을 달성하기 위해 요구되는 히알루로난 분해 효소의 양을 결정할 수 있다. 따라서 히알루로난 분해 효소의 요구량은 100 유닛과 기능적으로 동등하다. 다른 실시예에서, 공-투여된 인슐린의 수준 및 흡수 속도를 증가시키는 히알루로난 분해 효소의 능력은 하기 실시예 1에서 개시된 바와 같이 인간 대상체에서 평가될 수 있으며, 예를 들어 rHuPH20의 용량과 같이 인슐린의 동일한 수준 및 흡수 속도를 달성하기 위해 요구되는 히알루로난 분해 효소의 양은 혈액 중의 최대 인슐린 농도(C_max), 혈액 중의 최대 인슐린 농도를 달성하기 위해 요구되는 시간(t_max),및 주어진 기간에 걸친 누진적인 전신 인슐린 노출(AUC)을 평가하는 것과 같이 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 자연적으로 발생하는 α-아미노산의 잔기들은 자연에서 발견되는 이들 20개의 α-아미노산의 잔기들로서, 인간에서 이의 동종 mRNA 코돈에 의한 하전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질 내로 혼입된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA) 및 이들의 혼합물을 포함한 이들의 유사체들을 포함한다. 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 형광 라벨 또는 방사성 라벨과 같이 검출 가능한 라벨을 이용하는 것과 같이 선택적으로 라벨링된 탐침들 또는 프라이머들을 참고하는 경우, 단일 가닥 분자가 고려된다. 이러한 분자는 일반적으로 이들의 표적이 통계학적으로 독특하도록 하는 길이를 갖거나, 라이브러리(library)를 탐침하거나 프라이밍(priming)하기 위한 낮은 복제수(일반적으로는 5 미만, 일반적으로는 3 미만)를 갖는다. 일반적으로, 탐침 또는 프라이머는 관심 있는 유전자에 상보적이거나 동일한 서열의 적어도 14개, 16개 또는 30개의 연속 뉴클레오티드들을 함유한다. 탐침들 및 프라이머들은 10개, 20개, 30개, 50개, 100개 또는 그 이상의 핵산 길이를 가질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 펩티드는 2개 이상의 아미노산 길이, 40개 이하의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 제공된 아미노산들의 다양한 서열에서 나타나는 아미노산들은 이들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인된다(표 1). 다양한 핵산 단편들에서 나타나는 뉴클레오티드들은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 표준 1-문자 명칭으로 명명된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기 및 카르복실산기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2개 이상의 아미노산을 함유한다. 본원에서의 목적을 위해, 아미노산들은 20개의 자연적으로 발생하는 아미노산들, 비천연 아미노산들 및 아미노산 유사체들(즉, α-탄소가 사이드 사슬을 갖는 아미노산들)을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 이의 펩티드 결합들에서 폴리펩티드의 화학적 분해(가수분해) 시에 형성된 아미노산을 지칭한다. 본원에서 개시된 아미노산 잔기들은 "L" 이성체 형태인 것으로 추정된다. 동일한 방식으로 명명된 "D" 이성체 형태의 잔기들은 목적하는 기능적 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되고 있는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. NH₂는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 지칭한다. COOH는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 지칭한다. 문헌[J. Biol . Chem ., 243: 3557-3559 (1968)]에 개시되고 C.F.R. §§ 1.821-1.822로 채택된 표준 폴리펩티드 명명에 따르면, 아미노산 잔기들에 대한 약어가 표 1에 나타나 있다.

표 1. 대응표

본원에서 화학식으로 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열들은 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 갖는다. 또한 "아미노산 잔기"란 어구는 대응표(표 1)에서 나열된 아미노산 및 변형된 아미노산들, 및 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822에 언급된 것들 및 본원에서 참고로 삽입된 것들을 포함하도록 광범위하게 정의된다. 또한 아미노산 잔기 서열의 처음과 끝에 있는 대시(-)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적인 서열, 즉 NH₂와 같은 아미노 말단기 또는 COOH와 같은 카르복실 말단기에 결합된 펩티드를 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산들"은 폴리펩티드들에서 존재하는 20개의 L-아미노산들을 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하기 위해 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서 비-천연적으로 발생하는 아미노산은, 예를 들어 20개의 천연적으로 발생하는 아미노산들 이외의 아미노산 또는 이의 유사체를 포함하고, 상기 아미노산의 D-입체 이성질체들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 비천연 아미노산들은 본원에서 개시되어 있으며, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, DNA 구조체는 자연에서는 발견되지 않는 방식으로 조합되고 병치되어 있는 DNA의 절편을 포함하는, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형 DNA 분자이다. DNA 구조체들은 인간의 조작 결과로서 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, DNA 절편(segment)은 특이한 성질을 갖는 보다 큰 DNA 분자의 일부분이다. 예를 들어, 특정한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 절편은 더 큰 DNA 분자, 예컨대 5'에서 3' 방향으로 판독되는 경우에 특정 폴리펩티드의 아미노산들의 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편의 일부분이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드란 용어는 5' 말단에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드 염기들의 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드들은 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 공급원들로부터 단리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 천연 및 합성 분자들의 조합으로 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드들("nt"로 약칭됨) 또는 염기쌍("bp"로 약칭됨)이란 용어들에서 본원에 나타나 있다. 뉴클레오티드란 용어는 문맥에서 허용되는 경우 단일 가닥 및 이중 가닥 분자에 대해 사용된다. 상기 용어가 이중 가닥 분자에 적용되는 경우, 이는 전체 길이를 나타내기 위해 사용되며, 염기쌍이란 용어에 상응하는 것으로 이해될 것이다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥이 그 길이가 서로 다를 수 있으며, 이의 말단이 엇갈려 있을 수 있으며(staggered), 따라서 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드들은 쌍을 이루지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 같이 쌍을 이루지 않은 말단은 일반적으로 20개 뉴클레오티드 길이를 초과하지 않을 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 단백질들 또는 핵산들 사이의 "유사성(similarity)"은 단백질들의 아미노산들의 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열들 사이의 관련성을 지칭한다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그 안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질들 또는 핵산 사이의 유사성 정도를 평가하기 위한 방법들이 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 하나의 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들은 상기 서열들 사이의 최대의 상동성을 나타내는 방식으로 배열된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "동일성(identity)"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들이 다르지 않은 정도를 지칭한다. 아미노산 서열들의 배열, 및 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열들의 배열(alignment)시 또한 아미노산들(또는 뉴클레오티드들)에서의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적인 차이는 관련된 잔기들의 물리화학적 특성을 보존하는 것이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는, 비교대는 서열의 배열)이거나, 국소적(대부분의 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열들 일부의 배열)일 수 있다.

"동일성"은 그 자체로 기술로 인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 이용하여 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991] 참조). 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드들 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법들이 존재할지라도, "동일성"이란 용어는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있다(문헌[Carrillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)]).

본원에서 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열들과 관련하여) 상동성이란 용어는 약 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로 25% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 상동성을 의미하지만; 필요한 경우 정확한 퍼센트가 특정될 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, "상동성" 및 "동일성"이란 용어는 달리 언급하지 않는 한 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해 서열들은 최고 수준으로 매치되도록 배열된다(예를 들어, 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 문헌[Carrillo 등, (1988) SIAM J Applied Math 48:1073] 참조). 서열 상동성에 의하며, 보존된 아미노산의 개수는 표준 배열 알고리즘 프로그램들에 의해 결정되며, 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티와 함께 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 일반적으로 관심 있는 핵산의 길이 전체를 따라 전형적으로 보통의 엄격성(stringency) 또는 높은 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화 핵산 분자에서의 코돈들을 대신해서 축퇴성 코돈(degeneracy codon)들을 함유하는 핵산 분자도 고려된다.

임의의 2개의 분자가 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일한" 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열들 또는 아미노산 서열들을 갖는지의 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 문헌 Pearson 등, (1988) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 55:2444(다른 프로그램들을 GCG 프로그램 패키지를 포함함(Devereux, J. 등, Nucleic Acids Research 12(I): 387(1984])), BLASTP, BLASTN, FASTA(Altschul, S.F. 등, JMolec Biol 215: 403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carrillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48: 1013)에서와 같이 디폴트 파라미터들을 사용한 예컨대 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스용 BLAST 함수가 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 기타 상업적으로 또는 공적으로 이용 가능한 프로그램들로는 DNAStar의 "MegAlign" 프로그램(위스콘신주 매디슨 소재) 및 위스콘신 대학교의 유전학 컴퓨터 그룹(UWG)의 "Gap" 프로그램(위스콘신주 매디슨 소재)을 포함한다. 단백질들 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은, 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다(예를 들어, Needleman 등(1970) J. Mol . Biol . 48: 443, Smith 및 Waterman에 의해 개정 (1981) Adv . Appl . Math. 2:482). 요약하면, GAP 프로그램은 2개의 서열들 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 개수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드들 또는 아미노산)들의 수로서 유사성을 정의한다. GAP 프로그램용 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값 을, 비동일성에 대해 0의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 기술된 바와 같은 Gribskov 등(1986) Nucl . Acids Res. 14: 6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 패널티 및 각각의 갭에서 각 기호에 대한 추가의 0.10 벌점; 및 (3) 말단 갭에 대한 패널티 없음을 포함할 수 있다.

따라서 본원에서 사용된 바와 같이, "동일성" 또는 "상동성"이란 용어는 시험용 또는 참고용 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대해 적어도 "90% 동일한" 이란 용어는 참조용 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 100%의 동일성 비율(%)을 지칭한다. 90% 이상 수준의 동일성은 예시 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 참고용 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 중의 아미노산의 10%이하(즉, 100개 중 10개)가 참고용 폴리펩티드의 아미노산들과 상이하다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참고용 폴리뉴클레오티드 사이에서 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포하고 있는 점 돌연변이로서 나타낼 수 있거나, 이들은 최대 이용 가능한, 예를 들어 10/100 아미노산의 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의존함 없이 수동 배열에 의해 신속하게 측정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드들 또는 아미노산들의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에 배열된 2 이상의 서열들을 의미하며, EST와 RNA유래 서열 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 생성물에 대해 실질적으로 동일하다는 것은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 생성물이 본래 생성물을 대신하여 사용될 수 있도록 충분히 유사하다는 의미이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"이란 용어는 관련 분야에서의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로 도 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형(phenotype)의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들을 코딩할 수 있다. "대립형질 변이체"는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참고용 형태는 군집 또는 한 종의 참고용 종 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 코딩한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 변이체 및 종 내 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자 및 비교가 종 간인지 종 내인지에 의해 좌우된다. 일반적으로, 종 내(intra) 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서의 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원들 중에서 단백질 내 변이를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호 교환적으로 사용되는 "대립형질"은 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립형질은 상동성 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상체가 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 갖는 경우, 그 대상체는 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 대상체가 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 갖는 경우, 그 대상체는 그 유전자에 대해 이종접합성(hetrozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입과 같은 변형을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 종 변이체들은 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스 및 사람을 포함한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 변형(modification)은, 아미노산 서열의 변형과 관련하여 사용시, 폴리펩티드, 또는 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 변형을 묘사하기 위하여 사용되며, 각각의 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 재조합 DNA 방법을 이용하는 것과 같이 당업자에게 통상적인 일이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분은 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되는 경우에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.

제제는, 순도를 측정하기 위해 당업자에게 사용되는 표준 분석방법, 예컨대 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출 가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 그러나 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물들을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체 이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우에, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.

용어 세포 물질의 실질적 부재란 단백질이 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포성 구성성분들로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 세포 물질의 실질적 부재란 약 30% 미만(건조 중량 기준)의 비효소 단백질(본원에서 오염 단백질로도 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비효소 단백질 또는 약 10% 미만의 비효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 상기 효소 단백질에 실질적으로 배양 배지가 없는 것이다. 즉 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만, 또는 20%, 10% 또는 5% 정도를 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 기타 화학물질의 실질적 부재는 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리되어 있는 효소 단백질들의 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30% 미만(건조 중량 기준), 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자, 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의해 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 발현을 위한 분자생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미다.

본원에서 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원(heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 도입하기 위해 사용되는 별개 요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피솜(episome)으로 남지만, 유전자 또는 이의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공염색체 및 포유동물 인공 염색체들과 같은 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있.

본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 이러한 DNA 단편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 영역과 작동 가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 부가적인 부분은 프로모터 및 터미네이터 서열들을 포함할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구조체, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내로의 도입 시 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 기타 벡터와 같은 를 지칭한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포에서 복제 가능한 벡터들, 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 벡터들을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로서) 외래 유전자들을 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.

본원에서 사용된 바와 같이, DNA 절편을 언급할 때의 작동가능하게 또는 작동가능하게 연결된이란 절편들이 그들의 의도된 목적, 예컨대 전사가 프로모터에 의해 개시되어 코딩 절편을 거쳐 터미네이터까지 진행되는 목적으로 일제히 기능하도록 배열된 것을 의미한다. 프로모터는 통상적으로 도메인으로 전사 기구가 여기에 결합하여 전사를 개시하고 코딩 절편을 거쳐 터미네이터로 진행한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 평가(assessing)는 시료 중에 존재하는 프로테아제 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획들 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분율, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하도록 의도된다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제로 검출되는 화학적 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없지만, 예를 들어 이의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들어 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루(Coomassie blue)에 의한 단백질 염색에 의한 보체 단백질의 절단 산물의 검출.

본원에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체 내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체 내 투여 시에 나타나는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 이용하기 위해 설계된 시험관 내 시스템들에서 관측될 수 있다. 따라서 본원에서의 목적을 위해, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드를 가수분해하는 그의 촉매 활성이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산서열을 언급할 때 "동등한(equivalent)"란 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 코딩하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 치환만을 갖는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다. "동등한:이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예를 들어, 2개의 펩티드들이 동일한 유형의 효소 활성 다른 속도로 나타낼 수 있음), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 조합은 2개 이상의 항목간의 또는 항목 내의 임의의 연합을 의미한다. 상기 조합은 2개 이상의 별개의 항목, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 항목의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로, 상기 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 관련되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "질병 또는 장애"는 감염, 후천적 상태, 및 유전적 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 대상체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 관심 있는 질병 및 장애는 당뇨병을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 질병 또는 상태를 가진 대상체를 "치료하는 것(treating)"은 대상체의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적인 질병의 방지 및/또는 증상들의 악화 또는 질병의 진행의 방지를 지칭한다. 치료는 또한 본원에서 제공되는, 인슐린 및 변형된 히알루로난 분해 효소의 복합제형의 임의의 약학적 사용을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 임의의 치료제 또는 생리활성 제제, 예를 들어 마취제, 혈관 수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질병 또는 다른 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않는 경우에 유리하게 변경되는 임의의 방식을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질병 또는 상태의 증상들을 변경하거나, 일반적으로 개선 또는 완화하는, 또는 질병 또는 상태를 치유하는 대상체의 치료로부터 야기되는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상체에 투여 후 치료 효과를 초래하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 사람을 포함한 포유동물을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 환자는 질병의 증상 또는 장애를 나타내는 인간 대상체를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대 약학 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질병 또는 장애의 증상의 개선은 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련될 수 있는 징후의 영구적인 또는 일시적인, 지속적인 또는 일시적인, 임의의 경감을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질병 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 적어도 치료 효과를 나타내기에 충분한 화합물을 함유하는 약제, 화합물, 재료, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서 이는 질병 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 억제, 부분적으로 억제하기 위해 필요한 양이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 치료적으로 유효한 인슐린 용량은 혈당 조절을달성하기 위해 요구되거나 충분한 인슐린의 양이다. 이러한 양은 예컨대 글루코오스 또는 식사 도전(challenge)에 의해서 경험적으로 결정될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물은 치료적으로 유효한 용량이 투여되기 위한 치료적으로 유효한 양 또는 농도의 인슐린을 함유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단위 용량 제형(unit dose form)은 인간 및 동물 대상체에 적합하고, 당업계에 공지된 바와 같이 개별적 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "제조품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 상기 용어는 동일 또는 개별 포장 물품에 포함된 속효성 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해 효소 조성물을 포함하도록 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "키트"는 본원에서 제공되는 조성물과, 재구성, 활성화, 전달용 기구/장치, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적의 다른 물품의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 래트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 양, 소, 사슴 및 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비인간 동물은 고려되는 동물로서 인간을 제외한다. 본원에서 제공된 효소는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵생물 및 진균(fungal) 유래이다. 대부분의 효소들은 포유류 기원을 포함한 동물 기원이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 매개 변수로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태를 병에 걸리지 않은 정상지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 "하나의(a)", "하나의(an)", "및(and)", "그(the)"는 문맥에서 명백하게 반대로 구술하지 않는다면 복수의 대상을 포함한다. 따라서 예를 들어, "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 갖는 화합물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 및 범위로서 표현될 수 있다. "약(about)"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서 "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 "5개의 염기"를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "선택적(임의적)" 또는 "선택적으로"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합을에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다((1972) Biochemistry 11: 1726] 참조).

B. 히알루로난 분해 효소 제형 및 인슐린 복합제형의 생성

본원에서는 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 제들이 제공된다. 일반적으로, 히알루로난 분해 효소는 효소 활성을 보유하기 위해 상대적으로 높은 염을 요구한다(예를 들어 미국 특허 공개공보 제 US2011-0066111 호 참조). 또한 기존의 제형은 안정성을 위해 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유한다. 본원에서는 Lys-Lys 및 염화마그네슘(MgCl₂)이 NaCl보다 더 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20)를 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, Lys-Lys 또는 MgCl₂가 존재하면 HSA는 필요하지도 요구되지도 않는다. 본원에서 제공된 제형은 기존의 제형에 비해, 특히 높은 온도에서 장시간에서의 증가된 안정성을 포함하여 장점을 제공한다. 본원에서는 Lys-Lys 및/또는 MgCl₂를 함유하는 안정한 제형을 제공한다. 특히, 본원에서는 안정화제로서 Lys-Lys를 함유하는 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20)의 안정한 제형을 제공한다.

히알루로난 분해 효소의 복합제형은 또한 다른 치료제와 함께이어도 다양한 조건 하에서 안정성을 나타내어야 한다. 이는 다른 치료제의 제형 요건이 다르거나 히알루로난 분해효소에 요구되는 제형요건과 상반되는 경우에 문제가 될 수 있다. 본원에서, 히알루로난 분해 효소 및 인슐린의 복합제형은 혼합되는 경우임이 밝혀졌다. 본원에서는 히알루로난 분해 효소(예를 들어, PH20과 같은 가용성 히알루로니다아제) 및 인슐린, 예를 들어 속효성 인슐린 또는 인슐린 유사체의 안정한 복합제형을 제공한다.

시판되는 제형들을 포함한, 속효성 인슐린의 안정한 제형들은 일반적으로 상이한 부형제들 및 성분들 및/또는 상이한 농도의 부형제들 및 성분들을 함유하며, 이들은 가용성 히알루로니다아제들과 같은 히알루로난 분해 효소들의 안정한 제형에서 발견되는 것보다 인슐린의 안정성, 용해도 및 활성을 위해 요구된다. 이들 인슐린 및 가용성 히알루로니다아제들의 최적화된 제형들은 복합제형화된 인슐린 및 가용성 히알루로니다아제의 안정성, 용해도 및/또는 활성이 상당히 감소되도록 복합제형 내에서 함께 혼합하는 경우에 불화합성(incompatible)이다. 이러한 불화합성은 이들 약제의 안정한 복합제형을 개발하는데 주요 장벽이다.

1. 히알루로난 분해 효소 제형

히알루로난 분해 효소의 기존의 제형들은 일반적으로 NaCl, 일반적으로는 130mM 내지 150mM의 NaCl을 함유한다. 예를 들어, Hylenex^® 재조합(히알루로니다아제 인간 주사액)은 1㎖ 당 8.5㎎의 NaCl(145mM), 1.4㎎의 인산일수소나트륨(9.9mM), 1.0㎎의 인간 알부민, 0.9㎎의 에데테이트이나트륨(edetate disodium; 2.4mM), 0.3㎎의 CaCl₂(2.7mM), 및 pH를 7.4로 조절하기 위한 NaOH를 함유한다. 인간 가용성 히알루로난 분효효소의 다른 제형, 예컨대 미국 특허 공개공보 제 US2011-0053247 호에 개시된 rHuPH20 제형은 130mM의 NaCl, 10mM의 헤르페스(Herpes)(pH 7.0); 또는 10mM의 히스티딘, 130mM의 NaCl(pH 6.0)을 포함한다.

rHuPH20과 같은 PH20을 포함하는 히알루로니다아제와 같은 히알루로난 분해 효소들의 제형은, 인슐린의 제형들과는 상이한 성분들을 함유한다. 예를 들어, PH20은 pH 5.5와 pH 6.5 사이의 낮은 pH값에서 가장 안정하다. 낮은 pH 이외에, 인간 히알루로니다아제 제형들은 인슐린 제형들보다 많은 NaCl를 함유하며, 이들은 단백질의 안정성을 촉진하고, 효소 활성을 유지한다. 또한 Hylenex^® 재조합체(히알루로니다아제 인간 주사액)와 같은 인간 가용성 히알루로니다아제 제형은 현재까지 단일 용량 제형이었다. 이와 같이, 이들은 임의의 보존제들을 함유하지 않는다.

2. 속효성 인슐린 제형

레귤러 인슐린 및 신속 작용 인슐린 유사체들을 포함하는 속효성 인슐린은 일반적으로 승온(예를 들어, 25℃ 및 30℃)에서뿐만 아니라 냉장된 온도(예를 들어, 장기간 저장을 위해 4℃)에서 인슐린의 용해도, 안정성 및 순도를 최적화하기 위해 제형화된다. 상기 제형들은, 특히 다중 사용 및 포장을 위해 시간이 지남에 따라 안정성을 부여하도록 제조된다. 예를 들어, Humulin^®, Humalog^®, Novolog^® 및 Apidra^®를 포함하는 시판 인슐린 제품을 위한 라벨은 2 내지 8℃의 저장 온도에서 적어도 24개월, 및 25℃ 또는 30℃의 저장 온도에서 28일의 안정성을 기재하고 있다. 또한 상기 제형들은 37℃ 또는 약 37℃의 저장 온도에서 적어도 6일 동안 안정한 것으로 믿어진다.

각 인슐린에 대한 최적 제형은 다를 수 있지만, 일반적으로는 제형들 중에는 일부 공통성이 있다. 예를 들어, 인슐린 제형은 일반적으로 완충액, 등장화제(들) 및 하나 이상의 보존제를 함유한다. 대부분의 속효성 인슐린은 또한 아연을 함유하지만, 일부 속효성 인슐린은 안정화제를 또한 함유한다. 또한, 인슐린 제형들은 높은 중성 pH(예를 들어, 7.0 내지 7.8)에서 제조된다. 하기 표 2에는 하나의 레귤러 인슐린 및 3개의 신속 작용 인슐린 유사체를,선택 시판되는 4개의 속효성 인슐린 제형들이 나열되어 있다.

표 2. 속효성 인슐린 제형들의 선택

상기 속효성 인슐린 제형들은 다중 투여를 위해 바늘의 반복적인 삽입과 같이 반복적인 접속에 의해 제형 내로 미생물 오염이 도입되는 것을 방지하는 보존제를 함유한다. 현재 많은 보존제들이 승인된 비경구 약물 제품에서 사용될지라도, 페놀, 메타크레졸(m-크레졸) 및 파라벤류와 같은 페놀성 화합물들이 인슐린 제형들에서 가장 일반적으로 사용된다. 이들 페놀성 화합물들은 효과적인 항미생물 제제로서 작용할 뿐만 아니라, 인슐린 육량체 상의 알로스테릭 부위(allosteric site)에 결합하여 인슐린의 고차원 구조의 전체적인 형태를 변화시킬 수 있다. 이는 섬유질의 집합체(fibrils, 원섬유)의 형성을 억제함으로써 육량체를 안정화시키며, 상기 섬유질 집합체는 육량체보다 인슐린 단량체와 더욱 용이하게 형성한다(문헌[Rahuel-Clermont 등, (1997) Biochemistry 36: 5837-5845]). 이러한 보존제들이 안정화제로서 작용할지라도, 이들은 매우 높은 농도로 존재하는 경우에 인슐린의 용해도를 또한 감소시킬 수 있다. 따라서 인슐린의 보존제들의 농도는 상기 약제의 안정성 및 용해도에 중요하다.

하나 이상의 등장화제(tonicity modifiers)는 일반적으로 제제의 등장성을 조절하기 위해 인슐린 제형들에 포함된다. 종종 인슐린 제형들에 존재하는 예시적인 등장화제들은 글리세린 및/또는 NaCl을 포함한다. 등장성에 영향을 미친다는 것 이외에, NaCl은 NaCl 농도의 증가가 용해도의 감소를 초래하도록 인슐린의 용해도에 영향을 미친다. 인슐린 유사체들을 포함한 다양한 인슐린은 상이한 겉보기 용해도를 갖는다. 따라서 용해도에 악영향을 미치지 않은 채 상기 제형에 존재할 수 있는 NaCl의 양은 인슐린마다 다를 것이다. 예를 들어, 인슐린 글루리신(예를 들어, Apidra^® 인슐린 글루리신)은 인슐린 아스파르트(예를 들어, NovoLog^® 인슐린 아스파르트)보다 더욱 가용성이고, 따라서 상기 제형 내 더욱 많은 NaCl에 내성을 나타낸다. 비교해 보면, 인슐린 리스프로 및 레귤러 인슐린은 최소 가용성인 속효성 인슐린이고, 일반적으로 이들의 제형들 중에는 NaCl을 함유하지 않는다.

기타 성분들은 또한 인슐린 제형들에 포함될 수 있다. 레귤러 인슐린, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로 제형들을 포함한 많은 인슐린 제형들은 Zn^{2 +} 이온을 함유하며, 이는 육량체 형성을 촉진하고 안정화시킨다. 인슐린 글루리신 제형들이 아연을 함유하지 않을지라도, 이들은 단백질 안정화제로서 폴리소르베이트 20(P20; 트윈 20)을 함유한다. 속효성 인슐린 제형들에 사용된 완충액들은, 예를 들어 인산일수소나트륨 완충액 및 트로메타몰(Trometamol; 트리스 또는 THAM로도 공지됨)을 포함할 수 있다.

3. 히알루로난 분해 효소 및 인슐린 복합제형

속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 rHuPH20)를 함유하는 조성물은 속효성 인슐린 단독과 비교하여 비당뇨병 환자 대상체의 내인성(즉, 천연) 인슐린의 식후 방출을 더욱 근접하게 모방하는 초속효성 인슐린 조성물을 생성한다(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 US2009-0304665 호 참조). 따라서 이러한 초속효성 인슐린 조성물은 당뇨병 환자들에 사용되어 속효성 인슐린 단독에 비해 혈당치를 더욱 정확하게 조절하고 고혈당 변동폭(hyperglycemic excursion)을 감소시켜, 환자에게 실질적인 이점을 제공할 수 있다.

그러나, 속효성 인슐린의 다중 투여 제형들 및 히알루로난 분해 효소들의 제형들은 불화합성이고, 상기 2개의 제형들의 혼합은 일반적으로 히알루로난 분해 효소의 안정성 및 활성의 신속한 손실 및 인슐린 용해도 및 안정성의 신속한 손실을 초래한다. 따라서 현재까지는 초속효성 조성물은 활성의 손실을 예방하기 위해 인슐린과 히알루로난 분해 효소를 조합한 직후에 투여되어야 한다. 이는 불가능한 일이며, 당뇨 환자에게 있어서는 받아들이기 어려운 부담이다.

따라서 본원에서는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 rHuPH20)의 안정한 복합제형을 제공한다. 본원에서 제공된 복합제형은 당뇨병의 치료, 특히 식후 혈당치 조절을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 안정한 복합제형은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소 또는 폐쇄 루프 시스템에 제공되거나 임의의 기타 적합한 컨테이너에 제공될 수 있는 다중 용량 제형인 복합제형을 포함한다.

a. 안정성에 대한 반대 요건

인슐린, 및 가용성 히알루로니다아제들(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소들의 안정한 복합제형들의 개발을 방해하는 주요 장벽은 냉장된 온도에서의 속효성 인슐린의 결정화 및 침전, 및 승온에서의 히알루로난 분해 효소의 안정성을 포함한다. 일반적으로, 이러한 결과를 정상적으로 예방하는 부형제들 및 조건들은 2개의 활성제에 있어서 서로 상이하다. 인슐린 제형들의 가용성 및 안정성을 유지하기에 최적인 일부 부형제들 및 조건들은 가용성 히알루로니다아제들(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소들의 안정성 및 활성에 대해 악영향을 미칠 수 있다. 반대로, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정성에 최적인 부형제들 및 조건들은 인슐린의 안정성 및 가용성에 악영향을 미친다.

속효성(rapid-acting) 인슐린 유사체들을 포함한 인슐린의 기존의 제형들과 rHuPH20과 같은 가용성 히알루로니다아제들의 기존의 제형들을 단순히 혼합하면, 장기간의 냉장 저장 또는 주위 온도 또는 승온에서의 저장 하에 안정하지 않는 제형을 초래한다. 이는 인슐린 활성의 손실뿐만 아니라, rHuPH20의 신속한 응집 및 효소 활성의 손실에 기인한다. 이들 유해한 영향은 보존제들의 유형 및 농도, NaCl 농도, 아연 농도, pH 및 저장 온도를 들 수 있지만 이에 제한되지 않으며 다중 불화합성 부형제들 및 조건들의 결과이다. 따라서 상기 약제들 모두가 가용성이고 안정하며 활성인 상태인 제형들을 확인하는 것은 매우 어려운 일이다.

i. 보존제

다중투여 인슐린 제형들에는 상기 제형을 함유하는 바이알, 펜 카트리지 또는 기타 다중 투여 컨테이너에 대한 반복적인 접촉을 통해 제형에 유입될 수 있는 미생물 오염을 방지하기 위해 보존제들이 포함된다. 상기 보존제들은 일반적으로 규제 규칙을 만족시키기에 충분한 농도로 존재해야 한다. 예를 들어, 규제 요건 평가에 따르면, 상기 제형의 항균 유효성은 표적 시장의 보존제 유효성 시험(PET) 요건들을 만족시켜야 하는 것으로 나타나 있다. 미국 약전(USP) 및 유럽 약전(EP)의 PET 요건들은 상당히 다르며, 다중투여 제형들을 개발하는데 부가적인 제약을 부가한다.

판매되는 인슐린 제형들은 일반적으로 페놀, 메타-크레졸 (m-크레졸) 및/또는 메틸파라벤을 함유한다. 이들 화합물들은 효과적인 항균제로서 작용할 뿐만 아니라, 인슐린 분자의 육량체성 형태를 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 그러나 상기 인슐린 제형들에 사용된 보존제의 농도 및 유형이 중요하다. 예를 들어, 페놀성 화합물들이 최적의 농도에서 육량체성 인슐린 분자를 안정화시킬 수 있을지라도, 인슐린의 가용성은 보존제의 농도가 증가함에 따라 감소한다. 따라서 인슐린 제형들 중의 보존제의 농도는 본질적인 항균 활성을 제공할 뿐만 아니라 안정성과 가용성 모두에 대해 중요하다.

필수 구성성분일지라도, 보존제들은 일반적으로 수용액에서 단백질의 응집을 유도하기 때문에 단백질의 안정한 다중 투여 제형들을 개발하는데 유의한 문제점을 갖는다. 예를 들어, 페놀, m-크레졸 및 벤질 알코올과 같은 보존제들은 인간 성장 호르몬([Maa 및 Hsu (1996) Int . J. Pharm . 140: 155-168]), 재조합 인터류킨-1 수용체([Remmele (1998) Pharm . Res. 15: 200-208]), 인간 인슐린 유사 성장 인자 I([Fransson (1997) Pharm . Res. 14: 606-612]), rhIFN-γ([Lam (1997) Pharm . Res. 14: 725-729]) 및 시토크롬 c([Singh 등, (2011) J. Pharm Sci ., 100: 1679-89])의 응집을 유도하는 것으로 나타났다. 상기 보존제들이 용액에서 단백질에 미치는 불안정화 효과는 다중 투여 제형들의 개발에서 제한 인자였으며, 현재가지 대부분의 단백질 치료제들은 단지 1회용으로 제형화되어왔다.

대부분의 기타 단백질 치료제들과 마찬가지로, rHuPH20과 같은 PH20 히알루로니다아제는 보존제들의 존재 하에 급속하게 활성을 상실하며, 이는 단백질의 풀림(unfolding) 및 후속적인 집합체 형성에 기인되는 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 실시예에 나타낸 바와 같이, 보존제들은 특히 상승된 온도에서 PH20 효소 활성을 감소시킨다. 본원에서의 결과에 따르면, 동적 광산란(DLS), 시차 주사 열량법(DSC) 및 기타 물리적 화학적 특성화 기법들에 의해 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20의 용해 온도는 m-크레졸과 같은 페놀성 보존제들이 상기 제형에 첨가되는 경우에 유의하게 감소하는 것으로 나타나 있다. 예를 들어, rHuPH20의 풀림 온도는 44℃에서 24℃로 감소한다. 낮아진 PH20 풀림 온도는 특히 상승된 온도에서 PH20 응집을 증가시키고, 효소 활성을 감소시킨다.

상기한 바와 같이, 페놀, m-크레졸, 및 파라벤류과 같은 이들 페놀성 화합물들은 인슐린 제형들에 사용되는 바로 그 보존제들이다. 상기 불안정화 효과는 페놀성 보존제들의 소수성 특징에서 기인할 가능성이 있다. 상기 페놀성 화합물들의 소수성은 단백질에 대한 비-특이적 결합을 통해 rHuPH20과 상호작용을 야기하여, 궁극적으로는 rHuPH20의 구조적 온전성을 방해할 수 있다. 이는 보존제들의 존재 하에 rHuPH20 효소 활성의 유의한 손실로 이어진다.

본원의 실시예에서 증명된 바와 같이, 페놀성 보존제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 및 메틸파라벤)의 수준이 증가하고, 및/또는 온도가 증가함에 따라 rHuPH20 효소 활성에 대한 악영향 또한 증가한다. 예를 들어, 상기 rHuPH20의 효소 활성은 전체 보존제 수준이 상대적으로 높은(0.2% 초과) 경우에 35℃에서 배양한지 1주일 후에 유의하게 감소하였다. 실온 및 더욱 낮은 보존제 농도에서, 상기 효소는 적어도 1개월 동안 상대적으로 충분한 이의 활성을 유지한다. 게다가, 페놀성 화합물의 유형 또한 rHuPH20의 활성에 영향을 미치며, m-크레졸이 rHuPH20 활성에 가장 유해하고, 이어 페놀, 그 다음이 메틸파라벤이다. 그러나 메틸파라벤이 상기 페놀성 화합물들의 rHuPH20 활성에 대해 유해성이 가장 낮을 지라도 항균제로서 효과가 가장 낮으며, 따라서 최적의 보존제는 아니다. 티메로살 및 클로르헥시딘 염과 같은 기타 보존제들은 rHuPH20과 더욱 상용성으로 나타나지만, 광범위하게 수용되지는 않는다. 따라서 비-전형적인 이들 보존제들을 함유하는 제형들은 부가적인 규제 장벽에 직면한다.

상기 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20의 효소 활성에 대한 보존제들의 유해한 영향은 상승된 온도에서 상당히 증가된다. 실시예에서 나타낸 바와 같이, 페놀성 보존제들은 상기 효소의 용해 온도(T_m)에 악영향을 미친다. 예를 들어, rHuPH20에 대한 T_m은 보존제의 부재 하에 40℃ 초과의 온도에서부터, 예를 들어 0.25% m-크레졸의 존재 하에는 약 26℃까지 떨어진다. 따라서 rHuPH20의 T_m은 보존제를 용액 중의 rHuPH20에 첨가하는 경우에 유의하게 감소한다. 그 결과, 상기 가용성 히알루로니다아제는 승온에서 풀리게 된다. 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이러한 변성 및 후속적인 응집은 승온에서 보존제들의 존재 하에 rHuPH20 분자의 증가된 크기로 반영된다.

따라서 보존제들은 이들의 항균 활성들을 위해 요구되고 육량체성 인슐린에 대한 이들의 안정화 효과로 인해 유용할지라도 rHuPH20과 같은 히알루로난 분해 효소들의 안정성 및 활성에 대해 그리고 인슐린의 가용성에 대해 해로운 영향을 미칠 수 있다.

ii. NaCl 및 pH

인슐린 및 히알루로난 분해 효소들(예를 들어, rHuPH20)의 안정한 복합제형들을 개발하는데 있어서 다른 특정 문제점은 인슐린 가용성에 대한 최적의 pH 및 NaCl 농도 범위가 rHuPH20에 대한 최적의 pH 및 NaCl 농도 범위와 상이하다는 사실이다. 예를 들어, 인슐린 및 인슐린 유사체들의 가용성은 더욱 높은 pH(예를 들어, 7.2 초과) 및 더욱 낮은 NaCl 농도(예를 들어, 140mM 미만)와 함께 증가하는 경향이 있으며, 이의 조건들은 일반적으로 특히 승온에서 장기간 저장 하에 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20의 안정성에 악영향을 미친다. 이러한 차이는 보존제들의 존재 하에 더욱 더 악화되며, 이는 인슐린의 가용성 및 rHuPH20의 안정성을 감소시키는 경향이 있다.

레귤러 인슐린 및 신속 작용 인슐린 유사체들의 겉보기 가용성은 가용성이 가장 낮은 레귤러 인슐린에서부터 인슐린 리스프로까지, 이어 인슐린 아스파르트에서 가용성이 가장 큰 최종 인슐린 글루리신에 이르기까지 가용성이 증가하면서 변한다. 상기 가용성은 제형내의 NaCl에 대한 내성과 직접 관련이 있기 때문에, 레귤러 인슐린 및 인슐린 리스프로를 함유하는 판매되는 용액에는 NaCl이 존재하지 않고, 소량의 NaCl(10mM)이 인슐린 아스파르트 판매 제형에 존재하며, 다량의 NaCl(85mM)이 인슐린 글루리신의 판매되는 제형들에 존재한다.

상기 인슐린 제형들에서 NaCl 농도가 증가하면, 특히 더욱 낮은 온도에서 인슐린의 결정화/집성이 야기될 수 있다. 또한 가용성은 NaCl에 의해 크게 영향을 받는다. 실시예에서 증명된 바와 같이, 냉장된 인슐린 용액의 NaCl 농도가 50mM에서 140mM로 증가하는 경우, 레귤러 인슐린, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로의 가용성은 유의하게 감소한다. 그러나 실시예에서 증명된 바와 같이, 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20의 안정성의 경우 그 상반된 결과이다. 승온(예를 들어, 25℃ 및 30℃)에서 용액 중의 rHuPH20의 안정성은 NaCl 농도가 140mM에서 50mM로 감소함에 따라 시간의 경과와 함께 상당히 감소한다.

인슐린의 가용성은 또한 pH에 의해 크게 영향을 받는다. 인슐린의 가용성에 대한 더욱 높은 농도의 NaCl의 영향과 유사하게, 인슐린의 가용성에 대한 유사한 악영향이 pH를 7.6에서 6.6으로 감소시킴으로써 관측된다. 따라서 낮은 pH 및 높은 NaCl에서, 인슐린의 가용성이 크게 감소한다. 반대로, 인슐린의 가용성은 낮은 NaCl 및 높은 pH에서 최대이다. 인슐린과 PH20 사이의 NaCl 농도의 반대 요건과 유사하게, pH 요건들도 또한 반대이다. 승온(예를 들어, 25℃ 및 30℃)에서 용액 중의 rHuPH20의 안정성은 pH가 7.0에서 7.6으로 증가함에 따라 시간의 경과와 함께 크게 감소하였다.냉장된 온도에서 rHuPH20은 pH 및 NaCl 농도와는 무관하게 상대적으로 안정하다.

따라서 인슐린의 가용성 및 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20)의 안정성에 대한 최적의 NaCl 농도 및 pH는 양립할 수 없는 것으로 보인다. 인슐린의 가용성은 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 NaCl 농도에서 최대이다. 그러나 이들 조건은 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20에 대해 유해하며, 이는 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 NaCl 농도에서 안정성을 잃는다. rHuPH20의 안정성은 NaCl 농도를 증가시키고 pH를 낮춤으로써 증가될 수 있다. 그러나 이러한 조건은 낮은 pH 및 높은 NaCl 농도에서 침전하는 인슐린 및 인슐린 유사체들의 가용성에 악영향을 미친다. 따라서 인슐린 및 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20 또는 기타 히알루로난 분해 효소)의 안정한 복합제형들의 개발에서 주요 어려운 점들 중 하나는 상기 인슐린이 가용성이고 활성인 상태이고 상기 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20)가 안정하고 활성인 상태인 NaCl 농도 및 pH를 확인하는 것이다. 이는 본원에서 달성되었다.

b. 호환성 복합제형

안정성에 대한 인슐린 및 PH20 히알루로니다아제와 같은 히알루로니다아제의 반대 요건들은 복합제형에서 호환성을 최적화하기 위해 일부 매개 변수들이 균형을 이루어야 한다는 것을 의미한다. 본원에서 제공된 안정한 복합제형들은 허용 가능한 수준의 히알루로난 분해 효소 활성 및 인슐린 가용성 및 활성을 보유하기 위해 목적하는 균형을 이룬 보존제들, 염(예를 들어, NaCl), pH, 안정제(들), 및/또는 완충액을 함유한다. 위에서 논의된 바와 같이, 이러한 균형 확인의 어려움은 수배가 된다. 첫 번째 예로서, 다중 투여 제형들 중의 항-박테리아제로서 요구되는 페놀성 보존제들과 같은 보존제들은 rHuPH20과 같은 히알루로난 분해 효소들에 대한 유의한 불안정화 효과를 가지며, 그 결과 활성의 급격한 손실을 초래한다. 두 번째로, 인슐린의 가용성 및 안정성에 대한 최적의 NaCl 농도 및 pH는 히알루로난 분해 효소들의 안정성에 대한 것들과는 매우 상이하다. 인슐린의 가용성은 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 NaCl 농도에서 최대이다. 그러나 이들 조건들은 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 염 농도에서 안정성을 잃는 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20에 대해 유해하다. 이러한 rHuPH20의 불안정성은 보존제들의 존재 하에 더욱 더 악화된다. rHuPH20의 안정성은 NaCl 농도를 증가시키고 pH를 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 그러나 이러한 조건들은 낮은 pH 및 높은 염 농도에서 침전하는 인슐린 및 인슐린 유사체들의 가용성에 대해 악영향을 미친다.

따라서 히알루로난 분해 효소 및 속효성 인슐린 모두가 가용성이고 안정하며 활성인 상태인 조건을 확인하는 것은 극도로 어려운 일이다. 그럼에도 불구하고, 본원에서 제공된 복합제형들은 이들 조건을 제공한다. 최적의 염(예를 들어, NaCl), pH 및 보존제 조합이 확인될 뿐만 아니라, 부가적인 안정제들 및 완충액들도 또한 확인되어, 이들이 서로 조합되는 경우 및 어떤 경우에 상술한 염, pH 및 보존제들이 인슐린의 가용성을 유지할 뿐만 아니라 히알루로난 분해 효소 및 인슐린을 안정화시킨다. 예를 들어, 본원에서는 Lys-Lys가 효소 활성 및 인슐린 가용성을 유지하면서 NaCl가 사용되지 않거나 더욱 낮은 농도로 사용될 수 있도록 제형 내에서 사용될 수 있는 NaCl에 대한 대체물로서 일부 인슐린 유사체들과 함께 사용될 수 있는 안정제인 것으로 밝혀졌다.

하기 섹션에서는 제형들 또는 복합제형들에 포함시키기 위한 예시적인 히알루로난 분해 효소들 및 인슐린, 예시적인 안정한 제형들 및 복합제형들, 제형들 및 복합제형들의 안정성 및 활성을 평가하기 위한 방법들, 및 다양한 질병 및 상태에서 제형들 또는 복합제형들의 이용 방법들이 개시되어 있다.

C. 히알루로난 분해 효소

본원에서는 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형들이 제공된다. 또한 본원에서는 인슐린 및 히알루로난 분해 효소를 함유하는 안정한 복합제형들이 제공된다. 예를 들어, 본원에서의 상세한 설명 및 실시예에서는 인슐린, 및 히알루로니다아제와 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형들은 각각이 개별적으로 안정성 및 활성에 대한 반대 요건을 가질지라도 제조될 수 있는 것으로 나타나 있다. 이는 PH20(예를 들어, rHuPH20)에 의해 본원에서 예시되어 있지만, 가용성 히알루로니다아제들과 같은 기타 히알루로난 분해 효소들, 또는 기타 PH20 폴리펩티드들에 대해 일반화될 수 있다.

특히, 본원에서는 GPI 앵커 모티프의 전체 또는 일부가 없는 절단된 히알루로니다아제(예를 들어, C-말단이 절단됨)와 같은 히알루로니다아제인 히알루로난 분해 효소를 함유하는 제형들 또는 복합제형들이 제공된다. 이러한 히알루로니다아제 폴리펩티드들은 재조합에 의해 세포에서 발현되며, 이로부터 발현시 배지로 분비될 수 있다. 배지 내로의 분비로 인해 정상적으로는 세포막과 연결되어 있는 히알루로니다아제들은 절단되는 경우에 가용성 단백질 산물로서 존재할 수 있다. 본원에서 제공되거나 당업계에 공지된 바와 같은 히알루로난 분해 효소들을 생성하고 및/또는 발현하며, 본원의 상세한 설명 및 교시에 기초하여 안정한 제형들 또는 복합제형들을 제조하는 것이 당해 기술분야의 숙련자의 범주 이내에 있다.

히알루로난 분해 효소들은 이당류 반복 유닛, 즉 D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)으로 구성된 히알루로난 중합체들을 절단함으로써 히알루로난을 분해하도록 작용하며, 이들 반복 유닛들은 택일적인 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통해 서로 연결된다. 히알루로난 체인들은 그 길이가 약 25,000개의 이당류 반복서열 또는 그 이상에 도달할 수 있으며, 히알루로난의 중합체들은 생체 내에서 약 5,000 내지 20,000,000Da 크기의 범위를 가질 수 있다. 히알루론산 또는 히알루론산염으로도 지칭되는 히알루로난은 결합 조직, 상피 조직 및 신경 조직 전반에 걸쳐 광범위하게 분포되어 있는 비황산화된 글리코사미노글리칸이다. 히알루로난은 세포외 기질의 본질적인 구성성분이고, 체내 기관 사이의 장벽(interstitial barrier)의 주요 성분이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해 효소들은 히알루로난의 점도를 낮추어, 조직 투과성을 증가시키고 비경구 투여된 유체의 흡수 속도를 증가시킨다. 상기와 같이, 히알루로니다아제들과 같은 히알루로난 분해 효소들은, 예를 들어 이들의 분산 및 전달을 향상시키기 위해 기타 약제, 약물 및 단백질들과 함께 확산제 또는 분산제로서 사용되어 왔다.

따라서 히알루로난 분해 효소들은 히알루로난 이당류 체인 또는 중합체의 절단을 촉매하는 능력을 갖는 임의의 효소를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 분해 효소는 상기 히알루로난 체인 또는 중합체 중의 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 기타 실시예에서, 상기 분해 효소는 히알루로난 체인 또는 중합체 중의 β-1→3 글리코시드 결합의 절단을 촉매한다. 본원에서 제공된 복합제형들 중의 히알루로난 분해 효소들의 예시적인 예로는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커를 함유하지 않는 천연 히알루로니다아제들을 포함하여 세포 발현 시스템으로부터 발현되는 경우에 배지에 분비되는 히알루로니다아제들, 또는 세포 멤브레인으로부터 발현되는 경우에 다르게는 이와 연결되어 있지 않는 GPI 앵커 또는 히알루로니다아제들의 하나 이상의 아미노산이 결여된 절단된 히알루로니다아제들이 있다. 이러한 히알루로니다아제들은 재조합 또는 합성에 의해 생성될 수 있다. 기타 예시적인 히알루로난 분해 효소들로는 히알루로난을 절단하는 능력을 갖는 특정 콘드로이티나아제들 및 리아제들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 복합제형들에 제공된 히알루로난 분해 효소들은 또한 본원에서 개시된 바와 같이 히알루로난 분해 효소의 대립 유전자형 또는 종 변이체들 또는 기타 변이체들을 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소들은 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실과 같은 이의 1차 서열에서의 하나 이상의 변이를 함유할 수 있다. 히알루로난 분해 효소의 변이체는 일반적으로 변이를 함유하지 않는 히알루로난 분해 효소에 비해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상, 또는 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 임의의 변이는 본원에서의 목적을 위해 히알루로난 분해 효소에 포함될 수 있으며, 단 상기 효소는 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소의 활성의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상, 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상과 같은 히알루로니다아제 활성을 보유한다(당업계에 널리 공지되고 본원에서 개시된 시험관 내 및/또는 생체 내 검정들에 의해 측정됨).

히알루로니다아제들을 포함한 히알루로난 분해 효소들의 다양한 형태는 인간을 포함한 대상체에서 치료용 용도로 제조되어 승인되었다. 예를 들어, 동물 유래 히알루로니다아제 제제들로는 정제된 양 고환 히알루로니다아제인 Vitrase^®(ISTA 파마슈티컬스(ISTA Pharmaceuticals)) 및 소 고환 히알루로니다아제인 Amphadase^®(암파스타(Amphastar Pharmaceuticals)를 들 수 있다. Hylenex^®(백스터(Baxter))는 절단된 인간 PH20 폴리펩티드(rHuPH20으로 명명됨)를 암호화하는 핵산을 함유하는 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생성된 인간 재조합 히알루로니다아제이다. 임의의 히알루로니다아제와 같은 임의의 히알루로난 분해 효소는 본원에서 제공된 안정한 복합제형들에 포함될 수 있는 것으로 이해된다.(예를 들어, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 미국 특허 제 7,767,429 호, 및 미국 공개공보 제 2004-0268425 호 및 제 2010-0143457 호 참조).

일반적으로, 본원에서 제형들 및 복합제형들에 사용하기 위해서, 본원에서 개시된 바와 같은 인간 PH20 및 특히 C-말단 절단된 인간 PH20과 같은 인간 히알루로난 분해 효소가 사용된다. 기타 동물들로부터 유래한 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소들이 이용 가능할지라도, 이러한 제제들은 동물 단백질이기 때문에 잠재적으로 면역성이다. 예를 들어, 유의한 비율의 환자들에서는 섭취한 음식에 대해 부차적인 사전 감작(prior sensitization)이 증명되며, 이들이 동물 단백질이기 때문에 모든 환자들은 후속적인 감작 위험성을 갖는다. 따라서 비인간 제제들은 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비인간 제제들이 필요한 경우, 이들은 감소된 면역원성을 갖도록 제조될 수 있다. 이러한 변형은 당해 기술분야의 숙련자의 범주 내에 있으며, 예를 들어 분자 상의 하나 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 교체를 포함할 수 있다.

본원에서 제공된 제형들 및 복합제형들에서 사용된 히알루로니다아제들(예를 들어, PH20)을 포함한 히알루로난 분해 효소들은 재조합에 의해 생성될 수 있거나, 예를 들어 고환 추출물과 같은 천연 공급원으로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해 효소를 포함한 재조합 단백질을 제조하기 위한 방법들은 본원의 다른 곳에 제공되며, 당업계에 널리 공지되어 있다.

1. 히알루로니다아제

히알루로니다아제들은 히알루로난 분해 효소들의 거대 패밀리의 일원이다. 히알루로니다아제들의 3개의 일반적인 분류: 포유동물형 히알루로니다아제들, 박테리아 히알루로니다아제들 및 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류로부터 유래한 히알루로니다아제들이 있다. 이러한 효소들은 본원에서 제공된 복합제형들에 사용될 수 있다.

a. 포유동물형 히알루로니다아제

포유동물형 히알루로니다아제들(EC 3.2.1.35)은 사당류 및 육당류(hexasaccharide)와 같은 다양한 올리고당 길이로 히알루로난의 β-1→4 글리코시드 결합을 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들 효소는 가수분해 및 글리코시드 전달 효소 활성 모두를 가지며, 히알루로난 및 황산 콘드로이틴류(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 이러한 유형의 히알루로니다아제들은 소(소과)(서열번호 10, 11 및 64, 및 BH55(미국 특허 제 5,747,027 호 및 제 5,827,721 호)), 양(양과)(서열번호 26, 27, 63 및 65), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 호박벌(서열번호 15), 쌍살벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19 및 32), 돼지(서열번호 20 및 21),랫트(서열번호 22 내지 24 및 31), 토끼(서열번호 25), 오랑우탄(서열번호 28), 필리핀 원숭이(서열번호 29), 기니아 피그(서열번호 30), 침팬지(서열번호 185), 및 붉은털원숭이(서열번호 186)에서 유래한 히알루로니다아제들, 및 인간 히알루로니다아제들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

포유동물 히알루로니다아제들은 중성에서 활성이고 고환 추출물에서 주로 발견되는 히알루로니다아제, 및 산성에서 활성이고 간과 같은 기관에서 주로 발견되는 히알루로니다아제로 더 재분류될 수 있다. 예시적인 중성 활성 히알루로니다아제들은 양(서열번호 27), 소(서열번호 11) 및 인간(서열번호 1)과 같은 상이한 종으로부터 유래한 PH20을 포함하는 PH20을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 PH20(SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20으로도 공지됨)은 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 세포막에 부착되어 있다. 이는 자연적으로 정자-난자 접합에 관여하고, 히알루론산을 분해함으로써 난구 세포층의 정자 침투를 돕는다. 본원에서 복합제형들에 사용된 히알루로니다아제들의 예시적인 예로는 중성 활성 히알루로니다아제들이 있다.

인간 PH20(SPAM1로도 지칭됨) 이외에도, 5개의 히알루로니다아제 유사 유전자들, 즉 HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1이 인간 게놈에서 확인되었다. HYALP1은 위유전자(pseudogene)이고, HYAL3(서열번호 38)은 임의의 공지된 기질들에 대해 효소 활성를 갖는 것으로 나타나지 않았다. HYAL4(서열번호 39로 개시된 전구체 폴리펩티드)는 콘드로이티나아제이고, 히알루로난에 대해 활성을 거의 나타내지 않는다. HYAL1(서열번호 36으로 개시된 전구체 폴리펩티드)은 원형의 산 활성 효소이고, PH20(서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드)은 원형 중성 활성 효소이다. HYAL1 및 HYAL2(서열번호 37로 개시된 전구체 폴리펩티드)와 같은 산 활성 히알루로니다아제들은 일반적으로 중성 pH(즉, pH 7)에서 촉매 활성이 결여되어 있다. 예를 들어, HYAL1은 pH 4.5 초과에서는 시험관 내 촉매 활성을 거의 갖지 않다([Frost 등, (1997) Anal. Biochem . 251 :263-269]). HYAL2는 시험관 내에서 매우 낮은 특어적 활성을 갖는 산 활성 효소이다. 상기 히알루로니다아제 유사 효소들을 또한 일반적으로 인간 HYAL2 및 인간 PH20과 같은 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 플라즈마 멤브레인에 부착되는 효소들([Danilkovitch-Miagkova 등, (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8): 4580-5]), 및 인간 HYAL1과 같이 일반적으로 가용성인 효소들([Frost 등, (1997) Biochem Biophys Res Commun . 236(1): 10-5])에 의해 특징지어질 수 있다.

PH20

기타 포유동물 히알루로니다아제들과 같이, PH20은 사당류 및 육당류와 같은 다양한 올리고당 길이로 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해 및 글리코시드 전달 효소 활성 모두를 가지며, 히알루론산, 및 C4-S 및 C6-S와 같은 콘드로이틴류를 분해할 수 있다. PH20은 자연적으로 정자-난자 접합에 참여하고, 히알루론산 분해에 의한 난구 세포층의 정자 침투를 돕는다. PH20은 정자 표면 상에 위치하고, 리소좀 유래 첨체에 위치하며, 여기서 이는 내부 첨체 멤브레인과 결합되어 있다. 세포막 PH20은 중성 pH에서만 히알루로니다아제 활성을 갖는 반면, 내부 첨체 멤브레인 PH20은 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다아제 이외에도, PH20은 HA 유도 세포 신호전달을 위한 수용체, 및 난모세포를 둘러싼 투명대를 위한 수용체인 것으로 나타나 있다.

예시적인 PH20 단백질들로는 인간(서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드, 및 서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드), 소(서열번호 11 및 64), 토끼(서열번호 25), 양 PH20(서열번호 27, 63 및 65), 필리핀 원숭이(서열번호 29), 기니아 피그(서열번호 30), 랫트(서열번호 31), 마우스(서열번호 32), 침팬지(서열번호 185) 및 붉은털원숭이(서열번호 186) PH20 폴리펩티드들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

소 PH20은 553개의 아미노산의 전구체 폴리펩티드(서열번호 11)이다. 인간 PH20와 소 PH20의 배열은 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인하여 개별 카르복실 말단을 통해 470 아미노산에서부터 다수의 갭을 가진 약한 상동성만을 나타낸다(예를 들어, [Frost GI (2007) Expert Opin . Drug. Deliv . 4: 427-440] 참조). 사실상, 분명한 GPI 앵커들이 인간을 제외한 기타 많은 PH20 종에서 예측되지 않는다. 따라서 양 및 소로부터 생성된 PH20 폴리펩티드들은 자연적으로는 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20이 세포막에 매우 느슨하게 부착되어 존재할지라도, 이는 포스포리파아제 민감성 앵커를 통해 고착되지 않는다([Lalancette 등, (2001) Biol Reprod. 65(2): 628-36]). 이러한 소 히알루로니다아제의 독특한 특징은 임상적 사용을 위한 추출물로서 가용성 소 고환 히알루로니다아제 효소의 사용을 허용해 왔다(Wydase^®, Hyalase^®).

인간 PH20 mRNA 전사체는 정상적으로는 N 말단(1 내지 35번째 아미노산 잔기 위치)에 35개의 아미노산의 신호 서열, 및 C 말단(491 내지 509번째 아미노산 잔기 위치)에 19개의 아미노산의 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 부착 신호 서열을 함유하는 509개의 아미노산의 전구체 폴리펩티드(서열번호 1)를 생성하도록 번역된다. 따라서 성숙한 PH20은 서열번호 2로 개시된 474개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 ER로의 전달, 및 신호 펩티드의 제거 이후, C-말단 GPI-부착 신호 펩티드는 서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드의 490번째 위치에 상응하는 아미노산 위치에 새롭게 형성된 C-말단 아미노산에 대한 GPI 앵커 공유결합성 부착을 조장하기 위해 절단된다. 따라서 서열번호 2로 개시된 아미노산 서열을 갖는 474개의 아미노산의 GPI-고착된 성숙한 폴리펩티드가 생성된다.

인간 PH20이 GPI 앵커를 통해 세포막에 존재하는 경우에는 중성 활성 히알루로니다아제일지라도, 이는 내부 첨체 멤브레인 상에서 발현되는 경우에는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 나타낸다. PH20은 폴리펩티드의 독특한 영역에서 2개의 촉매 부위, 즉 펩티드 1 영역 및 펩티드 3 영역을 함유하는 것으로 나타난다([Cherr 등, (2001) Matrix Biology 20: 515-525]). 서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드의 107 내지 137번째 아미노산 위치, 및 서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드의 142 내지 172번째 아미노산 위치에 상응하는 PH20의 펩티드 1 영역은 중성 pH에서의 효소 활성을 위해 필요하다. 이러한 영역 내의 111번 및 113번째 위치에 있는 아미노산들(서열번호 2로 개시된 성숙한 PH20 폴리펩티드에 상응함)은, 아미노산 교체에 의한 돌연변이 유발이 야생형 PH20과 비교하여 각각 3% 히알루로니다아제 활성 또는 검출 불가능한 히알루로니다아제 활성을 갖는 PH20 폴리펩티드들을 초래함에 따라 중요한 것으로 나타난다([Arming 등, (1997) Eur . J. Biochem . 247: 810-814]).

서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드의 242 내지 262번째 아미노산 위치, 및 서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드의 277 내지 297번째 아미노산 위치에 상응하는 펩티드 3 영역은 산성 pH에서 효소 활성을 위해 중요한 것으로 나타나 있다. 이러한 영역 내에서 성숙한 PH20 폴리펩티드의 249번 및 252번째 위치에 있는 아미노산들이 활성을 위해 필수적인 것으로 나타나며, 이들 중 하나의 돌연변이 유발은 본질적으로 활성이 없는 폴리펩티드를 초래한다([Arming 등, (1997) Eur . J. Biochem. 247: 810-814]).

촉매 부위 이외에, PH20은 또한 히알루로난 결합 부위를 함유한다. 실험적 증거는 이러한 부위가 서열번호 1로 개시된 전구체 폴리펩티드의 205 내지 235번째 아미노산 위치, 및 서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드의 170 내지 200번째 아미노산 위치에 상응하는 펩티드 2 영역에 위치하는 것을 나타낸다. 이러한 영역은 히알루로니다아제들 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 헤파린 결합 모티프와 유사하다. 176번째 위치(서열번호 2로 개시된 성숙한 PH20 폴리펩티드에 상응함)에서 아르기닌 잔기의 글리신으로의 돌연변이는 야생형 폴리펩티드의 히알루로니다아제 활성의 오직 약 1%만을 갖는 폴리펩티드를 초래한다([Arming 등, (1997) Eur . J. Biochem. 247: 810-814]).

서열번호 1로 예시된 폴리펩티드의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에 인간 PH20에서의 7개의 가능한 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 서열번호 1의 36 내지 464번째 아미노산들이 최소 활성인 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 함유하는 것으로 나타나기 때문에 N-연결된 글리코실화 부위 N-490은 적절한 히알루로니다아제 활성을 위해서 요구되지 않는다. 인간 PH20에는 6개의 이황화 결합이 존재한다. 서열번호 1로 예시된 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C60과 C351 및 C224와 C238(서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드의 잔기 C25와 C316 및 C189와 C203에 각각 상응함) 사이에는 2개의 이황화 결합이 존재한다. 추가적인 4개의 이황화 결합은 서열번호 1로 예시된 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376과 C387; C381과 C435; C437과 C443; 및 C458과 C464(서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드의 잔기 C341과 C352; C346과 C400; C402와 C408; 및 C423과 C429 사이에 각각 상응함) 사이에 형성되어 있다.

b. 박테리아 히알루로니다아제

박테리아 히알루로니다아제들(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)은 히알루로난을 분해하고, 황산 콘드로이틴류 및 황산 더마탄류를 다양한 정도로 분해한다. 박테리아로부터 정제된 히알루로난 리아제들은 이들의 작용 형태로 인해 히알루로니다아제들(예를 들어, 다른 공급원 유래의 히알루로노글루코사미니다아제, EC 3.2.1.35)과는 상이하다. 이들은 히알루로난에서 N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기들 사이의 β1→4-글루코시드 결합의 가수분해가 아닌 제거 반응을 촉매하여, 3-(4-데옥시-β-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민 사당류 및 육당류, 및 이당류 최종 산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다아제이다. 상기 반응은 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기들과 함께 올리고당류의 형성을 초래한다.

본원에서 제공된 복합제형들을 위한 박테리아 유래 예시적인 히알루로니다아제들로는 아스로박터, 브델로비브리오, 크로스트리디움(Clostridium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스트렙토코쿠스, 펩토코쿠스(Peptococcus), 프로피오니박테리움, 박테로이데스(Bacteroides), 및 스트렙토마이세스의 균주를 포함하는 미생물 중의 히알루로난 분해 효소들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 효소들의 특정 예로는 아스토박터 종(FB24 균주)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보루스(서열번호 68), 프로피오니박테리움 아크네스(서열번호 69), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(서열번호 70; 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73)), 스타필로코쿠스 아우레우스(COL 균주)(서열번호 74); MRSA252 균주(서열번호 75 및 76); MSSA476 균주(서열번호 77); NCTC 8325 균주(서열번호 78); 소 RF122 균주(서열번호 79 및 80); USA300 균주(서열번호 81), 스트렙토코쿠스 뉴모니에((서열번호 82); ATCC BAA-255/R6 균주(서열번호 83); 혈청형 2, D39/NCTC 7466 균주(서열번호 84), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, MGAS10270 균주(서열번호 86); 혈청형 M4, MGAS10750 균주(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, MGAS2096 균주(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, MGAS9429 균주(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코쿠스 수이스(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피세리(ATCC 700601/ES1 14 균주(서열번호 96)), 및 히알루론산에 대해 특이적이고 콘드로이틴 또는 황산 콘드로이틴을 절단하지 못하는 스트렙토마이세스 히알루로노라이티쿠스 히알루로니다아제 효소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다([Ohya, T. 및 Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198: 607]).

c. 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제

거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제들(EC 3.2.1.36)은 사당류 및 육당류 최종 산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다아제이다. 이들 효소들은 히알루론산염에서 β-D-글루쿠론산염과 N-아세틸-D-글루코사민 잔기들 사이 1→3 결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리류 유래 히알루로니다아제 예시들은 히루디니대(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)), 에르포브데리대(Erpobdellidae)(예를 들어, 네페롭시스 오브스큐라(Nephelopsis obscura) 및 에르포브델라 펀크타타(Erpobdella punctata)), 글로시포니이대(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데세로브델라 픽카(Desserobdella picta), 헬로브델라 스태그날리스(Helobdella stagnalis), 글로시포니아 콤플라나타(Glossiphonia complanata), 플라코브데라 오르나타(Placobdella ornata) 및 테로마이존 종(Theromyzon sp.)) 및 해모피대(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata)) 유래의 히알루로니다아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hovingh 등. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol . 124(3): 319-26]). 거머리 히알루로니다아제와 동일한 작용 기구를 갖는 박테리아 유래 예시적인 히알루로니다아제는 시아노박테리아인 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.)(RCC307 균주, 서열번호 97) 유래 히알루로니다아제이다.

2. 기타 히알루로난 분해 효소

히알루로니다아제 패밀리 이외에, 기타 히알루로난 분해 효소들은 본원에서 제공된 안정한 제형들, 또는 본원에서 제공된 인슐린을 함유하는 복합제형들에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난을 절단하는 능력을 갖는 특정 콘드로이티나아제들 및 리아제들을 포함하는 효소들이 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해하는 예시적인 콘드로이티나아제들은 콘드로이틴 ABC 리아제(콘드로이티나아제 ABC로도 알려짐), 콘드로이틴 AC 리아제(황산 콘드로이틴 리아제 또는 황산 콘드로이틴 엘리미나아제로도 공지됨) 및 콘드로이틴 C 리아제를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공된 조성물들, 조합 및 방법들에 사용하기 위한 이러한 효소를 제조 및 정제하기 위한 방법들이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,054,569 호; [Yamagata 등, (1968) J. Biol . Chem . 243(7): 1523-1535]; [Yang 등, (1985) J. Biol. Chem. 160(30): 1849-1857]).

콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 즉 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 함유하며([Hamai 등, (1997) J Biol Chem . 272(14): 9123-30]), 이는 콘드로이틴-설페이트 및 더마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸류를 분해한다. 황산 콘드로이틴, 콘드로이틴-설페이트 프로테오글리칸 및 황산 더마탄은 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제를 위한 바람직한 기질이지만, 상기 효소는 더 낮은 속도로 히알루로난에 또한 작용할 수 있다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-설페이트 유형 및 더마탄-설페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸류를 분해하여, 상이한 크기의 Δ4-불포화 올리고당류의 혼합물을 생성하고, 이들은 궁극적으로 Δ4-불포화 사당류 및 이당류로 분해된다. 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질 특이성을 갖지만, 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 중합체성 황산 콘드로이틴류 및 이들의 올리고당 단편 모두의 비환원 말단으로부터 이당류 잔기들을 제거한다([Hamai, A. 등, (1997) J. Biol . Chem . 272: 9123-9130]). 예시적인 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제들 및 콘드로이틴-설페이트-ABC 엑소리아제들로는 프로테우스 불가리스 및 플라보박테리움 헤파리눔 유래 엑소리아제들(프로테우스 불가리스 콘드로이틴-설페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 개시되어 있음([Sato 등, (1994) Appl . Microbiol . Biotechnol . 41(l): 39-46]))을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 황산 콘드로이틴류 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이지만, 황산 더마탄(황산 콘드로이틴 B)에 대해서는 활성이 아니다. 박테리아 유래 예시적인 콘드로이티나아제 AC 효소들로는 서열번호 99 및 100으로 각각 개시된 플라보박테리움 헤파리눔 및 빅티발리스 바덴시스 유래 콘드로이티나아제 AC 효소들, 및 아스로박터 아우레센스 유래 콘드로이티나아제 AC 효소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다([Tkalec 등, (2,000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35]; [Ernst 등, (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5): 387-444]).

콘드로이티나아제 C는 황산 콘드로이틴 C를 절단하여, 불포화 6-설페이트 이당류(델타 Di-6S)에 더해 사당류를 생성한다. 이는 또한 히알루론산을 절단하여, 황산화되지 않은 불포화 이당류(델타 Di-OS)를 생성한다. 박테리아 유래 예시적인 콘드로이티나아제 C 효소들로는 스트렙토코쿠스 및 플라보박테리움 유래 콘드로이티나아제 C 효소들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다([Hibi 등, (1989) FEMS -Microbiol-Lett. 48(2): 121-4]; [Michelacci 등, (1976) J. Biol . Chem . 251: 1154-8]; 및 [Tsuda 등, (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133])

3. 절단된 히알루로난 분해 효소 또는 기타 가용성 형태

히알루로난 분해 효소들은 막 결합 또는 막에 연결된 형태로 존재할 수 있거나, 세포에서 발현되는 경우에 배지 내로 분비될 수 있으며, 그 결과 가용성 형태로 존재한다. 본원에서의 목적을 위해, 히알루로난 분해 효소들은 세포에서 발현되고 분비되는 경우에 세포막에 연결되어 있지 않으며, 그 결과 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해 효소들을 포함한다. 가용성 히알루로난 분해 효소들로는 소 PH20 또는 양 PH20과 같은 비인간 히알루로니다아제들(예를 들어, 동물 또는 박테리아 히알루로니다아제들), 및 Hyall과 같은 인간 히알루로니다아제들을 포함하는 히알루로니다아제들, 또는 비인간 또는 인간 멤브레인-연결된 히알루로니다아제들의 절단된 형태, 특히 인간 PH20 및 이의 대립 유전자형 변이체들, 이의 기타 변이체들의 절단된 형태들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공된 복합제형들 중의 히알루로난 분해 효소들의 예시적인 예로는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여되어 있고, 히알루로니다아제 활성을 보유한 히알루로난 분해 효소의 절단된 형태들이 있다. 일 실시예에서, GPI 앵커를 통해 일반적으로 막에 고착된 인간 히알루로니다아제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 전체 또는 일부를 절단 및 제거함으로써 가용성이 되게 할 수 있다.

따라서 어떤 경우, 일반적으로 GPI에 고착된 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 인간 PH20)는 C 말단에서의 절단에 의해 가용성이 부여된다. 이러한 절단은 GPI 앵커 부착 신호 서열 전체를 제거할 수 있거나, GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부만을 제거할 수 있다. 그러나 얻어진 폴리펩티드는 가용성이다. GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부분을 보유하고 있는 가용성 히알루로난 분해 효소의 경우, GPI-앵커 부착 신호 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 보유될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 가용성이고(즉, 세포로부터 발현되는 경우에 분비됨) 활성이다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 당업계에 널리 공지된 방법들을 이용하여 폴리펩티드가 GPI에 고착되어 있는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 방법들로는 GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω 부위의 존재 및 위치를 예상하기 위한 공지된 알고리즘을 사용하는 것, 및 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파아제 C(PI-PLC) 또는 D(PI-PLD)에 의해 분해 이전 및 이후에 가용성 분석을 수행하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 가용성 히알루로니다아제가 가용성이고, 히알루로니다아제 활성을 보유한다면, 가용성 히알루로니다아제의 예시적인 예로는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30 내지 32, 63 내지 65 및 185 내지 186 중 임의의 서열번호로 개시된 것과 같은 임의의 종에서 유래한 PH20, 또는 C-말단 GPI 앵커의 전체 또는 일부가 결여된 이의 절단된 형태들이 있다. C-말단이 절단되고 GPI 앵커 부착 신호 서열의 전체 또는 일부가 결여된 예시적인 가용성 히알루로니다아제들로는, 예를 들어 인간 및 침팬지 PH20 폴리펩티드들과 같은 영장류 기원의 PH20 폴리펩티드들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 가용성 PH20 폴리펩티드들은 서열번호 1, 2 또는 185로 개시된 임의 성숙한 또는 전구체 폴리펩티드들, 또는 이의 활성 단편을 포함한 이의 대립 유전자형 또는 기타 변종의 C-말단 절단에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 얻어진 폴리펩티드는 가용성이고, GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 아미노산 잔기들의 전체 또는 일부가 결여되어 있다. 또한 가용성 히알루로니다아제들 중에는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63 내지 65, 185 및 186 중 임의의 서열번호로 개시된 대립 유전자형 변이체들 또는 기타 변이체들, 또는 이의 절단된 형태들이 포함된다. 대립 유전자형 변이체들 및 기타 변이체들은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30 내지 32, 63 내지 65, 185 및 186 중 임의의 서열번호에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드들, 또는 이의 절단된 형태들을 포함한다. 아미노산 변이체들은 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 상술하거나 당해 기술분야에 공지된 임의의 것과 같은 히알루로니다아제의 활성에 중요하거나, 그렇지 않는 경우에 상기 활성을 위해 요구되는 잔기들은 일반적으로 변하지 않으며, 변경되지 않는 것으로 이해된다. 이들은, 예를 들어 활성 부위 잔기들을 포함한다. 따라서 예를 들어, 인간 PH20 폴리펩티드 또는 이의 가용성 형태의 111, 113 및 176번째 아미노산 잔기들(서열번호 2로 개시된 성숙한 PH20 폴리펩티드에서의 잔기들에 상응함)은 일반적으로 변하지 않으며, 변경되지 않는다. 글리코실화, 및 적당한 접힘을 위해 요구되는 이황화 결합의 형성을 허용하는 기타 잔기들 또한 변하지 않을 수 있다.

a. C-말단 절단된 인간 PH20

가용성 히알루로니다아제의 예시적인 예로는 C-말단 절단된 인간 PH20이 있다. 재조합 인간 PH20의 C-말단 절단된 형태들이 생성되었으며, 본원에서 개시된 복합제형들에 사용될 수 있다. PH20의 이러한 가용성 형태의 생성은 미국 특허 제 7,767,429 호, 및 미국 특허 출원 제 US2004-0268425 호, 제 US2005-0260186 호, 제 US2006-0104968 호 및 제 US2010-0143457 호에 개시되어 있다.

예를 들어, C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드들은 적어도 36 내지 464번째 아미노산들(히알루로니다아제 활성을 위해 요구되는 최소 부분)을 함유하는 폴리펩티드들을 포함하거나, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 포함하는 아미노산들의 서열에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산들의 서열을 포함하며, 히알루로니다아제 활성을 보유한다. 이들 폴리펩티드들 중에는 GPI-앵커 부착 신호 서열 전체가 완전히 결여된 인간 PH20 폴리펩티드들이 포함되어 있다. 또한 이들 폴리펩티드들 중에는 GPI-앵커 부착 신호 서열의 연속 아미노산 잔기들의 일부가 결여된 인간 PH20 폴리펩티드들(연장된 가용성 PH20(esPH20)로 지칭됨; 예를 들어 미국 특허 출원 제 US2010-0143457 호 참조)이 포함되어 있다. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드들은 서열번호 1 또는 2로 개시된 서열을 갖는 전장 야생형 폴리펩티드와 같은 전장 야생형 폴리펩티드, 또는 이의 대립 유전자형 또는 종 변이체들 또는 기타 변이체들과 비교해서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 또는 그 이상의 아미노산들에 의해 C-말단에서 절단될 수 있다. 따라서 ER 중의 단백질의 C 말단에 공유 결합에 의해 부착되어 플라즈마 멤브레인의 세포외층(extracellular leaflet) 에 고착되어 있는 GPI-앵커를 갖는 대신에, 이들 폴리펩티드들은 세포로부터 발현되는 경우에 분비되고, 가용성이 된다.

본원에서 제공된 예시적인 C-말단 절단된 인간 PH20 폴리펩티드들은, 서열번호 1의 적어도 36 내지 464번째 아미노산을 포함하는 임의의 것을 포함하며, 서열번호 1로 개시된 아미노산들의 서열, 또는 이와 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%의 서열 동일성을 나타내며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 이의 변이체의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 다음에 C 말단이 절단되어 있다. 표 3은 예시적인 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드들의 비제한적인 예를 제공한다. 하기 표 3에서, 전구체 및 성숙한 폴리펩티드들의 길이(아미노산들의 길이), 및 예시적으로 C-말단 절단된 PH20 단백질들의 전구체 및 성숙한 폴리펩티드들이 개시되어 있는 서열 식별인자(identifier)(서열번호)가 개시되어 있다. 야생형 PH20 폴리펩티드는 또한 비교를 위해 표 3에 포함되어 있다. 예를 들어, 예시적인 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드들로는 서열번호 4 내지 9, 47 내지 48, 234 내지 254, 및 267 내지 273 중 임의의 하나의 서열번호로 개시된 폴리펩티드들, 서열번호 4 내지 9, 47 내지 48, 234 내지 254, 및 267 내지 273 중 임의의 하나의 서열번호에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

표 3.예시적인 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드들

b. rHuPH20

서열번호 1의 C-말단 절단된 형태의 예시적인 예로는 서열번호 1로 개시된 서열의 482번째 아미노산 다음에 절단된 이의 폴리펩티드가 있다. 이러한 폴리펩티드는 1 내지 482번째 아미노산(서열번호 3으로 개시됨)을 암호화하는 핵산 분자로부터 생성될 수 있다. 이러한 예시적인 핵산 분자는 서열번호 49로 개시되어 있다. 번역 후 가공은 35개의 아미노산의 신호 서열을 제거하여, 447개의 아미노산의 가용성 재조합 인간 PH20(서열번호 4)이 남게 된다. 배양 배지에서 생성된 바와 같이, rHuPH20로 명명된 생성물이 서열번호 4 내지 9 중 임의의 하나를 포함할 수 있는 종의 혼합물을 매우 풍부하게 포함하도록 C 말단에 이종성이 존재한다. 일반적으로, rHuPH20은 활성을 보유하기 위해 정확한 N-글리코실화를 조장하는 세포, 예를 들어 CHO 세포(예를 들어, DG44 CHO 세포)에서 생성된다.

4. 히알루로난 분해 효소의 글리코실화

히알루로니다아제들을 포함한 일부 히알루로난 분해 효소들의 N 연결 및 O 연결된 글리코실화를 포함하는 글리코실화는 이들의 촉매 활성 및 안정성에 중요할 수 있다. 당단백질을 변형하는 글리칸의 유형을 변경하는 것이 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 가용성 및 안정성에 대해 극적 효과를 가질 수 있을지라도, 대부분의 효소들은 최적의 효소 활성을 위해 글리코실화를 요구하는 것으로 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다아제들에 있어서, N-연결된 글리코실화의 제거는 히알루로니다아제 활성의 거의 완전한 불활성화를 초래할 수 있다. 따라서 이러한 히알루로니다아제들에 있어서, N-연결된 글리칸류의 존재는 활성 효소를 생성하는데 결정적이다.

N-연결된 올리고당류는 일부 주요 유형(올리고만노오스형, 복합형, 하이브리드형, 황산화된 유형)으로 분류되며, 이들 모두는 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열(여기서, Xaa는 Pro가 아님) 내에 있는 Asn 잔기들의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)₃-GlcNAc-GlcNAc- 코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys- 부위에서의 글리코실화는 응고 단백질 C로 인해 보고되었다. 어떤 경우, 히알루로니다아제와 같은 히알루로난 분해 효소는 N-글루코시드 결합 및 O-글루코시드 결합 모두를 함유할 수 있다. 예를 들어, PH20은 N-연결된 올리고당류뿐만 아니라 O-연결된 올리고당류를 갖는다. 서열번호 1로 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393 및 N490에는 7개의 가능한 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. N82, N166 및 N254 아미노산 잔기들은 복합형 글리칸류에 의해 차지되는 반면, N368 및 N393 아미노산 잔기들은 고 만노오스형 글리칸류에 의해 차지된다. N235 아미노산 잔기는 약 80%의 고 만노오스형 글리칸류, 및 20%의 복합형 글리칸류에 의해 차지된다. 상기에서 언급된 바와 같이, N490에서의 N-연결된 글리코실화는 히알루로니다아제 활성을 위해 필요하지 않다.

일부 실시예에서, 본원에서 복합제형들에 사용하기 위한 히알루로난 분해 효소들은 하나 또는 전체 글리코실화 부위에 글리코실화되어 있다. 예를 들어, 인간 PH20 또는 이의 가용성 형태에 있어서, 서열번호 1의 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 아미노산들에 상응하는 N-글리코실화 부위 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 부위가 글리코실화된다. 일부 실시예에서, 히알루로난 분해 효소들은 하나 이상의 고유 글리코실화 부위에 글리코실화되어 있다. 일반적으로, PH20의 가용성 형태는, 글리코실화가 히알루로니다아제들의 촉매 활성 및 안정성을 위해 중요하기 때문에 상기 폴리펩티드가 활성을 보유하는지를 확실케 하기 위해 정확한 N-글리코실화를 촉진하는 단백질 발현 시스템들을 이용하여 생성된다. 이러한 세포로는, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, DG44 CHO 세포)를 들 수 있다.

기타 실시예에서, 히알루로난 분해 효소들은 하나 이상의 부가적인 부위에 폴리펩티드의 글리코실화를 제공하기 위해 하나 이상의 비-고유 글리코실화 부위에 변형되어 있다. 이러한 실시예에서, 부가적인 당 모이어티의 부착은 향상된 반감기 및/또는 향상된 활성과 같은 분자의 약물 동력학적 특성을 증강시킨다.

기타 실시예에서, 본원에서 제공된 복합제형들 중에 포함된 PH20 또는 인간 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소들은 부분적으로 탈글리코실화되어있다(또는 N-부분적으로 글리코실화된 폴리펩타이드)(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 US2010-0143457 호 참조). 글리코시다아제 또는 글리코시드 가수분해효소는 2개의 보다 작은 당류를 생성하기 위해 글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 척추동물에서 N-글리칸류의 주요 유형으로는 고 만노오스형 글리칸류, 하이브리드형 글리칸류 및 복합형 글리칸류를 들 수 있다. 고 만노오스형 및 하이브리드형 글리칸류을 절단하는 EndoF1; 바이안테나리(biantennary) 복합형 글리칸류를 절단하는 EndoF2; 바이안테나리 및 그 이상의 분지된 복합형 글리칸류를 절단하는 EndoF3; 및 고 만노오스형 및 하이브리드형 글리칸류를 절단하는 EndoH를 포함하여, 부분 단백질 탈글리코실화만을 초래하는 일부 글리코시다아제가 존재한다. 예를 들어, 하나 또는 모든 상기 글리코시다아제(예를 들어, EndoFl, EndoF2 EndoF3 및/또는 EndoH)에 의한 PH20(예를 들어, rHuPH20로 명명된 재조합 PH20)의 처리는 부분 탈글리코실화를 초래한다. 부분적으로 탈글리코실화된 이들 PH20 폴리펩티드들은 완전히 글리코실화된 폴리펩티드들에 필적하는 히알루로니다아제 효소 활성을 나타낼 수 있다. 대조적으로, N-글리칸류를 절단하는 글리코시다아제인 PNGaseF 또는 GlcNAc 포스포트란스페라아제(GPT) 억제제인 투니카마이신(tunicamycin)에 의한 PH20의 처리는 모든 N-글리칸류의 완전한 탈글리코실화를 초래하고, 이로 인해 PH20은 효소적으로 불활성이 된다. 따라서 모든 N-연결된 글리코실화 부위(예를 들어, 서열번호 1로 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 아미노산들에서의 부위)가 글리코실화될 수 있을지라도, 하나 이상의 글리코시다아제에 의한 처리는 하나 이상의 글리코시다아제로는 분해되지 않는 히알루로니다아제에 비해 감소된 글리코실화 정도를 제공할 수 있다.

따라서, 부분적으로 탈글리코실화된 가용성 히알루로니다아제들과 같은 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로난 분해 효소들은 하나 이상의 글리코시다아제, 일반적으로 모든 N-글리칸류를 제거하지 못하지만 상기 단백질을 부분적으로만 탈글리코실화할 수 있는 글리코시다아제에 의한 분해에 의해 생성될 수 있다. 부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드들을 포함한 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로난 분해 효소들은 완전히 글리코실화된 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 서열번호 1의 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 아미노산들에 상응하는 N-글리코실화 부위 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 부위는 부분적으로 탈글리코실화되어서, 그들은 더 이상 고 만노오스형 또는 복합형 글리칸류를 더 이상 함유하지 않지만 오히려 적어도 N-아세틸글루코사민 모이어티를 함유한다. 일부 실시예에서, 서열번호 1의 N82, N166 및 N254 아미노산들에 상응하는 N-글리코실화 부위 중 1개, 2개 또는 3개의 부위가 탈글리코실화되는데, 즉 이들은 당 모이어티를 함유하지 않는다. 기타 실시예에서, 서열번호 1의 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 아미노산들에 상응하는 N-글리코실화 부위 중 3개, 4개, 5개 또는 6개 부위가 글리코실화되어 있다. 글리코실화된 아미노산 잔기들은 N-아세틸글루코사민 모이어티를 최소로 함유한다. 일반적으로, 상기 부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드들을 포함하는 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로난 분해 효소들은 완전히 글리코실화된 폴리펩티드에 의해 나타난 히알루로니다아제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1,000% 또는 그 이상의 히알루로니다아제 활성을 나타낸다.

5. 약물 동력학적 특성을 개선하기 위한 히알루로난 분해 효소의 변형

히알루로난 분해 효소들은 이들의 반감기 생체 내 및/또는 활성들을 증가시키는 것과 같이 이들의 약물 동력학적 특성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 본원에서 제공된 안정한 제형들 또는 복합제형들, 또는 제공된 임의의 조성물들, 조합 및/또는 방법들에 사용하기 위한 히알루로난 분해 효소들의 변형은 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜 (페길화(PEG)) 또는 시알릴 모이어티 또는 천연 또는 당 중합체들과 같은 이러한 기타 중합체들을 직접 또는 공유 또는 다른 안정한 결합과 같은 링커를 통해 간접적으로 부착하는 단계를 포함할 수 있다.

치료제의 페길화는 단백질 가수분해에 대한 내성을 증가시키고, 플라즈마 반감기를 증가시키며, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 히알루로난 분해 효소에 대한 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG)와 같은 중합체성 분자의 공유 결합적 부착 또는 기타 안정한 부착(접합)은 얻어진 효소-중합체 조성물에 유리한 특성을 부여할 수 있다. 이러한 특성으로는 향상된 생체 적합성, 대상체 내의 혈액, 세포 및/또는 기타 조직에서의 단백질 (그리고 효소 활성) 반감기의 연장, 프로테아제들 및 가수분해로부터 단백질의 효과적인 차폐, 향상된 생체 분포, 증강된 약물 동력학 및/또는 약력학, 및 증가된 수용성을 들 수 있다.

히알루로난 분해 효소에 접합될 수 있는 예시적인 중합체들로는 폴리올류(즉, 폴리-OH), 폴리아민류(즉, 폴리-NH₂) 및 폴리카르복실산(즉, 폴리-COOH)과 같은 천연 및 합성 호모중합체들, 및 부가적인 헤테로중합체들, 즉 하나 이상의 상이한 결합기들, 예를 들어 하이드록실기 및 아민기들을 포함하는 중합체들을 들 수 있다. 적합한 중합체성 분자의 예로는 폴리프로필렌 글리콜류(PEG), 메톡시폴리에틸렌글리콜류(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜류를 포함한 폴리알킬렌 글리콜류(PAG)와 같은 폴리알킬렌 옥사이드류(PAO), PEG-글리시딜 에테르류(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 폴리에틸렌글리콜류(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카르복실레이트류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산들, 폴리에틸렌-말레산 공중합체 무수물, 폴리스티렌-말레산 공중합체 무수물, 카르복시메틸-덱스트란류을 포함한 덱스트란류, 헤파린, 상동성 알부민, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 카르복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함한 셀룰로오스, 키토산의 가수분해물, 하이드록시에틸-전분 및 하이드록시프로필-전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로오스 및 이들의 유도체, 구아 검, 풀루란(pullulan), 이눌린(inulin), 크산틴 고무, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물 및 생체 중합체들 중에서 선택된 중합체성 분자들을 들 수 있다.

통상적으로, 상기 중합체들은 PEG, 일반적으로는 mPEG와 같은 폴리에틸렌 옥사이드류와 같은 폴리알킬렌 옥사이드류(PAO)이며, 이는 덱스트란, 풀루란 등과 같은 다당류와 비교 시에 이와 같은 가교 가능한 반응기가 소수 존재한다. 일반적으로, 상기 중합체들은 상대적으로 단순한 화학작용을 이용하여 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 단백질 표면 상의 부착기)에 공유 결합에 의해 접합될 수 있는 (m)폴리에틸렌글리콜(mPEG)과 같은 비독성 중합체성 분자들이다.

상기 히알루로난 분해 효소에 대한 부착을 위한 적합한 중합체성 분자들로는 메톡시-폴리에틸렌글리콜류(mPEG), PEG-글리시딜 에테르류(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEG류, 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)와 같은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PEG 유도체들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어 [Roberts 등, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476]; [Harris 및 Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997]; [Mehvar 등, J. Pharm . Pharmaceut. Sci ., 3(1): 125-136, 2,000]; [Harris, Nature Reviews Drug Discovery 2:214 (2003)]; 및 [Tsubery, J Biol . Chem 279(37): 38118-24, 2004] 참조). 상기 중합체성 분자는 일반적으로 약 3kDa 내지 약 60kDa 범위의 분자량일 수 있다. 일부 실시형태에서, rHuPH20과 같은 단백질에 접합되는 중합체성 분자는 5kDa, 10kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, 35kDa, 40kDa, 45kDa, 50kDa, 55kDa, 60kDa, 또는 60kDa 이상의 분자량을 갖는다.

PEG 또는 PEG 유도체를 공유 결합에 의해 부착(접합)함으로써 폴리펩티드들을 변형하는 다양한 방법들(즉, "페길화")이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 US2006-0104968호 및 제 US2004-0235734 호; 미국 특허 제 US5,672,662 호 및 제 US6,737,505 호 참조). 페길화 기법들로는 특수용 링커 및 커플링 화학 작용(예를 들어, [Roberts, Adv . Drug Deliv . Rev. 54: 459-476, 2002] 참조), 단일 접합 부위에 대한 다중 PEG 모이어티들의 부착(예를 들어, 분지형 PEG의 사용을 통한 부착; 예를 들어, [Guiotto 등, Bioorg . Med . Chem . Lett . 12: 177-180, 2002), 부위 특이적 페길화 및/또는 모노페길화(예를 들어, [Chapman 등, Nature Biotech. 17: 780-783, 1999] 참조), 및 부위 특이적 효소적 페길화(예를 들어, [Sato, Adv . Drug Deliv . Rev., 54: 487-504, 2002] 참조)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다(또한 예를 들어, [Lu 및 Felix (1994) Int . J. Peptide Protein Res. 43: 127-138]; [Lu 및 Felix (1993) Peptide Res. 6: 140-6, 1993]; [Felix 등, (1995) Int . J. Peptide Res. 46: 253-64]; [Benhar 등, (1994) J. Biol. Chem . 269: 13398-404]; [Brumeanu 등 (1995) J Immunol . 154: 3088-95] 참조; 또한 [Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev. 55(10): 1261-77] 및 [Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S] 참조). 당업계에 개시된 방법들 및 기법들은 단일 단백질 분자에 부착된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 이상의 PEG 또는 PEG 유도체들을 갖는 단백질을 생성할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 2006-0104968 호 참조).

다수의 페길화 시약이 당업계에 개시되어 있다. 이러한 시약으로는 N-하이드록시숙시니미딜(NHS) 활성화된 PEG, 숙시니미딜 mPEG, mPEG2-N-하이드록시숙시니미드, mPEG 숙시니미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙시니미딜 프로피오네이트, mPEG 숙시니미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-하이드록시부탄산 숙시니미딜 에스테르, 동종 2기능성 PEG-숙시니미딜 프로피오네이트, 동종 2기능성 PEG 프로피온알데히드, 동종 2기능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐-카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커 부재" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르토피리딜티오에스테르, mPEG 오르토피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레신 PEG-NHS, 및 비오틴 PEG-NHS를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, [Monfardini 등, Bioconjugate Chem . 6: 62-69, 1995]; [Veronese 등, J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207, 1997]; 미국 특허 제 5,672,662 호; 제 5,932,462 호; 제 6,495,659 호; 제 6,737,505 호; 제 4,002,531 호; 제 4,179,337 호; 제 5,122,614 호; 제 5,324,844 호; 제 5,446,090 호; 제 5,612,460 호; 제 5,643,575 호; 제 5,766,581 호; 제 5,795,569 호; 제 5,808,096 호; 제 5,900,461 호; 제 5,919,455 호; 제 5,985,263 호; 제 5,990,237 호; 제 6,113,906 호; 제 6,214,966 호; 제 6,258,351 호; 제 6,340,742 호; 제 6,413,507 호; 제 6,420,339 호; 제 6,437,025 호; 제 6,448,369 호; 제 6,461,802 호; 제 6,828,401 호; 제 6,858,736 호; 미국 특허 출원 제 2001-0021763 호; 제 2001-0044526 호; 제 2001-0046481 호; 제 2002-0052430 호; 제 2002-0072573 호; 제 2002-0156047 호; 제 2003-0114647 호; 제 2003-0143596 호; 제 2003-0158333 호; 제2003-0220447 호; 제 2004-0013637 호; 제 2004-0235734 호; 제 2005-0114037 호; 제 2005-0171328 호; 제 2005-0209416 호; 유럽 특허 출원 제 EP1064951 호; 제 EP0822199 호; 국제 공개공보 제 WO01076640 호; 제 WO0002017 호; 제 WO0249673 호; 제 WO05000360 호; 제 WO9428024 호; 및 제 WO0187925 호 참조).

D. 안정한 히알루로난 분해 효소 제형

본원에서는 2가 양이온인 안정화 부형제를 함유하는 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형들이 제공된다. 2가 양이온의 예로는 리실-리신(디리신; Lys-Lys) 또는 마그네슘(예를 들어, MgCl₂), 또는 이의 염, 유도체, 유사체 또는 모방체를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형들은 안정화 부형제로서 Lys-Lys, 또는 이의 염, 유도체, 유사체 또는 모방체를 함유한다. 기타 실시예에서, 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형들은 안정화제로서 MgCl₂, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 모방체를 함유한다. 2가 양이온, 예를 들어 Lys-Lys 또는 MgCl₂를 함유하는 히알루로난 분해 효소들은 적어도 3일, 일반적으로 적어도 6일, 7일(1주일), 2주일, 3주일 또는 4주일(1개월) 동안 37℃ 이상의 온도에서 안정하다. 예를 들어, 이러한 제형들은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 또는 그 이상 동안 37℃ 내지 42℃ 이상의 온도, 예를 들어 적어도 40℃, 약 40℃ 또는 약 40℃의 온도에서 안정하다.

히알루로난 분해 효소들의 기존의 제형들은 안정제로서 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유한다. 예를 들어, Hylenex^® 재조합체는 1.0㎎의 인간 알부민을 함유한다. 안정한 HSA 부재 히알루로난 분해 효소 제형들이 일부 이유에 의해서 필요하다. 첫째, HSA는 혈액 유래 산물이며, 따라서 이는 종종 순수하지 않다. HSA의 분해물질 및 오염물질은 효소의 활성을 방해할 수 있다. 게다가, HSA 그 자체는 또한 특정 조건 하에서 집합체를 형성할 수 있기 때문에 안정성 문제에 영향을 받는다. 본원에서는 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로니다아제의 안정한 HSA 부재 제형들이 2가 양이온, 예를 들어, Lys-Lys를 포함함으로써 제조될 수 있는 것으로 밝히고 있다.

또한 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로니다아제의 대부분의 기존의 제형들은 또한 안정화제로서 NaCl을 함유한다. 130mM 내지 150mM NaCl 또는 그 이상, 또는 약 130mM 내지 약 150mM NaCl 또는 그 이상의 다량의 NaCl의 존재는 일반적으로 효소의 최적의 활성 및 안정성을 위해 요구된다. 예를 들어, 통상적인 PH20 제형 Hylenex^®는 145mM의 NaCl을 함유한다. 본원에서 실시예에서 증명된 바와 같이, 2가 양이온인 Lys-Lys 및 MgCl₂는 NaCl보다 향상된 예시적인 히알루로난 분해 효소 PH20에 대한 안정성 효과를 나타낸다. 이는, 본원에서 37℃ 초과의 승온 또는 가속 온도(예를 들어 실시예 23 및 24 참조)에서 배양 시 NaCl은 PH20을 효과적으로 안정화시키지 못하는 것으로 밝혀져 있기 때문에 유리하다. 대조적으로, Lys-Lys와 같은 2가 양이온을 함유하는 제형들 중의 PH20의 활성이 37℃의 온도, 예를 들어 37℃ 내지 42℃ 이상의 온도에서 4주 동안 배양, 예를 들어 적어도 40℃, 약 40℃ 또는 약 40℃에서 적어도 1개월 동안 배양 이후 상기 제형들이 최대 70% 이상의 활성, 및 일반적으로 적어도 80%, 85%, 90% 또는 그 이상 또는 약 80%, 85%, 90% 또는 그 이상의 활성을 나타낼 수 있도록 승온에서 보유된다. 안정제로서 2가 양이온, 예를 들어 Lys-Lys를 함유하는 본원에 제공된 제형들의 실시예에서, 적어도 38℃ 내지 42℃ 또는 적어도 약 38℃ 내지 약42℃의 승온, 및 특히 40℃에서 히알루로난 분해 효소의 활성은 2가 양이온을 함유하지 않은 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 안정화제로서 NaCl을 함유함)의 활성에 비해 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 그 이상, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 정도 증가한다.

본원에서는 치료적 유효량의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제, 및 상기 제형을 37℃ 이상의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정하도록 하는 양의 2가 양이온, 예를 들어 Lys-Lys 또는 MgCl₂를 함유하는 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들이 제공된다. 특정 실시예에서, 본원에서는 치료적 유효량의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제, 및 상기 제형을 37℃ 이상의 승온에서 적어도 1개월 동안 안정하도록 하는 양의 Lys-Lys를 함유하는 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들이 제공된다. 예를 들어, 이러한 제형들은 37℃ 내지 42℃ 이상, 예를 들어 적어도 40℃ 또는 약 40℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 또한 상기 제형들은 일반적으로 계면활성제, 항산화제(예를 들어, 메티오닌), 6.5와 7.8 사이, 또는 약 6.5와 약 7.8 사이의 pH, 및 상기 pH 범위를 유지하는 완충제를 함유한다. 선택적으로, 상기 제형들은 하나 이상의 기타 안정화제들, 등장화제들, 보존제(들) 또는 부형제들을 함유할 수 있다.

일반적으로, 상기 화합물들은 당업계에 널리 공지된 기법 및 절차들을 이용하여 약학 조성물 내로 제형화된다(예를 들어, [Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126] 참조). 약학적으로 허용 가능한 조성물들은 동물 및 인간에서 사용하기 위하여 일반적으로 공인된 약전에 따라 준비된 규제 기관 또는 기타 기관의 승인을 고려하여 제조된다. 상기 제형은 투여 형태에 적합해야 한다.

상기 안정한 제형들은 용액, 시럽 또는 현탁액으로서의 액체의 형태로 약학적 제제로서 제공될 수 있다. 액체 형태에서, 상기 약학적 제제들은 사용 이전에 치료적으로 유효한 농도까지 희석되도록 농축된 제제로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 상기 제제들은 사용을 위한 희석을 요구하지 않는 투약 형태, 즉 직접적인 투여를 위한 제형으로 제공된다. 이러한 액체 제제들은 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체들 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어, 렉시틴 또는 아라비아고무); 비수성 전달체들(예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르류, 또는 분류된 식물성 오일류); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 이용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 다른 실시예에서, 약학적 제제들은 사용 이전에 물 또는 기타 적합한 전달체를 이용하여 재구성을 위한 동결 건조된 형태로 제시될 수 있다. 상기 제형들은 단일 투여 또는 다중 투여 제형으로서 제조될 수 있다.

본원에서 제공된 제형들의 부피는 이들이 제공되는 컨테이너에 적합한 임의의 부피일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 제형들은 바이알, 주사기, 또는 임의의 기타 적합한 컨테이너에 제공된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 제형들은 0.1㎖과 500㎖ 사이, 또는 약 0.1㎖과 약 500㎖ 사이, 예를 들어 0.1㎖과 100㎖ 사이, 1㎖과 100㎖ 사이, 0.1㎖과 50㎖ 사이이며, 예를 들어 적어도 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상, 적어도 약 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상, 약 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상, 또는 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상이다.

본원에서 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들에 제공된 구성성분들의 상세한 설명이 하기에 제공된다. 하기의 안정한 제형들은 단지 예시적이며, 약간의 조절이 이루어질 수 있는 플랫폼(platform)을 제공한다. 다양한 부형제들 및 기타 구성성분들의 농도에서 매우 작은 변화(예를 들어, 상기에 언급한 농도의 ±15%) 또는 pH의 작은 변화는 히알루로난 분해 효소 안정성을 전부는 아니지만 일부 보유하면서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 추가적인 변화는 또한 부형제를 부가하거나 제거함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 안정화 계면활성제의 유형은 변할 수 있다.

1. 히알루로난 분해 효소

본원에서 제공된 안정한 제형들 중의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제의 양은 치료 효과를 달성하기에 충분한 직접적인 투여를 위한 양이다. 일 실시예에서, 상기 양은 인간 피부의 외피 아래의 피하 공간에서 히알루론산(HA)을 분해하기에 충분한 직접적인 투여를 위한 양이다. 예를 들어, 상기 제형 중의 히알루로난 분해 효소의 양은 공-주사되거나 공-투여된 치료제의 분산 및 흡수를 증가시키기 위한 직접적인 투여를 위한 양이다. 다른 실시예에서, 상기 양은 병든 조직 또는 세포와 연관이 있는 히알루론산(HA)을 분해하기에 충분한 직접적인 투여를 위한 양이다. 예를 들어, 상기 양은 종양 세포와 연관이 있는 HA를 분해하기에 충분한 직접적인 투여를 위한 양이다. 이러한 실시예에서, 상기 양은 간질 유체 압력(IFP)을 감소시키거나 낮추거나, 종양 혈관 부피를 증가시키기 위한 양이다.

예를 들어, 상기 양은 적어도 30유닛/㎖ 또는 적어도 약 30유닛/㎖에 대해 기능적으로 등량이다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들은 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제를 30유닛/㎖ 내지 20,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 3,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 20,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 6,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 60U/㎖ 내지 600U/㎖, 또는 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 양, 또는 약 30유닛/㎖ 내지 20,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 5,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 3,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 20,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 6,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 60U/㎖ 내지 600U/㎖, 또는 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 양, 예를 들어 적어도 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 200U/㎖, 300U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖, 2,000U/㎖, 3,000U/㎖, 4,000U/㎖, 5,000U/㎖, 6,000U/㎖, 7,000U/㎖, 8,000U/㎖, 9,000U/㎖, 10,000U/㎖, 12,000U/㎖, 15,000U/㎖ 또는 20,000U/㎖의 양, 또는 적어도 약 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 200U/㎖, 300U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖, 2,000U/㎖, 3,000U/㎖, 4,000U/㎖, 5,000U/㎖, 6,000U/㎖, 7,000U/㎖, 8,000U/㎖, 9,000U/㎖, 10,000U/㎖, 12,000U/㎖, 15,000U/㎖ 또는 20,000U/㎖의 양으로 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들은 PH20(예를 들어, rHuPH20)을 적어도 100U/㎖ 내지 300U/㎖, 예를 들어 적어도 100U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 165U/㎖, 170U/㎖, 175U/㎖, 180U/㎖, 185U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 220U/㎖, 240U/㎖, 260U/㎖, 280U/㎖ 또는 300U/㎖, 적어도 약 100U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 165U/㎖, 170U/㎖, 175U/㎖, 180U/㎖, 185U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 220U/㎖, 240U/㎖, 260U/㎖, 280U/㎖ 또는 약 300U/㎖, 또는 약 100U/㎖, 115U/㎖, 120U/㎖, 125U/㎖, 130U/㎖, 135U/㎖, 140U/㎖, 145U/㎖, 150U/㎖, 155U/㎖, 160U/㎖, 165U/㎖, 170U/㎖, 175U/㎖, 180U/㎖, 185U/㎖, 190U/㎖, 200U/㎖, 220U/㎖, 240U/㎖, 260U/㎖, 280U/㎖ 또는 약 300U/㎖의 양으로 함유한다.

본원에서 제공된 안정한 제형들에서, 상기 제형들 중 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제를 포함하는 히알루로난 분해 효소의 안정성은 상술한 바와 같이 37℃ 내지 42℃ 이상의 승온, 예를 들어 적어도 37℃ 또는 40℃, 약 37℃ 또는 40℃, 또는 약 37℃ 또는 약 40℃의 승온에서 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 1개월 동안 상기 효소의 회복 및/또는 활성의 함수이다. 이들 매개 변수를 평가하기 위한 검정들이 본원에서 개시되어 있다. 본원에서 제공된 제형들은 상기 제형들이 본원에서 개시된 바와 같이 치료용 용도로 적합하도록 히알루로니다아제 회복 및/또는 활성을 보유한다. 본원에서 제공된 안정한 제형들에서, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소의 활성은 일반적으로 본원에서 개시된 바와 같이 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 1개월 동안 37℃ 내지 42℃ 이상의 온도에 노출 이전에 상기 제형 중의 효소의 초기 활성의 50% 초과이거나 약 50%이며, 예를 들어 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 그 이상, 또는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소의 활성은 적어도 1개월 동안 4℃에서 저장되는 경우에 일반적으로 동일한 효소 제형의 활성의 50% 초과이거나, 약 50%이며, 예를 들어 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과, 또는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 일반적으로, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들은 37℃ 내지 42℃ 이상의 온도, 예를 들어 적어도 37℃ 또는 40℃, 약 37℃ 또는 40℃, 또는 약 37℃ 또는 약 40℃의 온도에서 저장 및 사용 하에서는 적어도 1개월 동안 효소의 초기 활성의 적어도 70%를 나타낸다. 따라서 예를 들어, 600U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 rHuPH20로 제형화된 용액에서, 적어도 360유닛/㎖, 365U/㎖, 370U/㎖, 375U/㎖, 380U/㎖, 390U/㎖, 420U/㎖, 480U/㎖, 540U/㎖, 546U/㎖, 552U/㎖, 558U/㎖, 564U/㎖, 570U/㎖, 576U/㎖, 582U/㎖, 588U/㎖, 594U/㎖ 또는 그 이상의 활성, 또는 적어도 약 360유닛/㎖, 365U/㎖, 370U/㎖, 375U/㎖, 380U/㎖, 390U/㎖, 420U/㎖, 480U/㎖, 540U/㎖, 546U/㎖, 552U/㎖, 558U/㎖, 564U/㎖, 570U/㎖, 576U/㎖, 582U/㎖, 588U/㎖, 594U/㎖ 또는 그 이상의 활성이 37℃ 내지 42℃의 온도, 예를 들어 적어도 37℃ 또는 40℃, 약 37℃ 또는 40℃, 또는 약 37℃ 또는 약 40℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 보유된다. 기타 실시예에서, 안정성은, 예를 들어 RP-HPLC를 이용하여 상기 효소의 회복 함수로서 평가할 수있다. 이러한 실시예에서, 본원에서 제공된 제형들에서는 히알루로니다아제 효소 회복은 60%와 140% 사이, 또는 약 60%와 약 140% 사이이다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들에서 히알루로니다아제 효소 회복은 3㎍/㎖와 7㎍/㎖ 사이, 또는 약 3㎍/㎖와 약 7㎍/㎖ 사이이다.

2. 2가 양이온

본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들은, 본원에서 개시된 바와 같이, 37℃ 내지 42℃의 온도, 예를 들어 적어도 37℃ 또는 40℃, 약 37℃ 또는 40℃, 또는 대략 37℃ 또는 40℃의 온도에서 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 1개월(예를 들어, 4주) 동안 히알루로난 분해 효소의 초기 효소 활성의 적어도 50%, 및 일반적으로는 적어도 70%를 달성하기 위한 양으로 2가 양이온을 함유한다. 예를 들어, 2가 양이온의 양은 37℃ 내지 42℃, 또는 약 37℃ 내지 약 42℃의 온도, 예를 들어 적어도 40℃, 약 40℃ 또는 대략 40℃의 온도에서 적어도 3일, 및 일반적으로는 적어도 4주 동안 히알루로난 분해 효소의 초기 효소 활성의 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 달성하기 위한 양이다.

예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 제형들은 37℃ 내지 42℃ 또는 약 37℃ 내지 약 42℃의 온도, 예를 들어 적어도 40℃, 약 40℃ 또는 거의 40℃의 온도에서 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 4주 동안 히알루로난 분해 효소의 초기 효소 활성의 적어도 50%, 및 일반적으로 적어도 70%를 달성하기 위한 양으로 Lys-Lys, 또는 이의 염, 유도체, 유사체 또는 모방체를 함유할 수 있다. 본원에서 제공된 이러한 안정한 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20) 제형은 Lys-Lys를 5mM 내지 300mM 또는 약 5mM 내지 약 300mM의 양, 예를 들어 10mM 내지 200mM, 50mM 내지 150mM, 또는 10mM 내지 50mM의 양으로 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20) 제형은 Lys-Lys를 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양, 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양, 또는 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양으로 함유한다.

다른 실시예에서, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 제형들은 MgCl₂, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 모방체를 37℃ 내지 42℃ 또는 약 37℃ 내지 약 42℃의 온도, 예를 들어 적어도 40℃, 약 40℃ 또는 대략 40℃의 온도에서 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 4주 동안 히알루로난 분해 효소의 초기 효소 활성의 적어도 50%, 및 일반적으로 적어도 70%를 달성하기 위한 양으로 함유할 수 있다. 본원에서 제공된 이러한 안정한 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20) 제형은 MgCl₂를 5mM 내지 300mM의 양 또는 약 5mM 내지 약 300mM의 양, 예를 들어 10mM 내지 200mM, 50mM 내지 150mM, 또는 10mM 내지 50mM의 양으로 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소(예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20) 제형은 MgCl₂를 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양, 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양, 또는 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM, 300mM 또는 그 이상의 양으로 함유한다.

아래에서 논의되는 바와 같이, 필요한 경우에 2가 양이온(예를 들어, Lys-Lys)을 함유하는 제형들은 또한 등장화제(예를 들어, NaCl)를 함유할 수 있다.

3. pH 및 완충액

본원에서는 6.5 내지 7.8 또는 6.8 내지 7.8의 pH, 또는 약 6.5 내지 약 7.8 또는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH, 예를 들어 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.6의 pH 또는 약 6.5 내지 약 7.5 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH를 갖는, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제의 안정한 제형들이 제공된다. 본원에서 pH에 대한 언급은 실온에서의 pH 측정에 기반을 두고 있다. 시간이 경과함에 따라 저장 도중에 pH가 변할 수 있지만, 일반적으로는 6.5와 7.8 사이 또는 약 6.5와 약 7.8 사이의 pH, 예를 들어 6.8과 7.8 사이 또는 약 6.8과 7.8 사이의 pH로 유지할 것으로 이해된다. 예를 들어, 상기 pH는 ±0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 또는 그 이상 정도로 변할 수 있다. 따라서 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4 또는 약 7.6의 pH, 또는 적어도 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.6의 pH를 갖는 제형에 대한 참조로는 상기 제형이 제조되는 경우에 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2 또는 7.6±0.2의 pH, 약 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2 또는 7.6±0.2의 pH, 또는 적어도 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2 또는 7.6±0.2의 pH를 갖는 복합제형들을 들 수 있는 것으로 이해된다.

필요한 경우, pH는 상기 pH를 낮추기 위한 산성화제, 또는 상기 pH를 증가시키기 위한 알칼리화제를 이용하여 조절될 수 있다. 예시적인 산성화제로는 아세트산, 시트르산, 황산, 염산, 인산일수소나트륨 용액 및 인산을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알칼리화제로는 인산이수소나트륨 용액, 탄산나트륨 또는 수산화나트륨을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

임의의 완충액은 상기 제형의 안정성에 악영향을 미치지 않고 요구되는 필요한 pH 범위를 지지하는 한, 이는 본원에서 제공된 복합제형들에서 사용될 수 있다. 특히 적합한 완충액들의 예로는 트리스, 숙시네이트, 아세테이트, 포스페이트 완충액들, 히스티딘, 시트레이트, 아코니데이트(aconitate), 말레이트 및 카르보네이트를 들 수 있다. 그러나 당해 기술분야의 숙련자라면, 특정 완충액이 허용 가능한 정도의 pH 안정성, 또는 "완충액 용량"을 표시된 범위 내에서 제공하는 한, 본원에서 제공된 제형들이 상기 완충액에 제한되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 완충액은 이의 pK의 약 1 pH 유닛 내의 적절한 완충액 용량을 갖는다([Lachman 등, 1986]). 완충액 접합성은 공개된 pK 목록에 기초하여 추정될 수 있거나, 당업계에 널리 공지된 방법들에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 용액의 pH는, 예를 들어 임의의 허용 가능한 산 또는 염기를 이용하여 상술한 바와 같은 범위 내에서 목적하는 종점(endpoint)까지 조절될 수 있다.

본원에서 제공된 복합제형들 중에 포함될 수 있는 완충액들로는 트리스(트로메타민), 히스티딘, 인산이수소나트륨과 같은 포스페이트 완충액들, 및 시트레이트 완충액들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 완충액은 히스티딘 염산염(히스티딘/HCl) 완충액일 수 있다. 일반적으로, 상기 완충제는 본원에서 상기 복합제형을 pH 범위를 6.5와 7.8 사이, 또는 약 6.5와 약 7.8 사이, 예를 들어 6.8과 7.8 사이 또는 약 6.8과 약 7.8 사이, 예를 들어 7.0과 7.6 사이 또는 약 7.0과 약 7.6 사이로 유지하기 위한 양으로 존재한다. 이러한 완충제들은 상기 제형들에 1mM 내지 100mM 또는 약 1mM 내지 약 100mM의 농도, 예를 들어 10mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM의 농도, 예를 들어 30mM 또는 약 30mM의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 완충제들은 상기 복합제형들에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM 또는 그 이상의 농도, 약 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM 또는 그 이상의 농도, 또는 적어도 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다.

일부 실시예에서, 완충제는 필요하지 않다.

4. 계면활성제

본원에서 제공된 안정한 제형들은 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 이러한 계면활성제들은 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 응집을 억제하고, 흡수 손실을 최소화한다. 상기 계면활성제들은 일반적으로 비이온성 계면활성제들이다. 본원에서 상기 제형들에 포함될 수 있는 계면활성제들로는 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 다가 알코올류의 부분 및 지방산 에스테르류 및 에테르류, 폴록사머류 및 폴리소르베이트류를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제형들 중의 예시적인 계면활성제들로는 폴록사머 188(PLURONIC^® F68과 같은 PLURONICS^®), TETRONICS^®, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, PEG 400, PEG 3000, 트윈^®(예를 들어, 트윈^® 20 또는 트윈^® 80), 트리톤^® X-100, SPAN^®, MYRJ^®, BRIJ^®, CREMOPHOR^®, 폴리프로필렌 글리콜류 또는 폴리에틸렌글리콜류 중 임의의 하나 이상을 들 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서의 상기 제형들은 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 및 폴리소르베이트 80, 및 일반적으로 폴록사머 188(pluronic F68)을 함유한다. 본원에서 제공된 제형들은 일반적으로 적어도 하나의 계면활성제, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개 계면활성제를 함유한다.

본원에서 제공된 제형들에서, 제형 중의 질량 농도(w/v)의 비율(%)로서 상기 하나 이상의 계면활성제의 총량은, 예를 들어 0.0005%와 1.0% 사이 또는 약 0.0005%와 약 1.0% 사이, 예를 들어 0.0005%와 0.005% 사이, 0.001%와 0.01% 사이, 0.01%와 0.5% 사이, 0.01%와 0.1% 사이 또는 0.01%와 0.02% 사이 또는 약 0.0005%와 0.005% 사이, 약 0.001%와 0.01% 사이, 약 0.01%와 0.5% 사이, 약 0.01%와 0.1% 사이 또는 약 0.01%와 0.02% 사이일 수 있다. 일반적으로, 상기 제형들은 적어도 0.01%의 계면활성제를 함유하고, 1.0% 미만, 예를 들어 0.5% 미만 또는 0.1% 미만의 계면활성제를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들은 계면활성제를 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.09%의 양, 또는 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08%, 또는 약 0.09%의 양으로 함유할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 제공된 제형들은 0.01% 내지 0.05% 또는 약 0.01% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 함유한다.

상기 효소의 산화는 계면활성제의 수준이 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀져 있다. 또한 상기 계면활성제인 폴록사머 188은 폴리소르베이트류보다 산화를 덜 야기한다. 따라서 본원에서의 상기 제형들은 일반적으로 폴록사머 188을 함유한다. 따라서 계면활성제들이 히알루로난 분해 효소를 안정화시킬 수 있을지라도, 본원에서 제공된 제형들 중의 계면활성제들의 포함은 높은 농도에서 히알루로난 분해 효소의 산화를 초래할 수 있다. 따라서 일반적으로는 계면활성제의 더욱 낮은 농도가, 예를 들어 1.0% 미만, 및 일반적으로는 0.01%와 0.05% 사이 또는 약 0.01%와 약 0.05% 사이, 예를 들어 0.01%의 질량 농도(w/v)의 비율(%)로서 본원에서 복합제형들에서 사용된다. 본원에서 하기에 제공된 바와 같이, 선택적으로 항산화제는 또한 산화를 감소시키거나 방지하기 위해 상기 제형에 포함될 수 있다.

5. 항산화제

본원에서 제공된 제형들은 또한 산화, 특히 히알루로난 분해 효소의 산화를 줄이거나 방지하기 위해 항산화제들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서의 실시예에서는 산화가 높은 농도의 계면활성제에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 나타난다. 예시적인 항산화제들로는 시스테인, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 상기 항산화제는 메티오닌이다. 본원에서 제공된 제형들은 항산화제를 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20m의 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌은 본원에서 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도로 상기 제형들에 제공될 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 예를 들어 메티오닌은 5mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM의 농도, 약 5mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 약 50mM의 농도, 또는 적어도 5mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM의 농도로 포함될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 복합제형들은 10mM 내지 20mM의 메티오닌, 예를 들어 10mM 또는 20mM, 약 10mM 또는 약 20mM, 또는 적어도 10mM 또는 20mM의 메티오닌을 함유한다.

6. 등장화제

선택적으로, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들은 등장화제를 함유할 수 있다. 특히, Lys-Lys와 같은 2가 양이온을 더욱 낮은 농도로 함유하는 제형들에서 충분한 등장성이 달성되지 않기 때문에 등장화제가 필요하다.

예를 들어, 등장화제는 목적하는 삼투질 농도를 갖는 용액을 제조하기 위해 본원에서 상기 제형들에 포함되어 있다. 본원에서 제공된 제형들은 245mOsm/㎏ 내지 500mOsm/㎏ 또는 약 245mOsm/㎏ 내지 약 500mOsm/㎏의 삼투질 농도를 갖는다. 예를 들어, 상기 삼투질 농도는 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 295mOsm/㎏, 300mOsm/㎏, 350mOsm/㎏, 400mOsm/㎏, 450mOsm/㎏ 또는 500mOsm/㎏이거나, 약 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 295mOsm/㎏, 300mOsm/㎏, 350mOsm/㎏, 400mOsm/㎏, 450mOsm/㎏ 또는 약 500mOsm/㎏이거나 적어도 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 295mOsm/㎏, 300mOsm/㎏, 350mOsm/㎏, 400mOsm/㎏, 450mOsm/㎏ 또는 500mOsm/㎏이다. 일반적으로, 등장화제는 본원에서 Lys-Lys와 같은 2가 양이온을 함유하는 상기 제형들에 100mM 미만의 농도, 예를 들어 80mM 미만, 70mM 미만, 60mM 미만, 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만, 10mM 미만 또는 그 이하의 농도로 포함된다. 예를 들어, 등장화제는 본원에서 Lys-Lys와 같은 2가 양이온을 함유하는 상기 제형들에 10mM 내지 50mM 또는 약 10mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 약 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 약 50mM의 농도 또는 대략 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 약 50mM의 농도로 포함된다.

등장화제들은 글리세린, NaCl, 아미노산들, 폴리알코올류, 트레할로오스, 및 기타 염류 및/또는 당류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들은 선택적으로 등장화제로서 NaCl을 포함할 수 있다. NaCl은 0mM 내지 200mM 또는 약 0mM 내지 약 200mM의 농도, 예를 들어 일반적으로 30mM 내지 100mM, 50mM 내지 160mM의 농도, 예를 들어 50mM 내지 120mM 또는 80mM 내지 140mM의 농도로 포함될 수 있다. 일반적으로, NaCl의 농도는 150mM미만이고, 일반적으로는 140mM 미만, 130mM 미만, 120mM 미만, 110mM 미만, 100mM 미만, 90mM 미만, 80mM 미만, 70mM 미만, 60mM 미만, 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만, 10mM 미만 또는 그 이하이다. 특정한 양은 2가 양이온, 예를 들어 Lys-Lys의 농도의 함수이다. 예를 들어, Lys-Lys의 농도가 높으면 높을수록 NaCl의 농도는 더욱 낮다(또는 NaCl이 존재하지 않음). 상기 특정한 양은 효소 활성 및/또는 등장성을 보유하기 위해 실험적으로 결정될 수 있다.

또다른 실시예에서, 글리세린(글리세롤)은 선택적으로 상기 안정한 제형들에 포함된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형들은 일반적으로 글리세린을 60mM 미만, 예를 들어 55mM 미만, 50mM 미만, 45mM 미만, 40mM 미만, 35mM 미만, 30mM 미만, 25mM 미만, 20mM 미만, 15mM 미만 또는 10mM 이하로 함유한다. 글리세린의 양은 일반적으로 존재하는 2가 양이온(예를 들어, Lys-Lys)의 양에 의해 결정되고 : 상기 제형 중에 2가 양이온(예를 들어, Lys-Lys)이 더욱 많이 존재하면 존재할수록 목적하는 삼투성을 달성하기 위해 더욱 적은 글리세린이 요구된다. 따라서 어떤 경우에, 상기 제형에는 글리세린의 적게 포함되거나 포함될 필요가 없다.

7. 기타 약제 또는 부형제

본원에서 제공된 안정한 제형들은 선택적으로 하나 이상의 기타 약제, 담체, 부형제 또는 보존제들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 히알루로난 분해 효소 제형들에 선택적으로 포함될 수 있는 예시적인 안정제들로는 아미노산들, 아미노산 유도체들, 아민류, 당류, 폴리올류, 염류 및 완충액들, 계면활성제들, 및 기타 약제들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 상기 제형들에 선택적으로 함유될 수 있는 안정제들의 유형들 중에는 아미노산 안정제 또는 히알루로니다아제 억제제(예를 들어, 히알루로난과 같은 히알루로니다아제 기질)가 포함되어 있다. 예시적인 아미노산 안정제들, 아미노산 유도체들 또는 아민류로는 L-아르기닌, 글루타민, 글리신, 리신, 메티오닌, 프롤린, Lys-Lys, Gly-Gly, 트리메틸아민 옥사이드(TMAO) 또는 베타인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당류 및 폴리올류의 예시적인 예로는 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 수크로스 또는 트레할로오스를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 염류 및 완충액들의 예시적인 예로는 염화마그네슘, 황산나트륨, 트리스(100mM)와 같은 트리스, 또는 벤조산나트륨을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 계면활성제들로는 폴록사머 188(예를 들어, Pluronic^® F68), 폴리소르베이트 80(PS80), 또는 폴리소르베이트 20(PS20)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 안정제들로는 히알루론산(HA), 인간 혈청 알부민(HSA), 페닐 부티르산, 타우로콜린산, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 아연을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서의 특정 실시예에서, 상기 안정한 히알루로난 분해 효소들은 HSA를 함유하지 않으며, HSA 불포함 제형들이다.

복수회 투여를 위해 제형화된 안정한 제형들에 있어서, 또한 상기 제형들은 선택적으로 상술한 구성성분들과 조합되는 되는 경우에 안정한 제형을 초래하는 양으로 보존제(들)를 함유할 수 있다. 상기 보존제들을 포함되는 경우에는, 예를 들어 미국 약전(USP) 및 유럽 약전(EP)의 항균성 요건들을 제공하기에 충분한 농도로 조재한다. 하기 실시예 7E에서의 표 23에는 최소 EP 항균성 요건들(EPA) 및 바람직한 EP 항균성 요건들(EPB)을 포함한 이들 요건들이 개시되어 있다. 일반적으로, EP(EPA 또는 EPB) 항균성 요건들을 충족시키는 제형들은 USP 항균성 요건들만을 충족시키기 위해 제형화된 것보다 많은 보존제를 함유한다. 일반적으로, 본원에서 제공된 제형들에 포함되는 경우에 상기 제형들은 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 항균성 보존제 유효성 시험(APET)에서 평가된 바와 같은 조성물의 시료에서 미생물 유기체를 살해하거나 이의 증식을 억제함으로써 항균 활성을 나타내는 양으로 보존제(들)를 함유한다. 본원에서 제공된 제형들에 포함될 수 있는 보존제들의 비제한적인 예로는 페놀, 메타-크레졸(m-크레졸), 메틸파라벤, 벤질 알코올, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드, 4-클로로-1-부탄올, 클로르헥시딘 디하이드로클로라이드, 클로르헥시딘 디글루코네이트, L-페닐알라닌, EDTA, 브로노폴(2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올), 페닐머큐릭 아세테이트, 글리세롤(글리세린), 이미드우레아, 클로르헥시딘, 소듐 디히드로아세테이트, 오르토-크레졸(o-크레졸), 파라-크레졸(p-크레졸), 클로로크레졸, 세트리미드, 벤제토늄 클로라이드, 에틸파라벤, 프로필파라벤 또는 부틸파라벤 및 이의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시예에서, 상기 제형 중의 보존제는 적어도 하나의 페놀성 보존제를 함유한다. 예를 들어, 상기 제형은 페놀, m-크레졸 또는 페놀 및 m-크레졸을 함유한다. 본원에서 제공된 제형들에 포함되는 경우, 질량 농도(w/v)의 비율(%)로서 상기 제형 중의 하나 이상의 보존제의 총량은, 예를 들어 0.1%와 0.4% 사이 또는 약 0.1%와 약 0.4% 사이, 예를 들어 0.1%와 0.3% 사이, 0.15%와 0.325% 사이, 0.15%와 0.25% 사이, 0.1%와 0.2% 사이, 0.2%와 0.3% 사이, 또는 0.3%와 0.4% 사이일 수 있으며, 및 일반적으로는 보존제는 0.4% 미만(w/v)일 수 있으며, 예를 들어, 보존제의 총량은 적어도 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35%이거나, 적어도 약 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35%이지만, 0.4% 미만일 수 있다.

선택적으로, 상기 제형들은 제형이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 전달체와 같은 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다. 이러한 조성물들은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적정량의 담체와 함께 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태인 상기 화합물을 치료적 유효량으로 함유할 것이다. 이러한 약학적 담체로는 땅콩 오일, 대두유, 광유, 및 참깨씨유와 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일, 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 상기 약학 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우에 전형적인 담체이다. 식염수, 및 덱스트로오스 및 글리세롤 수용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사 용액용으로 이용될 수 있다.

예를 들어, 비경구 제제들에서 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체로는 수성 전달체, 비수성 전달체, 항균제, 등장제, 완충액, 항산화제, 국부 마취제, 현탁제, 분산제, 유화제, 격리제 또는 킬레이팅제, 및 기타 약학적으로 허용 가능한 물질을 들 수 있다. 수성 전달체의 예로는 염화나트륨 주사액, 링거액, 등장성 덱스트로오스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로오스 및 젖산화 링거 주사액을 들 수 있다. 비수성 비경구 전달체로는 면실유, 옥수수 오일, 참깨씨유 및 땅콩 오일과 같은 식물성 기원의 고정유를 들 수 있다. 정균(bacteriostatic) 또는 진균 발육 저지(fungistatic) 농도로 존재하는 항균제는 페놀류 또는 크레졸류, 수은제, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르류, 티메로살, 염화벤즈알코늄 및 염화벤제토늄을 포함하는 다중 투여 컨테이너들에 패키징된 비경구 제제들에 첨가될 수 있다. 등장제로는 염화나트륨 및 덱스트로오스를 들 수 있다. 완충액으로는 포스페이트 및 시트레이트를 들 수 있다. 항산화제로는 이황산나트륨을 들 수 있다. 국부 마취제로는 프로카인 염산염을 들 수 있다. 현탁제 및 분산제로는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 들 수 있다. 유화제로는 폴리소르베이트 80(트윈 80)을 들 수 있다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이팅제로는 EDTA를 들 수 있다. 또한 약학적 담체로는 수혼화성 전달체를 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조절을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 들 수 있다.

조성물들은 활성 성분과 함께 락토오스, 수크로스, 인산이칼슘 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 희석제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘 및 활석과 같은 윤활제; 및 전분, 아라비아고무와 같은 천연 고무, 젤라틴, 글루코오스, 당밀, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 포비돈(povidone), 크로스포비돈(crospovidone)류와 같은 결합제 및 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 기타 이러한 결합제를 포함할 수 있다.

예를 들어, 부형제 단백질은 임의의 다수의 약학적으로 허용 가능한 단백질들 또는 펩티드들일 수 있는 제형에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 상기 부형제 단백질은 면역 반응을 유발하지 않은 채 포유동물 대상체에 투여되는 이의 능력 때문에 선택된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민은 일반적으로 본원에 제공된 안정한 제형들에 포함되지 않을지라도 일반적으로는 약학적 제형들에서 사용하기에 매우 적합하다. 기타 공지된 약학적 단백질 부형제들로는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 부형제는 보유 용기 또는 바이알에 대한 단백질의 흡착을 방지하기에 충분한 농도로 상기 제형에 포함된다. 상기 부형제의 농도는 부형제의 특징, 및 복합제형 중의 단백질의 농도에 따라 다를 것이다.

필요한 경우, 조성물은 또한 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트르산나트륨, 사이클로덱스트린 유도체들, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민, 아세트산나트륨, 트리에탄올아민 올리에이트, 및 기타 이러한 약제를 소량으로 함유할 수도 있다.

8. 예시적인 안정한 히알루로난 분해 효소 제형

본원에서 제공된 제형들은 37℃ 내지 42℃의 온도, 예를 들어 37℃ 또는 40℃ 보다 높거나 동등한 온도에서 적어도 3일, 및 일반적으로 적어도 1개월 동안 안정성을 보이는 안정한 히알루로난 분해 효소 제형이다.

일 예에서, 예시적인 제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 예를 들어 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제, 및 특히 적어도 155U/㎖, 적어도 약 155U/㎖ 또는 약 155U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제; 5mM 내지 200mM 또는 약 5mM 내지 약 200mM, 예를 들어 10mM 내지 50mM 또는 5mM 내지 20mM의 Lys-Lys(예를 들어, 적어도 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 또는 적어도 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM 또는 약 50mM); 0mM 내지 300mM 또는 약 0mM 내지 약 300mM의 다이베이직 소듐 포스페이트(예를 들어, 0mM 내지 150mM 또는 5mM 내지 50mM, 또는 약 0mM 내지 약 150mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 다이베이직 소듐 포스페이트, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 100mM 또는 150mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 100mM 또는 150mM의 다이베이직 소듐 포스페이트); 0mM 내지 50mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM의 메티오닌(예를 들어, 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 약 20mM, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 메티오닌); 및 0.01% 내지 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 예를 들어 0.01% 내지 0.05%의 폴록사머 188 예를 들어 0.001% 내지 0.05% (예를 들어, 적어도 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05%, 또는 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05%의 폴리소르베이트 80)을 함유한다. 상기 제형은 6.5 내지 7.6 또는 약 6.5 내지 약 7.6의 pH, 예를 들어 6.5 내지 7.2 또는 7.0 내지 7.6, 또는 약 6.5 내지 약 7.2 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH(예를 들어, 적어도 pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6, 또는 적어도 약 pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6)로 제조된다. 또 다른 예에서, NaCl은 140mM 미만의 농도로 포함된다. 예를 들어, NaCl은 50mM 내지 150mM 또는 약 50mM 내지 약 150mM의 농도, 예를 들어 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM, 또는 적어도 약 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도로 포함된다.

다른 예에서, 예시적인 제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 예들 들어 100U/㎖ 내지 500U/㎖ 또는 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제, 및 특히 적어도 155U/㎖, 적어도 약 155U/㎖ 또는 약 155U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제; 5mM 내지 200mM 또는 약 5mM 내지 약 200mM, 예를 들어 50mM 내지 150mM의 MgCl₂(예를 들어, 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM, 120mM, 130mM 또는 150mM, 또는 적어도 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 110mM, 약 120mM, 약 130mM 또는 약 150mM); 0mM 내지 300mM, 또는 약 0mM 내지 약 300mM의 히스티딘 클로라이드(예를 들어, 0mM 내지 150mM 또는 5mM 내지 50mM, 또는 약 0mM 내지 약 150mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 히스티딘 클로라이드, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 100mM 또는 150mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 100mM 또는 150mM의 히스티딘 클로라이드); 0mM 내지 150mM 또는 약 0mM 내지 약 150mM의 메티오닌 (예를 들어, 예를 들어, 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 약 20mM, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 메티오닌); 및 0.01% 내지 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 예를 들어 0.01% 내지 0.05%의 폴록사머 188(예를 들어, 적어도 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05%, 또는 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05%의 폴리소르베이트 80)을 함유한다. 상기 제형은 6.5 내지 7.6 또는 약 6.5 내지 약 7.6의 pH, 예를 들어 6.5 내지 7.2 또는 7.0 내지 7.6, 또는 약 6.5 내지 약 7.2 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH(예를 들어, 적어도 pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6, 또는 적어도 약 pH 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6)로 제조된다.

E. 인슐린 폴리펩티드

본원에서는 히알루로난 분해 효소 및 인슐린의 복합제형이 제공된다. 본원에서 제공된 복합제형은 인슐린의 자가 연결을 감소시키고 육량체의 더욱 신속한 해리를 초래하도록 변형된 레귤러 인슐린 또는 인슐린 유사체(예를 들어, 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는 속효성 유사체 또는 신속 작용 유사체로 지칭됨)와 같은 속효성 인슐린을 함유하는데, 이들은 예를 들어 아미노산 대체에 의해 변형된다.

인슐린은 분자량이 5808 달톤(dalton, Da)인 51개의 아미노산 잔기들로 구성된 폴리펩티드이다. 이는 췌장 내의 베타 세포 란게르한스섬에서 생성된다. 예시적인 인간 인슐린은 ER에 대한 24개의 아미노산의 신호 펩티드를 함유하는 110개의 아미노산의 전구체 폴리펩티드인 프레프로인슐린(서열번호 101)로서 번역되고, 상기 신호 서열은 절단되어, 프로인슐린(서열번호 102)이 된다. 상기 프로인슐린 분자는 후속적으로 프로호르몬 전환효소(prohormone convertase, PCI 및 PC2)로서 공지된 단백질 가수분해 효소의 작용에 의해, 그리고 엑소프로테아제 카르복시펩티다아제 E의 작용에 의해 성숙한 인슐린으로 전환된다. 이는 4개의 염기성 아미노산 잔기들의 제거를 초래하고, 나머지 31개의 아미노산의 C-펩티드 또는 연결사슬(서열번호 101로 기재된 프레프로인슐린 폴리펩티드의 57 내지 87번째 아미노산 잔기들에 상응함)을 초래한다. 결과적인 인슐린은 21개의 아미노산의 A-사슬(서열번호 102로 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 66 내지 86번째 아미노산 잔기들에 상응함) 및 30개의 아미노산의 B-사슬(서열번호 102로 기재된 프로인슐린 폴리펩티드의 1 내지 30번째 아미노산 잔기들에 상응함)을 함유하며, 이들은 이황화 결합에 의해 가교 결합된다. 전형적으로, 성숙한 인슐린은 3개의 이황화 교량, 즉 A-사슬의 7번째 위치와 B-사슬의 7번째 위치 사이에 첫 번째 교량, A-사슬의 20번째 위치와 B-사슬의 19번째 위치 사이 두 번째 교량, 및 A-사슬의 6번과 11번째 사이의 세 번째 교량을 함유한다. 성숙한 인슐린의 A 사슬의 서열은 서열번호 103으로 기재되며, B-사슬의 서열은 서열번호 104로 기재되어 있다.

인슐린에 대한 언급은, 그 인슐린이 인간 인슐린 수용체에 결합하여 신호 캐스케이드(cascade)를 개시하여 글루코오스 흡수 및 보관 및/또는 내인성 글루코오스 생산의 감소를 초래하는 한, 프레프로인슐린, 프로인슐린 및 단일사슬 또는 두 개의 사슬 형태의 인슐린 폴리펩티드, 활성이 있는 이의 절단된 형태를 포함하며, 대립형질 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 변이체 및 기타 변이체, 서열번호 1에 기재된 전체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖거나 이의 성숙한 형태를 포함하는, 예를 들어 인슐린 유사체 또는 기타 유도된 형태가 포함된다. 예를 들어, 인슐린은 인슐린 종 변이체를 포함한다. 이들은 소(서열번호 133으로 기재됨) 및 돼지(서열번호 123)로부터 유래한 인슐린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 소 인슐린은 A 사슬의 8 및 10번째 아미노산에서 인간 인슐린과 상이하다. 돼지 인슐린은 B 사슬의 30번째 아미노산에서만 인간 인슐린과 상이하며, 여기서 소 서열과 마찬가지로 트레오닌을 대신하여 알라닌 치환이 존재한다. 인슐린의 기타 예시적인 종 변이체는 서열번호 105 내지 146 중 임의의 서열번호로 기재되어 있다.

또한 인슐린의 변이체 중에는 서열번호 103 및 104(A 사슬 및 B 사슬)로 기재된 인간 인슐린에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 함유하는 인슐린 유사체가 포함된다. 이들 변이체는 신속 작용 또는 지속성 인슐린 유사체(본원에서의 목적을 위해 이는 속효성 및 지속성 인슐린 유사체 형태를 포함하는 것으로 이해될지라도 본원에서는 모두가 속효성 인슐린 유사체로 명명됨)을 포함한다. 속효성 및 지속성 유사체 형태를 포함하는 예시적인 인슐린 유사체(A사슬 및 B 사슬)은 서열번호 147 내지 165 및 182 내지 184로 기재되어 있다. 예를 들어, 인슐린 유사체로는 글루리신(LysB3, GluB29; 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 149(B 사슬)로 기재됨), HMR-1153(LysB3 및 IleB28; 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 182(B 사슬)로 기재됨), HMR-1423(GlyA21, HisB31 및 HisB32; 서열번호 183(A 사슬) 및 서열번호 184(B 사슬)로 기재됨), 인슐린 아스파르트(AspB28; 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 147(B 사슬)로 기재됨), 및 인슐린 리스프로(LysB28, ProB29; 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 148 (B-사슬)로 기재됨)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 모든 예에서, 상기 유사체의 명명은 상기 사슬의 N 말단으로부터 넘버링(numbering)된 인슐린의 A 사슬 또는 B 사슬 상의 특정 위치에서의 아미노산 치환에 대한 설명에 기반을 두고 있으며, 여기서 상기 서열의 나머지 부분은 천연 인간 인슐린의 서열이다.

따라서 본원에서 복합제형에 제공된 바와 같은 레귤러 인슐린은 서열번호 103 및 104로 기재된 아미노산들의 서열을 함유하는 성숙한 인슐린이다. 레귤러 인간 인슐린의 예시적인 예로는 Humulin^® R로 명명된 재조합 인간 인슐린이 있다. 또한 레귤러 인슐린은 A 사슬 및 B 사슬을 갖는 성숙한 인슐린의 종 변이체, 예를 들어 서열번호 105 내지 146 중 임의의 서열번호로 기재된 성숙한 형태의 종 변이체를 들 수 있다. 본원에서 복합제형에 포함되는 기타 예시적인 인슐린 유사체로는 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 149(B 사슬)로 기재된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린; 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 147(B 사슬)로 기재된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린; 또는 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 148(B 사슬)로 기재된 아미노산들의 서열을 갖는 인슐린을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

임의의 상술한 인슐린 폴리펩티드로는 인간과 같은 임의의 종으로부터의 췌장에 의해 생산되는 인슐린을 들 수 있으며, 또한 합성에 의해 생성되거나 재조합 기법을 사용함으로써 생산되는 인슐린을 들 수 있다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 인슐린은 인슐린의 A 사슬 및 B 사슬에 대한 합성 유전자들을 발현함으로써, 전장 프로인슐린을 발현하고 이를 적절한 효소적 및 화학적 방법들에 노출시켜 성숙한 인슐린을 생성함으로써, 또는 링커 펩티드에 의해 연결된 A 사슬 및 B 사슬을 발현함으로써 생합성에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, DeFelippis 등, (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조).

인슐린은 또한 단량체성 및 육량체성 형태와 같은 올리고머 형태를 포함한다. 인슐린은 혈장 내에서 순환하는 동안 단량체로서 존재할 수 있으며, 이는 또한 단량체 형태로 존재하는 동안에 이의 수용체에 결합한다. 그러나 인슐린은 이량체로 자가 결합(self-association)하는 경향을 가지며, Zn^{2 +}와 같은 금속 이온의 존재 하에 육량체와 같은 고차 구조로 용이하게 결합될 수 있다. 보다 약한 기타 아연 결합 부위가 보고된 바 있지만, Zn^{2 +}에 대한 대칭적 고친화성 결합 부위가 2개 존재한다(예를 들어, DeFelippis 등, (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 자가 결합은 화학적 분해 및 물리적 변성을 방지하기 위해 상기 분자의 안정에 있어서 중요하다. 따라서 췌장 베타 세포 내의 저장 소낭에서 인슐린은 육량체로서 존재한다. 그러나 세포외 공간으로의 방출 시 상기 인슐린 육량체는 보다 중성인 상태로의 pH의 변화를 경험할 수 있으며, 아연 이온을 함유하는 육량체는 희석되는 것으로 여겨지며, 이는 상기 육량체를 불안정화시킨다. 세포외 공간에서의 인슐린 육량체의 불안정성에 기여하는 기타 이유들이 있을 수 있다. 따라서 인슐린은 혈액에서 단량체로서 대부분 발견된다. 안정화 효과를 이용하기 위해, 대부분의 인슐린의 시판 제형은 육량체로의 자가 결합을 촉진하기에 충분한 양으로 아연 이온을 함유한다. 그러나 상기 육량체 구조는 피하 투여 시에 이들 제형의 흡수 속도를 감소시킨다.

인슐린은 당뇨 환자에서와 같이 혈당 조절을 위한 치료제로서 사용된다. 기저 요법, 식사 요법 또는 이의 조합에 대해 글루코오스를 조절하기 위해 인슐린이 투여되고 있는지의 여부에 따라 다양한 유형의 인슐린 제형이 존재한다. 인슐린 제형은 속효성 제형으로서 단독으로 제공될 수 있거나, 기저 작용 제형(즉, 중간 지속성 및/또는 지속성 형태)로서 단독으로 제공될 수 있거나, 이들의 혼합물로서 제공될 수 있다(예를 들어, 표 4 참조). 전형적으로, 혼합물은 속효성 인슐린 및 중간 또는 지속성 인슐린을 함유한다. 예를 들어, 속효성 인슐린은 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 및 50:50을 포함하여 다양한 혼합 비율로 NPH 인슐린(아래에서 논의되는 바와 같은 예시적인 중간 지속성 인슐린)과 조합될 수 있다. 이러한 예비-혼합된 제제들은 단일 제형에서 식사 관련 인슐린 요건들 및 기저 인슐린 요건들 모두를 편리하게 제공함으로써 일일 인슐린 주사의 횟수를 줄일 수 있다.

인슐린의 제제들은 특정 방식으로 제형화된 인슐린 폴리펩티드, 또는 이의 변이체(즉, 유사체)를 포함한다. 일부 예에서, 인슐린에 대한 상이한 특성, 예를 들어 상이한 작용 지속기간을 부여하는 것은 상기 제형 중의 구성요소 및 물질들이다. 예를 들어, 대부분의 인슐린 제제들은 제형 중에 아연과 같은 금속 이온을 함유하며, 이는 상기 분자의 자가 결합을 촉진함으로서 인슐린을 안정화시킨다. 육량체성 형태로의 자가 결합은 투여 시에 인슐린의 흡수에 영향을 미칠 수 있다. 더 나아가, 일부 지속성 기저 인슐린 제형은 아연의 첨가에 의해 아세테이트 완충액(포스페이트 대신)으로부터 인슐린을 침전시킴으로서 제조된다. 높은 아연 함량과의 인슐린의 대형 결정은 수집되고, 아세트산나트륨-염화나트륨의 용액(pH 7.2 내지 7.5) 내에 재-현탁되는 경우에 피하 주사 이후에 느리게 흡수되며, 지속성의 작용을 발휘한다. 결정 제제는 연장된 인슐린 아연 현탁액(울트라렌테(ultralente) 인슐린)으로 명명된다. 기타 아연 함유 인슐린 제제들은, 예를 들어 세미렌테(semilente) 인슐린(즉시형 인슐린 아연 현탁액들) 및 렌테(lente) 인슐린(인슐린 아연 현탁액들)을 포함하며, 이들은 주로 사용된 아연 농도가 상이하다. 아연 함유 인슐린 제제들은 또한 NPH 인슐린과 같이 프로타민에 의해 변형되는 인슐린을 포함한다.

다른 예에서, 프로타민과 같은 침전제는 미세 결정성 현탁액을 생성하기 위해 인슐린 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 결정 인슐린은 결정성 형태로 존재하지 않는 인슐린과 비교해서 연장된 작용 지속기간을 갖는다. 프로타민 아연 인슐린은 수성 현탁액으로 피하 주사되는 경우에 배치(disposition) 부위에서만 느리게 용해되며, 인슐린은 지연된 속도로 흡수된다. 프로타민 아연 현탁액 인슐린은 NPH 인슐린으로도 공지된 이소판(isophane) 인슐린 현탁액에 의해 상당히 대체되었다. 이는 결정성인 변형된 프로타민 아연 인슐린 현탁액이다. 인슐린, 프로타민 및 아연의 농도는 상기 제제가 레귤러 인슐린의 제제와 프로타민 아연 인슐린 현탁액의 중간인 작용 개시점 및 작용 지속기간을 갖도록 조정된다.

더 나아가, 상기 제제들에서 pH 차이는 또한 인슐린의 유형 및 특성에 영향을 미친다. 대부분의 인슐린은 중성 pH에서 제형화된다. 하나의 예외는 인슐린 글라르진(glargine)으로, pH 4.0에서 시판 제형으로 제공된다. B-사슬의 C 말단에 대한 2개의 아르기닌의 첨가로 인해, 글라르진 인슐린의 등전점(isoelectric point)은 이동되어, 산성 pH에서 이를 더욱 가용성이 되게 한다. 부가적인 아미노산 변경이 A 사슬(N21G)에 존재하여 산 민감성 아스파라긴으로부터 야기되는 탈아민화 및 이량화를 방지한다. 글라르진 인슐린의 A 사슬의 서열은 서열번호 150으로 기재되어 있으며, B-사슬은 서열번호 151로 기재되어 있다. 생리학적 pH에 대한 노출은 투여 시에 나타나기 때문에, 미세 침전물이 형성되며, 이는 글라르진을 결정성의 지속성 인슐린과 유사하게 만든다.

하기 표 4에는 인슐린의 다양한 유형, 이들의 작용 개시점 및 이들의 적용이 요약되어 있다.

표 4

가장 통상적으로 사용되는 인슐린은 속효성 인슐린으로, 레귤러 인슐린 (즉, 이의 대립 유전자형 및 종 변이체를 포함하는 고유 또는 야생형 인슐린) 및 속효성 인슐린 유사체를 포함한다. 본원에서의 목적을 위해, 인슐린에 대한 언급은 달리 구체적으로 언급하지 않는 한 속효성 인슐린이다.

속효성 인슐린

본원에서 제공되는 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 복합제형에서 사용될 수 있는 속효성 인슐린은 야생형 또는 고유 인슐린인 레귤러 인슐린, 및 속효성 인슐린 유사체를 포함한다. 기저 작용 인슐린에 비해 그들의 빠른 흡수 속도로 인해, 속효성 인슐린은 주로 식후 조절 목적으로 사용된다. 예시적인 속효성 인슐린은 하기 표 5에 기재되어 있다. 속효성 인슐린은 미국 특허 제 7,279,457 호 및 미국 특허 공개공보 제 2007-0235365 호, 제 2008-0039368 호, 제 2008-0039365 호, 제 2007-0086952 호, 제 2007-0244467 호 및 제 2007-0191757 호에 기재된 임의의 인슐린 제제 및 장치와 같이 당업계에 공지된 임의의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 임의의 속효성 인슐린은 본원에서 제공되는 히알루로난 분해 효소와 복합제형 내에서 조합될 수 있다. 이러한 제형은 또한 히알루로난 분해 효소에 더하여, 중간 지속성 또는 지속성 인슐린과 속효성 인슐린의 혼합물을 더 포함할 수 있다.

표 5

a. 레귤러 인슐린

레귤러 인슐린은 고유 또는 야생형 인슐린 폴리펩티드를 포함한다. 이들은 소, 돼지 및 기타 종에서 유래한 인슐린뿐만 아니라 인간 인슐린도 포함한다. 레귤러 인간 인슐린은 Humulin^® R, Novolin^® R 및 Velosulin^®로서 판매되고 있다. 돼지 인슐린은 Iletin II^®로서 판매되고 있다. 일반적으로, 레귤러 인슐린은 단독으로 피하 투여되는 경우에 30분의 작용 개시점을 갖는다. 최대 혈장 수준은 1 내지 3시간 이내에 관측되며, 강도의 지속은 투약과 함께 증가한다. 피하 투여에 따른 혈장 반감기는 약 1.5시간이다.

b. 속효성 유사체(소위 신속 작용 인슐린으로도 지칭됨)

종종 당업계에서 신속 작용 인슐린으로 지칭되는 속효성 인슐린 유사체는 일반적으로 하나 이상의 아미노산 변경을 함유하는 인슐린의 변형된 형태이다. 상기 유사체는 레귤러 인슐린과 비교 시에 흡수 속도 및 작용 개시점을 증가시킬 목적으로 인슐린 분자의 자가 결합을 감소시키도록 설계된다. 일반적으로, 이러한 유사체는 아연의 존재 하에 제형화되며, 따라서 안정한 아연 육량체로서 존재한다. 그러나 변형으로 인해 이들은 레귤러 인슐린에 비해 피하 투여 이후에 육량체 상태로부터 더욱 빠르게 해리된다.

i. 인슐린 리스프로

인간 인슐린 리스프로는 서열번호 104로 기재된 야생형 인슐린 B-사슬에서 28번 및 29번째 위치에서 아미노산 변화를 포함하여 이 위치의 Pro-Lys가 Lys-Pro로 전도된 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 리스프로의 서열은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 148(B 사슬)로 기재되어 있다. 이는 Humalog^®(인슐린 리스프로, rDNA 기원)란 명칭 하에 판매되고 있다. 이들 2개의 아미노산의 전도 결과는 자가 결합되는 경향이 감소된 폴리펩티드이며, 이는 더욱 신속한 작용 개시를 허용한다. 구체적으로, 상기 B-사슬에서의 서열 전도는 2회의 소수성 상호작용의 제거, 및 이량체를 안정화시키는 2개의 베타 병풍형 수소 결합의 약화를 초래한다(예를 들어, DeFelippis 등, (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 상기 폴리펩티드는 자가 결합하고, 항균제(예를 들어, m-크레졸) 및 안정화를 위한 아연과 같은 부형제들이 제형에 제공된 결과로서 육량체를 형성한다. 그럼에도 불구하고, 아미노산 변형으로 인해 인슐린 리스프로는 레귤러 인슐린보다 더욱 신속하게 작용한다.

ii. 인슐린 아스파르트

인간 인슐린 아스파르트는 서열번호 104로 기재된 인간 인슐린의 B-사슬의 28번째 위치에서 프롤린에서 아스파르트산으로의 아미노산 치환을 함유하는 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 아스파르트의 서열은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 147(B 사슬)로 기재되어 있다. 이는 Novolog^®(인슐린 아스파르트 [rDNA 기원] 주사액)란 명칭으로 판매되고 있다. 인슐린 아스파르트에서의 변형은 음으로 하전된 측쇄 카르복실기를 제공하여 전하 반발(charge repulsion)을 생성하고 단량체-단량체 상호작용을 탈안정화시킨다. 더 나아가, 프롤린의 제거는 단량체 사이의 중요한 소수성 상호작용을 제거한다(예를 들어, DeFelippis 등, (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics. In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional 참조). 상기 유사체는 주로 단량체로서 존재하며, 리스프로와 같은 기타 속효성 유사체에 비해 응집하려는 경향이 덜하다. 일반적으로, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로는 이들 각각의 약동학적 및 약력학적 특성이 유사하다.

iii. 인슐린 글루리신

인간 인슐린 글루리신은 서열번호 104로 기재된 인간 인슐린의 B-사슬의 서열과 비교 시에 B-사슬에서 B3 위치에서의 아스파라긴에서 리신으로 아미노산 치환 및 B29번째 아미노산에서의 리신에서 글루탐산으로 아미노산 치환을 함유하는 인슐린 폴리펩티드 제형이다. 인슐린 글루리신의 서열은 서열번호 103(A 사슬) 및 서열번호 149(B 사슬)로 기재되어 있다. 이는 Apidra^®(인슐린 글루리신 [rDNA 기원] 주사액)이란 명칭으로 판매되고 있다. 상기 변형은 상기 폴리펩티드 분자를 인간 인슐린에 비해 자가 결합의 경향이 덜하다. 기타 인슐린 유사체과 달리, 상기 폴리펩티드는 육량체 증진 아연의 부재 하에 상업적으로 제형화된다(Becker 등, (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47: 7-20). 따라서 인슐린 글루리신은 인슐린 리스프로 및 인슐린 아스파르트보다 더욱 신속한 개시 속도를 갖는다.

F. 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형

본원에서는 레귤러 인슐린 및 신속 작용 인슐린 유사체(속효성 인슐린 유사체로도 지칭됨)을 포함하는 인슐린, 특히 속효성 인슐린, 및 가용성 히알루로니다아제(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 제공된다. 본원에서 제공된 제형의 예시로는 신속 작용 인슐린 유사체, 및 PH20 또는 가용성이며 활성을 갖는 이의 C-말단 절단된 단편(예를 들어, rHuPH20)의 안정한 복합제형이 있다. 히알루로난 분해 효소 및 속효성 인슐린을 함유하는 본원에서 제공된 조성물은 다양한 조건 하에서 다양한 온도에서 안정성을 위해 제형화된다. 본원에서 제공된 복합제형은 본원에서 기재된 바와 같이 다양한 스트레스 조건(예를 들어, 교반) 하에서 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 동안 0℃ 내지 40℃ 또는 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 안정하다. 따라서 상기 제형은 다중 사용에 적합하거나, 승온 또는 교반을 요구하는 기타 사용 조건에 적합하다. 예를 들어, 상기 복합제형은 연속적인 피하 주입(CSI) 제형뿐만 아니라 다중 주사(MDI) 제형용으로 적합하다. 본원에서 제공된 복합제형은 피하, 복강내, 피내, 근육내 주사에 의해 및 경피 경로를 통해 투여용으로 제형화된다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형은 다중 투여 제형이다. 따라서 본원에서 제공된 모든 제형은 인슐린(예를 들어, 신속 작용 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린), 히알루로난 분해 효소(예를 들어, PH20), 보존제, 및 하나 이상의 기타 안정화 부형제들을 함유한다.

본원에서 기재되고 예에서 예시된 바와 같이, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 및 속효성 인슐린의 안정성에 대한 반대 요건들로 인해 복합제형은 상기 2개의 성분의 제형을 혼합함으로써 간단하게는 달성될 수 없는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 정확한 NaCl 농도 및 pH는 인슐린 및 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20 또는 기타 가용성 히알루로니다아제 및 히알루로난 분해 효소)의 복합제형의 안정성에 중요하다. 최적의 NaCl 농도 및 pH를 결정하는 것은 이들 매개 변수들이 인슐린 및 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20에 대해 갖는 반대 효과에 의해 복잡하게 된다. 인슐린 용해도는 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 NaCl 농도에서 최대이다. 그러나 이들 조건은 rHuPH20에 유해하며, 이는 더욱 높은 pH 및 더욱 낮은 NaCl 농도에서 안정성을 잃게 된다. 예시적인 히알루로난 분해 효소 rHuPH20의 안정성은 NaCl 농도를 증가시키고 pH를 낮춤으로써 증가될 수 있다. 그러나 이러한 조건은 낮은 pH 및 높은 NaCl 농도에서 침전하는 인슐린 및 인슐린 유사체의 가용성에 악영향을 미친다. 따라서 본원에서의 목적들 중에는 인슐린 및 rHuPH20(또는 기타 가용성 히알루로니다아제 및 히알루로난 분해 효소)의 안정한 제형을 위한 최적의 NaCl 농도 및 pH의 제공, 또는 NaCl을 함유하지 않거나 더욱 낮은 NaCl 농도를 갖는 안정한 복합제형의 제공이 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 상기 상이한 안정한 제형은 다중 약물 주사(MDI)를 위해 사용될 수 있거나, 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII)을 위해 사용될 수 있다. 상기 2개의 투여 방식은 안정성에 대한 상이한 요건들을 갖는다. 특히 CSII용 복합제형은 가속화(또는 스트레스) 조건 하, 예를 들어 승온 또는 교반 하에 안정할 필요가 있는 반면, 사용 시까지 냉장 온도 또는 주위 온도에서 보관될 수 있는 MDI용 복합제형은 승온에서 및 교반 하에 안정할 필요가 없다. 따라서 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 각각의 이들 보관 조건 하에서 안정성을 촉진하는 부형제 또는 부형제의 농도는 반드시 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 추가적인 부형제들 또는 안정화제들, 또는 부형제들 또는 안정화제들의 상이한 농도는, 20 내지 30℃ 또는 약 20 내지 약 30℃의 온도, 또는 2 내지 8℃ 또는 약 2 내지 약 8℃의 온도에서 히알루로난 분해 효소 및/또는 인슐린의 안정성을 유지하기 위해 요구되는 것보다는 32 내지 40℃ 또는 약 32 내지 약 40℃의 온도에서 및 교반 하에 안정성을 유지하기 위해 요구된다. 이들 동일한 안정화제들은 더욱 낮은 온도에서 상기 제형의 안정성에 적합하지 않을 수 있다.

예를 들어, 인슐린이 일반적으로 32℃ 미만의 낮은 온도에서 보관되거나 사용되는 경우에 높은 NaCl 농도 및 낮은 pH 하에서 안정하지 않는 반면, 이러한 조건이 적어도 3일 동안 32℃ 내지 40℃의 더욱 높은 온도에서의 인슐린 가용성에 도움이 되는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 높은 NaCl 및 낮은 pH의 조건은 더욱 높은 온도에서 안정성을 요구하는 투여 요법인 CSII 도중에 사용하기 위한 복합제형에 존재할 수 있다. 본원에서는 낮은 pH(예를 들어, pH 6.8) 및 높은 NaCl(예를 들어, 200mM)을 포함하는 제형이 승온에서 안정하며, 따라서 37℃에서 적어도 3일 동안 CSII에 적합한 것으로 나타난다. 낮은 pH(예를 들어, pH 6.8) 및 높은 NaCl(예를 들어, 200mM)은 냉장 온도 또는 주위 온도와 같은 더욱 낮은 보관 온도 하에서 안정성에 적합하지 않다.

또한 안정화제 히알루로난(HA)은 유효한 안정화제이고, 인슐린 가용성에 대한 임의의 유해 효과를 나타내지 않는 채 CSII에 사용하기 위해 승온에서 히알루로난 분해 효소의 안정성을 유지한다. 이러한 경우, 히알루로난은 승온에서 히알루로난 분해 효소의 안정성을 촉진하는 반면, 냉장 온도에서의 인슐린의 가용성은 감소한다. 따라서 더욱 낮은 온도에서 더욱 긴 보관 기간 동안에 MDI 제형 중의 HA의 존재는 인슐린 가용성에 영향을 미칠 수 있다.

또한 Lys-Lys는 특히 37℃ 초과의 승온에서 히알루로난 분해 효소의 특히 양호한 안정화제인 것으로 밝혀져 있다. 또한 승온에서 히알루로난 분해 효소의 특히 양호한 안정화제인 MgCl₂와는 달리, Lys-Lys는 가용성을 유지하면서 인슐린과 양립가능성을 갖도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 더욱 낮은 농도의 Lys-Lys, 및 하나 이상의 기타 안정화제들의 존재는 승온과 같은 가속화 조건 하에서도 히알루로난 분해 효소 활성 및 인슐린 가용성을 유지하게 한다. 따라서 이러한 Lys-Lys 함유 복합제형은 또한 CSII 적용에 적합할 수 있다.

안정한 MDI 또는 CSII 제형을 위한 부형제 또는 부형제의 농도는 반드시 동일할 필요는 없으며, 본원에서 제공된 MDI 제형은 안정한 CSII 제형을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 일부 예에서, 냉장 온도 및 주위 온도에서 안정하지만 승온 및 스트레스 하에서는 필수적으로 안정하지 않는 MDI 복합제형은 더욱 낮은 pH 및 더욱 높은 염 농도를 갖는 희석제로 희석된다. 이는 MDI 제형에 비해 더욱 낮은 pH 및 더욱 높은 염 농도를 가지며, 따라서 승온 및 스트레스 조건(예를 들어, 교반)에서 안정하며 CSII용으로 적합한 제형을 생성한다. 일반적으로, 이러한 CSII 복합제형은 낮은 pH 및 높은 염 농도를 갖은 조성물들 중의 인슐린의 불용성으로 인해 냉장 온도에서 보관되지 않는다.

일반적으로, 상기 화합물들은 당업계에 널리 공지된 기법 및 절차들을 이용하여 약학 조성물 내로 제형화된다(예를 들어, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition,1985,126 참조). 약학적으로 허용 가능한 조성물들은 동물 및 인간에서 사용하기 위한 일반적으로 공인된 약전에 따라 제조된 규제 기구 또는 기타 기구용 승인을 고려하여 제조된다. 상기 제형은 투여 형태에 적합해야 한다.

상기 복합제형은 용액, 시럽 또는 현탁액으로서의 액체의 형태로 약학적 제제로서 제공될 수 있다. 액체 형태에서, 상기 약학적 제제들은 사용 이전에 치료적으로 유효한 농도까지 희석되도록 농축된 제제로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 상기 제제들은 사용을 위한 희석을 요구하지 않는 투약 형태로 제공된다. 이러한 액체 제제들은 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체들 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클들(예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르류, 또는 분획된 식물성 오일류); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 이용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 다른 예에서, 약학적 제제들은 사용 이전에 물 또는 기타 적합한 비히클을 이용하여 재구성을 위한 동결 건조된 형태로 제시될 수 있다.

본원에서 제공된 복합제형의 부피는 이들이 제공되는 용기에 적합한 임의의 부피일 수 있다. 일부 예에서, 상기 복합제형은 바이알, 주사기, 펜, 펌프용 저장소 또는 폐쇄 루프 시스템, 또는 임의의 기타 적합한 용기에 제공된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 0.1㎖와 500㎖ 사이 또는 약 0.1㎖와 약 500㎖ 사이, 예를 들어 0.1㎖와 100㎖ 사이, 1㎖와 100㎖ 사이, 또는 0.1㎖와 50㎖ 사이이며, 예를 들어 적어도 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상이거나, 적어도 약 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상이거나, 약 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 약 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상이거나, 0.1㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖, 4㎖, 5㎖, 10㎖, 15㎖, 20㎖, 30㎖, 40㎖, 50㎖ 또는 그 이상이다.

본원에서 하기에 기재된 바와 같이, 일부 예에서, 상기 복합제형은 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 농축된 제형로서 제조되며, 이들은 후속적으로 사용을 위해 적절한 희석제로 희석된다. 이러한 경우, 상기 농축된 복합제형은, 예를 들어 2℃ 내지 8℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃에서 장기간 보관을 위해 특별히 제형화될 수 있다. 희석 시 상기 복합제형은 MDI 적용을 위해 직접 사용될 수 있다. 그 반면, MDI에서 사용된 다중 투여 제형을 위한 요건들, 또는 CSII 요법을 위한 요건들이 서로 상이하기 때문에 상기 희석제의 구성요소들은 승온에서 또는 교반 하에 상기 복합제형의 적용을 위한 희석된 복합제형의 안정성을 확보하게 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 위에서 논의되고 아래에서 추가로 논의된 바와 같이, 상기 희석제는, 예를 들어 CSII 요법의 특징적인 조건인 승온에서, 또는 스트레스 조건(예를 들어, 교반) 하에서 상기 복합제형의 안정성과 양립가능성이 있는 필요한 양 또는 수준의 구성요소들 또는 안정화제들을 함유할 수 있다. 따라서 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 농축된 복합제형이 희석제로 희석되는 경우, 새로운 희석된 복합제형은, 예를 들어 CSII 요법에서 사용하기 위해, 예를 들어 적어도 32℃ 내지 40℃ 또는 적어도 약 32℃ 내지 40℃와 같은 승온, 예를 들어 약 37℃ 또는 37℃의 승온에서 또는 기타 스트레스 조건(예를 들어, 교반)에서 안정하다.

본원에서 안정한 복합제형에 제공되는 구성요소들의 설명이 하기에 제공된다. 본원에서 현재 제공되는 복합제형에 포함된 단백질 둘 다의 안정성을 극대화하기 위한 요건의 특정한 균형은 다중 주사 제형 및 상기 복합제형의 CSII 시스템을 달성가능하게 한다. 부형제, 안정화제 또는 pH와 같은 구성요소 또는 조건의 설명이 하기에 제공된다.

1. 안정한 복합제형의 구성성분

본원에서는 치료적 유효량의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 제공된다. 또한 상기 복합제형은 신속 작용(예를 들어, 속효성) 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린을 치료적 유효량으로 함유한다. 본원에서 제공된 복합제형의 예에서, 상기 복합제형은 50mM 내지 200mM 또는 약 50mM 내지 약 200mM의 농도, 예를 들어 80mM 내지 140mM의 농도의 NaCl, 6.5 내지 8.0 또는 약 6.5 내지 약 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.8 또는 6.8 내지 7.8, 예를 들어 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.6 또는 약 6.5 내지 약 7.5 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH, 상기 pH 범위를 유지하는 완충제, 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물, 및 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 유지하고 인슐린 순도, 회복 및/또는 효력의 적어도 90%를 유지하는 양의 안정화제를 더 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 안정화제로서 0.01% 내지 0.5%의 계면활성제를 함유한다. 상기 복합제형은 선택적으로 부가적인 안정화제들 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 본원에서의 일부 예에서, 상기 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안 안정하다. 이러한 복합제형은 다중 주사(MDI) 용도로 사용될 수 있다. 기타 예에서, 본원에서 제공된 복합제형은 32℃ 초과 또는 약 32℃ 초과의 승온, 예를 들어 35℃ 내지 40℃, 특히 37℃ 또는 40℃ 초과 또는 약 37℃ 또는 약 40℃ 초과의 온도, 및/또는 교반 조건과 같은 가속화 조건 하에서 적어도 3시간, 및 일반적으로 적어도 3일 동안 안정하다. 이러한 복합제형은 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII) 방법용으로 사용될 수 있다.

또한 본원에서는 NaCl을 함유하지 않거나 더욱 적은 양의 NaCl, 예를 들어 140mM 미만의 NaCl, 및 일반적으로 0mM 내지 100mM의 NaCl, 예를 들어 0mM 내지 50mM, 10mM 내지 40mM, 20mM 내지 30mM의 NaCl, 예를 들어 적어도 30mM 또는 적어도 약 30mM의 NaCl을 함유하는 복합제형이 제공된다. 이러한 예에서, 본원에서는 Lys-Lys는 심지어 NaCl의 부재 하에서도 히알루로난 분해 효소 및 인슐린을 안정화시키는 양으로 포함될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 선택적으로, NaCl은 이러한 제형에, 예를 들어 등장화제로서 포함될 수 있다. 이는, 예를 들어 Lys-Lys의 농도가 50mM 이하 Lys-Lys인 경우에 요구될 수 있다.

따라서 본원에서 제공된 복합제형의 일부 예에서, 상기 복합제형은 치료적 유효량의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소를 함유한다. 또한 상기 복합제형은 치료적 유효량의 신속 작용(예를 들어, 속효성) 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린을 함유한다. 본원에서 제공된 복합제형의 예에서, 상기 복합제형은 50mM 내지 120mM 또는 약 50mM 내지 약 120mM의 농도, 예를 들어 50 내지 80mM, 80mM 내지 100mM 또는 100mM 내지 120mM의 농도의 Lys-Lys, 6.5 내지 8.0 또는 약 6.5 내지 약 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.8 또는 6.8 내지 7.8, 예를 들어 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.6 또는 약 6.5 내지 약 7.5 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH, 상기 pH 범위를 유지하는 완충제, 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물, 및 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%를 유지하고 인슐린 순도, 회복 및/또는 효능의 적어도 90%를 유지하는 양의 안정화제를 더 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 안정화제로서 0.0005% 내지 1.0%(예를 들어, 0.0005% 내지 0.005%)의 계면활성제를 함유한다. 상기 복합제형은 선택적으로 부가적인 안정화제들, 등장화제들, 항산화제 및/또는 기타 부형제들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합제형은 NaCl을 140mM 미만의 농도, 예를 들어 0mM 내지 100mM 또는 약 0mM 내지 약 100mM의 농도, 예를 들어 0mM 내지 50mM, 10mM 내지 40mM 또는 20mM 내지 30mM, 또는 약 0mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 농도로 함유한다. 본원에서의 일부 예에서, 상기 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안 안정하다. 이러한 복합제형은 다중 주사(MDI) 용도로 사용될 수 있다. 기타 예에서, 본원에서 제공된 복합제형은 32℃ 초과 또는 약 32℃ 초과의 승온, 예를 들어 35℃ 내지 40℃, 특히 37℃ 또는 40℃ 초과 또는 약 37℃ 또는 약 40℃ 초과의 온도, 및/또는 교반 조건과 같은 가속화 조건 하에서 적어도 3시간, 및 일반적으로 적어도 3일 동안 안정하다. 이러한 복합제형은 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII) 방법용으로 사용될 수 있다.

a. 속효성 인슐린

본원에서 제공된 복합제형은 치료적 유효량의 신속 작용 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린을 함유한다. 상기 인슐린은 섹션 E에서 기재된 바와 같이 임의의 속효성 인슐린일 수 있다. 상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린일 수 있다. 특정 예에서, 상기 인슐린은 신속 작용 인슐린 유사체, 예를 들어 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 글루리신인 속효성 인슐린이다. 예를 들어, 상기 치료적 유효량은 10유닛/㎖ 내지 1,000U/㎖, 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖ 또는 500U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 또는 약 10유닛/㎖ 내지 약 1,000U/㎖, 약 100U/㎖ 내지 약 1,000U/㎖ 또는 약 500U/㎖ 내지 약 1,000U/㎖의 양, 예를 들어 적어도 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖ 또는 1,000U/㎖, 또는 적어도 약 10U/㎖, 20U/㎖, 30U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 60U/㎖, 70U/㎖, 80U/㎖, 90U/㎖, 100U/㎖, 150U/㎖, 200U/㎖, 250U/㎖, 300U/㎖, 350U/㎖, 400U/㎖, 450U/㎖, 500U/㎖ 또는 1,000U/㎖의 양일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 신속 작용 인슐린 유사체(예를 들어, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 글루리신)와 같은 속효성 인슐린을 적어도 100U/㎖, 적어도 약 100U/㎖, 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 양으로 함유한다.

본원에서 제공된 안정한 복합제형에서, 상기 제형 중의 인슐린 유사체를 포함한 인슐린의 안정성은 본원에서 기재된 바와 같이 다양한 온도(예를 들어, 2℃ 내지 8℃, 20℃ 내지 30℃, 또는 적어도 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 승온) 및 시간(예를 들어, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월) 또는 사용 조건(예를 들어, 교반)에서 보관 하에 있는 인슐린의 회복, 순도 및/또는 활성의 함수이다. 이들 매개 변수를 평가하기 위한 분석은 아래에서 논의된다. 본원에서 제공된 제형은 본원에서 기재된 바와 같이 상기제형이 치료용 용도에 적합하도록 인슐린 회복, 순도 및/또는 활성을 유지한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형에서 본원에서 기재된 바와 같은 보관 또는 사용 조건 하에 시간의 경과에 따른 상기 인슐린 순도(예를 들어, RP-HPLC 또는 기타 유사한 방법에 의해 평가된 바와 같음)는 보관 또는 사용 이전에 상기 제형 중의 인슐린의 순도의 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 일반적으로, 인슐린 순도(예를 들어, RP-HPLC에 의해 평가됨)에 있어서, 상기 표적의 허용 가능한 사양은 적어도 90% 또는 약 90%의 순도, 또는 약 90% 또는 90% 초과의 순도이다. 기타 예에서, 인슐린 순도는, 예를 들어 비-변성 또는 변성 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 인슐린의 응집의 함수로서 평가될 수 있다. 이러한 예에서, 본원에서 제공된 제형에서는 본원에서 기재된 바와 같이 보관 또는 사용 조건 하에 시간이 지남에 따라 상기 제형 중의 인슐린은 최고 면적으로 2%미만의 고분자량(HMWt) 인슐린의 종, 예를 들어 1.9% 미만, 1.8% 미만, 1.7% 미만, 1.6% 미만, 1.5% 미만, 1.4% 미만, 1.3% 미만, 1.2% 미만, 1.1% 미만, 1.0% 미만 또는 그 이하의 고분자량(HMWt) 인슐린의 종을 함유한다. 본원에서 기재된 보관 조건(예를 들어, 다양한 온도 및 시간) 또는 사용 조건(예를 들어, 교반) 하에서 시간(예를 들어, 수시간, 수일, 주수 또는 수개월)이 지남에 따라, 본원에서 제공된 제형 중의 인슐린은 이의 회복 또는 활성의 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 그 이상, 또는 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상을 유지한다. 따라서 100유닛/㎖의 인슐린으로 제형화된 용액에서, 적어도 90U/㎖, 91U/㎖, 92U/㎖, 93U/㎖, 94U/㎖, 95U/㎖, 96U/㎖, 97U/㎖, 98U/㎖ 또는 99U/㎖, 또는 약 90U/㎖, 약 91U/㎖, 약 92U/㎖, 약 93U/㎖, 약 94U/㎖, 약 95U/㎖, 약 96U/㎖, 약 97U/㎖, 약 98U/㎖ 또는 약 99U/㎖가 본원에서 기재된 바와 같이 교반 조건 하에 2℃ 내지 8℃ 또는 20℃ 내지 30℃의 온도, 또는 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 승온의 보관 또는 사용 하에 수시간, 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 유지된다.

b. 히알루로난 분해 효소

본원에서 제공된 복합제형은 섹션 C에서 기재된 임의의 것과 같은 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제를 치료적 유효량으로 함유한다. 본원에서 제공된 복합제형 중 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 양은 상기 조성물을 초속효성으로 만들기에 충분한 양이다. 예를 들어, 상기 양은 적어도 30유닛/㎖ 또는 적어도 약 30유닛/㎖에 대해 기능적으로 등가량이다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소를 30유닛/㎖ 내지 20,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 300U/㎖ to 내지 5,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 3,000U/㎖, 300U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 20,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 15,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 10,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 6,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 4,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 2,000U/㎖, 600U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 60U/㎖ 내지 600U/㎖ 또는 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 양, 또는 약 30유닛/㎖ 내지 약 20,000U/㎖, 약 300U/㎖ 내지 약 15,000U/㎖, 약 300U/㎖ 내지 약 10,000U/㎖, 약 300U/㎖ to 내지 약 5,000U/㎖, 약 300U/㎖ 내지 약 3,000U/㎖, 약 300U/㎖ 내지 약 2,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 20,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 15,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 10,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 6,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 4,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 2,000U/㎖, 약 600U/㎖ 내지 약 1,000U/㎖, 약 60U/㎖ 내지 약 600U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 내지 300U/㎖의 양, 예를 들어 적어도 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 200U/㎖, 300U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖, 2,000U/㎖, 3,000U/㎖, 4,000U/㎖, 5,000U/㎖, 6,000U/㎖, 7,000U/㎖, 8,000U/㎖, 9,000U/㎖, 10,000U/㎖, 12,000U/㎖, 15,000U/㎖ 또는 20,000U/㎖의 양, 또는 적어도 약 30U/㎖, 35U/㎖, 40U/㎖, 50U/㎖, 100U/㎖, 200U/㎖, 300U/㎖, 400U/㎖, 500U/㎖, 600U/㎖, 700U/㎖, 800U/㎖, 900U/㎖, 1,000U/㎖, 2,000U/㎖, 3,000U/㎖, 4,000U/㎖, 5,000U/㎖, 6,000U/㎖, 7,000U/㎖, 8,000U/㎖, 9,000U/㎖, 10,000U/㎖, 12,000U/㎖, 15,000U/㎖ 또는 20,000U/㎖의 양으로 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 PH20(예를 들어, rHuPH20)을 적어도 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 양, 예를 들어 적어도 600U/㎖, 적어도 약 600U/㎖, 약 600U/㎖ 또는 600U/㎖의 양으로 함유한다.

본원에서 제공된 복합제형에서, 상기 제형 중의 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로니다아제를 포함한 히알루로난 분해 효소의 안정성은 본원에서 기재된 바와 같이 다양한 온도(예를 들어, 2℃ 내지 8℃, 20℃ 내지 30℃, 또는 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 승온) 및 시간(예를 들어, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월) 또는 사용 조건(예를 들어, 교반)에서 보관 하에 상기 효소의 회복 및/또는 활성의 함수이다. 이들 매개 변수를 평가하기 위한 분석이 하기에 제공된다. 본원에서 제공된 제형은 상기 제형이 본원에서 기재된 바와 같이 치료용 용도로 적합하도록 히알루로니다아제 회복 및/또는 활성을 유지한다. 본원에서 제공된 안정한 제형에서, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소의 활성은 일반적으로 보관 또는 사용 이전의 상기 제형 중의 효소의 활성의 50% 초과이거나 약 50%이며, 예를 들어 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과 또는 그 이상, 또는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 일반적으로, 히알루로니다아제 활성에 있어서, 상기 안정성에 대한 표적의 허용 가능한 사양은 본원에서 기재된 바와 같이 2℃ 내지 8℃ 또는 20℃ 내지 30℃의 온도, 또는 적어도 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 승온에서 교반 조건 하에서 보관 또는 사용 하에 수시간, 수일, 수주 또는 수개월 동안 상기 효소의 초기 활성의 적어도 62%이다. 따라서 예를 들어, 600U/㎖의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 rHuPH20로 제형화된 용액에서, 적어도 360유닛/㎖, 365U/㎖, 370U/㎖, 375U/㎖, 380U/㎖, 390U/㎖, 420U/㎖, 480U/㎖, 540U/㎖, 546U/㎖, 552U/㎖, 558U/㎖, 564U/㎖, 570U/㎖, 576U/㎖, 582U/㎖, 588U/㎖, 594U/㎖ 또는 그 이상의 활성, 또는 적어도 약 360유닛/㎖, 365U/㎖, 370U/㎖, 375U/㎖, 380U/㎖, 390U/㎖, 420U/㎖, 480U/㎖, 540U/㎖, 546U/㎖, 552U/㎖, 558U/㎖, 564U/㎖, 570U/㎖, 576U/㎖, 582U/㎖, 588U/㎖, 594U/㎖ 또는 그 이상의 활성이 보관 또는 사용 조건 하에서 시간이 지남에 따라 유지된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 복합제형에서, 보관 또는 사용 조건(예를 들어, 교반) 하에 시간이 지남에 따라 적어도 375U/㎖의 히알루로난 분해 효소 활성이 유지된다. 기타 예에서, 안정성은, 예를 들어 RP-HPLC를 이용하여 상기 효소의 회복의 함수로서 평가될 수 있다. 이러한 예에서, 본원에서 제공된 제형에서는 히알루로니다아제 효소 회복은 60%와 140% 사이, 또는 약 60%와 약 140% 사이이다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형에서 히알루로니다아제 효소 회복은 3㎍/㎖와 7㎍/㎖ 사이, 또는 약 3㎍/㎖와 약 7㎍/㎖ 사이이다.

c. 보존제

다중 투여 제형으로서 사용을 위해, 본원에서 제공된 복합제형은 보존제(들)를 함유한다. 위에서 논의된 바와 같이, 보존제들은 인슐린의 가용성, 및 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정성 및 활성에 유해한 효과를 미칠 수 있는 반면, 동시에 육량체성 인슐린 분자를 안정화시키고, 다중 투여 제형 중의 항균제로서 필수적이다. 따라서 본원에서의 목적들 중 하나는 신속 작용 인슐린 유사체를 포함한 인슐린, 및 가용성 히알루로니다아제(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형에 사용될 수 있는 보존제(들)의 유형 및 농도를 확인하는 것이다.

상기 복합제형에 존재하는 하나 이상의 보존제는, 본원에서 기재된 바와 같이, 보관 조건(예를 들어, 시간의 경과 및 다양한 온도)에서 이의 활성을 잃도록 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소를 실질적으로 불안정화시킬 수 없다. 더 나아가, 이들 보존제들은 인슐린 육량체를 안정화시키고 원하는 항균 효과를 발휘하기에 충분한 농도로 존재해야 하지만, 인슐린의 가용성을 감소시킬 만큼 농축되지 않을 수 있다. 중요한 것은, 상기 보존제들은, 예를 들어 미국 약전(USP) 및 유럽 약전(EP)의 항균성 요건들을 제공하기에 충분한 농도로 존재해야 한다는 것이다. 하기 실시예 7E에서의 표 23에는 최소 EP 항균성 요건들(EPA) 및 바람직한 EP 항균성 요건들(EPB)을 포함한 이들 요건들이 기재되어 있다. 일반적으로, EP(EPA 또는 EPB) 항균성 요건들을 충족시키는 제형은 USP 항균성 요건들만을 충족시키기 위해 제형화된 것보다 많은 보존제를 함유한다.

따라서 본원에서 제공된 복합제형은 항균성 보존제 유효성 시험(APET)에서 평가된 바와 같은 조성물의 시료에서 미생물 유기체를 사멸시키거나 이의 증식을 억제함으로써 항균 활성을 나타내는 양으로 보존제(들)를 함유한다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 최소 요건들을 충족시키기 위해 USP 및 EPA 또는 EPB 하에 충족되는 항균성 보존제 유효성 시험 및 표준에 익숙하다. 일반적으로, 상기 항균성 보존제 유효성 시험은 조성물, 예를 들어 본원에서 제공된 복합제형을 규정된 적합한 미생물, 즉 박테리아, 효모 및 진균의 접종물로 면역성 시험(challenging)을 하고, 규정된 온도에서 접종된 제제를 보관하고, 지정된 시간 간격으로 시료를 추출하고, 상기 시료 중의 유기체의 수를 계산하는 것을 포함한다(Sutton 및 Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56(6); 300-311]; 문헌[The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1, 2002), The United States Pharmacopeia 25 ^th Revision, Rockville, MD, Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; and European Pharmacopoeia, Chapter 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation 참조). 상기 면역성 시험에 사용된 미생물로는 일반적으로 3개의 균주의 박테리아, 즉 대장균(Escherichia coli; ATCC 번호: 8739), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa; ATCC 번호: 9027) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(ATCC 번호: 6538), 효모 (칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 번호: 10231) 및 진균류(아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ATCC 번호: 16404)를 들 수 있으며, 이들 모두는 상기 접종된 조성물이 조성물 1㎖ 당 105 또는 106개의 콜로니 형성 유닛(cfu)의 미생물을 함유하도록 첨가된다. 상기 조성물의 보존제 특성은 시험조건 하에 규정된 온도에서 규정된 시간 이후에 접종된 조성물 중의 미생물 개수에서 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 유의한 감소가 있거나 증가가 없는 경우에 적절한 것으로 간주된다. 평과 기준은 초기 시료 또는 이전 시점에 비해 생존 가능한 미생물의 개수에서 log 감소 측면에서 나타나 있다.

표 6

구체적으로,상기 조성물, 예를 들어, 복합제형은 박테리아 또는 진균(대장균(ATCC 번호: 8739), 슈도모나스 에루지노사(ATCC 번호: 9027), 스타필로코쿠스 아우레우스(ATCC 번호: 6538), 칸디다 알비칸스(ATCC 번호: 10231) 및 아스퍼질러스 나이거(ATCC 번호: 16404)) 각각에 대해 하나씩 적어도 5개 용기 내로 분취된다. 이어 각각의 용기는 상기 조성물 1㎖ 당 10⁵ 또는 10⁶ 마리의 미생물의 접종물을 제공하도록 시험 유기체들 중 하나로 접종되며, 이때 상기 접종물은 상기 조성물의 부피의 1%를 초과하지 않는다. 상기 접종된 조성물들은 28일의 기간 동안에 20 내지 25℃의 온도에 유지되며, 시료는 상기 표 6에 기재된 기준에 따라 6시간, 24시간, 7일, 14일 및 28일의 시점에 제거된다. 상기 각 시료 중의 생존 가능한 미생물의 개수(cfu)는 플레이트 계수 또는 멤브레인 여과에 의해 결정된다. 최종적으로, 각 시료에 대한 cfu는 상기 접종물과 이전 시료 중 하나와 비교하며, log 감소가 결정된다.

USP 표준 하에, 상기 미생물 유기체로 접종된 시료 중의 보존제들의 항균 활성의 속도 또는 수준은 접종 후 7일째 날에 박테리아 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소; 접종 후 14일째 날에 박테리아 유기체의 적어도 3.0의 log₁₀ 유닛의 감소; 및 적어도 추가적인 증가 없음, 즉 상기 미생물 접종물에 의한 조성물의 접종 후 14일째 날부터 28일째 날까지 박테리아 유기체의 0.5 이하의 log₁₀ 유닛 증가이다. USP 표준에 따른 진균 유기체에 있어서, 상기 미생물 유기체로 접종된 시료 중의 보존제들의 항균 활성의 속도 또는 수준은 상기 미생물 접종물에 의한 조성물의 접종 후 7일, 14일 및 28일 이후 초기 양으로부터 적어도 증가가 없음이다. EPB 또는 최소EP 표준 하에서, 상기 미생물 유기체로 접종된 시료 중의 보존제들의 항균 활성의 속도 또는 수준은 접종 후 24시간 정도에 박테리아 유기체의 적어도 1.0의 log₁₀ 유닛의 감소; 접종 후 7일째 날에 박테리아 유기체의 적어도 3의 log₁₀ 유닛의 감소; 및 적어도 추가적인 증가 없음, 즉 상기 미생물 접종물에 의한 조성물의 접종 후 14일째 날부터 28일째 날까지 박테리아 유기체의 0.5 이하의 log₁₀ 유닛 증가이다. EPA 표준에 따르면, 접종 후 6시간 정도에 박테리아 유기체의 적어도 2의 log₁₀ 유닛의 감소와 함께 접종 후 24시간 정도에 박테리아 유기체의 적어도 3의 log₁₀ 유닛의 감소, 및 접종 후 28일째 날에 미생물 유기체의 회복 없음이 요구된다. 최소 EPB 표준에 따른 진균 유기체에 있어서, 상기 미생물 유기체로 접종된 시료 중의 보존제들의 항균 활성의 속도 또는 수준은 접종 후 14일째 날에 진균 유기체의 적어도 1의 log₁₀ 유닛의 감소, 및 상기 조성물의 접종 이후 28일째 날에 진균 유기체에서의 증가 없음이며, 증가된 EPA 표준에 따르면, 접종 후 7일째 날에 2의 log₁₀ 유닛의 감소, 및 상기 조성물의 접종 이후 28일째 날에 진균 유기체에서의 증가 없음이 요구된다.

본원에서 제공된 복합제형에 포함될 수 있는 보존제들의 비제한적인 예로는 페놀, 메타-크레졸 (m-크레졸), 메틸파라벤, 벤질 알코올, 티메로살(thimerosal), 벤잘코늄 클로라이드, 4-클로로-1-부탄올, 클로르헥시딘 디하이드로클로라이드, 클로르헥시딘 디글루코네이트, L-페닐알라닌, EDTA, 브로노폴(bronopol), 페닐머큐릭 아세테이트, 글리세롤, 이미드우레아, 클로르헥시딘, 소듐 디히드로아세테이트, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 세트리미드, 벤제토늄 클로라이드, 에틸 파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤 및 이의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 단일 보존제를 함유할 수 있다. 기타 예에서, 상기 복합제형은 적어도 2개의 상이한 보존제들 또는 적어도 3개의 상이한 보존제들을 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 L-페닐알라닌 및 m-크레졸, L-페닐알라닌 및 메틸파라벤, L-페닐알라닌 및 페놀, m-크레졸 및 메틸파라벤, 페놀 및 메틸파라벤, m-크레졸 및 페놀, 또는 기타 유사한 조합과 같은 2개의 보존제들을 함유할 수 있다. 일 예에서, 상기 복합제형 중의 보존제는 적어도 하나의 페놀성 보존제를 함유한다. 예를 들어, 상기 복합제형은 페놀, m-크레졸 또는 페놀 및 m-크레졸을 함유한다.

본원에서 제공된 복합제형에서, 상기 제형에서 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 상기 하나 이상의 보존제의 총량은, 예를 들어 0.1%와 0.4% 사이 또는 약 0.1%와 약 0.4% 사이, 예를 들어 0.1%와 0.3% 사이, 0.15%와 0.325% 사이, 0.15%와 0.25% 사이, 0.1%와 0.2% 사이, 0.2%와 0.3% 사이, 또는 0.3%와 0.4% 사이일 수 있다. 일반적으로, 상기 복합제형은 0.4% 미만(w/v)의 보존제를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 적어도 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 또는 0.35%의 총량, 또는 적어도 약 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 또는 0.35%의 총량의 보존제를 함유한다. 그러나 0.4%미만인 총 보존제를 함유할 수 있다.

인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형에 사용되는 예시적인 보존제들로는 페놀 및 m-크레졸이 있다. 일부 예에서, 상기 복합제형 중의 페놀의 질량 농도(w/v)의 백분율(%)은 m-크레졸의 질량 농도(w/v)의 백분율(%)보다 크다. 이는 적어도 부분적으로 페놀에 비해 특히 승온에서 용액 중의 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20)의 안정성에 대한 m-크레졸의 더욱 유해한 효과에 기인한다(예를 들어 실시예 7 참조). 따라서 본원에서 제공된 복합제형에서, 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서의 페놀:메타-크레졸의 비율은 1:1 초과, 1.1:1 초과, 1.2:1 초과, 1.3:1 초과, 1.4:1 초과, 1.5:1 초과, 1.6:1 초과, 1.7:1 초과, 1.8:1 초과, 1.9:1 초과, 2:1 초과, 2.1:1 초과, 2.2:1 초과, 2.3:1 초과, 2.4:1 초과, 2.5:1 초과, 2.6:1 초과, 2.7:1 초과, 2.8:1 초과, 2.9:1 초과, 3:1 초과 또는 그 이상, 또는 약 1:1, 약 1.1:1, 약 1.2:1, 약 1.3:1, 약 1.4:1, 약 1.5:1, 약 1.6:1, 약 1.7:1, 약 1.8:1, 약 1.9:1, 약 2:1, 약 2.1:1, 약 2.2:1, 약 2.3:1, 약 2.4:1, 약 2.5:1, 약 2.6:1, 약 2.7:1, 약 2.8:1,약 2.9:1, 약 3:1 또는 그 이상이다.

일부 예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 0.1% 내지 0.25% 또는 약 0.1% 내지 약 0.25%의 페놀, 및 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 m-크레졸, 예를 들어 0.10% 내지 0.2% 또는 약 0.10% 내지 약 0.2%의 페놀, 및 0.06% 내지 0.18% 또는 약 0.06% 내지 약 0.18%의 m-크레졸, 또는 0.1% 내지 0.15% 또는 약 0.1% 내지 약 0.15%의 페놀, 및 0.08% 내지 0.15% 또는 약 0.08% 내지 약 0.15%의 m-크레졸을 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.15% 또는 약 0.15%의 m-크레졸; 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸; 0.15% 또는 약 0.15%의 페놀 및 0.175% 또는 약 0.175%의 m-크레졸; 또는 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸을 함유한다.

d. NaCl

본원에서 제공된 인슐린 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형의 예는 안정화제로서 NaCl를 함유할 수 있다. 안정화제로서 NaCl를 함유하는, 본원에서 제공된 복합제형에서, 상기 복합제형은 50mM 내지 200mM 또는 약 50mM 내지 약 200mM의 NaCl 농도, 예를 들어, 80mM 내지 140mM, 80mM 내지 120mM, 80mM 내지 100mM, 100mM 내지 140mM 또는 120mM 내지 140mM 또는 약 80mM 내지 약 140mM, 약 80mM 내지 약 120mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 100mM 내지 약 140mM 또는 약 120mM 내지 약 140mM의 NaCl 농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서는 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM, 약 100mM, 약 105mM, 약 110mM, 약 115mM, 약 120mM, 약 125mM, 약 130mM, 약 135mM, 약 140M, 약 150mM, 약 160mM, 약 170mM, 약 180mM, 약 190mM 또는 약 200mM, 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM, 또는 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM의 NaCl를 함유하는 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 제공된다.

더 나아가, 본원에서는 인슐린이 일반적으로 히알루로난 분해 효소의 활성이 최적인 높은 NaCl 농도 및 낮은 pH 조건에서 충분히 가용성이 아닐지라도 인슐린의 가용성은 승온의 가속화 조건 하에서 NaCl에 의해 영향을 덜 받는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 CSII 요법에 대해 사용된 조건과 같은 가속화 조건(예를 들어, 승온 또는 교반) 하에서 안정한 복합제형은 일반적으로 32℃ 미만의 온도 하에서 안정한 제형 보다 더욱 높은 농도의 NaCl을 함유한다.

또한 본원에서 제공된 복합제형에서, 상기 복합제형에서의 특정 pH는 NaCl 농도의 함수일 수 있으며 그 반대일 수도 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 7.2 또는 약 7.2의 pH, 예를 들어 7.2±0.2 이상의 pH를 갖는 복합제형에서, 상기 복합제형은 일반적으로 100mM 내지 140mM 또는 약 100mM 내지 약 140mM의 농도의 염을 함유한다. 7.3 또는 약 7.3의 pH, 예를 들어 7.3±0.2 이하의 pH를 갖는 복합제형에서, 상기 복합제형은 일반적으로 50 내지 100mM 또는 약 50 내지 약 100mM의 NaCl의 염 농도를 함유한다.

또한 본원에서 실시예에 기재된 바와 같이, 인슐린 및 인슐린 유사체는 각각 상기 제형 중의 NaCl 및 pH의 수준에 의해 영향을 받는 상이한 가용성 요건들을 갖는다. 일반적으로, 인슐린 및 인슐린 가용성은 높은 pH 및 낮은 염을 선호한다. 예를 들어, 레귤러 인슐린은 80mM 초과의 높은 NaCl 농도 및 7.0의 낮은 pH에서 1주 이내에 침전물을 형성한다. 그러나 레귤러 인슐린은 80mM 이하의 NaCl 농도 및 7.6의 높은 pH에서 15개월 초과 동안 시험한 임의의 시간에 걸쳐 침전물을 형성하지 않는다. 유사하게, 인슐린 유사체 리스프로 및 아스파르트는 80mM 초과의 염 농도 및 7.2 또는 7.0의 낮은 pH에서 침전물이 일반적으로 형성되는 상태에서 가용성에 대한 염 및 pH 의존성 효과를 나타낸다. 대조적으로, 80mM 이하의 낮은 염 농도 및 7.4 또는 7.6의 높은 pH에서, 상기 인슐린은 시간이 지남에 따라 더욱 높은 안정성을 나타내지만 침전은 거의 일어나지 않는다. 인슐린 글루리신은 가용성이 가장 높다. 따라서 가용성이 가장 낮은 인슐린은 가용성이 가장 높은 인슐린보다 염에 대해 더욱 낮은 내성을 갖는다. 따라서 상이한 인슐린의 상이한 겉보기 용해도로 인해, 본원에서 제공된 제형에 대한 염 농도는, 인슐린의 가용성이 염에 대한 내성에 직접적인 연관성이 있기 때문에 상기 제형 중의 인슐린의 유형에 의해 결정될 것이다.

본원에서의 설명을 고려하여 NaCl 농도, 특정 인슐린, 및 특정 제형의 원하는 안정성 매개 변수의 함수로서 본원에서 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 가용성 및 안정성을 실험적으로 평가하는 것은 당해 기술분야의 숙련자의 범주 이내에 있다.

e. pH

본원에서는 인슐린 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 제공되며, 여기서 상기 안정한 복합제형은 6.5 내지 8.0 또는 약 6.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.8 또는 6.8 내지 7.8 또는 약 6.5 내지 약 7.8 또는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH, 예를 들어 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.6 또는 약 6.5 내지 약 7.5 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH를 갖는다. pH에 대한 언급은 실온에서의 pH의 측정에 기반을 두고 있다. 보관 도중에 시간이 지남에 따라 pH가 변할 수 있지만, 일반적으로 pH 6.5와 8.0 사이 또는 pH 약 6.5와 약 8.0 사이, 예를 들어 6.8과 7.8 사이 또는 약 6.8과 약 7.8 사이로 존재할 것으로 이해된다. 예를 들어, pH는 ±0.1, ±0.2, ±0.3, ±0.4, ±0.5, ±0.6, ±0.7, ±0.8, ±0.9, ±1.0, ±1.2, ±1.3, ±1.4, ±1.5 또는 그 이상 정도로 다양할 수 있다. 따라서 pH 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4 또는 약 7.6 또는 적어도 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.6의 pH를 갖는 복합제형에 대한 언급은 상기 복합제형이 제조되는 경우 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2 또는 7.6±0.2, 약 7.0±0.2, 약 7.1±0.2, 약 7.2±0.2, 약 7.3±0.2, 약 7.4±0.2, 약 7.5±0.2 또는 약 7.6±0.2, 또는 적어도 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2, 7.5±0.2 또는 7.6±0.2의 pH를 갖는 복합제형을 들 수 있는 것으로 이해된다.

염 및 pH 모두가 인슐린의 가용성 및 히알루로난 분해 효소의 활성에 영향을 미치는 상반되는 매개 변수이기 때문에, 상기 복합제형에 이들을 포함시키는 것이 결과적으로 균형이 맞게 된다. 따라서 예를 들어, 일반적으로 본원에서 제공된 제형에서 염 농도가 낮으면 낮을수록 pH는 더욱 높아진다. 본원에서 제공된 복합제형의 다른 예에서, 염 농도가 높으면 높을수록 pH는 더욱 낮아진다. 본원에서 기재된 바와 같이 원하는 안정성을 달성하고 히알루로난 분해 효소의 활성 및 인슐린의 가용성을 유지하기 위해 복합제형에서 pH 및 염 요건들을 실험적으로 시험하는 것은 당해 기술분야의 숙련자의 범주 내에 있다. 예를 들어, 최적의 pH 및 염 요건들은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되고 본원에서 예시된 제형 기법들에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 최적의 pH 및 염 농도는, 예를 들어 섹션 H.2에 기재된 바와 같이, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법들을 이용하여 서로 상이한 pH 또는 염의 조건 하에 히알루로난 분해 효소의 활성 또는 회복, 및 인슐린의 가용성, 응집 또는 회복을 평가함으로써 결정될 수 있다.

예를 들어, 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 인슐린이 일반적으로 히알루로난 분해 효소의 활성이 최적인 높은 염 농도 및 낮은 pH 조건에서 충분히 가용성이 아닐지라도 인슐린의 가용성은 승온의 가속화 조건 하에서 낮은 pH 상태에 의해 영향을 덜 받는 것으로 본원에서 밝혀져 있다. 따라서 CSII 요법용으로 사용된 조건과 같은 가속화 조건(예를 들어, 승온 또는 교반) 하에서 안정한 복합제형은 일반적으로 32℃ 미만의 온도에서 안정한 제형보다 더욱 낮은 pH를 갖는다.

필요한 경우, pH는 상기 pH를 낮추기 위한 산성화제, 또는 상기 pH를 증가시키기 위한 알칼리화제를 이용하여 조절될 수 있다. 예시적인 산성화제로는 아세트산, 시트르산, 황산, 염산, 모노베이직 소듐 포스페이트 용액 및 인산을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알칼리화제로는 다이베이직 소듐 포스페이트 용액, 탄산나트륨 또는 수산화나트륨을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

f. 완충액

임의의 완충액은 상기 복합제형의 안정성에 악영향을 미치지 않고 요구되는 필요한 pH 범위를 뒷받침하는 한, 이는 본원에서 제공된 복합제형에서 사용될 수 있다. 특히 적합한 완충액들의 예로는 트리스, 숙시네이트, 아세테이트, 포스페이트 완충액들, 시트레이트, 아코니데이트, 말레이트 및 카르보네이트를 들 수 있다. 그러나 당해 기술분야의 숙련자라면, 특정 완충액이 허용 가능한 정도의 pH 안정성, 또는 "완충액 용량"을 표시된 범위 내에서 제공하는 한, 본원에서 제공된 제형이 상기 완충액에 제한되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 완충액은 이의 pK의 약 1 pH 유닛 내의 적절한 완충액 용량을 갖는다(Lachman 등, 1986). 완충액 접합성은 공개된 pK 목록에 기초하여 추정될 수 있거나, 당업계에 널리 공지된 방법들에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 용액의 pH는, 예를 들어 임의의 허용 가능한 산 또는 염기를 이용하여 상술한 바와 같은 범위 내에서 원하는 종말점까지 조정될 수 있다.

본원에서 제공된 복합제형 중에 포함될 수 있는 완충액들로는 트리스(트로메타민), 히스티딘, 다이베이직 소듐 포스페이트와 같은 포스페이트 완충액들, 및 시트레이트 완충액들을 들 수 있지만,이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 상기 완충제는 본원에서 상기 복합제형을 pH 범위를 6.5와 8.0 사이, 또는 약 6.5와 약 8.0 사이, 예를 들어 6.8과 7.8 사이 또는 약 6.8과 약 7.8 사이, 예를 들어 7.0과 7.6 사이 또는 약 7.0과 약 7.6 사이로 유지하기 위한 양으로 존재한다. 이러한 완충제들은 상기 제형에 1mM 내지 100mM 또는 약 1mM 내지 약 100mM의 농도, 예를 들어 10mM 내지 50mM 또는 20mM 내지 40mM의 농도, 예를 들어 30mM 또는 약 30mM의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 완충제들은 상기 복합제형에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM 또는 그 이상의 농도, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM, 약 10mM, 약 11mM, 약 12mM, 약 13mM, 약 14mM, 약 15mM, 약 16mM, 약 17mM, 약 18mM, 약 19mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM 또는 그 이상의 농도, 또는 적어도 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다.

본원에서 복합제형 중의 완충액들의 예시적인 예로는 포스페이트 완충액들과 같은 금속-결합 완충액들에 비해 인슐린 침전을 감소시키는 트리스와 같은 비금속 결합 완충액들이 있다. 본원에서 제공된 복합제형 중에 완충액으로서 트리스의 포함은 부가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 트리스로 완충된 용액의 pH는 용액이 유지되는 온도에 의해 영향을 받는다. 따라서 상기 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 pH 7.3에서 실온에서 제조되는 겨우, 냉장 시에 pH는 약 pH 7.6까지 증가한다. 이러한 pH는 만약 그렇지 않으면 인슐린이 불용성이 되기 쉬운 온도에서 인슐린 가용성을 증진시킨다. 반대로, 증가한 온도에서 상기 제형의 pH는 약 pH 7.1까지 감소하며, 이러한 pH는 다르게는 효소가 불안정하게 될 가능성이 있는 온도에서 히알루로난 분해 효소의 안정성을 증진시킨다. 따라서 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 가용성 및 안정성은 상기 복합제형이 완충액으로서 트리스를 함유하는 경우에 기타 완충액들과 비교해서 최대화된다. 더 나아가. 트리스는 양이온이기 때문에 상기 용액에 반대 이온으로서 NaCl의 첨가는 불필요하다. 이는 또한 높은 농도의 NaCl이 인슐린의 가용성에 불리하기 때문에 복합제형의 전체 안정성에는 유리하다.

예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형에는 트리스가 0mM 내지 50mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM의 농도로 포함된다. 특정 예에서, 상기 복합제형은 20mM 내지 30mM 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 트리스, 예를 들어 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM 또는 30mM 또는 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 26mM, 약 27mM, 약 28mM, 약 29mM 또는 약 30mM의 트리스를 함유한다. 특정 예에서, 본원에서 제공된 복합제형은 트리스를 30mM 또는 약 30mM의 농도로 함유한다.

g. Lys-Lys

본원에 기재된 예에서, 상기 복합제형은 상기 제형에서 히알루로난 분해 효소를 안정화시키기에 충분한 양으로 2가 양이온, 및 특히 리실-리신(디리신; Lys-Lys), 또는 이의 염, 유도체, 유사체 또는 모방체를 함유한다. 예를 들어, 상기 2가 양이온인 Lys-Lys는 MgCl₂보다 인슐린 가용성에 대해 낮은 효과를 나타낸다. Lys-Lys는 위에서 논의된 바와 같이 적절한 pH에서 보존제들 및 기타 안정화제들과 조합되는 경우에 안정한 복합제형을 초래하여, 히알루로난 분해 활성이 유지되고 인슐린 가용성에 대한 효과도 본원에서 상술한 바와 같이 최소화되는 양으로 제공된다.

예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형에는 Lys-Lys가 50mM 내지 120mM 또는 약 50mM 내지 약 120mM의 양, 예를 들어 50 내지 80mM, 80 내지 100mM 또는 100 내지 120mM, 또는 약 50 내지 약 80mM, 약 80 내지 약 100mM 또는 약 100 내지 약 120mM의 양으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형 중에는 Lys-Lys가 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 또는 120mM, 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 110mM 또는 약 120mM, 또는 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 또는 120mM의 양으로 포함될 수 있다.

일반적으로, Lys-Lys의 농도가 높으면 높을수록 PH20 및 인슐린 또는 인슐린 유사체를 함유하는 복합제형의 안정성은 더욱 양호해진다. 그러나 상기 제형 중의 Lys-Lys의 특정 양은 특정 인슐린의 함수일 수 있다. 예를 들어, 복합제형에서 유사한 안정성을 달성하기 위해, 상기 인슐린 유사체 글루리신은 최소량의 Lys-Lys(예를 들어, 50 내지 105mM)를 요구하며, 그 다음으로 인슐린 유사체 아스파르트 및 리스프로(예를 들어, 80 내지 100mM)이며, 레귤러 인슐린이 최고의 양(예를 들어, 100 내지 120mM)을 요구한다. 본원에서의 설명을 고려하여 Lys-Lys 농도, 특정 인슐린, 및 특정 제형의 원하는 안정성 매개 변수의 함수로서 본원에서 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 가용성 및 안정성을 실험적으로 평가하는 것은 당해 기술분야의 숙련자의 범주 이내에 있다.

일 예에서, 레귤러 인슐린을 함유하는 복합제형은 일반적으로 100 내지 120mM의 Lys-Lys, 예를 들어 적어도 100mM, 105mM, 110mM, 115mM 또는 120mM, 적어도 약 100mM, 105mM, 110mM, 115mM 또는 120mM, 또는 100mM, 105mM, 110mM, 115mM 또는 120mM의 Lys-Lys를 함유한다. 다른 예에서, 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로를 함유하는 복합제형은 80 내지 120mM의 Lys-Lys, 예를 들어 적어도 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM, 적어도 약 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM, 또는 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM의 Lys-Lys를 함유한다. 또 다른 예에서, 인슐린 글루리신을 함유하는 복합제형은 50 내지 105mM의 Lys-Lys, 예를 들어 적어도 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM 또는 105mM, 적어도 약 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM 또는 105mM, 또는 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM 또는 105mM의 Lys-Lys를 함유한다.

일반적으로, 본원에서 복합제형이 Lys-Lys를 함유하는 예에서, 안정화제로서 NaCl의 첨가는 구성요소들의 안정성을 유지하기 위해 필요하지 않다. 어떤 경우에, 등장화제들은 장성(tonicity)의 이유로 요구된다. 예를 들어, 복합제형 중의 Lys-Lys의 양은 50mM/㎖ 미만이고, 등장화제가 요구될 수 있다. 등장화제가 상기 복합제형에 포함되어야 하는지의 여부를 결정하는 것을 당해 기술분야의 숙련자의 범주 내에 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 예시적인 등장화제들로는 글리세린, NaCl, 아미노산들, 폴리알코올류, 트레할로오스, 및 기타 염류 및/또는 당류를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서 일부 예에서, Lys-Lys를 함유하는 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 또한 선택적으로 NaCl을 함유할 수 있다. NaCl은 일반적으로 140mM 미만, 및 일반적으로는 100mM 미만, 90mM 미만, 80mM 미만, 70mM 미만, 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만, 10mM 미만 또는 그 이하이다. 등장화제의 특정의 양은 효소 활성 및/또는 장성을 유지하기 위해 실험적으로 결정될 수 있다.

h. 추가의 예시적인 부형제 또는 안정화제

본원에서 제공된 복합제형은 선택적으로 적절한 pH에서 보존제들, 염 및 안정화제들과 조합되는 경우에 위에서 논의된 바와 같이 안정한 복합제형을 초래하는 기타 구성요소들을 함유할 수 있다. 기타 구성요소들로는, 예를 들어 하나 이상의 등장화제들, 하나 이상의 항산화제들, 아연 또는 기타 안정화제를 들 수 있다.

예를 들어, 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정성은 상기 복합제형이 낮은 함량의 NaCl, 높은 pH 및 보존제들의 존재를 함유하고 승온(예를 들어, 20℃ 내지 30℃ 또는 그 이상의 온도)에서 보관되는 경우에 크게 감소한다. 유사하게, 인슐린 안정성은 또한 이들 및 기타 매개 변수에 의해 영향을 받을 수도 있다. 이러한 불안정성은 하나 이상의 안정화제의 첨가에 의해 어느 정도 방지할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공된 제형은 안정화제 또는 안정화제들을 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 히알루로난 분해 효소 활성의 초기 활성(예를 들어, 375U/㎖)의 적어도 50%가 유지되는 양을 함유한다.

본원에서 제공된 제형에 함유될 수 있는 안정화제들의 유형 중에는 아미노산들, 아미노산 유도체들, 아민류, 당류, 폴리올류, 염류 및 완충액들, 계면활성제들, 및 기타 약제들이 포함되어 있다. 본원에서 제공된 복합제형은 적어도 하나의 안정화제를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 안정화제들을 함유한다. 따라서 임의의 하나 이상의 아미노산들, 아미노산 유도체들, 아민류, 당류, 폴리올류, 염류 및 완충액들, 계면활성제들, 및 기타 약제들이 본원에서 제공된 복합제형에 포함될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공된 복합제형은 적어도 계면활성제 및 적절한 완충액을 함유한다. 선택적으로, 본원에서 제공된 복합제형은 기타 부가적인 안정화제들을 함유할 수 있다.

예시적인 아미노산 안정화제들, 아미노산 유도체들 또는 아민류로는 L-아르기닌, 글루타민, 글리신, 리신, 메티오닌, 프롤린, Lys-Lys, Gly-Gly, 트리메틸아민 옥사이드(TMAO) 또는 베타인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당류 및 폴리올류의 예시적인 예로는 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 수크로스 또는 트레할로오스를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 염류 및 완충액들의 예시적인 예로는 염화마그네슘, 황산나트륨, 트리스(100mM)와 같은 트리스, 또는 벤조산나트륨을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 계면활성제들로는 폴록사머 188(예를 들어, Pluronic^® F68), 폴리소르베이트 80(PS80), 또는 폴리소르베이트 20(PS20)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 보존제들로는 히알루론산(HA), 인간 혈청 알부민(HSA), 페닐 부티르산, 타우로콜린산, 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 또는 아연을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

i. 계면활성제

일부 예에서, 본원에서 제공된 안정한 제형은 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 이러한 계면활성제들은 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 응집을 억제하고, 흡수 손실을 최소화한다. 상기 계면활성제들은 일반적으로 비이온성 계면활성제들이다. 본원에서 상기 제형에 포함될 수 있는 계면활성제들로는 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 다가 알코올류의 부분 및 지방산 에스테르류 및 에테르류, 폴록사머류 및 폴리소르베이트류를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 복합제형 중의 예시적인 계면활성제들로는 폴록사머 188(PLURONIC^® F68과 같은 PLURONICS^®), TETRONICS^®, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, PEG 400, PEG 3000, 트윈^®(예를 들어, 트윈^® 20 또는 트윈^® 80), 트리톤^® X-100, SPAN^®, MYRJ^®, BRIJ^®, CREMOPHOR^®, 폴리프로필렌 글리콜류 또는 폴리에틸렌글리콜류 중 임의의 하나 이상을 들 수 있다. 일부 예에서, 본원에서의 상기 복합제형은 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20, 및 폴리소르베이트 80, 및 일반적으로 폴록사머 188(pluronic F68)을 함유한다. 본원에서 제공된 복합제형은 일반적으로 적어도 하나의 계면활성제, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개 계면활성제를 함유한다.

본원에서 제공된 복합제형에서, 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 상기 제형 중의 하나 이상의 계면활성제의 총량은, 예를 들어 0.0005%와 1.0% 사이 또는 약 0.0005%와 약 1.0% 사이, 예를 들어 0.0005%와 0.005% 사이, 0.001%와 0.01% 사이 또는 0.01%와 0.5% 사이, 또는 약 0.0005%와 약 0.005% 사이, 약 0.001%와 약 0.01% 사이 또는 약 0.01%와 약 0.5% 사이, 예를 들어 0.01%와 0.1% 사이 또는 0.01%와 0.02% 사이 또는 약 0.01%와 약 0.1% 사이 또는 약 0.01%와 약 0.02% 사이일 수 있다. 일반적으로, 상기 복합제형은 적어도 0.0005%, 0.005%, 0.05% 또는 0.01%의 계면활성제를 함유하고, 1.0% 미만, 예를 들어 0.5% 미만 또는 0.1% 미만의 계면활성제를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 0.0005%, 0.0001%, 0.005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08% 또는 0.09%의 계면활성제, 또는 약 0.0005%, 약 0.0001%, 약 0.005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.015%, 약 0.02%, 약 0.025%, 약 0.03%, 약 0.035%, 약 0.04%, 약 0.045%, 약 0.05%, 약 0.055%, 약 0.06%, 약 0.065%, 약 0.07%, 약 0.08% 또는 약 0.09%의 계면활성제를 함유할 수 있다. 특정 예에서, 본원에서 제공된 복합제형은 0.01% 내지 0.05%의 계면활성제를 함유하거나, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 함유한다.

본원에서 예에서 나타낸 바와 같이, 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20)의 안정성 및 효소 활성은 일반적으로 상이한 계면활성제들 간에서 영향을 받지 않거나 계면활성제의 농도에 의해 영향을 받지 않는다. 그럼에도 불구하고, 상기 효소의 산화는 계면활성제의 수준이 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀져 있다. 또한 상기 계면활성제인 폴록사머 188은 폴리소르베이트류보다 산화를 덜 야기한다. 따라서 본원에서의 상기 공제형은 일반적으로 폴록사머 188을 함유한다. 따라서 계면활성제들이 히알루로난 분해 효소를 안정화시킬 수 있을지라도, 본원에서 제공된 복합제형 중의 계면활성제들의 포함은 높은 농도에서 히알루로난 분해 효소의 산화를 초래할 수 있다. 따라서 일반적으로 계면활성제의 더욱 낮은 농도가, 예를 들어 1.0% 미만, 및 일반적으로는 0.0005%와 0.1% 사이 또는 약 0.0005%와 약 0.1% 사이, 예를 들어 0.01%와 0.05% 사이 또는 약 0.01%와 약 0.05% 사이의 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 본원에서 복합제형에서 사용된다. 본원에서 하기에 제공된 바와 같이, 선택적으로 항산화제가 또한 산화를 감소시키거나 방지하기 위해 상기 제형에 포함될 수 있다.

본원에서 제공된 예시적인 복합제형은 폴록사머 188을 함유한다. 폴록사머 188은 더욱 높은 임계 미셀 농도(critical micelle concentration; cmc)를 갖는다. 따라서 폴록사머 188의 사용은 상기 제형에서 미셀의 형성을 감소시킬 수 있으며, 이는 이어 보존제들의 유효성을 감소시킬 수 있다. 따라서 본원에서 제공된 복합제형 중에는 0.01% 또는 0.05%의 폴록사머 188을 함유하거나, 약 0.01% 또는 약 0.05%의 폴록사머 188을 함유하는 것들이 있다.

기타 예에서, 본원에서 제공된 예시적인 복합제형은 폴리소르베이트 20을 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 예시적인 복합제형은 0.0005% 내지 0.1%, 예를 들어 0.0005% 내지 0.01%의 폴리소르베이트 20, 예를 들어 적어도 0.001%, 약 0.001% 또는 0.001%의 폴리소르베이트 20를 함유한다.

ii. 등장화제

예를 들어, 등장화제는 원하는 삼투성을 갖는 용액을 제조하기 위해 본원에서 제공된 제형에 포함되어 있다. 본원에서 제공된 복합제형은 245mOsm/㎏ 내지 305mOsm/㎏ 또는 약 245mOsm/㎏ 내지 약 305mOsm/㎏의 삼투성을 갖는다. 예를 들어, 상기 삼투성은 245mOsm/㎏, 250mOsm/㎏, 255mOsm/㎏, 260mOsm/㎏, 265mOsm/㎏, 270mOsm/㎏, 275mOsm/㎏, 280mOsm/㎏, 285mOsm/㎏, 290mOsm/㎏, 295mOsm/㎏, 300mOsm/㎏ 또는 305mOsm/㎏이거나, 약 245mOsm/㎏, 약 250mOsm/㎏, 약 255mOsm/㎏, 약 260mOsm/㎏, 약 265mOsm/㎏, 약 270mOsm/㎏, 약 275mOsm/㎏, 약 280mOsm/㎏, 약 285mOsm/㎏, 약 290mOsm/㎏, 약 295mOsm/㎏, 약 300mOsm/㎏ 또는 약 305mOsm/㎏이다. 일부 예에서, 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 275mOsm/㎏ 또는 약 275mOsm/㎏의 삼투성을 갖는다.

등장화제들은 글리세린, NaCl, 아미노산들, 폴리알코올류, 트레할로오스, 및 기타 염류 및/또는 당류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형에는 NaCl이 0mM 내지 200mM 또는 약 0mM 내지 약 200mM의 농도, 예를 들어 일반적으로 30mM 내지 100mM, 50mM 내지 160mM의 농도, 예를 들어 50mM 내지 120mM 또는 80mM 내지 140mM, 또는 50mM 내지 200mM의 농도로 포함될 수 있다. 일반적으로, 등장화제로서 사용되는 경우, 예를 들어 Lys-Lys를 함유하는 복합제형 중에서 NaCl은 140mM 미만의 농도, 및 일반적으로는 130mM 미만, 120mM 미만, 110mM 미만, 100mM 미만, 90mM 미만, 80mM 미만, 70mM 미만, 60mM 미만, 50mM 미만, 40mM 미만, 30mM 미만, 20mM 미만, 10mM 미만 또는 그 이하의 농도로 제공된다. 상기 특정한 양은 효소 활성, 인슐린 가용성 및/또는 장성을 유지하기 위해 실험적으로 결정될 수 있다.

iii. 글리세린

기타 예에서, 글리세린(글리세롤)이 복합제형에 포함된다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 일반적으로 글리세린을 60mM 미만, 예를 들어 55mM 미만, 50mM 미만, 45mM 미만, 40mM 미만, 35mM 미만, 30mM 미만, 25mM 미만, 20mM 미만, 15mM 미만 또는 10mM 이하로 함유한다. 글리세린의 양은 일반적으로 존재하는 NaCl의 양에 의해 결정되지만, 복합제형 중에 NaCl이 많으면 많을수록 원하는 삼투압을 달성하기 위해 더욱 적은 글리세린이 요구된다. 따라서 예를 들어, 더욱 높은 겉보기 용해도를 갖는 인슐린(예를 들어, 인슐린 글루리신)과 함께 제형화된 것과 같은 더욱 높은 농도의 NaCl을 함유하는 복합제형에서, 상기 제형에는 글리세린의 거의 포함될 필요가 없다. 대조적으로, 더욱 낮은 겉보기 용해도를 갖는 인슐린(예를 들어, 인슐린 아스파르트)과 함께 제형화된 것과 같은 다소 낮은 농도의 NaCl을 함유하는 복합제형에서는 글리세린이 포함될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 아스파르트를 함유하는 본원에서 제공된 복합제형은 글리세린을 50mM 미만의 농도, 예를 들어 20mM 내지 50mM의 농도, 예를 들어 50mM 정도 또는 약 50mM의 농도로 함유한다. 가장 낮은 겉보기 용해도를 갖는 인슐린(예를 들어, 인슐린 리스프로 또는 레귤러 인슐린)과 함께 제형화된 것과 같은 더욱 더 낮은 농도의 NaCl을 함유하는 복합제형에서, 글리세린은, 예를 들어 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 약 60mM의 농도로 포함된다.

iv 항산화제

본원에서 제공된 복합제형은 또한 산화, 특히 히알루로난 분해 효소의 산화를 줄이거나 방지하기 위해 항산화제들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서의 예에서는 산화가 높은 농도의 계면활성제 또는 히알루로난 올리고머들에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 나타난다. 예시적인 항산화제들로는 시스테인, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 상기 항산화제는 메티오닌이다. 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소를 함유하는 본원에서 제공된 제형은 항산화제를 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20m의 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌은 본원에서 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 5mM 내지 40mM, 5mM 내지 20mM 또는 10mM 내지 20mM의 농도로 상기 제형에 제공될 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 예를 들어 메티오닌은 5mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM의 농도, 또는 약 5mM, 약 10mM, 약 11mM, 약 12mM, 약 13mM, 약 14mM, 약 15mM, 약 16mM, 약 17mM, 약 18mM, 약 19mM, 약 20mM, 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 26mM, 약 27mM, 약 28mM, 약 29mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM 또는 약 50mM의 농도로 포함될 수 있다. 일부 예에서, 상기 복합제형은 10mM 내지 20mM의 메티오닌, 예를 들어 10mM 또는 20mM, 또는 약 10mM 또는 약 20mM의 메티오닌을 함유한다.

v. 아연

어떤 경우, 아연은 인슐린 육량체를 위한 안정화제로서 복합제형에 포함되어 있다. 예를 들어, 레귤러 인슐린, 인슐린 리스프로 또는 인슐린 아스파르트를 함유하는 제형은 일반적으로 아연을 함유하는 반면, 인슐린 글루리신을 함유하는 제형은 아연을 함유하지 않는다. 예를 들어 아연 옥사이드, 아연 아세테이트 또는 아연 클로라이드로서 아연이 제공될 수 있다. 본원에서 제공된 조성물에는 아연이 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.001 내지 0.1㎎ 또는 약 0.001 내지 약 0.1㎎의 양, 100U 당 0.001 내지 0.05㎎ 또는 약 0.001 내지 약 0.05㎎의 양, 또는 100U 당 0.01 내지 0.5㎎ 또는 0.01 내지 0.5㎎의 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 아연을 인슐린 100 유닛(㎎/100U) 당 0.002 밀리그램(㎎), 0.005㎎/100U, 0.01㎎/100U, 0.012㎎/100U, 0.014㎎/100U, 0.016㎎/100U, 0.017㎎/100U, 0.018㎎/100U, 0.02㎎/100U, 0.022㎎/100U, 0.024㎎/100U, 0.026㎎/100U, 0.028㎎/100U, 0.03㎎/100U, 0.04㎎/100U, 0.05㎎/100U, 0.06㎎/100U, 0.07㎎/100U, 0.08㎎/100U 또는 0.1㎎/100U의 양, 또는 약 0.002㎎/100U, 약 0.005㎎/100U, 약 0.01㎎/100U, 약 0.012㎎/100U, 약 0.014㎎/100U, 약 0.016㎎/100U, 약 0.017㎎/100U, 약 0.018㎎/100U, 약 0.02㎎/100U, 약 0.022㎎/100U, 약 0.024㎎/100U, 약 0.026㎎/100U, 약 0.028㎎/100U, 약 0.03㎎/100U, 약 0.04㎎/100U, 약 0.05㎎/100U, 약 0.06㎎/100U, 약 0.07㎎/100U, 약 0.08㎎/100U 또는 약 0.1㎎/100U의 양으로 함유할 수 있다.

vi. 아미노산 안정제

본원에서 제공된 복합제형은 또한 상기 제제의 안정성에 기여하는 아미노산 안정화제를 함유할 수 있다. 상기 안정화제는 비극성 및 염기성 아미노산일 수 있다. 예시적인 비극성 및 염기성 아미노산들로는 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 아미노산 안정화제는 글리신 또는 프롤린, 일반적으로는 글리신이다. 상기 안정화제는 단일 아미노산일 수 있거나, 이는 2개 이상의 이러한 아미노산의 조합일 수 있다. 상기 아미노산 안정화제들은 천연 아미노산, 아미노산 유사체, 변형된 아미노산들 또는 아미노산 등가물일 수 있다. 일반적으로, 상기 아미노산은 L-아미노산이다. 예를 들어, 프롤린인 안정화제로서 사용되는 경우, 이는 일반적으로 L-프롤린이다. 아미노산 등가물, 예를 들어, 프롤린 유사체를 사용하는 것도 또한 가능하다. 상기 복합제형에 포함된 아미노산 안정화제, 예를 들어 글리신의 농도는 0.1 M 내지 1 M의 아미노산 범위, 일반적으로는 0.1M 내지 0.75M, 일반적으로 0.2M 내지 0.5M의 아미노산 범위이며, 예를 들어 적어도 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.75M 또는 그 이상, 또는 적어도 약 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.75M 또는 그 이상이다. 상기 아미노산, 예를 들어 글리신은 염산염, 브롬화수소, 설페이트, 아세테이트 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 아미노산, 예를 들어 글리신의 순도는 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 이상이어야 한다.

vii. 히알루로니다아제 억제제

본원에서 제공된 복합제형의 일부 예에서, 본원에서 상술한 바와 같이 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안의 히알루로난 분해 효소 및 속효성 인슐린의 안정성은 히알루로니다아제 억제제를 포함시킴으로써 증가될 수 있다. 이러한 억제제는 일반적으로 본원에서 히알루로난(HA)으로 관측된 바와 같이 더욱 낮은 온도에서 인슐린이 응집하도록 하기 때문에 2℃ 내지 8℃에서 보관된 제형에는 적합하지 않다. 일부 예에서, 히알루로니다아제 억제제는 2℃ 내지 8℃에 사용하기에 적합하도록 선택될 수 있다.

특히, 히알루로니다아제 억제제들은 페놀성 보존제들의 효과에 대해 히알루로난 분해 효소를 안정화시키기 위해 복합제형에 포함되어 있다. 특정 예에서, 상기 히알루로니다아제 억제제는 연합 방식 및 비공유 결합 방식으로 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소와 반응하는 것이며, 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소와 공유결합성 복합체를 형성하지 않는다. 상기 히알루로니다아제 억제제는 적어도 이의 평형 농도로 제공된다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 다양한 부류의 히알루로니다아제 억제제들에 대해 잘 알고 있다(예를 들어 Girish 등, (2009) Current Medicinal Chemistry, 16: 2261-2288, 및 본원에서 인용된 인용문헌 참조). 당해 기술분야의 숙련자라면, 본원에서 반응 또는 안정한 조성물에서 히알루로니다아제 억제제의 평형 농도를 알고 있거나, 상기 평형 농도를 당업계의 표준 방법으로 결정할 수 있다. 히알루로니다아제 억제제의 선택은 상기 조성물에 사용된 특정 히알루로난 분해 효소에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 히알루로난은 히알루로난 분해 효소가 PH20인 경우에 본원에서 안정한 조성물들에 사용하기 위한 예시적인 히알루로니다아제 억제제이다.

본원에서 안정화제로 사용하기 위한 예시적인 히알루로니다아제 억제제들로는 단백질, 글리코사미노글리칸(GAG), 다당류, 지방산, 라노스타노이드류, 항생제, 항선충제, 합성 유기 화합물들, 또는 식물 유래 생물활성 구성요소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 히알루로니다아제 식물 유래 생물활성 구성요소는 알칼로이드, 항산화제, 폴리페놀, 플라보노이드류, 테르페노이드류 및 항염증성 약물들일 수 있다. 예시적인 히알루로니다아제 억제제들로는, 예를 들어 혈청 히알루로니다아제 억제제, 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 당단백질(WSG), 헤파린, 헤파린 설페이트, 데르마탄 설페이트, 키토산, β-(1,4)-갈락토-올리고당, 황산화 베르바스코스(verbascose), 황산화 플란테오스(planteose), 펙틴, 폴리(스티렌-4-설포네이트), 덱스트란 설페이트, 소듐 알기네이트(sodium alginate), 미역(Undaria pinnatifida) 유래 다당류, 만델산 축합 폴리머, 에이코사트리엔 산(eicosatrienoic acid), 네르본 산(nervonic acid), 올레아놀 산(oleanolic acid), 아리스토로크 산(aristolochic acid), 아즈말린(ajmaline), 레서핀(reserpine), 플라본, 데스메톡시센타우레딘(desmethoxycentauredine), 케르세틴(quercetin), 아피게닌(apigenin), 캠프페롤(kaempferol), 실리빈, 루테올린, 루테오린-7-글루코사이드, 프롤레틴(phloretin), 아피인(apiin), 헤스페리딘, 설폰화 헤스페리딘, 칼리코신-7-O-β-D-글루코피라노사이드, 소듐 플라본-7-설페이트, 플라본 7-플루오로-4'-히드록시플라본, 4'-클로로4,6-디메톡시칼콘, 소듐 5-히드록시플라본-7-설페이트, 미리세틴, 루틴, 모린, 글리시리진(glycyrrhizin), 비타민 C, D-이소아스코르브 산, D-사카린 1,4-락톤, L-아스코르빈 산-6-헥사데카노에이트(Vcpal), 6-O-아실화 비타민 C, 카테킨, 노르디히드로구아이아레트 산(nordihydroguaiaretic acid), 커큐민(curcumin), N-프로필 갈레이트, 탄닌 산, 엘라그 산, 갈산, 플로로퓨코퓨로엑콜 A(phlorofucofuroeckol A), 디에콜(dieckol), 8,8'-비에콜, 프로시아니딘(procyanidine), 고시폴, 셀레콕시브, 니메설라이드, 덱사메타손, 인도메스신(indomethcin), 페노프로펜(fenoprofen), 페닐부타존, 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 살리실레이트(salysylates), 디소듐 크로모글리케이트, 소듐 오로싸이오말레이트(aurothiomalate), 트랜실리스트(transilist), 트랙사녹스(traxanox), 이베르멕틴(ivermectin), 린코마이신(lincomycin) 및 스펙티노마이신(spectinomycin), 설파메톡사졸 및 트리머토프림(trimerthoprim), 네오마이신 설페이트, 3α-아세틸폴리포레닉 산 A (acetylpolyporenic acid A), (25S)-(+)-12α히드록시-3α-메틸카복시아세테이트-24-메틸라노스타-8,24(31)-디엔-26-오익 산, 라노스타노이드(lanostanoid), 폴리포레닉 산 c, PS53(히드로퀴논-술폰산-포름알데히드 폴리머), 폴리(스티렌-4-설포네이트)의 폴리머, VERSA-TL 502, 1-테트라데칸 술폰산, 만델산 축합 폴리머(SAMMA), 1,3-디아세틸벤즈이미다졸-2-티온, N-모노아실화 벤즈이미다졸-2-티온, N,N'-디아실화 벤즈이미다졸-2-티온, 알킬-2-페닐인돌 유도체, 3- 프로판오일벤즈옥사졸-2-티온, N-알킬화 인돌 유도체, N-아실화 인돌 유도체, 벤조 티아졸 유도체, N-치환된 인돌-2- 및 3-카복스아미드 유도체, N-치환된 인돌-2- 및 3-카복스아미드 유도체의 할로겐화 유사체(클로로 및 플루오), 2-(4-히드록시페닐)-3-페닐인돌, 인돌 카르복사미드, 인돌 아세트아미드, 3-벤조일-1-메틸-4-페닐-4-피페리디놀, 벤조일 페닐 벤조에이트 유도체, L-아르기닌 유도체, 구아니듐 HCL , L-NAME, HCN, 리나마린(linamarin), 아미그달린, 헤데라게닌, 에스신, CIS-히노키레시놀(CIS-hinokiresinol) 및/또는 1,3-디-p-히드록시페닐-4-펜텐-1-온을 포함한다.

일부 예에서, 히알루로니다아제 억제제인 안정화제는 N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 다당류이다. 다른 예에서, 히알루로니다아제 억제제인 안정화제는 음으로 하전된 당을 갖는 아민 당이다. 또 다른 예에서, 히알루로니다아제 억제제인 안정화제는 아미노메틸 인돌 또는 아스코르브산 유도체이다.

본원에서 제공된 예시적인 복합제형은 히알루로난(히알루론산; HA)인 안정화제를 함유한다. 히알루론산(HA, 히알루로난 및 히알루로네이트로도 공지됨)은 히알루로니다아제, 예를 들어 rHuPH20을 포함하는 PH20과 같은 히알루로난 분해 효소에 대한 천연 기질이다. HA는 결합 조직, 상피조직 및 신경 조직에 걸쳐 광범위하게 분포하고 있는 황산화되지 않은 글리코사미노글리칸이다. 이는 최고 25,000개의 이당류 유닛의 중합체로, 이들 자체는 D-글루쿠론산 및 D-N-아세틸글루코사민으로 구성되어 있다. HA의 분자량은 약 5kDa 내지 약 200,000kDa 범위이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써 rHuPH20(및 기타 히알루로니다아제 및 히알루로난 분해 효소)은 히알루로난의 점도를 낮추며, 그 결과 비경구 투여된 유체의 조직 투과성을 증가시키고 흡수 속도를 증가시킨다.

본원에서 증명된 바와 같이, 히알루론산(HA)은 다르게는 불안정화제들의 존재 하에, 그리고, 예를 들어 낮은 염, 높은 pH, 보존제들의 존재 및 승온과 같은 조건 하에 히알루로난 분해 효소의 유효한 안정화제이다. 특히, HA는 더욱 높은 pH 및/또는 승온이 특히 페놀성 보존제들의 존재 하에 rHuPH20 및 기타 가용성 히알루로니다아제 및 히알루로난 분해 효소에 대해 일반적으로 나타나는 악영향을 감소시키거나 없애는 것으로 나타난다. 예를 들어, 하기에서 기재된 연구(예를 들어, 실시예 10.D 및 실시예 15 참조)에 나타낸 바와 같이, rHuPH20의 안정성은 인슐린을 구비한 복합제형에 HA 올리고머들(4량체 내지 16량체)이 포함되는 경우에 유의하게 증가한다. HA의 농도 증가는 안정화 특성의 증가는 초래한다. 예를 들어, 1㎎/㎖의 HA 및 75mM의 NaCl과 함께 pH 7.1에서 30℃에서 1주 이후에 rHuPH20/인슐린 복합제형 중의 rHuPH20의 활성은 600U/㎖에서 341U/㎖로 감소하였다(즉, 초기 활성의 57%를 유지하였음). HA 농도가 10㎎/㎖까지 증가한 경우, rHuPH20만의 활성이 600U/㎖에서 510U/㎖로 감소하였다(즉, 초기 활성의 85%를 유지하였음).더 나아가 HA는 높은 pH가 rHuPH20에 미치는 불안정화 효과를 감소시키거나 없앤다. 예를 들어, 5.5㎎/㎖의 HA 및 100mM의 NaCl과 함께 pH 7.1에서 30℃에서 1주 이후에 초기 rHuPH20의 68%가 남아있다. 이러한 백분율(%)은 본질적으로 pH가 7.5까지 증가하는 경우에는 변하지 않았다. rHuPH20의 안정성에 대한 HA의 유사한 긍정적인 효과는 승온에서 관측되었다(예를 들어, 실시예 15 참조). 따라서 본원에서는 rHuPH20을 효과적으로 안정화시키기 위해 인슐린 및 rHuPH20(또는 기타 가용성 히알루로니다아제 및 히알루로난 분해 효소)의 제형에는 HA가 포함될 수 있는 것으로 결정된다.

따라서 본원에서는 HA를 함유하는 복합제형이 제공된다. 임의의 크기의 HA가 안정화제로서 조성물들에서 사용될 수 있다. 일부 예에서, HA는 이당류로, D-글루쿠론산 및 D-N-아세틸글루코사민으로 구성되어 있다. 기타 예에서, HA는 2개의 반복되는 이당류 유닛을 함유하는 사당류와 같은 올리고당이거나, 대안적으로, 본원에서 제공된 복합제형에 사용된 HA는 다수의 반복되는 이당류 유닛, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개 또는 그 이상의 반복되는 이당류 유닛을 함유할 수 있다. 기타 예에서, 본원에서 제공된 복합제형에 사용된 HA는 5kDa 내지 5,000kDa 또는 약 5kDa 내지 약 5,000kDa 범위의 분자량; 5kDa 내지 1,000kDa 또는 약 5kDa 내지 약 1,000kDa 범위의 분자량; 5kDa 내지 500kDa 또는 약 5kDa 내지 약 500kDa 범위의 분자량; 또는 5kDa 내지 20kDa 또는 약 5kDa 내지 약 200kDa 범위의 분자량을 갖는다. 본원에서 복합제형에 사용하기 위한 예시적인 HA 올리고당류는 6.4kDa, 74.0kDa 또는 234.4kDa 또는 약 6.4kDa, 약 74.0kDa 또는 약 234.4kDa의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 본원에서 제공된 인슐린 및 히알루로니다아제(예를 들어, rHuPH20)와 같은 히알루로난 분해 효소의 조성물들 중에는 적어도 5kDa, 6kDa, 7kDa, 8kDa, 9kDa, 10kDa, 15kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 120kDa, 140kDa, 160kDa, 180kDa, 200kDa, 220kDa, 240kDa, 260kDa, 280kDa, 300kDa, 350kDa, 400kDa, 450kDa 또는 500kDa의 분자량, 또는 약 5kDa, 약 6kDa, 약 7kDa, 약 8kDa, 약 9kDa, 약 10kDa, 약 15kDa, 약 20kDa, 약 30kDa, 약 40kDa, 약 50kDa, 약 60kDa, 약 70kDa, 약 80kDa, 약 90kDa, 약 100kDa, 약 120kDa, 약 140kDa, 약 160kDa, 약 180kDa, 약 200kDa, 약 220kDa, 약 240kDa, 약 260kDa, 약 280kDa, 약 300kDa, 약 350kDa, 약 400kDa, 약 450kDa 또는 약 500kDa의 분자량을 갖는 HA를 함유하는 것들이 포함되어 있다. 일 예에서, 상기 복합제형 중의 HA의 분자량은 10kDa 미만이다.

따라서 본원에서는 HA 올리고당을 함유하는, 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 제공된다. 상기 복합제형은 1㎎/㎖ 내지 20㎎/㎖의 HA를 함유하며, 예를 들어 적어도 1㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 4㎎/㎖, 5㎎/㎖, 6㎎/㎖, 7㎎/㎖, 8㎎/㎖, 9㎎/㎖, 10㎎/㎖, 11㎎/㎖, 12㎎/㎖, 13㎎/㎖, 14㎎/㎖, 15㎎/㎖, 16㎎/㎖, 17㎎/㎖, 18㎎/㎖, 19㎎/㎖ 또는 20㎎/㎖ 또는 그 이상의 HA, 또는 약 1㎎/㎖, 약 2㎎/㎖, 약 3㎎/㎖, 약 4㎎/㎖, 약 5㎎/㎖, 약 6㎎/㎖, 약 7㎎/㎖, 약 8㎎/㎖, 약 9㎎/㎖, 약 10㎎/㎖, 약 11㎎/㎖, 약 12㎎/㎖, 약 13㎎/㎖, 약 14㎎/㎖, 약 15㎎/㎖, 약 16㎎/㎖, 약 17㎎/㎖, 약 18㎎/㎖, 약 19㎎/㎖ 또는 약 20㎎/㎖ 또는 그 이상의 HA를 함유한다. 예시적인 인슐린 및 rHuPH20의 안정한 복합제형은 약 8㎎/㎖ 또는 약 12㎎/㎖ HA, 예를 들어 10㎎/㎖ 또는 약 10㎎/㎖. 일부 예에서, 히알루로난 분해 효소에 대한 HA의 몰비는 100,000:1, 95,000:1, 90,000:1, 85,000:1, 80,000:1, 75,000:1, 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1, 45,000:1, 40,000:1, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000:1, 15,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1 또는 그 이하이거나, 약 100,000:1, 약 95,000:1, 약 90,000:1, 약 85,000:1, 약 80,000:1, 약 75,000:1, 약 70,000:1, 약 65,000:1, 약 60,000:1, 약 55,000:1, 약 50,000:1, 약 45,000:1, 약 40,000:1, 약 35,000:1, 약 30,000:1, 약 25,000:1, 약 20,000:1, 약 15,000:1, 약 10,000:1, 약 5,000:1, 약 1,000:1, 약 900:1, 약 800:1, 약 700:1, 약 600:1, 약 500:1, 약 400:1, 약 300:1, 약 200:1, 약 100:1 또는 그 이하이다.

viii. 니코틴성 화합물

일부 예에서, 니코틴성 화합물은 안정화제로서 사용된다. 니코틴성 화합물들로는 니코틴아미드, 니코틴산, 니아신, 니아신아미드, 비타민 B3 및/또는 이의 염 및/또는 이의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정한 적용에서, 상기 안정화제는니코틴성 화합물 및 아미노산 또는 아미노산들을 포함할 수 있다(예를 들어 PCT 국제 공개공보 제 WO2010-149772 호 참조). 예를 들어, 상기 아미노산은 아르기닌, 글루탐산 및/또는 이의 염 또는 이의 조합일 수 있다.

ix. 기타 부형제 또는 약제

선택적으로, 안정한 복합제형은 복합제형과 함께 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료학적 유효한 양의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 상기 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체 담체로써 사용될 수 있다.

예를 들어, 비경구 제제들에서 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체로는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 금속이온 봉쇄제 또는 킬레이팅제, 및 기타 약학적으로 허용 가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예로는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로스 및 젖산화 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클로는 면실유, 옥수수 오일, 참기름 및 낙화생유와 같은 식물성 기원의 고정유를 포함한다. 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도 내 항미생물제가 다중 용량 용기 내에 포장된 비경구 제제들에 첨가될 수 있으며, 항미생물제는 페놀류 또는 크레졸류, 수은제, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르류, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 버퍼로는 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제로는 이황산나트륨을 포함한다. 국소 마취제로는 프로카인 염산염을 포함한다. 현탁 및 분산제로는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제로는 폴리소르베이트 80(트윈 80)을 포함한다. 금속이온 봉쇄제 또는 킬레이팅제로는 EDTA를 포함한다. 또한 약학적 담체로는 수혼합성 비히클을 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.

조성물들은 유효 성분과 함께: 락토오스, 수크로스, 인산이칼슘 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 희석제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘 및 활석과 같은 윤활제; 및 전분, 아카시아 고무와 같은 천연고무, 젤라틴, 글루코오스, 당밀, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 포비돈(povidone), 크로스포비돈(crospovidone)류와 같은 결합제 및 당업자에게 공지된 기타 이러한 결합제를 함유할 수 있다.

예를 들어, 임의의 다수의 약학적으로 허용 가능한 단백질들 또는 펩티드들일 수 있는 부형제 단백질이 복합제형에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 상기 부형제 단백질은 면역 반응을 유발하지 않으면서 포유류 대상체에 투여되는 이의 능력을 위해 선택된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민은 약학적 제형에서 사용하기에 매우 적합하다. 기타 공지된 약젝학적 단백질 부형제들로는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 부형제는 보유 용기 또는 바이알에 대한 단백질의 흡착을 방지하기에 충분한 농도로 상기 제형에 포함된다. 상기 부형제의 농도는 부형제의 성질, 및 복합제형 내 단백질의 농도에 따라 다양할 것이다.

원하는 경우, 조성물은 또한 습윤제, 유화제 또는 pH 버퍼, 예를 들어, 아세테이트, 시트르산나트륨, 사이클로덱스트린 유도체들, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 아세트산나트륨, 트리에탄올아민 올리에이트, 및 기타 이러한 약제를 소량으로 포함할 수도 있다.

2. 예시적인 안정한 복합제형

a. 예시적인 다중회 주사(MDI) 복합제형

본원에서는 신속 작용(속효성) 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 제공되며, 상기 안정한 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안 안정하다. MDI 복합제형의 예시적인 예로는 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 15개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월, 60개월 또는 그 이상, 또는 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 15개월, 약 20개월, 약 24개월, 약 30개월, 약 36개월, 약 42개월, 약 48개월, 약 54개월, 약 60개월 또는 그 이상 동안 안정한 복합제형, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 14일, 15일, 20일, 25일, 28일, 30일, 35일, 40일, 45일 또는 50일 또는 그 이상, 또는 약 14일, 약 15일, 약 20일, 약 25일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일 또는 약 50일 또는 그 이상 동안 안정한 복합제형이 있다.

예를 들어, 본원에서 제공된 제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1년, 예를 들어 적어도 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 36개월 또는 그 이상 동안 안정하다. 특히, 본원에서 제공된 제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 24개월 동안 안정하다.

기타 예에서, 본원에서 제공된 제형은 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 1주, 예를 들어 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃의 온도, 또는 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 적어도 1주 동안 안정하다. 예를 들어, 본원에서 제공된 제형은 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 동안 안정하다. 특히, 본원에서 제공된 제형은 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도, 예를 들어 25℃ 또는 30℃ 또는 약 25℃ 또는 약 30℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정하다.

일부 예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 600U/㎖, 약 600U/㎖ 또는 적어도 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 속효성 인슐린; 50mM 내지 200mM 또는 약 50mM 내지 약 200mM 농도의 NaCl; 6.8 내지 7.8 또는 약 6.8 내지 약 7.8, 예를 들어 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH; 6.8 내지 7.8 또는 7.0 내지 7.6, 또는 약 6.8 내지 약 7.8 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH를 유지하는 완충제; 질량 농도(w/v)로서 0.1% 내지 0.4% 보존제인 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물; 및 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 상기 초기 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%, 예를 들어 적어도 375U/㎖ 또는 적어도 약 375U/㎖의 히알루로난 분해 효소 활성이 유지되는 양의 안정화제를 함유한다. 완충제와 관련하여, 상기 복합제형의 pH 범위를 6.8과 7.8 또는 약 6.8과 약 7.8 사이, 예를 들어 7.0과 7.6 또는 약 7.0과 약 7.6 사이 유지하는 양으로 포함될 수 있는 임의의 완충제가 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공된 복합제형에는 트리스가 10mM 내지 50mM 또는 약 10mM 내지 약 50mM의 농도, 예를 들어 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM 또는 50mM의 농도로 포함되어 있다. 특정 예에서, 상기 복합제형은 20mM 내지 30mM 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 트리스, 예를 들어 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM 또는 30mM 또는 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM, 약 25mM, 약 26mM, 약 27mM, 약 28mM, 약 29mM 또는 약 30mM의 트리스를 함유한다. 특정 예에서, 본원에서 제공된 복합제형은 트리스를 30mM 또는 약 30mM의 농도로 함유한다.

예를 들어, 이러한 제형의 예시적인 예는 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 600U/㎖, 약 600U/㎖ 또는 적어도 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 속효성 인슐린; 80mM 내지 140mM 또는 약 80mM 내지 약 140mM 농도의 NaCl; 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH; 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH 범위를 유지하는 완충제; 질량 농도(w/v)로서 0.1% 내지 0.4%의 보존제; 및 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 상기 초기 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%가 유지되고, 예를 들어 적어도 375U/㎖ 또는 적어도 약 375U/㎖의 히알루로난 분해 효소 활성이 유지되는 양의 안정화제를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 1mM 내지 100mM의 완충제(예를 들어, 트리스)를 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 0.01% 내지 0.5%의 계면활성제를 함유한다. 본원에서 제공된 예시적인 복합제형은 또한 60mM 미만의 글리세린(글리세롤) 및 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 항산화제를 함유할 수 있다.

하기 안정한 제형은 단지 예시적이며, 약간의 조절이 이루어질 수 있는 플랫폼을 제공한다. 다양한 부형제들 및 기타 구성요소들의 농도에서 매우 작은 변화(예를 들어, 상기에 언급한 농도의 ±15%) 또는 pH의 작은 변화는 인슐린 가용성 및 안정성 및 히알루로난 분해 효소 안정성을 전부는 아니지만 일부 유지하면서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 추가적인 변화는 또한 부형제를 부가하거나 제거함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 안정화 계면활성제의 유형은 다양할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 예시적인 복합제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 및 특히 적어도 600U/㎖, 적어도 약 600U/㎖ 또는 약 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 속효성 인슐린, 및 특히 적어도 100U/㎖, 적어도 약 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 속효성 인슐린; 10mM 내지 50mM 또는 약 10mM 내지 약 50mM의 트리스(예를 들어, 20mM 내지 40mM 또는 약 20mM 내지 약 40mM, 예를 들어 적어도 20mM, 25mM, 30mM, 35mM 또는 40mM 또는 적어도 약 20mM, 25mM, 30mM, 35mM 또는 약 40mM의 트리스); 80mM 내지 140mM 또는 약 80mM 내지 약140mM의 NaCl(예를 들어, 적어도 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 120mM, 130mM, 140mM, 150mM 또는 160mM 또는 적어도 약 80mM, 90mM, 100mM, 110mM 120mM, 130mM, 140mM, 150mM 또는 160mM의 NaCl); 5mM 내지 50mM 또는 약 5mM 내지 약 50mM의 메티오닌(예를 들어, 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 메티오닌); 0mM 내지 50mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM의 글리세린 (예를 들어, 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 글리세린); 0.01% 내지 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 예를 들어 0.01% 내지 0.05%의 폴록사머 188(예를 들어, 적어도 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05% 또는 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% 또는 0.05%의 폴록사머 188); 0.1% 내지 0.25% 또는 약 0.1% 내지 약 0.25%의 페놀(예를 들어, 적어도 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% 또는 0.17% 또는 적어도 약 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% 또는 0.17%의 페놀); 및 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 m-크레졸(예를 들어, 적어도 0.075%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% 또는 0.17% 또는 적어도 약 0.075%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% 또는 0.17%의 m-크레졸)을 함유한다. 상기 제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH(예를 들어, 적어도 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH 또는 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5 또는 약 7.6의 pH)로 제조된다. 또 다른 예에서, 아연은 0.017㎎/100U, 0.018㎎/100U, 0.02㎎/100U, 0.022㎎/100U 또는 0.024㎎/100U 인슐린 또는 약 0.017㎎/100U, 약 0.018㎎/100U, 약 0.02㎎/100U, 약 0.022㎎/100U 또는 약 0.024㎎/100U 인슐린의 농도로 포함되어 있다.

위에서 논의된 바와 같이, 상기 제형 중의 다양한 구성요소들의 농도는 상기인슐린의 특정 특성에 따라 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 아스파르트와 같이 더욱 높은 겉보기 용해도를 갖는 제형은 일반적으로 인슐린 리스프로와 같이 더욱 낮은 겉보기 용해도의 인슐린의 제형에 비해 더욱 높은 농도의 NaCl 및 더욱 낮은 농도의 글리세린을 함유한다. NaCl 농도에 따라, 상기 제형의 특정 pH는 또한 상이한 인슐린 사이에서 변할 수 있다.

예를 들어, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중에는 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 포함되며, 이때 상기 안정한 복합제형은 50 내지 120mM 또는 약 50 내지 약 120mM, 예를 들어 50mM 내지 100mM, 예를 들어 50mM 내지 90mM 또는 80mM 내지 100mM의 NaCl을 함유한다. 이러한 복합제형으로는 인슐린 유사체 인슐린 리스프로를 함유하는 것들을 들 수 있다. 기타 예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이며, 이때 상기 안정한 복합제형은 80mM 내지 160mM 또는 약 80mM 내지 약 160mM, 예를 들어 100mM 내지 140mM, 예를 들어 120mM의 NaCl을 함유한다. 이러한 복합제형으로는 인슐린 아스파르트를 함유하는 것들을 들 수 있다. 예를 들어, 본원에서는 80mM 또는 100mM의 NaCl을 함유하거나 약 80mM 또는 약 100mM의 NaCl을 함유하는 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로의 복합제형이 제공된다.

다른 예에서, 본원에서 제공된 안정한 복합제형 중에는 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 안정한 복합제형이 포함되며, 이때 상기 안정한 복합제형은 80mM 내지 200mM 또는 약 80mM 내지 약 200mM, 예를 들어 100mM 내지 150mM, 예를 들어 130mM 내지 150mM, 120mM 내지 140mM 또는 110mM 내지 130mM의 NaCl을 함유한다. 이러한 복합제형으로는 인슐린 유사체 글루리신을 함유하는 것들을 들 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어 인슐린 글루리신을 함유하는 복합제형은 80mM, 90mM, 100mM, 110mM, 120mM, 121mM, 122mM, 123mM, 124mM, 125mM, 126mM, 127mM, 128mM, 129mM, 130mM, 131mM, 132mM, 133mM, 134mM, 135mM, 136mM, 137mM, 138mM, 139mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM의 염(NaCl) 농도, 또는 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 110mM, 약 120mM, 약 121mM, 약 122mM, 약 123mM, 약 124mM, 약 125mM, 약 126mM, 약 127mM, 약 128mM, 약 129mM, 약 130mM, 약 131mM, 약 132mM, 약 133mM, 약 134mM, 약 135mM, 약 136mM, 약 137mM, 약 138mM, 약 139mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 160mM, 약 170mM, 약 180mM, 약 190mM 또는 약 200mM의 염 농도를 갖는다. 예를 들어, 본원에서는 120mM 또는 140mM의 NaCl을 함유하거나 약 120mM 또는 약 140mM의 NaCl을 함유하는 rHuPH20 및 인슐린 글루리신의 복합제형이 제공된다.

본원에서 제공된 복합제형의 예에서는 7.2 또는 약 7.2, 예를 들어 7.2±0.2의 pH를 갖는 인슐린 아스파르트와 같은 인슐린 및 rHuPH20의 복합제형이 있다. 기타 예에서, 인슐린 리스프로와 같은 인슐린 및 rHuPH20의 복합제형은 7.4 또는 약 7.4, 예를 들어 7.4±0.2의 pH를 갖는다. 또 다른 예에서, 인슐린 글루리신과 같은 인슐린 및 rHuPH20의 복합제형은 7.3 또는 7.4 또는 약 7.3 또는 약 7.4, 7.3±0.2 또는 7.4±0.2의 pH를 갖는다.

히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 및 인슐린 리스프로를 함유하는 본원에서 제공된 복합제형의 예시적인 예로는 25mM 내지 35mM 또는 약 25mM 내지 약 35mM(예를 들어, 30mM 또는 약 30mM)의 트리스; 70mM 또는 100mM 또는 약 70mM 또는 약 100mM의 100mM NaCl(예를 들어, 80mM 또는 100mM 또는 약 80mM 또는 약 100mM의 NaCl); 10mM 내지 30mM 또는 약 10mM 내지 약 30mM의 메티오닌(예를 들어, 10mM 또는 20mM 또는 약 10mM 또는 약 20mM의 메티오닌); 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 약 60mM의 글리세린(예를 들어, 50mM 또는 약 50mM의 글리세린); 0.005% 내지 0.05% 또는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 폴록사머 188(예를 들어, 0.01% 또는 약 0.01%의 폴록사머 188); 0.017㎎/100U 인슐린 내지 0.024㎎/100U 인슐린 또는 약 0.017㎎/100U 인슐린 내지 약 0.024㎎/100U 인슐린의 아연(예를 들어, 0.017㎎/100U 인슐린, 0.018㎎/100U, 0.02㎎/100U, 0.022㎎/100U 또는 0.024/100U 인슐린의 아연); 0.08% 내지 0.17% 또는 약 0.08% 내지 약 0.17%의 페놀(예를 들어, 0.1%, 0.125% 또는 0.13%의 페놀); 및 0.07% 내지 0.17% 또는 약 0.07% 내지 약 0.17%의 m-크레졸(예를 들어, 0.075%, 0.08%, 0.13% 또는 0.15%의 m-크레졸)을 함유하는 것들이 있다. 예를 들어, 상기 복합제형은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸; 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸; 또는 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸을 함유할 수 있다. 인슐린 리스프로, 및 가용성 히알루로니다아제(예를 들어, rHuPH20)와 같은 히알루로난 분해 효소의 이러한 제형은 7.0 내지 7.5 또는 약 7.0 내지 약 7.5의 pH(일반적으로는 pH 7.2 또는 약 pH 7.2의 pH)로 제조된다.

히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소 및 인슐린 아스파르트를 함유하는 본원에서 제공된 복합제형의 예시적인 예로는 25mM 내지 35mM 또는 약 25mM 내지 약 35mM(예를 들어, 30mM 또는 약 30mM)의 트리스; 70mM 내지 100mM 또는 약 70mM 내지 약 100mM의 NaCl(예를 들어, 80mM 또는 100mM 또는 약 80mM 또는 약 100mM의 NaCl); 10mM 내지 30mM 또는 약 10mM 내지 약 30mM의 메티오닌(예를 들어, 10mM 또는 20mM 또는 약 10mM 또는 20mM의 메티오닌); 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 약 60mM의 글리세린(예를 들어, 50mM 또는 약 50mM의 글리세린); 0.005% 내지 0.05% 또는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 폴록사머 188(예를 들어, 0.01% 또는 약 0.01%의 폴록사머 188); 0.017㎎/100U 인슐린 내지 0.024㎎/100U 인슐린 또는 약 0.017㎎/100U 인슐린 내지 약 0.024㎎/100U 인슐린의 아연(예를 들어, 0.017㎎/100U 인슐린, 0.018㎎/100U, 0.02㎎/100U, 0.022㎎/100U 또는 0.024㎎ /100U 인슐린의 아연); 0.08% 내지 0.17% 또는 약 0.08% 내지 약 0.17%의 페놀(예를 들어, 0.1%, 0.125% 또는 0.13%의 페놀); 및 0.07% 내지 0.17% 또는 약 0.07% 내지 약 0.17%의 m-크레졸(예를 들어, 0.075%, 0.08%, 0.13% 또는 0.15%의 m-크레졸)을 함유하는 것들이 있다. 예를 들어, 상기 복합제형은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸; 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸; 또는 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸을 함유할 수 있다. 인슐린 아스파르트, 및 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 이러한 제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH(일반적으로는 pH 7.4 또는 약 pH 7.4의 pH)로 제조된다.

히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소 및 인슐린 글루리신을 함유하는 본원에서 제공된 복합제형의 예시적인 예로는 25mM 내지 35mM 또는 약 25mM 내지 약 35mM(예를 들어, 30mM 또는 약 30mM)의 트리스; 100mM 내지 150mM 또는 약 100mM 내지 약 150mM의 NaCl(예를 들어, 100mM 또는 140mM 또는 약 100mM 또는 약 140mM의 NaCl); 10mM 내지 30mM 또는 약 10mM 내지 약 30mM의 메티오닌(예를 들어, 10mM 또는 20mM 또는 약 10mM 또는 약 20mM의 메티오닌); 40mM 내지 60mM 또는 약 40mM 내지 약 60mM의 글리세린(예를 들어, 50mM 또는 약 50mM의 글리세린); 0.005% 내지 0.05% 또는 약 0.005% 내지 약 0.05%의 폴록사머 188(예를 들어, 0.01% 또는 약 0.01%의 폴록사머 188); 0.08% 내지 0.17% 또는 약 0.08% 내지 약 0.17%의 페놀(예를 들어, 0.1%, 0.125% 또는 0.13%의 페놀); 및 0.07% 내지 0.17% 또는 약 0.07% 내지 약 0.17%의 m-크레졸(예를 들어, 0.075%, 0.08%, 0.13% 또는 0.15%의 m-크레졸)을 함유하는 것들이 있다. 예를 들어, 상기 복합제형은 0.1% 또는 약 0.1%의 페놀 및 0.015% 또는 약 0.015%의 m-크레졸; 0.125% 또는 약 0.125%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.075% 또는 약 0.075%의 m-크레졸; 0.13% 또는 약 0.13%의 페놀 및 0.08% 또는 약 0.08%의 m-크레졸; 또는 0.17% 또는 약 0.17%의 페놀 및 0.13% 또는 약 0.13%의 m-크레졸을 함유할 수 있다. 인슐린 글루리신, 및 히알루로니다아제(예를 들어, rHuPH20)와 같은 히알루로난 분해 효소의 이러한 제형은 7.0 내지 7.6 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH(일반적으로는 pH 7.4 또는 약 pH 7.4의 pH)로 제조된다.

b. 예시적인 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII) 복합제형

본원에서는 32℃ 초과, 예를 들어 35℃ 내지 40℃, 특히 37℃ 초과 또는 40℃ 초과 또는 약 37℃ 초과 또는 약 40℃ 초과의 승온, 및/또는 적어도 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 적어도 5일, 적어도 6일 또는 적어도 7일, 및 일반적으로 적어도 3시간 또는 적어도 3일 동안의 교반 조건과 같은 가속화 또는 스트레스 조건의 존재 하에 안정성을 갖는 안정한 복합제형이 제공된다. 이들 안정한 복합제형은 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII)에 의한 투여에 적합하다.

위에서 논의된 바와 같이, 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃이 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안 본원에서 제공된 복합제형의 안정성을 부여하는 구성요소들의 농도, 양 또는 수준은 일반적으로 승온과 같은 스트레스 조건 하에서 상기 복합제형의 안정성을 부여하기에 충분하지 않다. 일반적으로, 이러한 복합제형은 24시간 미만, 및 일반적으로는 8시간 미만 동안 이러한 스트레스 조건(예를 들어, 승온) 하에서 안정하며, 이는 실질적으로 이러한 조건이 존재하는 다중 적용에서 이들의 용도를 손상시킬 수 있다. 예를 들어, CSII 요법은 신체 외부에 또는 근처에 착용되는 펌프 또는 기타 장치에 의해 하루 24시간 동안 2일 내지 3일이 걸쳐 제형의 연속적인 주입과 연관이 있다. 인슐린 제형 또는 복합제형은 복부 벽 또는 넓적다리 내로 바늘을 통해 주입되며, 이의 주사가 상기 인슐린 제형 또는 복합제형이 연속적으로 주입되도록 프로그래밍된 펌프에 의해 조절될 수 있다. 따라서 CSII 요법용으로 사용되는 복합제형은 적어도 37℃, 약 37℃ 또는 37℃ 초과의 증가된 체온 및 교반 조건에 적용된다.

예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 32℃ 초과, 및 일반적으로는 37℃ 초과 또는 40℃ 초과의 승온에서 특히 불안정하다. 또한 인슐린이 높은 염 농도 및 낮은 pH에서 2℃ 내지 8℃에서 결정화될지라도 이는 32℃ 내지 40℃의 더욱 높은 온도에서 높은 염 농도 및 낮은 pH에서는 결정화되지 않는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 32℃ 내지 40℃의 높은 온도에서 이의 안정성을 유지하기 위해 히알루로난 분해 효소(예를 들어, PH20)에 의해 요구되는 높은 염 농도 및 낮은 pH에 대한 반대 요건은 적어도 3일이라는 짧은 기간 동안에 더욱 높은 온도에서 더욱 양립가능성이다. 또한 동일한 높은 염 및 낮은 pH의 제형은, 더욱 낮은 온도에서 인슐린의 안정성에 영향을 미치는 겉보기 용해도에서의 차이에도 불구하고 인슐린 유사체 사이 또는 이들 중에서 유사한 안정성을 부여한다.

예를 들어 CSII 요법에서 사용하기 위한 스트레스 조건 하에서 안정성을 갖는 안정한 복합제형은 일반적으로 본원에서 제공된 기타 복합제형과 동일한 구성요소들을 함유한다. 그러나 이러한 복합제형은 스트레스 조건 하에 안정한 복합제형이 일반적으로 더욱 높은 농도의 염, 더욱 낮은 pH, 및/또는 32℃ 초과 또는 약 32℃ 초과, 예를 들어 35℃ 초과 내지 40℃ 초과 또는 약 35℃ 초과 내지 약 40℃ 초과, 특히 37℃ 초과 또는 40℃ 초과 또는 약 37℃ 초과 또는 약 40℃ 초과의 승온 및/또는 교반 조건에서 일반적으로 적어도 2 내지 3일 동안 상기 히알루로난 분해 효소 및/또는 인슐린을 충분히 안정화시키는 하나 이상의 기타 부형제의 존재를 함유한다는 점에서 차이가 있다. 예를 들어, 승온 또는 교반의 스트레스 조건에서 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 일반적으로 히알루로니다아제 기질(예를 들어, 히알루로난)과 같은 히알루로니다아제 억제제를 부형제로 함유한다.

일 예에서, 승온 또는 교반의 스트레스 조건에서 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 상기 섹션 E.1.a에서 제공된 복합제형보다 더욱 높은 농도의 염 및 더욱 낮은 pH를 함유한다. 예를 들어,본원에서는 적어도 3일 또는 3시간 동안 스트레스 조건(예를 들어, 32℃ 내지 40℃의 승온 또는 교반) 하에 안정한 복합제형이 제공되며, 이때 상기 복합제형은 120mM의 NaCl 내지 200mM의 NaCl 및 6.5 내지 7.5의 pH를 함유한다. 그러나 위에서 논의된 바와 같이, 특히 냉장 온도에서의 인슐린 가용성은 이들의 감소된 pH 및 증가된 염 조건에서 감소한다. 따라서 이러한 제형은 일반적으로 사용 이전에 냉장 온도 또는 주위 온도에서 보관되지 않는다.

다른 예에서, 적어도 3일 동안의 승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 적어도 3시간 동안의 교반과 같은 스트레스 조건에서 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 상기 복합제형 중의 히알루로난 분해 효소를 안정화시키기 위해 히알루로니다아제 억제제를 함유한다. 상술한 임의의 히알루로니다아제 억제제들은 적어도 3일 동안의 승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 적어도 3시간 동안의 교반과 같은 스트레스 조건에서 안정한 본원에서 제공된 복합제형에서 사용될 수 있다. 특정 예에서, 상기 히알루로니다아제 억제제는 히알루로니다아제 기질, 예를 들어, 히알루로난이다.

상기 히알루로니다아제 억제제 히알루로난에 대해 본원에서 실시예에 나타낸 바와 같이, 히알루로니다아제 억제제의 존재는 특히 승온, 예를 들어 32℃ 내지 40℃의 승온의 스트레스 조건 하에서 특히 보존제들의 존재 하에 PH20 활성을 안정화시킨다. HA 올리고머들이 히알루로난과 히알루로난 분해 효소의 효소적 반응 기질/산물이기 때문에 상기 히알루로난 올리고머들은 효소 활성 부위에 결합하여, 안정화 효과를 야기할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 32℃ 내지 40℃의 승온의 스트레스 조건 하에 시간이 지남에 따라, 예를 들어 37℃에서 1주 초과 또는 2주 초과 동안에 상기 복합제형 중의 HA와 같은 히알루로니다아제 억제제의 존재는 인슐린의 분해을 초래할 수 있으며, 그 결과 공유결합성 HA-인슐린 유사체 부가산물을 초래하는 것으로 또한 밝혀져 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형 중에 높은 농도의 HA의 존재는 37℃에서 1주 이후에 인슐린 아스파르트^®의 분해, 및 30℃에서 2주 이후에 인슐린 글루리신^®의 분해를 야기하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 나타나 있다. 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)의 분석에 따르면, 상기 분해 산물들 중 일부는 HA의 환원 말단과 인슐린의 반응에 의해 형성된 공유결합성 HA-인슐린 유사체 당화 부가산물인 것으로 나타났다. 예를 들어, 하나의 피크는 인슐린 아스파르트^®와 HA 7량체의 생성물인 것으로 결정되었으며, 그 반면 다른 피크는 인슐린 아스파르트^®와 HA 2량체의 생성물이었다.

HA와 같은 히알루로니다아제 억제제의 존재는 또한 상기 복합제형의 침전 및 변색에 대해 영향을 미칠 수 있다. 따라서 HA가 32℃ 내지 40℃의 승온의 스트레스 조건에서 히알루로난 분해 효소의 안정성을 향상시키는 반면, 이는 또한 인슐린 분해, 및 상기 복합제형의 침전 및 변색에 대해 영향을 미칠 수 있다. 원하는 안전 및 약리학적 매개 변수 및 지침서 내에서 이들 조건을 모니터링하는 것은 당해 기술분야의 숙련자의 범주 내에 있다. 일반적으로, HA와 같은 히알루로니다아제 억제제를 함유하는 본원에서 제공된 안정한 복합제형은 이들 매개 변수에 대한 효과로 인해 승온, 예를 들어 32℃ 내지 40℃의 온도의 스트레스 조건 하에 적어도 3시간 이상 7일 미만 동안 안정하다.

본원에서 제공된 일부 예에서, 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소과 공유결합성 복합체를 형성할 수 없는 히알루로니다아제 억제제가 사용된다. 따라서 연합성 결합에 의해 작용하는 비-공유결합성 억제제들이 본원에서 제공된 제형에서 고려된다. 예를 들어, 본원에서는 인슐린과 당화 부가산물을 더 이상 형성할 수 없도록 반응한 환원 말단을 갖는 HA를 함유하는 복합제형이 제공된다. 예를 들어, 일부 예에서, 본원에서 제공된 복합제형에 사용된 HA는 환원성 아민화에 의해 변형되었다. 환원성 아민화는 알데히드과 아민 사이에서 시프(Schiff) 염기의 형성을 포함하며, 이는 이어 환원되어 더욱 안정한 아민을 형성한다.당, 즉 HA의 환원 말단은 사이클릭 헤미아세탈 형태와 오픈 사슬 알데히드 형태의 평형 혼합물로서 존재한다. 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 적합한 조건 하에서, 아민기들은 당 알데히드와 함께 응축하여, 소듐 시아노보로하이드라이드와 같은 환원제와 함께 이미늄(iminium) 이온을 형성할 것이며, 이때 상기 이미늄 이온은 아민으로 환원될 수 있다(예를 들어, Gildersleeve 등, (2008) Bioconjug Chem 19(7): 1485-1490 참조). 얻어진 HA는 인슐린에 대해 반응성이 없으며, 인슐린 당화 부가산물을 형성할 수 없다.

특히, 본원에서는 32℃ 내지 40℃ 또는 약 32℃ 내지 약 40℃의 온도에서 적어도 3일 동안 안정성을 갖고, 및/또는 교반 하에 적어도 3시간 동안 안정성을 갖는 안정한 복합제형 조성물이 제공되며, 이때 상기 안정한 복합제형 조성물은 초기 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50%, 예를 들어 적어도 375U/㎖ 또는 적어도 약 375U/㎖의 히알루로난 분해 효소 활성이 유지되도록 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 600U/㎖, 약 600U/㎖ 또는 저어도 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어 rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 속효성 인슐린; 120mM 내지 200mM 또는 약 120mM 내지 약 200mM의 농도의 NaCl; 6.5 내지 7.5 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH; 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물; 및 히알루로니다아제 억제제와 같은 하나 이상의 추가적인 안정화제 또는 안정화제들을 함유한다. 예를 들어, 상기 복합제형은 HA를 1㎎/㎖ 내지 20㎎/㎖ 또는 약 1㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖의 농도로 함유할 수 있다. 또한 상기 안정한 복합제형은 pH 6.5 또는 약 pH 6.5의 pH 범위를 유지하기 위한 1mM 내지 100mM 또는 약 1mM 내지 약 100mM의 양의 완충제(예를 들어, 트리스); 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.1% 및 0.4% 또는 0.1% 내지 0.4%의 총량인 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물, 예를 들어 페놀성 보존제(예를 들어, 페놀 및/또는 m-크레졸); 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.005% 내지 1.0% 또는 약 0.005% 내지 약 1.0%의 계면활성제(예를 들어, 폴록사머 188); 및 선택적으로 추가적인 안정화제를 함유할 수 있다.

예를 들어, 스트레스 조건(예를 들어, 32℃ 내지 40℃의 승온 또는 교반) 하에 적어도 3일 또는 3시간 동안 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 120mM 내지 200mM의 NaCl, 예를 들어 150mM의 NaCl 내지 200mM의 NaCl 또는 160mM의 NaCl 내지 180mM의 NaCl을 함유하며, 예를 들어 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM 또는 200mM의 NaCl, 또는 약 120mM, 약 130mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 155mM, 약 160mM, 약 165mM, 약 170mM, 약 175mM, 약 180mM, 약 185mM, 약 190mM, 약 195mM 또는 약 200mM의 NaCl을 함유한다. 또한 스트레스 조건(예를 들어, 32℃ 내지 40℃의 승온 또는 교반) 하에 적어도 3일 또는 3시간 동안 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 6.5 내지 7.5 또는 6.5 내지 7.2의 pH, 예를 들어 6.5±0.2, 6.6±0.2, 6.7±0.2, 6.8±0.2, 6.9±0.2, 7.0±0.2, 7.1±0.2, 7.2±0.2, 7.3±0.2, 7.4±0.2 또는 7.5±0.2, 또는 약 6.5±0.2, 약 6.6±0.2, 약 6.7±0.2, 약 6.8±0.2, 약 6.9±0.2, 약 7.0±0.2, 약 7.1±0.2, 약 7.2±0.2, 약 7.3±0.2, 약 7.4±0.2 또는 약 7.5±0.2의 pH를 함유한다.

본원의 예에서, 승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 적어도 3일 또는 3시간 동안의 교반의 스트레스 조건에서 안정한 본원에서 제공된 복합제형은 5kDa 내지 5,000kDa의 분자량, 예를 들어 5kDa 내지 1,000kDa, 5kDa 내지 200kDa 또는 5kDa 내지 50kDa, 또는 약 5kDa 내지 약 1,000kDa, 약 5kDa 내지 약 200kDa 또는 약 5kDa 내지 약 50kDa의 분자량을 갖는 히알루로난(히알루론산; HA)을 함유한다. 특히, HA의 분자량은 10kDa 미만이다. HA는 2량체 내지 30량체 또는 4량체 내지 16량체와 같은 이당류로 구성된 올리고당일 수 있다. 인슐린, 및 히알루로니다아제, 예를 들어, PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 HA를 1㎎/㎖ 내지 20㎎/㎖ 또는 약 1㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖의 농도로 함유하고, 예를 들어 적어도 1㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 4㎎/㎖, 5㎎/㎖, 6㎎/㎖, 7㎎/㎖, 8㎎/㎖, 9㎎/㎖, 10㎎/㎖, 11㎎/㎖, 12㎎/㎖, 13㎎/㎖, 14㎎/㎖, 15㎎/㎖, 16㎎/㎖, 17㎎/㎖, 18㎎/㎖, 19㎎/㎖ 또는 20㎎/㎖ 또는 그 이상, 또는 약 1㎎/㎖, 약 2㎎/㎖, 약 3㎎/㎖, 약 4㎎/㎖, 약 5㎎/㎖, 약 6㎎/㎖, 약 7㎎/㎖, 약 8㎎/㎖, 약 9㎎/㎖, 약 10㎎/㎖, 약 11㎎/㎖, 약 12㎎/㎖, 약 13㎎/㎖, 약 14㎎/㎖, 약 15㎎/㎖, 약 16㎎/㎖, 약 17㎎/㎖, 약 18㎎/㎖, 약 19㎎/㎖ 또는 약 20㎎/㎖ 또는 그 이상의 HA를 함유한다. 예시적인 안정한 복합제형은 8㎎/㎖ 내지 12㎎/㎖ 또는 약 8㎎/㎖ 내지 약 12㎎/㎖의 HA, 예를 들어 10㎎/㎖ 또는 약 10㎎/㎖의 HA를 함유한다. 일부 예에서, 히알루로난 분해 효소에 대한 HA의 몰비는 100,000:1, 95,000:1, 90,000:1, 85,000:1, 80,000:1, 75,000:1, 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1, 45,000:1, 40,000:1, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000:1, 15,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1 또는 그 이하이거나, 약 100,000:1, 약 95,000:1, 약 90,000:1, 약 85,000:1, 약 80,000:1, 약 75,000:1, 약 70,000:1, 약 65,000:1, 약 60,000:1, 약 55,000:1, 약 50,000:1, 약 45,000:1, 약 40,000:1, 약 35,000:1, 약 30,000:1, 약 25,000:1, 약 20,000:1, 약 15,000:1, 약 10,000:1, 약 5,000:1, 약 1,000:1, 약 900:1, 약 800:1, 약 700:1, 약 600:1, 약 500:1, 약 400:1, 약 300:1, 약 200:1, 약 100:1 또는 그 이하이다.

승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 교반 하에 안정한 복합제형, 예를 들어 CSII 제형을 위해 요구되는 복합제형이 상기 섹션 E.1.a에 기재된 복합제형에 비해 감소된 pH 및 증가된 염 농도를 갖기 때문에, 이들은 이들로부터 제조되거나 유래할 수 있다. 이는, 예를 들어 MDI용으로 적합한 섹션 E.1.a에 제공된 임의의 복합제형과 같은 복합제형을 낮은 pH 및 높은 염 농도를 갖는 안정화 희석제로 희석함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 더욱 낮은 pH의 완충액 및 보존제들을 갖는 NaCl 함량이 높은 용액일 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 10mM 내지 50mM의 트리스 또는 기타 유사한 완충액; 120mM 내지 200mM의 NaCl; 및 0.1% 내지 0.4%의 보존제를 함유할 수 있다. 상기 희석제는 6.5 내지 7.8 또는 약 6.5 내지 약 7.8의 pH에서 제조될 수 있다. 따라서 2℃ 내지 8℃ 또는 20℃ 내지 30℃에서 안정한 보원에서 제고된 안정한 복합제형이 제공될 수 있으며, 희석제와 혼합하여 적어도 3일 동안의 승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 적어도 3시간의 교반의 스트레스 조건 하에서 안정한 복합제형을 제공한다.

예를 들어, 상술한 섹션 E.1.a에서의 임의의 MDI 복합제형은 안정화 희석제로 희석될 수 있으며, 그 결과 더욱 낮은 인슐린 농도, 6.8 내지 7.0 또는 약 6.8 내지 약 7.0(예를 들어, 6.8, 6.9 또는 7.0, 또는 약 6.8, 약 6.9 또는 약 7.0)의 pH, 및 150mM 내지 200mM 또는 약 150mM 내지 약 200mM의 NaCl 농도를 갖는 CSII 제형을 초래한다.

기타 예에서, 상기 안정한 MDI 복합제형은 상기 안정화 부형제 희석제와의 혼합 이후에 허용 가능한 장성 및 더욱 낮은 pH를 제공하기 위해 더욱 높은 인슐린 농도, 더욱 높은 PH20 농도, 더욱 낮은 NaCl 농도(80mM 내지 150mM 또는 약 80mM 내지 약 150mM) 및 더욱 낮은 완충 능력을 갖는 변형된 고농도 MDI 제형으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 더욱 높은 인슐린 농도는, 예를 들어 120 유닛 내지 500 유닛, 예를 들어 150 유닛, 200 유닛 또는 500 유닛(U)일 수 있으며, 더욱 높은 PH20 농도는 6㎍/㎖ 내지 25㎍/㎖, 예를 들어 6㎍/㎖, 7.5㎍/㎖, 10㎍/㎖ 또는 25㎍/㎖일 수 있다. 안정화 희석제에 의한 변형된 고농도 MDI 제형의 희석은 상기 섹션 E.1.a에 제공된 임의의 MDI 복합제형보다 낮은 pH(예를 들어, 6.5 내지 7.2) 및 증가된 NaCl 농도(140mM 내지 200mM)를 갖는 CSII 제형을 제공할 수 있다.

또 다른 예에서, 본원 섹션 E.1.a에서 제공된 임의의 MDI 제형은 제조되어, 동결 건조된 형태로 보관될 수 있다. 스트레스 조건 하에서의 사용 직후에 상기 동결 건조된 생성물은 더욱 낮은 pH(예를 들어, 6.5 내지 7.8) 및 증가된 농도의 NaCl(120mM 내지 200mM)을 함유하는 안정화 희석제로 희석될 수 있으며, 그 결과 섹션 E.1.a에서 제공된 임의의 MDI 복합제형보다 더욱 낮은 pH(예를 들어, 6.5 내지 7.8) 및 증가된 NaCl 농도(120mM 내지 200mM)를 갖는 CSII 제형을 초래하다.

그러나 본원 예에서 나타낸 바와 같이, 히알루로난은 더욱 낮은 온도에서 인슐린을 응집하게 하기 때문에 2℃ 내지 8℃에서 보관된 제형과 함께 사용하기에는 적합하지 않다. 따라서 상기 CSII 안정한 제형이 MDI 제형의 희석에 의해 생성되고 MDI 복합제형 또는 변형 농축된 MDI 복합제형이 히알루로니다아제 억제제를 함유하지 않는 상기 예에서, 히알루로니다아제 억제제는 적어도 3일 동안의 승온(예를 들어, 32℃ 내지 40℃) 또는 적어도 3시간 동안의 교반의 스트레스 조건 하에서 상기 복합제형의 안정성을 유지하기에 적절한 농도의 히알루로니다아제 억제제를 제공하기 위해 안정화 희석제에 포함될 수 있다.

c. 예시적인 Lys-Lys 복합제형

본원에서는 치료적 유효량의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 치료적 유효량의 신속 작용(예를 들어, 속효성) 인슐린 유사체와 같은 속효성 인슐린, 및 상기 복합제형에 안정성을 제공하는 양의 Lys-Lys를 함유하는 안정한 복합제형이 제공된다. 일반적으로, 상기 복합제형은 다중 투여 제형이고, 또한 미생물학적 유효량의 하나 이상의 보존제를 함유한다. 또한 상기 복합제형은 하나 이상의 기타 안정화제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 복합제형은 2℃ 내지 8℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월, 및 20℃ 내지 30℃ 또는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적어도 14일(즉, 2주) 동안 안정하다. 특히, 이러한 복합제형은 32℃ 초과 또는 약 32℃ 초과, 예를 들어 35℃ 내지 40℃의 승온, 특히 37℃ 초과 또는 40℃ 초과 약 37℃ 초과 또는 약 40℃ 초과, 또는 37℃ 초과 또는 40℃ 초과의 승온, 및/또는 적어도 3시간, 및 일반적으로 적어도 3일 동안의 교반 조건과 같은 가속화 조건 하에서 안정하다. 상기 복합제형은 다중 주사(MDI) 용도 또는 연속적인 피하 인슐린 주입(CSII) 방법용으로 사용될 수 있다.

예시적인 안정한 Lys-Lys 함유 제형이 하기에 기재되어 있다. 하기의 안정한 제형은 단지 예시적이며, 약간의 조절이 이루어질 수 있는 플랫폼을 제공한다. 다양한 부형제들 및 기타 구성요소들의 농도에서 매우 작은 변화(예를 들어, 상기에 언급한 농도의 ±15%) 또는 pH의 작은 변화는 인슐린 가용성 및 안정성 및 히알루로난 분해 효소 안정성을 전부는 아니지만 일부 유지하면서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 추가적인 변화는 또한 부형제를 부가하거나 제거함으로써 이루어질 수 있다.

예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 600U/㎖ 또는 약 적어도 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 및 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 속효성 인슐린을 함유하고, 상기 복합제형은 50mM 내지 120mM의 농도, 예를 들어 50 내지 80mM, 80mM 내지 100mM 또는 100mM 내지 120mM의 농도의 Lys-Lys, 6.5 내지 8.0 또는 약 6.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.8 또는 6.8 내지 7.8, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 6.8 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.6, 또는 약 6.5 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 7.4 또는 약 7.0 내지 약 7.6의 pH, 상기 pH 범위를 유지하는 완충제, 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제들의 혼합물, 및 보관 과정(온도 및 시간)에 걸쳐 히알루로난 분해 효소 활성의 적어도 50% 및 인슐린 순도, 회복 및/또는 효능의 적어도 90%를 유지하는 양의 안정화제를 더 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제형은 안정화제로서 0.0005% 내지 1.0%(예를 들어, 0.0005% 내지 0.005%)의 계면활성제를 함유한다. 상기 복합제형은 선택적으로 부가적인 안정화제, 등장화제, 항산화제 및/또는 기타 부형제들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합제형은 NaCl을 140mM 미만의 농도, 예를 들어 0mM 내지 100mM 또는 약 0mM 내지 약 100mM의 농도, 0mM 내지 50mM, 10mM 내지 40mM 또는 20mM 내지 30mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 농도로 함유한다.

일 예에서, 예시적인 제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 및 특히 적어도 600U/㎖, 적어도 약 600U/㎖ 또는 약 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖의 인슐린 글루리신; 50mM 내지 105mM 또는 약 50mM 내지 약 105mM(예를 들어, 적어도 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM, 또는 적어도 약 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM)의 Lys-Lys; 0mM 내지 50mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM의 메티오닌(예를 들어, 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 약 20mM, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 메티오닌); 0.0005% 내지 0.005% 또는 약 0.0005% 내지 약 0.005%, 예를 들어 0.001% 내지 0.005%의 폴리소르베이트 20(예를 들어, 적어도 0.0005%, 0.0001%, 0.005% 또는 0.001%, 또는 적어도 약 0.0005%, 0.0001%, 0.005% 또는 0.001%의 폴리소르베이트 20); 및 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.01% 내지 0.25% 또는 약 0.01% 내지 약 0.25%의 페놀, 및 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)을 함유한다. 상기 제형은 6.8 내지 7.4 또는 약 6.8 내지 약 7.4의 pH(예를 들어, 적어도 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH, 또는 적어도 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH)로 제조된다. 또 다른 예에서, NaCl은 140mM 미만의 농도로 포함되어 있다. 예를 들어, NaCl은 100mM 미만, 예를 들어 적어도 0mM 내지 100mM 또는 적어도 약 0mM 내지 약 100mM의 농도, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM 또는 90m, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM 또는 90mM의 농도로 포함되어 있다.

다른 예에서, 예시적인 제형은 100U/㎖ 내지 1,000U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소, 및 특히 적어도 600U/㎖, 적어도 약 600U/㎖ 또는 약 600U/㎖의 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20(예를 들어, rHuPH20)과 같은 히알루로난 분해 효소; 10U/㎖ 내지 1,000U/㎖, 및 특히 적어도 100U/㎖ 또는 약 100U/㎖ 의 인슐린 리스프로 또는 아스파르트; 80mM 내지 100mM 또는 약 80mM 내지 약 100mM(예를 들어, 적어도 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM, 또는 적어도 약 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM)의 Lys-Lys; 0mM 내지 50mM 또는 약 0mM 내지 약 50mM의 50mM 메티오닌(예를 들어, 5mM 내지 20mM 또는 약 5mM 내지 약 20mM, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 또는 50mM의 메티오닌); 0.0005% 내지 0.005% 또는 약 0.0005% 내지 약 0.005%, 예를 들어 0.001% 내지 0.005%의 폴리소르베이트 20(예를 들어, 적어도 0.0005%, 0.0001%, 0.005% 또는 0.001%, 또는 적어도 약 0.0005%, 0.0001%, 0.005% 또는 0.001%의 폴리소르베이트 20); 및 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.01% 내지 0.25% 또는 약 0.01% 내지 약 0.25%의 페놀, 및 질량 농도(w/v)의 백분율(%)로서 0.05% 내지 0.2% 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 m-크레졸을 포함하는 보존제(들)을 함유한다. 상기 제형은 6.8 내지 7.4 또는 약 6.8 내지 약 7.4의 pH(예를 들어, 적어도 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH, 또는 적어도 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH)로 제조된다. 또 다른 예에서, NaCl은 140mM 미만의 농도로 포함되어 있다. 예를 들어, NaCl은 100mM 미만, 예를 들어 적어도 0mM 내지 100mM 또는 적어도 약 0mM 내지 약 100mM의 농도, 예를 들어 적어도 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM 또는 90mM, 또는 적어도 약 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM 또는 90mM의 농도로 포함되어 있다.

G. 투약 및 투여

히알루로난 분해 효소의 안정한 제형인 본원에서 제공된 조성물들은 단일 또는 다중 투여용 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 히알루로난 분해 효소 및 속효성 인슐린의 복합제형은 다중 투여용 약학 조성물로서 제형화된다. 상기제형 및 복합제형은, 예를 들어 피하, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피내 투여를 포함한 비경구 투여와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공된 제형 또는 복합제형은 피하 투여된다.

치료적으로 유효한 용량은 공지된 시험관 내 및 생체 내 시스템들에서 상기 제형 또는 복합제형을 시험함으로써 실험적으로 결정될 수 있으며, 또한 물질대사, 음식 섭취 및 질병의 중증도와 같은 이러한 인자에 기초하여 각각의 대상체를 위해 개별화될 수 있다. 상기 제형 또는 복합제형 중의 히알루로난 분해 효소 및/또는 선택된 인슐린의 농도는, 예를 들어 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 기타 인자뿐만 아니라 흡수, 불활성화 및 복합체의 배설 속도, 투약 계획, 및 용량에 의해 결정된다. 예를 들어, 인슐린을 포함한 복합제형에 있어서, 치료의 정확한 투약은 대상체에서의 혈당치의 함수이고, 공지된 알고리즘을 이용하여 시험적으로 결정될 수 있거나, 생체 내 또는 시험관 내 시험 데이터로부터의 외삽, 대상체의 과거의 경험, 식사에서 탄수화물 함량을 결정하는 탄수화물 계수(carbohydrate counting), 및 이에 따른 식전 혈당의 추정된 증가 및 인슐린에 대한 후속적인 요건에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 농도 및 투약 수치는 치료받은 각 대상체에 따라 다를 수 있는 것으로 주지된다. 임의의 특정 대상체에 있어서, 특정 투약 요법은 개인의 필요성, 및 상기 제형을 투여하거나 상기 제형의 투여를 감독하는 사람의 직업적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조절되어야 하며, 본원에 기재된 농도 범위는 단지 예시적이며, 이의 범주를 제한하기 위해 의도된 것은 아닌 것으로 또한 이해되어야 한다. 당뇨 상태의 치료를 위해 투여되어야 할 선택된 인슐린의 양은 표준 임상적 기법들에 의해 결정될 수 있다. 더 나아가, 시험관 내 분석 및 동물 모델들은 최적의 투약 범위를 확인하는데 도움을 주기 위해 이용될 수 있다.

따라서 실험적으로 결정될 수 있는 정확한 투약은 상기 제형 또는 복합제형에 포함된 특정 히알루로난 분해 효소 및/또는 인슐린, 요법 및 투여 계획, 투여 경로, 치료될 당뇨병의 유형, 질병의 심각도, 및 치료 중인 대상체에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 인슐린은 혈당 조절을 달성하는 양으로 제공된다. 예를 들어, 식후 혈당 조절을 달성하기 위해, 당뇨병 환자 대상체들에게는 일반적으로 인슐린이 히알루로난 분해 효소 없이 전달되는 경우에 식사 30분 내지 5분 전에 체중 1㎏ 당 0.05U(U/㎏) 내지 1.0U/㎏ 또는 약 0.05U/㎏ 내지 약 내지 1.0U/㎏의 속효성 인슐린의 볼루스 주사액이 투여된다. 이는, 예를 들어 특정 대상체의 물질대사, 식사의 함량, 및 혈당치에 기초하여 적절하게 증가되거나 감소될 수 있는 것으로 이해된다. 인슐린이 식후 혈당 조절을 위해 전달되는 시간은 음식의 소화 시간에 근접하거나 상기 소화 시간으로부터 멀어지도록 변경될 수 있으며, 어떤 경우에 인슐린이 식사 시간 또는 식후에 전달되도록 변경될 수 있는 것으로 또한 이해된다.

특정 용량이 다를 수 있을지라도 속효성 인슐린은 일반적으로 0.05 유닛/㎏ 내지 0.25 유닛/㎏, 예를 들어 0.10 유닛/㎏의 용량으로 투여된다. 히알루로난 분해 효소(예를 들어, rHuPH20)과 함께 복합제형화된 인슐린의 향상된 약물 동력학적 및 약력학 특성으로 인해, 상기 제공된 복합제형은 히알루로난 분해 효소의 부재 하에 투여된 속효성 인슐린에 비해 더욱 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 속효성 인슐린을 히알루로난 분해 효소를 포함한 복합제형으로서 투여함으로써 상기 속효성 인슐린의 양을 낮출 수 있는 정도는, 예를 들어 환자가 앓고 있는 당뇨병의 유형, 및 상기 복합제형에 포함된 인슐린의 유형에 의해 결정된다. 일반적으로, 히알루로난 분해 효소를 함유한 복합제형으로서 투여되는 경우에 제 2형 당뇨 환자에 투여된 속효성 인슐린의 양의 감소는 히알루로난 분해 효소를 함유한 복합제형으로서 투여되는 경우에 제1형 당뇨 환자에 투여된 속효성 인슐린의 양의 감소보다 크다. 예를 들어, 식후 글루코오스 수준을 조절하기 위해 제1형 당뇨 환자 및 제 2형 당뇨 환자 모두에게 0.20U/㎏의 속효성 인슐린이 투여되는 경우, 동일하거나 보다 양호한 혈당 조절을 달성하기 위해 제1형 당뇨 환자에는 히알루로난 분해 효소와 함께 복합제형화된 속효성 인슐린이 0.15U/㎏의 양으로 투여될 수 있으며, 동일하거나 보다 양호한 혈당 조절을 달성하기 위해 제 2형 당뇨 환자에게는 히알루로난 분해 효소와 함께 복합제형화된 속효성 인슐린이 0.10U/㎏의 양으로 투여될 수 있다.

식후 혈당치를 조절하기 위해 본원에서 제공된 히알루로난 분해 효소를 함유한 복합제형을 이용한 인슐린의 피하 투여와 같은 비경구 투여를 위한 예시적인 투약 범위는 0.05U/㎏와 0.50U/㎏ 사이 또는 약 0.05U/㎏와 약 0.50U/㎏ 사이, 예를 들어 0.05U/㎏, 0.06U/㎏, 0.07U/㎏, 0.08U/㎏, 0.09U/㎏, 0.10U/㎏, 0.11U/㎏, 0.12U/㎏, 0.13U/㎏, 0.14U/㎏, 0.15U/㎏, 0.20U/㎏, 0.25U/㎏, 0.30U/㎏, 0.40U/㎏, 0.50U/㎏ 또는 1.0U/㎏, 또는 약 0.05U/㎏, 약 0.06U/㎏, 약 0.07U/㎏, 약 0.08U/㎏, 약 0.09U/㎏, 약 0.10U/㎏, 약 0.11U/㎏, 약 0.12U/㎏, 약 0.13U/㎏, 약 0.14U/㎏, 약 0.15U/㎏, 약 0.20U/㎏, 약 0.25U/㎏, 약 0.30U/㎏, 약 0.40U/㎏, 약 0.50U/㎏ 또는 약 1.0U/㎏이다. 상기 특정 투약은 질병 및 개인에 의해 결정된다.

본원에서 제공된 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 식후 혈당 조절 이외에도 밤과 낮을 통해 혈당 조절을 수행하기 위해 당뇨병 환자 대상체들에 투여될 수도 있다. 일반적으로, 연속적인 혈당 조절을 위해 투여된 인슐린의 용량은 식후 혈당 조절을 달성하기 위해 요구되는 것보다 낮다. 그러나 용량은 혈당치에 따라 증가되거나 감소될 수 있다. 연속적인 혈당 조절을 제공하기 위해 히알루로난 분해 효소를 함유한 복합제형으로서 투여된 인슐린의 피하 투여와 같은 비경구 투여를 위한 예시적인 용량 범위는 0.001U/㎏와 0.30U/㎏ 사이 또는 약 0.001U/㎏와 약 0.30U/㎏ 사이, 예를 들어 0.001U/㎏, 0.005U/㎏, 0.01U/㎏, 0.02U/㎏ 또는 0.05U/㎏과 0.30U/㎏ 사이, 또는 약 0.001U/㎏, 약 0.005U/㎏, 약 0.01U/㎏, 약 0.02U/㎏ 또는 약 0.05U/㎏과 약 0.30U/㎏ 사이이며, 예를 들어 0.05U/㎏, 0.06U/㎏, 0.07U/㎏, 0.08U/㎏, 0.09U/㎏, 0.10U/㎏, 0.11U/㎏, 0.12U/㎏, 0.13U/㎏, 0.14U/㎏, 0.15U/㎏, 0.20U/㎏, 0.25U/㎏, 0.30U/㎏, 0.40U/㎏, 0.50U/㎏ 또는 1.0U/㎏, 또는 약 0.05U/㎏, 약 0.06U/㎏, 약 0.07U/㎏, 약 0.08U/㎏, 약 0.09U/㎏, 약 0.10U/㎏, 약 0.11U/㎏, 약 0.12U/㎏, 약 0.13U/㎏, 약 0.14U/㎏, 약 0.15U/㎏, 약 0.20U/㎏, 약 0.25U/㎏, 약 0.30U/㎏, 약 0.40U/㎏, 약 0.50U/㎏ 또는 약 1.0U/㎏이다. 특정 용량은 질병, 투여 시간, 및 개인에 의해 결정된다. 필요한 경우, 용량은 실험적으로 결정될 수 있다.

정확한 용량 및 치료 기간은 치료중인 당뇨병의 함수이고, 공지된 시험 프로토콜을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있거나 생체 내 또는 시험관 내 시험 데이터의 외삽에 의해 실험적으로 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 또한 투약 수치는 당뇨병의 중증도, 및 물질대사, 음식 섭취 및 대상체의 체중과 같은 기타 인자에 따라 다를 수 있는 것으로 주지되어야 한다. 임의의 특정 대상체에 있어서, 특정 투약 요법은 개인의 필요성, 및 조성물을 투여하거나 상기 조성물의 투여를 감독하는 사람의 직업적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조절되어야 하며, 본원에 기재된 농도 범위는 단지 예시적이며, 조성물들 및 상기 조성물들을 함유하는 조합의 범주 및 용도를 제한하기 위해 의도된 것은 아닌 것으로 또한 이해되어야 한다. 상기 조성물들은 대상체 및 당뇨 상태에 따라 매분마다, 수분마다, 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 또는 1회 투여될 수 있다. 일반적으로, 투약 요법은 독성 및/또는 과량의 인슐린과 같이 기타 부적적인 효과를 제한하기 위해 선택된다. 내과 치료의는 투약을 줄이기 위해 요법을 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 시기를 알 수 있는 것으로 주지되어야 한다. 반대로, 내과 치료의는 또한 임상적 반응이 적절하지 않는 경우(독성 부작용을 배제함)에 치료를 더욱 높은 수준까지 조절하는 방법 및 시기를 알 수 있다.

투여 형태

a. 주사기 또는 바이알

본원에서 제공된 제형 또는 복합제형은 단일 투여 또는 다중 투여 제형에 적합한 주사기, 바이알 또는 기타 용기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일부 투여 형태 중 하나 이상의 투여 형태를 이용하여 대상체에 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 주사기를 포함한 일회용 주사기들은 상기 조성물들의 개별 주사액, 예를 들어 볼루스 주사액을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 조성물들의 투여에 유용한 주사기들로는 100U/㎖ 농도의 인슐린 제제들을 포함한 인슐린 제제들의 표준 농도를 유지하도록 설계될 수 있고 각각의 투여를 위해 인슐린 유닛으로 표시된 부분을 갖는 인슐린 주사기들을 들 수 있다.

b. 인슐린 펜

인슐린 펜은 본원에서 제공되는 조성물을 투여하기 위하여 이용될 수 있는 전달 시스템이다. 인슐린 펜은 투여되는 조성물로 채워진 교체가능한 카트리지를 갖는 것들 및 교체불가한 카트리지를 갖는 것들을 포함한다. 교체불가한 카트리지를 갖는 인슐린 펜은 전형적으로 카트리지가 비워지면 처분된다. 인슐린 펜은 예를 들어 절반 단위, 1개 단위 또는 2개 단위 증분으로 투약을 가능하게 하며, 이는 일반적으로 투약 다이알 또는 용량을 설정하기 위한 다른 기계장치를 이용하여 측정된다(예컨대, 미국특허번호 5947934호, 6074372호, 6110149호, 6524280호, 6582404호 참조). 그 후, 조성물은 펜에 부착된 미세한 바늘에 의하여 전달된다. 인슐린 펜은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국특허번호 5947934호, 4973318호, 5462535호, 5599323호, 5626566호, 5984906호, 6074372호, 6110149호, 6302869호, 6379339호 및 7241278호에 기재된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재된 것들을 포함한다. 다른 유사한 투약 장치는 예컨대 미국특허번호 5947394호, 6074372호, 6110149호 및 6379339호에 기재된 것들이 또한 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 공동-제형으로써, 또는 인슐린 조성물 및 히알루로난 분해 효소 조성물로써 별개로 중 어느 하나로 본원에서 제공되는 조성물을 투여하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 펜 또는 유사한 장치가 또한 대상체의 혈당치를 측정할 수 있는 센서 또는 모니터를 포함한다 (예컨대, WO2003047426호 참조).

본원에서 제공되는 인슐린 조성물을 전달하기 위하여 이용가능한 또는 이용되기 위하여 변형가능한 인슐린 펜 및 유사한 장치는 당업계에 널리 알려져 있으며, 상표 오토펜^® (오웬 뭄포드 사), 디세트로닉 펜 (디세트로닉 메디컬 시스템), 휴마로그^® 펜 (엘리 릴리 사), 휴마로그^® 믹스 75/25 펜 (엘리 릴리 사), 휴미린^® 70/30 펜 (엘리 릴리 사), 휴미린^® N 펜 (엘리 릴리 사), 노보로그^® 플렉스펜 (노보 노르디스크), 노보펜^® 3 (노보 노르디스크), 노보펜^® 4 (노보 노르디스크), 노보펜^® 4 (노보 노르디스크), 노보펜^® 주니어 (노보 노르디스크), 노보펜^® 믹스 70/30 플렉스펜 (노보 노르디스크), 인듀오^® (노보 노르디스크), 노보린^® 인노렛^® (노보 노르디스크), 인노보^® (노보 노르디스크), 옵티펜^® (사노피-아벤티스), 옵티펜^® 프로2 (사노피-아벤티스), 옵티셋^® (사노피-아벤티스) 및 솔로스타^® (사노피-아벤티스) 아래 시판되는 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

c. 인슐린 펌프 및 기타 인슐린 전달 장치

본원에서 제공되는 복합제형은 인슐린 전달 장치, 예를 들어 인슐린 펌프 또는 기타 유사한 연속적 주입 장치를 사용하여 당뇨병 대상에게 투여될 수 있다. 인슐린 전달 장치는, 전형적으로 인슐린 제형을 포함한 적어도 하나의 일회용 저장소, (임의의 조절장치, 소프트웨어, 처리 모듈 및/또는 배터리를 포함한) 펌프 및 피하 주사용 캐뉼라 또는 바늘을 포함한 일회용 주입 세트, 및 캐뉼라 또는 바늘을 인슐린 저장소에 연결하는 튜브를 포함한다. 본원의 방법에서 사용하기 위해, 인슐린 전달 장치는 복합제형화된 인슐린 및 히알루로난 분해 효소를 포함하는 저장소를 포함할 수 있다. 상기 복합제형은 연속적으로 및/또는 볼루스 주사로 투여될 수 있다. 더 나아가, 인슐린 전달 장치 사용자는 볼루스를 성형함으로써 인슐린의 프로파일에 영향을 주는 능력이 있다. 예를 들어, 표준 볼루스가 투여될 수 있는데, 이는 용량의 전부가 즉시 펌핑된다는 점에서 별개의 주사와 유사한 주입이다. 연장된 볼루스는 높은 초기 투여량을 피하고 조성물의 작용을 연장하는 시간에 걸친 느린 주입이다. 표준 볼루스 및 연장된 볼루스 둘 다를 포함하는 조합 볼루스 또한 인슐린 펌프 또는 다른 연속적 전달 시스템을 이용하여 투여될 수 있다. 인슐린 전달 장치는 당업계에 알려져 있고, 미국특허번호 제 6,554,798호, 6,641,533호, 6,744,350호, 6,852,104호, 6,872,200호, 6,936,029호, 6,979,326호, 6,999,854호, 7,025,743호 및 7,109,878호를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재되어 있다. 인슐린 전달 장치는 또한 글루코오스 모니터 또는 센서, 예컨대 폐쇄 루프 시스템에 연결될 수 있거나/있고, 혈당치, 식사의 탄수화물 함량 또는 다른 입력에 기초한 권장되는 인슐린 용량을 계산하는 수단을 포함할 수 있다. 추가적으로 인슐린 전달 장치는 대상체에 이식되거나, 외용될 수 있다.

d. 연속적인 주입 펌프 시스템

본원의 방법에서 사용되는 인슐린 전달 장치는 연속적인 인슐린 주입이 가능한 인슐린 펌프 또는 기타 유사한 장치를 포함한다. 개방 루프 및 폐쇄 루프 시스템을 포함하는 인슐린 전달 장치는, 전형적으로 인슐린 복합제형을 포함한 적어도 하나의 일회용 저장소, (임의의 조절장치, 소프트웨어, 처리 모듈 및/또는 배터리를 포함한) 펌프 및 피하 주사용 캐뉼라 또는 바늘을 포함한 일회용 주입 세트, 및 캐뉼라 또는 바늘을 인슐린 저장소에 연결하는 튜브를 포함한다. 폐쇄 루프 전달 장치는 추가적으로 글루코오스 모니터 또는 센서를 포함한다. 본원의 방법에서 사용하기 위해, 인슐린 전달 장치는 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 초속효성 인슐린 복합제형을 포함하는 저장소를 포함할 수 있다.

상기 인슐린 또는 초속효성 복합제형은 연속적으로 및/또는 볼루스 주사로 투여될 수 있다. 사용자는 종일 연속적으로 인슐린 제형이 꾸준히 소량을 또는 "기저"량을 공급하도록 펌프를 세팅한다. 펌프들은 또한 추가적인 ("볼루스") 용량의 인슐린 제형을 식사때 및 사용자 입력에 기초하여 혈당이 너무 높을 때 방출한다. 인슐린 용량을 결정하고 인슐린이 적절하게 전달되는 것을 보장하기 위해 빈번한 혈당 모니터링이 필수적이다. 이는 수동 모니터링, 별개의 또는 포함된 글루코오스 모니터에 의해 달성될 수 있다. 더 나아가, 인슐린 전달 장치 사용자는 볼루스를 성형함으로써 인슐린의 프로파일에 영향을 주는 능력이 있다. 예를 들어, 표준 볼루스가 투여될 수 있는데, 이는 용량의 전부가 즉시 펌핑된다는 점에서 별개의 주사와 유사한 주입이다. 연장된 볼루스는 높은 초기 투여량을 피하고 조성물의 작용을 연장하는 시간에 걸친 느린 주입이다. 표준 볼루스 및 연장된 볼루스 둘 다를 포함하는 조합 볼루스 또한 인슐린 펌프 또는 다른 연속적 전달 시스템을 이용하여 투여될 수 있다.

인슐린 전달 장치는 당업계에 알려져 있고, 미국특허번호 제 6,554,798호, 6,641,533호, 6,744,350호, 6,852,104호, 6,872,200호, 6,936,029호, 6,979,326호, 6,999,854호, 7,025,743호 및 7,109,878호를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 곳에 기재되어 있다. 인슐린 전달 장치는 또한 글루코오스 모니터 또는 센서, 예컨대 폐쇄 루프 시스템에 연결될 수 있거나/있고, 혈당치, 식사의 탄수화물 함량 또는 다른 입력에 기초한 권장되는 인슐린 용량을 계산하는 수단을 포함할 수 있다. 추가적으로 인슐린 전달 장치는 대상체에 이식되거나, 외용될 수 있다. 외부 인슐린 주입 펌프의 사용은 개인의 신중한 선택, 세심한 모니터링, 및 빈틈없는 교육을 통해 및 장기 진행 후속 조치를 요구한다. 이 주의는 일반적으로 인슐린 펌프 치료법에서 개인의 관리에서 특정한 전문적 지식 및 경험을 가진 보건 전문가의 종합적인 팀에 의해 제공된다.

i. 개방 루프 시스템

개방 루프 시스템들은 본원에서 제공되는 복합제형과 함께 사용될 수 있다. 개방 루프 시스템들은 전형적으로 인슐린 제형을 함유하는 적어도 하나의 일회용 저장소, 펌프(임의의 조절장치, 소프트웨어, 처리 모듈 및/또는 배터리를 포함함), 및 피하 주사용 캐뉼라(cannula) 또는 바늘, 및 상기 캐뉼라 또는 바늘을 인슐린 저장소에 연결하는 튜브를 포함한 일회용 주입 세트를 함유한다. 상기 개방 루프 시스템은 수 분마다 적은 (기저) 용량, 및 환자가 수동으로 설정하는 많은 (볼루스) 용량으로 주입한다. 그러나 개방 루프 시스템은 일반적으로 글루코오스 모니터 또는 센서를 함유하지 않으며, 따라서 환자의 혈청 글루코오스 수준에서의 변화에 반응하지 않을 수 있다. 혈당치를 측정하기 위해 사용되는 다양한 방법들 및 장치들이 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 그들의 혈당치를 개인적으로 모니터링하기 위한 많은 당뇨병 환자에 의해 사용되는 상기 통상적인 기법으로는 주기적인 채혈, 이러한 혈액의 시험용 스트립(test strip)에 적용, 및 열량 측정, 전기 화학적 측정 또는 광도 측정 검출을 이용한 혈당치의 결정을 들 수 있다. 다양한 장치들이 혈류 또는 간질액 내의 글루코오스와 같은 분석물질의 연속적 또는 자동적 모니터링을 위해 개발되었다. 이들 장치들의 일부는 환자의 혈관 내 또는 피하 조직 내에 직접 이식된 전기 화학적 센서를 이용한다. 글루코오스 수준을 모니터링하기 위한 예시적인 방법들 및 장치들로는 본원에서 참조로 포함된 미국 특허 번호 제 5,001,054 호, 제 5,009,230 호, 제 5,713,353 호, 제 6,560,471 호, 제 6,574,490 호, 제 6,892,085 호, 제 6,958,809 호, 제 7,299,081 호, 제 7,774,145 호, 제 7,826,879 호, 제 7,857,760 호 및 제 7,885,699 호에 개시된 것을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

인슐린 펌프와 같은 인슐린 전달 시스템들은 당업계에 공지되어 있으며, 개방 루프 시스템들에서 사용될 수 있다. 예시적인 개방 루프 인슐린 전달 장치들(상술한 것들과 같음)로는 본원에서 참조로 포함된 미국 특허 번호 제 4,562,751 호, 제 4,678,408 호, 제 4,685,903 호, 제 4,373,527 호, 제 4,573,994 호, 제 6,554,798 호, 제 6,641,533 호, 제 6,744,350 호, 제 6,852,104 호, 제 6,872,200 호, 제 6,936,029 호, 제 6,979,326 호, 제 6,999,854 호, 제 7,109,878 호, 제 7,938,797 호 및 제 7,959,598 호에 개시된 것들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 및 유사한 시스템들은 당해 기술분야의 숙련자에 의해 용이하게 확인 가능한 것으로, 본원에서 제공되는 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 인슐린 전달 장치들은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 저장소를 포함하며, 여기서 상기 저장소는 일반적으로 일회용이며, 본원에서 기술된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형과 같은 인슐린 제제를 포함한다. 일부 예에서, 상기 복합제형은 주입 튜브 및 캐뉼라 또는 바늘을 이용하여 전달된다. 다른 예에서, 상기 주입 장치는 피부에 직접 부착되어 있고, 상기 복합제형은 캐뉼라 또는 바늘을 통해 주입 장치로부터 신체 내로 튜브의 사용 없이 직접 흐른다. 추가적인 예에서, 상기 주입 장치는 신체 내에 있으며, 주입 튜브는 선택적으로 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있다.

ii. 폐쇄 루프 시스템

종종 인공 췌장으로도 지칭되는 폐쇄 루프 시스템들은 본원에서 제공된 복합제형과 함께 사용하기 위해서 특히 관심이 있다. 폐쇄 루프 시스템들은 통합된 연속적인 글루코오스 모니터, 인슐린 펌프 또는 기타 전달 시스템, 및 혈당치의 실시간 측정에 기초하여 혈당 조절을 위한 요구되는 인슐린의 주입을 끊임없이 계산하는 수학적 알고리즘을 포함하는 제어기가 구비된 시스템들을 지칭한다. 이러한 시스템들은 최적화될 때, 건강한 비당뇨병 환자 대상체에서 관찰되는 천연 인슐린 반응 및 혈당 조절과 유사한, 일정하고 매우 엄격한 혈당 조절을 용이하게 할 수 있다. 그러나 효과적이기 위해서는 폐쇄 루프 시스템들은 신뢰 가능하고 정확한 연속적인 글루코오스 모니터, 및 매우 빠른 작용을 갖는 인슐린의 전달 둘 다를 요구한다. 예를 들어, 속효성 인슐린의 피하 전달과 관련된 인슐린 흡수 및 작용에 있어서의 지연은 큰 식후 혈당 변동폭을 야기할 수 있다(Hovorka 등, (2006) Diabetic Med. 23: 1-12). 인슐린 흡수, 인슐린 작용, 간질 글루코오스 동력학, 및, 미세투석 기법에 기초한 시스템과 같은 생체 외 기반 모니터링 시스템들에 대한 수송 시간 때문에 지연은 인슐린의 전달 시간으로부터 이의 검출 가능한 글루코오스 저하 효과의 피크까지 총 100분 이상의 시간 지체를 초래할 수 있다(Hovorka 등, (2006) Diabetic Med . 23: 1-12). 따라서 일단 투여되면 인슐린은 거의 2시간 동안 이의 측정 가능한 효과를 계속해서 증가시킬 것이다. 이는 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 식사 섭취 이후에 글루코오스 농도의 효과적인 저하를 복잡하게 할 수 있다. 먼저, 글루코오스 증가는 검출되어야 한다. 그러나 이는 전형적으로 대략 10분 내지 40분 지체 이후에만 일어난다. 상기 시스템은 음식이 소화되었다는 것을 결정해야 하고, 적절한 용량의 인슐린을 투여해야 한다. '잘못 판단된' 인슐린 용량에 대해 후속적으로 보상하기 위한 시스템의 능력은 장기간 지연, 및 일단 투여된 경우에 인슐린을 '회복'하는데 있어서의 불능에 의해 절충된다. 이러한 문제점은, 적어도 부분적으로는 본원에서 제공된 것들과 같은 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형을 이용하여 극복될 수 있으며, 상기 복합제형은 증가된 흡수 비율 및 수준, 및 약력학에서의 연관된 향상을 나타낼 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제 US2009-0304665 호, 및 PCT 국제 공개 제 WO2009134380 호 참조). 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 속효성 인슐린 단독에 비해 감소된 t_max(즉 더 빠르게 최대 농도를 달성함)를 가지며, 속효성 인슐린 단독보다 빠르게 혈당치를 조절하기 시작한다. 이러한 작용의 개시 및 흡수의 증가된 비율은 인슐린 작용과 글루코오스 모니터링 및 입력 사이의 지체를 감소시키며, 그 결과 혈당치를 더욱 엄격하게 조절하여 혈당 변동을 감소시킬 수 있는 더욱 효과적인 폐쇄 루프 시스템을 제공한다.

폐쇄 루프 시스템들은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에서 참조로 포함된 미국 특허 번호 제 5,279,543 호, 제 5,569,186 호, 제 6,558,351 호, 제 6,558,345 호, 제 6,589,229 호, 제 6,669,663 호, 제 6,740,072 호, 제 7,267,665 호, 제 7,354,420 호 및 제 7,850,674 호를 포함하는 문헌에 개시되어 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당해 기술분야의 숙련자에 의해 용이하게 확인 가능한 이들 및 유사한 시스템들은 본원에서 제공되는 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 폐쇄 루프 시스템들은 혈당치를 측정하기 위한 센서 시스템, 제어기 및 전달 시스템을 포함한다. 이러한 통합된 시스템은 신체 내에서 혈당 농도의 변화에 반응할 때 완전히 기능을 하는 인간 β-세포에 의해 생성될 것인 바와 같이 유사한 농도 프로파일로 인슐린을 대상체 내로 전달하기 위해 주입 장치를 제어하도록 췌장 베타 세포(β 세포)를 모델링하도록 설계된다. 따라서 상기 시스템은 인슐린이 신체 대사 및 유사분열 촉진(mitogenic) 효과 둘 다를 갖기 때문에 혈당치에 대한 신체의 천연 인슐린 반응을 모방하며, 인슐린의 효율적인 이용을 만들 뿐만 아니라 기타 신체 기능도 또한 설명한다. 또한 폐쇄 루프 시스템을 이용하여 달성된 혈당 조절은 식사의 크기 및 시점, 또는 기타 인자에 관한 임의의 정보를 요구하지 않고 달성된다. 상기 시스템은 실시간 혈당 측정에만 의존할 수 있다. 글루코오스 센서는 신체 내의 혈당치를 나타내는 센서 신호를 생성하고, 상기 센서 신호를 제어기에 제공한다. 상기 제어기는 센서 신호를 수신하고, 인슐린 전달 시스템과 통신하는 명령을 생성한다. 상기 인슐린 전달 시스템은 명령을 수신하고, 상기 명령에 반응하여 신체 내로 인슐린을 주입한다. 본원에서 제공된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있는 폐쇄 루프 시스템들의 예시적인 구성요소들에 대한 설명이 하기에 제공된다. 당해 기술분야의 숙련자는 복합제형과 함께 사용하기에 적합한 폐쇄 루프 시스템들을 용이하게 확인할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 시스템들은 미국 특허 번호 제 5,279,543 호, 제 5,569,186 호, 제 6,558,351 호, 제 6,558,345 호, 제 6,589,229 호, 제 6,669,663 호, 제 6,740,072 호, 제 7,267,665 호 및 제 7,354,420 호에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않은 당해 기술분야에 개시되어 있다. 상기 시스템들의 개개의 구성요소들은 또한 개별적으로 및 혈당 제어를 달성하는데 사용하기 위한 폐쇄 루프 시스템의 내용에 당해 기술분야에 개시되어 있다. 본원에서 제공된 실시예는 단지 예시적이며, 기타 폐쇄 루프 시스템들 또는 개별 구성요소들은 본원에서 제공된 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

폐쇄 루프 시스템들은 연속적으로 기능을 하는 글루코오스 센서 또는 모니터를 함유한다. 이러한 장치들은 바늘형 센서를 포함할 수 있으며, 상기 센서는 피부 아래로 삽입되며, 무선 주파수 원격 측정법(radiofrequency telemetry)에 의해 무선으로 글루코오스 데이터를 소형 수신기와 통신하는 소형 송신기(transmitter)에 부착된다. 일부 예에서, 상기 센서는 삽입 바늘을 이용하여 대상체의 피부를 통해 삽입되며, 상기 삽입 바늘은 일단 상기 센서가 피하 조직에 위치하게 되면 제거되고 폐기된다. 상기 삽입 바늘은 피부 내로의 삽입 도중에 상기 센서를 유지하기 위해 날카로운 첨단부(tip) 및 개방형 구멍을 가진다(예를 들어,미국 특허 번호 제 5,586,553 호 및 제 5,954,643 호 참조). 상기 폐쇄 루프 시스템에 사용된 센서는 선택적으로 피하 조직내 간질액(ISF)에 노출되는 3개의 전극을 함유할 수 있다. 상기 3개의 전극은 회로를 형성하기 위해 사용되는 작업 전극, 기준 전극 및 상대 전극을 포함한다. 적절한 전압이 작업 전극 및 기준 전극을 가로질러 공급되는 경우, ISF는 상기 전극들 사이에 임피던스(impedance)를 제공한다. 아날로그 전류 신호는 신체를 통해 작업 전극에서 상대 전극으로 흐른다. 작업 전극에서의 전압은 일반적으로 접지 전압을 유지하며, 기준전극에서의 전압은 설정 전압(Vset), 예컨대 예를 들어 300㎷ 및 700㎷ 사이의 전압으로 유지될 수 있다. 상기 전극들 사이의 전압 차이에 의해 자극되는 가장 두드러진 반응은 먼저 이것이 글루코오스 산화효소(GOX)와 반응하여 글루콘산 및 과산화수소(H₂O₂)를 생성하는 글루코오스의 환원이다. 그 후, H₂O₂는 작업 전극의 표면에서 물(H₂O) 및 (O^―)로 환원된다. O^―는 센서 전기적 구성요소들로부터 양전하를 이끌고, 따라서 전자를 밀어내고, 전류 흐름을 야기한다. 이는 센서 전극과 접촉하는 ISF 내의 글루코오스의 농도에 비례하는 아날로그 전류 신호가 초래한다(예를 들어 미국 특허 번호 제 7,354,420 호 참조).

일부 예에서, 하나 이상의 센서가 혈당을 측정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 중복되는 센서가 사용될 수 있으며, 한 센서가 실패시 원격 계측(telemetering)된 특징 모니터 송신기 전자장치에 의해 대상체에 통지될 수 있다. 지시기(indicator)는 또한 대상체에게 어떤 센서가 여전히 기능하고 있는지, 및/또는 여전히 기능하는 센서의 개수를 알려줄 수 있다. 다른 예에서, 센서 신호는 평균화 또는 기타 수단을 통해 조합된다. 또한, 상이한 유형의 센서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 내부 글루코오스 센서 및 외부 글루코오스 센서가 혈당을 동시에 측정하기 위해 사용될 수 있다.

폐쇄 루프 시스템에서 사용될 수 있는 글루코오스 센서는 널리 공지되어 있으며, 용이하게 확인 가능하며, 선택적으로 당해 기술분야의 숙련자에 의해 추가로 변형될 수 있다. 예시적인 내부 글루코오스 센서로는 미국 특허 번호 제 5,497,772 호, 제 5,660,163 호, 제 5,791,344 호, 제 5,569,186 호, 및 제 6,895,265 호에 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 형광을 이용하는 글루코오스 센서의 예시적인 예로는 미국 특허 제 6,011,984 호에 개시된 것이 있다. 글루코오스 센서 시스템들은 또한 광선, 전도도, 제트 샘플링(jet sampling), 미세 투석, 미세 천공(microporation), 초음파 샘플링(ultrasonic sampling), 역이온 도입(reverse iontophoresis), 또는 기타 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,433,197 호 및 제 5,945,676 호, 및 PCT 국제 공개 번호 제 WO199929230 호)를 포함한 기타 감지 기술을 이용할 수 있다. 일부 예에서, 상기 작업 전극만이 피하 조직 내에 그리고 ISF와 접촉하여 위치하고, 상기 상대 전극 및 기준 전극은 신체 외부에 그리고 피부와 접촉하여 위치한다. 상기 상대 전극 및 기준 전극은 모니터 하우징의 표면 상에 위치할 수 있으며, 원격 계측된 특징 모니터의 일부로서 피부에 유지될 수 있다. 추가적인 예에서, 상기 상대 전극 및 기준 전극은 다른 장치를 이용하여, 예컨대 전선을 전극에 전개하고 피부에 상기 전극을 테이핑하고, 피부와 접촉하고 있는 시계의 밑면 상에 전극을 통합시키는 것을 이용하여 피부에 유지한다. 더 나아가, 하나 초과의 작업 전극이 중복하여 피하 조직 내에 위치될 수 있다. 간질액은 또한 대상체의 신체로부터 수확할 수 있으며, 신체에 이식되지 않은 외부 센서 상을 흐를 수 있다.

상기 제어기는 글루코오스 센서로부터 입력을 수신한다. 상기 제어기는 췌장 베타 세포(β 세포)를 모델링하고, 혈당 조절을 위한 인슐린의 요구량을 주입하기 위해 인슐린 전달 장치에 명령어들을 제공하도록 설계된다. 상기 제어기는 글루코오스 센서에 의해 검출된 글루코오스 수준에 기초하여 인슐린의 요구량을 계산하기 위한 알고리즘을 갖는 소프트웨어를 활용한다. 예시적인 알고리즘은 얼마나 많은 양의 인슐린이 전달되는지와 무관하게 신체 내에서 글루코오스 변동(glucose excursion)을 최소화하기 위해 설계된 알고리즘이 과도한 체중 증가, 고혈압 및 죽상 동맥 경화증을 야기할 수 있기 때문에 β-세포를 가깝게 모델링하는 알고리즘을 포함한다. 전형적으로, 상기 시스템은 생체 내 인슐린 분비 패턴을 모방하고 정상의 건강한 개인에 의해 경험되는 생체 내 β 세포 순응과 부합하는 이러한 패턴을 조정하도록 의도된다. 폐쇄 루프 시스템들에 유용한 제어 알고리즘은 비례 적분 미분(proportional-integral-derivative, PID) 제어기에 의해 활용되는 것들을 포함한다. 비례 미분 제어기들 및 모델 예측 제어(model predictive control, MPC) 알고리즘은 또한 일부 시스템들에서 사용될 수 있다(Hovorka 등 (2006) Diabetic Med. 23:1-12). 예시적인 알고리즘으로는 Hovorka 등(Diabetic Med . (2006) 23: 1-12), Shimoda 등(Front Med Biol Eng (1997) 8: 197-211), Shichiri 등(Artif . Organs (1998) 22: 32-42), Steil 등(Diabetes Technol Ther (2003) 5: 953-964), Kalatz 등(Acta Diabetol . (1999) 36:215), 미국 특허 번호 제 5,279,543 호, 제 5,569,186 호, 제 6,558,351 호, 제 6,558,345 호, 제 6,589,229 호, 제 6,740,042 호, 제 6,669,663 호, 제 6,740,072 호, 제 7,267,665 호 및 제 7,354,420 호 및 미국 특허 공개 번호 제 20070243567 호에 개시된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일 예에서, PID 제어기는 폐쇄 루프 시스템에서 활용된다. PID 제어기는 3개의 관점: 즉 목표 글루코오스로부터의 출발(비례 구성요소), 주위 글루코오스와 목표 글루코오스 사이의 곡선 하의 면적(적분 구성요소), 및 주위 글루코오스에서의 변화(미분 구성요소)로부터 글루코오스 변동을 평가함으로써 연속적으로 인슐린 주입을 조정한다. 일반적으로, 글루코오스 변화에 대한 생체 내 β 세포 반응은 "제 1" 및 "제 2" 상 인슐린 반응에 의해 특징지어진다. β 세포의 2-상(biphasic) 인슐린 반응은 비례, 더하기 적분, 더하기 미분(PID) 제어기의 구성요소들을 이용하여 모델링될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 7,354,420 호 참조).

상기 제어기는 원하는 인슐린 전달을 위한 명령을 생성한다. 인슐린 펌프들과 같은 인슐린 전달 시스템들은 당업계에 공지되어 있으며, 폐쇄 루프 시스템에 사용될 수 있다. 예시적인 인슐린 전달 장치들(예를 들어, 상술한 것들)로는 미국 특허 번호 제 4,562,751 호, 제 4,678,408 호, 제 4,685,903 호, 제 4,373,527 호, 제 4,573,994 호, 제 6,554,798 호, 제 6,641,533 호, 제 6,744,350 호, 제 6,852,104 호, 제 6,872,200 호, 제 6,936,029 호, 제 6,979,326 호, 제 6,999,854 호 및 제 7,109,878 호에 개시된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 전달 장치들은 전형적으로 본원에서 개시된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형과 같은 인슐린 제제를 함유하는, 일반적으로 일회용인 하나 이상의 저장소들을 함유한다. 일부 예에서, 상기 복합제형은 주입 튜브 및 캐뉼라 또는 바늘을 이용하여 전달된다. 다른 예에서, 상기 주입 장치는 피부에 직접 부착되며, 상기 복합제형은 튜브의 사용 없이 주입 장치로부터 캐뉼라 또는 바늘을 통해 신체 내로 직접 흐른다. 추가적인 예에서, 상기 주입 장치는 신체 내부에 있으며, 주입 튜브는 선택적으로 상기 복합제형을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 또한 폐쇄 루프 시스템들은 필터, 보정기(calibrator) 및 송신기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 부가적인 구성요소들을 함유할 수 있다.

H. 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소 및 이의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 생산하는 방법

본원에 기재된 인슐린 및 히알루로난 분해효소의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대한 해당 기술분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 획득될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 인슐린의 A-사슬 및 B-사슬이 화학적으로 합성된 후, 예를 들어 환원-재산화 반응을 통해 이황화 결합에 의해 가교될 수 있다. 폴리펩티드가 재조합 수단에 의해 생산될 때, 원하는 유전자를 코딩하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 원료로부터, 히알루로니다아제를 코딩하는, 전장(즉, 전체 코딩 영역을 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 획득할 수 있다. 변형된 또는 변이체 인슐린 또는 히알루로난 분해 효소는, 예컨대 위치-지정 돌연변이생성법(site-directed mutagenesis)에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 제작될 수 있다.

폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업자에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 이러한 방법들은 핵산의 PCR 증폭, 및 핵산 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 라이브러리 스크리닝을 포함한다.

예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 핵산 함유 물질은 원하는 폴리펩티드-코딩 핵산분자가 분리될 수 있는 출발 물질로써 사용될 수 있다. 예를 들어, 건강한 대상체 및/또는 병에 걸린 대상체로부터의 DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 조직추출물, 액체시료(예컨대, 혈액, 혈청, 타액), 및 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로써 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현된 서열을 기초로 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기초로 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산분자를 서열분석하여 원하는 폴리펩티드를 코딩하는지 확인할 수 있다.

벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터, 또는 DNA 서열을 코딩하는 코어 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커서열을 포함하는 폴리펩티드-코딩 핵산분자에 추가적인 뉴클레오티드 서열이 합쳐질 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정화하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-코딩 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 세포 내 단백질 발현을 용이하게 하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하도록 설계된 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 서열은 당업자에 알려져 있다. 추가적인 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합 영역을 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 이러한 영역은 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 용이하게 하거나 코딩하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변경시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효소는 PEG 모이어티에 연결될 수 있다.

또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위해 태그 또는 다른 모이어티가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 뉴클레오티드 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 기타 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열이 또한 효소-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 54) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호 55)를 코딩하는 핵산서열을 포함한다.

그 다음 확인되고 분리된 핵산이 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포에 양립가능(compatible)해야만 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터 내로의 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 단편을 접합함으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다. 만약 DNA 단편화에 사용된 상보적 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 접합함으로써 원하는 임의의 부위가 생산될 수 있다; 이러한 접합된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 코딩하는, 특정한, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 동일중합체 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 많은 복제의 유전자 서열을 생성하도록 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입될 수 있다.

인슐린은 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어 Ladisch 등(1992) Biotechnol . Prog . 8:469-478). 일부 예에서, 프레프로인슐린(preproinsulin) 또는 프로인슐린(proinsulin) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입된다. 발현시, 프레프로인슐린 또는 프로인슐린 폴리펩티드는 신호서열 및/또는 C 펩티드를 절단하는 효소적 또는 화학적 방법에 의해 인슐린으로 전환되어, 예를 들어 환원-재산화 반응에 의해, 이황화 결합을 통해 가교되는 A- 및 B- 사슬을 야기한다(예컨대 Cousens et al., (1987) Gene 61:265-275, Chance et al., (1993) Diabetes Care 4:147-154 참조). 또 다른 예에서, 인슐린의 A-사슬 및 B-사슬을 코딩하는 핵산은 하나의 발현 벡터로부터의 단일 폴리펩티드로서 공동-발현을 위해 또는 하나 또는 두개의 발현 벡터들로부터의 두 폴리펩티드로서 발현을 위해 하나 또는 두 개의 발현 벡터 내로 삽입된다. 그러므로, A- 및 B-사슬 폴리펩티드는 별도로 발현된 후 조합되어 인슐린을 생성할 수도 있고, C 사슬의 부재하에서 공동-발현될 수도 있다. A- 및 B- 사슬이 단일 폴리펩티드로서 공동-발현되는 예에서, 서브유닛들을 코딩하는 핵산은 하기 기술되는 링커 또는 스페이서와 같은 B-사슬 및 A-사슬 사이의 링커 또는 스페이서(spacer) 또한 코딩할 수 있다. 발현 벡터 내로 삽입된 핵산은, 예를 들어, 인슐린 B-사슬을 코딩하는 핵산, 링커, 예컨대 예를 들어 알라닌-알라닌-리신 링커, 및 A-사슬을 함유하여, 예를 들어 "인슐린 B-사슬-Ala-Ala-Lys-인슐린 A 사슬"의 발현을 야기할 수 있다.

특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA, 또는 합성된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환하는 것은 유전자의 다중 복제의 생성을 가능하게 한다. 그러므로, 형질전환체를 성장시키고, 그 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우, 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 유전자는 대량으로 수득될 수 있다.

1. 벡터 및 세포

하나 또는 그 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 단백질의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산이 적절한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수적인 전사 및 번역 신호가 또한 효소 유전자용 천연의 프로모터, 및/또는 이들의 측면영역(flanking sequence)에 의해 제공될 수 있다.

또한 효소를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 벡터는 그 안에 사용하기 적합한 임의의 벡터이다.

상기 벡터를 함유하는, 내피세포를 포함하는, 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 이러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 코딩된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회복함으로써, 이의 단백질을 생산하도록 상기 세포가 이용된다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 효소가 배지 내로 분비될 수 있다.

천연의 또는 이종의 신호 서열에 연결된, 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 다중 복제를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 세포 내 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다.

다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 기타 바이러스)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 포함하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다양하다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.

DNA 단편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 포함하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내에서 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. 상기 유전자 및 이의 단편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주 내에서 발현될 수 있도록, 단백질, 또는 도메인, 이들의 유도체, 단편, 또는 동족체(homologs)를 코딩하는 핵산의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 포함된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)); 원핵생물 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 등,(1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 Scientific American 242:79-94(1980) 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 포함하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 등, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 등, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 광합성효소 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 유전자이식(transgenic) 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절영역: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절영역(Swift 등, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절영역(Hanahan 등, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절영역(Grosschedl 등, Cell 38:647-658(1984); Adams 등, Nature 318:533-538(1985); Alexander 등, Mol . Cell Biol . 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절영역(Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절영역(Pinkert 등, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf 등, Mol . Cell. Biol . 5:1639-1648(1985)); Hammer 등, Science 235:53-58 1987), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절영역(Kelsey 등, Genes and Devel . 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로빈 유전자 조절영역(Magram 등, Nature 315:338-340(1985); Kollias 등, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절영역(Readhead 등, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절영역(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).

특정 구현예에서, 원하는 단백질 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 선택적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는, 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜성 결합부위(RBS Ⅱ), 6XHis 태그 코딩서열, t₀ 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단 중 어느 하나에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 이러한 플라스미드는 세 개의 판독프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국 특허 번호 제 4,952,496호 참조; NOVAGEN, Madison, WI 에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 이러한 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 함유하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 칼럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-Tag™ 리더서열 및 칼럼을 통한 정제 후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b 및 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)을 포함한다.

포유류 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 영역(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐화 신호(SV40)를 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech) 유래의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.

2. 링커 모이어티(moiety)

일부 예에서, 인슐린은, 예를 들어 B-사슬의 C 말단이 짧은 링커에 의해 A-사슬의 N 말단에 결합되도록 링커를 갖는 A-사슬 및 B-사슬 폴리펩티드들을 생성함으로써 제조된다. A-사슬 및 B-사슬은 링커를 함유하는 단일한 폴리펩티드로부터 발현될 수 있거나, 개별적으로 발현되어 링커에 의해 결합될 수 있다. 링커 모이어티는 원하는 특성에 따라 선택된다. 상기 링커 모이어티는 A-사슬 및 B-사슬이 인슐린의 천연의 공간배좌를 모방하도록 하기 위해 충분히 길어야 하며, 충분히 신축성이 있어야 한다.

링커는 인슐린 A-사슬 및 B-사슬에 적합한 임의의 모이어티일 수 있다. 이러한 모이어티는 펩티드 결합; 전형적으로 1개 및 약 60개 사이의 아미노산들을 포함하는 아미노산 및 펩티드 결합; 및 이종 2기능성 절단 가능한 가교-링커, 광절단 가능한 링커 및 산 절단 가능한 링커와 같은 화학적 링커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 링커 모이어티는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 전형적으로 약 2개 내지 약 60개 사이의 아미노산 잔기들, 예를 들어 약 5개 내지 약 40개, 또는 약 10개 내지 약 30개의 아미노산 잔기들을 갖는다. 펩티드 링커는 편리하게 핵산에 의해 코딩되고, E. coli와 같은 숙주 세포에서의 발현 시 융합 단백질들에 혼입될 수 있다. 일 예에서, 알라닌-알라닌-리신(AAK)(서열번호 178) 링커는 발현 시에 "인슐린 B-사슬-AAK-인슐린 A-사슬" 폴리펩티드가 생성되도록 인슐린 B-사슬을 코딩하는 핵산과 A-사슬을 코딩하는 핵산 사이의 핵산에 코딩된다. 펩티드 링커는 단일-사슬 항체 연구에서 공지된 것과 같은 신축성있는 스페이서 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 공지된 링커 모이어티의 예로는 RPPPPC(서열번호 166) 또는 SSPPPPC(서열번호 167), GGGGS(서열번호 168), (GGGGS)_n(서열번호 169), GKSSGSGSESKS(서열번호 170), GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 171), GSTSGSGKSSEGSGSTKG(서열번호 172), GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 173), GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 174), EGKSSGSGSESKEF(서열번호 175), SRSSG(서열번호 176) 및 SGSSC(서열번호 177)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

대안적으로, 상기 펩티드 링커 모이어티는 VM(서열번호 179) 또는 AM(서열번호 180)일 수 있거나, 화학식: AM(G_{2 to 4}S)_xAM에 의해 기술된 구조를 가지며, 상기 식에서 X는 1 내지 11의 정수이다(서열번호 181). 추가적인 연결 모이어티는, 예를 들어 Huston 등 (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 85: 5879-5883; Whitlow, M. 등, (1993) Protein Engineering 6: 989-995; Newton 등, (1996) Biochemistry 35: 545-553; A. J. Cumber 등, (1992) Bioconj . Chem . 3:397-401; Ladurner 등, (1997) J. Mol . Biol . 273: 330-337) 및 미국 특허 번호 제 4,894,443 호에 기술되어 있다.

일부 예에서, 펩티드 링커는 핵산에 의해 코딩되며, E. coli 또는 S. 세레비제와 같은 숙주 세포에서 발현 시 B-사슬과 A-사슬 사이에 혼입된다. 다른 예에서, 펩티드 링커는 화학적 방법들에 의해 합성된다. 이는 A-사슬 및 B-사슬 중 하나 이상의 합성에 대한 개별 프로토콜로 수행될 수 있으며, 그 이후에, 예를 들어 이종 2기능성 링커의 사용과 함께 상기 구성요소들은 합쳐진다. 대안적으로, 펩티드 링커는 인슐린 사슬들 중 하나의 N- 또는 C-말단에서 합성될 수 있으며, 이는 이어서 이종 2기능성 링커와 같은 펩티드 링커와 함께 다른 사슬에 연결된다.

당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 링커는 인슐린 A-사슬과 B-사슬을 연결하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 사슬을 화학적으로 연결하기에 적합한 링커 및 결합들로는 아민기 및 티올기와 같은 유리 반응성기들 사이의 이황화 결합, 티오에테르 결합, 저해된(hindered) 이황화 결합, 및 공유결합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 결합은 폴리펩티드들 중 하나 또는 둘 모두 상에 반응성 티올기를 생성하기 위해 이종 2기능성 시약을 사용한 후, 반응성 말레이미도기 또는 티올기들이 서로 부착할 수 있는 반응성 티올기 또는 아민기와 하나의 폴리펩티드 상의 티올기가 반응하여 생성된다. 기타 링커로는 보다 산성인 세포 내 구획에서 절단될 것인 비스말레이미드오톡시 프로판, 산분해성 트랜스페린 접합체 및 아디프산 디히드라지드와 같은 산 절단 가능한 링커; 인간 IgG1의 불변 영역으로부터의 다양한 도메인, 예를 들어 CH1, CH2 및 CH3와 같이 UV 또는 가시광선에 노출 시에 절단되는 가교-링커를 포함한다(Batra 등, (1993) Molecular Immunol . 30: 379-386 참조). 일부 구현예에서, 몇몇 링커는 각 링커의 원하는 특성을 이용하기 위해 포함될 수 있다. 화학적 링커 및 펩티드 링커는 상기 링커를 인슐린의 A-사슬 및 B-사슬에 공유결합에 의해 연결함으로써 삽입될 수 있다. 하기에서 기술되는 이종 2기능성 제제는 이러한 공유결합에 의해 연결을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 또한 B-사슬과 A-사슬 사이의 링커를 코딩하는 DNA를 발현함으로써 연결될 수 있다.

인슐린의 A-사슬과 B-사슬을 결합시키기 위해 사용될 수 있는 기타 링커로는: 효소 기질들, 예를 들어 카텝신(cathepsin) B 기질, 카텝신 D 기질, 트립신 기질, 트롬빈 기질, 섭틸리신(subtilisin) 기질, 인자 Xa 기질, 및 엔테로키나아제 기질이 포함되며, 가용성, 유연성, 및/또는 세포 내 절단성을 증가시키는 링커로는 (gly_mser)_n 및 (ser_mgly)_n과 같은 링커가 포함되며, 여기서 m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 2 내지 4이고, n은 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 4이다(예를 들어, 예시적인 링커를 제공하고 있는 국제 PCT 공개 번호 제 WO96/06641호 참조). 일부 구현예에서, 몇몇 링커들은 각 링커의 원하는 특성을 이용하기 위해 포함될 수 있다.

3. 발현

인슐린 및 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드들은 생체 내 및 시험관 내 방법들을 포함하는 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 원하는 단백질은, 예컨대 예를 들어 투여 및 치료를 위해 필요한 단백질의 형태 및 요구되는 양을 생산하기에 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주로는 E. coli, 효모, 식물, 곤충 세포, 및 인간 세포주를 포함하는 포유류 세포 및 형질전환 동물과 같은 원핵 및 진핵 유기체를 포함한다. 발현 숙주는 발현된 단백질 상에 존재하는 번역 후 변형의 유형뿐만 아니라 이들의 단백질 생성 수준에 대해 다를 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이들 및 기타 인자, 예를 들어 조절 및 안전의 고려, 생산 비용 및 정제 필요성 및 정제 방법들에 기초하여 이루어질 수 있다.

많은 발현 벡터들이 이용 가능하고 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있으며 단백질들의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받을 것이다. 일반적으로, 발현 벡터들은 전사 프로모터, 및 선택적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환을 위해 사용되는 발현 벡터들은 전형적으로 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 허용하는 선별마커를 갖는다. 일부 경우에, 복제 기점은 상기 벡터의 복제수를 증폭하기 위해 사용될 수 있다.

가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드들은 또한 단백질 융합체들로서 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소 융합체는 효소에 부가적인 기능성을 부가하기 위해 생성될 수 있다. 효소 융합 단백질들의 예로는 신호 서열, 예를 들어 his₆ 태그 또는 myc 태그와 같은 국소화용 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합체, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하기 위한 서열의 융합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

a. 원핵세포

원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 포함할 수 있고, 이러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.

단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 요소가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사 및 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 함유하며, 가용성 단백질의 생산으로 이어질 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내의 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자로부터의 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 가용성 및 리폴딩(refolding)을 용이하게 하기 위해 변성화제와 환원제가 사용될 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 가용성에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코실화가 추가될 수 있다.

b. 효모 세포

효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 이러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 대개 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라제와의 공동-발현은 발현수준 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제 유래의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 지시될 수 있다. 예컨대 Kex-2 프로테아제를 위한 프로테아제 절단부위는 그들이 분비경로를 탈출 시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.

c. 곤충세포

특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로니다아제의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 조절 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 처리되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.

곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.

d. 포유동물 세포

포유류 발현 시스템은 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 포함하는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(construct)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 전기천공과 미세주사와 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 전달시킬 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(Kozak 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 영역이 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 영역의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.

마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol . Bioeng . 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특별 배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.

e. 식물

유전자 이식 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot), 예컨대 벼와 옥수수로 나뉜다. 발현을 위한 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 유전자 이식 식물세포는 또한 히알루로니다아제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 상이한 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.

4. 정제기법

숙주세포로부터, 인슐린 및 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 유전자 이식 유기체, 예컨대 유전자 이식 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발물질로써 사용될 수 있다. 또한, 유전자 이식 동물 생산은 젖 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.

단백질, 예컨대 인슐린 폴리펩티드 또는 히알루로난 분해효소 폴리펩티드는가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기법을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기법 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 히알루로니다아제 효소에 결합하는 기타 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질에 대한 친화성 태그, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His₆를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔전기영동, 직교(orthogonal) HPLC 방법, 염색 및 분광광도기법을 포함한, 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다.

I. 안정성 및 활성의 평가 방법

분석은, 본원에서 제공된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소를 함유하는 복합제형을 포함하는, 본원에서 제공된 제형 또는 복합제형의 안정성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석은 히알루로난 분해 효소의 안정성 및 활성, 및/또는 복합제형 중의 속효성 인슐린의 안정성, 활성 및 가용성을 평가할 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어, 보관 이전 및 그 이후의 다양한 시점에 활성, 가용성, 및 안정성(예를 들어, 집괴의 형성 등)을 평가함으로써 특정 보관 온도 및 조건에서 시간의 경과에 따라 복합제형의 안정성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한 상기 분석은 활성제 둘 모두의 안정성을 유지하면서 본원에서 제공된 제형에 대해 약간 조정하여 사용될 수 있다.

1. 인슐린

본원에서 제공된 인슐린 복합제형의 안정성 및 가용성은 당업계에 널리 공지된 방법 및 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 안정성 및 가용성은 시각 평가, 산 정화(acid clarification), 광학 현미경법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 생체 내 생검들 및 변성 및 비-변성 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 평가될 수 있다. 일 실시예에서, 인슐린 가용성 및 안정성은 색변화를 포함한 시각 평가, 투명도, 집괴 또는 응집의 존재, 및 본원에서 제공된 복합제형을 함유하는 용기에 대한 재료의 부착 또는 결빙에 의해 결정된다. 시각적 변화는 산 정화에 의해 확인되며, 이때 산성화 이후의 분산의 결여로 인해 본원에서 제공된 복합제형에 불용성의 변성된 인슐린의 존재가 확인된다. 본원에서 제공된 복합제형 중의 인슐린에서의 시각적 변화는 또한 형광 역광 조명을 이용하는 광학 현미경법 및/또는 현미경법에 의해 확인될 수 있다. 본원에서 제공된 복합제형 중의 속효성 인슐린의 겉보기 용해도는, 예를 들어 실시예 3에 개시된 바와 같은 RP-HPLC에 의해 평가될 수 있다. 실시예 3 개시된 방법들에서, 겉보기 용해도는 다양한 조건 하에 다양한 시점에 저장 이후의 인슐린 회복(%) 및/또는 활성으로서 측정된다. 회복(%) 및/또는 활성은 참고용 시료와 비교하여 결정된다. 게다가. 데사미도 인슐린(desamido insulin)과 같은 인슐린 분해 산물들은 RP-HPLC에 의해 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 본원에서 제공된 복합제형에서의 인슐린 안정성은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 집괴의 형성을 측정함으로써 평가된다(예를 들어, 실시예 4 참조). 이러한 실시예에서, SEC는 고분자량 단백질, 즉 집괴의 존재를 결정하기 위해 사용된다.

인슐린 활성은 또한 당업계에 널리 공지된 방법 및 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료제로서 작용하는 인슐린 조성물들 및 복합제형을 포함하는 인슐린의 능력은 시험관 내 또는 생체 내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 시험관 내 분석은 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린의 능력을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 경쟁적 결합 분석은 수행되며, 상기 분석에서는 인간 태반 세포 멤브레인을 인슐린 수용체의 공급원으로서 제조하고, 라벨링되지 않은 인슐린 유사체의 존재 또는 부재 하에 방사성 라벨링된 인간 인슐린과 함께 배양한다. 이어, 결합된 방사성 라벨링된 인슐린의 양은 결합을 위해 경쟁하는 인슐린 유사체의 능력을 결정하기 위해 검출되며, 태반 인슐린 수용체에 대한 인슐린 유사체의 상대적인 친화도가 계산된다(예를 들어, Weiss 등, (2001) J. Biol. Chem . 276:40018-40024). 인슐린 수용체를 천연 또는 재조합에 의해 발현하는 기타 세포를 포함한 인슐린 수용체의 기타 공급원들은 또한 이러한 경쟁적 결합 분석에서 사용될 수 있다(Duttaroy 등, (2005) Diabetes 54:251-258).

글루코오스 흡수를 자극하고 이의 임의의 기타 전형적인 물질대사 결과를 달성하는 인슐린의 능력은 시험관 내에서 평가될 수 있다. 인슐린 자극 글루코오스 흡수를 측정하기 위해, 지방세포를 인슐린의 존재 및 부재 하에 2-데옥시-D-[2,6-³H]글루코오스 또는 D-[U-¹⁴C]글루코오스와 같은 라벨링된 글루코오스와 함께 배양한다. 이어, 혼입된 방사능은 인슐린의 존재 및 부재 하에 글루코오스 흡수량을 결정하기 위해 측정된다(Louveau 등, (2004) J Endocrin . 181 :271-280]; 문헌[Duttaroy 등, (2005) Diabetes 54:251-258). 인슐린 유사체의 활성을 평가하는 경우, 인간 인슐린의 활성은 또한 비교를 위해 평가되어 사용될 수 있다. 인슐린의 존재 하에 H4IIE 세포에서의 글루코오스 제조를 평가하기 위한 시험관 내 분석이 수행될 수 있다(Wang 등, (2,000) J. Biochem . 275: 14717-14721]; 및 문헌[Duttaroy 등, (2005) Diabetes 54:251-258).

당뇨 또는 건강한 동물 모델 또는 인간 대상체들을 이용한 생체 내 연구는 또한 인슐린 조성물들 및 복합제형을 포함한 인슐린의 치료 활성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 인슐린은 혈당치, 순환하는 인슐린 수준, 및 헤모글로빈 Ale(HbAlc)에 대한 효과를 평가하기 위해 당뇨병의 동물 모델에 투여될 수 있다. 예를 들어, 헤모글로빈 Ale는 글루코오스가 헤모글로빈에 부착되는 경우에 형성되며, 이는 혈당치가 증가된 경우에 나타나 있다. 혈액 시료 중의 HbAlc 수준은, 예를 들어 HPLC, ELISA, RIA 또는 기타 면역 분석에 의해 평가될 수 있다. 건강한 대상체에 있어서 HbAlc 정상치는 대략 4.0 내지 6.2%이다. 미국 당뇨 협회(American Diabetes Association)에서는 이는 당뇨병에 의한 합병증을 예방하는데 도움을 주기 위해 당뇨병을 앓은 환자에게 있어서 7% 미만(또는 특성 사람에서는 6% 미만)이어야 한다고 추천한다. 인슐린 수준은, 예를 들어 ELISA 또는 RIA에 의해 측정될 수 있다. 글루코오스 수준은 일반적으로 글루코오스 센서 또는 분석기를 이용하여 측정된다.

제1형 당뇨병에 대한 동물 모델로는 비-비만 당뇨(NOD) 마우스 및 바이오브리딩(BioBreeding, BB) 래트(Atkinson 등, (1999) Nature Med. 5:601-604)를 들 수 있다. 제 2형 당뇨병에 대한 동물 모델로는 렙틴 유전자 또는 렙틴 수용체 각각에 돌연변이를 갖는 ob/ob 마우스 및 db/db 마우스, K 마우스, 나고야-시바타-야스타(Nagoya-Shibata-Yasuda, NSY) 마우스, 쥬커 당뇨 비만(wZucker diabetic fatty, ZDF) 래트 및 가토-카타자키(Gato-Katazaki, GK) 래트(문헌[Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 실시예에서, 건강한 동물들은 히알루로난 분해 효소의 존재 또는 부재 하에 인슐린의 활성을 시험하기 위해 사용된다.

2. 히알루로난 분해 효소

히알루로난 분해 효소의 활성은 당업계에 널리 공지된 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제에 대한 USP XXII 분석에서는 히알루론산 또는 히알루로난, 및 상기 효소가 37℃에서 30분 동안 HA와 반응하도록 한 이후에 남아 있는 분해되지 않은 (HA) 기질의 양을 측정함으로써 직접 활성을 결정한다(메릴랜드주 로크빌 소재의 미국 약전 협회의 USP XXII-NF XVII (1990). 히알루로니다아제 참고용 표준물질(USP) 또는 국립 처방집(National Formulary, NF) 히알루로니다아제 표준 용액은 임의의 히알루로니다아제의 활성을 유닛으로 확인하기 위해 분석에서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 활성은 미세탁도 분석을 이용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합하는 경우에 불용성 침전물의 형성에 기반을 둔다. 상기 활성은 설정 시간(예를 들어, 10분) 동안 히알루론산나트륨(히알루론산)과 함께 히알루로니다아제를 배양한 후, 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 분해되지 않은 히알루론산나트륨을 침전시킴으로써 측정된다. 얻어진 시료의 탁도는 부가적인 현상 기간 이후에 640㎚에서 측정된다. 히알루론산나트륨 기질에 대한 히알루로니다아제 활성으로부터 유리한 탁도의 증가는 히알루로니다아제 효소 활성의 척도이다(예를 들어, 실시예 2 참조).

다른 실시예에서, 히알루로니다아제 활성은 비오티닐화(biotinylation)된 잔류 히알루론산이 히알루로니다아제와 함께 배양된 이후에 측정되는 미세역가 분석(microtiter assay)을 이용하여 측정된다(예를 들어, Frost 및 Stern (1997) Anal. Biochem . 251 :263-269, 및 미국 특허 공개공보 제 2005-0260186 호 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기들 상의 유리 카르복실기는 비오티닐화되어 있으며, 비오티닐화된 히알루론산 기질은 미세역가 플레이트에 공유 결합되어 있다. 히알루로니다아제와 함께 배양 이후, 비오티닐화된 잔류 히알루론산 기질은 아비딘-페록시다아제 반응을 이용하여 검출되며, 공지된 활성을 갖는 히알루로니다아제 표준물질들과 반응 이후에 수득된 것과 비교한다. 히알루로니다아제 활성을 측정하기 위한 기타 분석은 또한 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 상기 방법들에서 사용될 수 있다(예를 들어, Delpech 등, (1995) Anal. Biochem . 229: 35-41]; 및 문헌[Takahashi 등, (2003) Anal. Biochem. 322: 257-263 참조).

확산제 또는 분산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 트리판 블루 염료는 누드마우스의 각 측면의 측부 피부 내로 히알루로난 분해 효소와 함께 또는 상기 효소 없이 피하 주사될 수 있다. 이어, 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 결정하기 위해, 예를 들어 마이크로캘리퍼(microcaliper)를 사용하여 염료 영역이 측정된다(미국 특허 공개공보 제 2006-0104968 호). 약제의 약물 동력학적 및 약력학적 특성에 대한 인슐린과 같은 다른 약제와 히알루로니다아제의 공-투여의 효과는 또한 임상시험의 세팅에서와 같이 동물 모델 및/또는 인간 대상체들을 이용하여 생체 내에서 평가될 수도 있다. 히알루로니다아제가 아닌 히알루로난 분해 효소의 기능적 활성은 임의의 이들 분석을 이용하여 히알루로니다아제와 비교할 수 있다. 이는 히알루로난 분해 효소의 기능적 등량을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 확산제 또는 분산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력은 트리판 블루와 함께 이를 마우스의 측부 피부에 주사함으로써 평가될 수 있으며, 예를 들어 100 유닛의 히알루로니다아제 참고용 표준물질과 동일한 확산량을 달성하기 위해 요구되는 양도 측정될 수 있다. 따라서 히알루로난 분해 효소의 요구량은 히알루로니다아제 100 유닛과 기능적으로 등량이다.

본원에서 제공된 복합제형과 같은 조성물 중의 히알루로난 분해 효소의 안정성은 또한 당업계에 공지된 기타 방법 및 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 안정성은 상술한 바와 같이 히알루로니다아제 활성을 결정함으로써 평가될 수 있으며, 실시예 2에는 상술한 바와 같은 시각 검사, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 측정된 바와 같은 시간의 경과에 따른 회복(%) 및/또는 활성 및 단백질 순도(예를 들어, 실시예 3 참조), 및 겉보기 용해 온도가 평가될 수 있다. RP-HPLC에 결정된 바와 같은 단백질 순도는 모든 존재하는 히알루로니다아제 종과 비교 시 복합제형 중의 주요 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 rHuPH20의 백분율(%)이다. 회복(%) 및/또는 활성은 참고용 시료와 비교하여 시간의 경과에 따라 다양한 저장 조건에서 복합제형 중의 히알루로니다아제의 상대적인 백분율(%)이다. 일 실시예에서, 본원에서 제공된 복합제형 중의 히알루로니다아제의 용해 온도는 동적 광산란에 의해 입자의 유체 역학적 반경을 측정함으로써 결정된다(예를 들어, 실시예 7.B 참조). 입자 크기에서의 증가 및 유점에서의 감소는 히알루로니다아제의 변성 및 후속적인 응집을 나타낸다. 본원에서 제공된 복합제형 중의 히알루로니다아제의 안정성은 RP-HPLC를 이용하여 rHuPH20과 같은 히알루로니다아제의 산화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 산화율(%)은 주피크(ox-1) 및 부피크(ox-2)의 피크 면적의 합의 척도이다(예를 들어, 실시예 10.B 참조). 본원에서 제공된 복합제형 중의 히알루로니다아제의 안정성 을 결정하기 위해 사용될 수 있는, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 기타 방법들로는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 면역 블랏팅(immunoblotting), 핵자기공명(NMR) 분광법, 질량 분석법, 원편광 이색법(CD) 및 염료계 형광 분석을 들 수 있다.

J. 치료용 용도

히알루로난-분해효소의 선도 연 CSII 방법을 포함하는 CSII 방법은, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 속효성 인슐린이 이용되는 임의의 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이 섹션은 속효성 인슐린의 예시적인 치료용 용도를 제공한다. 하기에서 개시된 치료용 용도는 예시적이며, 본원에서 개시된 방법들의 적용을 제한하지 않는다. 치료용 용도로는 제 1형 진성 당뇨병, 제 2형 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병에 대한 치료, 및 중환자에서 혈당 조절을 위한 치료를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 별개의 용량으로 피하로 투여될 수 있는데, 예를 들어 주사기 또는 인슐린 펜을 통해, 혈당 조절을 달성하기 위해 당뇨병을 갖는 대상체에서 식사 인슐린으로서 식전에 투여될 수 있다. 상기 복합제형은 피하로 또는 복강내로 인슐린 펌프를 사용하여 또는 폐쇄 루프 시스템의 내용에서 투여되어 혈당 수치를 연속적으로 낮 및 밤에 걸쳐 끊임없이 조절하거나 및/또는 식후 혈당 변동을 조절할 수 있다. 이는 이러한 질환 또는 상태를 확인하기 위한 내과 치료의의 기술 범위 내에 있다.

위에서 논의된 바와 같이, 특정 투약 및 치료 프로토콜은 전형적으로 각 대상체를 위해 개별화된다. 필요한 경우, 특정 투약 및 치료 기간 프로토콜은 경험적으로 결정되거나 외삽될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소가 없는 속효성 인슐린의 예시적인 용량은 본원에서 제공된 복합제형의 적절한 투약을 결정하기 위한 시작점으로서 사용될 수 있다. 투약 수준은 개인의 체중, 일반적인 건강, 연령, 사용된 특정 화합물의 활성, 성, 식이요법, 대사적 활성, 혈당 농도, 투여 시간, 배설 비율, 약물 조합, 질환의 심한 정도 및 경과, 및 질환에 대한 환자의 성향, 및 내과 치료의의 판단과 같은 다양한 인자에 기초하여 결정될 수 있다. 특히, 혈당 센서에 의해 측정된 바와 같은 혈당치는 혈당 조절을 달성하기 위해 투여될 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 양을 결정하기 위해 측정되고 사용될 수 있다. 알고리즘들은 당업계에 공지되어 있어, 본원에서 제공되는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형의 흡수 비율 및 흡수 수준에 기초하고, 또한 혈당치에 기초하여 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 식후 혈당 조절을 위한 인슐린의 용량은, 예를 들어 식사의 탄수화물 함량을 결정함으로써 또한 계산되거나 조절될 수 있다(예를 들어, Bergenstal 등, (2008) Diabetes Care 31 : 1305-1310; Lowe 등, (2008) Diabetes Res. Clin . Pract . 80:439-443; 및 Chiesa 등,(2005) Acta Biomed. 76:44-48 참조).

1. 당뇨병

진성 당뇨병(또는 당뇨병)은 손상된 글루코오스 대사를 특징으로 한다. 혈당은 장에서 흡수되는 탄수화물로부터 유래하고 간에서 생산된다. 혈당치의 증가는 인슐린 방출을 자극한다. 식후 글루코오스의 유입은 식사와 식사 사이의 관찰되는 간에서의 글루코오스 생산보다 20 내지 30배 더 높을 수 있다. 10분 또는 그 정도 지속하는 초기 상(phase) 인슐린 방출은 간에서의 글루코오스 생산을 억제하고, 보다 긴 (후기) 상의 방출에 선행되며, 이는 2시간 이상 지속하며 식사 시간의 탄수화물 유입을 포함한다. 식사와 식사 사이에 낮은 연속적인 인슐린 수준, 즉 기저 인슐린은, 특히 지방 조직, 근육 조직 및 기타 표적 부위에 의한 글루코오스 이용뿐만 아니라 간에서의 글루코오스 생성량을 조절하기 위해 진행 중인 대사 요건을 커버한다. 당뇨병을 갖는 환자들은 상승된 혈당치(고혈당증)를 나타낸다. 당뇨병은 2개의 주요 그룹: 제 1형 당뇨병 및 제 2형 당뇨병으로 분류될 수 있다. 제 1형 당뇨병, 즉 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)은 인슐린 결핍을 야기하는, 췌장에서의 란게르한스섬의 인슐린 생성 β 세포의 소실을 특징으로 한다. β 세포 결핍의 주요 원인은 T-세포 매개 자가 면역이다. 제 2형 당뇨병, 즉 비인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM)은 β-세포 기능이 손상된 환자에서 발생한다. 이들 환자들은 인슐린 분비의 감소와 더불어 인슐린 내성 또는 감소된 인슐린 감수성을 갖는다. 제 2형 당뇨병은 결과적으로 제 1형 당뇨병으로 발전할 수 있다. 또한 당뇨병에는 임신성 당뇨병이 포함된다. 당뇨병을 갖는 환자에게는 기저 인슐린 수준을 유지하고 또한 식사 이후와 같이 혈당 변동을 예방하기 위해 인슐린이 투여될 수 있다.

a. 1형 당뇨병

제 1형 당뇨병은 T 세포 의존성 자가면역 질환으로, 란게르한스섬의 침윤, 췌장의 내분비 유닛, 및 β-세포들의 파괴를 특징으로 하며, 인슐린 생산에서의 결핍 및 고혈당증을 야기한다. 제 1형 당뇨병은 어린이 및 젊은 성인에서 가장 통상적으로 진단되지만, 임의의 연령에서 진단될 수 있다. 제 1형 당뇨병을 갖는 환자는 낮은 인슐린 수준 및 높은 혈당치 이외에도, 다뇨증, 조갈증, 다식증, 흐릿한 시야 및 피로가 나타날 수 있다. 예컨대 글루코오스 부하 시험에서 75g의 경구 글루코오스 부하 후 2시간에 126㎎/㎗(7.0mmol/ℓ) 또는 그 초과로 공복 혈장 글루코오스 수준, 200㎎/㎗(11.1mmol/ℓ)또는 그 초과로 혈장 글루코오스 수준, 및/또는 200㎎/㎗ 또는 그 초과(11.1mmol/ℓ)로 무작위적인 혈장 글루코오스 수준이 나타날 때 환자로 진단될 수 있다.

제 1형 당뇨병을 앓는 환자들을 위한 1차 치료는 대체 요법으로서 인슐린의 투여이고, 이는 전형적으로 혈당 모니터링과 함께 수행된다. 충분한 대체 인슐린 없이는 당뇨병성 케톤산증이 발병할 수 있으며, 이는 혼수상태 또는 사망을 초래할 수 있다. 하루 종일 적절한 혈당치를 유지하고 또한 식후 글루코오스 수준을 조절하기 위해 환자들에게는, 예를 들어 주사기 또는 인슐린 펜, 또는 인슐린 펌프를 이용하여 속효성 인슐린의 피하 주사액이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 폐쇄 루프 시스템의 내용에 포함되어 있는 것을 포함하는 인슐린 펌프는 인슐린을 복강 내 전달하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 혈당 및 인슐린 수준을 더욱 신속하게 조절하기 위해서 제 1형 당뇨병을 갖는 환자에게는 본원에서 개시된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 주사기, 인슐린 펜, 또는 인슐린 펌프, 또는 인슐린을 전달하기 위해 유용한 임의의 기타 수단을 통해 피하 또는 복강 내 투여될 수 있다.

b. 2형 당뇨병

제 2형 당뇨병은 인슐린 내성과 연관이 있으며, 일부 개체군에서는 인슐린 감소증(insulinopenia: β-세포 기능의 상실)에 의해 야기된다. 제 2형 당뇨병에서, 인슐린의 1상 방출은 존재하지 않으며, 2상 방출이 지연되거나 부적절하다. 식사 도중 및 식사 이후에 건강한 대상체에서 나타나는 인슐린 방출의 급상승은 제 2형 당뇨병을 앓는 환자에서 지연되고, 연장되며, 그 양이 충분하지 않으며, 그 결과 고혈당증을 초래한다. 제 2형 당뇨병을 갖는 환자들에게는 혈당치를 조절하기 위해 인슐린이 투여될 수 있다(Mayfield 등, (2004) Am Fam Physican 70:489-500]). 이는 식이요법, 운동 및 기타 항-당뇨 치료(예를 들어 설포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드, 티아졸리딘디온 및 알파-글루코시다제 저해제)를 포함하는 기타 치료 및 치료 요법과 조합하여 이루어질 수 있다. 그러므로, 제 2형 당뇨병을 갖는 환자에게 더욱 신속하게 혈당 및 인슐린 수준을 조절하기 위하여 본원에서 기술되는 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 피하 또는 복강 내에 주사기, 인슐린 펜, 또는 인슐린 펌프, 또는 인슐린을 전달하기에 유용한 임의의 다른 수단을 이용하여 투여될 수 있다.

C. 임신성 당뇨병

이전에 당뇨병을 앓은 적은 없으나 임신 동안 높은 혈당치를 갖는 임산부는 임신성 당뇨병으로 진단받는다. 이러한 유형의 당뇨병은 연구된 집단에 따라 모든 임산부의 대략 1-14％에서 발생한다 (Carr 등, (1998) Clinical Diabetes 16). 근본적인 원인은 여전히 알려져 있지 않으나, 아마도 임신 중에 생성되는 호르몬이 임산부의 인슐린에 대한 감수성을 감소시키기 때문인 것으로 보인다. 인슐린 내성의 기전은 수용체후 결함(postreceptor defect)일 수도 있는데, 이는 인슐린-감수성 세포에 의한 정상적인 인슐린 결합이 입증되었기 때문이다. 췌장은 결과적인 인슐린 내성의 증가에 반응하기 위해 1.5 내지 2.5배 더 인슐린을 방출한다. 췌장 기능이 정상인 환자는 이러한 요구를 만족시킬 수 있다. 췌장 기능이 경계선 상에 있는 환자는 인슐린 분비를 증가시키고 어렵고, 그 결과 부적절한 수준의 인슐린을 생성한다. 따라서, 말초 인슐린 내성 증가의 존재하에서 지연된 또는 불충분한 인슐린 분비가 있을 때 임신성 당뇨병이 발생한다.

임신성 당뇨병을 갖는 환자에게 혈당치를 조절하기 위해 인슐린이 투여될 수 있다. 따라서, 임신성 당뇨병을 갖는 환자에게 혈당 및 인슐린 수준을 보다 신속하게 제어하기 위해 본원에 기술된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합 제형을 주사기, 인슐린 펜, 인슐린 펌프 또는 인공 췌장, 또는 임의의 다른 수단을 통해 피하 투여할 수 있다.

2. 중증의 환자를 위한 인슐린 요법

고혈당증 및 인슐린 내성은 내과적으로 및/또는 외과적으로 중증인 환자에서 빈번하게 발생하고, 당뇨병 및 비-당뇨병 환자 모두에서, 그리고 외상성 손상, 뇌졸중, 무산소성 뇌 손상, 급성 심근 경색, 심장수술후 및 중증의 다른 원인을 갖는 환자에서 증가하는 이환률 및 사망률과 관련이 있다 (McCowen 등, (2001) Crit Clin. Care 17:107-124). 고혈당증이 있는 중증의 환자는 혈당치를 조절하기 위해 인슐린으로 치료되어 왔다. 이러한 치료는 이 개체군 중에서 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있다(Van den Berghe 등 (2006) N. Eng .J Med . 354:449-461). 인슐린은 전형적으로 예를 들어 전문의에 의해 주사기로 주사 또는 인슐린 펌프를 사용하여 주입에 의해, 환자에게 정맥내로 투여된다. 일부 예에서, 알고리즘 및 소프트웨어가 용량을 계산하기 위해 사용된다. 그러므로, 고혈당증이 있는 중증의 환자는 혈당치를 조절하도록 본원에서 기술된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형이 투여됨으로써, 고혈당증을 완화시키고 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있다.

K. 조합 요법

본원에서 기술된 방법들은 기타 생물제제들 및 소분자 화합물들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 치료제들을, 이전에, 간헐적으로, 또는 후속적으로 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 속효성 인슐린이 지시되거나 사용되어 온 그리고 기타 제제 및 치료들이 이용 가능한 상기 예시된 것 모두를 포함하는 임의의 질환 또는 상태를 위해서, 그들이 본원의 방법에서 추가적으로 사용될 수 있다. 치료될 질환 또는 상태에 따라 예시적인 기타 치료제들은 설포닐우레아류, 비구아나이드류, 메글리티나이드류, 티아졸리딘디온류, 알파-글루코시다아제 저해제, 글루카곤 유사 펩티드(GLP) 유사체 및 위 억제 펩티드(GIP) 유사체를 포함하는 펩티드 유사체, 및 DPP-4 저해제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 항-당뇨 약물들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 예에서, 상기 방법들은 속효성 인슐린, 및 기저 작용 인슐린을 포함하는 하나 이상의 기타 인슐린과 조합하여, 이전에, 간헐적으로, 또는 후속적으로 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.

L. 제조 물품 및 키트

본원에서 제공된 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 포장 재료, 당뇨병 환자 대상체 또는 중환자 대상체에서와 같이 혈당치를 제어하는데 있어 효과적인 약학 조성물, 및 복합제형이 혈당치를 제어하기는 사용되어야 한다는 것을 보여주는 라벨을 함유하는 제조 물품으로서 포장될 수 있다.

본원에서 제공된 제조 물품은 포장 재료를 함유한다. 약학적 제품들을 포장하는데 이용하기 위한 포장 재료들이 당해 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 그 각각의 전체가 본원에서 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제 5,323,907 호, 제 5,052,558 호 및 제 5,033,252 호를 참고한다. 약학적 포장 재료의 예료는 물집 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 봉지, 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료 형태에 적합한 임의의 포장 재료를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에 개시된 복합제형, 및 투여용 아이템을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 부가적인 약학 조성물을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 키트는 본원에서 제공된 하나 이상의 복합제형, 및 예를 들어 결정 인슐린을 비롯한 느린 작용 또는 중간 작용 인슐린과 같은 하나 이상의 기타 인슐린 조성물, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 속효성 인슐린 및 히알루로난 분해 효소의 복합제형에는 주사기, 인슐린 펜, 펌프, 또는 인슐린 펜, 펌프 또는 기타 전달 장치 내에 삽입되어 있는 저장소와 같은 투여 장치가 제공될 수 있다. 키트는 선택적으로 투약을 포함한 적용 지침서, 투여 요법, 및 투여 형태를 위한 지침서를 포함한다. 또한 키트는 본원에서 개시된 복합제형, 및 진단용 항목을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 글루코오스 모니터 또는 센서를 포함할 수 있다.

M. 실시예

하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 포함되며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

인슐린 및 인슐린 유사체 스톡(stock) 준비

A. 레귤러 인슐린

레귤러 인슐린에 대하여, 분말(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143)의 무게가 측정되었고 용액이 약 10-25 mg/mL의 인슐린을 포함할 때 까지 적절한 양의 물과 혼합되었다. 1 M HCl이 뿌연 혼합물에 첨가되어 HCl의 최종 농도가 20 mM이 되게 하였다. 인슐린이 완전히 용해될 때 까지 용액을 교반봉으로 조심스럽게 혼합하고 250 mM의 트리스, pH 10.7 (Trizma, Cat. No. T6066, Sigma)를 첨가하여 최종 트리스 농도가 20 mM이 되게 하였다. pH는 1 M NaOH를 사용하여 조정되었고 물을 첨가하여 인슐린이 상술된 바와 같이 하기의 개별적 예 각각으로 조제되었다. 이 인슐린은 대략 13 μg/ml의 아연을 포함한다.

B. 인슐린 유사체

각 인슐린 유사체에 대하여(인슐린 아스파르트(Aspart) 또는 인슐린 리스프로(Lispro) 중 하나), 12 바이알(각 10 mL)의 시판 제품(인슐린 리스프로:Eli Lilly Humalog®(인슐린 리스프로) 100 U/mL, Lot A5772364; 인슐린 아스파르트: Novo Nordisk, NovoRapid®(인슐린 아스파르트), LOT XS60195; 인슐린 글루리신(Glulisine): Apidra® 인슐린)이 수집되었고 Amicon Ultracel-10K (인슐린 리스프로) 또는 3K (인슐린 아스파르트) 칼럼 농축기를 사용하여 최종 농도가 원래 농도의 약 5배가 될 때까지 농축되었다. 상기 인슐린 유사체는 1M 아세트산 나트륨, pH 5.3 및 30 mM의 염화아연(ZnCl₂,EMD,CatNo.XZ0065-1)을 단백질 용액 부피의 10/1로 첨가하여 침전되었다. 용액을 30분간 얼음 위에 둔 후 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)(Beckman Coulter)를 사용하는 JS-5.3 Avanti J-E 원심분리기에서 20분간 4500 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 디캔팅한 후 펠렛을 20 mM 아세트산 나트륨, 2 mM 염화아연, pH 5.5 용액으로 세척하였다. 재현탁된 용액은 상기에서 기술된 바와 같이 원심분리되었다. 세척 단계는 총 5회 반복되었다. 최종 세척은 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5로 수행되어 염화아연의 모든 찌꺼기가 제거되었다. 그 결과로 얻은 단백질 페이스트는 20 mM HCl을 포함하는 물에 용해되었다. 완전한 용해 후에, 250 mM 트리스, pH 10.7이 첨가되어 최종 트리스 농도 20 mM이 되게 하였다. 그 결과 얻은 용액의 pH는 조정되었고 인슐린 유사체는 하기 실시예 각각에 기술된 바와 같이 제형화되었고 약 15-20 mg/mL로 단백질 농도가 조정되었다. 이 방법으로 준비된 인슐린 유사체는 일반적으로 약 90% 수율 및 출발 물질보다 100배 이하의 잔류 보존제 농도를 갖는다.

실시예 2

rHuPH20의 히알루로니다아제 활성 결정

rHuPH20(서열번호 1의 아미노산 36-482를 암호화하는 핵산의 CHO 세포에서의 발현 및 분비에 의해 수득됨)의 히알루로니다아제 활성은 탁도측정 분석을 사용하여 결정되었다. 최초 2회의 분석(A 및 B)에서, rHuPH20의 히알루로니다아제 활성은 가용성 rHuPH20을 소듐 히알루로네이트(히알루론산)과 배양하고 소화되지 않은 소듐 히알루로네이트를 산성화 혈청 알부민을 첨가하여 침전시킴으로써 측정되었다. 세번째 분석(C)에서, rHuPH20 히알루로니다아제 활성은 히알루론산(HA)이 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride, CPC)에 결합할 때 형성된 불용성 침전물에 기초하여 측정되었다. 600 U/mL rHuPH20 (5 μg/mL)을 포함하는 모든 분석에서, 허용 기준은 375 U/mL을 초과하는 효소 활성이었다.

A. 미세탁도 분석

이 분석에서, rHuPH20의 히알루로니다아제 활성은 가용성 rHuPH20을 소듐 히알루로네이트(히알루론산)과 한 세트의 시간(10분) 동안 배양하고 소화되지 않은 소듐 히알루로네이트를 산성화 혈청 알부민을 첨가하여 침전시킴으로써 측정되었다. 결과적인 시료의 탁도는 30분의 현상 기간 후에 640 nm에서 측정되었다. 소듐 히알루로네이트 기질에 대한 효소 활성으로 인한 탁도의 감소는 가용성 rHuPH20 히알루로니다아제 활성의 척도였다. 상기 방법은 참조 표준으로 작용하는 가용성 rHuPH20 분석의 희석으로 생성된 검정 곡선을 사용하여 수행되었고, 시료 활성 측정은 이 검정 곡선에 상대적으로 만들어졌다. 시료의 희석은 효소 희석 용액에서 준비되었다. 효소 희석 용액은 33.0 ± 0.05 mg의 가수분해된 젤라틴을 25.0 mL의 50 mM PIPES 반응 완충액(140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 및 25.0 mL의 주사용 증류수 (SWFI; Braun, 생산 번호 R5000-1)에 용해시키고 25% 인간 혈청 알부민(US Biologicals) 용액 0.2 mL를 혼합액에 희석하고 30초간 볼텍싱함으로써 준비되었다. 이는 사용 2시간 내에 수행되었고 필요할 때 까지 얼음 위에 보관되었다. 시료는 어림잡아 1-2 U/mL로 희석되었다. 일반적으로, 단계당 최대 희석은 1:100을 초과하지 않았고 최초 희석을 위한 초기 시료 크기는 20 uL 이상이었다. 분석을 수행하기 위한 최소 시료 부피는: 과정(In-process) 시료, FPLC 분획: 80 uL; 조직 배양 상층액: 1 mL; 농축. 재료 80 uL; 정제 또는 최종 단계 재료: 80 uL이었다. 희석은 저 단백질 결합 96 웰 플레이트에서 3반복적으로 이루어졌으며, 각 희석액 30 uL이 Optilux 흑색/투명 바텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겨졌다.

2.5 U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석액이 효소 희석 용액에서 준비되어 표준 곡선을 생성하였고 Optilux 플레이트에 3반복적으로 첨가되었다. 희석액은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL, 및 2.5 U/mL를 포함했다. 60 uL 의 효소 희석 용액을 포함하는 “공시약(Regent blank)” 웰은 음성 대조군으로서 플레이트에 포함되었다. 플레이트는 뚜껑을 덮고 열블록에서 5분간 37 ℃에서 가온하였다. 뚜껑을 제거하고 플레이트를 10분간 교반하였다. 교반 후, 플레이트는 열블록으로 되돌려 놓고 MULTIDROP 384 액체 조작 장치를 따뜻한 0.25 mg/mL 소듐 히알루로네이트 용액(100 mg의 소듐 히알루로네이트 (LifeCore Biomedical)를 20.0 mL의 SWFI에 용해함으로써 준비됨)으로 초기화하였다. 이를 조심스럽게 2-8 ℃에서 2-4시간 동안, 또는 완전히 용해될 때 까지 회전시키고/회전시키거나 흔들어서 혼합하였다. 그리고 나서 상기 플레이트를 MULTIROP 384로부터 제거하고 10초간 교반한 후 뚜껑을 덮고 열블록으로 이동시켰다. 플레이트는 37 ℃에서 10분간 배양하였다.

MULTIDOP 384는 기계를 혈청 작용 용액으로 준비하고 부피 세팅을 240 uL로 변화시킴으로써 준비되었다. (500 mM 아세테이트 완충 용액 75 mL 내의 25 mL의 혈청 스톡 용액 [말 혈청(Sigma) 1 부피는 9 부피의 500 mM 아세테이트 완충 용액으로 희석되었고 염산으로 pH가 3.1로 조정되었다]). 플레이트를 열블록으로부터 제거하고 MULTIDROP 384 위에 놓고 240 uL의 혈청 작용 용액을 각 웰로 분배했다. 플레이트는 제거되고 플레이트 판독기상에서 10초간 교반되었다. 추가적인 15분 후에, 시료의 탁도는 640 nm에서 측정되었고 각 시료의 히알루로니다아제 활성(U/mL)이 표준 곡선에 맞춤으로써 결정되었다.

비활성(유닛/mg)은 히알루로니다아제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눔으로써 계산되었다.

B. rHuPH20 효소 활성에 대한 탁도 분석

시료는 효소 희석액[50 mL의 포스페이트 완충액 (25 mM 포스페이트, pH 6.3, 140 mM NaCl) 및 50 mL 탈이온수(DI)에 용해된 66 mg 젤라틴 가수분해물(Sigma #G0262)]으로 희석되어 0.3 및 1.5 U/mL 사이의 예상 효소 농도가 되도록 하였다.

1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 표지된 2개의 시험 튜브 각각, 및 분석될 각 시료를 위한 2반복적 시험 튜브 각각이 37 ℃의 열블록에 놓여졌다. 하기 표에 나타난 효소 희석액의 부피가 표준 시험 튜브에 대한 2반복적으로 첨가되었다. 0.50 mL HA 기질 용액 [탈이온수 내의 5 mg/mL 히알루론산 (ICN #362421) 1.0 mL, 9 mL의 탈이온수, 10 mL의 포스페이트 완충액]이 모든 표준 및 시료 시험 튜브로 분배되었다. 효소 희석액 내의 USP 히알루로니다아제 표준 (USP #31200) 1.5 U/mL 부피)가 2반복적 표준 시험 튜브에 하기 표 7에 지시된 바와 같이 분배되었다. 모든 표준 시험 튜브가 완성되었을 때, 각 시료 0.50 mL를 2반복적 시료 시험 튜브 각각에 분배하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 4.0 mL의 혈청 작용 용액 {50 mL의 혈청 스톡 용액[1 부피의 말 혈청(공여군, 세포 배양 실험됨, 하이브리도마 배양 시험됨, USA 기원), 9 부피의 500 mM 아세테이트 완충액, pH 3.1로 조정, 실온에서 18-24시간 두어도 됨, 4℃에서 보관] 더하기 150 mL의 500 mM 아세테이트 완충액}이 표준 시험 튜브에 추가되었고, 이를 열블록으로부터 제거하고, 혼합하고 실온에 두었다. 모든 표준 및 시료 시험 튜브가 처리될 때까지 시료 시험 튜브를 이와 같은 방식으로 처리하였다.

“공(blank)” 용액이 0.5 mL 효소 희석액, 0. 25 mL 탈이온수, 0.25 mL 포스페이트 완충액 및 4.0 mL 혈청 작용 용액을 조합함으로써 준비되었다. 용액은 혼합되고, 부분 표본이 일회용 큐벳으로 옮겨졌다. 이 시료는 분광광도계를 640 nm에서 zero로 설정하는 데 사용되었다.

실온에서 30분간 각 표준 시험 튜브로부터 부분 표본이 배양된 후 이는 일회용 큐벳으로 옮겨졌고 640 nm에서 흡광도가 측정되었다. 이 과정은 2반복적 시료 시험 튜브에 대해서도 반복되었다.

히알루로니다아제 농도(U/mL) 대 관찰된 흡광도를 표시하여 선형 검정 곡선을 구축하였다. 선형 회귀 분석이 데이터를 맞추고(0.0 U/mL 검정 표준에 대한 데이터 제외) 경사, 절편 및 상관 계수 (r²)를 결정하는 데 사용되었다. 표준 곡선 회귀 등식 및 관찰된 시료 흡수가 시료 농도를 결정하는 데 사용되었다.

C. rHuPH20 효소 활성에 대한 탁도 분석

히알루로니다아제 활성 및 효소 농도 결정에 대한 탁도측정 방법은 히알루론산(HA)이 세틸피리디늄 클로라이드(CPC)과 결합할 때 불용성 침전물이 형성되는 것에 기초한다. 활성은 히알루로니다아제와 히알루로난을 1세트의 시간(30분) 동안 배양하고 CPC를 첨가함으로써 소화되지 않은 히알루로난을 침전시킴으로써 측정되었다. 결과적인 시료의 탁도는 640 nm에서 측정되었고 HA 기질에 대한 효소 활성으로 인한 탁도의 감소는 히알루로니다아제 효력의 척도였다. 이 방법은 rHuPH20 분석 작용 참조 표준의 희석으로 생성된 검정 곡선을 사용하여 수행되었고, 시료 활성 측정은 검정 곡선에 상대적으로 만들어졌다. 이 방법은 ~2.0 U/mL의 농도로 희석 후 용액에서 rHuPH20 활성 분석을 하기 위한 것이었다. 통상적 시험 최적 수행이 1 내지 3 U/mL의 범위에서 수득되었음에도 불구하고, 정량적 범위는 0.3 내지 3 U/mL이었다.

100 mg ± 10 mg 젤라틴 가수분해물(Sigma #G0262)을 75 mL의 반응 완충 용액(140 mM NaCl, 50 mM PIPES(1,4 피페라진 비스(2-에타노설폰산)), pH 5.3) 유리산(Mallinckrodt #V249) 및 74.4 mL의 관개용 증류수(SWFI)에 용해시키고 0.6 mL 25% 인간 혈청 알부민(HSA)을 첨가함으로써 효소 희석액이 즉석에서 준비되었다. 분광광도계 공시약이 1.0 mL 효소 희석액을 시험 튜브에 첨가하고 이를 37℃로 미리 가온된 열블록에 놓음으로써 준비되었다. 29.880 mL의 효소 희석액에 분석 작용 참조 표준 120 μL를 첨가함으로써 3배수의 rHuPH20 분석 작용 참조 표준의 1:25 희석을 만듬으로써 준비되었다. 각 시료의 적절한 희석이 ~2 U/mL 용액이 도출되도록 3반복적으로 준비되었다.

효소 희석액의 부피가 표 8에 따라 표준 시험 튜브 내에 3반복적으로 분배되었다. SWFI 내의 1.0 mg/mL 소듐 히알루로네이트(Lifecore, #81, 평균 분자량 20-50 kDa)가 공시약을 제외한 모든 시험 튜브에 분배되었고, 튜브는 열블록에서 5분간 37℃에 두었다. 표 7에 나타낸 희석된 참조 표준의 양은 적절한 표준 시험 튜브에 첨가되었고, 혼합 후 열블록으로 되돌려졌다. 각 시료 500 μL를 적절한 튜브에 3반복적으로 담았다. 첫 표준 튜브가 시작된 지 30분 후에, 정지 용액 4.0 mL(SWFI 내에 용해되고 0.22 마이크론 필터에 여과된 5.0 mg/mL 세틸피리디늄 클로라이드(Sigma, Cat # C-5460))이 모든 튜브(공시약 포함)로 옮겨졌고, 혼합 후 실온에 보관되었다.

분광광도계는 640 nm 고정파장에서 “초기화(blank)"되었다. 그 후 실온에서 30분간 배양되었다. 대략 1 mL의 표준 또는 시료가 일회용 큐벳으로 옮겨졌고 640 nm에서 흡광도가 판독되었다. 참조 표준 및 시료 미가공 데이터 값이 완전 붕괴에 있어서 0으로 제한된 지수 붕괴 함수를 사용하는 GRAPHPAD PRISM 컴퓨터 소프트웨어 (Hearne Scientific Software)를 이용하여 분석되었다. 최적합 표준 곡선이 결정되었고 상응하는 시료 농도를 계산하기 위해 사용되었다.

실시예 3

RP-HPLC

이 실시예에서, 역상-HPLC (RP-HPLC)가 인슐린 및 인슐린 유사체의 겉보기 가용성 및 rHuPH20의 퍼센트 순도를 결정하는데 사용되었다. 겉보기 가용성은 최초 제제/상태와 비교하여 퍼센트 인슐린 회복으로서 측정되었다.

참조 표준

레귤러 인슐린으로서, 휴무린®(Humulin)(인슐린 정규, 100 U)이 표준으로서 사용되었다. 인슐린 리스프로의 경우, USP 리스프로 1 바이알이 1.72 mL의 0.01 N HCl을 사용하여 재구성되었고 결과적으로 3.5 mg/mL USP 리스프로(100 U/mL) 참조 표준이 준비되었다. 인슐린 아스파르트의 경우, EP 아스파르트 1바이알이 1.00 mL의 0.01 N HCl을 사용하여 재구축되었고 결과적으로 3.89 mg/mL EP 아스파르트 참조 표준이 준비되었다. 각각 2.5 μg/mL, 5.0 μg/mL 또는 7.5 μg/mL rHuPH20을 포함하는 세가지 참조 표준이 사용되었는데, rHuPH20의 경우, 이는 50 μg/mL rHuPH20 시료(LOT HUB0701EB)를 적절한 양의 시료 희석액(20 mM 트리스, 130 mM NaCl, 0.01% 폴록사머 188, pH 7.3)으로 희석함으로써 생성되었다.

보존제 표준

각각 0.05% 메타크레졸/페놀, 0.10% 메타크레졸/페놀 또는 0.15% 메타크레졸/페놀을 포함하는, 세가지 보존제 참조 표준이 사용되었다.

시료 준비

필요한 경우, 인슐린/인슐린 유사체가 100 U/mL로 존재하고 rHuPH20이 5 μg/mL로 존재하도록 시료가 시료 희석액에 희석되었다. 시료는 매 시점에서 각 바이알로부터 100 μL씩 회수하고 로딩하기 전에 원심분리함으로써 준비되었다. 시료는 사용 전에 4℃에서 오토샘플러에 보관되었고, 준비 후 3일 동안은 안정한 것으로 간주되었다. 모든 시료는 2반복적으로 시험되었다.

인슐린의 경우, 20 μL가 각 HPLC 실시마다 주입되었다. rHuPH20의 경우, 100 μL가 각 HPLC 실시마다 주입되었다. HPLC 칼럼 및 방법 매개 변수는 하기 표 9에 기재된 바와 같이 설정되었다. HPLC 구배는 하기 표 10에 기재된 바와 같다.

A. 인슐린 가용성

겉보기 가용성을 결정하기 위해서, 인슐린/인슐린 유사체 주피크 및 데사미도(desamido) 피크의 피크 면적이 통합되었고 함께 결합되어 표준에 상대적인 백분율을 계산하였다. 가용성은 100%가 120 U/mL로서, 표준에 대한 상대적 백분율로 표현되었다. 데이터는 Design-Expert®7.0 (StatEase) 및 “역사적 데이터” 특징을 사용하여 처리되었다. 인슐린 퍼센트 순도는 주된 인슐린 대 모든 인슐린 종의 퍼센트로서 표현되었다.

B. rHuPH20 퍼센트 순도 및 퍼센트 회복

rHuPH20 퍼센트 순도는 rHuPH20 대 모든 rHuPH20 종의 퍼센트로서 표현되었다. rHuPH20 퍼센트 회복은 100%가 5 μg/mL로, 표준에 대한 상대적 백분율로서 표현되었다. 타겟 특정은 3-7 μg/mL(60-140%)이다.

실시예 4

크기 배제 크로마토그래피

이 실시예에서, 인슐린/rHuPH20 제제는 크기배제 고효율 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 분석되어 고분자량 단백질(HMWP), 즉 시료 내에 존재하는 인슐린 및 rHuPH20의 공유결합 집괴의 상대적인 양을 결정하였다. SEC를 변성시키기 위해, 이동상은 L-아르기닌 및 아세토나이트릴 내의 빙초산을 사용하였다. 실시예 29에 기술된 대로 사용된, SEC 비-변성을 위해, 이동상은 포스페이트 완충된 식염수였다.

A. SEC 변성

1. 참조 표준

휴무린®(인슐린 정규, Lilly, 농축, NDC 0002-8501-01) 또는 USP 인간 인슐린(USP Cat #I1F270) 및 rHuPH20 (120,000 U/mg 및 110,000 U/mg의 비활성을 각각 가진 lot HUA0703MA 또는 HUB0701EB)이 참조 표준으로 사용되었다. 인슐린 및 rHuPH20을 둘 다 포함하는 참조 표준이 예상된 시료 농도, 즉 100 U/mL 인슐린 및 5 μg/ml rHuPH20에 유사한 농도로 준비되었다. 액체 제형은 25 mM 트리스 희석액, pH 7.3으로 희석되었다. 중량이 측정된 USP 인간 인슐린은 TFA가 섞인 트리스 희석액 (2 μL TFA/mL 트리스)로 희석되었다. 참조 시료는 사용 전에 10 ℃에서 HPLC 바이알에 보관되었다.

2. 시료 준비

필요한 경우, 시료는 인슐린이 1-100 U/mL 범위로 존재하고 rHuPH20이 1-1000 μg/mL 범위로 존재하도록 트리스 희석액으로 희석되었다. 시료는 사용 전에 10 ℃에서 HPLC 바이알에 3일까지 보관되었다.

3. HPLC 준비

이동상이 650 mL 1.0 mg/mL L-아르기닌, 150 mL 빙초산 및 200 mL 아세토나이트릴을 조합함으로써 준비되었다. HPLC 칼럼 및 방법 매개 변수는 하기 표 11에 기재된 바와 같다. rHuPH20 피크는 13.8분경에서 나타났고 인슐린 피크는 20.2분경에서 나타났다.

B. SEC 비-변성

1. 참조 표준

휴마로그(Humalog)100(인슐린 리스프로, Eli Lilly Cat # VL-1510), 노보로그®(Novolog)100(인슐린 아스파르트, Novo Nordisk Cat #750111) 및 rHuPH20 (lot T09RD02)[비활성 122,000U/mg], HUA0703MA[비활성 120,000 U/mg] 또는 HUB0701EB[비활성 122,000 U/mg])이 참조 표준으로 사용되었다. 인슐린과 rHuPH20을 둘 다 포함하는 참조 표준은 예상된 시료 농도, 즉 100 U/mL 인슐린 및 5 μg/ml rHuPH20에 유사한 농도로 준비되었다. 참조 시료는 사용 전에 10 ℃에서 HPLC 바이알에 보관되었다.

2. 시료 준비

필요한 경우, 시료는 인슐린이 1-100 U/mL 범위로 존재하고 rHuPH20이 1-20 μg/mL 범위로 존재하도록 시료 희석액(20 mM 트리스, 130 mM NaCl, 0.01% 폴록사머 188, pH 7.3)으로 희석되었다. 시료는 사용 전에 10 ℃에서 HPLC 바이알에 3일까지 보관되었다.

3. HPLC 준비

0.5 X 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 용액이 10 X PBS를 HPLC 등급수 에 희석함으로써 준비되었다. HPLC 칼럼 및 방법 매개 변수는 하기 표 12에 기재된 바와 같다. rHuPH20 피크는 13분경에서 나타났고 인슐린 피크는 18.6분경에서 나타났다.

C. 인슐린 퍼센트 순도

인슐린 퍼센트 순도는 인슐린 주피크 대 총 인슐린 피크들의 백분율로 표현되었다. 타겟 특정은 2% 미만의 고분자량 단백질, 즉 인슐린 집괴이다.

실시예 5

시험 방법-삼투질 농도, 탁도 및 pH

이 실시예에서, 인슐린/인슐린 유사체 및 rHuPH20 제형의 외관, 삼투질 농도, 탁도 및 pH를 결정하기 위해 사용된 시험 방법이 기술된다. 이러한 시험 방법은 이하의 실시예에서 사용된다.

A. 외관

1. 시각적 분석

인슐린/rHuPH20 제제의 외관은 I형 유리 바이알 내의 인슐린/rHuPH20의 정성적 시각적 분석에 의해 결정되었다. 용액의 색깔 및 투명도 평가는 USP (또는 등가물) 관개용 증류수(SWFI)와 비교하여 결정되었다. 수용액은 SWFI와 투명도가 동일하면 투명한 것으로 결정되었다. 수용액은 SWFI의 외관을 가진 경우 무색인 것으로 결정되었다. 바이알은 실온에서 시험되었고 소용돌이가 발생하도록 흔들고 뒤집는 동안 불필요한 난류 및/또는 기포를 수용액 내에 발생시키지 않기 위하여 주의깊게 다루어졌다. 필요한 경우, 시험 전에 먼지 발생 또는 보푸라기 발생이 없는 와이프 및 70% 에탄올로 바이알이 닦여졌다. 과정은 하기와 같다: 150 W 또는 그 이상의 전등이 있는 지향등 광원이 켜졌다. 시료는 후드에서 준비되었다. 시험될 시료는 조심스럽게 뒤집어 확실히 균질하게 한 후 > 0.5 mL를 멸균 기술을 사용하여 I형 유리 바이알에 시험을 위해 옮겼다. SWFI 시료는 동일한 방법으로 준비되었다. 준비된 시험 시료 및 SWFI 바이알은 조심스럽게 뒤집어 확실히 균질하게 하였고, 기포가 전혀 발생하지 않도록 주의깊게 다루어졌다. 시험 시료 및 SWFI 바이알은 바이알의 바텀을 통한 각도로 비추는 광원으로 하얀 배경과 대비하여 색깔이 시각적으로 비교되었다. 용액은 SWFI와 동일한 외관을 갖는 경우 무색인 것으로 간주되었다. 시험 시료 및 SWFI 바이알은 바이알의 바텀을 통한 각도로 비추는 광원으로 흑색 배경에 대한 투명도가 시각적으로 비교되었다. 용액은 SWFI와 동일한 투명도라면 투명한 것으로 간주되었다. 색깔, 투명도 및 가시적 입자 및 외부 물질의 존재 또는 양이 기록되었다. 수용 기준은 투명하고, 무색인 용액이었다.

2. 조명기구 방법

이 방법에서, 액체의 투명도 및 착색 정도가 적용가능한 외관 특징에 대한 제품 품질을 (시각적으로) 보장하기 위하여 평가되었다. 조사는 특별히 설계된 고강도 광원이 있는 조사 부스(booth)에서 백색 및 흑색 배경에 대하여 수행되었다. 액체는 유백광이 참조 현탁액 I보다 더 두드러지지 않으면 투명한 것이다. 수용액은 물의 외관을 갖고 있거나 특정된 참조 용액(참조 용액 B9)보다 더 강하게 착색되지 않으면 무색인 것이다.

참조 용액의 준비

색 참조 용액은 희석 HCl 및 EP 색 표준 B(갈색 표준 용액, Ricca Chemical, #2880)을 하기 표 13에 기재된 바와 같이 혼합함으로써 준비되었다. 참조 용액 B₉, B₈, B₇, B₆은 마개 및 추가 밀봉으로 밀봉된 2mL 바이알에 보관되었다. 참조 용액은 매일 준비되었다. 2mL SWFI는 마개 및 추가 밀봉으로 밀봉된 바이알에 담아 1년까지 보관되었다.

투명도 참조 용액은 다음과 같이 준비되었다. 최초 유백광 현탁액은 25 mL 헥사메틸렌테트라민 (25 mL SWFI 내 2.5 g) 및 25 mL 하이드라진 설페이트 (100 mL SWFI 내 1g)를 혼합하고 용액을 24시간 동안 가만히 둠으로써 준비되었다. 현탁액은 유리 용기에 2개월까지 보관되었다. 표준 또는 유백광 용액은 45 μL의 최초 유백광 용액을 2955 μL의 SWFI에 희석하고 잘 혼합함으로써 준비되었다. 이 용액은 3달간 안정적이었다. 참조 현탁액 I 및 II는 혼합 표준 또는 유백광 및 SWFI를 하기 표 13에 기재된 바와 같이 혼합함으로써 준비되었다. 참조 표준은 마개와 추가 밀봉으로 밀봉된 2mL 바이알에 보관되었고 매일 준비되었다.

제품 시료는 먼저 제품 용액을 혼합하고 Class 100 후드에서 작업하는 동안 2mL를 바이알에 옮김으로써 준비되었다. 바이알은 마개 또는 추가 밀봉으로 밀봉되었다. 시각적 조사 부스가 준비되었고 광원의 강도는 1750을 초과하는 룩스(Lux)를 보장하기 위해 체크되었다. 제품 시료는 시각적 조사에 의해 참조 용액 및 현탁액과 비교되었다. 색은 SWFI 및 참조 용액 B₆, B₇, B₈ 및 B₉와 백색 배경에 대하여 수평으로 관찰되어 비교되었다. 투명도는 참조 현탁액 I 및 II와 흑색 배경에 대하여 수직으로 관찰됨으로써 비교되었다. 착색 및 투명도의 정도와 유백광의 정도는 하기 표 14에 기재된 바와 같이 기록되었다.

B. 삼투 농도

삼투 농도(삼투질 농도, osmolality)는 빙점강하 측정에 의하여 결정되었다. 상기 시험 방법은 100 및 500 mOsm/kg 물 사이의 삼투 농도를 가진 수용액의 분석을 위해 의도되었다. 빙점강하 삼투압 측정은 시험될 용액의 시료를 튜브 내로 피펫팅하고 튜브를 삼투압계의 냉각실에 두는 것을 수반한다. 시료는 과냉각(빙점 아래로 냉각)되었고 수많은 방법들(즉, 기계적 진동, 초음파 진동, 열 충격 또는 고체 종정 입자의 첨가) 중 하나에 의하여 종정을 만들었다(결정화 개시). 시료 온도는 평형 상태까지 동결 과정 중에 방출되는 융합열로 인하여 증가한다; 이 지점에서 물의 극히 일부만이 동결되고, 그 후 더 많은 물이 동결되고 온도는 다시 내려가기 시작하여, 냉각 곡선에서, 평평한 구간, 또는 플래토(plateau)를 야기한다. 플래토의 온도는 시료의 빙점이며 1.0 오스몰이 1.858℃의 물의 빙점 강하로 관찰됨으로써 삼투압의 단위로 변환된다. 여기에서, 1.0 오스몰=삼투적 활성 입자 1.0 몰=Φ(n) (C)이고, 여기에서

Φ=삼투 계수

n=용액내에서 각 분자의 해리로부터 야기된 입자의 수; 및

C=mol/kg 물 내의 각 분자의 농도

검정 체크(0-2000 mOsm/kg 물)이 500 mOsm/kg 및 200 mOsm/Kg 표준으로 삼투압계(MicroOsmette Freeze Point Osmometer, Model #5004, Precision Systems Inc.)의 각 사용 전에 수행되었다. 최초 켜짐 후에, 온도가 완전히 평형화되도록 10-15분의 워밍업 시간이 허용되었다. 시료, 프로브 및 종정 철사는 각 사용 전에 킴와이프(KimWipe)로 닦였다. 시험할 시료는 50 μL의 인슐린/rHuPH20 용액을 깨끗한, 건조된 시료 튜브 내로 피펫팅함으로써 준비되었다. 튜브는 냉각 장치 웰에 두었고 삼투질 농도는 표준 작동 과정에 따라 측정되었다. 이 과정은 인슐린/rHuPH20 시료 당 총 3회의 독립적 결과가 되도록 2번 더 반복되었다. 각 판독에 대한 미가공 데이터가 기록되었고 판독은 모든 3회의 판독이 ±5mOsm/kg 내에 있으면 유효한 것으로 간주되었다. 각 시료의 평균값이 보고되었다. 삼투질 농도는 제형에 따라 다양하고, 수용 기준은 각 개별 예에 대하여 하기에 나열된다.

C. 탁도

탁도는 350 nm에서 인슐린/rHuPH20 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 빛이 용액을 통과할 때, 용액으로부터 흡광 및 빛의 산란 효과에 의하여 그 강도가 약화된다. 용액 내의 단백질로 인한 빛의 산란 효과를 측정하기 위하여, 350 nm의 파장이 단백질로부터 흡광의 효과를 회피하기 위하여 선택되었다. 산란된 빛의 양은 분자/입자의 농도 및 크기에 의하여 상당히 영향을 받는다. 단백질을 제외한 모든 구성 요소를 포함하는 흑색 용액의 OD350이 최종 판독을 수득하기 위해 감해졌다. 각 인슐린/rHuPH20 제형의 시료 200 μL는 96-웰 UV 플랫 바텀 미세역가 플레이트의 3개의 인접한 웰로 옮겨졌다. 각 시료 200 μL의 각각의 부형제 혼합물(단백질 제외)이 공시약으로 사용하기 위하여 미세역가 플레이트의 인접한 웰에 첨가되었다. SWFI (200 μL)는 공 플레이트로서 사용되었다. 각 시료의 OD350이 UV-Vis Spectramax 384plus(분자 장치) 플레이트 판독기에서 판독되었다. 각 판독이 기록되었고, 3반복적 판독이 평균화되고 각각의 부형제 공시약의 평균 흡광도가 감해겼고, 결과적인 공시약 조정된 탁도가 기록되었다.

D. pH

pH는 미국 약전 개요서 <791>(pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c791.html)에 기술된 바와 같이 측정되었다. 수용 기준은 제형마다 다양했고 각 개별 예에서 하기에 나열된다. 일반적으로, 엄격한 pH 조절(즉, ±0.2)이 인슐린 가용성 및 PH20 안정성을 보장하기 위해 필수적이었다. 그러나, 비-보전된 인슐린에서, 인슐린 가용성은 pH에 의해 영향을 받지 않았으므로 수용 기준의 범위가 컸다(즉, pH 7.0 내지 7.8).

실시예 6

인슐린 및 인슐린 유사체의 시판 제형에서 rHuPH20의 안정성

이 실시예에서, 시판 인슐린 및 인슐린 유사체 제형에서의 rHuPH20 안정성이 5℃ 내지 25℃에서 보관 후 rHuPH20 효소적 활성을 측정함으로써 결정되었다. 요약하면, 약 1500 U/mL의 rHuPH20이 10 mM Hepes 및 130 mM NaCl, pH 7.0을 포함하는 완충액 내에 준비되었다. 그 후, 0.4 mL의 시판 휴무린®(각 mL가 100 U 인슐린, 2.5 mg/mL 메타크레졸 및 16 mL 글리세린(Eli Lilly)) 또는 휴마로그(각 mL가 100 U 인슐린, 3.15 mg/mL 메타크레졸, 16 mg 글리세린, 1.88 mg Na₂HPO₄, 0.0197 mg 아연 이온(산화아연), 및 극미량의 페놀(Eli Lilly))이 3.6 mL의 rHuPH20 용액에 첨가되어 인슐린-rHuPH20 또는 인슐린-유사체 rHuPH20 혼합물을 형성하였다(인슐린 제품의 10x 희석물, 1350 U/mL의 최종 rHuPH20 농도). 이 용액들은 5℃ 및 25℃에 1주일까지 보관되었다. rHuPH20 효소적 활성은 상기 실시예 2B에 기술된 바와 같이 0, 1, 2, 3 및 7일차에 측정되었다. 결과는 하기 표 15에 기재되었다. 표 15에서 보여지는 바와 같이, 50%의 rHuPH20 활성이 휴마로그®-rHuPH20(인슐린 리스프로-rHuPH20) 조합물에서 25℃에서 2일 또는 그 이상 동안 배양되었을 때 소실되었다. 25℃에서 보관된 휴무린®-rHuPH20에서 상당한 소실은 관찰되지 않았는데, 아마도 그 특정 제품 내의 보존제의 낮은 수준 및 희석 인자 때문인 것으로 보인다.

실시예 7

rHuPH20에 대한 보존제의 효과

이 실시예에서, 다양한 통상적인 인슐린 및 인슐린 유사체 보존제가 rHuPH20의 효소적 활성 및 안정성에 대한 그들의 효과에 대하여 평가되었다. rHuPH20 효소적 활성은 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정되었다. 적용가능한 경우에, rHuPH20 안정성은 상기 실시예 4에 기술된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정되었다.

A. rHuPH20 효소적 활성

이 실시예에서, 통상적인 인슐린 및 인슐린 유사체 보존제 페놀, m-크레졸 및 메틸파라벤이 다양한 농도, 온도 및 시간에서 rHuPH20의 효소적 활성에 대한 그들의 효과가 평가되었다. 각 보존제는 (하기 표 16에 지시된 최종 농도에 대하여) 3.7 mg/mL 인슐린(Organon Insulin API[재조합 인간 인슐린 SIHR 143] 분말이 실시예 1에 구체적으로 기술한 스톡 용액을 준비하는데 사용되었음), 20 mM 트리스/HCl, pH7.1 내의 20 μg/mL rHuPH20, 및 140 mM NaCl을 포함하는 인슐린/rHuPH20 제형에 첨가되었고 시료는 미리 결정된 양의 시간 동안 지시된 온도에서 배양되었다.

결과는 하기 표 16에서 보여지며, 표 16에는 보존제 및 그 농도, 배양 시간 및 온도, 및 rHuPH20 효소적 활성에 대해 기재되어 있다. 결과는 온도 의존적이다. rHuPH20의 효소적 활성은 전반적인 보존제 수치가 상대적으로 높았던 (>0.2%) 35℃에서 배양한 1주일 후에 상당히 감소되었다. 대조적으로, 실온(25℃) 및 더 낮은 보존제 농도에서, rHuPH20은 적어도 1개월간 상대적 활성을 유지한다. 일반적으로, 보존제 수치가 증가하면, rHuPH20 효소적 활성은 감소한다. 추가적으로, 3가지 보존제 중에서, m-크레졸이 가장 rHuPH20에 해로웠고, 그 다음으로는 페놀과 메틸파라벤이었다.

B. rHuPH20의 겉보기 용융점(Tm)

이 실시예에서, m-크레졸, 프로필 파라벤 또는 페녹시에탄올의 존재 또는 부재하에서 rHuPH20의 용융점(Tm)이 동적 빛 산란을 이용하여 입자의 유체역학적 반지름을 측정함으로써 결정되었다. 입자 크기 증가는 아마도 변성 및 그 후의 rHuPH20의 응집으로 인한 것이다. 온도가 증가하면, 단백질은 풀어질 것이고 이는 집괴 형성으로 이어진다.

간단히 말하면, rHuPH20(Lot HuB, 10 mg/mL 스톡)은 25 mM 트리스-HCl, pH 7.5 내의 1 mg/mL으로 희석되었다. 지시된 보존제가 100% 스톡 용액으로부터 PH20 시료 내로 섞였다. Z-평균 입자 크기는 Malvern Zeta sizer Nano-ZS를 온도 증가의 함수로서 사용하는 동적 빛 산란에 의하여 측정되었다. 총 3회 측정이 각 온도에서 저부피 쿼츠 큐벳(Helma, 3.00 mm)에서 수행되었다. 온도는 20℃에서 시작해서, 2℃ 경사로, 최종 온도 66℃까지, 각 온도마다 5분 평형 기간을 두고 상승되었다. 빛 산란 강도는 장비가 장착된 173°후방 산란 검출기로 측정되었고 누적된 Z-평균 입자 데이터는 단백질 시료에 대해 1.45의 굴절 지표를 사용하고, 분산제로서 물에 대해 1.33의 굴절 지표를 사용하는 DTS(분산 기술 소프트웨어)로 계산되었다. 온도축에서 입자 크기에서 상당한 증가가 나타나는 굴절점은 단백질이 변성되고 응집되기 시작하는 겉보기 Tm(용융점)으로 간주되었다.

결과는 하기 표 17에서 보여진다. 하기 표 17에서, 평균 입자 크기는 5가지 상이한 PH20 제형에 대한 다양한 온도이다. 표 17의 데이터는 2℃ 온도 증가에서, 5분 평형점으로, 지점마다 3회 측정한 평균이다. 결과는 40℃ 위에서 임의의 보존제 없이 0.25% m-크레졸의 존재하에서 26℃까지 떨어진 rHuPH20의 Tm을 보여준다. 유사한 경향이 시차주사 열량측정법(DSC)을 사용해서 m-크레졸과 함께 또는 m-크레졸 없이 rHuPH20의 Tm을 측정하기 위하여 관찰되었으나, Tm은 0.25% m-크레졸의 존재하에 약 2℃만 감소되었다.

C. rHuPH20에 대한 결합 친화력

어떻게 보존제가 rHuPH20과 상호작용하는지 여부를 더 이해하기 위하여 역가 형광 분광학이 보존제의 rHuPH20에 대한 겉보기 결합 친화력을 측정하기 위해 사용되었다. 이 연구는 Legacy BioDesign, LLC(Johnstown, CO)에서 수행되었다.

인슐린 유사체 리스프로 (USP 참조 표준, Cat. #1342321) 및 아스파르트 (EU 참조 표준, Cat #Y000349)는 분말 형태로서 취득되었고 857 μL의 18 MΩ 탈이온수 및 23 μL의 1M HCl로 재구성되었다. 120 μL의 250 mM 트리스(pH 10.65)가 각 표준 용액에 첨가되어 pH가 7.4 및 부피가 1 mL가 되었다. 2.5 mL의 1 mg/mL 각 표준 용액 및 2가지 인슐린 용액이 30 mM 트리스 pH 7.4로 희석함으로써 준비되었다. 모든 용액은 희석시 투명하고 무색이었는데, 예외적으로 USP 인슐린 리스프로 표준은 희석시 흐릿했으나, 준비 1시간 내에 투명하게 되었다. 각 2가지 시료는 참조 표준 및 제조된 재료와 함께 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로에 대하여 준비되었다. 1 mg/mL 인슐린 용액의 형광 방출 스펙트럼이 Aviv Model ATF 105 분광형광계 및 Aviv 105 소프트웨어 버전 1.3을 사용하여 수집되었다. 석영(quartz) 형광 세포가 각 측정을 위해 2.5 mL의 용액으로 로딩되었다. 여기(excitation)가 275 nm에서 4 nm의 대역폭으로 수행되었다. 방출 스펙트럼은 340 nm 및 180 nm 사이에서 1 nm의 분해능으로 수집되었다. 참조 (QC) PMT 전압이 250V로 설정된 반면, PMT 전압은 850V로 설정되었다.

데이터는 보존제와 rHuPH20 간에 어느 정도의 상호작용이 있었음에도 불구하고, 3가지 시험된 보존제(m-크레졸, 페놀 및 벤질 알코올)이 rHuPH20의 구조를 변경시키지 않음을 보여주었다. rHuPH20과 보존제들 간의 상호작용에 대한 겉보기 해리 상수(K_D)는 40 내지 3000 μM의 범위였고, 대부분의 데이터는 일반적으로 50 내지 100 μM 범위였다. 데이터는 또한 rHuPH20이 페놀계 화합물에 민감했음에도 불구하고, 이는 비-특이적 상호작용이고 환경적 온도에 크게 의존적인 것으로 보인다는 것을 나타냈다. 비-특이적 상호작용의 결론은 구조적으로 유사한 화합물인 페닐알라닌의 첨가가 rHuPH20을 m-크레졸 또는 페놀에 의해 야기된 분해에 대해 보호하지 않는다는 사실에 의해 더욱 뒷받침되었다(하기 섹션 E 참조).

D. 기타 통상적 보존제

rHuPH20이 모든 보존제에 대하여 민감한지, 또는 인슐린 제품에서 전형적으로 사용되는 것들에 대해서만 그런지 여부를 결정하기 위하여, 다양한 기타 시판 보존제들이 rHuPH20 효소적 활성 및 안정성에 대한 그들의 효과에 대해 시험되었다.

추가적으로, 페닐알라닌이 rHuPH20 활성에 있어서 보존제의 해로운 효과가 유해한 보존제 몇몇에 존재하는 페놀 고리 단독에 의해서 수행되는 것인지 여부를 평가하기 위하여 잠재적인 안정화제로서 첨가되었다. 페닐알라닌은 페놀계 보존제와 경쟁하고 안정화 효과를 제공할 수도 있을 것으로 가설이 세워졌다.

이들 연구에서, 총 100 μg/mL의 rHuPH20이 25 mM 트리스/HCl, pH 7.3, 140 mM NaCl, 0.01% 폴리소르베이트 80 및 특정한 수치의 선택된 보존제를 포함하는 기본 제형에 첨가되었다. 보존제 각각에 대하여 선택된 농도는 주로 문헌 데이터(예컨대, Kibbe, A. H., (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3판, Pharmaceutical Press; Powell 등., (1998) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 참조) 및 기존의 시판 제품에 존재하는 것으로 알려진 수치에 기초하였다.

결과는 하기 표 18-20에 기재되었다. 결과는 클로르헥시딘염 및 티메로살은 rHuPH20 효소적 활성에 영향을 주지 않는 것을 보여준다. 대조적으로, 벤잘코늄 클로라이드 또는 4-클로로-1-부탄올은 25℃에서 단 24시간 후에 rHuPH20 효소적 활성에 상당한 감소를 야기하였다. 페녹시에탄올 또는 m-크레졸의 첨가는 온도 의존적 방식으로 rHuPH20 활성의 감소를 야기했다. 4℃에서, rHuPH20의 활성은 보존제를 포함하지 않는 대조 시료와 대략 동일했는데, 반면 35℃에서 rHuPH20 활성은 적어도 48시간 내에 파괴되었다(표 20 참조).

메틸파라벤은 일반적으로 25℃에서 또는 단시간의 기간 동안, 예를 들어 24시간 동안, 35℃에서 rHuPH20 효소적 활성에 극히 적은 효과를 보였으나, 35℃에서 6일 동안 배양한 후에는 모든 효소적 활성이 소실되었다. 추가적으로, 메틸파라벤은 m-크레졸 또는 페놀과 비교하여 덜 효과적인 보존제이다. 페닐알라닌을 저농도 (5mM) 또는 고농도 (50 mM)로 첨가하는 것은 페놀계 보존제 m-크레졸 또는 메틸파라벤의 존재하에 rHuPH20 활성의 소실에 영향을 주지 않았다.

보존제의 첨가에 의해 야기된 효소적 활성의 소실 및 상승된 온도는 주로 rHuPH20 집괴의 형성에 기여했다. 하기 표 21-22에서 보여지는 바와 같이, 35℃에서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 주피크의 소실은 rHuPH20 효소적 활성의 소실에 수반하였다(표 21-22 참조). 추가적으로, 35℃에서 보관되었을 때 상당한 집괴 피크가 m-크레졸을 포함하는 시료에서 관찰되었다. 통상적인 보존제들은 상승된 온도 및 초과시간에서 rHuPH20 활성의 소실을 야기한다. 좀 더 양립할 수 있는 보존제, 예컨대 티메로살 및 클로르헥시딘염이 확인되었다.

E. 보존제 수치 및 항균제 효율성

현재 서로 다른 규제 기관들은 다중 투여를 위해 설계된 약학적 제품들에 대한 항균제 효율성에 대한 상이한 약전 기준을 갖고 있다. 표 23은 USP 및 EP 기준을 충족하는 주사가능한 약물에 대한 기준을 보여준다. 그러므로, rHuPH20에 대한 보존제의 효과를 더 평가하기 위하여 다양한 기준을 충족하기 위한 최소 보존제 농도를 결정할 필요가 있었다.

상이한 수준의 보존제와 타겟팅된 양의 인슐린 및 rHuPH20을 포함하는 제형들의 뱃치(batch) 수 개가 미생물 효율성 시험을 위해 준비되었다. 시험은 대조 분석 연구소(Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA)에 의하여 EP 및 USP의 지침서에 따라 수행되었다. 인슐린/rHuPH20 제형은 다음을 포함한다: 100 U/mL 인슐린(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143), 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl 및 0.02% 폴록사머 188. 인슐린은 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되었다. 다양한 보존제를 포함하는 제형들이 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), E.coli, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항-미생물 효율성이 시험되었다. 시험은 1) 각 유형의 박테리아의 최초 접종물(최소 10⁵ CFU/mL)을 시료에 첨가 및 2) 각 유형의 박테리아의 CFU/mL를 6시간, 1일 및 7일에 측정함으로써 수행되었다. 미가공 데이터(CFU/mL)는 측정된 접종물로부터 로그 10 유닛 감소로 전환되었다. 제형들은 37℃의 온도에서 시험되었고 각 유기체는 각 제형과 별도로 배양되었다.

결과는 표 24에서 보여진다. 표 24는 보존제의 백분율 및 조합이 EPA, EPB 및 USP의 항균 효율성 기준을 합격했는지 또는 불합격했는지 여부를 나타낸다.

USP 항균 효율성 기준을 충족하는 적합한 보존제 수치를 결정하기 위해, 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸의 조합의 추가 연구가 착수되었다. 기본 제형은 다음을 포함한다: 3.75 mg/mL 인슐린(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143 그리고 스톡 용액은 실시예 1에 구체적으로 기술한 방법에 의해 준비되었음), 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/ HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl 및 0.02% 폴록사머 188. 결과는 하기 표 25에서 보여진다. 표 25는 보존제의 백분율 및 조합이 USP의 항균 효율성 기준을 합격했는지 또는 불합격했는지 여부를 나타낸다. 제형 #2를 제외하고, 모든 조합이 USP 미생물 효율성 기준을 합격하였다.

유사한 실험이 페놀 및 m-크레졸의 다른 백분율 조합에 대해서도 수행되었다. 결과는 표 26에 나타내었다.

실시예 8

보존제의 조합 및 NaCl과 pH의 인슐린의 가용성 및 rHuPH20의 효소적 활성에 대한 효과

A. rHuPH20 효소적 활성에 대한 보존제의 조합의 효과

이 실시예에서, 통상적인 인슐린 및 인슐린 유사체 보존제의 조합이 다양한 농도에서 30℃에서 1개월간 rHuPh20의 효소적 활성에 대한 그들의 효과에 대하여 시험되었다. 각 보존제가 (하기 표 27에 지시된 최종 백분율로) 첨가되어, 인슐린/rHuPH20 제형이 100 U/mL 인슐린, 5 μg/mL (600 U/mL) rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl 및 0.02% 폴록사머 188을 포함하는 제형이 되었고 시료는 T=0 및 30℃에서 1개월간 배양 후에 시험되었다. 인슐린은 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 준비되었고 rHuPH20은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 준비되었다.

결과는 하기 표 27에 나타냈다. 표 27은 보존제 및 그 백분율, 시간 T=0 및 30℃에서 1개월간 배양 후의 rHuPH20 효소적 활성에 대해 나타낸다. 결과는 인슐린/rHuPH20을 30℃에서 1개월간 페놀계 보존제 하나 또는 조합의 존재하에서 배양한 경우 rHuPH20의 효소적 활성에서 감소를 야기한다는 것을 보여준다.

이 실시예에서, 페놀 및 m-크레졸의 조합이 다양한 농도, 온도 및 배양 시간에서 rHuPH20의 효소적 활성에 있어서의 그들의 효과에 대해 시험되었다. 각 보존제가 (하기 표 28에 지시된 최종 백분율로) 첨가되어, 인슐린/rHuPH20 제형이 100 U/mL 인슐린, 5 μg/mL (600 U/mL) rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 50 mL 글리세린, 50 mM 메티오닌, 및 0.01% 폴록사머 188을 포함하는 제형이 되었다.

결과는 하기 표 28에 나타냈다. 표 28은 보존제 및 그 백분율, 및 다양한 배양 시간 및 온도에서의 rHuPH20 효소적 활성에 대해 나타내었다. 상기에서 관찰된 바와 같이, 보관 온도는 효소적 활성에 상당한 효과를 갖는다. 보존제와 관계 없이, 30℃ 또는 37℃에서 배양된 시료는 25℃에서 배양된 시료와 비교하여 상당히 감소된 효소적 활성을 가졌다. 추가적으로, m-크레졸은 페놀보다 rHuPH20의 활성에 있어서 더 해로웠다. m-크레졸의 백분율이 증가됨에 따라, rHuPH20의 효소적 활성은 감소했다.

B. NaCl 및 pH의 인슐린 리스프로 가용성 및 rHuPH20 효소적 활성에 대한 효과

이 실시예에서, 완전 배치 연구 디자인이 0.15% 메타-크레졸 (m-크레졸) 및 0.15% 페놀의 존재하에서 NaCl 및 pH의 인슐린 리스프로의 가용성 및 rHuPH20의 효소적 활성에 대한 효과를 결정하기 위해 이용되었다. 4가지 상이한 pH 값 및 4가지 NaCl 농도가 평가되어, 총 16가지 시료를 생성했다.

pH 및 NaCl을 제외한 모든 구성요소들은 120 U/mL 인슐린 리스프로, 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl (Trizma, Sigma, Cat No. T6066), 0.15% m-크레졸, 0.15% 페놀, 0.01% 폴록사머 188(Poloxamer 188, Spectrum, Cat No.P1169), 및 0.1 mM 첨가된 ZnCl₂(EMD, Cat No.ZX0065-1)로 일정하게 유지되었다. pH 값은 7.0, 7.2, 7.4 및 7.6에서 시험되었다. 시험된 NaCl 농도는 50, 80, 110 및 140 mM이었다. 보존제는 페놀(Riedel-dh Haen, 16017, multiple compendia) 및 m-크레졸(Fluka, Cat No.65996)이었다. 퍼센트 인슐린 리스프로 회복은, 2-8℃에서 0, 0.25, 0.5, 1, 3, 5, 9 및 12 개월간 보관 후에 각 시료에 대하여 결정되었다. rHuPH20 효소적 활성은, 5℃에서 2주, 1, 5, 9 및 12개월간, 25℃에서 1주, 2주, 1개월 간, 30℃에서 1주 및 2주, 및 35℃에서 1주간 보관 후에, 각 시료에 대하여 측정되었다.

16가지 시료를 준비하기 위해, 각각 상이한 NaCl 농도를 가진 4가지 스톡 용액이 준비되었다. 인슐린 리스프로는 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되었고, 최종 인슐린 pH가 7.6이 되도록 준비했다. 기타 통상적인 구성요소들은 모두 그들의 최종 농도까지 첨가되었다. 그 후 각 스톡 용액의 pH는 1N 또는 0.1N NaOH로 7.6에서부터 7.0까지 연속적으로 적정되었다. pH의 정밀도는 ±0.02로 조절되었다. 정해진 pH가 도달할 때마다, 1mL의 용액이 제거되고 2mL 1형 유리 바이알 내로 채워졌다. 모든 시료가 준비되자, 그들은 시험이 수행되기 전까지 2-8℃에서 보관되었다. 역상-HPLC(RP-HPLC)는 하기의 변형이 된 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되었다. 이동상은 물(A) 내의 75% 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토나이트릴(B) 내의 25% 0.1% TFA로 시작하여 선형 구배로 16분에 걸쳐 68% A + 32% B가 되었고, 4분 동안 정지 시간을 거친 후, 5분 동안 100% B로 선형 증가되었다.

하기 표 29는 2-8℃에서 12개월간 보관 후에 원래 농도 (120 U/mL)의 % 잔류로서 표현된 가용성에 대해 나타낸다. 하기 표 30-31은 다양한 온도에서 다양한 시점 후에 rHuPH20 효소적 활성에 대해 나타낸다. 하기 표 32는 다양한 온도에서 다양한 시점 후에 rHuPH20 퍼센트 회복을 나타낸다. 인슐린 리스프로 가용성 및 rHuPH20 활성은 하기에 요약된다.

인슐린 리스프로 가용성

하기 표 29에 나타난 바와 같이, 인슐린 리스프로는 낮은 염 농도 및 높은 pH에서 안정하다. 예를 들어, pH 7.6에서, 인슐린 리스프로는 140 mM NaCl에서 단 2주간 안정했던 반면, 50 및 80 mM NaCl에서 적어도 12개월간 안정했다. 대조적으로, pH 7.0에서, 인슐린 리스프로는 50 mM NaCl에서 단 5개월간 안정했다. 가용성은 80, 110 또는 140 mM NaCl에서 단 1주 후에 65% 아래로 떨어졌다.

rHuPH20 효소적 활성

하기 표 29-30에서 보여지는 바와 같이, rHuPH20은 높은 염 농도 및 낮은 pH에서 안정하다. 50 mM NaCl에서 그리고 140 mM 농도의 NaCl에서 더 낮은 rHuPH20 활성을 가졌음에도 불구하고, rHuPH20은 5℃에서 12개월간 안정하다. 25℃에서, rHuPH20 효소적 활성은 pH7.6에서 단 1주 후 및 더 낮은 pH에서 2주 후에 낮은 염 농도에서 크게 감소되었다. 30℃에서, rHuPH20은 140 mM NaCl 및 pH7.0에서만 유용한 효소적 활성을 유지했다. 35℃에서 1주 후에, 의미있는 rHuPH20 효소적 활성이 남아있지 않았다.

실시예 9

보존제의 상이한 조합 하에서 인슐린 안정성 및 rHuPH20 효소적 활성에 대한 NaCl의 효과

이 실시예에서, NaCl 및 pH의 인슐린(레귤러 인슐린) 및/또는 인슐린 유사체(리스프로 또는 아스파르트) 안정성, 및 rHuPH20 효소적 활성에 대한 효과가 2-8℃에서 단기 및 장기 보관(7일, 5개월 또는 9개월) 및 35℃, 30℃ 및 25℃를 포함하는 상승된 온도에서 단기 보관(1개월 또는 이하)을 포함하는 다양한 보관 조건에 대해 결정되었다.

기본 제형은 하기 섹션 A-C에 나타내었다. 각 개별 연구에 대해, 조성물의 기타 구성요소가 동일했던 반면에 pH 및 NaCl 농도는 다양했다. 각각의 미리 결정된 보존제 조합에서 인슐린/인슐린 유사체 각각에 대한 시료를 준비하기 위해, 4가지 스톡 용액이 인슐린 및/또는 인슐린 유사체 각각에 대해 준비되었다. 인슐린 및 인슐린 유사체 스톡은 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, 최종 인슐린 pH가 7.6에 설정되도록 준비되었다. 모든 스톡 용액은 적절한 수치의 보존제 및 NaCl 농도(50, 80, 110 또는 140 mM)를 포함했고, 기타 통상적인 구성요소는 모두 그들의 최종 농도까지 첨가되었다. 그리고 나서 각 스톡 용액의 pH는 7.6에서 최종 타겟 pH까지 연속적으로 1N 또는 0.1N NaOH로 적정되었다. pH의 정밀도는 ±0.02에서 조절되었다. 정해진 pH가 도달될 때마다, 1mL의 용액이 제거되고, 0.2 마이크론 PES 필터를 통해 여과되고, 2mL 1형 유리 바이알 내로 채워졌다. 모든 시료가 준비되자, 그들은 시험이 수행되기 전까지 2-8℃에서 보관되었다.

A. NaCl 및 pH의 2-8℃에서 7일간 인슐린/인슐린 유사체 가용성에 대한 효과를 위한 완전 배치 연구

이 실시예에서, 완전 배치 연구 디자인이 보존제의 상이한 조합 존재에서 레귤러 인슐린 및 유사체 리스프로 또는 아스파르트의 가용성에 대한 NaCl 및 pH의 효과를 결정하기 위해 이용되었다. pH, NaCl 및 보존제를 제외한 기타 제형 구성요소들은 일정하게 유지되었다: 120 U/mL 인슐린/인슐린 유사체, 5 μg/mL rHuPH20 (600 U/mL), 20 mM 트리스/HCl (Trizma, Sigma, Cat No. T6066), 0.02% 플루로닉® (폴록사머 188, Spectrum, Cat No.P1169) 및 0.1 mM ZnCl₂(EMD, Cat No.ZX0065-1). 3가지 상이한 조합의 보존제 수치가 활용되었다: 1) 0.15% m-크레졸(Fluka, Cat No.65996) 및 0.2% 페놀(Riedel-dh Haen, 16017, multiple compendia); 2) 0.15% m-크레졸 및 0.15% 페놀; 및 3) 0.15% m-크레졸 및 0.2% 메틸파라벤(Fluka, Cat No.85265). 각 보존제 조합으로, 6가지 pH 수치 및 4가지 NaCl 농도 수치(총 24가지 시료)의 전체 조합이 생성되었다. 시험된 pH 값은 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 및 7.6이었다. 시험된 NaCl 농도는 50, 80, 110 및 140 mM이었다.

역상-HPLC(RP-HPLC)는 하기의 변형이 된 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행되었다. 이동상은 물(A) 내의 75% 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토나이트릴(B) 내의 25% 0.1% TFA로 시작하여 선형 구배로 16분에 걸쳐 68% A + 32% B가 되었고, 4분 동안 정지 시간을 거친 후, 5분 동안 100% B로 선형 증가되었다. 결과는 하기 표 33-35에 나타난다. 표 33-35에서는 2-8℃에서 7일간 보관 후에 원래 농도 (120 U/mL)의 % 잔류로서 표현된 가용성에 대해 나타낸다. 하기 표 33은 리스프로에 대한 결과를 나타낸다. 표 34는 레귤러 인슐린에 대한 결과를 나타낸다. 표 35는 인슐린 아스파르트에 대한 결과를 나타낸다.

3가지 인슐린/인슐린 유사체 분자 모두 pH 및 NaCl 농도에 유사하게 반응했다. 낮은 pH 및 높은 NaCl 농도에서, 잔류하는 인슐린/인슐린 유사체의 백분율에서 감소에 의해 나타난 바와 같이, 인슐린/인슐린 유사체는 결정 및 침전물을 형성했다. 이러한 결과는 시각적 조사에 의해 검증되었다. 3가지 인슐린/인슐린 유사체 모두 50 mM NaCl에서 pH≥7.2, 80 mM NaCl에서 pH≥7.4, 및 110 mM NaCl에서 pH≥7.6에 대해, 모든 보존제 조합에서 가용성이었다. 유사하게, 3가지 인슐린/인슐린 유사체 모두 140 mM NaCl에서 pH≤6.8 그리고 80 mM 및 110 mM NaCl 둘 다에서 pH 6.6에서 적절하게 가용성이 아니었다(관찰된 농도〈 90 U/㎖ 또는 75%). 가용성에 대한 정확한 경향은 3가지 인슐린/인슐린 유사체 간에서 다양했다. 시험된 조건하에서, 인슐린 아스파르트가 가장 가용성이었고 그 다음으로 인슐린 리스프로였고, 가장 가용성이 아니었던 것은 레귤러 인슐린이었다. 또한 보존제 적합성에서 차이가 있었는데, 인슐린 아스파르트 및 레귤러 인슐린은 0.15% 페놀 및 0.15% m-크레졸에서 가장 가용성이었고 인슐린 리스프로는 0.15% m-크레졸 및 0.2% 메틸파라벤에서 가장 가용성이었다. 메틸파라벤은 염 농도가 낮을 때 더 나은 보존제로 보이지만, 더 높은 염 농도에서, 페놀 또는 메틸파라벤을 포함하는 시료간에 차이가 나타나지 않았다.

레귤러 인슐린은 더 높은(〉110 mM) NaCl 농도에서, 높은 pH에서조차 완전히 용해되지 않았다. 표 34는 2-8℃에서 단 7일 후에 시험 조건의 50% 이상이 원래 값의 90% 아래의 인슐린 농도를 가지는, 인슐린의 낮은 가용성을 확인한다. 페놀 농도 감소 및/또는 페놀의 메틸파라벤으로의 대체는 가용성을 약간 증가시킨다. 이러한 실험 하에서, NaCl 농도에서 30 mM 증가를 수반하는 가용성 소실은 0.2 pH 유닛 감소와 비슷했다. 이러한 데이터는 높은 NaCl 농도가 5℃ 보관 동안 인슐린 가용성에 영향을 줄 것이기 때문에 인슐린 유사체에 상대적으로 레귤러 인슐린 제형이 감소된 NaCl 농도 및/또는 증가된 pH를 요구하기 쉽다는 것을 설명한다.

B. 감소된 m-크레졸 수치에서의 사후연구

인슐린 가용성은 감소된 m-크레졸 수치로 단순화된 사후연구에서 추가적으로 평가되었다. 4가지 보존제 수치의 조합이 활용되었다: 1) 0.1% m-크레졸 및 0.15% 페놀; 2) 0.1% m-크레졸 및 0.2% 페놀; 3) 0.1% m-크레졸 및 0.15% 메틸파라벤; 및 4) 0.1% m-크레졸 및 0.2% 메틸파라벤. 2가지 pH 수치 (7.3 및 7.1) 및 2가지 NaCl 농도(120 및 100 mM)이 평가되었다. 나머지 제형 구성요소는 일정하게 유지되었다: 120 U/mL 레귤러 인슐린, 5 μg/mL rHuPH20 (600 U/mL), 20 mM 트리스/HCl (Trizma, Sigma, Cat No. T6066), 0.02% 폴록사머 188 (Poloxamer 188, Spectrum, Cat No.P1169) 및 0.1 mM ZnCl₂(EMD, Cat No.ZX0065-1). 제형들은 상기 기술된 바와 같이 준비되고 시험되었다.

결과는 하기 표 36에 나타내었다. 레귤러 인슐린의 전반적인 가용성은 더 적은 양의 m-크레졸의 존재에서 약간 증가하고, 추가적으로, 페놀이 메틸파라벤으로 대체되었을 때 약간 증가했다.

C. pH 및 NaCl의 rHuPH20 및 인슐린 안정성에 대한 장기적 효과

이 실시예에서, 2-8℃에서 인슐린 가용성을 최대화시키고 실온 또는 그 이상에서 높은 보존제 수치에서 rHuPH20 안정성을 최대화시키는 조건을 확인하기 위하여 레귤러 인슐린 및 rHuPH20 가용성에 대한 pH 및 NaCl의 효과를 결정하기 위해 완전 배치 연구 디자인이 이용되었다. 보존제 수치는 EP-A 기준을 충족하도록 설정되었다. 4가지 수치의 NaCl 농도 및 4가지 수치의 pH가 평가되어 총 16개의 시료를 생성했다. 시료는 단기 가속화 조건(고온) 및 2-8℃에서 장기 보관 하에서 안정성에 대해 평가되었다.

레귤러 인슐린(100 U/mL, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되어, 최종 pH 7.0이 됨) 및 5μg/mL rHuPH20이 20 mM 트리스/HCl, 0.1 mM ZnCl₂, 0.01% 폴록사머 188, 0.15% m-크레졸 및 0.2% 페놀을 포함하는 통상적인 완충액 내에서 제형화되었다. 가용성은 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 결정되었다. 가용성은 100%가 100 U/mL인, 표준과 비교하여 상대적인 퍼센트로 표현되었다.rHuPH20 효소적 활성은 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 평가되었다. RP-HPLC는 rHuPH20의 총 함량 및 순도를 관찰하기 위해 사용되었다(상기 실시예 3 참조). 데이터는 Design Expert 7.0(StatEase)에 의해 처리되었다. ANOVA 및 상관관계 분석은 JMP 8.0 소프트웨어에 의해 수행되었다.

결과는 하기 표 37-42에 나타내었다. 표 37-38은 rHuPH20 효소적 활성을 나타내고 표 39는 rHuPH20 퍼센트 회복을 나타낸다. 단기 가속화 조건하에서, 하기 표 37에 지시된 바와 같이, rHuPH20 효소적 활성은 pH, NaCl 및 보관 조건에 의해 영향을 받는다. 35℃에서 1주 보관 후, 의미있는 rHuPH20 활성이 남아있지 않았다. 30℃에서 보관 후에 효소적 활성은 35℃와 비교하여 개선되었으나, 〉375 U/mL를 유지한 유일한 제형은 높은 NaCl 농도 (140 mM) 및 낮은 pH 7.0)을 가졌다. 일반적으로, pH가 높고 염 농도가 낮을수록, 효소적 활성은 더 낮다. 30℃에 대해 관찰된 경향이, 특히 낮은 염 및 높은 pH를 갖는 제형에 대해서, 남아있었음에도 불구하고, 25℃의 보관 온도에서 rHuPH20 효소적 활성에 대한 효과는 크게 감소되었다. 제형의 대다수가 4주 시점에서 375 U/mL의 설정된 기준보다 높게 효소적 활성을 유지했다. 5℃에서, 1개월간 보관 후에조차, 근본적으로 rHuPH20 효소적 활성의 소실이 없었다. 이 경향은 하기 표 38에서 보여지는 바와 같이 2-8℃에서 보관한지 9개월 넘게 유지되었다. 요약하면, rHuPh20은 25℃ 또는 더 낮은 온도에서 보관되었을 때, 특히 NaCl 농도가 80 mM 보다 높게 유지되었을 때 효소적 활성을 유지한다. 안정성은 25℃보다 높은 온도에서 빠르게 감소한다. RP-HPLC는 rHuPH20의 함량 및 순도를 관찰하기 위해 사용되었다. 하기 표 39에서 보여지는 바와 같이, 효소적 활성의 소실은 rHuPH20 함량의 소실과 상관관계가 있다(통계적 분석, p〈0.001). rHuPH20 순도의 분석은 rHuPH20 주피크 면적에 대한 상대적인 피크 면적 순도 값에서의 유의성있는 경향 또는 차이를 드러내었는데(데이터는 보여지지 않음), 이는 순도가 일정하므로 활성의 소실은 총 함량의 소실 때문이라는 것을 나타낸다. 함량의 소실은 rHuPH20의 응집 및 침전으로 이어지는, 높은 보존제 농도 및 온도에서 단백질 풀림 때문일 수 있다.

표 40-41은 2-8℃에서 장기 보관 후에 인슐린 주피크의 퍼센트 및 인슐린 회복의 퍼센트를 나타낸다. 표 38에서, 인슐린 회복의 퍼센트는 인슐린 주피크 및 데사미도 피크의 합계에 기초했다. 표 40에서 보여지는 바와 같이, 인슐린 주피크 백분율은 상당한 변화 없이 높게(약 97%) 유지되었는데, 이는 소실이 탈아민화 또는 응집과 같은 인슐린 화학적 또는 물리적 분해 때문이 아니라는 것을 나타낸다. 바이알의 시각적 조사는 때때로 흐린 용액과 함께 투명한 결정 또는 결정-유사 입자의 미세한 빛나는 조각의 혼합물을 나타내었다. 표 41의 데이터는 각 시점에서 제형에서 용액 내에 잔류하는 인슐린 함량을 요약한다. 최초 조건과 비교된 인슐린 회복은 가용성의 지표이다. 인슐린 침전/결정화는 시험된 pH 및 NaCl 농도의 범위에 의존적으로 다양했다. 일반적으로, pH가 낮고 염 농도가 높았을 때(rHuPH20 활성에 유리한 조건), 인슐린은 결정을 아주 신속하게 형성했고 수 개월 내에 평형 상태에 도달했다. 낮은 염 농도 및 높은 pH에서, 결정화는 느렸고 인슐린 분자의 대부분이 9개월에 용액 내에 잔류했다. 인슐린 회복 데이터의 통계적 분석(하기 표 42 참조)은 pH, NaCl, 시간, pH*NaCl 및 NaCl*시간이 모두 상당히 인슐린 가용성에 영향을 준다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 연장된 시기 동안 인슐린 가용성이 높은 pH(7.4보다 높은) 및 낮은 NaCl(80 mM보다 낮은)에 의존적이며, rHuPH20 효소적 활성을 유지하는 조건에 정반대라는 것을 나타낸다.

실시예 10

인슐린 유사체 제형 개발: rHuPH20과 제형화된 인슐린을 위한 안정화제 스크리닝

보존제는 다중 투여로 인해 가능한 인슐린의 잠재적인 미생물 오염에 대하여 보호한다. 전형적인 보존제는 m-크레졸, 페놀 및 파라벤이다. 이러한 보존제들은 항미생물제로 작용하기도 하지만 또한 인슐린의 고차구조를 안정화시키는 역할도 한다. 페놀계 보존제는 rHuPH20의 안정성을 감소시키는 것으로 보여진다(실시예 7 참조). 이 실시예에서는, 페놀계 보존제의 존재에서 다양한 안정화제가 인슐린/인슐린 유사체의 안정성을 유지하는 반면 rHuPH20의 분해를 방지하기 위한 능력에 대하여 스크리닝되었다. 스크리닝된 안정화제는 아미노산 및 그의 유도체, 염 및 완충제 종류, 폴리올 및 기타 화합물을 포함하는, 통상적으로 사용되는 약학적 부형제를 포함했다. 안정성은 rHuPH20 효소적 활성 및 인슐린 가용성에 의해 결정되었다. 특정한 안정화 효과는 rHuPH20의 흡수적 소실 및/또는 산화의 방지 및 rHuPH20 효소적 활성에 의해 측정된 일반적인 안정화 효과를 포함했다.

A. rHuPH20 효소적 활성에 대한 다양한 계면활성제의 효과

수 개의 통상적인 계면활성제, 즉 폴리소르베이트 80(PS80), 폴리소르베이트 20(PS20) 및 폴록사머 188(Pluronic® F68)이 rHuPH20 제형을 보존하는 능력에 대하여 스크리닝되었다. 모든 제형은 pH 6.5에서 100 μg/mL rHuPH20 (12,000 U) 및 150 mM NaCl을 포함했다. 제형들은 계면활성제와 계면활성제 농도 및 완충액(히스티딘 또는 포스페이트)에 있어서 다양했다. 제형들은 35℃에서 10일 동안 교반의 대상이 되었고, 시료들은 3일차 및 10일차에 rHuPH20 활성에 대해 분석되었다. rHuPH20 효소적 활성은 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 결정되었다. rHuPH20 안정성은 RP-HPLC에 의해 rHuPH20의 산화 피크를 측정함으로써 그리고 크기배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정되었다(상기 실시예 3 및 4 참조).

제형들 및 rHuPH20 효소적 활성의 결과는 하기 표 43에 나타내었다. RP-HPLC에 의해 측정된 rHuPH20 산화의 ANOVA 분석은 계면활성제 유형, 계면활성제 농도, 완충액 또는 교반 시간에 따라 효소적 활성에 있어서 유의성있는 차이를 보이지 않았다(F=0.6832, p=0.6397). 추가적으로, SEC 결과는 주피크의 크기에 있어서 검출가능한 차이를 보이지 않았다(결과는 보여지지 않음).

rHuPH20 산화의 결과는 하기 표 44에 나타내었다. 결과는 산화 피크 면적이 계면활성제 및 교반 시간의 증가와 함께 증가되었음을 보여준다. 폴리소르베이트 20은 측정가능한 양의 퍼록시다제 활성을 포함하는 것으로 알려져 있다(예컨대, Donobrow 등, (1978) J. Pharm Sci .67 (12):1676-1681, 또는 Kibbe, A.H., ed.(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients. 3rd Edition, American Pharmaceutical Association & Pharmaceutical Press: Washington, DC & London, UK 참조). 이 연구에서, 사용된 폴리소르베이트 20은 rHuPH20의 높은 산화를 초래한 오래된 롯트였다; 대조적으로, 폴록사머 188은 극미한 정도의 산화를 초래했다. 분산의 다변량 분석은 계면활성제 유형 및 농도 뿐 아니라 교반 시간이 rHuPH20의 산화 수치에 영향을 준다는 것을 나타내었다 (하기 표 45 참조). 또한, 유의성은 계면활성제 대 농도, 계면활성제 대 시간 및 농도 대 시간을 포함하는 상호작용항이었다.

이러한 결과에 기초하여, rHuPH20 제형에의 계면활성제의 첨가는 효과적으로 rHuPH20의 소실을 감소시킬 수 있다는 것이 명백하며, 이는 아마도 흡수적 소실 및 공기-물 접점에서의 잠재적인 변성 방지 때문이다. 그러나, 계면활성제의 첨가로부터의 잠재적인 결점은 그것이 rHuPH20의 산화를 증가시킬지도 모른다는 것이다.

B. 메티오닌

1. rHuPH20 산화 방지에 있어서의 메티오닌의 효과

rHuPH20은 2개의 잠재적인 산화 부위를 갖고 있다: Met458 및 Met35. RP-HPLC로 분석되었을 때 "ox-1" 피크는 Met458에 상응하고 주 산화 피크이다. "ox-2" 피크는 두 메티오닌 산화를 포함한다. 메티오닌 산화는 유리 메티오닌을 잠재적인 산화적 화합물과 반응하도록 스캐빈저로서 첨가함으로써 방지될 수 있다.

a. rHuPH20 제형

이 연구에서, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및/또는 폴록사머 188의 존재에서 rHuPH20의 산화에 대한 유리 메티오닌의 첨가의 효과가 평가된다. 각 제형은 5 μg/mL rHuPH20, 0.02% 지정된 계면활성제, 50 mM 포스페이트, pH 6.5, 150 mM NaCl 및 메티오닌(0 내지 50 mM)을 포함한다. 시료는 30℃에서 72시간 동안 배양되었고 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 검사되었다. 결과는 하기 표 46에 나타내었다. 통계적 분석은 하기 표 47에 나타내었다. 결과는 메티오닌이 rHuPH20의 산화를 2 mM의 농도에서 방지한다는 것을 나타내었다.

b. rHuPH20/인슐린 제형

메티오닌이 그것의 rHuPH20/인슐린 제형의 rhuPH20 산화를 방지하는 능력에 대하여 시험되었다. 제형들은 100 U/mL 인슐린(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143, 스톡 용액은 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되었음), 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, pH 7.4, 80 mM NaCl, 0.03% 폴록사머 188, 0.1% 페놀 및 0.1% m-크레졸을 포함하고, 40 mM 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않았다. 제형들은 30℃에서 5주간 배양되어 rHuPH20의 산화 피크를 평가하였다. 결과는 ox-1 피크가 메티오닌을 포함하지 않는 제형과 비교하여 메티오닌을 포함하는 제형에서 RP-HPLC에 의해 측정된 것 보다 상당히 작았다는 것을 보여준다.

2. 일반적인 안정화제로서의 메티오닌

메티오닌이 더 높은 온도 및 보존제 함량에서 rHuPH20 효소적 활성의 소실을 방지하는 능력에 대하여 추가적으로 평가되었다. 실험 계획(Designed of experiment, DOE) 반응 표면 방법론 연구(RSM)가 상이한 수치의 NaCl 농도 및 pH에서 rHuPH20 효소적 활성에 대한 메티오닌의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 기본 제형은 100 U/mL 인슐린(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143, 스톡 용액은 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되었음), 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, 0.1% m-크레졸, 0.1% 페놀, 및 0.01% 폴록사머 188을 포함했다. 메티오닌 농도 범위는 40 및 80 mM 사이에서 다양했고, NaCl 농도 범위는 70 및 110 mM 사이에서 다양했고 pH 범위는 7.2 및 7.6 사이였다. 제형들은 30℃에서 4주 또는 35℃에서 5일간 배양되었고 rHuPH20 활성은 상기 실시예 2에 나타난 바와 같이 결정되었다.

데이터는 하기 표 48에 나타내었다. 데이터의 통계적 분석은 하기 표 49-50에 나타내었다. 데이터는 NaCl의 농도가 30℃ 및 35℃ 둘 다에서 rHuPH20의 안정성에 유의성있는 효과를 갖는다는 것을 보여준다. pH는 35℃에서 유의성 있는 효과를 가졌다. 메티오닌은 40 및 80 mM 사이에서 rHuPH20에 대해 안정화 효과를 보이지 않았다. 사후연구는 결과가 메티오닌의 존재 또는 부재에서 동일했다는 것을 나타내었다. 각각 1 및 20 mM 메티오닌에 대하여 650 U/mL에서 시작하는 rHuPH20 효소적 활성을 갖는 제형들은, 1개월간 30℃에서 보관 후에 525 및 522 U/mL까지 떨어졌다. 그러므로, 메티오닌은 항-산화제로 작용하나, rHuPH20의 보존제 및 열 스트레스에 대한 전반적인 안정성을 개선하지는 않는다.

C. rHuPH20/인슐린 제형에 대한 잠재적인 안정화제 스크리닝

다양한 화합물들이 그들의 rHuPH20/인슐린 제형 내에서의 단백질 안정화제로서 작용하는 능력에 대하여 스크리닝되었다. 부형제는 아미노산 및 그의 유도체, 아민, 폴리올, 염 및 완충제 및 기타 화합물들을 포함했다(하기 표 51 참조). 각 화합물은, 전형적으로 2가지 농도에서, rHuPH20 효소적 활성 및 인슐린 가용성에 대한 효과에 대하여 스크리닝되었다. 기본 제형은 전형적으로 pH 7.3±0.1에서 100 U/mL 인슐린/인슐린 유사체, 5 μg/mL rHuPH20, 20 mM 트리스/HCl, 0.15% m-크레졸 및 0.2% 페놀을 포함했다. 100-140 mM NaCl을 포함하는 제형들은 참조 제형으로서 사용되었고 잠재적인 안정화제들은 제형 내에서 NaCl의 전부 또는 일부를 대체했다. rHuPH20 효소적 활성은 약 1주일간 30℃에서 배양된 시료에서 상기 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정되었다. 인슐린 가용성은 5℃에서 보관된 시료에서 RP-HPLC에 의해 평가되었다(상기 실시예 3 참조).

결과는 하기 표 51에 나타내었다. 평가는 NaCl과 비교하여 반-정량적이었다. 시험된 화합물들의 대다수는 잔류하는 것들과 인슐린 가용성에 있어서 효과가 없어서 인슐린 가용성에 있어 감소를 초래하였다. 종전의 데이터(실시예 8-9 참조)는 용액 내의 단백질의 전하에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 두 조건인 pH 및 염이 인슐린 가용성에 영향을 준다는 것을 나타내었다. 금번 스크리닝에서, 2가 양이온(Mg²⁺(염화마그네슘) 및 SO4^2-(황산나트륨) 및 Lys-Lys)을 포함하는 분자 또는 화합물은 인슐린의 심한 침전을 초래했다. 전하 격퇴 기전이 인슐린 분자들이 서로 상호작용하는 것을 막는 데 있어서 중요할 수도 있다고 보인다. Lys-Lys, 염화마그네슘 및 히알루론산 올리고머(HA, 4-16량체)가 NaCl보다 더 rHuPH20을 안정화시킨 분자들로 확인되었다. Lys-Lys 및 염화마그네슘 둘 다 인슐린 가용성을 감소시켰다는 사실 때문에, 이러한 분자들은 고농도에서 취할 수 있는 안정화제로 생각되지 않았다. Lys-Lys의 농도를 감소시키는 것은 인슐린의 가용성에 대한 그것의 영향을 감소시킬 것이다.

D. HA 올리고머의 rHuPH20/인슐린 제형에 대한 효과

HA 올리고머가 rHuPH20/인슐린 제형을 안정화시키기 위한 그들의 능력에 대하여 추가적으로 검사되었다. HA 올리고머는 rHuPH20의 히알루로난과의 효소적 반응의 기질/산물이며, 효소 활성 부위에 잠재적으로 결합할 수 있음으로써 결국 안정화 효과를 야기할 수 있다. 실험 계획(DOE) 연구가 전반적인 rHuPH20/인슐린 안정성에 대한 pH, NaCl 및 HA 올리고머 농도에 대한 효과를 조사하기 위해 수행되었다.

기본 제형은 3.75 mg/mL 인슐린(Organon Insulin API, 재조합 인간 인슐린 SIHR 143, 스톡 용액은 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비되었음), 5 μg/mL rHuPH20, 15 mM 트리스/HCl, 0.01% ZnCl₂, 0.01% 폴록사머 188, 0.15% 페놀 및 0.15% m-크레졸을 포함했다. 3가지 상이한 pH 수치(7.1, 7.3 및 7.5), 3가지 NaCl 농도(50, 75 및 100 mM) 및 3가지 HA 올리고머 농도(1, 5.5 및 10 mg/mL)의, 총 17가지 시료들이 평가되었다. rHuPH20 효소적 활성은 30℃에서 1주일간 배양된 시료에서 또는 2-8℃에서 9개월간 보관된 시료에서 측정되었다. rHuPH20 산화는 5℃에서 9개월간 보관된 시료에서 RP-HPLC에 의해 측정되었다. 인슐린 함량은 2-8℃에서 9개월간 보관된 시료에서 RP-HPLC에 의해 측정되었다.

제형 및 결과는 하기 표 52에 나타내었다. 인슐린 함량은 USP 참조 표준에 대하여 % 회복으로서 표현되었다. 퍼센트(%) rHuPH20 산화 피크 면적은 ox-1 (주) 및 0x-2(부) 피크의 합이다. 통계적 분석은 하기 표 53에 나타내었다. 표 53에서 보여지는 바와 같이, HA 및 NaCl 농도는 둘 다 30℃에서 1주일간 배양 후에 측정되었을 때 rHuPH20 효소적 활성에 있어서 유의성있는 효과를 가졌다. NaCl 및 HA의 농도가 증가할수록, rHuPH20 효소적 활성도 증가했다. 이는 부형제 농도가 둘 다 더 높을 때 특히 사실이었는데, 이는 두가지 인자 사이에 유의성있는 상호작용을 가리킨다(표 53 참조, P=0.0150).

HA의 부재에서 인슐린/rHuPH20 제형을 평가하는 종전의 연구에서는 거의 모두, pH의 증가가, 특히 6.0 내지 8.0의 pH 범위에 있어서 rHuPH20 효소적 활성에 있어서 유의성 있는 그리고 부정적인 효과를 갖는다는 점이 주목되었다. 대조적으로, HA가 제형 내에 포함되었던 이 연구에서, pH는 rHuPH20 효소적 활성에 있어서 효과가 매우 적거나 없는 것으로 나타났다. 그러므로, 인슐린/rHuPH20 제형 내의 HA의 존재가 더 높은 pH가 rHuPH20의 효소적 활성에 있어서 가질 수 있는 부정적 효과를 감소시키거나 없애는 것으로 보인다.

안정화제로서의 HA의 유효성을 추가적으로 평가하기 위하여, 인슐린 함량은 2-8℃에서 9개월간 보관되었던 시료에서 RP-HPLC에 의해 평가되었다. 인슐린 함량 데이터 및 통계적 분석 결과는 하기 표 54 및 55에서 보여진다. 결과는 명백히 인슐린 가용성에 대한 pH 및 NaCl 농도의 유의성을 입증한다(두 인자에 대하여 모두 p〈0.0001). pH가 증가함에 따라, 인슐린 가용성이 증가했다. NaCl 농도가 증가함에 따라, 인슐린 가용성이 감소했다. 인슐린 가용성/함량에 대한 HA의 효과는 유의성이 없었다(p=0.2755). 그러므로, HA 올리고머는 rHuPH20/인슐린 또는 rHuPH20/인슐린 유사체 제형에 대하여 부형제/안정화제일 수 있다.

HA 올리고머를 포함하는 제형의 장기 보관은 첨가된 HA를 포함하고 있지 않은 제형들과 비교하여 rHuPH20 산화의 수준을 유의성있게 증가시킴을 보여준다. 산화의 수준은 HA 농도와 꽤 상관관계가 있는 것으로 나타났으나, pH 또는 NaCl 농도와는 독립적이었다(하기 표 55 및 56 참조). HA는 글루쿠론산을 포함했는데, 이는 잠재적인 산소 공여자일 수 있으므로 최종 rHuPH20-인슐린 제형 내에서 HA가 부형제인 경우 항산화제 또는 산소 스캐빈저가 요구될 수도 있다. 이 연구에서 일부 제형들은 심하게 산화되었으나, 효소적 활성은 상당히 온전하게 유지되었는데(표 55 참조), 이는 산화된 rHuPH20이 여전히 유의성있는 효소적 활성을 유지함을 확증한다. 다변량 통계적 분석은 이러한 시료들의 rHuPH20 효소적 활성이 장기 저온 보관으로부터 HA에 의해 유의성있게 영향을 받으나(p=0.004, 감소된 효소적 활성), pH 또는 NaCl에 의해서는 그렇지 않다는 것을 나타내었다(각각 p=0.1715 및 0.4766)(하기 표 56 참조).

실시예 11

메틸파라벤 존재하에서 염농도 , pH 및 완충액 농도가 rHuPH20 에 미치는 영향

본 실시예에서, Box-Behnken 실험 설계를 페놀성 보존제 메틸파라벤의 존재하의 승온에서 rHuPH20 의 안정성을 위한 최적의 pH, 염농도(NaCl) 및 완충액 농도(Hepes)를 결정하기 위해 사용하였다. 반응표면분석(response surface method; RSM) 실험 실험 계획법(design of experiment; DOE)에서, 세가지 인자들, 즉 완충액 및 염의 다양한 농도, 그리고 pH들을 승온 및 교반(agitation)을 포함하는 스트레스의 영향을 받을 수 있는 시료가 되게 하는 가속화된 조건 하에서 그들이 rHuPH20 활성도에 미치는 영향에 대하여 평가하였다. 측정된 반응들은 역상-HPLC에 의해서 측정된 효소 활성, 순도/함량을 포함한다.

연구는 DOE 소프트웨어 패키지 Design-Exper®7.1(StatEase, Minneapolis, MN)을 기반으로 하였다. 실험에서 사용된 Hepes 농도, NaCl 농도 및 pH의 범위 및 중간점을 하기 표 87에 나타내었다. 본 연구를 수행하기 위하여, 상기 소프트웨어로 제조된 5개의 반복된 중점을 갖는 총 13개의 다른 제형들을 무작위 서열에 기초하여 제조하였다. 각각의 시료는 하기 표 58에서 특정된 것과 같은 다양한 농도의 Hepes(Calbiochem, Cat No. 391338) 및 NaCl (EMD, SX0418-1) 그리고 pH와 함께 100㎍/㎖ rHuPH20(히스티딘/HCl, pH 6.5, 130 mM NaCl 내 10 mg/mL 용액 유래), 0.20% 메틸파라벤(Fluka, Cat. No. 85265) 및 0.025 % 프로필파라벤(American Custom Chemicals, San Diego, Cat. No. CHEM-19713)을 포함한다. pH는 1.0N NaOH 또는 HCl을 이용하여 조절하였다. 상기 용액들을 제형당 2개 바이알을 갖도록 고무마개(Wheaton, Cat. No. 224100-072)를 갖는 2ml 1형 유리 바이알로 분취하였고, 그리고 알루미늄 캡으로 봉하였다. 시료들을 35℃ 설정 온도를 갖는 반응기에 위치시켰다. 바이알 중 하나의 세트는 Titer Plate shaker (LabLine) 를 이용하여 3일동안 600rmp에서 교반을 수행하였다(35 + ag). 나머지 셋트의 바이알은 교반없이 5일동안 35℃에 유지시켰다. 시료들은 후속 배양 기간 시험을 위해 사용되었다.

효소 활성도를 상기 실시예 2b에서 기술된 방법으로 측정하였다. 크기배제크로마토그래피(SEC)를 참조시료 대비 주피크의 퍼센트 측정에 의한 순도 평가에 사용하였다(상기 실시예 4 참조). SEC는 하기 조건을 이용하여 수행하였다: 1X 인산완충식염수(PBS), Toso BioScience G2000 SWXL 칼럼, 그리고 유속 1mL/분 설정. 데이터가 상기 기술된 바와 같이 수집되었고 평균이 보고되었으며, DOE 소프트웨어에 의해 제공되는 시료 서열에 따라 설계된 표로 삽입되었다. 해당 데이터는 상기 표 58에 나타내었다.

데이터 분석을 위하여, 하기와 같이 미가공 데이터들을 분석하였다. 간략하게, 상기 데이터들은 시작점으로서 2차 모델로 조정되었다. ANOVA가 2차 모델에 기반하여 수행되었으나 하기 모든 기준들에 더 근접하는 것을 만족하는 모델을 만들기위하여 파라미터들이 일반적으로 감소할 필요가 있다: 유의성 레벨 P<0.05, 적합성 결여(lack of fit)에 대한 p 값(P>0.1), 충분한 정밀 수준>4, 및 조절된 R-스퀘어의 0.2 이내의 예측된 R-스퀘어. 최종적으로, 잔차분석 및 진단플롯들을 ANOVA 가정을 만족시키는지 여부를 확인하기 위하여 체크하였다. 몇 가지 사례에서, 데이터들은 그들의 기준을 충족시키기 위하여 변환되었으며; 몇 가지 사례에서는, 미가공 데이터들을 적절한 수학식에 의하여 변환시키고, 그 다음 뒤이어 이전에 기술하였던 통계학적 분석을 하였다. 각각의 반응을 위해 사용되는 모델을 위한 ANOVA 시험 모델이 하기 표59에 기재되었고, 이는 반응, 모델 방정식, 변환이 사용되었는지 및 변화의 유형, 모델 P값 및 P값 적합성 결여를 보여준다.

A. 교반을 수반한 가속화된 온도에서 pH, NaCl 및 완충액 농도가 rHuPH20 에 미치는 영향

상기 ANOVA 모델들은, 35℃ 초과 교반 하에서, 완충액 농도가 rHuPH20의 효소 활성 및 함량/순도에 영향을 주지 못한다는 것을 보여준다(상기 표 59 참조, 반응 1 및 2, 모델식은 완충액을 포함하지 않음). rHuPH20 는 145-180mM 사이의 NaCl 농도를 갖는 pH 6.5-7.3 사이에서 가장 안정할 것으로 예측되었다. 이들 범위 외, 특히, pH가 8.0 그리고 염 농도가 가장 낮은 농도(120mM)일 때, 상기 모델은 rHuPH20 활성이 감소될 것으로 예측되었다. 이들 가속화된 조건 하에서, 측정된 가장 높은 rHuPH20 활성은 약 8100 U/mL (상기 표 56에서 STD9) 이고, 이는 100㎍/㎖ 효소에 기반하여 예측되는 rHuPH20 활성(약 12,000U/mL)의 약 65% 이다. 유사한 결과가 가장 안정한 제형에 대하여 예상되는 것의 약 20% 의 주피크 함량 손실을 갖는, SEC에 의해서 결정된 rHuPH20의 순도/함량에서 관찰되었다.

rHuPH20 효소 활성을 위한 염 농도 및 pH 에 대한 최적의 범위들은 rHuPH20 함량/순도에 대한 범위들보다 약간 좁았다. 그러므로, rHuPH20 의 효소활성은 스트레스 조건에 대하여 더 민감하였으며, 따라서 rHuPH20 의 효소활성을 보이는 것은 안정성을 보이는데 좋은 방법이다.

B. 교반을 수반하지 않은 가속화된 온도에서 pH, NaCl 및 완충액 농도가 rHuPH20 에 미치는 영향

데이터는 적은 스트레스 조건(즉, 교반 없음)하에서, 더 적은 효소 활성 감소 및 더 적은 주피크의 손실이 관찰된다는 것을 보여준다. 예를 들어, 더 나은 시료들에 대하여, 활성에서 오직 20% 손실이 관찰되었고(교반을 수반하여 반응시킨 시료의 35%와 비교) 그리고 주 피크에서 5% 미만의 손실이 관찰되었다(교반을 수반하여 반응시킨 시료의 20%와 비교). 추가적으로, ANOVA 모델들은 염농도가 효소 활성에 유의적인 영향을 주지 않는다는 것을 보여주었다. rHuPH20은 염농도가 적어도 130mM 이상인 한, pH 6.5 미만에서 효소 활성을 유지하였다. 추가적으로, 최적의 효소 활성은 7 이하의 pH에서 관찰되었다.

실시예 12

보존제를 갖는 인슐린 리스프로 / rHuPH20 또는 인슐린 아스파르트 / rHuPH20 의 안정성 연구

6개월 중간 데이터 표

본 실시예에서, 다양한 인슐린 리스프로/rHuPH20 제형의 안정성들을 세가지 저장 조건하에서 평가하였다: 시간에 따른 5 ℃, 25 ℃ 및 30 ℃ 조건. 하나의 제형은 또한 두 가지 물리적 가속화 스트레스 조건 하에서 평가되었다: 복수회 동결/해동 사이클 및 25℃에서의 교반 조건. 제형들은 pH 및 보존제 수준을 다양하게 하였다. 안정성은 일반적인 외관 및 특징, rHuPH20 효소 활성 및 rHuPH20 및 인슐린 유사체 순도 측정에 의하여 평가되었다.

인슐린 리스프로/rHuPH20 제형들을 하기 표 60에 나타내었다.

각각 제형의 1ml을 USP 1형 붕규산염(borosilicate) 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 저장하였다. 각각의 제형들을, 개별적으로 5±3℃, 25±2℃ 및 30±3℃에서 배양시켰고, 안정성 측정을 0, 0.5, 1, 2, 3 및 6 개월 시점에서 기록하였다. 제형 #2에는 25℃에서 24시간 동안 교반을 수행하였다(650rpm에서 진탕). 제형 #2에는 벤치에서 -30℃ 동결 온도 및 실온 간 교차 저장 조건에 따른 동결/해동 5 사이클을 수행하였다. 상기 시료는 각 사이클에 대하여 각각의 조건에서 적어도 2시간동안 유지시켰다(즉, -30℃ 동결 온도에서 2시간, 제거 그리고 실온의 벤치 상부에 2시간 동안 위치되어 있는 것을 1 사이클로 고려하였다).

안정성을 pH, 외관, 삼투질 농도, 350nm에서의 탁도 및 질적인 관찰, rHuPH20 효소 활성, 순도 퍼센트 및 RP-HPLC에 의한 rHuPH20의 회복율 그리고 비-변성 및 변성 SEC에 의한 인슐린 리스프로의 순도 퍼센트 측정에 의하여 평가하였다(실시예 2 내지 5 참조). 삼투질 농도에 있어서, 허용기준 안정성은 275±30 mOsm/kg이다. 외관에 있어서, 허용기준 안정성은 그것이 깨끗하고, 무색 용액인 것이다. rHuPH20 활성에 있어서, 허용기준 안정성은 제형이 >375 U/mL (>75 U/㎍ 기준)을 나타내는 것이다. RP-HPLC에 의한 rHuPH20 회복율에 있어서, RP-HPLC에 의한 허용가능한 사양(specification) 타겟은 3-7㎍/ml이다. RP-HPLC에 의한 인슐린 순도에 있어서, 허용가능한 사양 타겟은 RP-HPLC에 의한 ≥90% 의 순도이다. RP-HPLC에 의한 인슐린 회복에 있어서, 허용가능한 사양 타겟은 RP-HPLC에 의한 90-100 U/mL (90-110 %) 이다. 비-변성 SEC에의한 순도 퍼센트에서, 허용가능한 사양 타겟은 피크 영역에 의한 ≤2% 고분자량(HMWt) 인슐린 종이다. 변성 SEC에 의한 순도 백분율에서, 허용가능한 사양 타겟은 변성 SEC를 갖는 피크 영역에 의한 ≤2% 고분자량(HMWt) 인슐린 종이다.

결과를 하기에 요약하였다. 표 60에 나타낸 인슐린 리스프로 /rHuPH20 제형에서, 제형 #1, #2 및 #3들은 T=0 (91.22 %, 91.40% 또는 91.30%, 각각)에서 낮은 함량의 인슐린 리스프로와 함께 제형화하였고, 반면 다른 제형들은 거의 100% 단백질 함량을 포함하도록 결정하였다.

1. 3 개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 시험된 제형들은 5±3℃에서 3 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로가 안정하였다. 상기 모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 인슐린 리스프로 함량은 #1 내지 #3에서는 낮았으나(타깃의 약 91%의 회복률), 이는 5℃에서 예상되는 회복률이 일정한 것에 따른 제형 제조 에러인 것으로 나타났다.

25±2℃에서 2 및 3 개월 사이에 rHuPH20 효소 활성이 375 U/mL 타깃 사양(specification) 이하가 된 제형 #8을 제외하고는, 모든 제형 내의 rHuPH20가 안정하였다. 이것은 높은 pH 및 높은 보존제 농도를 가진 제형 #8에서 예상외의 결과는 아니였으며, 일반적으로, rHuPH20는 더 낮은 pH 및 낮은 보존제 농도에서 더욱 안정하다. 인슐린 리스프로는 일반적으로 25℃에서 3 개월 시점 이후까지 모든 제형에서 안정하였으나, RP-HPLC에 의하여 평가된 순도는 약 한달 이후부터 약간 감소하기 시작하였다.

30±3℃에서 오직 가장 낮은 pH 제형(#1 및 #4, 모두 pH 7.2)들만 30℃에서 1 개월 후 rHuPH20 효소 활성도가 타깃 사양보다 높았다(>375 U/mL). 제형 #2는 30℃에서 2 주후 타깃 사양 이상이였으나 1 개월 후 375 U/mL 이하였다. 인슐린 리스프로는 일반적으로 30℃의 모든 제형에서 3 개월 동안 타깃 사양 내로 안정하였으나, 25℃에서 관찰된 것과 비교하여 순도에서 약간 큰 감소를 보였다. 순도 감소는 30℃에서 함량 감소를 동반하였고, 이는 25℃에서는 명백하지 않았다. 3 개월 시점 후, 30℃ 조건을 종결하였다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험된 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 3 개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다.

rHuPH20 은 2 및 3 개월 사이에 rHuPH20 활성이 375 U/mL 타깃 사양 이하로 감소한 제형 #7을 제외하고는 3 개월 이후까지 25±2℃에서 유지된 모든 제형들에서 타깃 사양을 만족하였다. 제형 #7 및 #8들이 pH 값을 제외(7.2 및 7.6, 각각) 하고 동일하다는 것은 다소 예상 외의 결과였고, 일반적으로, rHuPH20은 낮은 pH에서 더 안정하다. 이러한 예상 외의 결과는 제형 #7이 타깃(600U/ml 및 100%, 각각)보다 낮은 활성도(500U/ml) 및 함량(93.8%)에서 시작했다는 사실에 기인하는 것으로 보이며, 그리고 이것은 제형 #7 및 #8 에 대한 허용가능한 순도값에 의하여 추가적으로 뒷받침된다. 인슐린 아스파르트는 25℃에서 3 개월 시점 이후에도 모든 제형에서 안정하였으나, 순도 및 회복%에서 약간 감소 경향이였다. rHuPH20 는 25℃와 비교하여 30±3℃로 유지된 모든 제형에서 안정성이 낮았다. 가장 낮은 pH 제형들(#1 및 #4, 모두 pH 7.2) 및 가장 낮은 총 보존제 제형 (#4 및 #5, 총 보존제 수준(level) = 0.175%)들은 30℃에서 1 개월 이후에 rHuPH20 효소 활성이 여전히 타깃 사양 이상이였다. 제형 #2는 30℃에서 1 개월 이후에 타깃 사양 바로 이하였고 그리고 제형 #6은 1 개월 이후 활성이 약간 타깃 사양 이상이였으나, 2주 후에 약간 낮아졌다. 제형 #1- #6은 30℃에서 2주 이후에 rHuPH20 효소 활성이 일반적으로 타깃 사양 이내에 유지되었다. 인슐린 아스파르트는 30℃ 모든 제형 내에서 3 개월 동안 타깃 사양 이내로 안정하였으나 25℃에서 관찰된 것과 비교하여 순도 및 회복%에서 약간 큰 감소 경향을 보였다. 30±3℃ 비율의 연구는 3 개월 시점 이후 종결하였다.

2. 6 개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 투명하고 입자가 없는 무색이였다. 모든 시험된 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 리스프로가 5℃, 6-개월 시점에서 안정하였다. 회복률 외 전에 관찰된 것과 같은 제형 #1 -#3 에 대한 낮은 인슐린 리스프로 함량(타깃의 약 91% 회복)은 5℃에서 여전히 감소되어 있었다.

25℃에서, rHuPH20는 제형#1, #2, #4, 및 #5에서 또한 계속하여 안정하였다(> 375 U/mL rHuPH20 활성도). 이들 제형들은 모두 낮은 pH(7.2 또는 7.4) 에서 현재 USP 보존제 수준(#1, #2: 0.125 % 페놀, 0.075 % m-크레졸) 또는 약간 낮은 보존제 수준(#4, #5: 0.1 % 페놀, 0.075 % m-크레졸)이였다. 모든 8개 제형들은 6개월에서 타깃 rHuPH20 회복 퍼센트 사양 이내를 유지하였으나, rHuPH20 순도 및 RP-HPLC에 의한 회복율 측면에서는 뚜렷하게 감소하였다. 언급한 인슐린 리스프로의 25℃에서 3개월 후 관찰된 감소된 RP-HPLC에 의한 순도, RP-HPLC에 의한 함량, 및 비-변성 SEC에 의한 순도는 6개월째에 더욱 뚜렷해졌다. 변성 SEC에 의한 순도는 매우 약간 감소되었으나 주피크 값 전부가 여전히 >99.4% 이였으므로 손실은 이 시점까지 매우 적었다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험된 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 6 개월 시점, 5±3℃에서 안정하였다.

25℃로 유지된 제형들 중 4개 제형(#1, #2, #4 및 #5)에서 rHuPH20 가 지속적으로 효소 활성에 대한 타깃 활성 사양(> 375 U/mL)을 6개월 이후에도 만족하였다. 낮은 pH에서 이들 제형들은 모두 현재 USP 보존제 수준(#1, #2: 0.125 % 페놀, 0.075 % m-크레졸) 또는 약간 낮은 보존제 수준(#4, #5: 0.1 % 페놀, 0.075 % m-크레졸)이였다. 모든 8개 제형들은 6개월에서 타깃 rHuPH20 회복률 사양 이내를 유지하였으나 rHuPH20 순도 및 RP-HPLC에 의한 회복률 모두 관점에서는 분명한 감소가 관찰되었다. 언급되었던 3개월 이후의 25℃에서의 인슐린 아스파르트에 대한 감소 경항은 RP-HPLC에 의한 순도, RP-HPLC에 의한 함량, 비-변성 SEC에 의한 순도에 대하여 6개월째에 더 명백하였다. 변성 SEC에의한 순도는 매우 적은 감소 경항이였으나 주피크값 전부가 여전히 >99.5이였으므로 손실은 이 시점까지 매우 적었다.

3. 가속화된 조건- 25℃에서의 교반 및 동결/해동

a. 인슐린 리스프로

제형 #2는 25℃에서 24시간 동안 교반한 이후 탁해졌다. 인슐린 리스프로는 비록 5회 동결 해동 사이클 이후 회복율이 약 75%까지 감소되었지만 두가지 조건 모두에 대하여 안정하였다. rHuPH20 는 25℃ 에서 24시간 동안 교반된 시료들에서 타깃 활성도 사양(>375U/mL)을 만족하였다. 5회 동결/해동 사이클 이후, rHuPH20는 효소적으로 비활성되었다.

b. 인슐린 아스파르트

교반 또는 동결/해동 조건 하에서, 인슐린 리스프로 제형에서 얻어진 것과 유사한 결과가 인슐린 아스파르트 제형 #2에 대하여 얻어졌다.

실시예 13

다양한 보존제를 가진 인슐린 리스프로 / rHuPH20 , 인슐린 아스파르트 / rHuPH20 또는 인슐린 글루리신/rHuPH20 의 안정성 연구

2개월 또는 3개월 중간 데이터 표

본 실시예에서, 다양한 인슐린 리스프로/rHuPH20, 인슐린 아스파르트/rHuPH20 또는 인슐린 글루리신/rHuPH20 제형들의 안정성들을 4개의 다른 저장 조건에서 평가하였다 : 시간 대비 5℃, 15℃, 25℃ 및 30℃. 제형들의 pH, 염 농도 및 글리세린 농도를 다양화였다. 안정성은 일반적 외관 및 특징, rHuPH20 효소 활성 및 rHuPH20 및 인슐린 유사체 순도 측정에 의하여 평가하였다. 본 연구는 3개 보존제 수준에서 임상 3상 개발을 뒷받침하기 위한 데이터 제공을 의도하고 수행하였다: 보존제 수준은 상업적 인슐린 보존제(Novolog) 또는 EP-B(유럽 약전) 및 USP(United States Pharmacopeia) 보존제 수준 내에 포함되었다.

인슐린 리스프로/rHuPH20 제형들을 하기 표 61에 나타내었다. 인슐린 아스파르트/rHuPH20 제형들은 표 62에 나타내었다. 인슐린 글루리신/rHuPH20 제형은 표 63에 나타내었다. 기본(base) 제형은 3.5mg/mL 인슐린 리스프로 또는 아스파르트, 600U/mL rHuPH20, 30mM Tris/HCl, 20mM 메티오닌 및 0.01% 폴록사머 188을 포함하였다. pH, NaCl 농도 및 글리세린 농도는 3개 기본 보존제 농도내에서 다양하게 하였다.

표 61 및 62에 나타낸 인슐린 리스프로/rHuPH20 및 인슐린 아스파르트/rHuPH20 제형들에서, A1 내지 A4 제형들은 상업적 Novolog® 보존제 수준을 가졌다: 0.15% 페놀 및 0.172% m-크레졸; 제형 B1 내지 B5는 EP-B 보존제 수준을 가졌다: 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸 그리고 제형 U1 은 USP 보존제 레벨을 가졌다: 0.125% 페놀 및 0.075% m-크레졸.

추가적으로, 표 63에 표시된 인슐린 글루리신/rHuPH20 제형들에서, 제형 1은 상업적 Novolog® 보존제 수준을 가졌다: 0.15% 페놀 및 0.172% m-크레졸. 제형 2는 EP-B 보존제 수준을 가졌다: 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸. 제형 3은 USP 보존제 수준을 가졌다 :0.125% 페놀 및 0.075% m-크레졸. 제형 4 내지 7은 상업적 Novolog® 보존제 수준을 가졌으며 제형 1과 비교하여 하나 이상의 인자들이 상이하였다. 제형들 사이의 다양성을 굵은 글씨체로 나타내었다. 제형 4는 NaCl 농도가 높으며, 제형 7은 다른 계면활성제를 갖는다. 제형 5 및 제형 6은 메티오닌 농도 및 pH에서 제형 4와 상이하다.

각각 제형의 1ml을 상기 실시예 12에서 기술한 바와 같이 USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 다양한 온도에서 저장하고 배양하였다. 안정성 측정을 다양한 시간에서 기록하였다: t= 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 6 또는 9 개월. 안정성은 또한 pH, 외관, rHuPH20 효소 활성, 순도 백분율 및 RP-HPLC 의한 rHuPH20 의 회복률 RP-HPLC 의한 인슐린 리스프로의 회복률 및 비-변성 및 변성 SEC에 의한 인슐린 리스프로의 순도 백분율 측정에 의하여 평가하였다(실시예 2 내지 5 및 실시예 12 참조). 허용가능한 안정성 기준 또는 각각의 시험된 파라미터들에 대한 타깃 사양은 실시예 12에서 기술된 바와 동일하다. 시료들은 초기 수준의 ≥30% 을 나타내는 결과가 나오는지에 대해서 연속적인 시점에서 오직 평가하였다.

결과를 하기에 요약하였다.

1. 1개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험된 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두에서 1 개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다. 15±2℃의 제형들은 일개월 시점에서 평가하지 않았다.

rHuPH20 은 A1, A2, A4 및 B4 제형의 예외를 제외하고는 1 개월 이후에도 25±2℃로 유지된 대부분의 제형들에서 안정함을 유지하였다. 제형 A1, A2 및 B4는 2주 및 1 개월사이에 rHuPH20 효소 활성이 375 U/mL 타깃 사양 이하까지 떨어졌으며 제형 A4는 25℃에서 저장 후 1주 및 2주 사이에 타깃 사양 이하로 떨어졌다. 그들 제형들은 상용 Novolog 또는 높은 pH(pH 7.6)을 갖는 EP-B 보존제 수준을 가지며, 이들은 rHuPH20 안정성이 사라졌다. 25℃에서 한달 후에 <375U/ml 히아루로니다아제 활성을 갖는 단일 EP-B 제형(B4)은 pH 7.6 및 낮은 염화나트륨 농도(50mM)을 가지며, 이는 rHuPH20 과 함께 하기에 적합하지 않았다. pH 7.6 에서 높은 염화나트륨 농도(80mM 또는 100mM)을 갖는 다른 EP-B 제형들은 모두 25℃에서 한달 후에 375U/ml rHuPH20 효소 활성의 타깃 수준 이상을 잘 유지하였다. 모든 다른 제형들은 25℃에서 저장 한달 후 타깃 사양 이상이였다. 인슐린 리스프로는 1 개월 시점 이후까지 25℃의 모든 제형에서 안정하였으나 RP-HPLC에 의한 순도율은 약간 감소하기 시작하였다.

rHuPH20는 25±2℃에서와 비교하여 30±2℃에서 모든 제형들에서 낮은 안정성을 유지하였다. USP 제형은 30℃에서 1개월 이후까지 허용가능한 rHuPH20 활성을 유지하였으나, 상용 보존제(A1- A4) 또는 EP-B(B1-B5) 제형들 중 어느 것도 30℃에서 저장 1주 후에 타깃 사양 이상을 유지하지 못하였다. 인슐린 리스프로는 30℃의 모든 제형에서 1개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나 RP-HPLC에 의한 순도율은 약간 감소하였다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 1개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다. 15±2℃의 제형들은 1개월 시점에서 평가되지 않았다.

rHuPH20 는 각각 1-2 주 사이 및 2 주 -1 개월 사이에 375U/mL 타깃 사양 이하로 떨어진 A4 및 B4제형들을 제외하고는 1 개월 이후까지 25±2℃의 모든 제형에서 안정하였다. 이들 제형들은 상용 Novolog® 또는 낮은 염(50mM) 및 높은 pH(7.6)을 갖는 EP-B 보존제 수준을 가지며, 이것들은 각각 rHuPH20 안정성에 선호되지 않는 조건들이다. 이 외 모든 제형들은 25℃ 저장 1 개월 이후 rHuPH20 효소 활성이 타깃 사양 이상이였다. 인슐린 아스파르트는 1 개월 시점이 지난 후에도 25℃ 모든 제형에서 안정하였다. 인슐린 아스파르트 총 함량은 기대한 것보다 낮았으나 값들은 시간 = 0 에서부터 일관되게 유지되었다.

rHuPH20는 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃에서 유지된 모든 제형들에서 적게 안정하였다. USP 제형(U1)은 30℃에서 1 개월 이후까지 허용가능한 rHuPH20 활성을 유지하였다. EP-B 제형들 중 여럿은 1주 이후까지 허용가능한 rHuPH20 활성을 유지하였으나 Novolog®보존제 제형의 어느 것도 30℃ 저장 1 주 후 허용가능한 활성을 유지하지 못하였다. 인슐린 아스파르트는 30℃ 모든 제형에 대하여 1 개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나 그들은 RP-HPLC에 의한 순도율에 대해서는 뚜렷한 약간의 감소 경항을 보였다.

c. 인슐린 글루리신

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 글루리신 모두에 대하여 1 개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다. 제형들은 15±2℃ 1 개월 시점에서 평가되지 않았다.

rHuPH20 는 1 개월 이후에도 25±2℃로 유지된 모든 제형에서 안정하였다. 그들은 RP-HPLC에 의한 rHuPH20 순도율 및 rHuPH20 활성 관점에 대해서는 몇 개의 제형에대해서 약간 감소 경항을 보였다. 인슐린 글루리신은 1 개월 시점 이후까지 25℃ 모든 제형에서 안정하였으나 순도 및 회복 퍼센트 관점에서는 역시 약간의 감소 경향을 보였다.

rHuPH20는 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃에서 유지된 모든 제형들에서 적게 안정하였다. 7 개 시험물(article) 중 4개는 30℃에서 1주 이후 > 375mL의 타깃 rHuPH20 활성 사양을 만족하는데 실패하였다. 제형 6은 오직 1주에서만 허용가능한 활성을 보였고, 제형 2는 2주 동안 허용가능한 활성을 보여주었으며, 그리고 USP 제형(#3)은 30℃에서 1개월 이후까지 허용 가능한 rHuPH20 활성(532U/mL)을 유지하였다. 인슐린 글루리신은 30℃ 모든 제형에서 1개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나, 그들은 RP-HPLC에 의한 순도 퍼센트 및 회복 퍼센트에 대하여 뚜렷한 정도의 명백한 감소 경향을 보였다.

2. 2-개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험 제형들은 5±3℃에서 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두에 대하여 2개월 시점까지 안정하였다.

모든 시험물들은 또한 15±2℃에서 2개월 까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두 안정하였다. 그들 중 몇개는 rHuPH20의 효소 활성에 대하여 매우 약간 감소 경향을 보였으나 안정성에서는 어느 것도 명백한 감소 경향을 나타내지 않았다.

rHuPH20는 2개월 이후에는 25±2℃의 상용 보존제 제형들(A1-A4)에서 안정하지 않았으나, 제형 A3는 1 개월에서 좋은 활성(436U/mL)을 가졌고, 2 개월에서 의도하는 375U/mL 사양보다 단지 약간 낮았다(361U/mL). 5EP-B 제형들 중 4개들(B1, B2, B3 및 B5)은 2개월 이후 25℃에서 375U/mL 타깃 사양 이상 이였으며, 우수한 rHuPH20 순도 및 회복을 가졌다. USP 제형(U1) 또한 510U/mL의 값을 갖고 25℃에서 2개월 이후 rHuPH20 활성 타깃 사양 이상이였으며 높은 순도 및 회복 값에 상응하였다. 인슐린 리스프로는 2 개월 시점 이후까지 25℃의 모든 제형에서 안정하였으나 1개월에서 확인된 감소 경향이 지속되었다.

1 개월에서 확인된 바와 같이, rHuPH20 은 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃로 유지된 모든 제형에서 안정성이 낮았고 모든 A(상용 보존제) 및 B(EP-B 보존제) 제형들은 30℃에서 2개월까지 타깃 rHuPH20 활성 사양보다 매우 낮았다. USP 제형은 30℃ 에서 2개월 이후에도 허용가능한 rHuPH20 활성(375U/mL)을 잘 유지하였으나, 1개월 시점에서는 사양 이하로 떨어졌다(334U/mL). 이것들은 아마도 rHuPH20 활성 분석에서의 고유변수 또는 시료의 변화에 기인한 것으로 예상되나, 그럼에도 불구하고 30℃ 안정성에서 일반적인 감소 경향을 보여주었다. 인슐린 리스프로는 30℃의 모든 제형에서 2 개월 동안 타깃 사양 이내로 안정하였으나, 비-변성 SEC에 의한 순도 퍼센트 뿐만 아니라 RP-HPLC에 의한 회복 및 순도 퍼센트에 대하여 뚜렷한 감소 경향이 분명하였다.

b.인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두 2개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다. 모든 시험물들은 또한 15±2℃에서 2개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두 안정하였다. 약간의 감소가 rHuPH20 효소 활성, 순도 및 회복에 대하여 관찰되었다.

rHuPH20 는 2개월 이후까지 25±2℃의 4개 상용 보존제 제형 중 3개에서 (A2, A3 및 A4) 에서 안정하지 않았으나 제형 A1은 2개월에서 허용가능한 활성을 가졌으며(385U/mL) 그리고 시험물 A3는 2개월에서 의도된 >375U/mL 사양보다 아주 약간 낮았다(357U/mL). 5EP-B 제형들 중 3개(B1, B2 및 B3)들은 25℃에서 2개월 이후 rHuPH20 효소 활성에 대한 375U/mL 타깃 사양 이상을 계속 잘 유지하였고 허용가능하였으나 유사한 제형을 가지고 실험한 것에 기초하여 예상되는 rHuPH20 순도 및 회복보다는 뚜렷하지 않은 정도로 낮았다. USP 제형(U1)은 25℃에서 2개월 이후 허용가능한 순도 및 회복과 함께 444U/mL 값을 가지고 rHuPH20 활성 타깃 사양 이상을 잘 유지하였다. 인슐린 아스파르트는 2개월 시점 이후까지 25℃의 모든 제형에서 안정하였으나 그들은 RP-HPLC 및 비- 변성 SEC에 의한 순도에서 약간의 감소 경향을 나타내었다.

1 개월 째에 확인한 바와 같이, rHuPH20은 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃이 유지되는 모든 제형에서 적게 안정하였고 모든 A 및 B 제형들은 30℃에서 2개월까지 rHuPH20 효소 활성 사양보다 상당히 낮았다. USP 제형(U1)은 30℃ 에서 2 개월까지 허용가능한 rHuPH20 활성(382U/mL)를 가졌다. USP 제형에 대한 rHuPH20 회복 및 순도 퍼센트는 상기에서 기술된 것과 같은 유사한 제형을 이용한 실험에 기초하여 기대되는 것보다 약간 낮았으나 이들은 허용가능한 한계 이내였다. 인슐린 아스파르트는 30℃ 의 모든 제형에서 2개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나 변성 및 비-변성 SEC에 의한 순도 퍼센트 뿐만 아니라 RP-HPLC에 의한 순도 퍼센트에 대하여 뚜렷한 감소 경향을 나타내었다. 이전 시점에 대하여 관찰된 낮은 회복 퍼센트는 더이상 분명하지 않았고 RP-HPLC에 의한 인슐린 아스파르트의 회복 퍼센트에 대한 값은 모든 온도에 대해서 1 및 2개월 사이에 약간 증가하였다(30℃에서 가장 명백함).

c. 인슐린 글루리신

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 글루리신 모두 5±3℃ 2개월 시점까지 타깃 사양 이내에서 안정하였다.

모든 시험 물건들은 15±2℃, 2 개월에서 rHuPH20 및 인슐린 글루리신 모두에 대하여 타깃 사양 이내에서 안정하였다. 2개월 데이터는 일반적으로 rHuPH20 활성 및 회복에 대하여 약간 낮았으나 순도 퍼센트는 2개월 째에 뚜렷하게 낮은 순도 퍼센트을 가지는 제형 #5(메티오닌 미첨가)를 제외하고 동일하게 유지되었다. 인슐린 글루리신은 또한 15℃에서 2개월 시점까지 타깃 사양 이내에서 안정하였고, 15℃에서 2개월 이후에 오직 회복 및 순도 퍼센트에 대해서만 약간 낮아짐을 보였다.

rHuPH20 활성은 25±2℃로 유지된 데에서 2개월 이후에 7개 제형 중 3개(#2, #3 및 #6)에 관해서는 예비적 사양(< 375 U/mL)보다 매우 높았으며, 제형 #4에 관해서는 사양 바로 위였다. 일반적으로 이들 제형들은 낮은 수준의 보존제(#2 및 #3) 또는 높은 염 및 낮은 pH (#6)를 포함한다. rHuPH20 활성 사양 바로 위인 제형 #4는 본 연구에서 가장 높은 보존제 수준과 pH를 가질 뿐만 아니라 또한 높은 농도의 NaCl 을 포함한다. 여기에서는 모든 제형들에 대하여 rHuPH20 활성, 순도 및 함량들이 감소 경향이였다. 인슐린 글루리신은 2 개월 이후 시점 25℃의 모든 제형에서 안정하나 순도 및 회복 퍼센트의 경우 1 개월 때 확인된 약간의 감소경향이 지속되었다.

rHuPH20은 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃이 유지되는 모든 제형에서 덜 안정하였다. 오직 USP 보존제 수준 제형(#3)만이 30℃에서 2 개월 후 >375U/mL 의 타깃 활성 사양을 만족시켰다. 제형 #3은 또한 2 개월 시점에서 허용가능한 rHuPH20 순도 및 회복을 보였다. 인슐린 글루리신은 30℃의 모든 제형에서 2개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나, 그들은 RP-HPLC에 의한 회복 퍼센트 및 순도 퍼센트에 대하여 뚜렷한 감소 경향이 명백하였다.

3. 3-개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 5±3℃에서 3 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두 안정하였다. RP-HPLC에 의한 rHuPH 20 순도는 예상된 것보다 다소 낮았으나, 이는 일반적인 분석 변화에 기인한 것으로 나타났다. 모든 제형들은 "2 red foreign slivers"를 포함하는 것으로 확인되는 제형 A3을 제외하고 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다.

모든 제형들은 15±2℃에서 3개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로에 대하여 모든 타깃 사양을 만족하였다. RP-HPLC에 의한 rHuPH20 순도는 예상되는 것보다 다소 낮았으나, 전에 언급된 것처럼 이는 일반적인 분석 변화에 기인한 것으로 나타났다. rHuPH20 활성 및 비-변성 SEC에 의한 인슐린 리스프로 순도는 약간의 경미한 감소 경향을 보였으나, 그러나 이 외의 분명한 감소 경향은 없었다.

rHuPH20 은 3 개월 이후에 25±2℃ 상용 보존제 제형(A1-A4) 내에서 안정하지 않았다. 5개 EP-B 제형들 중 4개 (B1, B2.B3 및 B5) 들은 25℃에서 3 개월 이후에도 rHuPH20 효소 활성에 대한 375U/mL 타깃 사양 이상이였으며, 감소 경향이긴 하나 허용가능한 rHuPH20 순도 및 회복을 가졌다. USP 제형(U1)은 여전히 상응하는 높은 순도 및 회복 값을 가졌으며 522U/mL 와 같이 25℃에서 3 개월 이후에 rHuPH20 활성 타깃 사양보다 아주 높은 값을 가졌다. 인슐린 리스프로는 3-개월 시간 지난 이후에도 25℃의 모든 제형에서 안정하였으나 RP-HPLC 및 비-변성 SEC 에 의한 인슐린 리스프로 순도에 대해서는 감소 경향이 뚜렷하였다.

이전에 확인한 바와 같이, rHuPH20은 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃이 유지되는 모든 제형에서 적게 안정하였고 모든 제형들은 30℃에서 3개월 이후 타깃 rHuPH20 활성 사양 이하였다. 인슐린 리스프로는 30℃ 모든 제형에서 3개월 동안 타깃 사양 이내에서 안정하였으나, 비-변성 SEC에 의한 순도 퍼센트 뿐만 아니라 RP-HPLC에 의한 순도 퍼센트에 대해서 확실한 감소 경향을 보였다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 모든 시험된 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 3개월 시점까지 5±3℃에서 안정하였다. 모든 제형들은 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 3개월 시점까지 15±2℃에서 모든 타깃 사양을 만족하였다. rHuPH20 활성, 순도 및 회복은 약간 감소 경향이였다. 비-변성 SEC에 의한 인슐린 아스파르트 순도는 2개월 시점보다 다소 낮았으나, 이것이 감소 경향인지 또는 일반적인 분석 변화인 것인지 불분명하였다.

rHuPH20 는 상용 보존제 제형에서 안정하지 않았으나 제형 A1은 3개월에서 타깃 rHuPH20 활성 사양(<375U/mL)보다 아주 약간 낮았다(369 U/mL). 5EP-B 제형들 중 3개(B1, B2 및 B3)들은 계속 25±2℃에서 3개월 이후 375U/mL 타깃 사양 이상을 잘 유지하였고 2개월 요약에서 언급된 것과 같이 허용가능하나 예상과 다른 낮은 rHuPH20 순도 및 회복을 가졌다. USP 제형(U1)은 25℃에서 3개월 이후 허용가능한 순도 및 회복을 가졌으며 492U/mL을 나타내어 rHuPH20 활성 타깃 사양보다 여전히 아주 높았다. 인슐린 아스파르트는 3개월이 지난 이후에도 25℃의 모든 제형에서 안정하였으나 그들은 RP-HPLC 및 비- 변성 SEC에 의한 순도에서 명백한 감소 경향을 나타내었다.

이전에 논의한 바와 같이, rHuPH20은 25±2℃의 그들과 비교하여 30±2℃가 유지되는 모든 제형에서 적게 안정하였다. 모든 A 및 B 제형들은 30℃에서 1개월까지 타깃 rHuPH20 활성 사양 이하였다. USP 제형(U1)은 3개월에서 의도된 >375U/mL 사양보다 아주 약간 낮았으나(371U/mL) 또한 RP-HPLC에 의한 낮은 회복 퍼센트 및 rHuPH20 순도 퍼센트를 가졌다. 인슐린 아스파르트는 모든 제형에 대해서 주피크 약 97% 로 아주 약간 감소한 비-변성 SEC를 제외하고 모든 기술에 의하여 30℃의 모든 제형에서 3개월 동안 타깃 사양 이내로 안정하였다.

4. 6개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 30±2℃의 제형들은 6개월 시점에서 평가하지 않았다.

모든 제형들은 5±3℃ 및 15±2℃에서 6 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두에 대하여 안정하였다. 모든 제형들에 대하여 rHuPH20 활성 및 rHuPH20 회복 퍼센트는 몇몇 약간의 감소경향을 보였다.

제형 A4는 두 개 온도에서 모두 최소한 안정하였다.

오직 제형 B3 및 U1이 25±2℃에서 요구되는 안정성을 만족하였다. 이들 제형들은 pH 7.4 및 80mM 염을 포함하였다. 나머지 제형들은 375U/mL 보다 낮은 rHuPH20 효소 활성을 가졌다. 이러한 활성의 손실은 rHuPH20 회복 퍼센트에서의 손실과 일치하였다. 비-변성 SEC는 인슐린 리스프로 순도 퍼센트에서 약간의 감소경향을 보여주었다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 30±2℃의 제형들은 6개월 시점에서 평가하지 않았다.

모든 제형들은 5±3℃ 및 15±2℃에서 6개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두에 대하여 안정하였다. 모든 제형들에 대하여 rHuPH20 활성 및 rHuPH20 회복 퍼센트는 몇몇 약간의 감소 경향을 보였다.

제형 A4는 두개 온도에서 모두 최소한 안정하였다.

오직 제형 U1이 25±2℃에서 요구되는 안정성을 만족하였다. 나머지 제형들은 375U/mL 보다 낮은 낮은 rHuPH20 효소 활성을 가졌다. 이러한 활성의 손실은 rHuPH20 회복 퍼센트에서의 손실과 일치하였다. 비-변성 SEC는 인슐린 아스파르트 순도 퍼센트에서 약간의 감소경향을 보여주었다.

5. 9-개월 시점

a. 인슐린 리스프로

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 25±2℃ 및 30±2℃의 제형들은 9개월 시점에서 평가하지 않았다.

모든 제형들은 5±3℃ 및 15±2℃에서 9 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 리스프로 모두에 대하여 안정하였다. 모든 제형들에 대하여 rHuPH20 활성 및 rHuPH20 회복 퍼센트는 몇몇 약간의 감소 경향을 보였다. 6 개월에서 보인 바와 같이, 제형 A4는 두 개 온도 모두에서 최소한 안정하였다.

b. 인슐린 아스파르트

모든 제형들은 모든 시점 및 온도에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 25±2℃ 및 30±2℃의 제형들은 9 개월 시점에서 평가하지 않았다.

모든 제형들은 5±3℃ 및 15±2℃에서 9 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트 모두에 대하여 안정하였다. 모든 제형들에 대하여 rHuPH20 활성 및 rHuPH20 회복 퍼센트는 몇몇 약간의 감소 경향을 보였다. 6 개월에서 보인 바와 같이, 제형 A4는 두개 온도 모두에서 최소한 안정하였다.

실시예 14

아스파르트-rHuPH20 및 리스프로-rHuPH20의 가속화된 안정성 연구:

동결/해동, 교반 및 높은 저장온도

본 실시예에서, 다양한 인슐린 아스파르트-rHuPH20 및 인슐린 리스프로-rHuPH20 제형들의 안정성을 세가지 물리적 가속화 스트레스 조건 하에서 평가하였다: 복수 동결/해동 사이클; 25℃에서 교반, 및 37℃의 열 스트레스. 안정성은 일반적인 외관 및 특성, rHuPH20 효소 활성 및 rHuPH20 및 인슐린 유사체 순도 측정에 의하여 평가하였다.

인슐린 유사체/ rHuPH20 제형들을 하기 표 64 에 나타내었다. Humalog® 시료(인슐린 리스프로, 제형 4) 및 NovoLog® 시료(인슐린 아스파르트, 제형 8) 들이 대조군으로서 사용되었다. 기본 제형들은 3.47mg/mL 인슐린 리스프로 또는 3.5mg/mL 인슐린 아스파르트, 600U/mL rHuPH20, 30mM Tris/HCl, 및 0.01% 폴록사머 188을 포함하였다. 제형 1 및 5들은 추가적으로 50mM NaCl, 100mM 메티오닌, 0.13% 페놀 및 0.075% m-크레졸을 포함하였고 pH 7.4를 가졌다. 제형 2 및 6 (EP-B 제형들)은 EP-B 수준의 보존제를 가지고 추가적으로 80mM NaCl, 20mM 메티오닌 및 50mM 글리세린을 포함하였다 : 0.15% 페놀 및 0.175% m-크레졸. 제형 3 및 7 (USP 제형들)은 USP 수준의 보존제를 가지고 추가적으로 80mM NaCl, 20mM 메티오닌, 및 50mM 글리세린을 포함하였다: 0.13% 페놀 및 0.075% m-크레졸.

각각 제형들은 하기 가속화된 분해 조건에 노출되었다.

(1) 25℃에서 교반 : 각 제형은 혼합기(shaker)를 갖는 25℃ 배양기 장치에서 유지시켰다. 바이알을 650rpm에서 진탕하며 수직으로 세워두었다. 시료들을 6, 12 및 24시간 동안 진탕 후 분석을 위해 꺼냈다. 모든 시료들은 분석 전에 2-8℃ 에서 저장해두었다.

(2) 복수 사이클 동결/해동: 각 제형에 벤치에서 -30℃ 동결 및 실온 사이의 저장 조건 교차에 의한 동결/해동 5 사이틀을 수행하였다. 시료들은 각 사이클에 대하여 각각의 조건에서 적어도 2시간 동안 유지시켰다(즉, -30℃ 동결 온도에서 2시간, 제거 및 실온의 벤치 상부에 2시간 동안 위치되어 있는 것은 1 사이클로 고려하였다). 시료들을 1,3 및 5 사이클 후에 꺼내었으며 분석전에 2-8℃ 에서 저장해두었다.

(3) 열 스트레스 : 각 제형을 37℃ 의 배양기에서 유지시켰다. 시료들은 8, 24 및 48 시간후에 꺼냈으며 시료들은 분석 전에 2-8℃ 에서 저장해두었다.

분석은 스트레스 상태가 적용된 전 및 후에 수행하였다. 모든 제형들은 외관, 삼투질 농도, pH, 탁도, 히아루로니다아제 효소 활성, 히알루로니다아제 순도, 및 인슐린 순도, HWM 순도 및 함량(시험 과정에 대하여 상기 실시예 2 -5 및 12 참조)을 포함하는 분석적 시험의 완전한 세트에 의하여 특징지어졌다. 안정성 허용기준 또는 각 시험된 파라미터에 대한 타깃 사양들은 실시예 12에서 기술된 바와 동일하다. 결과는 하기에 요약하였다.

1. 25℃에서 교반

EP -B 제형들(#2 및 #6) 그리고 대조 제형들(#4 및 #8)들은 모든 시점에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. UPS 제형들(#3 및 #7)들은 교반 6시간 후 무색이며 투명하였으나 12시간 시점에서 침전물이 형성되었다. 제형 #1 및 #5는 6시간 시점에서 침전물이 생겼다.

rHuPH20은 >375U/mL 효소 활성을 가지고 모든 시점의 모든 제형에서 안정하였다. rHuPH20 회복 퍼센트는 모든 연속적인 시점에서 약간 감소하였으나, 모든 제형은 허용가능한 회복 수준을 유지하였다. 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로는 모든 시점에서 안정하였다. NovoLog ®(인슐린 아스파르트 ) 및 Humalog ®(인슐린 리스프로) 대조군들은 모든 시점에서 안정하였다.

2. 동결/해동

모든 제형들은 모든 시점에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 1회 동결/해동 사이클 이후, 비록 순도 퍼센트가 모든 제형 및 시점에 대하여 >95% 남아 있었으나 rHuPH20 효소 활성은 심각하게 사라졌다(가장 높은 제형, #3은 168U/mL의 활성을 가짐). rHuPH20 회복 퍼센트는 대부분의 제형에 대하여 허용가능한 수준이하였다. 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로는 모든 시점에서 안정하였다. NovoLog®(인슐린 아스파르트) 및 Humalog®(인슐린 리스프로)들은 모든 시점에서 안정하였다.

3. 37℃에서의 온도 스트레스

모든 제형들은 모든 시점에서 입자가 없는 무색이고 투명하였다. 제형 #1, #3, #5 및 #7은 37℃에서 8시간 후 허용가능한 rhuPH20 효소 활성 (>375U/mL)을 가졌다. rHuPH20 활성 감소(375U/mL 이하) 및 회복 퍼센트에서의 감소에 의하여 증명된 것과 같이 rHuPH20 안정성은 모든 제형에 대하여 모든 연속적인 시간에서 감소하였다. 인슐린 아스파르트 및 인슐린 리스프로는 모든 시점에서 안정하였다. NovoLog®(인슐린 아스파르트) 및 Humalog®(인슐린 리스프로) 대조군들은 모든 시점에서 안정하였다.

실시예 15

인슐린/rHuPH20 제형 안정성에서의 HA 올리고머의 영향

본 실시예에서는, HA 올리고머의 추가가 다양한 인슐린/rHuPH20 제형들의 안정성에서 미치는 영향을 평가하였다. 첫째로, 시험은 4가지 저장 조건 하에서 안정성을 평가하기 위하여 완성되었다: 시간에 따라 5℃, 25℃, 30℃ 및 35℃. 둘째로, 다양한 보존제의 존재 하에서 rHuPH20 안정성에 대한 HA 올리고머의 효과를 시험하였다. 셋째로, 다른 크기의 HA 올리고머의 안정화 효과를 인슐린 아스파르트-rHuPH20 제형들에 대하여 평가하였다.

A. 저장 안정성에서의 HA 올리고머의 영향

제형들은 다양한 양의 HA를 포함하였다(10, 15 또는 20 mg/mL).

추가적인 제형들은 다양한 pH, 글리세린 및 염 농도를 가지고 15mg/mL HA를 포함하였다.

인슐린/rHuPH20 제형들을 하기 표 65에 나타내었다. 기본 제형들은 pH 7.4에서 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸을 가지며 3.5mg/mL 인슐린, 600U/mL(5㎍/mL) rHuPH20, 30mM Tris/HCl, 80mM NaCl, 20mM 메티오닌 및 0.01 플록사머 188(폴록사머 188)을 포함하였다. 제형 #2 내지 #4는 추가적으로 각각 10, 15 및 20mg/mL HA 올리고머를 포함하도록 하였다. 15mg/mL 올리고머를 포함하는 제형 #6에 더불어, 제형 # 1 및 # 6 은 추가적으로 50mM 글리세린을 포함하였다. 제형 #5 및 제형 #7은 그들의 pH 및 NaCl 농도가 제형 #3과 상이하였다. pH 7.4에서 메티오닌을 포함하지 않는 것을 포함하여, 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸과 더불어 각각 3.5 mg/mL 인슐린, 600 U/mL rHuPH20, 15 mg/mL HA 올리고머, 30 mM Tris/HCl, 80 mM NaCl 및 0.01 % 폴록사머를 포함하는 세개의 추가적인 제형들(#8-#10)들을 평가하였다. 제형 #8은 추가적으로 20mM 메티오닌을 포함하고 제형 #10은 추가적으로 50mM 글리세린을 포함하였다.

각각 제형의 1ml을 USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 저장하였다. 각각의 제형들은 각각 5±3℃, 25±2℃, 30±2℃ 및 35±2℃에서 배양하였고 t= 0, 2, 5, 7 또는 9 일, 1 및 2주, 1개월 또는 2개월에서 안정성을 측정하여 기록하였다. 안정성은 pH, 외관, 삼투질 농도, rHuPH20 효소 활성, RP-HPLC에 의한 rHuPH20의 함량, RP-HPLC에 의한 인슐린의 함량, 비-변성 SEC에 의한 인슐린의 순도 퍼센트 측정에 의해 평가되었다(실시예 2 - 5 및 실시예 12 참조). 안정성 허용기준 또는 각각의 시험된 파라미터에 대한 타깃 사양들은 실시예 12에 기술된 바와 동일하다.

1. 5℃

적어도 15mg/mL HA 올리고머를 포함하는 모든 제형들은 5℃에서 단 1주일 후에 눈에 보이는 입자를 포함하였다. 단 10mg/mL HA 올리고머 또는 HA 올리고머를 포함하지 않는 제형들은 5℃에서 2주 후에도 입자를 포함하지 않았으며 무색, 투명하였으나, 1개월 후에는 입자가 관찰되었다. 모든 시험된 제형들의 rHuPH20는 2개월 시점까지 5℃에서 안정하였다. 인슐린은 5℃에서 20mg/mL HA 올리고머를 포함하는 제형(#4), 낮은 pH(#5)를 갖는 제형, 높은 염(#7)을 포함하는 제형에서 단 1개월 후에 불안정하였다.

2. 25℃

25℃에서 단 1주일 이후에, 제형 #5(낮은 pH) 및 #7(높은 염)은 입자를 포함하였다. 나머지 제형들은 모두 입자를 포함하지 않았으며 무색이고 투명하였다. 모든 시험된 제형들은 25℃에서 2 개월 시점까지 rHuPH20 및 인슐린에 대하여 안정하였다.

3. 30℃

30℃에서 단 1주일 이후에, 제형 #5(낮은 pH) 및 #7(높은 염)은 입자를 포함하였다. 나머지 제형들은 모두 입자를 포함하지 않았으며 무색이고 투명하였다. 모든 HA를 포함하는 제형들에서 30℃에서 1개월 동안까지 rHuPH20는 안정하였다. 2개월 시점쯤에는, rHuPH20 효소 활성이 허용가능한 수준 375U/mL 이하로 감소하였다. 인슐린은 1개월 시점의 모든 제형에서 안정하였으며, 25℃, 2개월 이후에 관찰된 안정성에서는 명백한 감소를 나타냈다. HA 올리고머의 추가는 인슐린의 안정성에 영향을 주지 않으면서 25℃에서 rHuPH20 안정성에 명백한 긍정적인 효과를 가져왔다.

제형 #8 내지 #10들을 25℃에서 제로 시점 및 3일 이후의 rHuPH20 산화에 대하여 시험하였다. 50mM 글리세린을 포함하는 제형 #10은 25℃에서 단 3일 이후에 산화 증가를 나타내었다.

4. 35℃

HA 올리고머를 포함하는 제형들은 rHuPH20에 대하여 35℃에서 2일 동안 안정하였다. 5일째에, 오직 15mg/mL HA 올리고머를 포함하고 다른 pH를 가지는 제형 #3 및 # 5들에서만 rHuPH20가 안정하였다. rHuPH20 함량은 35℃에서 단 2일 이후에 모든 제형에서 낮아졌다. HA 올리고머의 추가는 인슐린의 안정성에 영향을 주지 않으면서 35℃에서 rHuPH20 안정성에 명백한 긍정적인 효과를 가져왔다.

B. 보존제 영향

1. USP 보존제

본 실시예에서, USP 수준의 보존제를 포함하는 인슐린 아스파르트-rHuPH20 또는 인슐린 리스프로-rHuPH20 제형들의 안정화에 대한 HA 올리고머의 능력을 밝혀진 rHuPH20 효소 활성을 통해 평가하였다.

제형 F1-F7들을 시험하였다. 기본 제형들은 3.5 mg/mL 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로, 600 U/mL rHuPH20, 30 mM Tris/HCl, pH 7.4, 5 mM 메티오닌, 0.01 % 폴록사머 188, 0.125 % 페놀 및 0.075 % m-크레졸을 포함하였다. 제형 F1은 인슐린 아스파르트를 포함하지 않았다. rHuPH20 효소 활성은 상기 실시예 2B 에서 기술된 것과 같이 평가되었다. 결과를 하기 표 66 내지 67 에 나타내었다. 모든 제형들은 5℃에서 3일 또는 6일 동안 안정하였다. 모든 HA를 포함하는 제형들은, 그들의 pH 및 NaCl 농도와 무관하게, HA를 포함하지 않는 동일한 제형들과 비교하여 더 높은 효소 활성을 가졌다. 하기 표 66에서 나타내는 바와 같이, 10mg/mL HA를 포함하는 제형 F4는 HA를 포함하지 않고, 동일하거나 낮은 pH를 갖는 제형 F2 및 F3와 비교하여 37℃에서 시간에 따라 더 높은 rHuPH20 효소 활성을 가졌다. 감소된 NaCl 농도를 갖는 제형 F5(하기 표 67 참조) 제형으로의 HA 10mg/mL의 추가는 rHuPH20을 불안정화시키는 낮은 NaCl 농도에 기인한 rHuPH20 활성 손실을 제한하였다(예를 들어 F3 참조).

2. EP-B 보존제 수준

본 실시예에서, EP-B 수준의 보존제를 갖는 인슐린-rHuPH20 제형의 안정화에 대한 HA 올리고머의 능력을 밝혀진 rHuPH20 효소 활성에 의하여 평가하였다. 기본 제형들은 3.5 mg/mL 인슐린, 600 U/mL rHuPH20, 30 mM Tris/HCl, pH 7.4, 20mM 메티오닌, 0.01 % 폴록사머 188, 0.10 % 페놀 및 0.15 % m-크레졸을 포함하였다. rHuPH20 효소 활성은 상기 실시예 2B 에서 기술된 것과 같이 평가하였다. 결과를 하기 표 68 에 나타내었다. 35℃에서, HA를 포함하는 제형들(F2-F6)은 모두 HA를 포함하지 않는 제형 F1과 비교하여 더 높은 rHuPH20 효소 활성을 가졌다. 9일째에, F1에는 오직 약 10% 효소활성만이 남아있었던 반면, 제형 F2-F6은 그들의 pH, HA 및 NaCl 농도에 의존적으로 30% 내지 60%의 rHuPH20 효소 활성을 여전히 가졌다. 이들 제형에 대한 유사한 결과가 30℃에서 배양된 더 긴 기간의 안정성 연구에서도 관찰되었다. 하기 표 68에서도 보여주는 바와 같이, 30℃에서 3개월간 저장의 마지막에는, 약 30%의 rHuPH20 효소 활성이 HA를 포함하지 않는 제형 F1에 대해 남아있었으며; HA를 포함하는 다른 모든 제형과 관련해서는 평균적으로 약 50% 이상의 rHuPH20 효소 활성이 남아있었다.

낮은 온도에서, rHuPH20는 HA를 포함하거나 포함하지 않는 제형들 사이의 상대적 효소 활성의 변화에 관한 작은 차이에 대하여 설명할 수 있는 적은 온도 스트레스를 경험하였다. 본 연구에서 동일한 pH 및 NaCl 조건 하에서, rHuPH20 활성이 시험된 HA의 농도와 무관하다는 것에 유의해야한다. HA가 rHuPH20에 대한 기질이라는 사실에 기인하여, 이것의 안정화 메카니즘은 아마 분명히 특이적 효소-기질 결합 효과와 연관이 있을 것이다. 이러한 분명한 상호작용은 두개의 분자사이의 몰비에 의하여 영향을 받는다. 특정 기질: 효소 비율에서, 최대 안정화 효과에 도달하면 더 많은 HA의 추가가 더이상 활성을 증가시키지 못한다. 본 실시예에서, 약 10mg/mL의 HA가 5㎍/mL rHuPH20의 안정화에 필요하다.

C. rHuPH20 안정화에 대한 HA 분자량의 영향

본 실시예에서, HA 올리고머의 사이즈 차이의 안정화 효과는 인슐린-아스파르트-rHuPH20 제형들에서 밝혀진 rHuOH20 효소 활성 측정에 의하여 평가하였다. 3개의 다른 분자량 소듐하이알루로네이트(sodium hyaluronate)들을 Lifecore Biomedica(미네소타, USA)로부터 얻었다: 6.4 kDa (Lot: GSP252-5-7), 74 kDa (Lot:GSP252-60-2) 및 234.4 kDa (Lot:002799). 10mg의 각 HA들을 100U/mL 인슐린 아스파르트, 5㎍/mL rHuPH20, 30mM mM Tris/HCl, pH 7.4, 80 mM NaCl, 50 mM 글리세롤, 20 mM 메티오닌, 0.01% 폴록사머 188, 0.10% 페놀, 및 0.15% m-크레졸을 포함하는 인슐린 아스파르트-PH20제형 1mL에 추가하였다. HA를 포함하지 않는 제형 또한 본 연구에 대조군으로 포함하였다. 이들 용액들을 HA의 다른 사이즈가 rHuPH20 효소 활성에 미치는 안정화 효과를 평가하기 위하여 9 일까지 5℃ 및 37℃에서 배양하였다. rHuPH20 효소 활성은 상기 실시예 2B 에서 기술한 것과 같이 측정되었다.

결과를 하기 표 69에 나타내었다. HA를 포함하지 않는 인슐린 아스파르트-rHuPh20 제형(F1)은 37℃ 배양에서 3일 이후에 효소적으로 불활성화되었다. 반면, 제형 F2-F4들은 약 30-40%의 rHuPH20 효소 활성을 보유하고 있었다. 보통, 더 적은 HA 폴리머들이 큰 것들보다 더 나은 보호를 제공하는 것으로 보이는 경향이 있다. 이것은 HA 크기 단독 또는 HA 와 rHiPH20 몰비에 기인하는 것일 수 있다.

실시예 16

인슐린 아스파르트/rHuPH 20 제형의 안정성 연구

본 실시예에서, 다양한 인슐린 아스파르트/rHuPH20 제형들에서 2개의 저장 조건, 30℃ 및 37℃ 하 및 가속화된 조건(25℃ 에서 9일 동안 교반)에서의 안정성을 평가하였다. 시험된 인슐린/rHuPH20 제형들은 하기 표 70에 나타내었다. 참고 제형(#7)은 0.1 % 페놀 및 0.15 % m-크레졸과 함께 pH 7.4에서 3.5 mg/mL 인슐린 아스파르트, 600 U/mL (5㎍/mL) rHuPH20, 30 mM Tris/HCl, 80 mM NaCl, 50 mM 글리세린, 20 mM 메티오닌 및 0.01 % 폴록사머 188 (Poloxamer 188)포함하였다.

제형 #1-#3은 3개의 다른 수준의 안정화제 폴록사머 188과 함께 0.13% 페놀 및 0.12% m-크레졸 보존제 수준을 시험하였다. 제형 #4-#6은 3개의 다른 수준의 안정화제 폴록사머 188 과 함께 0.15% 페놀 및 0.12% m-크레졸 보존제 수준을 시험하였다. 낮은 수준의 글리세린(20mM)을 가진 제형 #8에 더불어, 제형 #8 및 #9는 10mg/mL HA 올리고머를 추가적으로 더 포함하였다. 제형 #10 및 #11은 낮은 수준의 메티오닌(5mM) 을 포함하였고 #11은 추가적으로 10mg/mL HA 올리고머를 더 포함하였다.

각각 제형의 1ml을 USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 저장하였다. 각각의 제형들은 개별적으로, 30±2℃ 및 37±2℃에서 배양시켰으며, 안정성 측정을 다양한 시간 t= 0, 2, 4, 7 및 9일, 2주, 1개월 또는 1.5 개월에서 기록하였다. 각 제형들에 대하여, 하나의 바이알 셋트를 Titer Plate shaker (LabLine)을 이용하여 600rpm, 25℃에서 9일 동안 교반하였다. NovoLog®(인슐린 아스파르트) 는 또한 대조군으로써 동일한 교반조건으로 수행되었다.

안정성은 pH, 외관, 삼투질 농도, rHuPH20 효소 활성도, RP-HPLC 의한 rHuPH20 함량 및 RP-HPLC 에 의한 인슐린 함량 측정에 의하여 평가되었다(실시예 2-5 및 12 참조). 허용가능한 기준 또는 안정성 파라미터에 대한 타깃 사양은 실시예 12에서 나타낸 바와 동일하였다.

1. 30℃

모든 제형들은 30℃에서 2주 후에 입자를 포함하지 않으며 모두 무색이고 투명하였다. 모든 제형에서 관찰된 안정성의 시간에 따른 약간의 감소 경향과 더불어, 모든 시험된 제형들은 30℃에서 2주 시점까지 rHuPH20 및 인슐린 아스파르트에 대하여 안정하였다. HA 올리고머를 포함하지 않는 제형들과 비교하여 더 높은 효소 활성도 및 함량에 의해서 입증되는 HA 올리고머를 포함하는 제형(#8, #9, #11)의 rHuPH20 활성화에 대한 안정화 효과가 관찰되었다. 추가적으로, 글리세린과 메티오닌의 농도 감소는 이들 제형들의 안정화에 대한 영향에 있어서 인지가능할 정도의 결과를 나타내지 않았다(#8, #9, #11).

보존제 농도의 비교는 메타크레졸의 양 감소 및 페놀 양의 비교적 적은 증가가 rHuPH20 안정화에 유용하나, 페놀의 농도가 높은 경우 이러한 유용성이 제거된다는것을 보여주었다. 반면, 보존제 농도의 변화는, 모든 제형에서 인슐린 아스파르트 함량이 비교적 적게 감소한 바와 같이 인슐린 아스파르트 안정성에 적은 영향을 미쳤다. 예를 들어 rHuPH20은 0.15% 페놀을 포함하는 제형(#4-#6) 보다 0.13% 페놀을 포함하는 제형(#1-#3)에서 더 안정하였다. 증가된 페놀 농도 및 감소된 메타크레졸 농도를 갖는 제형들(#1-#3)은 낮은 양의 페놀 및 높은 양의 메타크레졸을 포함하는 참고 제형(#7) 보다 더 안정하였다. 반면 제형 #4-#6은 참고 제형 #7 만큼 안정하였다.

2. 37℃

모든 제형들은 37℃에서 9일 후에 입자를 포함하지 않으며 모두 무색이고 투명하였다. 비록 제형중 어느 것도 허용 수준의 rHuPH 20 효소 활성도를 가지지 못하였지만, HA 올리고머를 포함하지 않는 제형들보다 37 ℃에서 2일 후 더 높은 효소 활성도 및 함량에 의해서 입증되는 rHuPH20 활성도에 대한 HA 올리고머를 포함하는 제형들(#8, #9, #11)의 안정화 효과가 관찰되었다. rHuPH20 효소 활성의 손실은 rHuPH20 함량의 손실과 연관되어 있었다. 반면, 인슐린 아스파르트 함량은 37℃ HA 올리고머의 존재 하에서 인슐린 아스파르트가 안정하지 않다는 것을 보여주는 HA 올리고머를 포함하는 모든 제형들에서의 감소 경향을 보였다. 25℃에서 보았던 결과와 유사하게, 보존제 농도의 비교는 메타크레졸의 양 감소 및 페놀 양의 비교적 적은 증가가 rHuPH20 안정화에 유용하나, 페놀의 농도가 높은 경우 이러한 유용성이 제거된다는 것을 보여주었다. 반면, 보존제 농도의 변화는 모든 제형에서 인슐린 아스파르트 함량이 비교적 적게 감소하였듯이 인슐린 아스파르트의 안정성에 적은 영향을 미쳤다.

3. 25℃ 에서의 교반

비록 HA 올리고머를 포함하는 제형들(#8, #9, 및 #11)들이 24시간 후 뿌옇게 되었으나, rHuPH20 및 인슐린 아스파르트는 25℃에서의 교반에서 24 시간 또는 48 시간 이후 모든 제형에서 안정하였다. Novolog®은 25℃에서의 교반에서 24시간 후에 안정하였다. 보존제 농도의 변화는 rHuPH20 또는 인슐린 아스파르트 안정성에 영향을 주지 않았다.

실시예 17

이가 금속 이온(Mg ⁺² ) 및 HA 올리고머를 포함하는 제형

본 실시예에서, EP-B 수준의 보존제가 rHuPH20 효소 활성에 미치는 영향을 두 개의 저장조건 하에서 평가하였다: 5℃에서 5일, 37℃에서 3-5일. 제형들은 HA 올리고머와 이가 금속 이온(Mg⁺²)을 다양한 양으로 포함하도록 하였다.

rHuPH20 제형들을 하기 표 71에 나타내었다. 기본 제형들은 0.100 % 페놀 및 0.150 % m-크레졸과 함께 pH 6.8에서 600U/mL rHuPH20, 30 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, 5 mM 메티오닌, 0.01 % 폴록사머 188 (Poloxamer 188)를 포함하였다. 제형 2 및 4는 추가적으로 10mg/mL의 HA 올리고머를 포함하며, 제형 3 및 5는 20mg/mL의 HA 올리고머를 포함하였다. 제형 2 및 3은 추가적으로 3mM Mg⁺²를 포함하며, 제형 4 및 5는 10mM Mg⁺²를 포함하였다.

각 제형 1ml을 USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 저장하였다. 각각의 제형들은 개별적으로, 5℃ 및 37℃에서 배양시켰으며, 안정성 측정값을 t= 3, 4 및/또는 5일에서 기록하였다. 안정성을 pH, 외관, 삼투질 농도, rHuPH20 효소 활성, RP-HPLC 의한 rHuPH20 함량 측정에 의하여 평가하였다(실시예 2-3 및 5 그리고 실시예 12 참조). 허용가능한 기준 또는 상기 파라미터의 각각에 대한 타깃 사양은 실시예 12에서 나타낸 바와 동일하였다.

결과는 모든 제형들이 입자가 없는 무색이고 투명하다는 것을 보여주었다. 삼투성은 Mg⁺² 추가에 따라 증가하는 경향을 보였다. rHuPH20 효소 활성과 함량은 5℃ 모든 제형에서 안정하였다. 37℃에서, rHuPH20 효소 활성이 3일째에 감소하였고, 4일 이후에는 수용되는 타깃 사양인 375U/mL 이였다. 5일 이후에는, 초기 rHuPH20 효소 활성의 약 절반이 남아있었다. 이러한 활성 감소는 rHuPH20 함량 감소와 관련이 있다.

실시예 18

5℃ 또는 37℃에서의 USP 보존제 제형의 연구

본 실시예에서, USP 수준의 보존제가 rHuPH20 효소 활성에 미치는 영향을 두 개의 저장 조건하에서 평가하였다: 5℃에서 4일 및 37℃에서 2, 4, 6, 8 및 12일. 제형들은 다른 양의 HA 올리고머와 염 그리고 다양한 pH를 갖도록 하였다. rHuPH20 제형들을 하기 표 72에 나타내었다. 기본 제형들은 0.125% 페놀 및 0.075 % m-크레졸과 함께 600U/mL rHuPH20, 3.5mg/mL 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로 또는 레귤러 인슐린, 30 mM Tris/HCl, 5 mM 메티오닌, 0.01 % 폴록사머 188 (Poloxamer 188)를 포함하였다. 제형 1은 인슐린을 포함하지 않았다. 제형 2-5는 인슐린 아스파르트를 포함하고, 제형 6-9는 레귤러 인슐린을 포함하였고 제형 10-13은 인슐린 리스프로를 포함하였다. 4개 기본 제형들을 각각의 인슐린 유사체에 대하여 준비하였다. 제형 2,6 및 10들은 pH만을 달리한(7.0 vs 7.2) 3,7 및 11과 각각 동일하였다. 제형 3,8 및 12들은 NaCl만을 달리한 4, 9 및 13과 각각 동일하였다. 이들 제형들은 추가적으로 10mg/mL HA 올리고머를 포함하였다.

각 제형 1ml을 USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 봉합을 하여 저장하였다. 각각의 제형들은 개별적으로, 5℃ 및 37℃에서 배양시켰으며, 안정성 측정값을 t= 2, 4, 6, 8 및/또는 12일에서 기록하였다. 안정성을 pH, 외관, 삼투질 농도, rHuPH20 효소 활성도, RP-HPLC 의한 rHuPH20 함량 및 RP-HPLC에 의한 인슐린의 함량 측정에 의하여 평가하였다(실시예 2-3 및 5 그리고 실시예 12 참조). 허용가능한 기준 또는 상기 시험된 파라미터의 각각에서의 안정에 관한 타깃 사양은 실시예 12에서 나타낸 바와 동일하였다.

결과는 5℃ 또는 37℃에서 12일 이후 제형 1 및 모든 인슐린 아스파르트 제형들(#2-5)이 입자가 없는 무색이고 투명하다는 것을 보여주었다. 5℃에서 6일 이후, 제형 6 및 8-9 그리고 11-13에서는 결정들이 관찰되었으며 제형 10에서는 5℃에서 단 2일 후 결정이 관찰되었다.

모든 제형들은 5℃에서 4일 이후에도 안정하였다. 인슐린 리스프로 제형들(#10-13)들은 37℃에서 8일 동안 안정한 반면, 인슐린 제형들(#6-9)들은 37℃에서 오직 2일 동안만 안정하였다(#7은 예외). 인슐린 아스파르트 제형들(#2-5) 들은 37℃에서 4-6 일동안 안정하였다. 37℃에서 rHuPH20 함량은 모든 제형들에 대하여 시간에 따라 감소하였다. 인슐린 함량은 모든 제형들에 대하여 시간에 따라 감소하였다.

실시예 19

다른 보존제 수준의 항균 효과 시험

본 실시예에서, 타깃 양의 인슐린 및 rHuPH20과 함께 다양한 수준의 보존제를 포함하는 제형들의 여러개 뱃치를 미생물 효과시험을 위하여 준비하였다. 본 시험은 분석 실험 계약(Quadrants Scientific, Inc., San Diego, CA and Lancaster Laboratories, Lancaster, PA)에 의한 EP 및 USP 가이드에 따라 수행하였다. 박테리아 Pseudomonas aeruginosa, E. coli 및 Staphylococcus aureus 그리고 균류 Aspergillus niger 및 Candida albicans.에 대한 항균 효과에 관하여 다양한 보존제를 포함하는 제형들을 시험하였다. 시험들은 1) 시료에 각각 박테리아의 초기 접종원을 추가(적어도 10⁵ CFU/mL) 하고 2) 각 박테리아 또는 균의 CFU/mL을 24시간, 7일 및 14일째에 측정하여 수행하였다. 미가공 데이터(CFU/mL)들은 측정된 접종원으로부터의 감소를 log 10 단위로 하여 전환하였다. 제형들을 37℃의 온도에서 시험하였다.

모든 제형들은 100U/mL 인슐린 또는 인슐린 유사체 및 5㎍/mL rHuPH20를 포함하였다. 나머지 성분들은 제형들마다 다양하게 하였으며, 이러한 다양한 성분의 영향에 대하여 비교하였다. 결과를 표 73에 요약하였으며, 이는 항균 효과에 대한 다양한 제형 성분의 영향을 요약한다. 중성 효과(neutral effect)는 표시된 성분 및 농도가 항균 효과에 대하여 어떤한 영향도 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 인슐린 유사체는 인슐린 유사체, 즉, 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로의 차이만 있는 두 개의 제형을 비교하였을때 항미생물 효과에 대하여 중성 효과를 갖는다. NaCl 농도는 제형에 따라 항미생물 효과에 대하여 중성 또는 음성 효과를 갖는다.

실시예 20

가용성 rHuP20-발현 세포주의 세대

HZ24 플라스미드(서열번호 52에 표시)는 중국햄스터난소세포(CHO 세포)의 감염에 이용된다(예를 들어, 미국특허 7,76,429 및 7,781,607 그리고 US 공개 2006-0104968 참조). 가용성 rHuPH20 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본(Promega), 인간 PH20 히아루로니다아제의 1-482 아미노산을 암호화하는 DNA(서열번호 49), ECMV 바이러스 유래 IRES(internal ribosomal entry site)(Clontech), 그리고 마우스 디하이드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR) 유전자를 포함한다. pCI 벡터 백본은 또한 베타-락타마아제 저항성 유전자(AmpR)을 암호화하는 DNA, f1 복제원점, 사이토메갈로바이러스 전-초기 인헨서/프로모터영역(Cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter region (CMV)), 키메릭 인트론, 그리고 SV40 후기 폴리아데닐화신호(SV40 late polyadenylation signal ; SV40)를 포함한다. 가용성 rHuPH20 구조를 암호화하는 DNA는 NheI 부위 및 인간 PH20의 천연 35 아미노산 신호서열의 첫번째 아미노산 위치의 메티오닌을 암호화하는 DNA 이전의 Kozak 보전 서열, 그리고 서열번호 1로 표시된 인간 PH20 히아루로니다아제의 482 아미노산 위치에 상응하닌 티로신을 암호화하는 DNA 이후의 정지코돈, 뒤에 이어지는 BamHI 제한부위를 포함한다. 그러므로 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24) 구조는, 결과적으로 IRES(internal ribosomal entry site)에 의해서 분리된 인간 PH20의 1-482 아미노산(서열번호 3으로 표시) 및 마우스 디하이드로엽산 환원효소의 1-186 아미노산(서열번호 53으로 표시) 를 암호화하는, CMV 프로모터가 이끄는 단일 mRNA 종이다.

비-형질감염된 DG44 CHO 세포들을 DHFR(-) 세포를 위한 4mM 글루타민 및 18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)가 보충된 GIBCO 수정된 CD-CHO 배지에서 성장시키고, 형질감염을 위해 준비된 세이커 플라스크에 0.5 x 10⁶ cells/ml 로 분주하였다. 세포들을 37℃, 5% CO₂ 의 가습된 배양기에서 성장시켰으며, 120rpm에서 교반시켰다. 비-형질감염 DG 44 CHO 세포의 기하급수적인 성장을 형질감염 이전의 생존율에 대하여 평가하였다.

비-형질감염 DG 44 CHO 세포 배양의 살아있는 60만개의 세포들은 펠렛하고 0.7 mL의 2x 형질감염 완충액(2xHeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na₂HPO₄, 12 mM 덱스트로오스)에 2x10⁷ cells 밀도로 재현탁시켰다. 각각의 재현탁 세포들의 분취물에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)으로 밤새 절단되어 선형화됨) 0.09ml(250㎍)를 추가하였으며, 그리고 세포/DNA 용액들을 실온에서 0.4cm 갭 BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 음성 대조군 전기천공을 플라스미드 DNA 없이 혼합된 세포를 이용하여 수행하였다. 세포/플라스미드 혼합물들을 330V 및 960㎌ 또는 350V 및 960㎌ 로 하전된 축전기를 이용하여 전기천공시켰다.

세포들을 전기천공후 큐벳에서 제거하고 4mM 글루타민 및 18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)가 보충된 수정된 DHFR(-) 세포용 CD-CHO 배지 5mL로 이동시켰으며, 37℃, 5% CO₂ 가습화된 배양기 내 6-웰 조직배양플레이트 상에서 2일 동안 선택없이 성장하도록 하였다.

전기천공 후 2일째에, 0.5mL 조직 배양 배지를 각 웰로부터 제거하고 실시예 2에 기술된 미세탁도 분석(microturbidity assay)을 이용하여 히알루로니다아제 활성의 존재를 시험하였다.

형질감염 2(350V) 유래 세포들을 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하고 살아있는 세포가 1mL 당 1x10⁴ 내지 2x10⁴ 이 되도록 희석하였다. 0.1mL 세포 현탁 분취물을 96웰 둥근바닥 조직 배양 플레이트 5개의 웰에 각각 이동시켰다. 4mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함하고 하이포크산틴 및 티미딘 보충물을 갖지 않는 100 마이크로리터 CH-CHO 배지(GIBCO)를, 세포를 포함하는 웰에 추가하였다(최종 부피 0.2mL).

메토트렉세이트를 갖지 않는 5개 성장플레이트로부터 10개의 클론들이 동정되었다.

6개 HZ24 클론들은 배지에서 증식되었으며, 단일세포 현탁으로 쉐이커 플라스크로 옮겨졌다. 이차원 무한희석 전략을 이용하여 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, 및 4D10 들을 96-웰 둥근바닥 조직배양 플레이트로 도포하였고, 여기에서 세포들은 웰 왼쪽 상단 5000 세포에서 시작하여 플레이트 아래로 1:2 희석되고 플레이트를 가로질러 1:3 희석되었다. 희석된 클론들이 배양일 초기에 필요한 성장인자를 공급하기 위하여, 500 비-형질감염 DG44 CHO 세포/웰 백그라운드에서 성장하였다. 50nM 메토트렉세이트를 포함하는 5개 플레이트와 메토트렉세이트를 포함하지 않는 5개 플레이트들을 갖는 10개 플레이트들을 서브클론당 제조하였다.

클론 3D3은 24개의 눈에 보이는 서브클론들을 제조하였다(메토트렉세이트를 처리하지 않은 것에서 13개 및, 50nM 메토트렉세이트 처리한 것에서 11개). 뚜렷한 히알루로니다아제 활성이 24개 서브클론 중 8개 유래의 상청액에서 관찰되었고(>50 Units/mL), 이들 8개 서브클론들을 T-25 조직 배양 플라스크로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜 유래의 동정된 클론들은 50nM 메토트렉세이트의 존재 하에서 증식되었다. 클론 3D35M은 추가적으로 쉐이커 플라스크 내에서 1000 Units/ml 초과 생산 클론을 가져다 주는 500nM 메토트렉세이트 내에서 증식되었다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 3D35M 세포들의 마스터 셀 뱅크(master cell bank; MCB)를 그 후 준비하였다.

실시예 21

가용성 인간 PH20(rHuPH20)을 포함하는 Gen2 세포 생산

실시예 20에 기술된 Gen1 3D35M 세포주들을 2세대(Gen2) 클론의 생산을 위하여 높은 메토트랙세이트 수준에 적용시켰다. 3D35M 세포들은 메토트렉세이트를 포함하는 수립된 배양에서 4mM GlutaMAX-1™ 및 1.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 CH-CHO-배지로 분주되었다. 세포들을 37℃, 7% CO₂ 가습화된 배양기 내에서 46일 동안 9회 이상의 계대 및 성장에 의하여 높은 메토트렉세이트 수준에 적응되도록 하였다. 증식된 수의 세포들을 2.0μM 메토트렉세이트를 갖는 배지를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트 내에서 제한 희석에 의하여 복제시켰다. 약 4주 후, 클론들을 동정하고 클론 3E10B를 증식을 위해 선택하였다. 3E10B 세포들은 4mM GlutaMAX-1™ 및 2.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지에서 20계대 동안 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 셀 뱅크(MCB)를 제조하고 동결하였으며 이후의 연구에 사용하였다.

세포주들의 증식은 4mM GlutaMAX-1™ 및 4.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지에서의 3E10B 세포들의 배양에 의하여 계속되었다. 12번째 계대 이후, 세포들을 research cell bank(RCB)로서 바이알에서 동결되었다. RCB 중 하나의 바이알을 해동시키고 8.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 배양하였다. 5일 후, 배지 내 메토트렉세이트 농도는 16.0μM로 증가하였으며, 18일 이후에는 20.0μM 로 증가하였다. 20μM 메토트렉세이트를 포함하는 배지 내에서의 8번째 계대 유래 세포들을 4mM GlutaMAX-1™ 및 20.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트 내에서 제한 희석에 의하여 복제시켰다. 클론들은 5-6주 후 동정하였으며 클론 2B2를 20.0μM 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서의 증식을 위하여 선택하였다. 11번째 계대 후, 2B2 세포들을 바이알에서 research cell bank(RCB)로서 동결시켰다.

그 결과물인 2B2 세포들은 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디히드로엽산환원효소(dihydrofolate reductase) 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포였다. 가용성 PH20은 약 206 copies/cell의 복제수에서 2B2 세포 내에 존재하였다. rHuPH20-특이적 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind Ⅲ-분해된 genomic 2B2 세포 DNA의 서던 블랏 분석은 하기 제한효소 분해 프로파일을 나타내었다: Spe I의 DNA 절단에서 하나의 주요 혼성화 밴드 ~7.7 kb 및 4개의 부수적인 혼성화 밴드들(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6 kb); Xba I의 DNA 분해에서 하나의 주요 혼성화 밴드 ~5.0kb 및 2개의 부수 혼성화 밴드(~ 13.9 and ~6.5 kb); 그리고 하나의 단일 혼성화 밴드 ~1.4kb가 BamH I/Hind Ⅲ의 2B2 DNA 분해를 이용하여 관찰되었다. mRNA 전사제의 서열 분석은 유래된 cDNA(서열번호 56)가 참조서열(서열번호 49)과 1131 위치의 하나의 염기쌍을 제외하고는 동일하다는 것을 보여주었으며, 이는 예상되는 시토신(C) 대신 티미딘(T)으로 관찰되었다. 이는 아미노산 서열에는 영향을 주지 않는 침묵돌연변이이다.

실시예 22

A. 300L 생물반응기 세포 배양에서의 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산

HZ24-2B2 바이알을 해동시켰으며 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX-1™ (인비트로젠)이 보충된 CD-CHO 배지(인비트로젠, Carlsbad, CA)에서 36L 스피너 플라스크를 통해 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 간단하게, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동시키고, 배지를 추가하였으며 세포들은 원심분리하였다. 세포들을 20mL의 신선한 배지를 갖는 125mL 진탕 플라스크에서 재현탁시키고 37℃, 7% CO₂ 배양기에 위치시켰다. 세포들을 125mL 진탕 플라스크 내에서 40mL 까지 증식시켰다. 세포 밀도가 1.5x10⁶ cells/mL 초과에 도달하였을 때, 배양물을 100mL 배양 부피 내에서 125mL 스피너 플라스크로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO₂ 에서 배양하였다. 세포 밀도가 1.5 x 10⁶ cells/mL 초과에 도달하였을 때, 배양물들을 200mL 배양 부피내에서 250mL 스피너 플라스크로 확장시켰고 플라스크를 37℃, 7% CO₂ 에서 배양하였다. 세포 밀도가 1.5 x 10⁶ cells/mL 초과에 도달하였을 때, 배양물들을 800mL 배양 부피내에서 1L 스피너 플라스크로 확장시켰고 37℃, 7% CO₂ 에서 배양하였다. 세포 밀도가 1.5 x 10⁶ cells/mL 초과에 도달하였을 때, 배양물들은 5000mL 배양 부피내에서 6L 스피너 플라스크로 확장되었고 37℃, 7% CO₂ 에서 배양하였다. 세포 밀도가 1.5 x 10⁶ cells/mL 초과에 도달하였을 때, 배양물들을 32L 배양 부피에서 36L 스피너 플라스크로 확장시키고 37℃, 7% CO₂ 에서 배양하였다.

400L 반응기를 멸균시키고 230mL 의 CD-CHO 배지를 추가하였다. 사용 전에, 반응기의 오염을 확인하였다. ml 당 4.0 x 10⁵ 의 살아있는 세포의 세포접종밀도 및 총 부피 260L에서 약 30L 세포들을 36L 스피너 플라스크로부터 400L 생물반응기(Braun)로 이동시켰다. 파라미터들은 설정된 지점의 온도, 37℃; 임펠러 속도 40-55 RPM; 관 압력: 3 psi; 공기 살포 0.5- 1.5 L/Min; 공기 오버레이(Overlay): 3 L/ min이다. 반응기는 세포 측정, pH 확인, 배지 분석, 단백질 생산 및 보유를 위하여 매일 시료화하였다. 또한 실행동안 영양 피드를 추가하였다. 120시간(5일)에, 10.4L의 Feed #1 배지(4x CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 160 mL/L Glutamax-1™+ 83 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 33 mg/L rHuInsulin)를 추가하였다. 168시간(7일)에, 10.8L의 Feed #2 배지(2x CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 80 mL/L Glutamax-1™+ 167 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 0.92 g/L 나트륨 낙산염(Sodium Butyrate))를 추가하였고, 배양 온도를 36.5℃로 변화시켰다. 216시간(9일)에, 10.8L의 Feed #3 배지(1x CD-CHO + 50 g/L 글루코오스 + 50 mL/L Glutamax-1™+ 250 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 1.80 g/L 나트륨 낙산염(Sodium Butyrate))를 추가하였고, 배양 온도를 36℃로 변화시켰다. 264시간(11일)에, 10.8L의 Feed #4 배지(1x CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 33 mL/L Glutamax-1™+ 250 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 0.92 g/L 나트륨 낙산염(Sodium Butyrate))를 추가하였고, 배양 온도를 35.5℃로 변화시켰다. 피드(Feed)배지의 추가로 생산 최종 단계에서 가용성 rHuPH20 생산에서의 극적인 증가가 관찰되었다. 반응기는 14일 또는 15일 또는 살아있는 세포가 40% 이하로 떨어질 때에 수거하였다. 이러한 과정은 1200만 cells/mL의 최대 세포 밀도를 갖는 ml 당 17,000 유닛의 최종 생산성 결과를 나타내었다. 수확물에서 배양물들은 투과전자현미경(TEM)에 의한 in vivo 및 in vitro 에서 바이러스, 마이코플라즈마, 바이오버든, 내독소 및 효소 활성에 대하여 시료화되었다.

배양물들을 연동펌프에 의해, 각각 4-8㎛ 등급의 규조토층 및 1.4-1.1㎛ 등급의 규조토 층으로 구성된 4개의 평행 4 Millistak 여과 시스템 모듈(Millipore)을 통해, 이어서 셀룰로오스 멤브레인, 그리고 이어서 0.4-0.11㎛ 등급의 규조토층 및 < 0.1㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 2차 단일 Millistak 여과 시스템(Millipore) 통해, 이어서 셀룰로오스 멤브레인에, 그리고 이어서 0.22㎛ 최종 필터를 통해, 350L 용량의 멸균 단일 용도 신축성 백으로 펌핑하였다. 수확한 세포 배양물 유체들에 10mM EDTA 및 10mM Tris를 pH 7.5까지 보충하였다. 배양물을 4 개의 Sartoslice TFF 30 kDa 분자량 cut-off (MWCO) 폴리에테르 설폰 (PES) 필터 (Sartorius)를 이용한 TFF(tangential flow filtration) 기기를 이용하여 10x 농축시켰고, 이어서 10mM Tris, 20 mM Na₂SO₄, pH 7.5 로 10x 완충액을 교환하고, 0.22㎛의 최종 필터를 통해 50 L 멸균 저장 백으로 여과시켰다.

농축되고 여과된 수확물들을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전, 10 % 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스테이트(TNBP) 용액을 제조하였다. 농축되고 여과된 수확물들을 Q 컬럼에서 정제되기 직전에 36L 유리 반응조(reaction vessel)에서 1 % 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 1시간 동안 노출시켰다.

B. Gen2 가용성 rHuPH20의 정제

Q 세파로오즈(Pharmacia) 이온 교환 칼럼(9L 리신, H=29cm, D=20cm) 을 준비하였다. 세척 시료를 pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석의 결정을 위해 수집하였다. 칼럼은 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na₂SO₄, pH 7.5 평형화하였다. 바이러스 불활성화 후, 농축, 투석여과 수확물을 100 cm/hr 유속의 Q 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na₂SO₄, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0로 세척하였다. 단백질을 10mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 를 가지고 0.22 ㎛ 최종 필터를 거쳐 멸균 백으로 용출시켰다. 용출 시료의 멸균유효성(Bioburden), 단백질 농도 및 히알루로니다아제 활성에 대하여 시험하였다. A₂₈₀ 흡광도 분석을 교환의 시작과 종료점에서 수행되었다.

페닐-세파로오스(Pharmacia) 소수성 상화작용 크로마토그래피를 다음 단계로 수행하였다. 페닐-세파로오스(PS) 칼럼(19-21 레진, H=29cm, D= 30 cm)을 준비하였다. 세척물을 pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 수집하고 시료화하였다. 칼럼을 5 컬럼 부피로 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl₂, pH 7.0 로 평형화시켰다. Q 세파로오스 칼럼으로부터 용출된 단백질에 최종 농도 5 mM, 0.5 M 그리고 0.1 mM을 각각 수득하기 위하여 2M 암모늄 설페이트, 1 M 인산칼륨 및 1 M CaCl₂ 스탁 용액을 보충하였다. 단백질들을 100cm/hr 유속에서 PS 칼럼에 로딩하였으며, 칼럼 유동을 통해 수집하였다. 칼럼을 5mM 인산칼륨, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl₂ pH 7.0로 100 cm/hr에서 세척하였으며, 세척물을 수집한 유동에 추가하였다. 칼럼 세척물, 통과액의 조합을 0.22㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 통과액을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대하여 시료화하였다.

아미노페닐 보로네이트(aminophenyl boronate) 칼럼(ProMedics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고 pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)에 대하여 시료화하였다. 컬럼은 5 컬럼 부피의 5mM 인산칼륨, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화하였다. 정제된 단백질을 포함하는 PS 통과액을 아미노페닐 보로네이트 칼럼에 100cm/hr 유속에서 로딩시켰다. 컬럼을 5mM 인산칼륨, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0로 세척하였다. 칼럼을 20mM bicine, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 9.0로 세척하였다. 컬럼을 20 mM bicine, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0 으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9 로 용출하고 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 용출된 시료들을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대하여 시험하였다.

수산화인회석(HAP) 컬럼(Biorad)를 준비하였다. 세척물을 수집하고 pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)에 대하여 시험하였다. 컬럼은 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, pH 7.0로 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질에 최종 농도 5 mM 인산칼륨 및 0.1 mM CaCl₂ 를 보충하고 100 cm/hr 유속에서 HAP 칼럼에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂로 세척하였다. 컬럼을 10mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂로 후속 세척시켰다. 단백질을 70mM 인산칼륨, pH 7.0 로 용출시켰으며 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 용출된 시료들을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대하여 시험하였다.

HAP 정제된 단백질들을 그 후 바이러스 제거 필터를 통과하도록 하였다. 멸균된 Viosart filter (Sartorius) 를 첫번째로 2 L의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0로 세척하여 준비하였다. 사용하기 전에, 여과된 완충액을 pH 및 전도도에 대하여 시료화하였다. HAP 정제된 단백질들을 연동 펌프를 경유해 20nM 바이러스 제거 필터를 통해 펌프하였다. 70mM 인산칼륨, pH 7.0에서 여과된 단백질을 0.22㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 바이러스가 여과된 시료들을 단백질 농도, 효소 활성, 다당류, 단당류 및 살리실산 프로파일링에 대하여 시험하였다. 시료들은 또한 관련 순도 공정에 대하여 시험하였다.

여과액 내 단백질들을 그 후 10 kD 분자량 컷 오프(MWCO) Sartocon Slice TFF(tangential flow filtration) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10 mg/mL 로 농축시켰다. 여과물들을 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0을 가지고 세척하여 일차로 준비하였으며, 투과물은 pH 및 전도도에 대하여 시료화하였다. 농도에 따라, 농축된 단백질들을 시료화하고, 단백질 농도 및 효소 활성에 대하여 시험하였다. 6x 완충 교환을 농축된 단백질 상에서 수행하여 최종 완충액이 되도록 하였다: 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0. 완충액 교환에 따라, 농축된 단백질을 0.22 ㎛ 필터를 거쳐 20L 멸균된 저장 백으로 통과시켰다. 단백질을 시료화하고 단백질 농도, 효소 활성, 자유 설프히드릴기, 다당류 프로파일 및 삼투질 농도에 대하여 시험하였다.

멸균 여과된 벌크 단백질을 무균적으로 30mL 멸균 테플론 병(Nalgene)으로 20ml씩 분배하였다. 병들을 그 후 급속냉동시키고 -20±5℃에서 저장하였다.

실시예 23

rHuPH20에 대한 리실 리진의 안정화제로서의 영향

승온에서의 리실 리진(Lys-Lys 또는 다이리진)의 rHuPH20 안정화 능력에 대하여 시험하였다. 하기 표 76에 기술된 것과 같이 8개 제형들을 준비하였다. 대조군으로서, Hylenex™ (167U/mL rHuPH20, 12.5 mM Na₂PO₄, 145 mM NaCl, 1 mg/mL HSA, 2.7 mM CaCl₂, 0.1% EDTA pH 7.4로 구성됨; F1으로 표시)를 시험하였다. 나머지 제형들은 170 U/mL rHuPH20, 0.01% Tween 80 및 다양한 부형제/안정화제로 구성되도록 하기 표 76에 표시된 것과 같이 제조하였다. 각 시험된 제형들에 대하여, Lys-Lys 중염산염(H-Lys-Lys-OH HCl; RnD Chem #G-2675)을 50, 100 또는 150 mM 농도로 추가하였다. Lys-Lys 이 염화염(chloride salt)으로서 사용되기 때문에, 삼투질 농도는 하기 표 76에서 보이는 바와 같이 조성물 간 다양하였다.

모든 제형들은 2mL USP 1형 붕규산염 2mL 유리병에 13 mm 4432/50 회색 고무 마개 및 알루미늄 봉합을 하여 충진하였다. 바이알을 3개의 다른 온도 5℃, 25℃ 및 40℃에서 3개월 동안 배양시켰다. 시료들을 0, 1 주, 2 주, 1 개월 , 2개월 및 3개월에 온도에 따라 시험하였다 (표 77-79 참조). 각 시점에서, 시료들을 배양기로부터 제거하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 히알루로니다아제 활성도에 대하여 시험하였다.

결과를 하기 표 77-79에 나타내었고, 히알루로니다아제 활성은 U/mL로 표시하였다. 5℃ 또는 25℃ 에서 저장된 시료에서는, rHuPH20 활성이 적게 감소하는 것으로 관찰되었으나, 모든 시료들은 적어도 135U/mL 이상의 히알루로니다아제 활성을 유지하였다(표 77 및 78). 추가적으로, Lys-Lys를 포함하는 조성물과 Lys-Lys을 포함하지 않는 조성물 사이에서 뚜렷한 히알루로니다아제 활성의 차이가 관찰되지 않았다. 40℃에서 저장된 시료들은, 모든 시료에서 시간에 따라 효소 활성이 감소되었다. Lys-Lys을 포함하지 않는 제형 F1 및 F2들은 히알루로니다아제 활성이 가장 크게 감소하였다. 40℃에서 2주 후, 제형 F1 및 F2의 활성은 135U/mL 미만이 되었다. Lys-Lys을 포함하는 제형들은, 모든 농도에서, 40℃에서 적어도 1개월 동안 그들의 활성을 135U/mL 초과로 모두 유지하였다.

실시예 24

rHuPH20 안정성에 대한 낮은 농도의 리실 리진의 영향

승온에서 rHuPH30의 활성도에 미치는 낮은 농도의 리실 리진 및 pH 영향에 대하여 다양한 rHuPH20 제형들을 시험하였다. 세개의 다른 Lys-Lys 농도(10, 30 및 50 mM) 및 세개의 다른 pH (6.5, 7.0 및 7.5)에 대하여 평가하였으며, 총 9개의 시료를 제조하였다. 시험된 제형들을 하기 표 80에 나타내었다. 대조군으로써, Hylenex™(실시예 23 ; F1으로 표시)을 시험하였다. 제형 F2 내지 F10들은 모두 타깃 정도의 160U/mL rHuPH20, 10 mM L-메티오닌 (Spectrum #M1441), 그리고 0.01% 폴리소르베이트 80 (Baker #4117-04) 및 다양한 양의 H-Lys-Lys-OH HCl (RnD Chem #G-2675) 그리고 NaCl (Baker #3628)으로 제조하였다. 1N NaOH (EMD #SX0607H-6) 를 pH 조절을 위하여 사용하였다. NaCl 농도를 조절하여 모든 제형들이 거의 동일한 삼투질 농도(300 mOsm/Kg)를 갖도록 하였다. 모든 제형들은 0.2 마이크로 필터를 통하여 멸균여과하였다.

모든 제형들은 바이알 당 0.5mL 씩 USP I 형 규산염 2mL 유리병에 13 mm 4432/50 회색 고무 마개 및 알루미늄 봉합을 하여 충진하였다. 바이알들을 8주 까지 40℃에서 배양시켰다. 시료들을 0 및 1, 2, 3, 4, 및 8주에서 평가하였다. 각 평가 지점에서, 배양기로부터 시료들을 제거하고 히알루로니다아제 활성도를 실시예 2에 기술된 것과 같이 시험하였다.

결과를 하기 표 81에 나타내었으며, 히알루로니다아제 활성을 U/mL, 활성의 비율을 0 시점과 비교하여 표시하였다. Lys-Lys을 모두 구성으로 하는 제형 F2-F9들은 pH에도 불구하고 참조 제형 F1보다 증가된 rHuPH20 안정도를 보였다. 10, 30 또는 50 mM Lys-Lys을 포함하는 시료들 사이에서는 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았고, 이는 40℃에서 rHuPH20 안정도를 증가시키는데 10 mM Lys-Lys 의 추가가 충분한 것을 보인다. 높은 pH (7.5)를 갖는 제형은 낮은 pH(6.5 또는 7.0)을 갖는 모든 제형들과 비교하여 감소된 효소 활성을 가졌다. 예를 들어, pH 6.5 또는 7.0을 갖는 시료들에서, 히알루로니다아제 활성은 40℃에서 4주간 배양 후 초기 활성의 80% 초과를 유지하는 반면, pH 7.5 를 갖는 시료들은 초기 활성의 단지 약 70% 만이 남아있었다. 4주 이후, 참조 rHuPH20 시료(F1)에서는 50% 미만의 rHuPH20 활성도가 남아있었다.

실시예 25

rHuPH20 /인슐린 복합제형 내의 rHuPH20 활성 및 인슐린 안정성에 대한 리실 리신의 효과

리실 리신은 rHUPH20 및 인슐린 유사체 모두를 포함하는 복합제형을 안정화하기 위한 이의 능력에 대해 평가되었다. 제형은 하기 표 82에 제시된다. 모든 제형은 600 U/mL rHuPH20, 3.5 mg/mL 인슐린 글루리신, 30 mM 트리스 HCl, 5 mM 메티오닌, 0.001% 폴리소르베이트 20, pH 7.2, 및 보존제(EP-B 보존제 수준)로 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸을 포함하였다. F5, F1, F2 및 F3 제형은 50 mM 염화나트륨과 각각 0 mM, 20 mM, 40 mM 및 80 mM Lys-Lys를 함유하였다. 제형 F4는 염화나트륨(140mM)의 더 높은 농도를 함유하였고 Lys-Lys를 함유하지 않었다. 제형 F3 및 F4의 삼투질 농도는 대략적으로 같도록 염화나트륨으로 조절되었다.

각각의 제형은 1.0mL로 분주되었고 13 mm 4432/50 회색 고무 마개를 가진 2ml USP 유형 I 붕규산 유리병에 채워졌고 알루미나 씰로 밀봉되었다. 바이알은 5℃ 및 37℃에서 배양되었다. 시료는 3일 및 6일에 빼내어졌고 실시예 2 및 3에 기술된 것처럼 히알루로니다아제 효소 활성, pH, 삼투질 농도 및 외관에 대해 테스트되었다.

모든 제형은 인슐린 안정성을 가리키는 눈에 보이는 입자를 가지지 않는 맑고 무색이었기 때문에 리실 리신의 첨가는 외관에 영향을 미치지 않었다. 표준 곡선으로부터 외삽됨으로, 테스트된 제형의 히알루로니다아제 활성은 하기 표83에 나타내었다. 모든 제형은 5℃에서 6일동안 배양된 후 히알루로니다아제 활성이 유지되었다. 80mM Lys-Lys이 함유된 오직 제형 F3만 37℃에서 3일 후에 약간의 히알루로니다아제 효소 활성을 유지하였다. 37℃에서 6일 후에, F3은 이의 히알루로니다아제 효소 활성의 대부분을 잃었다. 삼투질 농도가 대충 비슷하도록 조절되었을 때, 제형 F3 및 F4에서, Lys-Lys는 증가된 히알루로니다아제 활성에 의해 증거된 것 같이 염화나트륨보다 더좋은 rHuPH20 안정화제였다.

실시예26

rHuPH20 /인슐린 복합제형 내의 rHuPH20 안정성에 대한 리실리신 및 염화나트륨의 비교

rHuPH20 및 인슐린의 복합제형은 rHuPH20 안정성에 대한 염화나트륨 및 리실 리신의 효과에 대해 테스트되었다. 테스트된 제형은 동일한 이온 강도를 가지도록 생성되었지만, 리실 리신 및 염화나트륨을 포함하는 하나의 제형과 오직 염화나트륨만을 포함하는 다른 제형은 그렇지 않다. 특히, 이온 강도의 다른 수준을 가지는 인슐린 글루리신 및 rHuPH20 제형의 세 세트가 준비되었다. 제형은 하기 표 84에 제시된다. 모든 제형은 600 U/mL rHuPH20, 3.5 mg/mL 인슐린 글루리신, 30 mM 트리스 HCl, 5 mM 메티오닌, 0.001% 폴리소르베이트 20, pH 7.2, 및 보존제(EP-B 보존제 수준)로 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸을 포함하였다. 제형 F1, F3 및 F5는 하기 표 84에 제시된 것과 같이 리실 리신 및 염화나트륨을 포함하였다. 제형 F2, F4 및 F6은 오직 염화나트륨만을 포함하였다. 제형은 이들의 실제 pH 및 삼투질 농도에 대해 측정되었다.

각각의 제형은 1.0mL로 분주되었고 13 mm 4432/50 회색 고무 마개를 가진 2ml USP 유형 I 붕규산 유리병에 채워졌고 알루미나 씰로 밀봉되었다. 바이알은 최대 4주간 5℃ 및 30℃에서 배양되었다. 시료는 6일에 및 2주 및 4주 후에 빼내어졌고 실시예 2에 기술된 것처럼 히알루로니다아제 효소 활성에 대해 테스트되었다.

결과는 T0(%to T0)에서 보여지는 활성에 대비되는 히알루로니다아제 활성 %에 더하여 테스트된 날에서 히알루로니다아제 효소 활성(U/ml)을 제시하는 것으로, 하기 표 85에 나타냈다. 배양 시간에 반응하는 rHuPH20 효소 활성, 리실 리신 농도, 및 이온 강도의 다중-변이 분석은 T0에 대한 상대적인 활성에 기초하여 수행되었고, JMP v. 8.02 (SAS Institutes)에 의해 분석되었다. 더 높은 이온 강도(F5 및 F6) 를 가지는 제형은 더 낮은 이온강도(F1 및 F2) (p<0.001)를 가지는 제형보다 더 높은 히알루로니다아제 효소 활성을 유지하였다. 게다가 리실 리신을 함유하는 제형은 이들이 없는 것보다 상당히 더 높은 활성을 가졌다 (P=0.04). 히알루로니다아제 효소 활성 손실의 속도는 더 높은 이온 강도가 분해 속도를 상당히 감소시킬 수 있음을 가리키는 이온 강도와 상반되게 연관되었다. 같은 이온 강도에서 용액에 대한 중요한 차이는 2주 후에 관찰되지 않았으나, 그러나 30℃에서 4주 후에, 중요한 차이가, 리실 리신을 함유하는 F5는 91% 활성을 유지하는 반면 리실 리신을 함유하지 않았던 F6은 단지 75% 잔여 활성을 가지는 것으로 히알루로니다아제 효소활성에서, 관찰되었다. 같은 경향은, 리실 리신이 없는 이들과 대비하여 증가된 활성을 가지는 리실 리신을 함유하는 제형과 함께, 더 낮은 이온 강도에서 제형에 대해 관찰되었다.

실시예 27

완충액으로 리실 리신의 효과 및 rHuPH20 /인슐린 복합제형의 pH 변화에 대한 온도의 효과

리실 리신은 리실 리신으로 트리스를 교체한 인슐린 및 rHuPH20을 함유하는 복합제형에서 완충액으로 작용하는 이의 능력에 대해 평가되었다. 테스트된 제형은 하기 표 86에 제시하였다. 모든 제형는 600 U/mL rHuPH20, 3.5 mg/mL 인슐린 글루리신, 5 mM 메티오닌, 0.001% 폴리소르베이트 20, pH 7.2, 및 보존제(EP-B 보존제 수준)로 0.1% 페놀 및 0.15% m-크레졸을 함유하도록 생성되었다. 각각의 제형은 30, 50, 80 또는 105 mM의 리실 리신(Biopeptide, G-2675, Lot#1037762)을 함유하였다. 제형은 트리스 HCl을 함유하지 않었다. 염화나트륨은 최종 삼투질 농도를 380±30 mOsm로 맞추기 위해 첨가되었다.

각각의 제형은 1.0mL로 분주되었고 13 mm 4432/50 회색 고무 마개를 가진 2ml USP 유형 I 붕규산 유리병에 채워졌고 알루미나 씰로 밀봉되었다. 바이알은 5℃ 및 37℃에서 배양되었다. 시료는 1일, 4일 및 6일에 빼내어졌고 실시예 2 및 3에 기술된 것처럼 히알루로니다아제 효소 활성, pH 및 삼투질 농도에 대해 테스트되었다. 각각의 제형은 또한 첨가된 적정제(1N NaOH; EMD, Cat No. SX0607H-6, Lot HC067239)의 양의 기능으로 pH의 적정 곡선을 생성하는 것에 의해 pH 6.5 내지 8.0의 목표 pH 범위에서 완충액으로 작용하는 리실 리신의 능력을 평가하기 위해 테스트되었다.

결과는 삼투질 농도와 히알루로니다아제 효소 활성을 제시하는 하기 표 87에 나타내졌다. 앞선 실시예서 본 바와 같이, 히알루로니다아제 활성은 Lys-Lys의 더 높은 농도로 덜 감소되었기 때문에 Lys-Lys는 제형에서 rHuPH20을 안정화하였다. 게다가, 리실 리신은 이온 강도의 유사한 수준에서 염화나트륨보다 더 rHuPH20을 안정화할 수 있었다.

하기 표 88은 pH에 대한 온도의 효과와 다양한 온도에서 pH를 제시한다. 수산화나트륨으로 리실 리신의 적정은 리실 리신이 6.5 내지 8.0의 pH 범위, 특히 높은 농도(예: 80 또는 105 mM)에서 완충액으로 제공될 수 있음을 보여주었다. 표 88에 나타낸 바와 같이, 온도의 영향 (dpH/dT), 또는 온도 변화에 대한 pH 변화의 비율은 트리스(-0.028U/℃)에 대해 보고된 것보다 약간 높은 -0.033U/℃에서 일정하게 유지되었다. 낮은 저장 온도 (예: 2-8℃)에서 인슐린이 더 높은 pH로부터 이익을 얻는 반면 높은 온도에서 rHuPH20이 낮은 pH로부터 이익을 얻기 때문에, 이상적인 완충액은 더 큰 온도 효과를 가졌다. 그러므로, 리실 리신은 인슐린 및 rHuPH20 모두를 포함하는 제형에서 안정화제 및 최적의 완충액 모두가 될 수 있음을 보여준다.

실시예 28

5℃, 30℃ 및 37℃에서 시간 지남에 따라 리실 리신을 함유하는 인슐린 복합제형에서 rHuPH20의 안정성

리실 리신은 보존제의 USP 수준을 포함하는 인슐린 유사체-rHuPH20 복합제형을 안정화시키기 위한 이의 능력에 대해 테스트되었다. 제형은 표 89에 제시되었다. 각각의 제형은 600U/ml rHuPH20, 3.5 mg/ml 인슐린 유사체(인슐린 글루리신 또는 인슐린 아스파르트), 5mM 메티오닌, 0.001% 계면활성제(폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 20), 및 보존제(0.125% 페놀 및 0.075% m-크레졸)의 USP 수준을 포함한다. 각각의 인슐린 유사체에 대하여, 두 제형은 pH 7.0을 가졌으며 두 제형은 pH 7.2를 가졌다. 게다가, 각각의 pH에서 한 제형은 오직 100mM 리실 리신을 함유한 반면 다른 제형은 30mM 염화나트륨 및 80mM 리실 리신을 함유하였다. 인슐린 아스파르트에 대한 비교로써, F9는 30mM 트리스/HCl을 함유하도록 준비되었다.

각각의 제형은 1.0mL로 분주되었고 13 mm 4432/50 회색 고무 마개를 가진 2ml USP 유형 I 붕규산 유리병에 채워졌고 알루미나 씰로 밀봉되었다. 바이알은 최대 4주 동안 5℃, 30℃ 및 37℃에서 배양되었다. 시료는 표 90 및 91에 지시된 바에 따라 빼내어졌고 실시예 2에 기술된 것처럼 rHuPH20 효소 활성에 대해 측정되었다. 결과는 U/ml로 히알루로니다아제 효소 활성을 제시하는 표 90 및 91에 나타내었다.

*F68 = 폴록사머 188 (Pluronic®F68); PS20 = 폴리소르베이트 20.

1. rHuPH20-인슐린 글루리신 복합제형

표 90에 나타낸 바와 같이, rHuPH20-인슐린 글루리신 제형에 대해, 히알루로니다아제 활성은 5℃ 및 30℃에서 모든 제형에 대해 일정하게 남아있었다. 37℃에서, 히알루로니다아제 활성의 감소는 모든 제형 중에서 시간이 지남에 따라 관찰되었다. 테스트된 시간동안, 어떠한 제형도 375U/ml아래로 히알루로니다아제 활성을 가지지 않았기 때문에, 제형은 안정한 것으로 결정되었다.

2. rHuPH20-인슐린 아스파르트 복합제형

표 91에 나타낸 바와 같이, rHuPH20-인슐린 아스파르트 제형에 대해, 모든 제형은 5℃에서 최대 3달까지 안정하였다. 30℃에서, 리실 리신을 함유하는 모든 제형은 최대 4주까지 안정하였는 반면, F9 제형(리실 리신을 함유하지 않음)은 히알루로니다아제 활성에서 손실을 보였다. 37℃에서, 모든 제형은 시간이 지남에 따라 제형에 의존적인 쇠퇴 속도에 따라 히알루로니다아제 활성이 감소되었다. 예를 들어, 37℃에서 6일 후에, 제형 F5(100 mM Lys-Lys 및 pH7.0을 가짐)는 제형 F8(80 mM Lys-Lys 및 pH 7.2)보다 높은 활성을 가졌다. 이 시간 지점과 온도에서, 리실 리신을 함유하지 않은 제형 F9는 거의 모든 히알루로니다아제 활성을 잃었다.

실시예 29

교반 및 열 스트레스 하에 rHuPH20의 안정성에 대한 사람 혈청 알부민( HSA ) 또는 리실 리신의 효과

rHuPH20 제형은 교반과 열 스트레스를 포함하는 가속 조건 하에 안정성에 대해 시험되었다. 제형은 하기 표 92에 제시되었다. 각각의 제형은 160 U/mL rHuPH20, 12.5 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0 및 145 mM 염화나트륨을 함유하였다. 각각의 제형은 하기 표 92에 제시된 바와 같이 추가적으로 하나 또는 그 이상의 사람 혈청 알부민(HSA), 염화칼슘, EDTA, 폴리소르베이트 80, 메티오닌 및 리실 리신을 포함하였다.

각각의 제형은 1.5 mL로 분주되었고 13 mm 4432/50 회색 고무 마개를 가진 2ml USP 유형 I 붕규산 유리병에 채워졌고 알루미나 씰로 밀봉되었다. 눈에 보이는 입자를 함유하는 바이알은 연구로부터 제외되었다. 제형은 교반과 열 스트레스 모두 하에 테스트되었다. 교반 연구에 대하여, 각각의 제형의 2 시료는 25℃에서 배양되었고 72시간 동안 650 rpm에서 교반되었다. 열 스트레스 연구에 대하여, 각각의 제형의 4 시료는 시료를 매주마다 꺼내면서 최대 4주간 40℃에서 배양되었다.

모든 제형은 실시예 2에 기재된 바와 같이 히알루로니다아제 활성에 대해 테스트되었다. 가용성 또는 불용성 입자의 존재는 MicroFlow Imaging(MFI)를 사용하여 테스트되었다. 이를 위해, 각각의 rHuPH20 제형 또는 대조군 시료는 Micro-Flow Imaging 기기 모델 4200(Brightwell Technologies, Inc., Ottawa, Canada)으로 측정되었다. 각각의 첫 수행 이전, 블랭크(blank) 완충액은 0.22 micron 필터를 통해서 필터되었고 깨끗한 배경(background)을 제공하기 위하여 시스템을 통해서 씻겨졌고 빛을 최적화하였다. 시스템을 평형화하기 위하여, 적어도 2ml의 시료는 분석 전에 분배되었다. 1 ml 시료는 연동 펌프를 사용하여 170uL/min의 유속에서 수행되었다. 배율 세팅은 100 um의 분석 깊이 필드로 1 내지 100um 범위 내에서 입자의 탐지를 허락하기 위한 5X 였다. 입자는 기계에 의해 자동적으로 계산되고 기록되었고 입자 수/ml로 보고되었다. rHuPH20을 함유하지만 교반의 대상이 아닌 완충액 및 또는 제형은 대조군으로 사용되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 또한 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 하기 표 93-95에 나타내었다.

1. 히알루로니다아제 활성

표 93은 U/mL로 히알루로니다아제 활성 및 시간 0 (T0)과 대비되는 활성 %를 제시한다. 결과는 40℃에서 8일 후에 HSA를 함유하지 않는 제형(F4, F5 및 F6)은 HSA를 함유하는 F1, F2 및 F3 제형과 대비하여 감소된 히알루로니다아제 활성을 가지는 것을 보여준다. Lys-Lys를 함유하는 제형 F7은 40℃에서 15일 후에 히알루로니다아제 활성의 가장 높은 수준을 유지하였다.

교반 스트레스 후에, 적어도 0.04% 폴리소르베이트 80 및 10 mM 메티오닌을 함유하는 제형은 Lys-Lys를 함유하였던 것과 같이 히알루로니다아제 활성을 유지하였다. 제형 F1-F4는 히알루로니다아제 활성에서 약간의 감소를 가졌다. 전체적으로, 제형 F7은 열 스트레스 테스트 및 교반 테스트 모두 하에서 rHuPH20 효소 활성에서 가장 큰 유지를 보였다.

2. 응집된 단백질 또는 불용성 응집체의 존재

표 94는 각각의 마이크론(micron) 크기 범위에 대해 입자 수/ml로 미립자의 수를 제시한다. 예를 들어, MFI를 사용하여 테스트된 마이크론 크기 범위는 5 마이크로미터(um)보다 크지만 10 um보다 작은 입자이다 (5≤p<10), 10≤p<25, 25≤p<50 및 p≥50. F1 및 F4에 대한 대조군 제형은 rHuPH20을 함유하지 않도록 생성되었고, F2, F4 및 F6 시료에 대한 대조군 제형은 교반되지 않는 동일 제형이었다.

HSA의 존재 또는 부존재는 각각 대략적으로 동등한 입자 수를 가져 비-교반된 대조군 시료에 영향을 미치지 않았다. 한번 교반되면, HSA를 함유하지만 폴리소르베이트 80이 결여된 제형(F1 및 F2)은, 폴리소르베이트 80의 첨가만이 F2와 다른 F3을 포함하는 다른 모든 제형과 대비하여 상당히 더 입자를 가졌다. 더 많은 폴리소르베이트 80의 첨가(F4와 대비하여 F5 및 F6)는 응집 제형을 감소하는 상당한 효과를 가지지 않었다. Lys-Lys를 함유하는 제형 F7은 교반 후에 불용성 응집체의 가장 작은 수를 가졌다.

p- 입자 크기 (마이크론)

3. 크기 배제 크로마토그래피

가용성 응집체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 또한 측정되었다. 표 95는 전체 피크 영역의 퍼센트 및 mAu*min으로 가용성 응집체를 제시한다. F4 내지 F7 제형은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되는 매우 작은 단백질을 함유하였다. HSA를 함유하는 제형 F1-F3은 25℃에서 교반 후에 고분자량 응집체의 낮은 수준을 보였다. 폴리소르베이트 80의 첨가는 응집체의 전체 수를 감소시켰다(F1 또는 F2와 대비하여 F3).

HMW= 고분자량

변형은 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 이 발명은 오직 첨부된 청구 범위에 의해서만 한정되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. Yang, Tzung-Horng LaBarre, Michael James Vaughn, Daniel Edward Caster, Christopher L. Nicol, Francois Kim, Donghyun <120> STABLE FORMULATIONS OF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME <130> 33320-3085PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> US 61/520,962 <151> 2011-06-17 <160> 273 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp 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(strain RCC307) <220> <223> hyaluronan lyase <400> 97 Met Gly Ala Pro Ala Ile Pro Lys Val Pro Arg Ser Pro Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu His Thr Thr Arg Pro Asn Ser Gly Glu Ser Glu Val Val Arg Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Leu Phe Glu Gln Thr Leu Val Asn Val Arg Gly Gln Leu 35 40 45 Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Glu Ser Ser Val His Asp Ser Glu Leu 50 55 60 Asn Tyr Gly Glu Ile Phe Leu Arg Asp Asn Val Pro Val Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Gly Arg Phe Glu Ile Val Arg His Phe Leu Asp Leu 85 90 95 Cys Leu Glu Leu Gln Ser Arg Ser Tyr Arg Thr Arg Gly Val Phe Pro 100 105 110 Thr Ser Phe Val Glu Glu Asp Asp Lys Ile Leu Ala Asp Tyr Gly Gln 115 120 125 Arg Ser Ile Gly Arg Ile Thr Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro 130 135 140 Val Leu Cys Trp Met Tyr Val Arg Ala Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Pro Lys Val Gln Arg Ala Val Gln Leu Leu Leu Asp Leu Val 165 170 175 Leu Gln Pro Ser Phe Tyr Glu Pro Pro Val Leu Phe Val Pro Asp Cys 180 185 190 Ala Phe Met Ile Asp Arg Pro Met Asp Val Trp 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vadensis ATCC BAA-548 <220> <223> chondroitin AC lyase <400> 100 Met His Arg Lys Ile Val Phe Pro Leu Phe Val Leu Leu Phe Thr Ala 1 5 10 15 Phe Ala Ala Phe Ala Ala Ser Gln Pro Gln Trp Lys Trp Arg Gln Ser 20 25 30 Lys Tyr Cys Arg Ile Thr Glu His Ala Gly Lys Lys Leu Leu Thr Val 35 40 45 Ala Ile Pro Ala Asp Ala Pro Glu Ile Ser Arg Arg Asn Thr Ala Asp 50 55 60 Thr Pro Val Gly Leu Thr Cys Phe Glu Gly Gln Pro Ile Glu Phe Ser 65 70 75 80 Ile Arg Leu Arg Asn Ser Gly Ile Ser Arg Pro Asp Asn Leu His Asn 85 90 95 Gly Ile Lys Phe Gln Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Asn Gly Thr Glu Arg 100 105 110 Trp Thr Gln Ala Glu Ile Pro His Glu Pro Phe Pro Trp Arg Arg Phe 115 120 125 Arg Phe Ser Glu Arg Ile Pro Ala Asp Ala Thr Ser Gly Thr Leu Arg 130 135 140 Leu Gly Leu Gln Gly Ser Ser Gly Asn Val Glu Phe Asp Leu Asp Ser 145 150 155 160 Leu Gln Ile Arg Pro Leu Asp Pro Glu Leu Ser Pro Val Pro Pro Thr 165 170 175 Pro Glu Gln Ile Arg Glu Cys Glu Leu Ile Glu Ser Arg Leu Arg Ala 180 185 190 Gly Leu Pro Ala Gln Gln Pro Pro 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Lys Val Pro Leu Pro Ala Gly 820 825 830 Glu Phe Ala Gly Gln Ser Val Lys Ile Val Leu Lys 835 840 <210> 101 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Preproinsulin <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <223> Signal sequence <220> <221> CHAIN <222> (25)...(54) <223> Insulin B Chain <220> <221> PROPEP <222> (57)...(87) <223> Insulin C peptide <220> <221> CHAIN <222> (90)...(110) <223> Insulin A chain <400> 101 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 102 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proinsulin <220> <221> CHAIN <222> (66)...(86) <223> Insulin B Chain <220> <221> PROPEP <222> (33)...(63) <223> Insulin C peptide <220> <221> CHAIN <222> (1)...(30) <223> Insulin A chain <400> 102 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 103 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain <400> 103 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 104 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain <400> 104 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 105 <211> 110 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <220> <223> Preproinsulin <220> <221> CHAIN <222> (66)...(86) <223> Insulin B Chain <220> <221> CHAIN <222> (1)...(30) <223> Insulin A chain <400> 105 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 106 <211> 110 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <220> <223> Preproinsulin <400> 106 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 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Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Pro Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 109 <211> 110 <212> PRT <213> Cercopithecus aethiops <220> <223> Preproinsulin <400> 109 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Val Pro Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 110 <211> 110 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <223> Preproinsulin <400> 110 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Pro Thr Arg Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Asp Leu Gln Val Arg 50 55 60 Asp Val Glu Leu Ala Gly Ala Pro Gly Glu Gly Gly Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ala Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 111 <211> 110 <212> PRT <213> Spermophilus tridecemlineatus <220> <223> Preproinsulin <400> 111 Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Asp Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Glu Gln Gln Gly Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Leu Pro Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Met Ala Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 112 <211> 110 <212> PRT <213> Volemys kikuchii <220> <223> Preproinsulin <400> 112 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Gln Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> Aotus trivirgatus <220> <223> Preproinsulin <400> 113 Met Ala Leu Trp Met His Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Glu Pro Ala Pro Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Ala Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Ser Ile Thr Gly Ser Leu Pro Pro Leu 65 70 75 80 Glu Gly Pro Met Gln Lys Arg Gly Val Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gln Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 114 <211> 110 <212> PRT <213> Apodemus semotus <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 114 Met Ala Leu Cys Val Arg Phe Leu Ser Leu Leu Ile Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Asn Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Glu 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ala Pro Gly Thr Gly Asp Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg 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<400> 118 Met Ala Leu Trp Ile Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 119 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus losea <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 119 Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg 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123 Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Ala Glu Asn Pro Gln Ala Gly 50 55 60 Ala Val Glu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Gly Pro Pro Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 124 <211> 110 <212> PRT <213> Meriones unguiculatus <220> <223> Preproinsulin <400> 124 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Phe Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Thr Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Phe Arg Arg Gly Val Glu Asp Pro Gln Met Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Ala Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg 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Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Trp Glu Ser His Pro Thr Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Gln Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 129 <211> 108 <212> PRT <213> Mus caroli <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 129 Met Ala Leu Leu Val Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Thr Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Ser Pro Lys Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Glu 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Asp Leu Gln Thr Leu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Val Ala Arg Glu Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 130 <211> 110 <212> PRT <213> Mus caroli <220> <223> Preproinsulin 2 <400> 130 Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Val Ala Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Trp Glu Ser His Pro Thr Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Met Ser Arg Arg Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Ala 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Gln Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 131 <211> 110 <212> PRT <213> Psammomys obesus <220> <223> Preproinsulin <400> 131 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Phe Leu Ile Leu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Phe Arg Arg Gly Val Asp Asp Pro Gln Met Pro 50 55 60 Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ala Gly Asp Leu Arg Ala Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Gly Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 132 <211> 110 <212> PRT <213> Felis silvestris catus <220> <223> Preproinsulin <400> 132 Met Ala Pro Trp Thr Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Ile Pro Ala Pro Thr Arg Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Gly Lys 50 55 60 Asp Ala Glu Leu Gly Glu Ala Pro Gly Ala Gly Gly Leu Gln Pro Ser 65 70 75 80 Ala Leu Glu Ala Pro Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu His Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 133 <211> 105 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <223> Preproinsulin <400> 133 Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Arg Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Pro Pro Pro Pro Ala Arg Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Gly Pro Gln Val Gly 50 55 60 Ala Leu Glu Leu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Pro 65 70 75 80 Pro Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser 85 90 95 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 134 <211> 105 <212> PRT <213> Ovis aries <220> <223> Preproinsulin <400> 134 Met Ala Leu Trp Thr Arg Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Pro Ala His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Arg Arg Glu Val Glu Gly Pro Gln Val Gly 50 55 60 Ala Leu Glu Leu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Pro 65 70 75 80 Pro Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Gly Val Cys Ser 85 90 95 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 135 <211> 110 <212> PRT <213> Cavia porcellus <220> <223> Preproinsulin <400> 135 Met Ala Leu Trp Met His Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asn Thr Gly Gln Ala Phe Val Ser Arg His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser Asn Leu Val Glu Thr Leu Tyr Ser Val Cys Gln Asp Asp Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Ile Pro Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Asp Pro Gln Val Glu 50 55 60 Gln Thr Glu Leu Gly Met Gly Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Met Ala Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Gly Thr Cys Thr Arg His Gln Leu Gln Ser Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 136 <211> 86 <212> PRT <213> Equus caballus <220> <223> Proinsulin <220> <221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 64 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 65 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 136 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Xaa Xaa 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Glu Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Leu Gly Gly Leu Gln Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Gln Gln Xaa 50 55 60 Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Gly Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 137 <211> 109 <212> PRT <213> Octodon degus <220> <223> Preproinsulin <400> 137 Met Ala Pro Trp Met His Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asn Ser Val Gln Ala Tyr Ser Ser Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser Asn Leu Val Glu Ala Leu Tyr Met Thr Cys Gly Arg Ser Gly Phe 35 40 45 Tyr Arg Pro His Asp Arg Arg Glu Leu Glu Asp Leu Gln Val Glu Gln 50 55 60 Ala Glu Leu Gly Leu Glu Ala Gly Gly Leu Gln Pro Ser Ala Leu Glu 65 70 75 80 Met Ile Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys Asn Asn Ile 85 90 95 Cys Thr Phe Asn Gln Leu Gln Asn Tyr Cys Asn Val Pro 100 105 <210> 138 <211> 86 <212> PRT <213> Chinchilla brevicaudata <220> <223> Proinsulin <220> <221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 64 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 65 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 138 Phe Val Asn Lys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Asp Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Met Ala Xaa Xaa 20 25 30 Glu Leu Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Ala Asp Pro Gly Val Val Pro 35 40 45 Glu Ala Gly Arg Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Met Thr Leu Gln Xaa 50 55 60 Xaa Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Thr Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <223> Preproinsulin <400> 139 Met Ala Leu Trp Ile Arg Ser Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe 1 5 10 15 Ser Gly Pro Gly Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Ser Pro Lys Ala Arg Arg Asp Val Glu Gln Pro Leu Val Ser 50 55 60 Ser Pro Leu Arg Gly Glu Ala Gly Val Leu Pro Phe Gln Gln Glu Glu 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Val Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Asn Thr 85 90 95 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 140 <211> 103 <212> PRT <213> Selasphorus rufus <220> <223> Proinsulin <400> 140 Ile Gln Ser Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ser Gly Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser His Ala Ala Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 20 25 30 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ser Pro 35 40 45 Lys Ala Arg Arg Asp Ala Glu His Pro Leu Val Asn Gly Pro Leu His 50 55 60 Gly Glu Val Gly Asp Leu Pro Phe Gln Gln Glu Glu Phe Glu Lys Val 65 70 75 80 Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Asn Thr Cys Ser Leu Tyr 85 90 95 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 <210> 141 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus laevis <220> <223> Preproinsulin 1 <400> 141 Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Phe Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Val Lys Arg Asp Met Glu Gln Ala Leu Val Ser Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Leu Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105 <210> 142 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus laevis <220> <223> Preproinsulin 2 <400> 142 Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Ile Lys Arg Asp Ile Glu Gln Ala Gln Val Asn Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Phe Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 143 <211> 106 <212> PRT <213> Xenopus tropicalis <220> <223> Preproinsulin <400> 143 Met Ala Leu Trp Met Gln Cys Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Thr Glu Ala Leu Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Tyr Pro Lys Ile Lys Arg Asp Ile Glu Gln Ala Met Val Asn Gly 50 55 60 Pro Gln Asp Asn Glu Leu Asp Gly Met Gln Leu Gln Pro Gln Glu Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Met Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Gln Leu Glu Ser Tyr Cys Asn 100 105 <210> 144 <211> 106 <212> PRT <213> Rana pipiens <220> <223> Preproinsulin <400> 144 Met Ala Leu Trp Ile Gln Cys Leu His Ile Ala Val Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Phe Thr Pro Thr Leu Lys Thr Phe Asp Asn Gln Tyr Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Met Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Ser Pro Arg Ser Arg Arg Asp Leu Glu Gln Pro Leu Val Asn Gly 50 55 60 Leu Gln Gly Ser Glu Leu Asp Glu Met Gln Val Gln Ser Gln Ala Phe 65 70 75 80 Gln Lys Arg Lys Pro Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Asn Thr Cys 85 90 95 Ser Leu Tyr Asp Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 145 <211> 81 <212> PRT <213> Anas platyrhynchos <220> <223> Preproinsulin <220> <221> UNSURE <222> 31 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 32 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 59 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <220> <221> UNSURE <222> 60 <223> Xaa=Basic residue assumed by homology <400> 145 Ala Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ser Pro Lys Thr Xaa Xaa 20 25 30 Asp Val Glu Gln Pro Leu Val Asn Gly Pro Leu His Gly Glu Val Gly 35 40 45 Glu Leu Pro Phe Gln His Glu Glu Tyr Gln Xaa Xaa Gly Ile Val Glu 50 55 60 Gln Cys Cys Glu Asn Pro Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 65 70 75 80 Asn <210> 146 <211> 51 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <223> Preproinsulin <400> 146 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Gly Ile 20 25 30 Val Glu Gln Cys Cys Ala Gly Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Asn 50 <210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Aspart insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 147 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 148 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Lispro insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 148 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glulisine insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 149 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30 <210> 150 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glargine insulin <220> <223> Insulin A chain analog <400> 150 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 151 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glargine insulin <220> <223> Insulin B chain analog <400> 151 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 <210> 152 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Detemir insulin <220> <223> Proinsulin analog <220> <221> CHAIN <222> (33)...(53) <223> A Chain <220> <221> CHAIN <222> (1)...(29) <223> B chain <400> 152 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys 20 25 30 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 35 40 45 Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=Pro, Lys, Leu, Val or Ala <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=Lys or Pro <400> 153 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 <210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog (des 28-30) <400> 154 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 20 25 <210> 155 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog (des 27) <400> 155 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Lys Thr 20 25 <210> 156 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Thr or Ser <400> 156 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 157 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe, Asp or none <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Val or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Asn or Asp <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Ser or Asp <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=His or Asp <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=L-Pro, D-Pro, D-hydroxypro, L-hydroxypro, L-(N-methyllysine), D-Lysine, L-(N-methyl arginine) or D-arginine <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Xaa=Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg or none <400> 157 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 158 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=His, Phe, Gly, Gln, Glu, Ser, Asn, Asp, or Pro <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gln, Asn, Ala or Pro <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Leu, Pro, Val, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gln or Asn <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa=Pro, Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Gly, Gln or Asn <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asp or Glu <400> 158 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 159 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe, Glu, Asp, Thr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Val, Arg, His, Ala, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gln, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=His, Ala, Glu, Aps, Thr, Ser, Gln, or Asn <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa=Ser, Leu, Asp, Pro, Glu, Ile, Val, His, Thr, Gln, Asn, Met, Tyr, Trp or Phe <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=His, Asn, Leu, Asp, Arg, Glu, Ser, Thr, Ile or Gln <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa=Val, Asn, His, Ile or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa=Ala, Glu, Asp, Asn, Gln, Ser, Thr, Gly <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa=Tyr, Asp, Glu, Gln, Asn, Ser, Thr, His or Arg <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa=Leu, Ser, Thr, Asn, Gln, Glu, Asp or His <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa=Val, Ser, Thr, Asn, Gln or His <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa=Gly, Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, His or Arg <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa=Tyr, Ala, Asp, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa=Thr, Asp, His or Glu <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa=Pro, Asp or Glu <400> 159 Xaa Xaa Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Xaa Glu Xaa Leu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Cys Xaa Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30 <210> 160 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp or Glu <400> 160 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa=Ly, Ala, Thr or Ser <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Thr, Arg, Lys, Hyl, Orn or Cit <400> 161 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa 20 25 30 <210> 162 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <400> 162 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 163 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa=Asn, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp, Glu, His or Gln <400> 163 Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 20 25 30 <210> 164 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin A chain analog <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa=Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa=Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Xaa=Asn, Asp, Gly, Ser, Thr or Ala <400> 164 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Xaa Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 165 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin B chain analog <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Phe or none <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Thr or none <400> 165 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 20 25 30 <210> 166 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 166 Arg Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 167 Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 168 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 168 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 169 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)...(5) <223> Repeating linker peptide <400> 169 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 170 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 171 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 172 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 173 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 174 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 175 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 176 Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 <210> 177 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 177 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 178 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 178 Ala Ala Lys 1 <210> 179 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 179 Val Met 1 <210> 180 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <400> 180 Ala Met 1 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide Sequence <220> <221> REPEAT <222> (3)...(5) <223> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 repeats <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=Gly, Gly-Gly or Gly-Gly-Gly <400> 181 Ala Met Gly Xaa Ser Ala Met 1 5 210> 182 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 153 B-chain <400> 182 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr 20 25 30 <210> 183 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 1423 A-chain <400> 183 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 184 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HMR-1 1423 B-chain <400> 184 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His 20 25 30 <210> 185 <211> 510 <212> PRT <213> Pan troglodytes <220> <223> Chimpanzee PH20 <400> 185 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Val Thr Gly Gln Asp Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Ser Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Asp 485 490 495 Leu Cys Asp Leu Tyr Leu Val Pro Thr Ser Tyr Leu Ile Leu 500 505 510 <210> 186 <211> 512 <212> PRT <213> Macaca mulatta <220> <223> Rhesus Monkey PH20 <400> 186 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asn Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ile Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Val Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ser Lys 115 120 125 Gln Asp Ile Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Pro Gln Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr Ile Lys Leu Gly Arg 195 200 205 Ser Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Val Val 260 265 270 Val Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala 290 295 300 Arg Leu Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu 305 310 315 320 Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Ser Leu Ser Ile Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Thr Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Asp Ile Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val His Gly Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro 465 470 475 480 Ile Phe Tyr Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe Ile 485 490 495 Trp Arg Leu Glu Val Trp Asp Gln Gly Ile Ser Arg Ile Gly Phe Phe 500 505 510 <210> 187 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuPH20 precursor 1-505 <400> 187 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met 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25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp 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Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr 450 <210> 273 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature HuPH20 36-486 <400> 273 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro 450

Claims (38)

1. 히알루로니다아제; 및 리실 리신(Lys-Lys)을 포함하는 조성물로서, 37 ℃ 내지 42 ℃의 임의의 온도에서 배양되는 경우, 상기 조성물 내 히알루로니다아제는 Lys-Lys를 함유하지 않는 것을 제외하고 동일한 조성물에 비해 적어도 10% 초과의 히알루로니다아제 활성을 나타내는, 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 리실 리신(Lys-Lys) 농도는 5 mM 내지 120 mM인 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 리실 리신(Lys-Lys) 농도는 5 mM 내지 300 mM인 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 리실 리신(Lys-Lys) 농도는 50 mM 내지 150 mM인 것인, 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 히알루로니다아제의 농도는 적어도 30 U/mL인 것인, 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 히알루로니다아제의 농도는 10 U/mL 내지 20,000 U/mL인 것인, 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   계면활성제를 더 포함하며, 여기에서 제형 내 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 상기 계면활성제의 양은 0.0005% 내지 1.0%인 것인, 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 계면활성제는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 솔비톨, 폴록사머 및 폴리소르베이트 중에서 선택되는 것인, 조성물.
9. 제7항에 있어서,
   상기 계면활성제는 폴록사머 188, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 중에서 선택되는 것인, 조성물.
10. 제1항에 있어서,
    6.5 내지 8.0의 pH 범위로 완충되며, 여기에서 완충제는 트리스, 히스티딘, 포스페이트 및 시트레이트 중에서 선택되는 것인, 조성물.
11. 제1항에 있어서,
    상기 히알루로니다아제는 중성 pH에서 활성인 가용성 히알루로니다아제인, 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    상기 가용성 히알루로니다아제는 양 PH20, 소 PH20 및 가용성 인간 PH20 중에서 선택되는 가용성 PH20 폴리펩티드이고, 여기에서 상기 가용성 인간 PH20은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 부착 서열의 전부 또는 일부가 결여된 것인, 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 PH20 폴리펩티드는 서열번호 4-9, 47-48, 234-254, 및 267-273의 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 가지는 것인, 조성물.
14. 제12항에 있어서,
    상기 히알루로니다아제는 서열번호 4-9의 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 가용성이며 중성 pH에서 활성인 C-터미널 절단된 PH20인 것인, 조성물.
15. 제6항에 있어서
    상기 히알루로니다아제의 농도는 10 U/mL 내지 5,000 U/mL인 것인, 조성물.
16. 제1항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 6.5 내지 7.2이고; 및
    상기 조성물은
    100 U/mL 내지 500 U/mL의 양으로 히알루로니다아제;
    5 mM 내지 30 mM의 농도로 리실 리신(Lys-Lys);
    140 mM 미만의 농도로 NaCl;
    0.01% 내지 0.05%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로, 폴리소르베이트 80인 계면활성제;
    5 mM 내지 20 mM인 농도로 메티오닌; 및
    5 mM 내지 50 mM인 농도로 소디움 포스페이트;
    를 포함하는 것인, 조성물.
17. 제1항에 있어서,
    속효성 인슐린을 더 포함하는 것인, 조성물.
18. 제17항에 있어서,
    리실 리신(Lys-Lys)의 농도는 30 mM 내지 120 mM인 것인, 조성물.
19. 제17항에 있어서,
    상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린, 또는 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로 및 인슐린 글루리신 중에서 선택되는 속효성 인슐린 유사체인 것인, 조성물.
20. 제19항에 있어서,
    상기 속효성 인슐린은 레귤러 인슐린이고, 상기 레귤러 인슐린은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린인 것인, 조성물.
21. 제19항에 있어서,
    상기 속효성 인슐린은 인슐린 유사체인 것인, 조성물.
22. 제21항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 서열번호 103으로 제시된 아미노산의 서열을 가지는 A 사슬 및 서열번호 147-149의 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 가지는 B 사슬을 가지는 인슐린에서 선택되는 것인, 조성물.
23. 제17항에 있어서,
    상기 속효성 인슐린의 양은 10 U/mL 내지 1000 U/mL인 것인, 조성물.
24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 다중 투여를 위한 것이고, 항균적 유효량의 보존제 또는 보존제의 혼합물을 포함하는 것인, 조성물.
25. 제1항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 6.8 내지 7.4이고, 및
    상기 조성물은
    100 U/mL 내지 1000 U/mL의 양으로 PH20인 히알루로니다아제;
    10 U/mL 내지 1000 U/mL의 양으로 인슐린 글루리신인 속효성 인슐린 유사체;
    50 mM 내지 105 mM의 농도로 리실 리신(Lys-Lys);
    100 mM 미만의 농도로 NaCl;
    0.0005% 내지 0.005%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 폴리소르베이트20인 계면활성제;
    5 mM 내지 20 mM의 농도로 메티오닌; 및
    0.1% 내지 0.25%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 페놀 및 0.05% 내지 0.2%의 질량 농도(w/v)의 퍼센트(%)로 m-크레졸을 포함하는 보존제;
    를 포함하는 것인, 조성물.
26. 제1항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 6.8 내지 7.4이고, 및
    상기 조성물은
    100 U/mL 내지 1000 U/mL의 양으로 PH20인 히알루로니다아제;
    10 U/mL 내지 1000 U/mL의 양으로 인슐린 아스파르트 또는 인슐린 리스프로인 속효성 인슐린 유사체;
    80 mM 내지 100 mM의 농도로 리실 리신(Lys-Lys);
    30 mM 미만의 농도로 NaCl;
    0.0005% 내지 0.005%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 폴리소르베이트20인 계면활성제;
    5 mM 내지 20 mM의 농도로 메티오닌; 및
    0.1% 내지 0.25%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 페놀 및 0.05% 내지 0.2%의 질량 농도(w/v) 퍼센트(%)로 m-크레졸을 포함하는 보존제;
    를 포함하는 것인, 조성물.
27. 제1항 내지 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 주사기 또는 바이알.
28. 제1항 내지 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 폐쇄 루프 시스템.
29. 제1항 내지 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 인슐린 펌프.
30. 제1항 내지 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 인슐린 펜.
31. 당뇨병을 치료하거나 대상체에서 혈당치를 조절하기 위한, 제1항 내지 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
32. 제31항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
33. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    인슐린을 더 포함하는 것인, 조성물.
34. 제33항에 있어서,
    상기 인슐린은 레귤러 인슐린, 또는 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로 및 인슐린 글루리신 중에서 선택되는 속효성 인슐린 유사체인 것인, 조성물.
35. 제34항에 있어서,
    상기 인슐린은 레귤러 인슐린이고, 상기 레귤러 인슐린은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린인 것인, 조성물.
36. 제34항에 있어서,
    상기 인슐린은 속효성 인슐린 유사체인 것인, 조성물.
37. 당뇨병을 치료하거나 대상체에서 혈당치를 조절하기 위한, 제33항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
38. 당뇨병을 치료하거나 대상체에서 혈당치를 조절하기 위한, 제34항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.