CN105797140B - 乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供组合物，其包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶；和赖氨酰基赖氨酸(Lys‑Lys)，其量足以使得所述乙酰透明质酸降解酶比除了组合物不包含所述Lys‑Lys之外相同的组合物更稳定。

Description

乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂

本申请是2012年6月15日提交的、发明名称为“乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂”的中国专利申请201280039713.8的分案申请。

相关申请

本申请要求2011年6月17日提交的标题为“STABLE CO-COFORMULATIONS OF AHYALURONAN-DEGRADING ENZYME AND AN INSULIN”的系列号为61/520,962的美国临时申请的优先权。

本申请涉及与本文同日提交的标题为“STABLE FORMULATIONS OF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME”的系列号为13/507,263的美国申请，后者要求系列号为61/520,962的美国临时申请的优先权。本申请也涉及与本文同日提交的标题为“STABLE FORMULATIONSOF A HYALURONAN-DEGRADING ENZYME”的系列号为13/507,262的美国申请，后者要求系列号为61/520,962的美国临时申请的优先权。上面指出的相关申请的主题以其整体援引加入。

本申请也涉及2011年6月17日提交的第61/520,940号美国临时申请、2011年10月27日提交的第61/628,389号美国临时申请和2012年6月08日提交的第61/657,606号美国临时申请，各自的标题为“Continuous Subcutaneous Insulin Infusion Methods with aHyaluronan-Degrading Enzyme”。本申请也涉及与本文同日提交的标题为“ContinuousSubcutaneous Insulin Infusion Methods with a Hyaluronan-Degrading Enzyme”的系列号为13/507,261的美国申请，后者要求系列号为61/520,940、61/628,389和61/657,606的美国临时申请的优先权。本申请也涉及与本文同日提交的标题为“ContinuousSubcutaneous Insulin Infusion Methods with a Hyaluronan-Degrading Enzyme”的第PCT/US2012/042818号国际PCT申请，后者要求系列号为61/520,940、61/628,389和61/657,606的美国临时申请的优先权。

本申请也涉及2009年4月28日提交的标题为“Super Fast-Acting InsulinCompositions”的以美国公开号US20090304665公开的系列号为12/387,225的美国申请(发明人为Gregory Frost、Igor Blinsky、Daniel Vaughn和Barry Sugarman)，后者要求2008年4月28日提交的第61/125,835号美国临时申请的优先权。

上面提及的申请的主题以其整体援引加入。

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技术领域

本发明提供组合物，其是乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂，或者是速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(包括重组人PH20(rHuPH20))的稳定复合制剂。

背景技术

糖尿病由于胰腺不能产生足量的胰岛素或由于细胞不能适当地合成和释放胰岛素而导致慢性高血糖症。危重患者也会经历高血糖症，导致死亡率和发病率增加。已将胰岛素作为治疗剂给药以治疗患有糖尿病(包括例如I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病)的患者，以模拟发生在正常个体中的内源性胰岛素应答。还已将胰岛素向患有高血糖症的危重患者给药以控制血糖水平。

通常，响应于高血糖症或对高血糖症的预期(例如进食后)，向这些个体给药可导致血糖控制的速效胰岛素。然而，胰岛素的现有速效形式的吸收和起效存在延迟，因此不近似于快速的内源性胰岛素的作用。因此，这些制剂起效不够快速以致不能阻止胰岛素释放的该第一阶段以后立即发生的肝葡萄糖产生。由于药理学作用的延迟，应在进食之前给药速效胰岛素制剂以达到所需的血糖控制。并且，必须给药的剂量导致作用时间延长，其可引起低血糖症，并且在许多情况下引起肥胖症。

乙酰透明质酸降解酶是单独和/或在没有治疗剂(如胰岛素)联合给药下表现出治疗活性的酶。例如，已经研发了包含乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素(例如快速起效胰岛素类似物)的超速效胰岛素组合物，其得到这样的组合物：当将其向个体给药时，与单独的速效胰岛素相比，其更接近地模拟非糖尿病个体的内源性(即天然)餐后胰岛素释放(参见例如第US20090304665号美国公开)。存在对于改善的乙酰透明质酸降解酶的制剂和复合制剂的需求。还存在对于用于治疗个体(例如以控制糖尿病个体的血糖水平)的改善的稳定胰岛素制剂的需求。

发明概述

本文提供稳定的复合制剂组合物，其包含治疗有效量的速效胰岛素和足以使所述组合物超速效的量的乙酰透明质酸降解酶。所提供的稳定复合制剂被配制用于多次药物注射(MDI)或被配制用于连续皮下胰岛素输注(CSII)，其各自对稳定性具有不同的要求。具体地，将用于CSII的复合制剂配制成在升高的温度和在搅拌下是稳定的，而将用于MDI的复合制剂配制成当在冷藏或环境温度储存时是稳定的。

本文提供稳定复合制剂组合物，其包含：治疗有效量的速效胰岛素、足以使所述组合物超速效的量的乙酰透明质酸降解酶、浓度为或约为50mM-200mM的NaCl，抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，和一种或多种稳定剂。所提供的复合制剂的pH为或约为6.8-7.8，并且被配制使得所述组合物在为或约为2℃-8℃的温度稳定持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度稳定持续至少14天。

在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶在为或约为2℃-8℃的温度保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天，和/或所述胰岛素在为或约为2℃-8℃的温度保留至少90％的所述组合物中初始胰岛素水平的效能或回收持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天，和/或所述胰岛素在为或约为2℃-8℃的温度保留至少90％的初始胰岛素纯度持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天，和/或所述胰岛素在为或约为2℃-8℃的温度保留小于2％的高分子量(HMWt)胰岛素种类持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天。例如，所述稳定复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶在为或约为2℃-8℃的温度保留至少55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的初始透明质酸酶活性持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天，并且在为或约为2℃-8℃的温度，胰岛素的纯度或效能至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多持续至少6个月和/或在为或约为20℃-30℃的温度持续至少14天。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂组合物的pH是或约是7.0-7.6。例如，所述稳定复合制剂的pH是或约是6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2、7.6±0.2、7.7±0.2或7.8±0.2。本文提供的稳定复合制剂组合物中的NaCl浓度是或约是80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM或120mM-140mM。例如，所述稳定复合制剂的NaCl浓度是或约是至少50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM。在这样的实例中，小于100mM的组合物中的NaCl的上限量是至多110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂包含足量的缓冲剂以维持pH范围为或约为6.8-7.8。

在一个实施方案中，本文提供的稳定复合制剂在为或约为2℃-8℃(包括端值)的温度稳定持续至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月或30个月。例如，所述复合制剂在为或约为2℃-8℃(包括端值)的温度稳定持续至少18个月或至少24个月。在另一实施方案中，本文提供的稳定复合制剂在为或约为20℃-30℃的温度(包括端值)稳定持续至少15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天或50天。例如，所述复合制剂在为或约为20℃-30℃(包括端值)的温度稳定持续至少1个月。

本文还提供稳定复合制剂组合物，其包含：治疗有效量的速效胰岛素、足以使所述组合物超速效的量的乙酰透明质酸降解酶、浓度为或约为120mM-200mM之间的NaCl、抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，和一种或多种稳定剂。所提供的复合制剂的pH为或约为6.5-7.5，并且所述组合物在为或约为32℃-40℃的温度稳定持续至少3天，或在搅拌下稳定持续至少3小时。

在一些实例中，所述稳定复合制剂还包含有效量的透明质酸酶抑制剂，例如但不限于，蛋白质、糖胺聚糖(GAG)、多糖、脂肪酸、羊毛甾烷、抗生素、抗线虫剂、合成的有机化合物和/或植物源性生物活性组分。植物源性生物活性组分的实例为生物碱、抗氧化剂、多酚、黄酮类化合物、萜类化合物和/或抗炎药。在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂中的透明质酸酶抑制剂不与乙酰透明质酸降解酶或胰岛素形成共价复合物。透明质酸酶抑制剂的实例是但不限于：血清透明质酸酶抑制剂、睡茄(Withania somnifera)糖蛋白(WSG)、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、壳聚糖、β-(1,4)-半乳糖-寡糖、硫酸化毛蕊草糖、硫酸化车前糖、果胶、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)、硫酸葡聚糖、海藻酸钠、得自裙带菜(Undaria pinnatifida)的多糖、扁桃酸缩聚物、二十碳三烯酸、神经酸、齐墩果酸、马兜铃酸、阿义马林、利血平、黄酮、去甲氧基矢车菊黄素(desmethoxycentauredine)、槲皮素、芹菜素、山柰酚、水飞蓟宾、四羟黄酮、四羟黄酮-7-葡萄糖苷、根皮素、芹菜苷、橙皮苷、磺酸化橙皮苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄酮-7-硫酸钠、黄酮7-氟-4’-羟基黄酮、4’-氯-4,6-二甲氧基查耳酮、5-羟基黄酮7-硫酸钠、杨梅黄酮、芦丁、桑色素、甘草皂苷、维生素C、D-异抗坏血酸、D-糖1,4-内酯、L-抗坏血酸-6-十六酸酯(Vcpal)、6-O-酰化维生素C、儿茶素、去甲二氢愈创木酸、姜黄素、N-没食子酸丙酯、鞣酸、鞣花酸、没食子酸、phlorofucofuroeckol A、二鹅掌菜酚、8,8’-二鹅掌菜酚、原花青素、棉酚、塞来昔布、尼美舒利、地塞米松、吲哚美辛、非诺洛芬、保泰松、羟布宗、水杨酸酯、色甘酸二钠、金硫丁二钠、transilist、曲呫诺、伊维菌素、林可霉素和大观霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶(trimerthoprim)、硫酸新霉素、3α-乙酰基多孔菌酸A、(25S)-(+)-12α-羟基-3α-甲基羧基乙酸酯-24-甲基羊毛甾-8,24(31)-二烯-26-酸、羊毛甾烷(lanostanoid)、多孔菌酸C、PS53(氢醌-磺酸-甲醛聚合物)、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)的聚合物、VERSA-TL 502、1-十四烷磺酸、扁桃酸缩聚物(SAMMA)、1,3-二乙酰基苯并咪唑-2-硫酮、N-单酰化的苯并咪唑-2硫酮、N,N’-二酰化的苯并咪唑-2-硫酮、烷基-2-苯基吲哚衍生物、3-丙酰基苯并噁唑-2-硫酮、N-烷基化的吲哚衍生物、N-酰化的吲哚衍生物、苯并噻唑衍生物、N-取代的吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物、N-取代的吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物的卤代类似物(氯和氟)、2-(4-羟基苯基)-3-苯基吲哚、吲哚甲酰胺、吲哚乙酰胺、3-苯甲酰基(benzolyl)-1-甲基-4-苯基-4-哌啶醇、苯甲酰基苯基苯甲酸酯衍生物、L-精氨酸衍生物、盐酸胍、L-NAME、HCN、亚麻苦苷、苦杏仁苷、常春藤皂甙元、七叶皂苷、顺式-异扁柏脂素和/或1,3-二-对羟基苯基-4-戊烯-1-酮。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂包含浓度为或约为1mg/mL-20mg/mL的透明质酸酶抑制剂，所述透明质酸酶抑制剂为乙酰透明质酸(HA)寡糖。在一些实例中，所述HA寡糖是二糖或四糖。在其它实例中，所述HA寡糖具有反应过的还原端。

配制本文提供的稳定复合制剂，使得所述复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶在为或约为32℃-40℃的温度保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时，和/或所述组合物中的胰岛素在为或约为32℃-40℃的温度保留至少90％的所述组合物中初始胰岛素水平的效能或回收持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时，和/或在为或约为32℃-40℃的温度保留至少90％的初始胰岛素纯度持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时，和/或在为或约为32℃-40℃的温度保留小于2％的高分子量(HMWt)胰岛素种类持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时。在一个实施例中，配制所述稳定复合制剂，使得所述组合物中的乙酰透明质酸降解酶在为或约为32℃-40℃的温度保留至少55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的初始透明质酸酶活性持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时。在另一实施例中，配制所述稳定复合制剂，使得在为或约为32℃-40℃的温度，胰岛素的纯度或效能是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂的pH是或约是6.3±0.2、6.4±0.2、6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2或7.5±0.2。在其它实施方案中，所述稳定复合制剂组合物的NaCl浓度是或约是150mM-200mM或160mM-180mM。例如，所述NaCl浓度是或约是120mM、130mM、140mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM。在一些实施方案中，所述稳定复合制剂在为或约为37℃稳定持续至少3天。在其它实施方案中，所述稳定复合制剂稳定持续至少4天、至少5天或至少6天。在一些实施方案中，所述稳定复合制剂包含足量的缓冲剂以维持pH范围为或约为6.5-7.5。

在本文提供的稳定复合制剂组合物中包含的乙酰透明质酸降解酶包括，例如，透明质酸酶，诸如动物(包括人)透明质酸酶，特别是其可溶形式和/或软骨素酶。乙酰透明质酸降解酶的实例是透明质酸酶和/或软骨素酶。在一些实施方案中，所述乙酰透明质酸降解酶是在中性pH具有活性的透明质酸酶。在其它实施方案中，所述乙酰透明质酸降解酶缺少糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当其从细胞表达时不是膜结合的。例如，所述乙酰透明质酸降解酶包含一个或多个氨基酸残基的C-端截短，以移除所有或部分GPI锚。在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶是透明质酸酶，所述透明质酸酶为PH20。PH20透明质酸酶的实例是非人或人PH20透明质酸酶。包括这样的PH20透明质酸酶：其具有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或其氨基酸序列与至少包含SEQ IDNO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。例如，所述PH20与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。包括这样的PH20多肽：其氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短。变体包括这样的PH20多肽：其表现出与特定氨基酸序列的至少85％的序列相同性并且保留透明质酸酶活性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短。在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂中的PH20与特定氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性并且保留透明质酸酶活性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短。在一些实施方案中，所述乙酰透明质酸降解酶是截短的PH20，后者是C-端截短的PH20多肽，其包括具有在SEQ ID NO:4-9中任一个所示的氨基酸序列的任意多肽或其等位基因变体和其它变体。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂中的PH20的量是或约是0.1μg/mL-100μg/mL、1μg/mL-50μg/mL或1μg/mL-20μg/mL。例如，PH20的量是或约是5μg/mL。在其它实施方案中，所述PH20的比活是或约是75单位(U)/μg-120U/μg，或者是至少或约是或是75单位(U)/μg、80U/μg、85U/μg、90U/μg、100U/μg、110U/μg或120U/μg。本文提供的稳定复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶的量是或约是10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL或100U/mL-1000U/mL。例如，所述乙酰透明质酸降解酶的量是至少或约是或是30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL或2000U/mL。在一稳定复合制剂的实例中，所述乙酰透明质酸降解酶的量是或约是600U/mL。

所述速效胰岛素可以是，例如，单体的或多聚体的，诸如二聚体的或六聚体的。在一个实施方案中，所述速效胰岛素是速效人胰岛素。在另一实施方案中，所述速效胰岛素是正规胰岛素，例如，人胰岛素或猪胰岛素。在一个实施例中，所述速效胰岛素是正规胰岛素，并且本文提供的稳定复合制剂的NaCl浓度是50mM-80mM。所述速效胰岛素包括正规胰岛素，例如，其为具有氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO:104所示的B链的胰岛素，或者具有氨基酸序列如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。所述胰岛素可以是重组胰岛素，或者可以是合成的或部分地合成的，或者可以从天然来源分离的。所述速效胰岛素可以是胰岛素类似物。所述胰岛素类似物的实例选自具有氨基酸序列如SEQID NO:103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO:147-149所示的B链的胰岛素。在本文提供的一些示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是具有在SEQ NO:103(A-链)和SEQ ID NO:147(B-链)中所示的氨基酸序列的门冬胰岛素，并且NaCl浓度是或约是80mM-160mM。在本文提供的其它示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是具有在SEQ NO:103(A-链)和SEQ IDNO:149(B-链)中所示的氨基酸序列的赖谷胰岛素，并且NaCl浓度是或约是80mM-200mM。在本文提供的另一种示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是具有在SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:148(B-链)中所示的氨基酸序列的赖脯胰岛素，并且NaCl浓度是或约是50mM-120mM。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂中的胰岛素的量是10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL或500U/mL-1000U/mL，包括端值。例如，速效胰岛素的量是至少或约是或是10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、500U/mL或1000U/mL。在一示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素的量是或约是100U/mL。在另一示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物，并且所述乙酰透明质酸降解酶是PH20。

本文提供的稳定复合制剂任选地包含缓冲剂，例如但不限于，非金属结合剂或金属结合剂。在一些实例中，所述缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐。在一示例性稳定复合制剂中，所述缓冲剂是Tris。所述缓冲剂的浓度是或约是1mM-100mM、10mM-50mM或20mM-40mM。例如，所述缓冲剂的浓度是或约是或至少是1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更高。在一示例性稳定复合制剂中，所述缓冲剂的浓度是或约是30mM。

本文提供的稳定复合制剂组合物包括抗微生物有效量的防腐剂，其杀死或抑制所述组合物的样品中的微生物生物体的繁殖，使得在接种后7天细菌生物体减少至少1.0log₁₀单位。在一些实例中，抗微生物有效量的防腐剂杀死或抑制微生物生物体的繁殖，使得当将其在抗微生物防腐剂有效性试验(APET)中试验时，在给所述组合物接种微生物接种物以后，在接种后7天细菌生物体减少至少1.0log₁₀单位，在接种后14天细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位，在接种后28天细菌生物体至少没有进一步增加，并且在接种后7天真菌生物体至少没有增加。在其它实例中，抗微生物有效量的防腐剂杀死或抑制微生物生物体的繁殖，使得当将其在抗微生物防腐剂有效性试验(APET)中试验时，在给所述组合物接种微生物接种物以后，在接种后24小时细菌生物体减少至少1.0log₁₀单位，在接种后7天细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位，在接种后28天细菌生物体没有进一步增加，在接种后14天真菌生物体减少至少1.0log₁₀单位，并且在接种后28天真菌生物体至少没有进一步增加。在另一实施例中，抗微生物有效量的防腐剂杀死或抑制微生物生物体的繁殖，使得当将其在抗微生物防腐剂有效性试验(APET)中试验时，在给所述组合物接种微生物接种物以后，在接种后6小时细菌生物体减少至少2.0log₁₀单位，在接种后24小时细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位，在给所述组合物接种微生物接种物以后28天后没有细菌生物体回收，在接种后7天真菌生物体减少至少2.0log₁₀单位，并且在接种后28天真菌生物体至少没有进一步增加。

稳定复合制剂中的一种或多种防腐剂可以包含以下各项中的一种或多种：一种或多种酚防腐剂、一种或多种非酚防腐剂，或者一种或多种酚防腐剂和一种或多种非酚防腐剂。例如，所述一种或多种防腐剂选自但不限于，苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苄醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、二盐酸氯己定、二葡萄糖酸氯己定、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、西三溴胺、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯及它们的任意组合。在一些实例中，所述稳定复合制剂包含单一防腐剂。在其它实例中，所述稳定复合制剂包含多种防腐剂的混合物，所述多种防腐剂的混合物包含2种、3种或4种不同的防腐剂。在一些实施方案中，所述稳定复合制剂包含至少一种酚防腐剂。在一特定实施方案中，所述一种或多种防腐剂是苯酚或间甲酚，或者是苯酚和间甲酚。

作为在本文提供的稳定复合制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)，所述一种或多种防腐剂的总量是或约是0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％，包括端值。在一些实例中，所述防腐剂是苯酚和间甲酚，并且其作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的量是或约是0.1％-0.25％的苯酚和是或约是0.05％-0.2％的间甲酚、是或约是0.10％-0.2％的苯酚和是或约是0.6％至01.8％的间甲酚、是或约是0.1％-0.15％的苯酚和0.8％-0.15％的间甲酚、是或约是0.10％-0.15％的苯酚和是或约是0.06-0.09％的间甲酚、或者是或约是0.12％-0.18％的苯酚和是或约是0.14-0.22％的间甲酚。在示例性复合制剂中，所述防腐剂是苯酚和间甲酚，并且其作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的量是或约是0.1％的苯酚和0.075％的间甲酚、是或约是0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚、是或约是0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚、是或约是0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚，是或约是0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚，是或约是0.15％的苯酚和0.175％的间甲酚，或者是或约是0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

本文提供的稳定复合制剂包含稳定剂，所述稳定剂选自但不限于，氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐或表面活性剂。在一些实例中，所述稳定复合制剂包含单一稳定剂。在其它实例中，所述稳定复合制剂包含2种、3种、4种、5种或6种不同的稳定剂。在一些实例中，所述稳定剂是氨基酸、氨基酸衍生物或胺，其选自L-精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、Lys-Lys、Gly-Gly、氧化三甲胺(TMAO)、甜菜碱或其盐。在一特定实例中，所述氨基酸是甘氨酸或脯氨酸。所述氨基酸的浓度是或约是0.01M-1M、0.01M-0.1M、0.1M-0.75M或0.2M-0.5M，包括端值。在一些实例中，所述稳定剂是糖或多元醇，其选自但不限于，甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、蔗糖和海藻糖。

在一示例性稳定复合制剂中，所述稳定剂是表面活性剂，并且作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的表面活性剂的量是或约是0.005％-1.0％、0.01％-0.5％、0.01％-0.1％、0.01％-0.05％或0.01％-0.02％。例如，所述稳定剂是表面活性剂，并且作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的表面活性剂的量是或约是0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.9％。在本文提供的稳定复合制剂中的表面活性剂可以选自但不限于，聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。例如，所述表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一示例性稳定复合制剂中，所述稳定剂是的表面活性剂，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，并且其以作为质量浓度(w/v)百分比是或约是0.01％-0.05％的量提供。在另一示例性稳定复合制剂中，所述稳定剂是表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯20，并且其以作为质量浓度(w/v)百分比是或约是0.01％-0.05％的量提供。在另一示例性稳定复合制剂中，所述稳定剂是表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯80，并且其以作为质量浓度(w/v)百分比是或约是0.01％-0.05％的量提供。

本文提供的稳定复合制剂任选地包含张力调节剂(其选自但不限于，甘油、盐、氨基酸、多元醇或海藻糖)，以维持是或约是245mOsm/kg-305mOsm/kg的渗量(osmolarity)。在一些实例中，所述张力调节剂维持所述制剂的渗量为或约为245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、300mOsm/kg或305mOsm/kg。在一示例性稳定复合制剂中，所述张力调节剂维持制剂的渗量为或约为275mOsm/kg。在一实施方案中，所述张力调节剂是甘油，其以小于60mM、小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、小于30mM、小于25mM、小于20mM、小于15mM或小于10mM的浓度存在于所述复合制剂中。在一示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物，所述胰岛素类似物为门冬胰岛素，并且所述制剂包含浓度为或约为20mM-50mM(包括端值)的甘油。在另一示例性稳定复合制剂中，所述速效胰岛素是正规胰岛素或者是赖脯胰岛素，并且所述制剂包含浓度为或约为40mM-60mM(包括端值)的甘油。

在一些实施方案中，本文提供的稳定复合制剂任选地包含抗氧化剂。在其它实施方案中，本文提供的稳定复合制剂任选地包含表面活性剂和/或乙酰透明质酸寡糖，并且其也包含抗氧化剂。在本文提供的稳定复合制剂中包含的抗氧化剂选自但不限于，半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在一示例性稳定复合制剂中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。所述稳定复合制剂中的抗氧化剂的浓度为或约为5mM-50mM、5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM，包括端值。在一示例性实施方案中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸，并且甲硫氨酸的浓度是或约是10mM-20mM。

本文提供的稳定复合制剂任选地包含锌。例如，在一个实施方案中，所述速效胰岛素是正规胰岛素、赖脯胰岛素或门冬胰岛素，并且所述制剂包含锌。所述稳定复合制剂中的锌选自但不限于，氧化锌、乙酸锌或氯化锌，并且以是或约是0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)、0.001-0.05mg/100U或0.01-0.05mg/100U的浓度存在。

本文提供的稳定复合制剂任选地包含烟碱化合物，其选自但不限于，烟酰胺(nicotinamide)、烟酸、尼克酸、烟酰胺(niacinamide)、维生素B3和/或它们的盐和/或它们的任意组合。所述烟碱化合物以是或约是1mM-150mM、10mM-150mM、50mM-100mM或80mM或约80mM的浓度存在。

本文提供的稳定复合制剂任选地包含一种或多种氨基酸，其选自但不限于，精氨酸、谷氨酸和/或它们的盐和/或它们的组合。所述氨基酸以1-100mM、10-100mM或为或约为30mM、50mM或80mM的浓度存在。

本文提供的一示例性稳定复合制剂的pH为或约为7.0-7.6，并且包含量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶(其为PH20)；量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素类似物；浓度为或约为10mM-50mM(包括值)的Tris缓冲剂；浓度为或约为50-200mM(包括端值)的NaCl；浓度为或约为5mM-50mM(包括端值)的甲硫氨酸；浓度为或约为0mM-50mM(包括端值)的甘油；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.5％的表面活性剂(其为泊洛沙姆188、聚山梨酯20或聚山梨酯80)；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.1％-0.25％的苯酚和质量浓度百分比为或约为0.05％-0.2％的间甲酚。在另一实施方案中，该示例性稳定复合制剂还包含浓度为0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)的锌。在一个实施方案中，所述稳定复合制剂中的防腐剂是或约是0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚、0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚或0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

本文提供的一示例性稳定复合制剂的pH为或约为7.0-7.6，并且其包含：量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素(其为赖脯胰岛素)；量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶(其为PH20)；浓度为或约为25mM-35mM(包括端值)的Tris缓冲剂；浓度为或约为50mM-120mM(包括端值)的NaCl；浓度为或约为10mM-30mM(包括端值)的甲硫氨酸；浓度为或约为40mM-60mM(包括端值)的甘油；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.05％(包括端值)的表面活性剂(其为泊洛沙姆188、聚山梨酯20或聚山梨酯80)；浓度为0.017-0.024mg/100单位胰岛素(mg/100U)的锌；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.08％-0.17％的苯酚(包括端值)和为或约为0.07％-0.17％的间甲酚。在一个实施方案中，所述NaCl浓度是或约是70mM-100mM。在另一实施方案中，所述pH是或约是7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2或7.4±0.2。在一个实施方案中，所述稳定复合制剂中的防腐剂是或约是0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚、0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚或0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

本文提供的一示例性稳定复合制剂的pH为或约为7.0-7.6，并且其包含：量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素(其为门冬胰岛素)；量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶(其为PH20)；浓度为或约为25mM-35mM(包括端值)的Tris缓冲剂；浓度为或约为80mM至约160mM(包括端值)的NaCl；浓度为或约为10mM-30mM(包括端值)的甲硫氨酸；浓度为或约为20mM-50mM(包括端值)的甘油；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.05％(包括端值)的表面活性剂(其为泊洛沙姆188、聚山梨酯20或聚山梨酯80)；浓度为0.017-0.024mg/100单位胰岛素(mg/100U)的锌；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.08％-0.17％(包括端值)的苯酚和为或约为0.07％-0.17％的间甲酚。在一个实施方案中，所述NaCl浓度是或约是70mM-100mM。在另一实施方案中，所述pH是或约是7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2或7.5±0.2。在一个实施方案中，所述稳定复合制剂中的防腐剂是或约是0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚、0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚、0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚或0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

本文提供的一示例性稳定复合制剂的pH为或约为7.0-7.6，并且其包含：量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素(其为赖谷胰岛素)；量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶(其为PH20)；浓度为或约为25mM-35mM(包括端值)的Tris缓冲剂；浓度为或约为80mM-200mM(包括端值)的NaCl；浓度为或约为10mM-30mM(包括端值)的甲硫氨酸；浓度为或约为40mM-60mM(包括端值)的甘油；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.05％(包括端值)的表面活性剂(其为泊洛沙姆188)；和防腐剂，其具有质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.08％-0.17％(包括端值)的苯酚和为或约为0.07％-0.17％的间甲酚。在一个实施方案中，所述NaCl浓度是或约是100mM-150mM。在另一个实施方案中，所述pH是或约是7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2或7.5±0.2。

在一个实施方案中，本文提供的稳定复合制剂中的PH20是人PH20，其具有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或其氨基酸序列与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。例如，所述PH20多肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短，或者是其变体，并且保留透明质酸酶活性，所述变体表现出与特定氨基酸序列的至少85％、90％或95％的序列相同性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短。在另一实施例中，所述PH20多肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点482以后的C-端截短，或者是其变体，并且保留透明质酸酶活性，所述变体表现出与特定氨基酸序列的至少85％、90％或95％的序列相同性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点482以后的C-端截短。在一示例性稳定复合制剂中，所述PH20多肽具有在SEQ ID NO:4-9中任一个所示的氨基酸序列。本文提供的稳定复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶或PH20可以从哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中生产和表达。在一特定实例中，所述PH20被命名为rHuPH20。

本文提供的稳定复合制剂可以配制用于多剂量给药。所述稳定复合制剂的体积可以是或约是0.5mL-50mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL，包括端值。本文提供的稳定复合制剂可以配制用于使用小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统的递送。在一特定实例中，所述稳定复合制剂被配制用于使用连续皮下胰岛素输注(其由闭环系统提供)的递送。

本文提供的稳定复合制剂可以注射器或小瓶、闭环系统、胰岛素泵和/或胰岛素笔的形式提供。

本发明提供给药所述稳定复合制剂的方法。例如，本文提供通过向个体给药治疗有效量的本文提供的稳定复合制剂来治疗糖尿病的方法。要治疗的糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。本文还提供通过向个体给药治疗有效量的本文提供的稳定复合制剂来控制个体中的血糖水平的方法。在实施本文的方法时，将所述稳定复合制剂皮下或腹膜内给药，例如，通过注射器或胰岛素笔或通过连续皮下输注。在实施本文的方法时，可以在餐前给药所述稳定复合制剂作为膳食胰岛素疗法。在本文提供的方法中，可使用递送方法(例如通过胰岛素泵或闭环系统)给药所述稳定复合制剂，以实现连续皮下胰岛素输注。在一些情况下，本文提供的方法包括给药另外的抗糖尿病药物，所述抗糖尿病药选自但不限于，磺酰脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂、肽类似物(包括高血糖素样肽(GLP)类似物和抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂)。

本文还提供组合物，其包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)。在一些实例中，Lys-Lys的浓度是或约是5mM-120mM、10mM-100mM、10mM-50mM、30mM-110mM、30mM-80mM、50mM-100mM或100mM-120mM。在其它实例中，Lys-Lys的浓度是至少或至少是约或是5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM或120mM。本文提供组合物，其包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和足够使得乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少三(3)天的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久。在一个特定实例中，所述乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少1个月。在其它实例中，所述乙酰透明质酸降解酶保留至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的初始透明质酸酶活性。

在一些所提供的组合物的实例中，所述制剂的pH是或约是6.5-8.0、6.5-7.4、6.8-7.8、7.0-7.6或6.8-7.2，包括端值。例如，所述制剂的pH是或约是或至少是6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2、7.6±0.2、7.7±0.2或7.8±0.2。

任意所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物还可包含稳定剂。例如，所述组合物可包含选自氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和表面活性剂的稳定剂。在一些实例中，所述稳定剂是表面活性剂，并且所述表面活性剂的量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比是或约是0.0005％-1.0％、0.0005％-0.005％、0.001％-0.01％、0.01％-0.5％、0.01％-0.1％、0.01％-0.05％或0.01％-0.02％，包括端值。在其它实例中，所述稳定剂是表面活性剂，并且所述表面活性剂的量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比是或约是或至少是0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.9％。所述表面活性剂可以选自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。在一特定实例中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80。

在一些实例中，所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物也包含抗氧化剂。例如，所述组合物包含选自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的抗氧化剂。在一特定实例中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。在一些实例中，所述抗氧化剂以是或约是5mM-50mM、5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM(包括端值)的浓度存在。在其它实例中，所述抗氧化剂以是或约是或至少是5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM或50mM的浓度存在。

在一些实例中，所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物也包含张力调节剂以维持为或约为245mOsm/kg-500mOsm/kg(包括端值)的渗量。在一些实例中，所述组合物包含张力调节剂以维持所述制剂的渗量约为或至少约为或为245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、300mOsm/kg、350mOsm/kg、400mOsm/kg、450mOsm/kg或500mOsm/kg。在一些实例中，所述张力调节剂选自甘油、NaCl、氨基酸、多元醇或海藻糖。在一特定实例中，所述张力调节剂是NaCl，并且NaCl的浓度是或约是20mM-200mM、40mM-160mM、80mM-120mM、20mM-80mM或50mM-150mM，包括端值。在其它实例中，所述张力调节剂是NaCl，并且NaCl的浓度是0mM-150mM、10mM-50mM、50mM-100mM和100mM-130mM。在一些实例中，NaCl的浓度是小于150mM、小于140mM、小于130mM、小于120mM、小于110mM、小于100mM、小于90mM、小于80mM、小于70mM、小于60mM、小于50mM、小于40mM、小于30mM、小于20mM、小于10mM或更低。

任意所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物还可包含足量的缓冲剂以维持pH范围为或约为6.5-8.0、6.8-7.8或7.0-7.6、6.5-7.2、6.8-7.4，包括端值。在一些实例中，所述缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐和柠檬酸盐。在一特定实例中，所述缓冲剂是磷酸盐，所述磷酸盐为磷酸钠。在另一特定实例中，所述缓冲剂是Tris。在一些实例中，所述组合物中的缓冲剂的浓度是或约是1mM-100mM、10mM-80mM、5mM-50mM或20mM-40mM，包括端值。

任意所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物中的乙酰透明质酸降解酶可以是透明质酸酶或软骨素酶。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是在中性pH具有活性的透明质酸酶。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶缺少糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当其从细胞表达时不是膜结合的。在其它实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是这样的乙酰透明质酸降解酶：其包含一个或多个氨基酸残基的C-端截短以移除所有或部分GPI锚。

在所提供的组合物的其它实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是这样的透明质酸酶：其为PH20或其C-端截短的片段。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是为非人PH20或人PH20的PH20。在一些实例中，所述PH20具有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或其氨基酸序列与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。例如，所述PH20与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。在所述组合物的一些实施例中，所述乙酰透明质酸降解酶是这样的PH20多肽：其氨基酸序列包含在SEQID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短，或者是其变体，所述变体表现出与特定氨基酸序列的至少85％的序列相同性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短，并且保留透明质酸酶活性。在特定实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是具有在SEQ ID NO:4-9中任一个所示的氨基酸序列的C-端截短的PH20。

在一些所提供的组合物的实例中，所述乙酰透明质酸降解酶的量是或约是10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL、100U/mL-1000U/mL、200U/mL-800U/mL、100U/mL-500U/mL或150U/mL-300U/mL，包括端值。例如，所述乙酰透明质酸降解酶的量是至少或约是或是30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、50U/mL、55U/mL、60U/mL、65U/mL、70U/mL、75U/mL、80U/mL、85U/mL、90U/mL、95U/mL、100U/mL、105U/mL、110U/mL、115U/mL、120U/mL、125U/mL、130U/mL、135U/mL、140U/mL、145U/mL、150U/mL、155U/mL、160U/mL、170U/mL、180U/mL、190U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL或2000U/mL。

在一些包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物的实例中，Lys-Lys的浓度是5mM-50mM，包括端值。例如，Lys-Lys的浓度是至少5mM、10mM、15mM、20mM、30mM或50mM；和/或是小于50mM、40mM、30mM、20mM或10mM。

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)的组合物，其中所述组合物的pH是或约是6.5-7.2，并且所述组合物包含量为或约为100U/mL-500U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶；浓度为或约为5mM-30mM(包括端值)的Lys-Lys；浓度小于140mM的NaCl的NaCl；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.05％(包括端值)的表面活性剂(其为聚山梨酯80)；浓度为或约为5mM-20mM(包括端值)的甲硫氨酸；和浓度为或约为5mM-50mM(包括端值)的磷酸钠。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是PH20或其C-端截短的片段。

在一些实例中，所提供的组合物的体积是或约是0.5mL-50mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL，包括端值。所述组合物可以配制成用于使用小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统的递送。本文还提供包含本文提供的任意组合物的注射器或小瓶。

本文还提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶、使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)和速效胰岛素的组合物。在一些实例中，Lys-Lys的浓度是30mM-120mM、50mM-105mM或80mM-100mM，包括端值。在所提供的组合物中，所述速效胰岛素可以是单体的、二聚体的或六聚体的。在一些实例中，所述速效胰岛素是速效人胰岛素。在其它实例中，所述速效胰岛素是正规胰岛素。在一特定实例中，所述速效胰岛素是正规胰岛素，所述正规胰岛素为人胰岛素或猪胰岛素。在一些实例中，所述速效胰岛素是这样的正规胰岛素：其为具有氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的A链和氨基酸序列如SEQ IDNO:104所示的B链的胰岛素，或者具有氨基酸序列如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位点88-108所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位点25-54所示的B链的胰岛素。在其它所提供的组合物的实例中，所述速效胰岛素是重组胰岛素。所述速效胰岛素可以是合成的或部分地合成的。在一些实例中，所述胰岛素是分离的。

在其它所提供的组合物的实例中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物。在一些实例中，所述胰岛素类似物选自门冬胰岛素、赖脯胰岛素和赖谷胰岛素。例如，所述胰岛素类似物选自具有氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的A链和氨基酸序列如SEQ ID NO:147-149所示的B链的胰岛素。在任意所提供的组合物中，所述速效胰岛素可以是或约是10U/mL-1000U/mL、20U/mL-500U/mL、50U/mL-300U/mL或200U/mL-800U/mL(包括端值)的量存在。例如，所述速效胰岛素的量是至少或约是或是10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL或1000U/mL。

在所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶、使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)和速效胰岛素的组合物的特定实例中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物，并且所述乙酰透明质酸降解酶是PH20或其C-端截短的片段。在一个特定实例中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物，所述胰岛素类似物为赖谷胰岛素，并且Lys-Lys的浓度是50-105mM。在另一实例中，所述速效胰岛素是胰岛素类似物，所述胰岛素类似物为门冬胰岛素或赖脯胰岛素，并且Lys-Lys的浓度是80-100mM。

本文提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶、使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)和速效胰岛素的任意组合物可以用于单剂量给药或用于多剂量给药。在所述组合物用于多剂量给药的实例中，所述组合物包含抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物。在所述制剂中的防腐剂可包含以下各项中的一种或多种：一种或多种酚防腐剂、一种或多种非酚防腐剂，或一种或多种酚防腐剂和一种或多种非酚防腐剂。在一些实例中，所述一种或多种防腐剂选自苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苄醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、二盐酸氯己定、二葡萄糖酸氯己定、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、西三溴胺、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯及它们的任意组合。在一些所提供的用于多剂量给药的组合物的实例中，所述制剂包含单一防腐剂。在其它所提供的用于多剂量给药的组合物的实例中，所述制剂包含多种防腐剂的混合物，所述多种防腐剂的混合物包含2种、3种或4种不同的防腐剂。在一些实例中，所述组合物包含至少一种酚防腐剂。在其它实例中，所述一种或多种防腐剂是苯酚或间甲酚，或者是苯酚和间甲酚。

在一些所提供的组合物的实例中，作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)，防腐剂的总量是或约是0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％，包括端值。在所提供的组合物的特定实例中，其中所述防腐剂是苯酚和间甲酚，其作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的量是或约是0.1％-0.25％的苯酚和是或约是0.05％-0.2％的间甲酚、是或约是0.10％-0.2％的苯酚和是或约是0.06％-0.18％的间甲酚、是或约是0.1％-0.15％的苯酚和0.08％-0.15％的间甲酚、是或约是0.10％-0.15％的苯酚和是或约是0.06-0.09％的间甲酚或者是或约是0.12％-0.18％的苯酚和是或约是0.14-0.22％的间甲酚，包括端值。在其它所提供的组合物的特定实例中，其中所述防腐剂是苯酚和间甲酚，其作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比的量是或约是0.1％的苯酚和0.075％的间甲酚、是或约是0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚、是或约是0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚、是或约是0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚、是或约是0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚、是或约是0.15％的苯酚和0.175％的间甲酚、或者是或约是0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶、使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)和速效胰岛素的组合物，其中所述组合物的pH是或约是6.8-7.4；并且所述组合物包含：量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶，所述乙酰透明质酸酶为PH20；量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素类似物，所述胰岛素类似物为赖谷胰岛素；浓度为或约为50mM-105mM(包括端值)的Lys-Lys；浓度小于100mM的NaCl；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.0005％-0.005％(包括端值)的表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯20；浓度为或约为5mM-20mM(包括端值)的甲硫氨酸；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.1％-0.25％的苯酚和质量浓度百分比为或约为0.05％-0.2％的间甲酚。

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶、使所述乙酰透明质酸降解酶稳定的量的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)和速效胰岛素的组合物，其中所述组合物的pH是或约是6.8-7.4；并且所述组合物包含：量为或约为100U/mL-1000U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶，所述乙酰透明质酸酶为PH20；量为或约为10U/mL-1000U/mL(包括端值)的速效胰岛素类似物，所述速效胰岛素类似物为门冬胰岛素或赖脯胰岛素；浓度为或约为80mM-100mM(包括端值)的Lys-Lys；浓度小于30mM的NaCl；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.0005％-0.005％(包括端值)的表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯20；浓度为或约为5mM-20mM(包括端值)的甲硫氨酸；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.1％-0.25％的苯酚和质量浓度百分比为或约为0.05％-0.2％的间甲酚。

在一些实例中，所提供的组合物的体积是或约是0.5mL-50mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL，包括端值。所述组合物可以配制成用于使用小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统的递送。在一些实例中，所述组合物被配制用于使用连续皮下胰岛素输注的递送。本文还提供包含本文提供的任意组合物的注射器或小瓶。

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和足够使得所述乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少三(3)天的量的MgCl₂的组合物。在一些实例中，所述组合物包含浓度为或约为50mM-150mM、75mM-125mM或80mM-100mM(包括端值)的MgCl₂。例如，所述组合物包含浓度是至少或约是或是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM或150mM的MgCl₂。在所述组合物的一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久。例如，所述乙酰透明质酸降解酶在37℃保留至少50％的初始透明质酸酶活性持续至少1个月，诸如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的初始透明质酸酶活性。

所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和MgCl₂的组合物的pH可以是或约是6.5-8.0、6.5-7.4、6.8-7.8、7.0-7.6或6.8-7.2。在一些实例中，所述组合物的pH是或约是或至少是6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2、7.6±0.2、7.7±0.2或7.8±0.2。所述组合物还可包含选自氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和表面活性剂的稳定剂。在一些实例中，所述稳定剂是表面活性剂，并且所述表面活性剂的量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比是或约是0.0005％-1.0％、0.0005％-0.005％、0.001％-0.01％、0.01％-0.5％、0.01％-0.1％、0.01％-0.05％或0.01％-0.02％，包括端值。例如，所述稳定剂是表面活性剂，并且表面活性剂的量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比是或约是或至少是0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.9％。在一些实例中，所述表面活性剂选自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。在特定实例中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80。

在一些实例中，所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和MgCl₂的组合物包含选自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的抗氧化剂。在特定实例中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。在一些实例中，所述抗氧化剂的浓度为或约为5mM-50mM、5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM，包括端值。例如，所述抗氧化剂是甲硫氨酸，并且其浓度是或约是或至少是5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM或50mM。在一些实例中，所述组合物包含足量的缓冲剂以维持pH范围为或约为6.5-8.0、6.8-7.8、7.0-7.6、6.5-7.2或6.8-7.4。在一些实例中，所述缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐和柠檬酸盐。在一个特定实例中，所述缓冲剂是盐酸组氨酸。在所提供的组合物中的缓冲剂的浓度可以是或约是1mM-100mM、10mM-80mM、5mM-50mM或20mM-40mM。

在一些实例中，所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和MgCl₂的组合物包含为透明质酸酶或软骨素酶的乙酰透明质酸降解酶。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是在中性pH具有活性的透明质酸酶。在其它实例中，所述乙酰透明质酸降解酶缺少糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当其从细胞表达时不是膜结合的。例如，所述乙酰透明质酸降解酶是这样的乙酰透明质酸降解酶：其包含一个或多个氨基酸残基的C-端截短以移除所有或部分GPI锚。

在其它实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是这样的透明质酸酶：它是PH20或其C-端截短的片段。所述PH20可以是非人PH20或人PH20。在一些所提供的组合物的实例中，所述PH20具有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或其氨基酸序列与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。例如，所述PH20与至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性。在其它实例中，所述PH20多肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短，或者是其变体，所述变体表现出与特定氨基酸序列的至少85％的序列相同性，并且保留透明质酸酶活性，所述特定氨基酸序列包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后的C-端截短。在特定实例中，所述乙酰透明质酸降解酶是具有在SEQ ID NO:4-9中任一个所示的氨基酸序列的C-端截短的PH20。

在一些实例中，所提供的包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和MgCl₂的组合物包含量为或约为10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL、100U/mL-1000U/mL、200U/mL-800U/mL、100U/mL-500U/mL或150U/mL-300U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶。例如，所述组合物包含量是至少或约是或是30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、50U/mL、55U/mL、60U/mL、65U/mL、70U/mL、75U/mL、80U/mL、85U/mL、90U/mL、95U/mL、100U/mL、105U/mL、110U/mL、115U/mL、120U/mL、125U/mL、130U/mL、135U/mL、140U/mL、145U/mL、150U/mL、155U/mL、160U/mL、170U/mL、180U/mL、190U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL或2000U/mL的乙酰透明质酸降解酶。

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶和MgCl₂的组合物，其中所述组合物的pH是或约是6.5-7.2，并且所述组合物包含：量为或约为100U/mL-500U/mL(包括端值)的乙酰透明质酸降解酶；浓度为或约为50mM-150mM(包括端值)的MgCl₂；质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.05％(包括端值)的表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯80；浓度为或约为5mM-20mM(包括端值)的甲硫氨酸；和浓度为或约为5mM-50mM(包括端值)的组氨酸/HCl。

在一些实例中，所提供的组合物的体积是或约是0.5mL-50mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL，包括端值。所述组合物可以配制成用于使用小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统的递送。本文还提供包含本文提供的任意组合物的注射器或小瓶。

本文提供的包含诸如正规胰岛素或速效胰岛素类似物(例如门冬胰岛素、赖脯胰岛素或赖谷胰岛素或其它胰岛素类似物)的胰岛素的组合物可以在治疗糖尿病的方法和用途中使用。例如，本文提供通过向个体给药治疗有效量的本文提供的任意上述稳定组合物来治疗糖尿病的方法。要治疗的糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。本文还提供通过向个体给药治疗有效量的本文提供的包含速效胰岛素的稳定组合物来控制个体的血糖水平的方法。在实施本文的方法时，皮下或腹膜内给药所述稳定组合物，例如，通过注射器或胰岛素笔或通过连续皮下输注。在实施本文的方法时，可以在餐前给药所述稳定组合物作为膳食胰岛素疗法。在本文提供的方法中，可使用诸如通过胰岛素泵或闭环系统的递送方法给药所述稳定组合物，以实现连续皮下胰岛素输注。在一些情况下，本文提供的方法包括给药另外的抗糖尿病药物，其选自但不限于，磺酰脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂、肽类似物(包括高血糖素样肽(GLP)类似物和抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂)。

发明详述

A.定义

B.乙酰透明质酸降解酶制剂和制备胰岛素复合制剂

1.乙酰透明质酸降解酶制剂

2.速效胰岛素制剂

3.乙酰透明质酸降解酶和胰岛素复合制剂

a.稳定性的相反(opposing)要求

i.防腐剂

ii.NaCl和pH

b.相容的复合制剂

C.乙酰透明质酸降解酶

1.透明质酸酶

a.哺乳动物型透明质酸酶

PH20

b.细菌透明质酸酶

c.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶

2.其它乙酰透明质酸降解酶

3.截短的乙酰透明质酸降解酶或其它可溶形式

a.C-端截短的人PH20

b.rHuPH20

4.乙酰透明质酸降解酶的糖基化

5.修饰乙酰透明质酸降解酶以改善它们的药代动力学性质

D.稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂

1.乙酰透明质酸降解酶

2.二价阳离子

3.pH和缓冲剂

4.表面活性剂

5.抗氧化剂

6.张力调节剂

7.其它物质或赋形剂

8.示例性稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂

E.胰岛素多肽

速效胰岛素

a.正规胰岛素

b.速效类似物(也称为快速起效胰岛素)

i.赖脯胰岛素

ii.门冬胰岛素

iii.赖谷胰岛素

F.胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的稳定复合制剂

1.稳定复合制剂的组分

a.速效胰岛素

b.乙酰透明质酸降解酶

c.防腐剂

d.NaCl

e.pH

f.缓冲剂

g.Lys-Lys

h.其它示例性赋形剂或稳定剂

i.表面活性剂

ii.张力调节剂

iii.甘油

iv.抗氧化剂

v.锌

vi.氨基酸稳定剂

vii.透明质酸酶抑制剂

viii.烟碱化合物

ix.其它赋形剂或试剂

2.示例性稳定复合制剂

a.示例性多剂量注射(MDI)复合制剂

b.示例性连续皮下胰岛素输注(CSII)复合制剂

c.示例性Lys-Lys复合制剂

G.剂量和给药

给药方式

a.注射器

b.胰岛素笔

c.胰岛素泵和其它胰岛素递送装置

d.连续输注泵系统

i.开环系统

ii.闭环系统

H.制备编码胰岛素或乙酰透明质酸降解酶及其多肽的核酸的方法

1.载体和细胞

2.连接基

3.表达

a.原核细胞

b.酵母细胞

c.昆虫细胞

d.哺乳动物细胞

e.植物

4.纯化技术

I.评价稳定性和活性的方法

1.胰岛素

2.乙酰透明质酸降解酶

J.治疗用途

1.糖尿病

a.I型糖尿病

b.II型糖尿病

c.妊娠糖尿病

2.用于危重患者的胰岛素疗法

K.联合治疗

L.制品和药盒

M.实施例

A.定义

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。除非另外指明，本文完整公开内容通篇提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它公开的材料以其整体援引加入。当本文术语存在多个定义时，以本章节的那些为准。当提及URL或其它这样的标识符(identifier)或地址时，要理解，这些标识符可以变化，并且因特网上的具体信息可以不断变化，但是等同的信息是已知的，并且可以通过例如搜索因特网和/或适合的数据库容易地访问。对它们的参考证明了这些信息的可获得性和公开传播性。

本文使用的“胰岛素”指用于增加葡萄糖摄入和储存和/或降低内源性葡萄糖产生的激素、其前体或者合成的或重组的类似物。示例性人胰岛素被翻译为110个氨基酸的前体多肽，前胰岛素原(SEQ ID NO:101)，其包含将该蛋白质引导至内质网(ER)的24个氨基酸的信号肽，该信号肽在内质网被裂解，生成胰岛素原(SEQ ID NO:102)。胰岛素原经进一步加工释放31个氨基酸的C-或连接链肽(对应于SEQ ID NO:101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基57-87，和SEQ ID NO:102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基33-63)。所得胰岛素包含通过二硫键交联的21个氨基酸的A-链(对应于SEQ ID NO:101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基90-110，以及SEQ ID NO:102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基66-86)和30个氨基酸的B-链(对应于SEQ ID NO:101所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基25-54，以及SEQ ID NO:102所示胰岛素原多肽的氨基酸残基1-30)。适当交联的人胰岛素包含3个二硫键：一个在A-链的7位和B-链的7位之间，第二个在A-链的20位和B-链的19位之间，以及第三个在A-链的6和11位之间。提及的胰岛素包括单链或双链形式的前胰岛素原、胰岛素原和胰岛素多肽，其具有活性的截短形式，并包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其它变体，例如包含与SEQ ID NO:101所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽的胰岛素类似物。示例性胰岛素类似物包括SEQ ID NO:147-149、152所示的那些和包含SEQ ID NO:150、156、158、160、162和164所示的A-链和/或SEQ ID NO:151、153-155、157、159、161、163和165所示的B-链的那些。

示例性胰岛素多肽为包括人在内的哺乳动物来源的那些。人源胰岛素的示例性氨基酸序列显示于SEQ ID NO:101-104。示例性胰岛素类似物包括SEQ ID NO:147-149、152所示的那些和包含SEQ ID NO:150、156、158、160、162和164所示的A-链和/或SEQ ID NO:151、153-155、157、159、161、163和165所示的B-链的那些。胰岛素多肽也包括任何非人源的，其包括但不限于SEQ ID NO:105-146所示的任意前体胰岛素多肽。提及的胰岛素包括单体和多聚体胰岛素，其包括六聚体胰岛素以及人源化胰岛素。

本文使用的“速效胰岛素”指响应于在给药速效胰岛素时或给药速效胰岛素后约四小时个体中发生的真实的、察觉到的或预期的高血糖症(例如由进食引起的或预期由进食引起的餐时高血糖症)而紧急向糖尿病个体给药的任意胰岛素或速效胰岛素组合物，从而所述速效胰岛素能够预防、控制或缓解所述急性高血糖症。通常速效胰岛素为向个体皮下给药后不超过四小时或约不超过四小时显示峰胰岛素水平的胰岛素。速效胰岛素包括重组胰岛素和分离的胰岛素(也称作“正规”胰岛素)，例如以

R销售的胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素，以及通过改变氨基酸而设计为快速起效的快速起效胰岛素类似物(在本文中也被称作速效胰岛素类似物)。示例性正规胰岛素制剂包括但不限于人正规胰岛素，例如以商标

R、

R和

Insulin Human、USP和Insulin HumanInjection、USP销售的那些，以及胰岛素的酸制剂，例如Toronto Insulin、Old Insulin和Clear Insulin，以及正规猪胰岛素，例如Iletin

(猪胰岛素)。正规胰岛素通常在30分钟-1小时开始起效，并且给药后2-5小时有峰胰岛素水平。

本文使用的快速起效胰岛素类似物(也称为速效胰岛素类似物)是快速开始起效的胰岛素。快速胰岛素通常是已经经过工程改造(诸如通过引入一个或多个氨基酸置换)以变得比正规胰岛素更快速起效的胰岛素类似物。快速起效胰岛素类似物通常注射后10-30分钟开始起效，并在注射后30-90分钟有峰胰岛素水平。示例性快速起效胰岛素类似物包括但不限于：例如，赖脯胰岛素(例如

胰岛素)、门冬胰岛素(例如

胰岛素)和赖谷胰岛素(例如

胰岛素)、以

和

销售的速效胰岛素组合物(参见，例如第7,279,457号美国专利)。也包括30分钟或更短开始起效和在注射后90分钟之前(通常30-90分钟)有峰水平的其它任意胰岛素。

本文使用的人胰岛素指基于人多肽的合成或重组制备的胰岛素，包括其等位基因变体和类似物。

本文使用的速效人胰岛素或人速效胰岛素组合物包括任意的速效的人胰岛素或人胰岛素组合物，但是不包括非人胰岛素，例如正规猪胰岛素。

本文使用的术语“基础作用胰岛素”或“基础胰岛素”指作为用于例如糖尿病的慢性病症的整体治疗方案的一部分给药以维持基础胰岛素水平的胰岛素。通常，基础作用胰岛素被配制用于当周期性(例如，每天一次或每天两次)给药时通过胰岛素的控释维持大约稳定状态的胰岛素水平。基础作用胰岛素包括结晶胰岛素(例如，NPH和

鱼精蛋白胰岛素、surfen insulin)、基础胰岛素类似物(甘精胰岛素、HOE 901、NovoSol Basal)和减缓正规胰岛素吸收速率的其它胰岛素的化学制剂(例如，阿拉伯胶、卵磷脂或油混悬剂)。本文使用的所述基础作用胰岛素可包括通常理解为长效(通常达到相对低的峰浓度，但是具有约20-30小时的最长作用时间)或中效(通常在给药后约4-12小时引起峰胰岛素浓度)的胰岛素。

本文使用的术语“高血糖病症”或“高血糖症”指不期望的血糖升高。

本文使用的术语“低血糖病症”或“低血糖症”指不期望的血糖降低。

本文使用的血糖控制或“控制血糖水平”指将血糖浓度维持在期望的水平，其通常为70-130mg/dL或90-110mg/dL。

本文使用的闭环系统为用于提供持续血糖控制的集成系统。闭环系统包括测量血糖的装置(mechanism)、递送包括胰岛素组合物在内的一种或多种组合物的装置以及用于测定达到血糖控制需要递送的胰岛素的量的装置。因此，闭环系统通常包括葡萄糖传感器、例如胰岛素泵的胰岛素递送装置和接受来自所述葡萄糖传感器的信息并向所述胰岛素递送装置提供指令的控制器。这些指令可由所述控制器中的软件生成。该软件通常包括用于基于葡萄糖传感器检测的或使用者预期的血糖水平来测定达到血糖控制需要递送的胰岛素的量的算法。开环系统指类似的装置，但是所述装置不会自动地测量和对葡萄糖水平做出应答。

本文使用的给药方案指给药胰岛素的量和给药频率。所述给药方案取决于要治疗的疾病或病症，因此可发生变化。

本文使用的乙酰透明质酸降解酶指催化透明质酸聚合物(也称作透明质酸或HA)裂解成较小分子量片段的酶。示例性乙酰透明质酸降解酶为透明质酸酶，特别是具有解聚透明质酸的能力的软骨素酶和裂解酶。作为乙酰透明质酸降解酶的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶(eliminase))和软骨素C裂解酶。软骨素ABC裂解酶包括两种酶，即硫酸软骨素ABC内解酶(endolyase)(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外解酶(exolyase)(EC4.2.2.21)。示例性硫酸软骨素ABC内解酶和硫酸软骨素ABC外解酶包括但不限于来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和肝黄黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素-ABC内解酶显示于SEQ ID NO:98；Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝黄黄杆菌(显示于SEQ ID NO:99)、Victivallis vadensis(显示于SEQ ID NO:100)和金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)的那些(Tkalec等人(2000)Applied andEnvironmental Microbiology 66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。来自于细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属(Streptococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。

本文使用的透明质酸酶指一类乙酰透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)、来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)以及哺乳动物型的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶包括任意非人(包括但不限于鼠科、犬科、猫科、兔属、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙类、细菌)来源的透明质酸酶，和任意来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶。示例性非人透明质酸酶包括来自下列的透明质酸酶：来自母牛的(SEQ ID NO:10、11、64和BH55(第5,747,027号和第5,827,721号美国专利)、来自黄蜂的(SEQ ID NO:12和13)、来自蜜蜂的(SEQ ID NO:14)、来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO:15)、来自胡蜂的(SEQ ID NO:16)、来自小鼠的(SEQ ID NO:17-19、32)、来自猪的(SEQ ID NO:20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO:22-24、31)、来自兔的(SEQID NO:25)、来自绵羊的(SEQ ID NO:26、27、63和65)、来自猩猩的(SEQ ID NO:28)、来自食蟹猴的(SEQ ID NO:29)、来自豚鼠的(SEQ ID NO:30)、来自黑猩猩的(SEQ ID NO:185)、来自罗猴的(SEQ ID NO:186)、来自节杆菌属的(Arthrobacter sp.)的(菌株FB24)(SEQ IDNO:67)、来自食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)的(SEQ ID NO:68)、来自痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的(SEQ ID NO:69)、来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的(SEQ ID NO:70)；来自18RS21的(SEQ ID NO:71)；来自血清型Ia的(SEQ IDNO:72)；来自血清型III的(SEQ ID NO:73)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的(菌株COL)(SEQ ID NO:74)；来自菌株MRSA252的(SEQ ID NO:75和76)；来自菌株MSSA476的(SEQ ID NO:77)；来自菌株NCTC 8325的(SEQ ID NO:78)；来自菌株牛RF122的(SEQ ID NO:79和80)；来自菌株USA300的(SEQ ID NO:81),来自肺炎链球菌的(Streptococcus pneumoniae)(SEQ ID NO:82)；来自菌株ATCC BAA-255/R6的(SEQ ID NO:83)；来自血清型2，菌株D39/NCTC7466的(SEQ ID NO:84)、来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(血清型M1)的(SEQ ID NO:85)；来自血清型M2，菌株MGAS10270的(SEQ ID NO:86)；来自血清型M4，菌株MGAS10750的(SEQ ID NO:87)；来自血清型M6的(SEQ ID NO:88)；来自血清型M12，菌株MGAS2096的(SEQ ID NO:89和90)；来自血清型M12，菌株MGAS9429的(SEQ ID NO:91)；来自血清型M28的(SEQ ID NO:92)；来自猪链球菌(Streptococcus suis)的(SEQ ID NO:93-95)；来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)(菌株ATCC 700601/ES114(SEQID NO:96))的透明质酸酶，以及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对透明质酸具有特异性并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya,T.and Kaneko,Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198:607)。透明质酸酶也包括人源的那些。示例性人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO:36)、HYAL2(SEQ ID NO:37)、HYAL3(SEQ ID NO:38)、HYAL4(SEQ IDNO:39)和PH20(SEQ ID NO:1)。透明质酸酶也包括可溶性透明质酸，其包括羊和牛PH20、可溶性人PH20以及可溶性rHuPH20。可商购的牛或羊可溶性透明质酸酶为

(羊透明质酸酶)和

(牛透明质酸酶)。

提及的乙酰透明质酸降解酶、透明质酸酶或PH20包括前体乙酰透明质酸降解酶多肽和成熟乙酰透明质酸降解酶多肽(例如已移除其中的信号序列的那些)、其具有活性的截短形式(例如C-端截短形式)，并包括含有与SEQ ID NO:1和10-48、63-65、67-100中所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽的等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其它变体。例如，提及的乙酰透明质酸降解酶(例如PH20)包括在SEQ ID NO:2中所示的成熟的人PH20及其具有活性的截短形式，并包括含有与SEQ ID NO:2具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽的等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其它变体。例如，提及的乙酰透明质酸降解酶也包括SEQ ID NO:50-51所示的人PH20前体多肽变体。乙酰透明质酸降解酶也包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含有化学或翻译后修饰的那些。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和本领域已知的其它多肽修饰。

本文使用的PH20指存在于精子中并且在中性条件下是有活性(neutral-active)的一类透明质酸酶。PH-20存在于精子表面和溶酶体衍生的顶体中，其中PH-20结合至顶体内膜。PH20包括任意来源的PH20，其包括但不限于来源于人、黑猩猩、食蟹猴、罗猴、鼠、牛、羊、豚鼠、兔和大鼠。示例性PH20蛋白包括但不限于：人(在SEQ ID NO:1中所示的前体多肽，在SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽)、牛(SEQ ID NO:11和64)、兔(SEQ ID NO:25)、羊PH20(SEQ ID NO:27、63和65)、食蟹猴(SEQ ID NO:29)、豚鼠(SEQ ID NO:30)、大鼠(SEQ ID NO:31)、小鼠(SEQ ID NO:32)、黑猩猩(SEQ ID NO:185)和罗猴(SEQ ID NO:186)的PH20多肽。提及的PH20包括前体PH20多肽和成熟PH20多肽(如其中信号序列已被移除的PH20多肽)，其具有活性的截短形式，并且包括含有与SEQ ID NO:1、10、25、27、30-31、63-65、185-186所示的前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽的等位基因变体和物种变体，剪接变体编码的变体，以及其它变体。PH20多肽还包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含有化学或翻译后修饰的那些。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和本领域已知的其它多肽修饰。可商购的牛或羊可溶性透明质酸酶的实例是

透明质酸酶(羊透明质酸酶)和

透明质酸酶(牛透明质酸酶)。

本文使用的可溶性透明质酸酶是指这样的多肽：其从细胞分泌，并且不是膜锚定的或结合的，并且因此可以通过它在生理条件下的溶解度来表征。可溶性透明质酸酶可通过例如其分配在加热到37℃的Triton X-114溶液的水相中进行区分(Bordier等人,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)。膜锚定的(例如脂质锚定的)透明质酸酶会分配到富含去污剂的相中，但是用磷脂酶C处理后会分配到去污剂含量少的相中或水相中。可溶性透明质酸酶包括这样的膜锚定的透明质酸酶，其中一个或多个与透明质酸酶与膜的锚定相关的区域已被移除或修饰，其中该可溶性形式保留透明质酸酶活性。因此，可溶性透明质酸酶(诸如可溶性PH20多肽)包括其截短形式，例如，C-端截短形式，其中糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的一个或多个氨基酸缺失。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶和包含于天然来源或纯化自天然来源的那些，例如来自绵羊或牛的睾丸提取物的那些。这样的示例性可溶性透明质酸酶的是可溶性人PH20。其它可溶性透明质酸酶包括羊(SEQ ID NO:27、63、65)和牛(SEQID NO:11、64)的PH20。

本文使用的可溶性人PH20或sHuPH20包括成熟PH20多肽，所述多肽在C-端缺乏全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点，使得在其表达后，所述多肽不与产生它们的宿主细胞的膜结合，使得它们被分泌，并因而可溶于细胞培养基中。因此，可溶性人PH20包括C-端截短的人PH20多肽。示例性可溶性的或C-端截短的PH20多肽包括：具有在SEQ ID NO:4-9、47-48、234-254和267-273中任一个所示的氨基酸序列的成熟多肽，或表现出与SEQ IDNO:4-9、47-48、234-254和267-273中任一个的至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。示例性sHuPH20多肽包括具有在SEQ ID NO:4-9和47-48中任一个所示的氨基酸序列的成熟多肽。这样的示例性sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。示例性前体为SEQ IDNO:3和40-46所示的那些，其各自在氨基酸位点1-35处包含35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽也包括在本文所述的生产和纯化方法期间或之后降解的那些。

本文使用的重组人PH20(其被称作rHuPH20)是指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达的分泌的人PH20的可溶形式。可溶性rHuPH20是由这样的核酸产生的产物：所述核酸编码信号序列，诸如天然信号序列，并且其包括编码氨基酸36-482的核酸，并且其示例性序列(包括编码天然信号序列的核酸)在SEQ ID NO:49中显示。也包括作为其等位基因变体和其它可溶性变体的DNA分子。编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌所述成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中制备时，在C-端存在异质性使得该产物包含不同种类(species)的混合物，其可以包含多种丰度的SEQ ID NO：4-9中的任意一个或多个。也包括相应的等位基因变体和其它变体，包括对应于SEQ ID NO:50-51中所示前体人PH20多肽的那些。其它变体可与SEQ ID NO:4-9和47-48中任一个具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性，只要它们保留透明质酸酶活性并且为可溶的。

本文使用的“超速效胰岛素组合物”是指这样的胰岛素组合物：其包含速效胰岛素(特别是速效胰岛素类似物，诸如具有更快开始的胰岛素的胰岛素类似物)和乙酰透明质酸降解酶(例如但不限于，rHuPH20制剂)，使得所述胰岛素组合物在胃肠外向个体给药以后前40分钟内在个体中所提供的累积全身性胰岛素暴露大于在没有乙酰透明质酸降解酶存在下通过相同途径给药相同剂量的速效胰岛素以后在相同时段内提供给个体的累积全身性胰岛素暴露。所述超速效胰岛素组合物可任选地包含基础作用胰岛素。

本文使用的制剂是指包含至少一种活性剂或药物和一种或多种赋形剂的组合物。

本文使用的复合制剂是指包含2种或更多种活性剂或药物和一种或多种赋形剂的组合物。例如，速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂包含速效胰岛素、乙酰透明质酸降解酶和一种或多种赋形剂。

如果与初始活性和/或纯度和/或效能或回收相比，本文使用的组合物中的活性成分至少保留必要的活性和/或纯度和/或效能或回收的水平，则称作所述组合物在限定的条件下是稳定的。为了本文中的目的，如果组合物保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性，和/或如果组合物保留至少90％的胰岛素效能或回收和/或至少90％的胰岛素纯度，则所述组合物是稳定的。

在下述情况下，本文使用的包含至少2种活性成分的稳定复合制剂是稳定的：与初始活性和/或纯度和/或效能或回收相比，每种活性成分至少保留必要的活性和/或纯度和/或效能或回收的水平。为了本文中的目的，如果复合制剂保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性，和/或如果复合制剂保留至少90％的胰岛素效能或回收和/或至少90％的胰岛素纯度，则所述复合制剂是稳定的。

本文使用的限定的条件是指储存和/或使用的条件。

本文使用的“储存”是意指没有在制备后立即向个体给药制剂，而是在使用前将其在特定条件(例如特定温度、时间、液体或低压冻干形式)下保存一段时间。例如，在向个体给药之前，可以在不同温度(诸如冷藏(0℃-10℃，诸如2℃-8℃)、室温(例如温度高达32℃，诸如18℃至约或在32℃)或升高的温度(例如30℃-42℃，诸如32℃-37℃或35℃-37℃))下将液体制剂保存数天、数周、数月或数年。

关于与稳定性有关的条件在本文中使用的“使用”是指为了特定目的而采用制剂的动作。特定应用可以影响蛋白质或试剂的活性或性质。例如，某些应用可以要求，使所述制剂处于特定温度持续特定时间，使其处于波动的温度和/或处于搅拌、摇动、搅动或其它类似的可影响活性剂的稳定性(例如活性和/或溶解度)的运动下。示例性条件是连续输注方法，其中在数天将活性剂从与使用者连接的泵或注入器向个体连续地输注。这样的条件可以与搅拌和温度波动有关。

本文使用的为储存或使用的限定的条件(在该条件下测量稳定性)包括温度条件、储存时间条件和/或使用条件。例如，限定的温度条件包括2℃-8℃的低温或冷藏温度、20℃-30℃的环境温度或32℃-40℃的升高的温度。在另一实例中，限定的时间条件是指在变化的温度条件下储存的持续时间，诸如储存数天(至少3天、4天、5天、6天或7天)、数周(至少1周、至少2周、至少3周或至少4周)或数月(至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、18个月、24个月或更久)。在另一实例中，限定的使用条件表示搅乱或改变组合物混合物的条件，诸如搅拌条件。

本文使用的单一剂量制剂是指用于直接给药的制剂或复合制剂。通常，单一剂量制剂是这样的制剂：其包含用于直接给药的单剂量的治疗剂。单一剂量制剂通常不包含任何防腐剂。

本文使用的多剂量制剂是指这样的制剂：其包含多剂量的治疗剂，并且可以将其直接给药以提供数次单剂量的治疗剂。可以在数分钟、数小时、数周、数天或数月内给药所述剂量。多剂量制剂可进行剂量调节、剂量合并和/或剂量分拆。因为多剂量制剂在一段时间内使用，它们通常包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长。可将多剂量制剂配制用于注射或输注(例如连续输注)。

本文使用的“稳定的多剂量注射(MDI)复合制剂”是指这样的稳定复合制剂：其在为或约为2℃-8℃的温度稳定持续至少6个月，和/或在为或约为20℃-30℃的温度稳定持续至少14天，使得与初始活性和/或纯度和/或效能或回收相比，在限定的时间和温度内保留必要的活性和/或纯度和/或效能或回收的水平。例如，稳定的多剂量注射剂在为或约为2℃-8℃的温度保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性和至少90％的胰岛素效能或回收和/或至少90％的胰岛素纯度持续至少6个月，和/或在为或约为20℃-30℃的温度保留持续至少14天。

本文使用的“稳定的连续胰岛素输注制剂”是指这样的稳定复合制剂：其在为或约为32℃-40℃的温度稳定持续至少3天，使得与初始活性和/或纯度和/或效能或回收相比，在限定的时间和温度内保留必要的活性和/或纯度和/或效能或回收的水平。例如，稳定的连续胰岛素输注制剂在为或约为32℃-40℃的温度保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性和至少90％的胰岛素效能或回收和/或至少90％的胰岛素纯度持续至少3天。

本文使用的连续皮下胰岛素输注(CSII)疗法是指这样的胰岛素给药方案：其中以程序化的速率在数天的时程内从小注入器或泵通过连接至泵的输注装置皮下给药胰岛素。通常，在必须更换输注装置和泵容器之前，CSII疗法持续2-4天。所述治疗将连续基线胰岛素释放(基线速率)和餐前的以及响应于高血糖值的额外胰岛素推注剂量(即校正推注)相结合。CSII疗法通常使用电池驱动的注射器驱动器、胰岛素泵或其它相似的装置来根据给药方案递送速效胰岛素，特别是胰岛素类似物。通常，由医师针对每位患者来设定连续基线胰岛素释放的计划安排。基于膳食需求和血糖应答来确定推注剂量。因此，CSII疗法是患者特异性的。根据患者的需要和其它患者特异性的参数(诸如患者的重量、年龄、锻炼、饮食和临床症状)而为每位患者确定特定胰岛素给药方案，完全是在熟练的医师和患者的水平内。

本文使用的稳定剂是指这样的化合物：将其加入制剂中，在诸如储存或使用本文所述复合制剂的盐、pH和温度的条件下保护乙酰透明质酸降解酶或胰岛素或二者免于降解。因此，包括防止蛋白质由于组合物中的其它组分而降解的试剂。这样的试剂的实例是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂、抑制剂或底物以及如本文中所述的其它试剂。

本文使用的赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys或二赖氨酸)是指Lys-Lys二肽、其盐、衍生物、类似物或模拟物。例如，提及的Lys-Lys包括其盐，诸如Lys-Lys的二盐酸盐，即Lys-Lys二盐酸盐(或二赖氨酸二盐酸盐；H-Lys-Lys-OH HCl)。Lys-Lys二盐酸盐由下式表示：

提及的Lys-Lys也包括其衍生物，诸如含有保护基(诸如Fmoc-、Noc-或Cbz)的衍生物。可商购的Lys-Lys二盐酸盐的实例包括但不限于可从Sigma Aldrich、RnD Chem.、MPBio、Tetrahedron Scientific Inc.和Crescent Chemical Company得到的那些。示例性可商购的Lys-Lys二盐酸盐是可从Sigma Aldrich(产品编号L5502)或RnD Chem(产品编号G-2675)得到的Lys-Lys二盐酸盐。

本文使用的抗微生物有效性试验证实产品中的防腐剂系统的有效性。将产品接种受控量的特定生物体。然后在该试验中对比在28天的时间内与试验样品相比在对照样品中发现的微生物水平。用于进行抗微生物有效性试验的参数是如本文中所述的领域的技术人员已知的。

本文使用的防腐剂的抗微生物(anti-microbially)或抗微生物(anti-microbial)有效量是指防腐剂杀死样品中的微生物生物体或抑制其繁殖的量，所述微生物生物体在储存或使用时引入。例如，对于多剂量容器，抗微生物有效量的防腐剂抑制可能由重复抽取单个剂量引入的微生物的生长。USP和EP(EPA和EPB)具有决定防腐剂有效性并且严格性可变的抗微生物要求。例如，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量：其在抗微生物防腐剂有效性试验(APET)中使得在接种后7天细菌生物体减少至少1.0log₁₀单位。在一特定实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量：其使得在接种后7天细菌生物体减少产生至少1.0log₁₀单位，在接种后14天细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位的，在接种后28天至少细菌生物体没有进一步增加；和在接种后7天以后至少真菌生物体没有增加。在另一实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量：其使得在接种后24小时细菌生物体减少至少1.0log₁₀单位，在接种后7天细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位，在接种后28天细菌生物体没有进一步增加，在接种后14天真菌生物体减少至少1.0log₁₀单位，并且在接种后28天至少真菌生物体没有进一步增加。在另一实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量：其使得在接种后6小时细菌生物体减少至少2.0log₁₀单位，在接种后24小时细菌生物体减少至少3.0log₁₀单位，在给所述组合物接种微生物接种物以后28天后没有细菌生物体的回收，在接种后7天真菌生物体减少至少2.0log₁₀单位，并且在接种后28天真菌生物体至少没有进一步增加。

本文使用的“赋形剂”是指当在没有活性剂存在下给药时，不提供活性剂的生物学效应的活性剂制剂中的化合物。示例性赋形剂包括但不限于：盐、缓冲剂、稳定剂、张力调节剂、金属、聚合物、表面活性剂、防腐剂、氨基酸和糖。

本文使用的“缓冲剂”是指这样的物质，其通常是溶液：尽管存在强酸或强碱的加入和温度、压力、体积或氧化还原电位的外部影响，其可保持它的pH稳定。缓冲剂防止另外的化学物质(例如质子供体和受体系统)的浓度的变化，以防止氢离子浓度(pH)的显著变化。所有缓冲剂的pH值是温度和浓度依赖性的。用于维持pH值或pH范围的缓冲剂的选择，可以由本领域技术人员根据经验基于已知缓冲剂的已知缓冲能力来确定。示例性缓冲剂包括但不限于：碳酸氢盐缓冲剂、二甲基胂酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris缓冲剂。例如，Tris缓冲剂(氨丁三醇)是胺系缓冲剂，其具有8.06的pKa，并且具有在7.9-9.2的有效pH范围。对于Tris缓冲剂，温度每降低1℃，pH增加约0.03单位，每稀释10倍，pH减小0.03-0.05单位。

本文使用的活性指与全长(完整)蛋白质相关的多肽或其部分的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于催化活性或酶活性、抗原性(与多肽结合或竞争以结合抗-多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异结合至所述多肽的受体或配体的能力。

本文使用的透明质酸酶活性是指酶催化透明质酸裂解的能力。美国药典(USP)XXII透明质酸酶的测定通过测量较大分子量的透明质酸或乙酰透明质酸，即使酶与HA在37℃反应30分钟后剩余的(HA)底物，来间接测定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention,Inc,Rockville,MD)。在测定中可使用参比标准溶液以确定任意透明质酸酶的相对活性(以单位计)。测定例如可溶性rHuPH20的透明质酸酶的透明质酸酶活性的体外测定法为本领域已知的并在本文中描述。示例性测定法包括下文描述的微浊度测定法(参见例如实施例2)，其通过检测当未裂解的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀来间接测量透明质酸酶对透明质酸的裂解。例如可使用参比标准品生成标准曲线以测定被测透明质酸酶的活性(以单位计)。

本文使用的关于乙酰透明质酸降解酶的“功能等价量”或其语法变体，是指达到与一定量(例如已知数值的单位透明质酸酶活性)的参比酶(例如透明质酸酶)相同作用的乙酰透明质酸降解酶的量。例如，可将任意乙酰透明质酸降解酶的活性与rHuPH20的活性比较，以测定会达到与已知量的rHuPH20相同作用的乙酰透明质酸降解酶的功能等价量。例如，乙酰透明质酸降解酶作为铺展(spreading)剂或扩散剂的能力可通过将其与锥虫蓝一起注射入小鼠的侧面皮肤来进行评价(参见例如第20050260186号美国专利公开)，并且可测定达到与例如100单位透明质酸酶参比标准品相同的扩散量所需的乙酰透明质酸降解酶的量。因此，所需的乙酰透明质酸降解酶的量功能上等价于100单位。在另一实例中，可在人类个体中评价乙酰透明质酸降解酶增加联合给药的胰岛素的水平和吸收速率的能力(如下文实施例1中所述)，并且可测定达到与例如所给药量的rHuPH20相同的胰岛素水平和吸收速率的增加所需的乙酰透明质酸降解酶的量(例如通过测定最大血胰岛素浓度(C_max)、达到最大血胰岛素浓度所需的时间(t_max)和经给定时间内的累积全身胰岛素暴露(AUC))。

本文使用的天然存在的α-氨基酸的残基为那些自然界发现的20个α-氨基酸的残基，其通过人体中运载的(charged)tRNA分子与其同族的mRNA密码子的特异性识别而并入蛋白质中。

本文使用的核酸包括DNA、RNA及其类似物，其包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可为单链或双链的。当其指探针或引物(其任选地被例如可检测标记(如荧光或放射标记)进行标记)时，涵盖单链分子。这些分子通常具有的长度使得在用于探针或引导文库时它们的靶点是统计学上独特的或具有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)。通常探针或引物包含至少14、16或30个与关注的基因互补或相同的连续核苷酸序列。探针和引物的长度可为10、20、30、50、100或更多个核酸。

本文使用的肽是指长度大于或等于两个氨基酸，并且长度小于或等于40个氨基酸的多肽。

本文使用的出现在本文提供的多种氨基酸序列中的氨基酸根据它们已知的三字母或单字母缩写(表1)进行识别。出现在多种核酸片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准的单字母名称进行命名。

本文使用的“氨基酸”为含有氨基和羧基的有机化合物。多肽包含两个或更多个氨基酸。用于本文目的，氨基酸包括二十个天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中的α-碳具有侧链的氨基酸)。

本文使用的“氨基酸残基”指多肽在其肽键处的化学消化(水解)时形成的氨基酸。假定本文描述的氨基酸残基为“L”异构形式。如此命名的“D”异构形式的残基可由任意L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留期望的功能性质。NH₂是指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游离羧基。为了与J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中描述并在37 C.F.

§§1.821-1.822中采用的标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写如表1所示。

表1–对照表

本文以表达式显示的所有氨基酸残基序列在从氨基端到羧基端的常规方向中具有从左到右的定向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对照表(表1)中列出的氨基酸以及经修饰的和稀有的氨基酸，例如37 C.F.R.§§1.821-1.822中提到的那些，并通过援引将其加入本文。此外，氨基酸残基序列的开头或结尾处的破折号表示肽键，其与一个或多个氨基酸残基的其它序列连接，或者与例如NH₂的氨基端基团或与例如COOH的羧基端基团连接。

本文使用的“天然氨基酸”指出现在多肽中的20种L-氨基酸。

本文使用的“非天然氨基酸”指具有与天然氨基酸相似的结构但是经结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此非天然氨基酸包括例如除所述20种天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸在本文描述并是本领域技术人员已知的。

本文使用的DNA构建体为包含以自然界不存在的方式结合和并列的DNA区段的单链或双链、线性或环状的DNA分子。DNA构建体由于人为操作而产生，并包括所操作分子的克隆和其它拷贝。

本文使用的DNA区段为较大DNA分子的具有特定属性的部分。例如编码特定多肽的DNA区段为较长DNA分子的部分，例如质粒或质粒片段，当从5’-3’方向阅读时其编码所述特定多肽的氨基酸序列。

本文使用的术语多核苷酸意指从5’-3’端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可分离自天然来源、在体外合成或由天然和合成分子的组合制备。本文以核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(“缩写为bp”)的方式给出多核苷酸分子的长度。当上下文允许时将术语核苷酸用于单链和双链分子。当将该术语用于双链分子时，其用于表示长度并理解为等价于术语碱基对。本领域技术人员会意识到双链多核苷酸的两条链的长度可略有差异并因此这些末端可为交错的；因此双链多核苷酸分子中的核苷酸可以不全是配对的。这些未配对末端的长度一般不会超多20个核苷酸。

本文使用的两个蛋白质或核酸之间的“相似性”是指所述蛋白质的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可基于残基序列及其中所包含残基的相同性和/或同源性的程度。评价蛋白质或核酸之间相似性的程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一种评价序列相似性的方法中，以得到序列之间最大相同性水平的方式比对两个氨基酸或核苷酸序列。

本文使用的“相同性”是指氨基酸或核苷酸序列无变化的程度。氨基酸序列的比对以及某种程度上核苷酸序列的比对，也可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守性差异和/或经常性取代。保守性差异是那些保持所涉及残基的理化性质的差异。比对可为全局性的(所比对序列在这些序列全长上的比对并包括所有残基)或局部性的(仅包括最相似的一个或多个区域的部分序列的比对)。“相同性”本身具有本领域认可的含义并可采用已公开的技术计算。(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,NewYork,1991)。尽管存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”为本领域技术人员熟知的(Carrillo,H.&Lipton,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。

本文使用的同源的(就核酸和/或氨基酸序列而言)意指约大于或等于25％的序列同源性，通常大于或等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列同源性；必要时可指定精确的百分数。用于本文目的，除非另外说明，术语“同源性”和“相同性”通常可替换使用。一般而言，为了测定同源性或相同性百分数，将序列进行比对以得到最高等级的匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,NewYork,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。就序列同源性而言，保守氨基酸的数量通过标准比对算法程序来测定，并且可与各供应商建立的默认空位罚分(gap penalties)一起使用。基本上同源的核酸分子通常会沿着关注的核酸的长度以中等的严格性或高度的严格性杂交。也涵盖含有取代杂交核酸分子中密码子的简并密码子的核酸分子。

任意两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列可使用已知的计算机算法例如"FASTA"程序，使用例如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中的默认参数来测定(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research12(I):387(1984)),BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul,S.F.,等人,J Molec Biol 215:403(1990))；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,编,Academic Press,San Diego,1994,和Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，National Center forBiotechnology Information数据库的BLAST功能可用于测定相同性。其它可商购的或可公开获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison,WI)和University of WisconsinGenetics Computer Group(UWG)"Gap"程序(Madison WI)。蛋白质和/或氨基酸分子的同源性或相同性百分数可通过例如使用GAP计算机程序(例如Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443,由Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482修改)比较序列信息来测定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列的符号的总数。用于GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(comparison matrix)(包括相同为数值1，不相同为0)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff,编,ATLAS OF PROTEINSEQUENCE AND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每一个空位罚分3.0和每一个空位中每一个符号另外罚分0.10；以及(3)末尾空位不罚分。

因此，本文使用的术语“相同性”或“同源性”表示待测和参比多肽或多核苷酸之间的比较。本文使用的术语至少“90％相同性”是指相对于多肽的参比核酸或氨基酸序列90-100％的相同性百分数。90％或更高水平的相同性表明下列事实：假设为了举例说明，比较长度为100个氨基酸的待测和参比多肽，待测多肽中不多于10％(即100中的10个)的氨基酸与参比多肽的不同。可在待测和参比多核苷酸之间进行相似的比较。这些差异可表现为随机分布在多肽全长中的点突变，或者它们聚集在长度变化的一个或多个位置，所述长度变化可长至最大允许的值，例如10/100氨基酸差异(约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在同源性或相同性大于约85-90％的水平时，该结果应不依赖于程序或所设定的空位参数；这样的高水平相同性可容易地进行评价，通常通过手工比对而不依赖于软件。

本文使用的被比对的序列指使用同源性(相似性和/或相同性)比对核苷酸或氨基酸序列中的对应位点。通常，比对由50％或更高相同性相关联的两个或多个序列。序列的比对集合指在对应位置比对的2个或多个序列并可包括比对衍生自RNA的序列，例如与基因组DNA序列比对的EST和cDNA。

本文使用的与产物基本相同指足够相似，从而使关注的性质基本未改变，使得该基本相同的产物可替代该产物使用。

如本文使用的，也应理解术语“基本相同”或“相似”如相关领域技术人员所理解随上下文变化。

本文使用的等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种中的任意可替换形式。等位基因变异通过突变自然产生并可在群体中引起表型多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。本文也使用术语“等位基因变体”以表示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。通常基因的参比形式编码来自物种的群体或单一参比成员的多肽的野生型和/或主要形式。通常，包括物种间或物种内变体的等位基因变体通常与来自相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80％、90％或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取决于该基因以及比较为物种间还是物种内。一般地，物种内等位基因变体与多肽的野生型和/或主要形式具有至少约80％、85％、90％或95％相同性或更高，包括与多肽的野生型和/或主要形式具有96％、97％、98％、99％或更高的相同性。本文提及等位基因变体一般指相同物种成员之间的蛋白质中的变异。

如本文使用的，在本文中与“等位基因变体”可互换使用的“等位基因”是指基因或其部分的可替换形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当个体具有基因的两个相同等位基因时，认为该个体就该基因或等位基因而言是纯合的。当个体具有基因的两个不同等位基因时，认为该个体就该基因而言是杂合的。具体基因的等位基因可在单个核苷酸或数个核苷酸上彼此不同，并且可包括例如核苷酸取代、缺失和插入的修饰。基因的等位基因也可为包含突变的基因形式。

本文使用的物种变体是指不同物种(包括不同的哺乳动物物种，例如小鼠和人)之间的多肽的变体。

本文使用的修饰分别指多肽的氨基酸序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，并且其包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和替代。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，例如通过使用重组DNA方法。

本文使用的分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物活性部分为基本不含来自于产生该蛋白质的细胞或组织的细胞物质或其它污染性蛋白质，或者当其为化学合成的时基本不含化学前体或其它化学品。如果制剂表现为不含用标准分析方法(如本领域技术人员用来评价纯度的薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC))可容易检测的杂质，则它们可被确定为基本上不含该杂质，或者足够纯以致于进一步纯化不能可检测地改变该物质的物理和化学性质，例如酶活性和生物学活性。用于纯化化合物以制备基本化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可为立体异构体的混合物。在这些情况下，进一步纯化可增加该化合物的比活。

术语基本不含细胞物质包括其中的蛋白质与细胞的细胞组分分离的蛋白制剂，该蛋白从所述细胞中分离或者在该细胞中重组制备。在一个实施方案中，术语基本不含细胞物质包括含有小于约30％(以干重计)非酶蛋白质(本文也称作污染性蛋白)，一般小于约20％非酶蛋白质或10％非酶蛋白质或小于约5％非酶蛋白质的酶蛋白的制剂。当该酶蛋白为重组制备时，它也基本不含培养基，即，以该酶蛋白制剂的体积计，培养基小于或约为20％、10％或5％或者约为20％、10％或5％。

本文使用的术语基本不含化学前体或其它化学品包括酶蛋白的制剂，其中所述蛋白质从所述蛋白质的合成中涉及的化学前体或其它化学品分离。该术语包括含有小于约30％(以干重计)、20％、10％、5％或更少的化学前体、非酶化合物或组分的酶蛋白制剂。

如本文使用的，当提及合成的(例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽)时，其指通过重组方法和/或通过化学合成方法制备的核酸分子或多肽分子。

如本文使用的，通过使用重组DNA方法制备意指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆DNA编码的蛋白质。

本文使用的载体(或质粒)是指为了异源核酸的表达或复制而将其引入细胞中所使用的分离的元件(element)。这些载体通常保持为附加体，但是可经设计实现将基因或其部分整合入基因组的染色体中。也涵盖作为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和使用为本领域技术人员所熟知。

本文使用的表达载体包括能够表达通过操作(operatively)与调控序列连接的DNA的载体，所述调节序列(例如启动子区)能够实现这些DNA片段的表达操作。这些额外的区段可含有启动子和终止子序列，并可任选地含有一个或多个复制起点、一个或多个可选择的标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以包含二者的元件。因此，表达载体指在引入合适的宿主细胞后可引起克隆的DNA表达的重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体。适合的表达载体为本领域技术人员所熟知并包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些以及保持为附加体的那些或整合入宿主细胞基因组的那些。

本文使用的载体也包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒载体为通过与异源基因操作连接以将所述异源基因转移(作为载体或穿梭质粒(shuttle))进细胞的工程化病毒。

如本文使用的，当提及DNA区段时，可操作地或可操作地连接意指该区段经排列使得它们为了其预期目的一致发挥功能，例如转录起始启动子下游和任意已转录序列的上游。所述启动子通常为转录机结合的结构域以起始转录并沿着编码区段前进到达终止子。

本文使用的术语评价，就获得存在于样品中的蛋白酶或其结构域的活性的绝对值以及就获得表明该活性的水平的指数、比例、百分数、直观的或其它数值指示而言，意指包括定量和定性测定。评价可以是直接的或间接的，并且实际检测的化学物质本身不一定是蛋白酶解产物但可以是例如其衍生物或一些另外的物质。例如，通过例如SDS-PAGE和考马斯蓝蛋白质染色检测补体蛋白的裂解产物。

本文使用的生物活性指化合物的体内活性或体内给药化合物、组合物或其它混合物后引起的生理学响应。因此生物学活性涵盖这些化合物、组合物和混合物的疗效和药物活性。可在设计用于试验或使用这些活性剂的体外系统中观察生物活性。因此，用于本文目的，蛋白酶的生物学活性为它的催化活性，多肽因之被水解。

如本文使用，当提及两个核酸序列时，等同(等同物)意指所讨论的两个序列编码相同的氨基酸序列或等同的蛋白。当等同(等同物)用于指两个蛋白质或肽时，其意指这两个蛋白质或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本不改变该蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸取代。当等同指性质时，该性质不一定以相同的程度存在(例如，两个肽可显示相同类型的酶活性的不同速率)，但是所述活性通常是基本相同的。

本文使用的组合物指任意混合物。其可为溶液剂、混悬剂、液体制剂、散剂、糊剂、水性制剂、非水性制剂或其任意组合。

本文使用的组合(combination)指两个或多个项目之间的任意关联。所述组合可为两个或多个分离的项目，例如两种组合物或两个集合，可为其混合物，例如两个或多个项目的单一混合物或其任意变型。组合的要素通常在功能上关联或相关。

本文使用的“疾病或病症”指由包括但不限于感染、获得性病况、遗传病况的病因或病况引起的生物体的病理状态，其以可识别的症状为特征。本文所关注的疾病和病症包括糖尿病。

本文使用的“治疗”患有疾病或病症的个体意指该个体的症状得到部分或全部缓解，或在治疗后保持稳定。因此，治疗涵盖预防、治疗和/或治愈。预防指防止可能的疾病和/或防止症状的恶化或疾病的进展。治疗也涵盖本文提供的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂的任意药物用途。

本文使用的药学上有效的药剂包括任意治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物包括小分子药物和治疗性蛋白质。

本文使用的治疗意指其中缓解或者有利地改变病况、病症或疾病或其它适应症的症状的任意方式。

本文使用的疗效意指对个体的治疗引起的作用，所述治疗改变(通常为改善或缓解)疾病或病症的症状或者治愈疾病或病症。治疗有效量指在向个体给药后引起疗效的组合物、分子或化合物的量。

本文使用的术语“个体”指动物，其包括哺乳动物，例如人。

本文使用的患者指显示出疾病或病症的症状的人类个体。

本文使用的通过治疗(例如通过给药药物组合物或其它治疗剂)缓解具体疾病或病症的症状，指可归因于或与所述组合物或治疗剂的给药相关的所述症状的任意减少(不论是持久的或暂时的，持续的或短暂的)。

本文使用的预防或防止指降低发生疾病或病症的风险的方法。

本文使用的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指药剂、化合物、物质或包含化合物的组合物至少足以产生疗效的量。因此，其为用于预防、治疗、缓解、阻止或部分阻止疾病或病症的症状所必需的量。

本文使用的治疗有效的胰岛素剂量为达到血糖控制所需要的或足以达到血糖控制的胰岛素的量。该量可凭经验确定，例如通过糖负荷或食物负荷。本文提供的组合物包含治疗有效量或治疗有效浓度的胰岛素，从而给药治疗有效剂量。

本文使用的单位剂量形式指如本文领域已知的适用于人或动物个体并单独包装的物理不连续的单位。

本文使用的“制品”为生产和出售的产品。如本申请全文所使用，该术语意在涵盖包含于相同的或单独的包装品(article of packaging)中的速效胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物。

本文使用的流体指任意可流动的组合物。因此流体涵盖为半固体剂、糊剂、溶液剂、水性混合物、凝胶剂、洗剂、乳膏形式的组合物和其它这样的组合物。

本文使用的“药盒”指本文提供的组合物和其它用于包括但不限于复制(reconstitution)、活化的物品(item)、用于递送、给药、诊断和评价生物学活性或性质的仪器/装置的组合。药盒任选包含使用说明。

本文使用的动物包括任意动物，例如但不限于包括人、大猩猩和猴子在内的灵长类动物；啮齿类，例如小鼠和大鼠；家禽，例如鸡；反刍动物，例如山羊、母牛、鹿、绵羊；猪以及其它动物。非人类动物排除人作为所涵盖的动物。本文提供的酶来自任意来源(动物、植物、原核生物和真菌)。大多数酶为动物来源，包括哺乳动物来源。

本文使用的对照指除了未受试验参数处理外与受试样品基本相同的样品，或者，如果其为血浆样品，其可来自未受关注的病症影响的健康志愿者。对照也可为内部对照。

本文使用的单数形式“a”、”an”和“the”包括复数指示物，除非上下文明确另外指明。因此，例如，提及的包含“胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。

本文使用的范围和量可表示为“约”某具体的值或范围。“约”也包括精确的量。因此“约5个碱基”意指“约5个碱基”并且也指“5个碱基”。

本文使用的“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件或情况发生或未发生，并且该描述包括所述事件或条件发生的情况或其未发生的情况。例如，任选地取代的基团意指该基团未被取代或被取代。

除非另外定义，本文使用的任意保护基、氨基酸和其它化合物的缩写与它们的通常用法、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(参见(1972)Biochemistry 11:1726)一致。

B.乙酰透明质酸降解酶制剂和制备胰岛素复合制剂

本文提供乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶，例如PH20)的稳定制剂。通常，乙酰透明质酸降解酶需要相对高的盐以保持酶活性(参见例如第US20110066111号美国专利公开)。现有制剂为了稳定性也包含人血清白蛋白(HSA)。在本文中发现，Lys-Lys和氯化镁(MgCl₂)对乙酰透明质酸降解酶(例如可溶性透明质酸酶，例如PH20)的稳定化胜过NaCl。此外，在Lys-Lys或MgCl₂的存在下，HSA不是必需的，也不需要。本文提供的制剂会提供胜过现有制剂的优点，其包括增加的稳定性，特别是在较高的温度和持续较长的时间。本文提供包含Lys-Lys和/或MgCl₂的稳定制剂。具体地，本文提供包含Lys-Lys作为稳定剂的乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶，例如PH20)的稳定制剂。

乙酰透明质酸降解酶与另外治疗剂的复合制剂也将在多种条件下表现出稳定性。当其它治疗剂的制剂要求与乙酰透明质酸降解酶所需要的制剂要求不同和有时相反时，这可以成为问题。在本文中发现，当混合乙酰透明质酸降解酶和胰岛素的复合制剂时，确实如此。本文提供乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶，例如PH20)和胰岛素(例如速效胰岛素或胰岛素类似物)的稳定复合制剂。

与在乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶)的稳定制剂中发现的那些相比，速效胰岛素的稳定制剂(包括市售制剂)通常包含不同的赋形剂和组分和/或不同浓度的赋形剂和组分(它们是胰岛素的稳定性、溶解度和活性所需要的)。胰岛素和可溶性透明质酸酶的这些经优化的制剂当在复合制剂中混合到一起时是不相容的，使得复合配制的胰岛素和可溶性透明质酸酶的稳定性、溶解度和/或活性大幅降低。这样的不相容性是研发这些药剂的稳定复合制剂的主要障碍。

1.乙酰透明质酸降解酶制剂

乙酰透明质酸降解酶的现有制剂通常包含NaCl，其通常是130mM-150mM的NaCl。例如，

重组体(透明质酸酶人注射液)包含(每mL)8.5mg NaCl(145mM)、1.4mg磷酸氢二钠(9.9mM)、1.0mg人白蛋白、0.9mg依地酸二钠(2.4mM)、0.3mg CaCl₂(2.7mM)和NaOH，所述NaOH用于调节pH至7.4。其它人可溶性透明质酸酶的制剂(诸如在第US2011/0053247号美国专利公开中描述的rHuPH20制剂)包含130mM的NaCl、10mM Hepes、pH 7.0；或10mM组氨酸、130mM的NaCl、pH 6.0。

乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，包括PH20诸如rHuPH20)的制剂包含与胰岛素制剂不同的组分。例如，PH20在pH 5.5-6.5的较低pH值是最稳定的。除了较低pH以外，人透明质酸酶制剂包含比胰岛素制剂更多的NaCl，它们二者会促进蛋白质的稳定性且维持酶活性。并且，人可溶性透明质酸酶制剂(诸如

重组体(透明质酸酶人注射液))迄今为止已经成为单剂量制剂。这样，它们不包含任何防腐剂。

2.速效胰岛素制剂

通常配制速效胰岛素(包括正规胰岛素和速效胰岛素类似物)来优化胰岛素在冷藏温度(例如4℃，诸如用于长期储存)以及升高的温度(例如25℃和30℃)的溶解度、稳定性和纯度。制备制剂以赋予其随时间的稳定性，特别是用于多剂量使用和包装。例如，市售的胰岛素产品(包括

和

)的标签表明，在2-8℃的储存温度至少24个月的稳定性和在25℃或30℃储存下28天的稳定性。并且，认为所述制剂在为或约为37℃的储存温度稳定持续至少6天。

尽管每种胰岛素的最优制剂可以不同，所述制剂通常存在一些共同点。例如，胰岛素制剂通常包含缓冲剂、一种或多种张力调节剂和一种或多种防腐剂。许多速效胰岛素也包含锌，而一些也包含稳定剂。此外，通常在高中性pH(例如7.0-7.8)制备胰岛素制剂。下面的表2显示所选择的4种速效胰岛素(包括1种正规胰岛素和3种速效胰岛素类似物)的市售制剂。

所述速效胰岛素制剂包含防腐剂，所述防腐剂防止通过用于多次给药的重复进入(诸如重复插入针头)而引入制剂中的微生物污染。尽管目前在经批准的胃肠外药物产品中使用许多防腐剂，酚类化合物诸如苯酚、间甲酚(间-甲酚)和对羟基苯甲酸酯最常用于胰岛素制剂中。这些酚类化合物不仅充当有效的抗微生物剂，而且可以结合胰岛素六聚体上的别构部位并改变胰岛素的高级结构的整体构象。这通过抑制丝状聚集体(原纤维)的形成来稳定化六聚体，所述丝状聚集体更容易由胰岛素单体(与六聚体相比)形成(Rahuel-Clermont等人(1997)Biochemistry 36:5837-5845)。尽管这些防腐剂可以充当稳定剂，它们也可以降低胰岛素的溶解度(如果以过高的浓度存在)。因此，胰岛素中的防腐剂的浓度对于药剂的稳定性和溶解度是关键的。

胰岛素制剂中通常包含一种或多种张力调节剂，以调节制剂的等渗性。胰岛素制剂中经常存在的示例性张力调节剂包括甘油和/或NaCl。除了影响等渗性以外，NaCl影响胰岛素的溶解度，使得NaCl浓度的增加会导致降低的溶解度。不同的胰岛素(包括胰岛素类似物)具有不同的表观溶解度。因此，在没有不利地影响溶解度下可以存在于制剂中的NaCl的量将随胰岛素而不同。例如，赖谷胰岛素(例如

赖谷胰岛素)比门冬胰岛素(例如

门冬胰岛素)更可溶，从而在制剂中耐受更多的NaCl。通过对比，赖脯胰岛素和正规胰岛素是具有最低溶解度的速效胰岛素，并且通常在它们的制剂中不包含NaCl。

在胰岛素制剂中还可以包括其它组分。许多胰岛素制剂(包括正规胰岛素、门冬胰岛素和赖脯胰岛素制剂)包含Zn²⁺离子，其会促进和稳定化六聚体的形成。尽管赖谷胰岛素制剂不包含锌，它们包含聚山梨酯20(P20；吐温20)作为蛋白质稳定剂。在速效胰岛素制剂中使用的缓冲剂可以包括，例如磷酸氢二钠缓冲剂和氨丁三醇(也称作Tris或THAM)。

3.乙酰透明质酸降解酶和胰岛素复合制剂

包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶，例如rHuPH20)的组合物产生这样的超速效胰岛素组合物：与单独的速效胰岛素相比，其更接近地模拟非糖尿病个体的内源性(即天然的)餐后胰岛素释放(参见例如第US20090304665号美国公开)。因此，与单独的速效胰岛素相比，糖尿病个体可使用这样的超速效胰岛素组合物更准确地控制血糖水平和缩短高血糖历程，从而向患者提供实质益处。

但是，速效胰岛素的多剂量制剂和乙酰透明质酸降解酶的制剂是不相容的，并且二者的混合通常导致乙酰透明质酸降解酶的稳定性和活性的快速损失以及胰岛素溶解度和稳定性的快速损失。因此，直到现在，超速效组合物的给药必须在将胰岛素和乙酰透明质酸降解酶合并后立即进行，以防止活性的损失。这对于糖尿病患者是不实用的和不可接受的负担。

因此，本文提供速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶，例如rHuPH20)的稳定复合制剂。本文提供的复合制剂可以用作治疗剂用于治疗糖尿病，特别是用于控制餐后血糖水平。所述稳定复合制剂包括为多剂量制剂的那些，所述多剂量制剂可在小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统或其它任意适合的容器中提供。

a.稳定性的相反要求

妨碍胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶(例如rHuPH20))的稳定复合制剂的研发的主要障碍包括，速效胰岛素在冷藏温度的结晶和沉淀，以及乙酰透明质酸降解酶在升高的温度的稳定性。通常，对于两种活性剂而言，通常防止这样的结果的赋形剂和条件是不同的。一些对于维持胰岛素制剂的溶解度和稳定性而言最优的赋形剂和条件可对乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶(例如rHuPH20))的稳定性和活性具有负面作用。相反，对于乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定性而言最优的赋形剂和条件对胰岛素的稳定性和溶解度具有负面作用。

仅仅混合胰岛素(包括速效胰岛素类似物)的现有制剂和可溶性透明质酸酶(诸如rHuPH20)的现有制剂会得到在长期冷藏储存下或在环境温度或升高的温度储存下不稳定的制剂。这是由于rHuPH20的快速聚集和酶活性的损失以及胰岛素活性的损失。这些有害作用是多种不相容的赋形剂和条件(包括但不限于防腐剂的类型和浓度、NaCl浓度、锌浓度、pH和储存温度)的结果。因此，鉴别两种物质在其中保持可溶性、稳定性和活性的制剂是非常挑战性的。

i.防腐剂

在多剂量胰岛素制剂中包含防腐剂以防止微生物污染，所述微生物污染可以通过重复进入小瓶、笔筒或其它含有所述制剂的多剂量容器中而引入所述制剂中。防腐剂通常必须以足够满足管理条例的浓度存在。例如，管理规定主张，制剂的抗微生物效力必须满足目标市场的防腐剂效力试验(PET)的规定。美国药典(USP)和欧洲药典(EP)的PET规定显著不同，从而在研发多剂量制剂时造成另外的约束。

市售的胰岛素制剂通常包含苯酚、间甲酚(间-甲酚)和/或对羟基苯甲酸甲酯。这些化合物不仅充当有效的抗微生物剂，并且可以起稳定化胰岛素分子的六聚体形式的作用。但是，在胰岛素制剂中使用的防腐剂的浓度和类型是重要的。例如，尽管最优浓度的酚类化合物可稳定化六聚体胰岛素分子，胰岛素的溶解度会随着防腐剂浓度的增加而下降。因此，胰岛素制剂中的防腐剂浓度对于稳定性和溶解度以及提供必要抗微生物活性而言是关键性的。

尽管防腐剂是必要组分，由于它们通常会诱导蛋白质在水溶液中的聚集，防腐剂在蛋白质的稳定多剂量制剂的研发中产生显著问题。例如，已经证实防腐剂(诸如苯酚、间甲酚和苄醇)诱导人生长激素(Maa和Hsu(1996)Int.J.Pharm.140:155-168)、重组白介素-1受体(Remmele(1998)Pharm.Res.15:200-208)、人胰岛素-样生长因子I(Fransson(1997)Pharm.Res.14:606-612)、rhIFN-γ(Lam(1997)Pharm.Res.14:725-729)和细胞色素c(Singh等人(2011)J.Pharm Sci.,100:1679-89)的聚集。防腐剂对溶液中的蛋白质的失稳效应已成为多剂量制剂的研发中的一个限制因素，并且迄今为止，已将大多数蛋白治疗剂配制仅用于一次性使用。

像大多数其它蛋白治疗剂，PH20透明质酸酶(诸如rHuPH20)在防腐剂存在下快速损失活性，可能是由于蛋白质的解折叠和随后的聚集体形成。例如，如本文中的实施例所示，防腐剂降低PH20酶活性，特别是当期在升高的温度。本文中的结果通过动态光散射(DLS)、差示扫描量热法(DSC)和其它物理化学表征技术表明，当将酚防腐剂(诸如间甲酚)加入制剂中时，示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20的熔化温度显著下降。例如，rHuPH20的解折叠温度从44℃下降至24℃。较低的PH20解折叠温度导致PH20聚集的增加(特别是在升高的温度)和降低的酶活性。

如上面所指出的，这些酚类化合物(诸如苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸酯)是在胰岛素制剂中常用的防腐剂。失稳效应可能是由于酚防腐剂的疏水性。酚类化合物的疏水性可以通过与蛋白质的非特异性结合而导致与rHuPH20的相互作用，最终扰乱rHuPH20的结构完整性。这造成在防腐剂存在下rHuPH20酶活性的显著损失。

如本文的实施例所证实的，随着酚防腐剂(例如苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯)水平增加和/或温度增加，对rHuPH20酶活性的负面影响也增加。例如，当总防腐剂水平相对较高(>0.2％)时，在35℃孵育1周以后，rHuPH20的酶活性显著降低。在室温和较低防腐剂浓度，所述酶维持它的活性相对较好持续至少1个月。此外，酚类化合物的类型也影响rHuPH20的活性，例如间甲酚是对rHuPH20活性最有害的，其次是苯酚，然后是对羟基苯甲酸甲酯。但是，尽管对羟基苯甲酸甲酯是酚类化合物中对rHuPH20活性的有害性最低的，其作为抗微生物剂也是有效性最低的，因此其不是最优防腐剂。其它防腐剂(诸如硫柳汞和氯己定盐)似乎与rHuPH20更相容，但是未被广泛接受。因此，包含这些非传统防腐剂的制剂面临额外的管理障碍。

防腐剂对示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20酶活性的有害作用在升高的温度会极大地增强。如实施例所示，酚防腐剂对酶的熔化温度(T_m)具有负面作用。例如，rHuPH20的T_m从在没有防腐剂存在下的40℃以上降低至在例如有0.25％的间甲酚存在下的约26℃。因此，当将防腐剂加入到溶液中的rHuPH20时，rHuPH20的T_m显著降低。因此在升高的温度，可溶性透明质酸酶展开。如实施例所示，在防腐剂的存在和升高的温度，这种变性和随后的聚集反映为rHuPH20分子的尺寸增加。

因此，尽管需要防腐剂的抗微生物活性并且它们对于对六聚体胰岛素的稳定化是有用的，但防腐剂可以对乙酰透明质酸降解酶(诸如rHuPH20)的稳定性和活性以及对胰岛素的溶解度具有有害作用。

ii.NaCl和pH

在研发胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)的稳定复合制剂中的另一具体挑战是下述事实：对于胰岛素溶解度而言最优的pH和NaCl浓度范围不同于rHuPH20的最优pH和NaCl浓度范围。例如，胰岛素和胰岛素类似物的溶解度常常随较高pH(例如>7.2)和较低NaCl浓度(例如<140mM)增加，这些条件通常对示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20的稳定性具有有害作用，特别是在升高的温度和经历长期储存。在防腐剂的存在下，该差异甚至进一步加剧，这常常降低胰岛素溶解度和rHuPH20稳定性。

正规胰岛素和速效胰岛素类似物的表观溶解度会变化，溶解度从可溶性最低的正规胰岛素开始增加至赖脯胰岛素，然后是门冬胰岛素，最后是可溶性最高的赖谷胰岛素。溶解度与制剂中的NaCl的容许量直接相关，所以在包含正规胰岛素和赖脯胰岛素的市售溶液中不存在NaCl，在门冬胰岛素的市售制剂中存在少量NaCl(10mM)，并且在赖谷胰岛素的市售制剂中存在更大量的NaCl(85mM)。

增加胰岛素制剂的NaCl浓度可导致胰岛素的结晶/聚集(特别是在较低的温度)。NaCl也极大地影响溶解度。如在实施例中所证实，当冷藏胰岛素溶液的NaCl浓度从50mM增加至140mM时，正规胰岛素、门冬胰岛素和赖脯胰岛素的溶解度显著降低。但是，如在实施例中所证实，对于示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20的稳定性，是相反的。在升高的温度(例如25℃和30℃)下，随着NaCl浓度从140mM降低至50mM，溶液中的rHuPH20的稳定性随时间极大下降。

pH也极大地影响胰岛素的溶解度。类似于较高浓度的NaCl对胰岛素溶解度的影响，通过使pH从7.6降低至6.6，观察到对胰岛素溶解度的类似负面作用。因此，在低pH和高NaCl，胰岛素溶解度极大地下降。相反，胰岛素溶解度在低NaCl和高pH时最大。类似于胰岛素和PH20之间对NaCl浓度的相反要求，对pH的要求也是相反的。在升高的温度(例如25℃和30℃)时，随着pH从7.0增加至7.6，溶液中的rHuPH20的稳定性随时间极大下降。在冷藏温度，不论pH和NaCl浓度如何，rHuPH20是相对稳定的。

因此，对于胰岛素溶解度和乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)稳定性而言最优的NaCl浓度和pH似乎是不相容的。胰岛素溶解度在较高pH和较低NaCl浓度为最大。但是，这些条件对示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20是有害的，所述rHuPH20在较高pH和较低NaCl浓度损失稳定性。通过增加NaCl浓度和降低pH，可以增加rHuPH20的稳定性。但是，这样的条件对胰岛素和胰岛素类似物的溶解度具有负面作用，它们在低pH和高NaCl浓度沉淀。因此，研发胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20或其它乙酰透明质酸降解酶)的稳定复合制剂的主要挑战之一是，确定这样的NaCl浓度和pH：其中胰岛素保持可溶性和活性，并且乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)保持稳定性和活性。这已经在本文中实现。

b.相容的复合制剂

胰岛素和透明质酸酶(诸如PH20透明质酸酶)的稳定性的相反要求意味着，必须平衡数个参数以优化其在复合制剂中的相容性。本文提供的稳定复合制剂包含防腐剂、盐(例如NaCl)、pH、一种或多种稳定剂和/或缓冲剂的所需平衡以保留可接受水平的乙酰透明质酸降解酶活性和胰岛素溶解度和活性。如以上所讨论的，确定该平衡的挑战是数倍。在第一种情况下，在多剂量制剂中作为抗细菌剂所需要的防腐剂(诸如酚防腐剂)对乙酰透明质酸降解酶(诸如rHuPH20)具有显著失稳效应，从而导致活性的快速损失。其次，与对于乙酰透明质酸降解酶的稳定性而言最优的NaCl浓度和pH相比，对于胰岛素溶解度和稳定性而言最优的NaCl浓度和pH是非常不同的。胰岛素溶解度在较高pH和较低NaCl浓度为最大。但是，这些条件对示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20是有害的，所述rHuPH20在较高pH和较低盐浓度损失稳定性。在有防腐剂存在下，rHuPH20的这种不稳定性甚至进一步加剧。通过增加NaCl浓度和降低pH，可以增加rHuPH20的稳定性。但是，这样的条件对胰岛素和胰岛素类似物的溶解度具有负面作用，它们在低pH和高盐浓度沉淀。

因此，确定乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素在其中保持可溶性、稳定性和活性的条件是非常挑战性的。尽管如此，本文提供的复合制剂提供这些条件。不仅确定了最优的盐(例如NaCl)、pH和防腐剂组合，并且确定了其它稳定剂和缓冲剂，当它们彼此组合时，并且在某些情况下，所述的盐、pH和防腐剂进一步稳定化乙酰透明质酸降解酶和胰岛素，并且维持胰岛素的溶解度。例如，在本文中发现，Lys-Lys是这样的稳定剂：其在一些情况下，并且与一些胰岛素类似物一起，可以用作NaCl的替代物，使得在制剂中可以不使用NaCl或使用较低浓度的NaCl，同时保留酶活性和胰岛素溶解度。

以下部分描述用于包含在制剂或复合制剂中的示例性乙酰透明质酸降解酶和胰岛素、示例性稳定制剂和复合制剂、评价制剂和复合制剂的稳定性和活性的方法以及在多种疾病和病症中使用制剂或复合制剂的方法。

C.乙酰透明质酸降解酶

本文提供乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂。本文还提供包含胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的稳定复合制剂。例如，本文中的描述和实施例表明，尽管对于稳定性和活性，胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶)各自单独地具有相反要求，但可以制备它们的稳定复合制剂。这在本文中用PH20(例如rHuPH20)进行例证，但是可以推广至其它乙酰透明质酸降解酶，诸如可溶性透明质酸酶或其它PH20多肽。

具体地，本文提供包含乙酰透明质酸降解酶的制剂或复合制剂，所述乙酰透明质酸降解酶是透明质酸酶，诸如缺少全部或部分GPI锚基序的截短透明质酸酶(例如C-端截短的)。这样的透明质酸酶多肽可以重组地表达并且在从细胞表达后从细胞分泌入培养基中。通过分泌入培养基中，通常与细胞膜结合的透明质酸酶在被截短时可以作为可溶性蛋白质产物的形式存在。制备和/或表达本文提供的或本领域已知的乙酰透明质酸降解酶以及制备基于本文的描述和教导的稳定制剂或复合制剂，是在本领域技术人员的水平内。

乙酰透明质酸降解酶用作通过裂解透明质酸聚合物来降解透明质酸，该聚合物由通过交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起的重复二糖单位(D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc))组成。透明质酸链的长度可达到约25,000或更多的二糖重复，并且体内透明质酸聚合物的大小可约为5,000-20,000,000Da。乙酰透明质酸(hyaluronan)也称作透明质酸(hyaluronic acid)或透明质酸盐(hyaluronate)，为广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织的非硫酸化糖胺聚糖。透明质酸为胞外基质的重要组分，并且是间质屏障的主要成分。通过催化透明质酸的水解，乙酰透明质酸降解酶降低透明质酸的粘性，由此增加组织渗透性并增加胃肠外给药的液体的吸收速率。因此，已将乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)作为扩散剂或分散剂与其它药剂、药物和蛋白质一起使用以增强它们的分散和递送。

因此，乙酰透明质酸降解酶包括任意具有催化透明质酸二糖链或聚合物裂解的能力的酶。在一些实例中，所述降解酶裂解透明质酸链或聚合物中的β-1→4糖苷键。在其它实例中，所述降解酶催化透明质酸链或聚合物中的β-1→3糖苷键的裂解。本文提供的复合制剂中的示例性乙酰透明质酸降解酶是，当从细胞表达系统表达时分泌入培养基中的透明质酸酶，其包括不含有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的天然透明质酸酶或缺少GPI锚的一个或多个氨基酸的截短透明质酸酶或当从细胞表达时不与细胞膜结合的透明质酸酶。可以重组地或合成地制备这样的透明质酸酶。其它示例性乙酰透明质酸降解酶包括但不限于：具有裂解透明质酸的能力的特定软骨素酶和裂解酶。

在本文的复合制剂中提供的乙酰透明质酸降解酶也包括如本文中所述的乙酰透明质酸降解酶的等位基因变体或物种变体或其它变体。例如，乙酰透明质酸降解酶可在其一级序列中包含一个或多个变异，例如氨基酸取代、添加和/或缺失。与不包含所述变异的乙酰透明质酸降解酶相比，乙酰透明质酸降解酶的变体一般显示至少为或约为60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。用于本文目的的乙酰透明质酸降解酶中可包含任意变异，条件是该酶保留透明质酸酶活性，例如至少为或者约为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的不含所述变异的乙酰透明质酸降解酶的活性(通过本领域熟知的和本文描述的体外和/或体内测定法测量)。

已经制备多种形式的乙酰透明质酸降解酶(包括透明质酸酶)，并批准其用于个体(包括人)的治疗用途。例如，源自动物的透明质酸酶制剂包括

(ISTAPharmaceuticals)、纯化的羊睾丸透明质酸酶和

(AmphastarPharmaceuticals)、牛睾丸透明质酸酶。

(Baxter)是由遗传工程改造的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制备的人重组透明质酸酶，所述CHO细胞包含编码截短的人PH20多肽(命名为rHuPH20)的核酸。要理解，在本文提供的稳定复合制剂中可以包含任意乙酰透明质酸降解酶(诸如任意透明质酸酶)(参见例如，第7,767,429号美国专利和第20040268425号和第20100143457号美国公开，将它们以其整体援引加入)。

通常，为了用于本文的制剂和复合制剂，使用人乙酰透明质酸降解酶，诸如人PH20，特别是如本文中所述的C-端截短的人PH20。尽管可使用来自其它动物的乙酰透明质酸降解酶(例如PH20)，但是这些制剂均有潜在的免疫原性，因为它们为动物蛋白质。例如，大部分患者显示继发于摄入的食物的早期致敏(prior sensitization)，并且因为这些是动物蛋白质，所有的患者均具有后续致敏的风险。因此，非人类的制剂可能不适于长期使用。如果需要非人类的制剂，可以将它们制备成具有降低的免疫原性。这样的修饰在本领域技术人员的水平之内，并可包括例如移除和/或替换分子上的一个或多个抗原表位。

用于本文提供的制剂和复合制剂中的包括透明质酸酶(例如PH20)的乙酰透明质酸降解酶可以是重组制备的，或者可以从天然来源(例如从睾丸提取物)纯化或部分纯化。在本文的其它部分提供制备包括重组乙酰透明质酸降解酶的重组蛋白的方法，并且这是本领域熟知的。

1.透明质酸酶

透明质酸酶为乙酰透明质酸降解酶大家族的成员。有三大类透明质酸酶：哺乳动物型透明质酸酶、细菌透明质酸酶和来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶。这些酶可用于本文提供的复合制剂中。

a.哺乳动物型透明质酸酶

哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)为水解透明质酸的β-1→4糖苷键产生多种寡糖长度(例如四糖和六糖)的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，并可降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)(一般为C4-S和C6-S)。这一类型的透明质酸酶包括但不限于来自母牛(牛)的(SEQ ID NO:10、11和64以及BH55(第5,747,027和5,827,721号美国专利))、来自绵羊(Ovis aries)的(SEQ ID NO:26、27、63和65)、来自黄蜂的(SEQ IDNO:12和13)、来自蜜蜂的(SEQ ID NO:14)、来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO:15)、来自胡蜂的(SEQ ID NO:16)、来自小鼠的(SEQ ID NO:17-19,32)、来自猪的(SEQ ID NO:20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO:22-24、31)、来自兔的(SEQ ID NO:25)、来自猩猩的(SEQ ID NO:28)、来自食蟹猴的(SEQ ID NO:29)、来自豚鼠的(SEQ ID NO:30)、来自黑猩猩的(SEQ ID NO:185)、来自罗猴的(SEQ ID NO:186)透明质酸酶和人透明质酸酶。

哺乳动物透明质酸酶可进一步细分为主要存在于睾丸提取物中的中性活性的那些和主要存在与器官(例如肝脏)中的酸性活性的那些。示例性中性活性透明质酸酶包括PH20，其包括但不限于得自不同物种的PH20，例如得自羊的(SEQ ID NO:27)、得自牛的(SEQID NO:11)和得自人的(SEQ ID NO:1)。人PH20(也称作SPAM1或精子表面蛋白PH20)通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与质膜结合。其天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。在本文的复合制剂中使用的示例性透明质酸酶是中性活性的透明质酸酶。

除人PH20(也称作SPAM1)外，已在人类基因组中鉴定出五个透明质酸酶样基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1为假基因，HYAL3(SEQ ID NO:38)未显示具有对任意已知底物的酶活性。HYAL4(显示于SEQ ID NO:39的前体多肽)为软骨素酶，并显示很小的对透明质酸的活性。HYAL1(显示于SEQ ID NO:36的前体多肽)为原型的酸性活性酶，PH20(显示于SEQ ID NO:1的前体多肽)为原型的中性活性酶。酸性活性透明质酸酶(例如HYAL1和HYAL2(显示于SEQ ID NO:37的前体多肽))一般在中性pH(即pH7)时缺乏催化活性。例如，HYAL1在大于pH 4.5时具有很小的体外催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochem.251:263-269)。HYAL2为具有非常低的体外特异性活性的酸性活性酶。透明质酸酶样酶也可由通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与质膜结合的那些(例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5))，以及一般为可溶的那些(例如人HYAL1(Frost等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1):10-5))来表征。

PH20

与其它哺乳动物透明质酸酶一样，PH20也为可水解透明质酸的β-1→4糖苷键产生多种寡糖长度(例如四糖和六糖)的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性，并可降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)(例如C4-S和C6-S)。PH20天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。PH20位于精子表面，并在溶酶体衍生的顶体中，在那里其与顶体内膜结合。质膜PH20仅在中性pH下具有透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20在中性和酸性pH下都具有活性。除了为透明质酸酶外，PH20也似乎是HA-诱导的细胞信号的受体并为环绕卵母细胞的透明带的受体。

示例性PH20蛋白包括但不限于人PH20多肽(显示于SEQ ID NO:1的前体多肽，显示于SEQ ID NO:2的成熟多肽)、牛PH20多肽(SEQ ID NO:11和64)、兔PH20多肽(SEQ ID NO:25)、羊PH20多肽(SEQ ID NO:27、63和65)、食蟹猴PH20多肽(SEQ ID NO:29)、豚鼠PH20多肽(SEQ ID NO:30)、大鼠PH20多肽(SEQ ID NO:31)、小鼠PH20多肽(SEQ ID NO:32)、黑猩猩PH20多肽(SEQ ID NO:185)和罗猴PH20多肽(SEQ ID NO:186)。

牛PH20为553个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO:11)。牛PH20与人PH20的比对显示仅有弱同源性，从氨基酸470到各自的羧基端存在多个空位，这归因于牛多肽中无GPI锚(参见例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4:427-440)。事实上，在除人之外的许多其它PH20种类中未预测出明确的GPI锚。因此，从羊和牛产生的PH20多肽天然以可溶形式存在。尽管牛PH20以非常松散地与质膜结合的形式存在，但是其并未通过磷脂酶敏感的锚蛋白锚定(Lalancette等人(2001)Biol Reprod.65(2):628-36)。牛透明质酸酶的这一特性允许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶以提取物的形式用于临床用途

人PH20mRNA转录物正常翻译生成509个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO:1)，其包含在N-端的35个氨基酸信号序列(氨基酸残基位点1-35)和在C-端的19个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚结合信号序列(氨基酸位点491-509)。因此，成熟的PH20为显示于SEQ IDNO:2的474个氨基酸的多肽。在将前体多肽转运至ER并移除信号肽后，C-端GPI-结合信号肽被裂解以促使GPI锚与位于对应于SEQ ID NO:1所示前体多肽的490位点的氨基酸位点处新形成的C-端氨基酸共价结合。因此，产生了具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的474个氨基酸的GPI-锚定的成熟多肽。

尽管人PH20是中性活性的透明质酸酶，当它通过GPI锚存在于质膜处时，它在中性和酸性pH下显示活性(当它在顶体内膜上表达时)。PH20似乎包含位于该多肽的不同区域的两个催化位点：肽1和肽3区域(Cherr等人,(2001)Matrix Biology 20:515-525)。对应于SEQ ID NO:2所示成熟多肽的氨基酸位点107-137和SEQ ID NO:1所示前体多肽的位点142-172的PH20的肽1区域是在中性pH下的酶活性必需的。这区域内位点111和113处的氨基酸(对应于SEQ ID NO:2所示的成熟PH20多肽)对于活性是重要的，因为氨基酸替换突变分别得到与野生型PH20相比具有3％透明质酸酶活性或不可检测的透明质酸酶活性的PH20多肽(Arming等人,(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。

对应于SEQ ID NO:2所示成熟多肽的氨基酸位点242-262和SEQ ID NO:1所示前体多肽的位点277-297的肽3区域对于在酸性pH下的酶活性是重要的。在这一区域内，成熟PH20多肽的位点249和252处的氨基酸对于活性是必需的，二者中任意一个的突变得到基本无活性的多肽(Arming等人,(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。

除了催化位点，PH20也包含透明质酸结合位点。试验证据证明该位点位于肽2区域内，肽2区域对应于SEQ ID NO:1所示前体多肽的氨基酸位点205-235和SEQ ID NO:2所示成熟多肽的位点170-200。该区域在透明质酸酶中高度保守并与肝素结合基序相似。位点176处的精氨酸残基(对应于SEQ ID NO:2所示的成熟PH20多肽)突变至甘氨酸得到仅具有野生型多肽的约1％的透明质酸酶活性的多肽(Arming等人,(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。

在人PH20中在SEQ ID NO:1所示多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处有七个潜在的N-联糖基化位点。由于SEQ ID NO:1的氨基酸36-464似乎包含最小的活性人PH20透明质酸酶结构域，所以N-联糖基化位点N-490不是适合的透明质酸酶活性必需的。人PH20中有六个二硫键。两个二硫键在SEQ ID NO:1所示多肽的半胱氨酸残基C60和C351以及C224和C238之间(分别对应于SEQ ID NO:2所示成熟多肽的残基C25和C316，以及C189和C203)。另外的四个二硫键形成于SEQ ID NO:1所示多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间；C381和C435之间；C437和C443之间；以及C458和C464之间(分别对应于SEQ ID NO:2所示成熟多肽的残基C341和C352之间；C346和C400之间；C402和C408之间；以及C423和C429之间)。

b.细菌透明质酸酶

细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)降解透明质酸，并在不同程度上降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。分离自细菌的透明质酸裂解酶与透明质酸酶(来自其它来源，例如透明质酸氨基葡糖苷酶EC 3.2.1.35)在它们的作用方式上存在差异。它们为催化透明质酸的N-乙酰-β-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基之间的β1→4-糖苷键的消除反应，而不是水解反应，从而得到3-(4-脱氧-β-D-gluc-4-enuronosyl)-N-乙酰-D-葡糖胺四糖和六糖，以及二糖终产物的内切-β-N-乙酰己糖胺酶。该反应形成在非还原端具有不饱和己糖醛酸残基的寡糖。

用于本文提供的复合制剂中的来自细菌的示例性透明质酸酶包括但不限于微生物中的乙酰透明质酸降解酶，所述微生物包括节杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属、消化球菌属(Peptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和链霉菌属(Streptomyces)的菌株。这些酶的具体实例包括但不限于节杆菌属(菌株FB24)(SEQ ID NO:67)、食菌蛭弧菌(SEQ IDNO:68)、痤疮丙酸杆菌(SEQ ID NO:69)、无乳链球菌((SEQ ID NO:70)；18RS21(SEQ ID NO:71)；血清型Ia(SEQ ID NO:72)；血清型III(SEQ ID NO:73)、金黄色葡萄球菌(菌株COL)(SEQ ID NO:74)；菌株MRSA252(SEQ ID NO:75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO:77)；菌株NCTC 8325(SEQ ID NO:78)；菌株牛RF122(SEQ ID NO:79和80)；菌株USA300(SEQ ID NO:81)、肺炎链球菌((SEQ ID NO:82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO:83)；血清型2，菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO:84)、酿脓链球菌(血清型M1)(SEQ ID NO:85)；血清型M2，菌株MGAS10270(SEQ ID NO:86)；血清型M4，菌株MGAS10750(SEQ ID NO:87)；血清型M6(SEQ IDNO:88)；血清型M12，菌株MGAS2096(SEQ ID NO:89和90)；血清型M12，菌株MGAS9429(SEQ IDNO:91)；血清型M28(SEQ ID NO:92)；猪链球菌(SEQ ID NO:93-95)；费氏弧菌(菌株ATCC700601/ES114(SEQ ID NO:96))，以及Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对透明质酸具有特异性并且不裂解软骨素或硫酸软骨素(Ohya,T.和Kaneko,Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta198:607)。

c.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶

来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)为可生产四糖和六糖终产物的内切-β-葡糖醛酸糖苷酶。这些酶催化透明质酸盐中β-D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1→3-连接的水解。来自水蛭的示例性透明质酸酶包括但不限于来自水蛭科(Hirudinidae)(例如欧洲医蛭(Hirudo medicinalis))、石蛭科(Erpobdellidae)(例如Nephelopsis obscura和Erpobdella punctata)、舌蛭科(Glossiphoniidae)(例如Desserobdella picta、静泽蛭(Helobdella stagnalis)、扁舌蛭(Glossiphoniacomplanata)、润饰盾蛭(Placobdella ornata)和Theromyzon sp.)以及黄蛭科(Haemopidae)(马蛭(Haemopis marmorata))的透明质酸酶(Hovingh等人(1999)CompBiochem Physiol B Biochem Mol Biol.124(3):319-26)。与水蛭透明质酸酶具有相同作用机制的来自细菌的示例性透明质酸酶为来自蓝细菌的聚球藻(Synechococcus sp.)(菌株RCC307，SEQ ID NO:97)的透明质酸酶。

2.其它乙酰透明质酸降解酶

除了透明质酸酶家族以外，在本文提供的稳定制剂或本文提供的包含胰岛素的复合制剂中可以使用其它乙酰透明质酸降解酶。例如，可使用包括特定的软骨素酶和裂解酶在内的具有裂解透明质酸的能力的酶。可降解透明质酸的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶)和软骨素C裂解酶。用于本文提供的组合物、组合和方法中的这些酶的生产和纯化方法为本领域已知的(例如第6,054,569号美国专利；Yamagata等人(1968)J.Biol.Chem.243(7):1523-1535；Yang等人(1985)J.Biol.Chem.160(30):1849-1857)。

软骨素ABC裂解酶包括两种酶，硫酸软骨素ABC内解酶(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外解酶(EC 4.2.2.21)(Hamai等人(1997)J Biol Chem.272(14):9123-30)，它们降解多种硫酸软骨素型和硫酸皮肤素型糖胺聚糖。硫酸软骨素、硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素是硫酸软骨素ABC内解酶的优选底物，但是该酶也可以较低速率作用于透明质酸。硫酸软骨素ABC内解酶降解多种硫酸软骨素型和硫酸皮肤素型糖胺聚糖，其产生不同大小的Δ4-不饱和寡糖的混合物，所述不饱和寡糖最终被降解成Δ4-不饱和的四糖和二糖。硫酸软骨素ABC外解酶具有相同的底物特异性，但是可从聚合硫酸软骨素和它们由硫酸软骨素ABC内解酶产生的寡糖片段的非还原端移除二糖残基(Hamai,A.等人(1997)J.Biol.Chem.272:9123-9130)。示例性硫酸软骨素ABC内解酶和硫酸软骨素ABC外解酶包括但不限于来自普通变形杆菌和肝黄黄杆菌的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内解酶示于SEQ ID NO:98)(Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。

软骨素AC裂解酶(EC 4.2.2.5)对硫酸软骨素A和C、软骨素和透明质酸具有活性，但是对硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)无活性。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于分别显示于SEQ ID NO:99和100的来自肝黄黄杆菌和Victivallis vadensis的那些，和来自金黄节杆菌的那些(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology30(5):387-444)。

软骨素酶C裂解硫酸软骨素C，产生四糖和不饱和的6-硫酸化的二糖(ΔDi-6S)。它也裂解透明质酸，产生不饱和的非硫酸化二糖(ΔDi-OS)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属和黄杆菌属的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。

3.截短的乙酰透明质酸降解酶或其它可溶形式

乙酰透明质酸降解酶可以膜结合的或膜连接的形式存在，或者可以在从细胞表达时分泌入培养基中并由此以可溶形式存在。为了本文中的目的，乙酰透明质酸降解酶包括任意乙酰透明质酸降解酶，当其从细胞表达和分泌时没有与细胞膜结合，并且由此以可溶形式存在。可溶性的乙酰透明质酸降解酶包括但不限于：透明质酸酶，其包括非人透明质酸酶(例如动物或细菌透明质酸酶)，诸如牛PH20或羊PH20，和人透明质酸酶(诸如Hyal1)，或非人或人膜结合的透明质酸酶的截短形式，特别是人PH20的截短形式、它的等位基因变体和它的其它变体。本文的复合制剂中的示例性乙酰透明质酸降解酶是这样的乙酰透明质酸降解酶的截短形式：其缺少糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的一个或多个氨基酸残基，并且保留透明质酸酶活性。在一个实例中，正常情况下通过GPI锚锚定于膜的人透明质酸PH20可通过截短或移除全部或部分C-端的GPI锚而成为可溶性的。

因此，在一些情况下，通过在C-端处的截短，使得通常GPI锚定的乙酰透明质酸降解酶(例如人PH20)成为可溶性的。这样的截短可移除全部的GPI锚结合信号序列或可仅移除部分的GPI锚结合信号序列。然而，所得多肽为可溶的。在可溶性乙酰透明质酸降解酶保留部分的GPI锚结合信号序列的情况中，可保留GPI锚结合信号序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸残基，条件是所述多肽为可溶的(即当从细胞表达时被分泌)和有活性的。本领域的技术人员使用本领域熟知的方法可以确定多肽是否为GPI锚定的。这样的方法包括但不限于使用已知算法预测GPI锚结合信号序列和ω-位点的存在和位置，并在用磷脂酰肌醇-特异性的磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)进行消化之前和之后进行溶解度分析。

示例性可溶性透明质酸酶为来自任意物种的PH20，例如SEQ ID NO:1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中所示的任意PH20，或它们的缺乏全部或部分C-端GPI锚的截短形式，只要该透明质酸酶是可溶性的并保留透明质酸酶活性。C-端截短的并且缺少全部或部分GPI锚结合信号序列的示例性可溶性透明质酸酶包括但不限于：灵长类动物来源的PH20多肽，例如，人和黑猩猩PH20多肽。例如，可如下制备可溶性PH20多肽：将在SEQ ID NO:1、2或185所示的任意成熟多肽或前体多肽，或包括其活性片段的等位基因或其它变体的C-端截短，其中所得的多肽是可溶性的并且缺少来自GPI锚结合信号序列的全部或部分氨基酸残基。可溶性透明质酸酶也包括SEQ ID NO:1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中任一个的等位基因变体或其它变体，或它们的截短形式。等位基因变体和其它变体为本领域技术人员已知的，并且其包括与SEQ ID NO:1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高序列相同性的多肽或其截短形式。氨基酸变体包括保守和非保守突变。要理解，对于透明质酸的活性是重要的或必需的残基(如任意上文所述或本领域技术人员已知的)一般是不变的，并且不可改变。这些包括例如活性位点残基。因此例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(对应于SEQ ID NO:2所示成熟PH20多肽的残基)一般是不变的并且不被改变。提供正确折叠必需的糖基化和二硫键的形成的其它残基也可以是不变的。

a.C-端截短的人PH20

示例性可溶性透明质酸酶是C-端截短的人PH20。已制备C-端截短形式的人PH20重组体，并且可以用于本文描述的复合制剂中。这样的可溶形式的PH20的制备在第7,767,429号美国专利和第US20040268425、US20050260186、US20060104968和US20100143457号美国专利申请中描述。

例如，C-端截短的PH20多肽包括这样的多肽：其至少包含氨基酸36-464(透明质酸酶活性所需的最小部分)，或其包含与特定氨基酸序列具有至少85％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％)序列相同性的氨基酸序列并且其保留透明质酸酶活性，所述特定氨基酸序列至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464。这些多肽包括完全缺少全部GPI锚结合信号序列的人PH20多肽。这些多肽也包括缺少GPI锚结合信号序列的连续氨基酸残基的一部分的人PH20多肽(被称作延长的可溶性PH20(esPH20)；参见例如US20100143457)。与全长野生型多肽(例如具有SEQ ID NO:1或2所示序列的全长野生型多肽或其等位基因变体或物种变体或其它变体)相比，C-端截短的PH20多肽可在C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60个或更多个氨基酸。因此，这些多肽当从细胞表达时是被分泌的并且是可溶的，而不是具有在ER中与蛋白质的C端共价结合的GPI锚并被锚定至质膜的外片(extracellular leaflet)。

本文提供的示例性C-端截短的人PH20多肽包括这样的任意人PH20多肽：其至少包括SEQ ID NO:1的氨基酸36-464，并且在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位点465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500以后在C-端截短，或它们的表现出至少85％(诸如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的序列相同性)的序列相同性的变体，并且保留透明质酸酶活性。表3提供示例性C-端截短的PH20多肽的的非限制性实例。在下表3中提供前体和成熟多肽的长度(以氨基酸计)以及序列标识符(SEQ ID NO)，其中显示C-端截短的PH20蛋白的前体和成熟多肽的示例性氨基酸序列。野生型PH20多肽也被包括于表3中用于比较。例如，示例性C-端截短的PH20多肽包括但不限于：在SEQ ID NO:4-9、47-48、234-254和267-273中任一个所示的多肽，或与SEQ ID NO:4-9、47-48、234-254和267-273中任一个表现出至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。

表3.示例性C-端截短的PH20多肽

b.rHuPH20

示例性SEQ ID NO:1的C-端截短形式为SEQ ID NO:1所示的序列的氨基酸482以后截短的多肽。这样的多肽可以从编码氨基酸1-482(显示于SEQ ID NO:3)的核酸分子产生。这样的示例性核酸分子显示于SEQ ID NO:49。翻译后加工移除35个氨基酸的信号序列，得到447个氨基酸的可溶性人PH20重组体(SEQ ID NO:4)。由于在培养基中制备，所以C-端存在异质性，使得命名为rHuPH20的产物包含种类的混合物，其可以包含多种丰度的SEQ IDNO:4-9中的任意一个或多个。通常，rHuPH20在促使正确的N-糖基化以保留活性的细胞(如CHO细胞，例如DG44 CHO细胞)中制备。

4.乙酰透明质酸降解酶的糖基化

包括透明质酸酶在内的一些乙酰透明质酸降解酶的糖基化(包括N-和O-联糖基化)对于它们的催化活性和稳定性是重要的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型可对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解度和稳定性具有显著作用，但是认为为了最优的酶活性，大多数酶不需要糖基化。对于一些透明质酸酶，移除N-联糖基化可引起透明质酸酶活性接近完全失活。因此，对于这样的透明质酸酶，N-联聚糖的存在对于生成活性的酶是必需的。

N-联寡糖分属数种主要类型(寡甘露糖型、复合型、杂合型(hybrid)、硫酸化型)，其全部具有通过属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不为Pro)的Asn残基的酰胺氮连接的(Man)₃-GlcNAc-GlcNAc-核心。对于凝固蛋白C(coagulation protein C)在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化已有报道。在一些情况下，乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)可既包含N-糖苷键也包含O-糖苷键。例如，PH20具有O-联寡糖以及N-联寡糖。在SEQ ID NO:1所示的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处有七个潜在的N-联糖基化位点。氨基酸残基N82、N166和N254被复合型聚糖占据，而氨基酸残基N368和N393被高甘露糖型聚糖占据。氨基酸残基N235被大约80％高甘露糖型聚糖和20％复合型聚糖占据。如上文所述，N490处的N-联糖基化不是透明质酸酶活性必需的。

在一些实例中，所提供的复合制剂中使用的乙酰透明质酸降解酶在一个或所有的糖基化位点上被糖基化。例如，对于人PH20或其可溶形式而言，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的2、3、4、5或6个被糖基化。在一些实例中，所述乙酰透明质酸降解酶在一个或多个天然糖基化位点被糖基化。因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的，所以一般使用有助于正确N-糖基化的蛋白质表达系统来制备可溶形式的PH20，以确保该多肽保留活性。这样的细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44 CHO细胞)。

在其它实例中，乙酰透明质酸降解酶的一个或多个非天然的糖基化位点被修饰以提供该多肽在一个或多个另外的位点处的糖基化。在这样的实例中，另外的糖基团的结合可增强分子的药代动力学性质，例如改善半衰期和/或提高的活性。

在其它实例中，本文提供的复合制剂中包含的乙酰透明质酸降解酶(诸如PH20或人PH20)被部分地去糖基化(或N-部分地糖基化的多肽)(参见例如第US20100143457号美国专利公开)。糖苷酶或糖苷水解酶为催化糖苷键的水解以生成两个更小的糖的酶。脊椎动物中N-聚糖的主要类型包括高甘露糖型聚糖、杂合型聚糖和复合型聚糖。有数种仅引起部分的蛋白质去糖基化的糖苷酶，包括：EndoF1，其裂解高甘露糖型聚糖和杂合型聚糖；EndoF2，其裂解二分支的(biantennary)复合型聚糖；EndoF3，其裂解二分支的和更多分支的复合型聚糖；以及EndoH，其裂解高甘露糖型和杂合型聚糖。例如，用一种或所有上述糖苷酶(例如EndoF1、EndoF2、EndoF3和/或EndoH)处理PH20(例如命名为rHuPH20的重组PH20)引起部分去糖基化。这些部分去糖基化的PH20多肽可显示与完全糖基化的多肽类似的透明质酸酶酶活性。相反，用PNGaseF(裂解所有N-聚糖的糖苷酶)或用GlcNAc磷酸转移酶(GPT)抑制剂衣霉素处理PH20引起所有N-聚糖的完全去糖基化，并由此使得PH20无酶活性。因此，尽管所有的N-联糖基化位点(例如，位于SEQ ID NO:1所示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的那些)可被糖基化，但是，与未用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比，用一种或多种糖苷酶处理可使糖基化程度降低。

因此，可通过用一种或多种糖苷酶(通常为不移除所有N-聚糖但是仅使蛋白质部分去糖基化的糖苷酶)进行消化，制备部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶(例如部分去糖基化的可溶性透明质酸酶)。部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶(包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽)可具有完全糖基化的多肽的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。在一个实例中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的1、2、3、4、5或6个N-糖基化位点被部分去糖基化，使得它们不再包含高甘露糖型聚糖或复合型聚糖，而是至少包含N-乙酰基葡糖胺基团。在一些实例中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166和N254的1、2或3个N-糖基化位点被去糖基化，也就是说，它们不包含糖基团。在其它实例中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的3、4、5或6个N-糖基化位点被糖基化。糖基化的氨基酸残基至少包含N-乙酰基葡糖胺基团。通常，部分去糖基化的乙酰透明质酸降解酶(包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽)显示的透明质酸酶活性是完全糖基化的多肽显示的透明质酸酶活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。

5.修饰乙酰透明质酸降解酶以改善它们的药代动力学性质

可以修饰乙酰透明质酸降解酶以改善它们的药代动力学性质，例如增加它们的体内半衰期和/或活性。用于本文提供的稳定制剂或复合制剂中或所提供的任意组合物、组合和/或方法中的乙酰透明质酸降解酶的修饰可以包括直接连接或通过连接基间接连接(例如共价地或通过其它稳定的键)、聚合物(例如葡聚糖、聚乙二醇(聚乙二醇化(PEG))或唾液酸基(sialyl)基团)或其它这样的聚合物(例如天然的或糖聚合物)连接。

已知治疗剂的聚乙二醇化可增加对蛋白酶解的抗性、增加血浆半衰期并减少抗原性和免疫原性。因此，聚合物分子(例如聚乙二醇部分(PEG))与乙酰透明质酸降解酶的共价或其它稳定连接(缀合)可赋予所得的酶-聚合物组合物有益的性质。这些性质包括提高的生物相容性、在个体血液、细胞和/或其它组织中的蛋白质(和酶活性)的半衰期延长、有效保护蛋白质不被蛋白酶作用和水解、改善生物分布、增强药代动力学和/或药效学以及增加水溶性。

可与乙酰透明质酸降解酶缀合的示例性聚合物包括天然的和合成的同聚物，例如多元醇(即，多-OH)、多胺(即，多-NH2)和多羧酸(即，多-COOH)，以及另外的杂聚物，即包含一种或多种不同的偶联基团(例如羟基和氨基)的聚合物。适合的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，例如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚丙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支化聚丙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D,L-氨基酸、聚乙烯-马来酸酐共聚物(polyethylene-co-maleic acid anhydride)、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物(polystyrene-co-maleic acid anhydride)、包括羧甲基葡聚糖的葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素(包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素)、壳聚糖的水解产物、淀粉(例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、芽霉菌糖(pullulan)、胰岛素、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸水解产物和生物聚合物。

通常，所述聚合物为聚亚烷基氧化物(PAO)，例如聚氧化乙稀，如PEG，代表性的为mPEG，其与多糖(例如葡聚糖、芽霉菌糖等)相比具有很少的能够交联的反应性基团。通常，所述聚合物为无毒性的聚合物分子，例如可以使用相对简单的化学与乙酰透明质酸降解酶共价缀合(例如与蛋白质表面的基团结合)的(m)聚乙二醇(mPEG)。

适合用于与乙酰透明质酸降解酶连接的聚合物分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，例如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、支化PEG和聚氧化乙烯(参见例如Roberts等人,Advanced Drug DeliveryReview 2002,54:459-476；Harris和Zalipsky,S(编)"Poly(ethy1ene glycol),Chemistryand Biological Applications"ACS Symposium Series 680,1997；Mehvar等人,J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1):125-136,2000；Harris,Nature Reviews DrugDiscovery 2:214(2003)；和Tsubery,J Biol.Chem 279(37):38118-24,2004)。所述聚合物分子的分子量通常可以是约3kDa至约60kDa。在一些实施方案中，与蛋白质(例如rHuPH20)缀合的聚合物分子的分子量为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa。

本领域已知多种通过共价连接(缀合)PEG或PEG衍生物(即“聚乙二醇化”)来修饰多肽的方法(参见例如，第20060104968和U.S.20040235734号美国专利公开；第5,672,662和U.S.6,737,505号美国专利)。聚乙二醇化技术包括但不限于专化的(specialized)连接基和偶联化学(参见例如，Roberts等人,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)、将多个PEG基团连接到单个缀合位点(例如通过使用支化PEG；参见例如Guiotto等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单-聚乙二醇化(参见例如Chapman等人,Nature Biotech.17:780-783,1999)和定点(site-directed)酶促聚乙二醇化(参见例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:487-504,2002)(也参见例如Lu和Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.43:127-138；Lu和Felix(1993)Peptide Res.6:140-6,1993；Felix等人(1995)Int.J.Peptide Res.46:253-64；Benhar等人(1994)J.Biol.Chem.269:13398-404；Brumeanu等人(1995)J Immunol.154:3088-95；也参见Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77以及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt 2):3S-8S)。本领域描述的方法和技术可制备具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个PEG或PEG衍生物与单个蛋白质分子结合的蛋白质(参见例如第20060104968号美国专利公开)。

本领域记载了许多用于聚乙二醇化的试剂。这些试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化的PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺基酯、同双功能(homobifunctional)PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、同双功能PEG-丙醛、同双功能PEG-丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、邻-硝基苯基-羧酸酯PEG、mPEG-苯并三唑羧酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支化mPEG2丁醛、乙酰基mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG"无连接基(linkerless)"马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶基硫代酸酯(orthopyridylthioester)、mPEG邻吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见例如，Monfardini等人,Bioconjugate Chem.6:62-69,1995；Veronese等人,J.Bioactive Compatible Polymers12:197-207,1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO05000360；WO 9428024；和WO 0187925)。

D.稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂

本文提供乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂，其包含作为二价阳离子的稳定化赋形剂。二价阳离子的实例包括但不限于：赖氨酰基-赖氨酸(二赖氨酸；Lys-Lys)或镁(例如MgCl₂)，或它们的盐、衍生物、类似物或模拟物。在特定实例中，乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂包含Lys-Lys或其盐、衍生物、类似物或模拟物作为稳定化赋形剂。在其它实例中，乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂包含MgCl₂或其衍生物、类似物或模拟物作为稳定剂。包含二价阳离子(例如Lys-Lys或MgCl₂)的乙酰透明质酸降解酶在大于或等于37℃的温度稳定持续至少三(3)天，并且通常至少6天、7天(1周)、2周、3周或4周(1个月)。例如，这样的制剂在大于或等于37℃-42℃(诸如至少或接近或约40℃)的温度稳定持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更久。

乙酰透明质酸降解酶的现有制剂包含人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂。例如，

重组体包含1.0mg人白蛋白。由于数个原因，需要稳定的不含HSA的乙酰透明质酸降解酶制剂。首先，HSA是源自血液的产物，因而它经常是不纯的。HSA的降解物和污染物可干扰酶的活性。另外，HSA本身也面临稳定性的挑战，因为它在特定条件下可以形成聚集体。在本文中发现，通过包括二价阳离子(例如，Lys-Lys)，可以制备乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，诸如PH20)的稳定的不含HSA的制剂。

并且，如在本文其它部分讨论的，大多数现有的乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，诸如PH20)的制剂也包含NaCl作为稳定剂。为了酶的最优活性和稳定性通常需要NaCl以是或约是130mM-150mM的NaCl或更高的高含量存在。例如，市售的PH20制剂

包含145mM的NaCl。如本文的实施例所证实，二价阳离子Lys-Lys和MgCl₂表现出比NaCl提高的对示例性乙酰透明质酸降解酶PH20的稳定性作用。这是有利的，因为在本文中发现，在大于37℃的升高的温度或加速温度孵育时，NaCl未有效地稳定化PH20(参见例如实施例23和24)。与此相反，在升高的温度，包含二价阳离子(诸如Lys-Lys)的制剂中的PH20活性保留，使得在大于或等于37℃的温度(诸如大于或等于37℃-42℃，诸如至少或接近或约40℃)孵育4周以后，制剂可以表现出高达70％或更高的活性，并且通常至少或约至少80％、85％、90％或更高的活性，持续至少1个月。在本文的包含二价阳离子(例如Lys-Lys)作为稳定剂的制剂的实例中，与不包含二价阳离子的乙酰透明质酸降解酶(例如包含NaCl作为稳定剂)的活性相比，乙酰透明质酸降解酶在至少或约至少38℃-42℃，并且特别是在40℃的升高的温度的活性增加大于或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

本文提供稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂，其包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和一定量的二价阳离子(诸如Lys-Lys或MgCl₂)，以使该制剂在大于或等于37℃的温度稳定持续至少1个月。在特定实例中，本文提供稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂，其包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和一定量的Lys-Lys，以使该制剂在大于或等于37℃的温度稳定持续至少1个月。例如，这样的制剂在大于或等于37℃-42℃(诸如至少或接近或约40℃)的温度稳定持续至少1个月。所述制剂通常也包含表面活性剂、抗氧化剂(例如甲硫氨酸)、为或约为6.5-7.8的pH和维持所述pH范围的缓冲剂。任选地，所述制剂可包含一种或多种其它稳定剂、张力调节剂、一种或多种防腐剂或赋形剂。

通常，使用本领域熟知的技术和方法将化合物配制成药物组合物(参见例如，Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第四版,1985,126)。考虑到管理机构或其它机构的批准，根据普遍公认的用于动物和人类的药典，制备药学可接受的组合物。制剂应是适合给药模式。

可以液体形式的药物制剂(以溶液剂、糖浆剂或混悬剂)提供所述稳定制剂。以液体形式时，可以将药物制剂以浓制剂形式提供，将其在使用前稀释至治疗有效浓度。通常，以使用时不需要稀释的剂型(即用于直接给药的制剂)提供所述制剂。这样的液体制剂可以通过常规方式用以下物质制备：药学可接受的添加剂，诸如助悬剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用的脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，扁桃仁油、油状酯或分馏获得的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在另一实例中，药物制剂可以低压冻干的形式存在，将其在使用前用水或其它适合的载体重构。可将所述制剂制备为单剂量制剂或多剂量制剂。

本文提供的制剂的体积可以是对于其中提供它的容器适合的任意体积。在一些实例中，将所述制剂在小瓶、注射器或其它任意适合的容器中提供。例如，本文提供的稳定制剂是或约是0.1mL-500mL，诸如0.1mL-100mL、1mL-100mL、0.1mL-50mL，诸如至少是或约至少是或约是或是0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。

下面提供在本文的稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂中提供的组分的描述。下述稳定制剂仅仅是示例性的，并且提供可以从其进行微小调整的平台。要理解，可以对多种赋形剂和其它组分的浓度进行非常小的改变(例如所述浓度的±15％)或对pH进行小改变，同时保留一些或全部的乙酰透明质酸降解酶稳定性。也可以通过添加或移除赋形剂进行其它改变。例如，可以改变稳定化表面活性剂的类型。

1.乙酰透明质酸降解酶

本文提供的稳定制剂中的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的量是直接给药足以实现治疗效果的量。在一个实例中，所述量是在人皮肤外表面下面的皮下空间中直接给药足以降解透明质酸(HA)的量。例如，所述制剂中的乙酰透明质酸降解酶的量是用于直接给药以增加联合注射的或联合给药的治疗剂的分散和吸收的量。在另一实例中，所述量是直接给药足以降解与患病组织或患病细胞有关的透明质酸(HA)的量。例如，所述量是直接给药足以降解与肿瘤细胞有关的HA的量。在这样的实例中，所述量是减少或降低组织间隙液压(IFP)或增加肿瘤血管体积的量。

例如，所述量在功能上等价于至少或约至少30单位/mL。例如，本文提供的制剂包含如下量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))：为或约为30单位/mL-20,000U/mL、300U/mL-15,000U/mL、300U/mL-10,000U/mL、300U/mL-5,000U/mL、300U/mL-3000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-20,000U/mL、600U/mL-15,000U/mL、600U/mL-10,000U/mL、600U/mL-6000U/mL、600U/mL-4000U/mL、600U/mL-2000U/mL、600U/mL-1000U/mL、60U/mL-600U/mL或100U/mL-300U/mL，诸如至少或约至少30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL、7000U/mL、8000U/mL、9000U/mL、10,000U/mL、12,000U/mL、15,000U/mL或20,000U/mL。例如，本文提供的制剂包含如下量的PH20(例如rHuPH20)：至少100U/mL-300U/mL，例如至少是或约至少是或约是或是100U/mL、115U/mL、120U/mL、125U/mL、130U/mL、135U/mL、140U/mL、145U/mL、150U/mL、155U/mL、160U/mL、165U/mL、170U/mL、175U/mL、180U/mL、185U/mL、190U/mL、200U/mL、220U/mL、240U/mL、260U/mL、280U/mL或300U/mL。

在本文提供的稳定制剂中，所述制剂中的乙酰透明质酸降解酶(包括透明质酸酶，诸如PH20(例如rHuPH20))的稳定性是如上所述的所述酶在大于或等于37℃-42℃(诸如至少或接近或约37℃或40℃)的升高的温度持续至少三(3)天并且通常至少1个月的回收和/或活性的函数。本文描述评价这些参数的测定。本文提供的制剂保留透明质酸酶回收和/或活性，使得所述制剂适合用于如本文中所述的治疗用途。在本文提供的稳定制剂中，乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20)的活性通常是，在如本文中所述暴露于大于或等于37℃-42℃的温度持续至少三(3)天并且通常至少1个月之前，所述制剂中的酶的初始活性的大于或约50％，诸如大于或至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。例如，乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20)的活性通常是，当在4℃储存至少1个月时的相同酶制剂的活性的大于或约50％，诸如大于或至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。通常，本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂在大于或等于37℃-42℃(诸如至少或接近或约37℃或40℃)的温度的储存或使用下表现出该酶的初始活性的至少70％持续至少1个月。因此例如，在用600U/mL的乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)配制的溶液中，在大于或等于37℃-42℃(诸如至少或接近或约37℃或40℃)的温度保留至少或约至少360单位/mL、365U/mL、370U/mL、375U/mL、380U/mL、390U/mL、420U/mL、480U/mL、540U/mL、546U/mL、552U/mL、558U/mL、564U/mL、570U/mL、576U/mL、582U/mL、588U/mL、594U/mL或更高的活性持续至少1个月。在其它实例中，可以将稳定性评估为酶回收的函数(例如使用RP-HPLC)。在这样的实例中，本文提供的制剂中的透明质酸酶酶回收是或约是60％-140％。例如，在本文提供的制剂中，所述透明质酸酶酶回收是或约是3-7μg/mL。

2.二价阳离子

本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂包含一定量的二价阳离子，以如本文中所述在为或约为37℃-42℃(诸如至少或约或接近37℃或40℃)的温度达到至少50％，并且通常至少70％的乙酰透明质酸降解酶的初始酶活性，持续至少三(3)天并且通常至少1个月(例如4周)。例如，二价阳离子的量是这样的量：其在或接近37℃-42℃(诸如至少或约或接近40℃)的温度达到至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的乙酰透明质酸降解酶的初始酶活性，持续至少三(3)天，并且通常持续至少4周。

例如，本文提供的稳定透明质酸降解制剂可包含一定量的Lys-Lys、其盐、衍生物、类似物或模拟物，以在或接近37℃-42℃(诸如至少或约或接近40℃)的温度达到至少50％，并且通常至少70％的乙酰透明质酸降解酶的初始酶活性，持续至少三(3)天并且通常持续至少4周。本文提供的这样的稳定的乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，例如PH20)制剂包含为或约为5mM-300mM(诸如10mM-200mM、50mM-150mM或10mM-50mM)的Lys-Lys。例如，本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，例如PH20)制剂包含至少为或约至少为或为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、200mM、300mM或更多的Lys-Lys。

在另一实例中，本文提供的稳定乙酰透明质酸降解制剂可包含一定量的MgCl₂、其衍生物、类似物或模拟物，以在为或约为37℃-42℃(诸如至少或约或接近40℃)的温度达到至少50％，并且通常至少70％的乙酰透明质酸降解酶的初始酶活性，持续至少三(3)天，并且通常持续至少4周。本文提供的这样的稳定的乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，例如PH20)制剂包含为或约为5mM-300mM(诸如10mM-200mM、50mM-150mM或10mM-50mM)的MgCl₂。例如，本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，例如PH20)制剂包含至少为或约至少为或为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、200mM、300mM或更多的MgCl₂。

如下面讨论的，如果需要，包含二价阳离子(例如Lys-Lys)的制剂也可包含张力调节剂(例如NaCl)。

3.pH和缓冲剂

本文提供乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定制剂，其pH为或约为6.5-7.8或6.8-7.8(诸如为或约为6.5-7.5或7.0-7.6)。在本文中提及的pH是基于在室温的pH测得量。要理解，pH在储存期间可以随时间变化，但是通常会保持在为或约为pH 6.5-7.8，例如为或约为6.8-7.8或约6.8-约7.8。例如，pH可以变化±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5或更多。因此，要理解，提及的pH约为或至少为pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.6的制剂包括这样的复合制剂：当制备时，其pH为或约为或至少为6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2或7.6±0.2。

如果需要，可以如下调节pH：使用酸化剂降低pH，或使用碱化剂增加pH。示例性酸化剂包括但不限于：乙酸、柠檬酸、硫酸、盐酸、磷酸二氢钠溶液和磷酸。示例性碱化剂包括但不限于：磷酸氢二钠溶液、碳酸钠或氢氧化钠。

本文提供的复合制剂中可使用任意缓冲剂，只要它未不利地影响制剂的稳定性，并支持所需的必要pH范围。特别适合的缓冲剂的实例包括Tris、琥珀酸盐、乙酸盐、磷酸盐缓冲剂、组氨酸、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐。但是，本领域技术人员会认识到，本文提供的制剂不限于特定缓冲剂，只要所述缓冲剂提供可接受程度的pH稳定性或在指定范围内的“缓冲容量”。通常，缓冲剂具有在它的pK的约1个pH单位内的足够缓冲容量(Lachman等人1986)。缓冲剂适合性可以基于公开的pK列表来估测，或者可以通过本领域熟知的方法经验地确定。例如，使用任意可接受的酸或碱，可以将溶液的pH调节至在如上所述范围内的期望端点。

本文提供的复合制剂中可包含的缓冲剂包括但不限于：Tris(氨丁三醇)、组氨酸、磷酸盐缓冲剂(诸如磷酸氢二钠)和柠檬酸盐缓冲剂。例如，所述缓冲剂可以是盐酸组氨酸(组氨酸/HCl)缓冲剂。通常，所述缓冲剂以本文中的量存在，以维持所述复合制剂的pH范围为或约为6.5-7.8，例如为或约为6.8-7.8，诸如为或约为7.0-7.6。这样的缓冲剂可以为或约为1mM-100mM，诸如10mM-50mM或20mM-40mM，诸如为或约为30mM的浓度存在于制剂中。例如，这样的缓冲剂可以下述浓度存在于复合制剂中：为或约为或至少为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更多。

在一些实例中，不需要缓冲剂。

4.表面活性剂

本文提供的稳定制剂包含一种或多种表面活性剂。这样的表面活性剂抑制乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的聚集并使吸收损失最小化。所述表面活性剂通常是非离子型表面活性剂。在本文的制剂中可包含的表面活性剂包括但不限于：多元醇(诸如甘油或山梨醇)的偏(partial)酯和偏醚以及脂肪酸酯和醚，泊洛沙姆和聚山梨酯。例如，本文的制剂中的示例性表面活性剂包括以下的任意一种或多种：泊洛沙姆188(

诸如

F68)、

聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG 400、PEG 3000、

(例如

20或

80)、

X-100、

聚丙二醇或聚乙二醇。在一些实例中，本文中的制剂包含泊洛沙姆188、聚山梨酯20、聚山梨酯80，通常是泊洛沙姆188(PLURONICF68)。本文提供的制剂通常包含至少一种表面活性剂，诸如1种、2种或3种表面活性剂。

在本文提供的制剂中，一种或多种表面活性剂的总量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)可以是，例如为或约为0.0005％-1.0％，诸如为或约为0.0005％-0.005％、0.001％-0.01％、0.01％-0.5％、0.01％-0.1％或0.01％-0.02％。通常，所述制剂包含至少0.01％的表面活性剂，并且包含小于1.0％(诸如小于0.5％或小于0.1％)的表面活性剂。例如，本文提供的制剂可包含为或约为0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.09％的表面活性剂。在特定实例中，本文提供的制剂包含0.01％-0.05％或约0.01％-约0.05％的表面活性剂。

在本文中发现，所述酶的氧化随着表面活性剂水平的增加而增加。并且，表面活性剂泊洛沙姆188造成比聚山梨酯更少的氧化。因此，本文的制剂通常包含泊洛沙姆188。因此，尽管表面活性剂能够稳定化乙酰透明质酸降解酶，在本文提供的制剂中包含表面活性剂可以在高浓度时导致乙酰透明质酸降解酶的氧化。因此，在本文的复合制剂中通常使用较低浓度的表面活性剂，例如，作为质量浓度(w/v)百分比(％)，其小于1.0％，并且通常为或约为0.01％或0.05％，诸如0.01％。并且，如以下提供的，所述制剂中可任选地包含抗氧化剂以减少或防止氧化。

5.抗氧化剂

本文提供的制剂也可包含抗氧化剂以减少或防止氧化，特别是减少或防止乙酰透明质酸降解酶的氧化。例如，本文中的实例证明，高浓度的表面活性剂可引起氧化。示例性抗氧化剂包括但不限于：半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在一具体实例中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。本文提供的制剂可以包含浓度为或约为5mM-50mM或约5mM-约50mM(诸如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM)的抗氧化剂。例如，甲硫氨酸可以浓度为或约为5mM-50mM或约5mM-约50mM(诸如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM)提供于本文的制剂中。例如，可包含浓度是或约是或至少是5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的抗氧化剂(例如甲硫氨酸)。在一些实例中，所述复合制剂包含10mM-20mM的甲硫氨酸，诸如是或约是或至少是10mM或20mM的甲硫氨酸。

6.张力调节剂

任选地，本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂可包含张力调节剂。具体地，在包含较低浓度的二价阳离子(诸如Lys-Lys)的制剂中，由于没有达到足够的张力，张力调节剂是必需的。

例如，在本文的制剂中包含张力调节剂，以得到具有期望渗量的溶液。本文提供的制剂的渗量为或约为245mOsm/kg-500mOsm/kg。例如，所述渗量是或约是或至少是245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kg、350mOsm/kg、400mOsm/kg、450mOsm/kg或500mOsm/kg。通常，在本文中的包含二价阳离子(诸如Lys-Lys)的制剂中包含张力调节剂，其浓度小于100mM，诸如小于80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或更低。例如，在本文中的包含二价阳离子(诸如Lys-Lys)的制剂中包含张力调节剂，其浓度为或约为10mM-50mM，诸如约或接近10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。

张力调节剂包括但不限于：甘油、NaCl、氨基酸、多元醇、海藻糖和其它盐和/或糖。例如，本文提供的制剂可任选地包含NaCl作为张力调节剂。可包含以下浓度的NaCl：为或约为0mM-200mM，诸如通常为30mM-100mM、50mM-160mM，例如50mM-120mM或80mM-140mM。通常，NaCl是小于150mM，并且通常小于140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或更低。具体量是二价阳离子(例如Lys-Lys)的浓度的函数。例如，Lys-Lys的浓度越高，NaCl的浓度越低(或无NaCl)。具体量可以根据经验来确定，以便保留酶活性和/或张力。

在另一实例中，在稳定制剂中任选地包含甘油(丙三醇)。例如，本文提供的制剂通常包含小于60mM(诸如小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、小于30mM、小于25mM、小于20mM、小于15mM、10mM或更低)的甘油。甘油的量通常取决于存在的二价阳离子(例如Lys-Lys)的量：存在于制剂中的二价阳离子(例如Lys-Lys)越多，达到期望的渗量所需的甘油越少。因此，在一些情况下，在制剂中包含少量甘油或不需要包含甘油。

7.其它物质或赋形剂

本文提供的稳定制剂可以任选地包含一种或多种其它物质、媒介物、赋形剂或防腐剂。例如，在本文提供的稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂中可任选地包含的示例性稳定剂包括但不限于：氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂和其它物质。例如，在本文的制剂中可任选地包含的稳定剂的类型包括氨基酸稳定剂或透明质酸酶抑制剂(例如透明质酸酶底物，诸如透明质酸)。示例性氨基酸稳定剂、氨基酸衍生物或胺包括但不限于：L-精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、Lys-Lys、Gly-Gly、氧化三甲胺(TMAO)或甜菜碱。示例性糖和多元醇包括但不限于：甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、蔗糖或海藻糖。示例性盐和缓冲剂包括但不限于：氯化镁、硫酸钠、Tris(诸如Tris(100mM))或苯甲酸钠。示例性表面活性剂包括但不限于：泊洛沙姆188(例如

F68)、聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)。其它稳定剂包括但不限于：透明质酸(HA)、人血清白蛋白(HSA)、苯基丁酸、牛磺胆酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或锌。在本文的特定实例中，稳定的乙酰透明质酸降解酶不包含HSA，并且是不含HSA的制剂。

对于配制用于多剂量给药的稳定制剂，所述制剂也可任选地包含一定量的一种或多种防腐剂，所述防腐剂当与上述的组分组合时会得到稳定制剂。当包含时，所述防腐剂以足够的浓度存在以提供例如美国药典(USP)和欧洲药典(EP)的抗微生物要求。在下面的实施例7E中的表23阐述这些要求，其包括最低EP抗微生物要求(EPA)和优选的EP抗微生物要求(EPB)。通常，满足EP(EPA或EPB)抗微生物要求的制剂比仅配制成满足USP抗微生物要求的那些制剂包含更多的防腐剂。通常，当包含时，本文提供的制剂包含一定量的一种或多种防腐剂，其通过杀死组合物的样品中的微生物生物体或抑制其繁殖(如在如在本文其它部分讨论的抗微生物防腐剂有效性试验(APET)中所评价)来表现出抗微生物活性。在本文提供的制剂中可包含的防腐剂的非限制性实例包括但不限于：苯酚、间甲酚(间-甲酚)、对羟基苯甲酸甲酯、苄醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、二盐酸氯己定、二葡萄糖酸氯己定、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、醋酸苯汞、甘油(丙三醇)、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻-甲酚(邻甲酚)、对-甲酚(对甲酚)、氯甲酚、西三溴胺、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯及它们的任意组合。在一个实例中，所述制剂中的防腐剂包含至少一种酚防腐剂。例如，所述制剂包含苯酚或间甲酚，或者包含苯酚和间甲酚。当包含于本文提供的制剂中时，作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)，一种或多种防腐剂的总量可以是，例如，为或约为0.1％-0.4％，诸如0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％，并且通常小于0.4％(w/v)的防腐剂，例如，至少或约至少0.1％、0.12％、0.125％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.175％、0.18％、0.19％、0.2％、0.25％、0.3％、0.325％、0.35％，但是小于0.4％的总防腐剂。

任选地，所述制剂可包含与所述制剂一起给药的载体，诸如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。适合的药用载体的实例由E.W.Martin记载在“Remington's PharmaceuticalSciences”中。这样的组合物会包含治疗有效量的化合物(通常以纯化的形式或部分纯化的形式)以及适合量的载体，从而提供适合向患者给药的形式。这样的药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当静脉内给药所述药物组合物时，水是代表性载体。也可以使用盐水溶液和葡萄糖与甘油的水溶液作为液体载体，特别是对于可注射的溶液。

例如，在胃肠外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂和其它药学可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水、葡萄糖和乳酸化林格氏注射液。非水性胃肠外媒介物包括植物源性不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。在多剂量容器中包装的胃肠外制剂中可以加入抑制细菌或者抑制真菌浓度的抗微生物剂，其包括苯酚或者甲酚、汞制剂、苄醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(TWEEN 80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药用载体也包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇(用于水可混溶的媒介物)，以及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸(用于pH调节)。

连同活性成分，组合物可包含：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石粉；和粘合剂，诸如淀粉、天然树胶(诸如金合欢树胶)、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其它这样的粘合剂。

例如，可向所述制剂中加入的赋形剂蛋白质可以是许多药学可接受的蛋白质或肽中的任一种。通常，根据将其向哺乳动物个体给药而不引起免疫应答的能力来选择赋形剂蛋白质。例如通常，人血清白蛋白非常适合用于药物制剂中，尽管通常它未被包含在本文的稳定制剂中。其它已知的药物蛋白质赋形剂包括但不限于：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、天然碳酸钙(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。制剂中包含足以防止蛋白质吸附至容纳容器或小瓶的浓度的赋形剂。赋形剂的浓度会随赋形剂的性质和复合制剂中蛋白质的浓度而变化。

如果需要，组合物也可包含微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸酯和其它这样的试剂。

8.示例性稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂

本文提供稳定的乙酰透明质酸降解酶制剂，其在37℃-42℃(诸如大于或等于37℃或40℃)的温度稳定持续至少三(3)天，并且通常至少1个月。

在一个实例中，示例性制剂包含100U/mL-1000U/mL(诸如100U/mL-500U/mL或100U/mL-300U/mL)的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是至少或约至少或约155U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))；5mM-200mM或约5mM-约200mM(诸如10mM-50mM或5mM-20mM)的Lys-Lys(例如至少或约至少10mM、20mM、30mM、40mM或50mM)；0mM-300mM或约0mM至约300mM的磷酸氢二钠(例如是或约是0mM-150mM，或5mM-50mM的磷酸氢二钠，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM、100mM或150mM)；0mM-50mM或约0mM-约50mM的甲硫氨酸(例如是或约是5mM-20mM，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甲硫氨酸)；和0.01％-0.5％或约0.01％-约0.5％的泊洛沙姆188，诸如0.01％-0.05％(例如至少或约至少0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％的聚山梨酯80)。制备的制剂的pH是或约是6.5-7.6，诸如是或约是6.5-7.2或7.0-7.6或约7.0-约7.6(例如至少或约至少pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。在其它实例中，包含小于140mM的浓度的NaCl。例如，包含是或约是50mM-150mM(诸如至少或约至少50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM)浓度的NaCl。

在另一实例中，示例性制剂包含100U/mL-1000U/mL(诸如100U/mL-500U/mL或100U/mL-300U/mL)的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是至少或约至少或约155U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))；5mM-200mM或约5mM-约200mM(诸如是或约是50mM-150mM)的MgCl₂(例如至少或约至少50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM或150mM)；0mM-300mM或约0mM至约300mM的盐酸组氨酸(例如是或约是0mM-150mM或5mM-50mM的盐酸组氨酸，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM、100mM或150mM)；0mM-50mM或约0mM-约50mM的甲硫氨酸(例如是或约是5mM-20mM，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甲硫氨酸)；和0.01％-0.5％或约0.01％-约0.5％的泊洛沙姆188，诸如0.01％-0.05％(例如至少或约至少0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％的聚山梨酯80)。制备的制剂的pH是或约是6.5-7.6，诸如是或约是6.5-7.2或7.0-7.6或约7.0-约7.6(例如至少或约至少pH6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。

E.胰岛素多肽

本文提供乙酰透明质酸降解酶和胰岛素的复合制剂。本文提供的复合制剂包含速效胰岛素，诸如正规胰岛素或胰岛素类似物(例如被称作速效类似物或快速起效的类似物，它们在本文中互换使用)，其经过修饰(例如通过氨基酸置换)以减少胰岛素的自结合并导致六聚体的更快速解离。

胰岛素为包含51个氨基酸残基的多肽，分子量为5808道尔顿。其由胰腺中的胰岛(Langerhans)β-细胞产生。示例性人胰岛素翻译为110个氨基酸的前体多肽，前胰岛素原(SEQ ID NO:101)包含定向至ER的24个氨基酸的信号肽，该信号序列被裂解，产生胰岛素原(SEQ ID NO:102)。随后通过已知为激素原转化酶(PC1和PC2)的蛋白水解酶的作用和肽链端解酶(exoprotease)羧肽酶E的作用，将胰岛素原分子转化为成熟胰岛素。这引起4个碱性氨基酸残基和剩余的31个氨基酸C-肽或连接链(对应于SEQ ID NO:101所示的前胰岛素原多肽的氨基酸残基57-87)的移除。所得胰岛素包含21个氨基酸的A-链(对应于SEQ ID NO:102所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基66-86)和30个氨基酸的B-链(对应于SEQ ID NO:102所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基1-30)，它们通过二硫键交联。通常，成熟胰岛素包含三个二硫桥：一个在A-链的7位和B链的7位之间，第二个在A链的20位和B链的19位之间，第三个在A链的6位和11位之间。成熟胰岛素A链的序列显示于SEQ ID NO:103，B链的序列显示于SEQ ID NO:104。

提及的胰岛素包括前胰岛素原、胰岛素原以及单链或双链形式的胰岛素多肽、其具有活性的截短形式，并包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体或其它变体，例如包含与SEQ ID NO:101所示前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽的胰岛素类似物或其它衍生化形式，只要该胰岛素与人胰岛素受体结合以起始引起葡萄糖摄入和储存增加和/或内源性葡萄糖产生降低的信号级联。例如，胰岛素包括胰岛素的物种变体。这些包括但不限于衍生自牛(SEQ ID NO:133)和猪(SEQ ID NO:123)的胰岛素。牛胰岛素与人胰岛素在A链的8和10位氨基酸以及B链的30位氨基酸存在差异。猪胰岛素与人胰岛素仅在B链的30位氨基酸存在差异，与牛的序列一样，该位点存在代替苏氨酸的丙氨酸取代。其它示例性胰岛素种类变体为SEQ ID NO:105-146中所显示的任一个。

胰岛素变体也包括与SEQ ID NO:103和104(A链和B链)所示的人胰岛素相比含有一个或多个氨基酸修饰的胰岛素类似物。这些变体包括速效或长效胰岛素类似物(在本文中都命名为速效胰岛素类似物，尽管要理解，为了本文中的目的，这包括速效和长效胰岛素类似物形式)。包括速效和长效胰岛素类似物形式在内的示例性胰岛素类似物(A链和B链)显示于SEQ ID NO:147-165、182-184。例如，胰岛素类似物包括但不限于赖谷胰岛素(LysB3、GluB29；显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:149(B-链))、HMR-1 153(LysB3、IleB28；显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:182(B-链))、HMR-1423(GlyA21、HisB31、HisB32；显示于SEQ ID NO:183(A-链)和SEQ ID NO:184(B-链))、门冬胰岛素(AspB28；显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:147(B-链))，以及赖脯胰岛素(LysB28,ProB29；显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:148(B-链))。在上述每个例子中，所述类似物的命名基于胰岛素A链或B链上特定位点的氨基酸取代的描述(从链的N端编号)，其中序列的剩余部分为天然人胰岛素序列。

因此，在本文的复合制剂中提供的正规胰岛素是包含SEQ ID NO:103和104所示的氨基酸序列的成熟胰岛素。示例性正规人胰岛素是命名为

R的重组人胰岛素。正规胰岛素也包括具有A链和B链的成熟胰岛素的物种变体，例如，SEQ ID NO:105-146中任一个的成熟形式。在本文的复合制剂中包含的其它示例性胰岛素类似物包括但不限于这样的胰岛素：其具有在SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:149(B-链)中所示的氨基酸序列；在SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:147(B-链)中所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:148(B-链)中所示的氨基酸序列。

上述任意胰岛素多肽包括由任意物种(例如人)的胰腺产生的那些，也包括合成产生的或使用重组技术产生的胰岛素。例如，如本文其它部分所描述，可通过表达胰岛素A链和B链的合成基因，通过表达完整的胰岛素原并将其暴露于适合的酶法和化学方法以生成成熟的胰岛素，或通过表达由连接肽连接的A链和B链，来生物合成制备胰岛素(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg andRifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。

胰岛素也包括单体和寡聚体形式，例如六聚体形式。胰岛素在血浆中循环时可以单体形式存在，并且其为单体形式时也结合它的受体。然而，胰岛素具有自身结合为二聚体的倾向，并且在金属离子(例如Zn²⁺)存在时易于结合为更高级别的结构(例如六聚体)。有两个对称的对于Zn²⁺高亲和力的结合位点，然而也报道了其它较弱的锌结合位点(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg andRifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。自结合(self-association)对于分子防止化学降解和物理变性的稳定性是重要的。因此，在胰腺β细胞的储存小泡中，胰岛素以六聚体的形式存在。然而，释放到胞外空间后，人们认为这些胰岛素六聚体可能经历pH向更中性的条件的变化，并且含锌离子的六聚体被稀释，这使得该六聚体不稳定。可能有其它原因导致该胰岛素六聚体在胞外空间的去稳定化。因此存在于血液中的胰岛素主要为单体。为了利用这一稳定化作用，大多数市售胰岛素制剂包含足量的锌离子以促进自结合为六聚体。然而，六聚体结构减慢这些制剂皮下给药后的吸收速率。

胰岛素用作例如糖尿病患者的血糖控制的治疗剂。根据给药胰岛素控制血糖是用于基础疗法、餐时疗法或其组合，存在多种类型的胰岛素制剂。可仅以速效制剂、仅以基础作用制剂(即中效和/或长效形式)或以其混合物(参见例如表4)的形式提供胰岛素制剂。通常，混合物包含速效和中效或长效胰岛素。例如，可以包括10:90、20:80、30:70、40:60和50:50在内的多种混合比例将速效胰岛素与NPH胰岛素(如以下论述的示例性中效胰岛素)组合。这些预混合的制剂可通过在单一制剂中方便地提供进餐相关的和基础的胰岛素需求，从而减少每日胰岛素注射的次数。

胰岛素制剂包括以特定方式配制的胰岛素多肽或其变体(即类似物)。在一些情况下，它是制剂中的赋予胰岛素不同性质(诸如不同作用持续时间)的组分和物质。例如，多数胰岛素制剂在制剂中包含金属离子(诸如锌)，其通过促进分子的自结合而稳定化胰岛素。自结合为六聚体形式可以在给药后影响胰岛素的吸收。此外，一些较长效的基础胰岛素制剂通过加入锌使胰岛素从乙酸盐(而不是磷酸盐)缓冲液中沉淀而制备。当收集具有高的锌含量的大胰岛素晶体并将其再悬浮于醋酸钠-氯化钠溶液(pH 7.2-7.5)中时，其在皮下注射后被缓慢吸收并发挥长期作用。该晶体制剂被称为长效(extended)胰岛素锌混悬剂(特慢胰岛素)。其它含锌胰岛素制剂包括，例如Semilente胰岛素(速效胰岛素锌混悬剂)和缓释胰岛素(胰岛素锌混悬剂)，它们的差别主要在于所使用的锌浓度。含锌胰岛素制剂也包括由鱼精蛋白修饰的那些，例如NPH胰岛素。

在另一实例中，可向胰岛素多肽中加入沉淀剂(例如鱼精蛋白)以生成微晶混悬剂。通常，与不以结晶形式存在的胰岛素相比，结晶胰岛素具有延长的作用时间。当其在水性混悬剂中皮下注射时，鱼精蛋白锌胰岛素仅在沉积部位缓慢溶解，并且以减慢的速率吸收该胰岛素。鱼精蛋白锌混悬剂胰岛素已大量地被也称作NPH胰岛素的低精蛋白胰岛素混悬剂代替。其为结晶形式的经修饰的鱼精蛋白锌胰岛素混悬剂。调节胰岛素、鱼精蛋白和锌的浓度使得该制剂具有介于正规胰岛素和鱼精蛋白锌胰岛素混悬剂之间的起效和作用时间。

另外，制剂的pH差异也影响胰岛素的类型和性质。多数胰岛素为在中性pH下配制。一个例外是甘精胰岛素，其以pH 4.0的市售制剂的形式提供。由于向B-链的C-端添加了两个精氨酸，改变了甘精胰岛素的等电点，使其在酸性pH下更可溶。另外的氨基酸变化存在于A链(N21G)以防止酸敏感的天冬酰胺引起的脱酰胺作用和二聚化。甘精胰岛素的A链序列显示于SEQ ID NO:150并且B链显示于SEQ ID NO:151。由于在给药后暴露于生理pH，所以形成微量沉淀，其使得甘精胰岛素与结晶、长效胰岛素相似。

下面表4总结了多种类型的胰岛素、它们的起效开始和它们的应用。

最常用的胰岛素为速效胰岛素，其包括正规胰岛素(即天然的或野生型胰岛素，包括其等位基因变体和物种变体)和速效胰岛素类似物。用于本文目的，除非另外具体指明，提及的胰岛素指速效胰岛素。

速效胰岛素

在本文提供的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的复合制剂中可以使用的速效胰岛素包括正规胰岛素(其是野生型或天然胰岛素)和速效胰岛素类似物。由于它们与基础作用胰岛素相比具有快速的吸收速率，所以速效胰岛素主要用于餐后控制目的。示例性速效胰岛素显示于下面表5中。速效胰岛素也包括任意本领域已知的，例如但不限于在第7,279,457号美国专利和第20070235365、20080039368、20080039365、20070086952、20070244467和20070191757号美国专利公开中公开的任意胰岛素制剂和装置。可以将任意速效胰岛素与本文提供的乙酰透明质酸降解酶一起组合于复合制剂中。除了乙酰透明质酸降解酶以外，这样的制剂还可以进一步包括速效胰岛素与中效或长效胰岛素的混合物。

a.正规胰岛素

正规胰岛素包括天然或野生型胰岛素多肽。这些包括人胰岛素，以及来自牛、猪和其它物种的胰岛素。正规人胰岛素以

R、

R和

销售。猪胰岛素以Iletin

销售。通常，当单独皮下给药正规胰岛素时具有30分钟的起效开始。最大血浆水平出现在1-3小时并且强度的持续随剂量增加。皮下给药后的血浆半衰期为约1.5小时。

b.速效类似物(也称为快速起效的胰岛素)

速效胰岛素类似物(在本领域中经常将其称作速效胰岛素)为胰岛素的修饰形式，其通常包含一个或多个氨基酸改变。为了与正规胰岛素相比，增加吸收速率和起效的目的，对这些类似物进行设计以减少胰岛素分子的自结合。通常，在锌存在下配制这样的类似物，因此它们作为稳定的锌六聚体存在。然而，由于修饰，它们与正规胰岛素相比，在皮下给药后更快地从六聚体状态解离。

i.赖脯胰岛素

人赖脯胰岛素为这样的胰岛素多肽制剂，其包含在B-链的28位和29位的氨基酸改变使得SEQ ID NO:104所示野生型胰岛素B-链在该位点的Pro-Lys转换为Lys-Pro。赖脯胰岛素的序列显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:148(B-链)。它以商品名

(赖脯胰岛素,rDNA起源)销售。这两个氨基酸的转换(inversion)得到自结合倾向降低的多肽，使得其起效更快。具体而言，B-链中的序列转换引起两个疏水相互作用的消除和稳定二聚体的两个β-折叠片氢键的减弱(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistryand Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。由于所述制剂中提供的赋形剂(例如抗微生物剂，例如间甲酚)和起稳定作用的锌，该多肽自结合并形成六聚体。尽管如此，由于氨基酸修饰，赖脯胰岛素比正规胰岛素更快速地起效。

ii.门冬胰岛素

人门冬胰岛素为包含在SEQ ID NO:104所示人胰岛素B链28位处由脯氨酸向门冬氨酸的氨基酸取代的胰岛素多肽制剂。门冬胰岛素的序列显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:147(B-链)。它以商品名

(门冬胰岛素[rDNA起源]注射液)销售。门冬胰岛素中的修饰提供带负电荷的侧链羧基，以产生电荷排斥并使单体-单体相互作用不稳定。此外，脯氨酸的移除消除了单体之间关键的疏水相互作用(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’sDiabetes Mellitus(pp.481-500)McGraw-Hill Professional)。该类似物主要以单体形式存在，并且与其它速效类似物(例如赖脯胰岛素)相比，较不易聚集。通常，门冬胰岛素和赖脯胰岛素在各自的药代动力学和药效学性质方面相似。

iii.赖谷胰岛素

人赖谷胰岛素为与SEQ ID NO:104所示的人胰岛素B链的序列相比，包含在B-链的B3位处由天冬酰胺向赖氨酸的氨基酸取代和在氨基酸B29处由赖氨酸向谷氨酸的氨基酸取代的胰岛素多肽制剂。赖谷胰岛素的序列显示于SEQ ID NO:103(A-链)和SEQ ID NO:149(B-链)。它以商品名

(赖谷胰岛素[rDNA起源]注射液)销售。与人胰岛素相比，这些修饰使得该多肽分子较不易自结合。与其它胰岛素类似物不同，该多肽在商业上是在不存在促进六聚体的锌的存在下配制的(Becker等人(2008)Clinical Pharmacokinetics,47:7-20)。因此，赖谷胰岛素具有比赖脯胰岛素和门冬胰岛素更快的起效速率。

F.胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的稳定复合制剂

本文提供胰岛素(特别是速效胰岛素，包括正规胰岛素和速效胰岛素类似物(也称为快速起效的胰岛素类似物))和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶(例如rHuPH20))的稳定复合制剂。本文提供的示例性制剂是速效胰岛素类似物和PH20或其C-端截短的可溶性的并且有活性的片段(例如rHuPH20)的稳定复合制剂。为了在不同温度或在不同条件下的稳定性，配制所提供的包含乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素的组合物。如本文中所述，本文提供的复合制剂在是或约是0℃-40℃或在不同应力条件(例如搅拌)下稳定数小时、数天、数周、数月或数年。因此，所述制剂适合用于多剂量使用，或者适合用于需要升高的温度或搅拌的其它使用条件。例如，所述复合制剂适合用于多剂量可注射(MDI)制剂以及连续皮下输注(CSI)制剂。将本文提供的复合制剂配制用于通过皮下、腹膜内、真皮内、肌肉内、注射和透皮途径给药。示例性制剂被配制用于皮下给药。

本文提供的稳定复合制剂是多剂量制剂。因此，本文提供的所有制剂包含胰岛素(例如速效胰岛素，诸如速效胰岛素类似物)、乙酰透明质酸降解酶(例如PH20)、防腐剂和一种或多种其它稳定化赋形剂。

如本文中所述的和在实施例中例证的，发现由于乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和速效胰岛素的稳定性的相反要求，复合制剂不可简单地通过混合二者的制剂来得到。例如，正确的NaCl浓度和pH对于胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20或其它可溶性透明质酸酶和乙酰透明质酸降解酶)的复合制剂的稳定性而言是关键的。这些参数对胰岛素和示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20的相反作用，使最优NaCl浓度和pH的确定复杂化。胰岛素溶解度在较高pH和较低NaCl浓度为最大。但是，这些条件对rHuPH20是有害的，所述rHuPH20在较高pH和较低NaCl浓度丧失稳定性。通过增加NaCl浓度和降低pH，可以增加示例性乙酰透明质酸降解酶rHuPH20的稳定性。但是，这样的条件对胰岛素和胰岛素类似物的溶解度具有负面作用，它们在低pH和高NaCl浓度发生沉淀。因此，本文的目的包括，提供对于胰岛素和rHuPH20(或其它可溶性透明质酸酶和乙酰透明质酸降解酶)的稳定制剂而言最优的NaCl浓度和pH，或者提供不包含NaCl或包含较低NaCl浓度的稳定复合制剂。

如本文中所述的，不同的稳定制剂可以用于多次药物注射(MDI)，或者可以用于连续皮下胰岛素输注(CSII)。所述两种给药模式具有不同的稳定性要求。具体地，用于CSII的复合制剂需要在加速(或应力)条件(诸如升高的温度和在搅拌)下是稳定的，而用于MDI的复合制剂(其在使用前可以在冷藏或环境温度储存)不需要在升高的温度和在搅拌下是稳定的。因此，如本文其它部分所述，促进在这些储存条件中的每一种下的稳定性的赋形剂或赋形剂浓度不一定是相同的。例如，与在或约在20-30℃或在或约在2-8℃维持乙酰透明质酸降解酶和/或胰岛素的稳定性的要求相比，在或约在32-40℃或在搅拌下需要其它赋形剂或稳定剂或不同浓度的赋形剂或稳定剂来维持稳定性。这些相同的稳定剂可能不与制剂在较低温度的稳定性相容。

例如，在本文中发现，尽管当在小于32℃的低温储存或使用时，胰岛素在高NaCl浓度和低pH条件下通常是不稳定的，这样的条件有助于胰岛素在32℃-40℃的较高的温度持续至少3天的溶解性。因此，高NaCl和低pH的条件可以存在于在CSII中使用的复合制剂中，所述CSII是需要在较高温度的稳定性的给药疗法。在本文中证实，包含低pH(例如pH 6.8)和高NaCl(例如200mM)的制剂在升高的温度是稳定的，因而适合用于CSII在37℃持续至少3天。低pH(例如pH 6.8)和高NaCl(例如200mM)对于在较低储存温度(诸如在冷藏或环境温度)的稳定性是不适合的。

此外，稳定剂透明质酸(HA)是有效的稳定剂，并在用于CSII的升高的温度维持乙酰透明质酸降解酶的稳定性，而不表现出对胰岛素溶解度的任何有害作用。在该情况下，尽管透明质酸促进乙酰透明质酸降解酶在升高的温度的稳定性，胰岛素在冷藏温度的溶解度降低。因此，用于在较低温度更长期储存的MDI制剂中的HA的存在可以影响胰岛素溶解度。

在本文中还发现，Lys-Lys是乙酰透明质酸降解酶的特别好的稳定剂，特别是在大于37℃的升高的温度。不同于MgCl₂(其也是乙酰透明质酸降解酶在升高的温度的特别强的稳定剂)，可以使Lys-Lys与胰岛素相容并且维持溶解度。例如，较低浓度的Lys-Lys和一种或多种其它稳定剂的存在在加速条件(诸如升高的温度)下保留乙酰透明质酸降解酶活性和胰岛素溶解度。因此，这样的包含Lys-Lys的复合制剂也可以适合用于CSII应用。

尽管用于稳定的MDI或CSII制剂的赋形剂或赋形剂浓度不一定是相同的，本文提供的MDI制剂可以用于产生稳定的CSII制剂。因此，在一些实例中，用具有较低pH和较高盐浓度的稀释剂稀释MDI复合制剂(其在冷藏和环境温度是稳定的，但在升高的温度和应力下不一定是稳定的)。这得到与MDI制剂相比具有更低pH和更高盐浓度的制剂，因此其在升高的温度和应力条件下(例如在搅拌下)是稳定的并且适合用于CSII。通常，由于胰岛素在具有低pH和高盐浓度的组合物中的不溶解性，不在冷藏温度储存这样的CSII复合制剂。

通常，使用本领域熟知的技术和方法(参见例如，Ansel Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第四版,1985,126)，将化合物配制成药物组合物。考虑到管理机构或其它机构的批准，根据普遍公认的用于动物和人类的药典，制备药学可接受的组合物。制剂应为适合给药的模式。

可以将复合制剂以液体形式的药物制剂(溶液剂、糖浆剂或混悬剂)提供。以液体形式，可以将药物制剂以在使用前稀释至治疗有效浓度的浓制剂形式提供。通常，以不需要稀释即可使用的剂型制备制剂。这样的液体制剂可以通过常规方式用以下药学可接受的添加剂制备：诸如助悬剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性的媒介物(例如，扁桃仁油、油状酯或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在另一实例中，药物制剂可以低压冻干形式存在，用于在使用前用水或其它适合的媒介物重构。

本文提供的复合制剂的体积可以是适合于其中提供它的容器的任意体积。在一些实例中，将复合制剂在小瓶、注射器、笔、泵用容器或闭环系统或其它任意适合的容器中提供。例如，本文提供的复合制剂是或约是0.1mL-500mL，诸如0.1mL-100mL、1mL-100mL、0.1mL-50mL，诸如至少是或约至少是或约是或是0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。

如下文所述，在一些实例中，将复合制剂制备为胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的浓制剂，然后用适当的稀释剂稀释使用。在这样的情况中，可以专门配制浓复合制剂用于在例如2℃-8℃或约2℃至约8℃下长期储存。稀释后，所述复合制剂可以直接用于MDI应用。另一方面，由于用在MDI中的多剂量制剂的要求或CSII疗法的要求可以是不同的，可以选择稀释剂的组分，以确保稀释的复合制剂对于所述复合制剂在升高的温度或在搅拌下的应用的稳定性。例如，如上面和在下面进一步所讨论，所述稀释剂可包含，例如，需要量或水平的组分或稳定剂，其与所述复合制剂在升高的温度或在应力条件(例如搅拌)下的稳定性相容，所述条件是CSII疗法的特征性条件。因此，当用稀释剂稀释胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的浓复合制剂时，新稀释的复合制剂在例如升高的温度(诸如至少或约至少32℃-40℃，诸如37℃或约37℃)或其它应力条件(例如搅拌)下是稳定的(例如用于CSII疗法)。

下面提供在本文的稳定复合制剂中提供的组分的描述。本文提供的复合制剂中包含的两种蛋白质的稳定性最大化的要求的特定平衡，现在使得给药所述复合制剂的多剂量可注射制剂和CSII系统(例如闭合泵给药)成为可能。下面提供每种组分或条件(诸如赋形剂、稳定剂或pH)的描述。

1.稳定复合制剂的组分

本文提供包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂。所述复合制剂也包含治疗有效量的速效胰岛素，诸如快速起效(例如速效)胰岛素类似物。在本文提供的复合制剂的实例中，所述复合制剂还包含：浓度为或约为50mM-200mM(诸如80-140mM)的NaCl，为或约为6.5-8.0(例如，6.5-7.8或6.8-7.8，诸如为或约为6.5-7.5或7.0-7.6)的pH，维持该pH范围的缓冲剂，抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，和在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性且保留至少90％的胰岛素纯度、回收和/或效能的量的稳定剂。例如，本文提供的复合制剂包含0.01％-0.5％的表面活性剂作为稳定剂。所述复合制剂可以任选地包含额外稳定剂或抗氧化剂。在本文的一些实施例中，所述复合制剂在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少6个月，并且在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)。这样的复合制剂可以用于多剂量注射(MDI)用途。在其它实例中，本文提供的复合制剂在加速条件(诸如大于或约大于32℃的升高的温度，诸如35℃-40℃，特别是大于或约为或为37℃或40℃)和/或搅拌条件下稳定持续至少3小时，并且通常至少3天。这样的复合制剂可以用于连续皮下胰岛素输注(CSII)方法。

本文还提供这样的复合制剂：其不包含NaCl，或者包含较少量的NaCl，诸如小于140mM的NaCl，并且通常0mM-100mM的NaCl，例如，0mM-50mM、10mM-40mM、20mM-30mM，诸如至少为或约至少为或为30mM的NaCl。在本文中发现，在这样的实例中可以包含即使在没有NaCl存在下也会稳定化乙酰透明质酸降解酶和胰岛素的量的Lys-Lys。在这样的制剂中任选地包含例如，作为张力调节剂的NaCl。例如，如果Lys-Lys的浓度是50mM的Lys-Lys或更低，这可以是必要的。

因此，在本文提供的复合制剂的一些实例中，所述复合制剂包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))。所述复合制剂也包含治疗有效量的速效胰岛素，诸如快速起效(例如速效)胰岛素类似物。在本文提供的复合制剂的实例中，所述复合制剂还包含：浓度为或约为50mM-120mM(诸如50-80mM、80mM-100mM或100mM-120mM)的Lys-Lys，为或约为6.5-8.0(例如，6.5-7.8或6.8-7.8，诸如为或约为6.5-7.5或7.0-7.6)的pH，维持该pH范围的缓冲剂，抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，和在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性且保留至少90％的胰岛素纯度、回收和/或效能的量的稳定剂。例如，本文提供的复合制剂包含0.0005％-1.0％(例如0.0005％-0.005％)的表面活性剂作为稳定剂。所述复合制剂可以任选地包含其它的稳定剂、张力调节剂、抗氧化剂和/或其它赋形剂。例如，所述复合制剂包含小于140mM，诸如为或约为0mM-100mM，例如为或约为0mM-50mM、10mM-40mM或20mM-30mM浓度的NaCl。在本文的一些实例中，所述复合制剂在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少6个月，和在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)。这样的复合制剂可以用于多剂量注射(MDI)用途。在其它实例中，本文提供的复合制剂在加速条件(诸如大于或约大于32℃的升高的温度，诸如35℃-40℃，特别是大于或约为或为37℃或40℃)和/或搅拌条件下稳定持续至少3小时，并且通常至少3天。这样的复合制剂可以用于连续皮下胰岛素输注(CSII)方法。

a.速效胰岛素

本文提供的复合制剂包含治疗有效量的速效胰岛素，诸如速效胰岛素类似物。所述胰岛素可以是如在部分E中描述的任意速效胰岛素。所述速效胰岛素可以是正规胰岛素。在特定实例中，所述胰岛素是为速效胰岛素类似物(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素)的速效胰岛素。例如，所述治疗有效量可以是以下量：为或约为10单位/mL-1000U/mL、100U/mL-1000U/mL或500U/mL-1000U/mL，诸如至少或约至少10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml、500U/mL或1000U/mL。例如，本文提供的复合制剂包含速效胰岛素，诸如速效胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素)，其量至少是或至少约是或是或约是100U/mL。

在本文提供的稳定复合制剂中，制剂中的胰岛素(包括胰岛素类似物)的稳定性是在如本文中所述的不同温度(例如2℃-8℃、20℃-30℃，或至少为或约为32℃-40℃的升高的温度)和时间(例如数小时、数天、数周或数月)或使用条件(例如搅拌)下储存的胰岛素的回收、纯度和/或活性的函数。下面讨论用于评价这些参数的测定。本文提供的制剂保留胰岛素回收、纯度和/或活性，使得所述制剂适合用于如本文中所述的治疗用途。例如，在本文提供的制剂中，在如本文中所述的储存或使用条件下随时间变化的胰岛素纯度(例如通过RP-HPLC或其它类似方法来评估)是在储存或使用之前制剂中的胰岛素纯度的至少85％，例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。通常，对于胰岛素纯度(例如通过RP-HPLC)，可接受的目标规格是至少或约90％的纯度或约或大于90％的纯度。在其它实例中，可以将胰岛素纯度评估为胰岛素聚集的函数，例如，使用非变性或变性尺寸排阻色谱法(SEC)评估。在这样的实例中，在本文提供的制剂中，在如本文中所述的储存或使用条件下随时间变化，所述制剂中的胰岛素包含小于2％的高分子量(HMWt)胰岛素种类(以峰面积计)，例如，小于1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％或更少。在如本文中所述的储存(例如在不同的温度和时间)或使用(例如搅拌)条件下随时间(例如数小时、数天、数周或数月)变化，本文提供的制剂中的胰岛素保留它的大于或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的回收或活性。因此，在用100单位/mL胰岛素配制的溶液中，在2℃-8℃、20℃-30℃的温度或在至少或约32℃-40℃的升高的温度或在如本文中所述的搅拌条件下储存或使用，在数小时、数天、数周或数月的时间内保留至少或约90U/mL、91U/mL、92U/mL、93U/mL、94U/mL、95U/mL、96U/mL、97U/mL、98U/mL或99U/mL。

b.乙酰透明质酸降解酶

本文提供的复合制剂包含治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶，诸如在C部分中描述的任一种，例如透明质酸酶，诸如PH20(例如rHuPH20)。在本文提供的复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的量是足以使所述组合物超速效的量。例如，所述量在功能上等价于至少或约至少30单位/mL。例如，本文提供的复合制剂包含以下量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))：为或约为30单位/mL-20,000U/mL、300U/mL-15,000U/mL、300U/mL-10,000U/mL、300U/mL-5,000U/mL、300U/mL-3000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-20,000U/mL、600U/mL-15,000U/mL、600U/mL-10,000U/mL、600U/mL-6000U/mL、600U/mL-4000U/mL、600U/mL-2000U/mL、600U/mL-1000U/mL、60U/mL-600U/mL或100U/mL-300U/mL，诸如至少或约至少30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL、7000U/mL、8000U/mL、9000U/mL、10,000U/mL、12,000U/mL、15,000U/mL或20,000U/mL。例如，本文提供的复合制剂包含PH20(例如rHuPH20)，其量至少为100U/mL-1000U/mL，例如至少是或约至少是或约是或是600U/mL。

在本文提供的复合制剂中，在制剂中的乙酰透明质酸降解酶(包括透明质酸酶，诸如PH20(例如rHuPH20))的稳定性是所述酶在如本文中所述的在不同温度(例如2℃-8℃、20℃-30℃，或至少或约32℃-40℃的升高的温度)和时间(例如数小时、数天、数周或数月)或使用条件(例如搅拌)下储存的酶的回收和/或活性的函数。下面讨论用于评估这些参数的测定。本文提供的制剂保留透明质酸酶回收和/或活性，使得所述制剂适合用于如本文中所述的治疗用途。在本文提供的稳定复合制剂中，乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20)的活性通常是在储存或使用之前所述制剂中的酶的活性的大于或约50％，诸如大于或至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。通常，对于透明质酸酶活性，可接受的稳定性目标规格是，在2℃-8℃、20℃-30℃的温度或至少或约32℃-40℃的升高的温度，或在如本文中所述的搅拌条件下的储存或使用中，为至少62％的酶的初始活性持续数小时、数天、数周或数月。因此，例如，在用600U/mL的乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)配制的溶液中，在储存或使用条件下随时间保留至少或约至少360单位/mL、365U/mL、370U/mL、375U/mL、380U/mL、390U/mL、420U/mL、480U/mL、540U/mL、546U/mL、552U/mL、558U/mL、564U/mL、570U/mL、576U/mL、582U/mL、588U/mL、594U/mL或更高的活性。例如，在本文提供的稳定复合制剂中，在储存或使用条件(例如搅拌)下随时间变化，保留至少375U/mL的乙酰透明质酸降解酶活性。在其它实例中，可以将稳定性评估为酶的回收的函数(例如使用RP-HPLC)。在这样的实例中，本文提供的制剂的所述透明质酸酶酶回收是或约是60％-140％。例如，在本文提供的制剂中，所述透明质酸酶酶回收是或约是3-7μg/mL。

c.防腐剂

为了用作多剂量制剂，本文提供的复合制剂包含一种或多种防腐剂。如以上所讨论的，防腐剂可以对胰岛素的溶解度和乙酰透明质酸降解酶(诸如PH20(例如rHuPH20))的稳定性和活性具有有害作用，同时稳定化六聚体胰岛素分子，并且其作为多剂量制剂中的抗微生物剂是必需的。因此，本文中的目标之一是，鉴别可以用在胰岛素(包括速效胰岛素类似物)和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶(例如rHuPH20))的稳定复合制剂中的防腐剂的类型和浓度。

存在于所述复合制剂中的一种或多种防腐剂不可以使乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))大幅失稳，使得它在如本文中所述的储存条件(例如随时间和在不同的温度)下丧失它的活性。此外，这些防腐剂必须以足够的浓度存在以稳定化胰岛素六聚体并发挥所需的抗微生物作用，但是不会浓至降低胰岛素的溶解度。重要的是，防腐剂必须以足够的浓度存在以满足例如美国药典(USP)和欧洲药典(EP)的抗微生物要求。表23(在下面的实施例7E中)阐述了这些要求，包括最低EP抗微生物要求(EPA)和优选的EP抗微生物要求(EPB)。通常，满足EP(EPA或EPB)抗微生物要求的制剂包含比仅配制成满足USP抗微生物要求的那些制剂更多的防腐剂。

因此，本文提供的复合制剂包含一定量的一种或多种防腐剂，其通过杀死所述组合物的样品中的微生物生物体或抑制其繁殖(如通过抗微生物防腐剂有效性试验(APET)所评价的)来表现抗微生物活性。本领域技术人员熟知抗微生物防腐剂有效性试验和为了满足最低要求而在USP和EPA或EPB下应当满足的标准。一般而言，抗微生物防腐剂有效性试验包括：用合适的微生物(即细菌、酵母和真菌)的规定接种物挑战组合物(例如，本文提供的复合制剂)，在规定温度储存接种的制剂，在指定的时间间隔取出样品，并对样品中的生物体计数(参见，Sutton和Porter,(2002)PDA Journal of Pharmaceutical Science andTechnology 56(6)；300-311；The United States Pharmacopeial Convention,Inc.,(2002年1月1日生效),美国药典第25次修订,Rockville,MD,第<51>章AntimicrobialEffectiveness Testing；和欧洲药典,第5.1.3章,Efficacy of AntimicrobialPreservation)。在挑战中使用的微生物通常包括3个细菌菌株，即大肠杆菌(ATCCNo.8739)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC No.9027)和金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)，酵母(白念珠菌，Candida albicans ATCC No.10231)和真菌(黑曲霉菌，Aspergillus niger ATCC No.16404)，将它们全部加入，使得接种的组合物每mL组合物包含10⁵或10⁶个菌落形成单位(cfu)的微生物。在下述情况下，认为组合物的防腐性质是足够的：在试验的条件下，在规定的温度一段时间后，接种的组合物中的微生物的数目具有显著下降或没有增加，如下面的表6所示。以与初始样品或之前的时间点相比，活微生物的数目的对数减少的方式给出评价标准。

具体地，将组合物(例如复合制剂)等分进至少5个容器中，各一个容器用于以下的每一种：细菌或真菌(大肠杆菌(ATCC No.8739)、铜绿假单孢菌(ATCC No.9027)、金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)、白念珠菌(ATCC No.10231)和黑曲霉菌(ATCC No.16404))。然后将每个容器接种试验生物体之一，以得到10⁵或10⁶个微生物/mL组合物的接种物，所述接种物不超过组合物的体积的1％。将接种的组合物在20-25℃的温度维持28天的时段，并根据上面表6所示的标准，在6小时、24小时、7天、14天和28天取出样品。通过平板计数或膜过滤，测定每个样品中的活微生物的数目(cfu)。最后，将每个样品的cfu与接种物或以前的样品进行对比，并确定对数减少。

在USP标准下，在接种有微生物生物体的样品中的防腐剂的抗微生物活性的比率或水平是：在接种后7天细菌生物体具有至少1.0log₁₀单位减少；在接种后14天细菌生物体具有至少3.0log₁₀单位减少；和在用微生物接种物接种组合物后第14天至第28天，细菌生物体至少没有进一步增加，即，不超过0.5log₁₀单位增加。对于根据USP标准的真菌生物体，在接种有微生物生物体的样品中的防腐剂的抗微生物活性的比率或水平是：在用微生物接种物接种组合物后7、14和28天，从初始量至少没有增加。在EPB或最低EP标准下，在接种有微生物生物体的样品中的防腐剂的抗微生物活性的比率或水平是：在接种后24小时细菌生物体具有至少1log₁₀单位减少；在接种后7天细菌生物体具有至少3log₁₀单位减少；和在用微生物接种物接种组合物后28天，细菌生物体至少没有进一步增加，即，不超过0.5log₁₀单位增加。EPA标准要求：在接种后6小时细菌生物体具有至少2log₁₀单位减少，在接种后24小时细菌生物体具有至少3log₁₀单位减少，并且接种后28天微生物生物体没有恢复。对于根据最低EPB标准的真菌生物体，在接种有微生物生物体的样品中的防腐剂的抗微生物活性的比率或水平是：在接种后14天真菌生物体具有至少1log₁₀单位减少，并且在组合物接种后第28天真菌生物体没有增加；并且提高的EPA标准要求：在接种后7天具有2log₁₀单位减少，并且在组合物接种后28天真菌生物体没有增加。

在本文提供的复合制剂中可以包含的防腐剂的非限制性实例包括但不限于：苯酚、间甲酚(间-甲酚)、对羟基苯甲酸甲酯、苄醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、二盐酸氯己定、二葡萄糖酸氯己定、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、醋酸苯汞、甘油(丙三醇)、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚(邻-甲酚)、对甲酚(对-甲酚)、氯甲酚、西三溴胺、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯及它们的任意组合。例如，本文提供的复合制剂可包含单一防腐剂。在其它实例中，所述复合制剂包含至少2种不同的防腐剂或至少3种不同的防腐剂。例如，本文提供的复合制剂可包含2种防腐剂，诸如L-苯丙氨酸和间甲酚、L-苯丙氨酸和对羟基苯甲酸甲酯、L-苯丙氨酸和苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯、苯酚和对羟基苯甲酸甲酯、间甲酚和苯酚或其它类似的组合。在一个实例中，所述复合制剂中的防腐剂包含至少一种酚防腐剂。例如，所述复合制剂包含苯酚或间甲酚，或者包含苯酚和间甲酚。

在本文提供的复合制剂中，作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)，所述一种或多种防腐剂的总量可以是，例如，是或约是0.1％-0.4％，诸如0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％。通常，所述复合制剂包含小于0.4％(w/v)的防腐剂。例如，本文提供的复合制剂包含至少或约至少0.1％、0.12％、0.125％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.175％、0.18％、0.19％、0.2％、0.25％、0.3％、0.325％、0.35％，但是小于0.4％的总防腐剂。

在胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂中使用的示例性防腐剂是苯酚和间甲酚。在一些实例中，所述复合制剂中的苯酚的质量浓度(w/v)百分比(％)大于间甲酚的质量浓度(w/v)百分比(％)。这(至少部分)由于与苯酚相比，间甲酚对溶液中的乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)的稳定性具有更有害的作用，特别是在升高的温度(参见例如实施例7)。因此，在本文提供的复合制剂中，苯酚:间甲酚的比率(作为质量浓度百分比)是大于或是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1或更高。

在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂包含为或约为0.1％-0.25％的苯酚和为或约为0.05％-0.2％的间甲酚，诸如为或约为0.10％-0.2％的苯酚和为或约为0.06％-0.18％的间甲酚，或为或约为0.1％-0.15％的苯酚和为或约为0.08％-0.15％的间甲酚。例如，本文提供的稳定复合制剂包含或包含约0.1％的苯酚和0.075％的间甲酚；0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚；0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚；0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚；0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚；0.15％的苯酚和0.175％的间甲酚；或0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。

d.NaCl

本文提供的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂的实例可包含NaCl作为稳定剂。在本文提供的包含NaCl作为稳定剂的复合制剂中，所述复合制剂可以具有为或约为50mM-200mM，诸如为或约为80mM-140mM、80mM-120mM、80mM-100mM、100mM-140mM或120mM-140mM浓度的NaCl。例如，本文提供胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，其包含约为或至少为或为50mM、60mM、70mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM的NaCl。

另外，在本文中发现，尽管胰岛素通常在高NaCl浓度和低pH条件(在其中乙酰透明质酸降解酶的活性是最优的)不具有足够的可溶性，但是胰岛素的溶解度在升高的温度的加速条件下更少受到NaCl影响。因此，与在小于32℃的温度稳定的制剂相比，在加速条件(例如升高的温度或搅拌，诸如用于CSII疗法的那些条件)下稳定的复合制剂通常包含更高浓度的NaCl。

还要理解，在本文提供的复合制剂中，所述复合制剂中的特定pH可以是NaCl浓度的函数，反之亦然。例如，在具有7.2或约7.2(例如7.2±0.2或更低)的pH的复合制剂中，所述复合制剂通常包含为或约为100mM-140mM的盐浓度。在具有7.3或约7.3(例如7.3±0.2或更高)的pH的复合制剂中，所述复合制剂通常包含为或约为50-100mM的NaCl的盐浓度。

并且，如在本文中的实施例中所述，胰岛素和胰岛素类似物各自具有不同的溶解度要求，所述溶解度受制剂中的NaCl和pH的水平影响。通常，胰岛素和胰岛素溶解度偏好高pH和低盐。例如，正规胰岛素在大于80mM的高NaCl浓度和在低pH 7.0在1周内形成沉淀物。但是，正规胰岛素在80mM或更低的NaCl浓度和高pH 7.6在大于15个月的任意试验时段内未形成沉淀物。类似地，胰岛素类似物赖脯胰岛素和门冬胰岛素也表现出溶解度对盐和pH的依赖作用，通常在大于80mM的盐浓度和在7.2或7.0的低pH形成沉淀物。与此相反，在80mM或更低的低盐浓度和在7.4或7.6的高pH，胰岛素表现出更大的稳定性，并且随时间几乎没有沉淀或没有沉淀。赖谷胰岛素是最可溶性的。因此，与最可溶性的胰岛素相比，最低可溶性的胰岛素耐受更低的盐。因此，因为不同胰岛素的不同表观溶解度，本文提供的制剂的盐浓度可以取决于制剂中的胰岛素的类型，因为胰岛素的溶解度与对盐的耐受直接相关。

考虑到本文中的描述，根据经验来评估本文中的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶随着特定制剂的NaCl浓度、特定胰岛素和所需的稳定性参数而变化的溶解度和稳定性，是在本领域技术人员的水平内。

e.pH

本文提供胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂，其pH为或约为6.5-8.0，例如，6.5-7.8或6.8-7.8，诸如为或约为6.5-7.5或7.0-7.6。在本文中提及的pH是基于在室温的pH测得量。要理解，pH在储存过程中可以随时间变化，但是通常会保持为或约为pH 6.5-8.0，例如6.8-7.8或约6.8-约7.8。例如，pH可以变化±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5或更多。因此，要理解，提及的pH约为或至少为pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.6的复合制剂包括这样的复合制剂：当制备时，其pH为或约为或至少为7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2或7.6±0.2。

由于盐和pH是影响胰岛素的溶解度和乙酰透明质酸降解酶的活性的相反参数，相应地平衡它们在复合制剂中的包含量。因此，例如通常，在本文提供的制剂中，盐浓度越低，pH越高。在本文提供的另一复合制剂的实例中，盐浓度越高，pH越低。如本文中所述，根据经验试验复合制剂中的pH和盐要求以实现期望的稳定性并保留乙酰透明质酸降解酶的活性和胰岛素的溶解度，是在本领域技术人员的水平内。例如，最优pH和盐要求可以通过本领域技术人员已知的制剂技术来得到，并在本文中例证。例如，通过使用本领域技术人员已知的多种方法(例如，如在部分H.2中所述)在不同的pH或盐条件下评估乙酰透明质酸降解酶的活性或回收以及胰岛素的溶解度、聚集或回收，可以确定最优pH和盐浓度。

例如，如在本文其它部分所讨论，在本文中发现，尽管胰岛素通常在高NaCl浓度和低pH条件(在其中乙酰透明质酸降解酶的活性是最优的)不足够可溶，但是胰岛素的溶解度在升高的温度的加速条件下更少受到低pH条件影响。因此，与在小于32℃的温度稳定的制剂相比，在加速条件(例如升高的温度或搅拌，诸如用于CSII疗法的那些条件)下稳定的复合制剂通常具有更低的pH。

如果需要，可以如下调节pH：使用酸化剂降低pH，或使用碱化剂增加pH。示例性酸化剂包括但不限于：乙酸、柠檬酸、硫酸、盐酸、磷酸二氢钠溶液和磷酸。示例性碱化剂包括但不限于：磷酸氢二钠溶液、碳酸钠或氢氧化钠。

f.缓冲剂

在本文提供的复合制剂中可以使用任意缓冲剂，只要它不会不利地影响复合制剂的稳定性，并支持需要的必要pH范围。特别合适的缓冲剂的实例包括Tris、琥珀酸盐、乙酸盐、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐。但是，本领域技术人员会认识到，本文提供的制剂不限于特定缓冲剂，只要所述缓冲剂提供可接受程度的pH稳定性或在指定范围内的“缓冲容量”。通常，缓冲剂具有在它的pK的约1个pH单位内的足够缓冲容量(Lachman等人1986)。缓冲剂适合性可以基于公开的pK列表来估测，或者可以通过本领域熟知的方法经验地确定。可以将溶液的pH调节至在如上所述范围内的期望端点，例如，使用任意可接受的酸或碱。

在本文提供的复合制剂中可以包含的缓冲剂包括但不限于：Tris(氨丁三醇)、组氨酸、磷酸盐缓冲剂(诸如磷酸氢二钠)和柠檬酸盐缓冲剂。通常，所述缓冲剂以本文中的量存在，以维持所述复合制剂的pH范围为或约为6.5-8.0，例如为或约为6.8-7.8，诸如为或约为7.0-7.6。这样的缓冲剂可以下述浓度存在于复合制剂中：为或约为1mM-100mM，诸如10mM-50mM或20mM-40mM，诸如为或约为30mM。例如，这样的缓冲剂可以下述浓度存在于复合制剂中：为或约为或至少为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更多。

在本文的复合制剂中的示例性缓冲剂是非金属结合缓冲剂，诸如Tris，其与金属结合缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲剂)相比，会减少胰岛素沉淀。在本文提供的复合制剂中的包含Tris作为缓冲剂具有额外益处。例如，用Tris缓冲的溶液的pH受溶液所保持的温度影响。因此，当在室温在pH 7.3制备胰岛素和乙酰透明质酸降解酶复合制剂时，在冷藏后，pH增加至大约pH 7.6。这样的pH促进胰岛素在特定温度的溶解度，否则胰岛素在所述特定温度可能是不溶性的。相反，在增加的温度，所述制剂的pH降低至大约pH 7.1，这促进乙酰透明质酸降解酶在特定温度的稳定性，否则该酶在所述特定温度可能变得不稳定。因此，与其它缓冲剂相比，当所述复合制剂包含Tris作为缓冲剂时，使胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的溶解度和稳定性最大化。此外，因为Tris是阳离子，不需要向溶液中加入NaCl作为抗衡离子。这对所述复合制剂的总稳定性也是有益的，因为高浓度的NaCl对胰岛素溶解度是有害的。

例如，在本文提供的复合制剂中包含以下浓度的Tris：为或约为10mM-50mM，例如，10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在特定实例中，所述复合制剂包含或包含约20mM-30mM的Tris，诸如21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM的Tris。在特定实例中，本文提供的复合制剂包含浓度为或约为30mM的Tris。

g.Lys-Lys

在本文的实例中，所述复合制剂包含足以稳定化复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶的二价阳离子，特别是赖氨酰基-赖氨酸(二赖氨酸；Lys-Lys)或其盐、衍生物、类似物或模拟物。例如，与MgCl₂相比，二价阳离子Lys-Lys表现出对胰岛素溶解度更少的影响。提供一定量的Lys-Lys，以使当如以上所讨论在适当pH与防腐剂和其它稳定剂相组合时，得到稳定的复合制剂，使得乙酰透明质酸降解酶活性得到保留，并且如上文中所述使对胰岛素溶解度的影响最小化。

例如，可以在本文提供的复合制剂中包含以下量的Lys-Lys：为或约为50mM-120mM，诸如为或约为50-80mM、80-100mM或100-120mM。例如，在本文提供的复合制剂中可以包含以下量的Lys-Lys：至少是或至少是约或是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM或120mM。

通常，Lys-Lys的浓度越高，包含PH20和胰岛素或胰岛素类似物的复合制剂的稳定性越好。但是，制剂中的Lys-Lys的具体量可以是具体胰岛素的函数。例如，为了在复合制剂中实现类似的稳定性，胰岛素类似物赖谷胰岛素需要最少量的Lys-Lys(例如50-105mM)，其次是胰岛素类似物门冬胰岛素和赖脯胰岛素(例如80-100mM)，而正规胰岛素需要最高量(例如100-120mM)。考虑到本文中的描述，根据经验来评估本文中的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶随着特定制剂的Lys-Lys浓度、特定胰岛素和所需的稳定性参数而变化的溶解度和稳定性，是在本领域技术人员的水平内。

在一个实例中，包含正规胰岛素的复合制剂通常包含100-120mM的Lys-Lys，诸如至少为或约至少为或为100mM、105mM、110mM、115mM或120mM。在另一实例中，包含门冬胰岛素或赖脯胰岛素的复合制剂包含80-120mM的Lys-Lys，诸如至少为或约至少为或为80mM、85mM、90mM、95mM或100mM。在另一实例中，包含赖谷胰岛素的复合制剂包含50-105mM的Lys-Lys，诸如至少为或约至少为或为50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM或105mM。

通常，在本文包含Lys-Lys的复合制剂的实例中，不需要加入NaCl作为稳定剂来维持组分的稳定性。在一些情况下，由于张力原因，需要张力调节剂。例如，复合制剂中的Lys-Lys的量是小于50mM/mL，可以需要张力调节剂。确定复合制剂中是否应当包含张力调节剂，是在本领域技术人员的水平内。如下面讨论的，示例性张力调节剂包括但不限于：甘油、NaCl、氨基酸、多元醇、海藻糖和其它盐和/或糖。因此，在一些实例中，本文提供的包含Lys-Lys的稳定复合制剂也可以任选地包含NaCl。在这样的实例中，NaCl通常小于140mM，并且通常小于100mM、90mM、80mM、70mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或更低。可以经验地确定张力调节剂的具体量，以便保留酶活性和/或张力。

h.其它示例性赋形剂或稳定剂

本文提供的复合制剂可以任选地包含其它组分，当其如以上所讨论在适合的pH与防腐剂、盐和稳定剂相组合时，得到稳定的复合制剂。其它组分包括，例如，一种或多种张力调节剂、一种或多种抗氧化剂、锌或其它稳定剂。

例如，在复合制剂具有低NaCl、高pH、存在防腐剂和在升高的温度(例如20℃-30℃或更高)储存时，极大地降低乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定性。类似地，胰岛素稳定性也受这些和其它参数影响。通过加入一种或多种稳定剂，可以在一定程度上抵消这样的不稳定性。通常，本文提供的制剂包含一定量的一种或多种稳定剂，其在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性的初始活性(例如375U/mL)。

在本文提供的制剂中可以包含的稳定剂的类型包括氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂和其它试剂。本文提供的复合制剂包含至少一种稳定剂。例如，本文提供的复合制剂包含至少1、2、3、4、5、6种或更多种稳定剂。因此，在本文的复合制剂中可以包含氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂和其它试剂中的任意一种或多种。通常，本文的复合制剂至少包含表面活性剂和适当的缓冲剂。任选地，本文提供的复合制剂可包含其它额外稳定剂。

示例性氨基酸稳定剂、氨基酸衍生物或胺包括但不限于：L-精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、Lys-Lys、Gly-Gly、氧化三甲胺(TMAO)或甜菜碱。示例性糖和多元醇包括但不限于：甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、蔗糖或海藻糖。示例性盐和缓冲剂包括但不限于：氯化镁、硫酸钠、Tris(诸如Tris(100mM))或苯甲酸钠。示例性表面活性剂包括但不限于：泊洛沙姆188(例如

F68)、聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)。其它防腐剂包括但不限于：透明质酸(HA)、人血清白蛋白(HSA)、苯基丁酸、牛磺胆酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或锌。

i.表面活性剂

在一些实例中，本文提供的复合制剂包含一种或多种表面活性剂。这样的表面活性剂抑制乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的聚集并使吸收损失最小化。所述表面活性剂通常是非离子型表面活性剂。在本文的复合制剂中可以包含的表面活性剂包括但不限于：多元醇(诸如甘油或山梨醇)的偏酯和偏醚和脂肪酸酯和醚，泊洛沙姆和聚山梨酯。例如，本文的复合制剂中的示例性表面活性剂包括以下的任意一种或多种：泊洛沙姆188(

诸如

F68)、

聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG 400、PEG 3000、吐温

(例如

20或

80)、

X-100、

聚丙二醇或聚乙二醇。在一些实例中，本文的复合制剂包含泊洛沙姆188、聚山梨酯20、聚山梨酯80，通常是泊洛沙姆188(PLURONICF68)。本文提供的复合制剂通常包含至少一种表面活性剂，诸如1种、2种或3种表面活性剂。

在本文提供的复合制剂中，一种或多种表面活性剂的总量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)可以是，例如为或约为0.0005％-1.0％，诸如为或约为0.0005％-0.005％、0.001％-0.01％、0.01％-0.5％，诸如0.01％-0.1％或0.01％-0.02％。通常，所述制剂包含至少0.0005％、0.005％、0.05％或0.01％的表面活性剂，并且包含小于1.0％(诸如小于0.5％或小于0.1％)的表面活性剂。例如，本文提供的复合制剂可包含为或约为0.0005％、0.0001％、0.005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.09％的表面活性剂。在特定实例中，本文提供的复合制剂包含0.01％-0.05％或约0.01％-约0.05％的表面活性剂。

如本文中的实施例所证实，乙酰透明质酸降解酶(例如rHuPH20)的稳定性和酶活性通常不受不同的表面活性剂或表面活性剂浓度影响。尽管如此，在本文中发现，所述酶的氧化随着表面活性剂水平的增加而增加。并且，表面活性剂泊洛沙姆188造成比聚山梨酯更少的氧化。因此，本文的复合制剂通常包含泊洛沙姆188。因此，尽管表面活性剂能够稳定化乙酰透明质酸降解酶，在本文提供的复合制剂中包含表面活性剂可以在高浓度时导致乙酰透明质酸降解酶的氧化。因此，通常在本文的复合制剂中使用较低浓度的表面活性剂，例如，作为质量浓度(w/v)百分比(％)，小于1.0％，并且通常为或约为0.0005％-0.1％，诸如为或约为0.01％或0.05％。并且，如下文提供的，可以在所述制剂中任选地包含抗氧化剂以减少或防止氧化。

本文提供的示例性复合制剂包含泊洛沙姆188。泊洛沙姆188具有较高的临界胶束浓度(cmc)。因此，使用泊洛沙姆188可以减少制剂中的胶束的形成，这反而可以降低防腐剂的有效性。因此，本文提供的复合制剂包括包含或包含约0.01％或0.05％的泊洛沙姆188的那些。

在其它实例中，本文提供的示例性复合制剂包含聚山梨酯20。例如，本文提供的复合制剂包含0.0005％-0.1％，诸如0.0005％-0.01％，诸如至少为或约至少为或为0.001％的聚山梨酯20。

ii.张力调节剂

例如，在本文提供的制剂中可以包含张力调节剂以产生具有期望的渗量的溶液。本文提供的复合制剂具有为或约为245mOsm/kg-305mOsm/kg的渗量。例如，所述渗量是或约是245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kg或305mOsm/kg。在一些实例中，胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的复合制剂的渗量为或约为275mOsm/kg。

张力调节剂包括但不限于：甘油、NaCl、氨基酸、多元醇、海藻糖和其它盐和/或糖。例如，在本文提供的复合制剂中可以包含NaCl，其浓度为或约为0mM-200mM，诸如通常为30mM-100mM、50mM-160mM，例如50mM-120mM或80mM-140mM或50mM-200mM。通常，例如在包含Lys-Lys的复合制剂中，当用作张力调节剂时，以以下浓度提供NaCl：小于140mM，并且通常小于130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或更低。为了保留酶活性、胰岛素溶解度和/或张力，可以经验地确定具体量。

iii.甘油

在其它情况下，在所述复合制剂中包括甘油(丙三醇)。例如，本文提供的复合制剂通常包含小于60mM的甘油，诸如小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、小于30mM、小于25mM、小于20mM、小于15mM、10mM或更低。甘油的量通常取决于存在的NaCl的量：在复合制剂中存在的NaCl越多，达到期望的渗量所需的甘油越少。因此，例如，在包含较高NaCl浓度的复合制剂(诸如用具有较高表观溶解度(例如赖谷胰岛素)的胰岛素配制的那些)中，在制剂中几乎不需要包含甘油或根本不需要包含甘油。与此相反，在包含稍微更低NaCl浓度的复合制剂(诸如用具有较低表观溶解度(例如门冬胰岛素)的胰岛素配制的那些)中，可以包含甘油。例如，本文提供的包含门冬胰岛素的复合制剂包含以下浓度的甘油：小于50mM，诸如20mM-50mM，例如为或约为50mM。在包含甚至更低的NaCl浓度的复合制剂(诸如用具有最低表观溶解度(例如赖脯胰岛素或正规胰岛素)的胰岛素配制的那些)中，包含为或约为例如40mM-60mM的浓度的甘油。

iv.抗氧化剂

本文提供的复合制剂也可包含抗氧化剂以减少或防止氧化，特别是减少或防止乙酰透明质酸降解酶的氧化。例如，本文中的实例表明，高浓度的表面活性剂或透明质酸寡聚体可以造成氧化。示例性抗氧化剂包括但不限于：半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在特定实例中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。本文提供的包含胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的复合制剂可以包含以下浓度的抗氧化剂：5mM-50mM或约5mM-约50mM，诸如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM。例如，可以在本文的复合制剂中提供以下浓度的甲硫氨酸：5mM-50mM或约5mM-约50mM，诸如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM。例如，可以包含以下浓度的抗氧化剂(例如甲硫氨酸)：为或约为5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些实例中，所述复合制剂包含10mM-20mM的甲硫氨酸，诸如为或约为10mM或20mM的甲硫氨酸。

v.锌

在一些情况下，在复合制剂中包含锌作为胰岛素六聚体的稳定剂。例如，包含正规胰岛素、赖脯胰岛素或门冬胰岛素的制剂通常包含锌，而包含赖谷胰岛素的制剂不含锌。可以将锌以例如氧化锌、乙酸锌或氯化锌的形式提供。在本文提供的组合物中可以存在为或约为0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)、0.001-0.05mg/100U或0.01-05mg/100U的锌。例如，本文提供的复合制剂可包含为或约为0.002毫克/100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U的锌。

vi.氨基酸稳定剂

本文提供的复合制剂也可包含氨基酸稳定剂，其有助于所述制剂的稳定性。所述稳定剂可为非极性氨基酸和碱性氨基酸。示例性非极性氨基酸和碱性氨基酸包括但不限于丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和脯氨酸。例如，所述氨基酸稳定剂是甘氨酸或脯氨酸，通常是甘氨酸。所述稳定剂可为单一氨基酸或者其可为两种或更多种这样的氨基酸的组合。所述氨基酸稳定剂可为天然氨基酸、氨基酸类似物、修饰的氨基酸或氨基酸等同物。所述氨基酸一般为L-氨基酸。例如，当使用脯氨酸作为稳定剂时，其一般为L-脯氨酸。还可能使用氨基酸等同物，例如脯氨酸类似物。包含于所述复合制剂中的氨基酸稳定剂(例如甘氨酸)的浓度范围为0.1M-1M氨基酸，通常为0.1M-0.75M，一般为0.2M-0.5M，例如至少为或约为0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多。所述氨基酸(例如甘氨酸)可以药学可接受的盐的形式使用，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐等。所述氨基酸(例如甘氨酸)的纯度应至少为98％、至少99％，或者至少99.5％或更高。

vii.透明质酸酶抑制剂

在本文提供的复合制剂的一些实例中，通过包含透明质酸酶抑制剂，可以增加如上文中所述的乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)的稳定性。这样的抑制剂通常不适合用于在2℃-8℃储存的制剂，因为如用本文的透明质酸(HA)所观察到的，它可以造成胰岛素在较低温度聚集。在一些实例中，可以选择适合在2℃-8℃使用的透明质酸酶抑制剂。

特别地，在复合制剂中包含透明质酸酶抑制剂以使乙酰透明质酸降解酶对于酚防腐剂的影响稳定。在特定实例中，所述透明质酸酶抑制剂这样的抑制剂：其以结合和非共价方式与胰岛素或乙酰透明质酸降解酶反应，并且不与胰岛素或乙酰透明质酸降解酶形成共价复合物。至少以它的平衡浓度提供透明质酸酶抑制剂。本领域技术人员熟知多种类别的透明质酸酶抑制剂(参见例如Girish等人(2009)Current Medicinal Chemistry,16:2261-2288，和其中引用的参考文献)。本领域技术人员知道或通过本领域的标准方法可以确定本文中的反应物或稳定组合物中的透明质酸酶抑制剂的平衡浓度。透明质酸酶抑制剂的选择会取决于在组合物中使用的具体乙酰透明质酸降解酶。例如，当所述乙酰透明质酸降解酶是PH20时，透明质酸是用于本文的稳定组合物中的示例性透明质酸酶抑制剂。

用作本文的稳定剂的示例性透明质酸酶抑制剂包括但不限于：蛋白质、糖胺聚糖(GAG)、多糖、脂肪酸、羊毛甾烷、抗生素、抗线虫剂、合成的有机化合物或植物源性生物活性组分。例如，透明质酸酶植物源性生物活性组分可以是生物碱、抗氧化剂、多酚、黄酮类化合物、萜类化合物和抗炎药。示例性透明质酸酶抑制剂包括，例如，血清透明质酸酶抑制剂、睡茄糖蛋白(WSG)、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、壳聚糖、β-(1,4)-半乳糖-寡糖、硫酸化毛蕊草糖、硫酸化车前糖、果胶、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)、硫酸葡聚糖、海藻酸钠、得自裙带菜的多糖、扁桃酸缩聚物、二十碳三烯酸、神经酸、齐墩果酸、马兜铃酸、阿义马林、利血平、黄酮、去甲氧基矢车菊黄素、槲皮素、芹菜素、山柰酚、水飞蓟宾、四羟黄酮、四羟黄酮-7-葡萄糖苷、根皮素、芹菜苷、橙皮苷、磺酸化橙皮苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄酮-7-硫酸钠、黄酮7-氟-4’-羟基黄酮、4’-氯-4,6-二甲氧基查耳酮、5-羟基黄酮7-硫酸钠、杨梅黄酮、芦丁、桑色素、甘草皂苷、维生素C、D-异抗坏血酸、D-糖1,4-内酯、L-抗坏血酸-6-十六酸酯(Vcpal)、6-O-酰化维生素C、儿茶素、去甲二氢愈创木酸、姜黄素、N-没食子酸丙酯、鞣酸、鞣花酸、没食子酸、phlorofucofuroeckol A、二鹅掌菜酚、8,8’-二鹅掌菜酚、原花青素、棉酚、塞来昔布、尼美舒利、地塞米松、吲哚美辛、非诺洛芬、保泰松、羟布宗、水杨酸酯、色甘酸二钠、金硫丁二钠、transilist、曲呫诺、伊维菌素、林可霉素和大观霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶、硫酸新霉素、3α-乙酰基多孔菌酸A、(25S)-(+)-12α-羟基-3α-甲基羧基乙酸酯-24-甲基羊毛甾-8,24(31)-二烯-26-酸、羊毛甾烷、多孔菌酸c、PS53(氢醌-磺酸-甲醛聚合物)、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)的聚合物、VERSA-TL 502、1-十四烷磺酸、扁桃酸缩聚物(SAMMA)、1,3-二乙酰基苯并咪唑-2-硫酮、N-单酰化的苯并咪唑-2硫酮、N,N’-二酰化的苯并咪唑-2-硫酮、烷基-2-苯基吲哚衍生物、3-丙酰基苯并噁唑-2-硫酮、N-烷基化的吲哚衍生物、N-酰化的吲哚衍生物、苯并噻唑衍生物、N-取代的吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物、N-取代的吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物的卤代类似物(氯和氟)、2-(4-羟基苯基)-3-苯基吲哚、吲哚甲酰胺、吲哚乙酰胺、3-苯甲酰基-1-甲基-4-苯基-4-哌啶醇、苯甲酰基苯基苯甲酸酯衍生物、L-精氨酸衍生物、盐酸胍、L-NAME、HCN、亚麻苦苷、苦杏仁苷、常春藤皂甙元、七叶皂苷、顺式-异扁柏脂素和1,3-二-对羟基苯基-4-戊烯-1-酮。

在一些实例中，作为透明质酸酶抑制剂的稳定剂是N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸的多糖。在另一实例中，作为透明质酸酶抑制剂的稳定剂是具有带负电荷的糖的胺糖。在其它实例中，作为透明质酸酶抑制剂的稳定剂是氨基甲基吲哚或抗坏血酸衍生物。

本文提供的示例性复合制剂包含为透明质酸(透明质酸；HA)的稳定剂。透明质酸(HA，也被称作透明质酸和透明质酸盐)是乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20，包括rHuPH20)的天然底物。HA是广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织的非硫酸化糖胺聚糖。它是至多25,000个二糖单位的聚合物，其本身由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰基葡糖胺构成。HA的分子量约为5kDa-200,000kDa。通过催化透明质酸的水解，rHuPH20(和其它透明质酸酶和乙酰透明质酸降解酶)降低透明质酸的粘度，由此增加组织渗透性并且增加胃肠外给药的流体的吸收速率。

如本文所证实，在否则失稳的试剂和条件(例如，低盐、高pH、存在防腐剂和升高的温度)存在下，透明质酸(HA)是乙酰透明质酸降解酶的有效稳定剂。具体地，HA似乎减轻或消除较高pH和/或升高的温度通常对rHuPH20和其它可溶性透明质酸酶和乙酰透明质酸降解酶具有的负面作用，特别是在酚防腐剂的存在下。例如，如下述的研究(参见例如实施例10D和实施例15)所示，当含有胰岛素的复合制剂中包含HA寡聚体(4-16聚体)时，rHuPH20稳定性显著增加。增加HA的浓度具有增加的稳定性质。例如，在30℃在pH 7.1与1mg/mL HA和75mM的NaCl一起1周以后，rHuPH20/胰岛素复合制剂中的rHuPH20的活性从600U/mL降低至341U/mL(即保留57％的初始活性)。当HA浓度增加至10mg/mL时，rHuPH20的活性仅从600U/mL降低至510U/mL(即保留85％的初始活性)。此外，HA减轻或消除高pH对rHuPH20的失稳效应。例如，在30℃在pH 7.1与5.5mg/mL HA和100mM的NaCl一起1周以后，保留68％的初始rHuPH20。当pH增加至7.5时，该百分比基本上不变。在升高的温度观察到HA对rHuPH20稳定性的类似积极影响(参见例如实施例15)。因此，在本文中确定，胰岛素和rHuPH20(或其它可溶性透明质酸酶和乙酰透明质酸降解酶)的制剂中可以包含HA以有效地稳定化rHuPH20。

因此，本文提供包含HA的复合制剂。在组合物中可以使用任意大小的HA作为稳定剂。在一些实例中，所述HA是由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰基葡糖胺构成的二糖。在其它实例中，所述HA是寡糖，诸如包含2个重复二糖单位的四糖，或者，在本文提供的复合制剂中使用的HA可包含多个重复二糖单位，诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个二糖单位。在其它实例中，在本文提供的复合制剂中使用的HA的分子量为5kDa-5,000kDa或约5kDa-约5,000kDa；5kDa-1,000kDa或约5kDa-约1,000kDa；5kDa-500kDa或约5kDa-约500kDa；或5kDa-200kDa或约5kDa-约200kDa。用于本文的复合制剂中的示例性HA寡糖的分子量为或约为6.4kDa、74.0kDa或234.4kDa。例如，本文提供的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶(例如rHuPH20))的组合物包括这样的组合物：其包含分子量至少为或约为5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、120kDa、140kDa、160kDa、180kDa、200kDa、220kDa、240kDa、260kDa、280kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa或500kDa的HA。在一个实例中，所述复合制剂中的HA的分子量小于10kDa。

因此，本文提供包含HA寡糖的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的复合制剂。所述复合制剂包含1mg/mL-20mg/mL的HA，诸如至少为或约为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL或更多的HA。胰岛素和rHuPH20的示例性稳定复合制剂包含8mg/mL-12mg/mL或约8mg/mL-约12mg/mL(例如，10mg/mL或约10mg/mL)的HA，。在一些实例中，HA与乙酰透明质酸降解酶的摩尔比是或约是100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1或100:1或更低。

viii.烟碱化合物

在一些实例中，使用烟碱化合物作为稳定剂。烟碱化合物包括但不限于：烟酰胺、烟酸、尼克酸、烟酰胺、维生素B3和/或它们的盐和/或它们的任意组合。在具体应用中，所述稳定剂可以包含烟碱化合物和一种或多种氨基酸(参见例如国际公开的PCT申请号WO2010149772)。例如，所述氨基酸可以是精氨酸、谷氨酸和/或其盐或它们的组合。

ix.其它赋形剂或试剂

任选地，所述复合制剂可以包含与所述复合制剂一起给药的载体，诸如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。适合的药用载体的实例由E.W.Martin记载在“Remington'sPharmaceutical Sciences”。这样的组合物会包含治疗有效量的一般为纯化形式或部分纯化形式的所述化合物以及适合量的载体，从而提供用于适合向患者给药的形式。这样的药用载体可为无菌的液体，例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油)。当静脉内给药所述药物组合物时，水是代表性的载体。还可以将盐水溶液和葡萄糖和甘油的水溶液用作液体载体，特别是用于注射液的液体载体。

例如，在胃肠外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂和其它药学可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水、葡萄糖和乳酸化林格氏注射液。非水性胃肠外媒介物包括植物源性不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。在多剂量容器中包装的胃肠外制剂中可以加入抑制细菌或者抑制真菌浓度的抗微生物剂，其包括苯酚或者甲酚、汞制剂、苄醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(TWEEN 80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药用载体也包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇(用于水可混溶的媒介物)以及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸(用于pH调节)。

与活性成分一起，组合物可包含：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石粉；和粘合剂，诸如淀粉、天然树胶(诸如金合欢树胶)、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其它这样的粘合剂。

例如，可加入复合制剂中的赋形剂蛋白质可以是许多药学可接受的蛋白质或肽中的任一种。通常，根据将其向哺乳动物个体给药而不引起免疫应答的能力来选择赋形剂蛋白质。例如，人血清白蛋白非常适合用于药物制剂中。其它已知的药用蛋白质赋形剂包括但不限于：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、天然碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。制剂中包含足以防止蛋白质吸附至容纳容器或小瓶的浓度的赋形剂。赋形剂的浓度会随赋形剂的性质和复合制剂中的蛋白质的浓度而变化。

如果需要，组合物也可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸酯和其它这样的试剂。

2.示例性稳定复合制剂

a.示例性多剂量注射(MDI)复合制剂

本文提供速效胰岛素(诸如速效(快速起效的)胰岛素类似物)和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂，其在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少6个月，和在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)。示例性MDI复合制剂是在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少或约6、7、8、9、10、15、20、24、30、36、42、48、54、60个月或更多月，并且在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少或约14、15、20、25、28、30、35、40、45或50天或更多天。

例如，本文提供的制剂在或约在2-8℃稳定持续至少1年，例如至少12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月、36个月或更久。具体地，本文提供的制剂在或约在2-8℃稳定持续至少24个月。

在其它实例中，本文提供的制剂在或约在20-30℃稳定持续至少1周，诸如在或约在22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃稳定持续至少1周。例如，本文提供的制剂在或约在20-30℃稳定持续至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久。具体地，本文提供的制剂在或约在20-30℃(诸如在或约在25℃或30℃)稳定持续至少1个月。

在一些实例中，本文提供的稳定复合制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是为或约为或至少为600U/mL、10U/mL-1000U/mL的速效胰岛素，特别是至少或约100U/mL；浓度为或约为50mM-200mM的NaCl；pH为或约为6.8-7.8，诸如为或约为7.0-7.6；维持pH范围为或约为6.8-7.8或7.0-7.6的缓冲剂；抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，防腐剂的质量浓度(w/v)为0.1％-0.4％；和在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的初始乙酰透明质酸降解酶活性，诸如保留至少或约至少375U/mL的乙酰透明质酸降解酶活性的量的稳定剂。关于缓冲剂，可以使用任意缓冲剂，包含使其可以维持所述复合制剂的pH范围为或约为6.8-7.8(诸如为或约为7.0-7.6)的量。通常，在本文提供的复合制剂中包含以下浓度的Tris：为或约为10mM-50mM，例如，10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在特定实例中，所述复合制剂包含或包含约20mM-30mM的Tris，诸如21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM的Tris。在特定实例中，本文提供的复合制剂包含浓度为或约为30mM的Tris。

例如，示例性这样的制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是为或约为或至少为600U/mL、10U/mL-1000U/mL的速效胰岛素，特别是至少或约100U/mL；浓度为或约为80-140mM的NaCl；pH为或约为7.0-7.6；维持pH范围为或约为7.0-7.6的缓冲剂；质量浓度(w/v)为0.1％-0.4％的防腐剂；和在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的初始乙酰透明质酸降解酶活性，诸如保留至少或约至少375U/mL乙酰透明质酸降解酶活性的量的稳定剂。例如，本文提供的复合制剂包含1mM-100mM缓冲剂(例如Tris)。例如，本文提供的复合制剂包含0.01％-0.5％的表面活性剂。本文提供的示例性复合制剂也可包含小于60mM的甘油(丙三醇)和5mM-50mM或约5mM-约50mM的抗氧化剂。

下述稳定制剂仅仅是示例性的，并提供可以从其进行微小调节的平台。要理解，可以对多种赋形剂和其它组分的浓度进行非常小的变化(例如所述浓度的±15％)或对pH进行小变化，同时保留一些或全部的胰岛素溶解度和稳定性和乙酰透明质酸降解酶稳定性。还可以通过添加或移除赋形剂进行其它变化。例如，可以改变稳定化表面活性剂的类型。例如，本文的示例性复合制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是至少或约至少或约600U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))；10U/mL-1000U/mL的速效胰岛素，特别是至少或约至少或约100U/mL的速效胰岛素；10mM-50mM或约10mM-约50mM的Tris(例如为或约为20mM-40mM的Tris，诸如至少或约至少20mM、25mM、30mM、35mM或40mM)；80mM-140mM或约80mM至约140mM的NaCl(例如至少或约至少80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM或160mM的NaCl)；5mM-50mM或约5mM-约50mM的甲硫氨酸(例如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甲硫氨酸)；0mM-50mM或约0mM-约50mM的甘油(例如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甘油)；0.01％-0.5％或约0.01％-约0.5％的泊洛沙姆188，诸如0.01％-0.05％(例如至少或约至少0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％的泊洛沙姆188)；0.1％-0.25％或约0.1％-约0.25％的苯酚(例如至少或约至少0.1％、0.12％、0.125％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％或0.17％的苯酚)；和0.05％-0.2％或约0.05％-约0.2％的间甲酚(例如至少或约至少0.075％、0.08％、0.09％、0.1％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％或0.17％的间甲酚)。制备的制剂的pH为7.0-7.6或约7.0-约7.6(例如至少或约至少pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。在其它实例中，包含以下浓度的锌：为或约为0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U或0.024mg/100U胰岛素。

如以上所讨论的，根据胰岛素的具体性质，可以增加或降低制剂中的多种组分的浓度。例如，与具有较低表观溶解度的胰岛素(诸如赖脯胰岛素)的制剂相比，具有较高表观溶解度的胰岛素(诸如门冬胰岛素)的制剂通常包含更高浓度的NaCl和更低浓度的甘油。取决于NaCl浓度，制剂的特定pH也可以在不同的胰岛素之间变化。

例如，本文提供的稳定复合制剂包括胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂，其包含为或约为50-120mM(例如50mM-100mM，诸如50mM-90mM或80mM-100mM)的NaCl。这样的复合制剂包括含有胰岛素类似物赖脯胰岛素的那些。在其它实例中，本文提供的稳定复合制剂是胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂，其包含为或约为80mM-160mM(诸如100mM-140mM，例如120mM)的NaCl。这样的复合制剂包括含有门冬胰岛素的那些。例如，本文提供rHuPH20和门冬胰岛素或赖脯胰岛素的复合制剂，其包含或包含约80mM或100mM的NaCl。

在另一实例中，本文提供的稳定复合制剂包括胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的稳定复合制剂，其包含为或约为80mM-200mM，例如100mM-150mM，诸如130mM-150mM、120mM-140mM或110mM-130mM。这样的复合制剂包括含有胰岛素类似物赖谷胰岛素的那些。在一些实例中，所述包含例如赖谷胰岛素的复合制剂的盐(NaCl)浓度为或约为80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、121mM、122mM、123mM、124mM、125mM、126mM、127mM、128mM、129mM、130mM、131mM、132mM、133mM、134mM、135mM、136mM、137mM、138mM、139mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。例如本文提供rHuPH20和赖谷胰岛素的复合制剂，其包含或包含约120mM或140mM的NaCl。

在本文提供的复合制剂的实例中，包含胰岛素(诸如门冬胰岛素)和rHuPH20的复合制剂的pH为或约为7.2(例如7.2±0.2)。在其它实例中，胰岛素(诸如赖脯胰岛素)和rHuPH20的复合制剂的pH为或约为7.4(例如7.4±0.2)。在其它实例中，胰岛素(诸如赖谷胰岛素)和rHuPH20的复合制剂的pH为或约为7.3或7.4(例如7.3±0.2或7.4±0.2)。

本文提供的包含乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和赖脯胰岛素的示例性复合制剂包含：25mM-35mM或约25mM至约35mM(例如为或约为30mM)的Tris；70mM-100mM或约70mM至约100mM的NaCl(例如为或约为80mM或100mM的NaCl)；10mM-30mM或约10mM至约30mM的甲硫氨酸(例如为或约为10mM或20mM的甲硫氨酸)；40mM-60mM或约40mM至约60mM的甘油(例如为或约为50mM的甘油)；0.005％-0.05％或约0.005％-约0.05％的泊洛沙姆188(例如为或约为0.01％的泊洛沙姆188)；为或约为0.017mg锌/100U胰岛素至为或约为0.024mg锌/100U胰岛素(例如0.017mg锌/100U胰岛素、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U或0.024mg锌/100U胰岛素)；0.08％-0.17％或约0.08％-约0.17％的苯酚(例如0.1％、0.125％或0.13％的苯酚)；和0.07％-0.17％或约0.07％-约0.17％的间甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％的间甲酚)。例如，所述复合制剂可包含为或约为0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚；为或约为0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚；或为或约为0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。将这样的赖脯胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如可溶性透明质酸酶(例如rHuPH20))的制剂制备成pH为7.0-7.5或约7.0-约7.5(通常pH为或约为pH 7.2)。

本文提供的包含乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和门冬胰岛素的示例性复合制剂包含：25mM-35mM或约25mM至约35mM(例如为或约为30mM)的Tris；70mM-100mM或约70mM至约100mM的NaCl(例如为或约为80mM或100mM的NaCl)；10mM-30mM或约10mM至约30mM的甲硫氨酸(例如为或约为10mM或20mM的甲硫氨酸)；40mM-60mM或约40mM至约60mM的甘油(例如为或约为50mM的甘油)；0.005％-0.05％或约0.005％-约0.05％的泊洛沙姆188(例如为或约为0.01％的泊洛沙姆188)；为或约为0.017mg锌/100U胰岛素至为或约为0.024mg锌/100U胰岛素(例如0.017mg锌/100U胰岛素、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U或0.024mg锌/100U胰岛素)；0.08％-0.17％或约0.08％-约0.17％的苯酚(例如0.1％、0.125％或0.13％的苯酚)；和0.07％-0.17％或约0.07％-约0.17％的间甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％的间甲酚)。例如，所述复合制剂可包含为或约为0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚；为或约为0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚；或为或约为0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。将这样的门冬胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))的制剂制备成pH为7.0-7.6或约7.0-约7.6(通常pH为或约为pH 7.4)。

本文提供的包含乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))和赖谷胰岛素的示例性复合制剂包含：25mM-35mM或约25mM至约35mM(例如为或约为30mM)的Tris；100mM-150mM或约100mM至约150mM的NaCl(例如为或约为100mM或140mM的NaCl)；10mM-30mM或约10mM至约30mM的甲硫氨酸(例如为或约为10mM或20mM的甲硫氨酸)；40mM-60mM或约40mM至约60mM的甘油(例如为或约为50mM的甘油)；0.005％-0.05％或约0.005％-约0.05％的泊洛沙姆188(例如为或约为0.01％的泊洛沙姆188)；0.08％-0.17％或约0.08％-约0.17％的苯酚(例如0.1％、0.125％或0.13％的苯酚)；和0.07％-0.17％或约0.07％-约0.17％的间甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％的间甲酚)。例如，所述复合制剂可包含为或约为0.1％的苯酚和0.015％的间甲酚；为或约为0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚；为或约为0.13％的苯酚和0.08％的间甲酚；或为或约为0.17％的苯酚和0.13％的间甲酚。将这样的赖谷胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶(例如rHuPH20))的制剂制备成pH为7.0-7.6或约7.0-约7.6(通常pH为或约为pH 7.4)。

b.示例性连续皮下胰岛素输注(CSII)复合制剂

本文提供稳定复合制剂，其在有加速或应力条件(诸如大于或约大于32℃的升高的温度，诸如35℃-40℃，特别是大于或约或为37℃或40℃)和/或搅拌条件存在下稳定持续至少3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、至少5天、至少6天或至少7天，并且通常至少3小时或至少3天。这些稳定复合制剂适合用于通过连续皮下胰岛素输注(CSII)来给药。

如以上所讨论的，赋予本文的复合制剂在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少6个月和在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)的稳定性的组分的浓度、量或水平，通常不足以赋予所述复合制剂在诸如升高的温度的应力条件下的稳定性。通常，这样的复合制剂在这样的应力条件(例如升高的温度)下稳定小于24小时，并且通常小于8小时，这可以基本上损害它们在存在这样的条件的多剂量应用中的用途。例如，CSII疗法与每天24小时持续2-3天通过泵或其它装置(其被佩戴在体外或身体附近)连续输注的制剂有关。通过针头将胰岛素制剂或复合制剂注射进腹壁或大腿中，该注射可以受程序化的泵控制，从而连续地输注胰岛素制剂或复合制剂。因此，用于CSII疗法的复合制剂遭受至少或约或大于37℃的升高的体温和搅拌条件。

例如，乙酰透明质酸降解酶在大于32℃和通常大于37℃或40℃的升高的温度是特别不稳定的。在本文中还发现，尽管胰岛素在2℃-8℃，于高盐浓度和低pH下结晶，它在高盐浓度和低pH，于32℃-40℃的较高的温度不结晶。因此，乙酰透明质酸降解酶(例如PH20)为了维持它在32℃-40℃的高的温度的稳定性所需要的高盐浓度和低pH的相反要求在较高的温度是更相容的，至少持续至少3天的短时间段。并且，相同的高盐和低pH制剂赋予胰岛素类似物之间的类似稳定性，尽管在较低温度影响胰岛素的稳定性的表观溶解度存在差异。

在应力条件下稳定的稳定复合制剂(例如用于CSII疗法中)通常包含与这里提供的其它复合制剂相同的组分。但是，这样的复合制剂的差别在于，在应力条件下稳定的复合制剂通常包含较高盐浓度、较低pH和/或一种或多种其它赋形剂的存在，它们足以使乙酰透明质酸降解酶和/或胰岛素在大于或约大于32℃(诸如35℃-40℃，特别是大于或约或为37℃或40℃)的升高的温度和/或搅拌条件下稳定通常至少2-3天。例如，本文提供的在升高的温度或搅拌的应力条件下稳定的复合制剂通常包含透明质酸酶抑制剂(诸如透明质酸酶底物(例如透明质酸))作为赋形剂。

在一个实例中，与在上面的E.1.a部分中提供的复合制剂相比，本文提供的在升高的温度或搅拌的应力条件下稳定的复合制剂包含更高盐浓度和更低pH。例如，本文提供在应力条件(例如32℃-40℃的升高的温度或搅拌)下稳定持续至少3天或3小时的复合制剂，其包含120mM的NaCl至200mM的NaCl并且pH为6.5-7.5。但是，如以上所讨论的，在这些降低的pH和增加的盐条件下，胰岛素溶解度(特别是在冷藏温度)会下降。因此，在使用之前通常不在冷藏或环境温度储存这样的制剂。

在另一实例中，本文提供在升高的温度(例如32℃-40℃)的应力条件下稳定持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时的复合制剂包含透明质酸酶抑制剂以稳定化所述复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶。在本文的复合制剂中可使用任意上述的透明质酸酶抑制剂，所述复合制剂在升高的温度(例如32℃-40℃)的应力条件下稳定持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时。在特定实例中，所述透明质酸酶抑制剂是透明质酸酶底物，例如透明质酸。

如在本文的实施例中用透明质酸酶抑制剂透明质酸所证实的，透明质酸酶抑制剂的存在使PH20活性稳定(特别是在有防腐剂存在下，特别是在升高的温度，诸如在32℃-40℃的温度的应力条件下)。由于HA寡聚体是乙酰透明质酸降解酶与透明质酸的酶反应的底物/产物，透明质酸寡聚体可以结合酶活性部位并产生稳定作用。尽管如此，还发现在32℃-40℃的升高的温度(诸如在37℃大于1周或2周)的应力条件下，透明质酸酶抑制剂(诸如HA)在复合制剂中的存在可以随时间导致胰岛素的降解，由此产生共价的HA-胰岛素类似物加合物。例如，已经通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)证实，高浓度的HA在本文提供的复合制剂中的存在造成：

在37℃在1周后的降解，和

在30℃在2周后的降解。液相色谱法-质谱法(LC-MS)分析显示，一些降解产物是通过胰岛素与HA的还原端的反应形成的共价HA-胰岛素类似物糖化加合物。例如，确定了一个峰为

和HA 7聚体的产物，而另一个峰为

和HA 2聚体的产物。

透明质酸酶抑制剂(诸如HA)的存在也可以对复合制剂的沉淀和颜色变化产生影响。因此，尽管HA提高乙酰透明质酸降解酶在32℃-40℃的升高的温度的应力条件下的稳定性，它也可以对胰岛素降解、所述复合制剂的沉淀和颜色变化产生影响。监测这些条件在期望的安全性和药理学参数和指南内，是在本领域技术人员的水平内。通常，本文提供的包含透明质酸酶抑制剂(诸如HA)的稳定复合制剂在升高的温度(诸如在32℃-40℃的温度的应力条件下)稳定持续至少3小时，但是不超过7天(由于对这些参数的作用)。

在本文提供的一些实施例中，使用不能与胰岛素或乙酰透明质酸降解酶形成共价复合物的透明质酸酶抑制剂。因此，本文的制剂包含通过缔合性结合(associativebinding)起作用的非共价抑制剂。例如，本文提供这样的复合制剂：其包含具有经反应的还原端的HA，使得它不能与胰岛素形成糖化加合物。例如，在一些实例中，在本文提供的复合制剂中使用的HA已经通过还原胺化进行修饰。还原胺化包括：在醛和胺之间形成希夫碱，然后将其还原以形成更稳定的胺。糖(即HA)的还原端以环状半缩醛形式和开链醛形式的平衡混合物存在。在本领域技术人员已知的合适条件下，胺基会与糖醛缩合以形成亚胺鎓离子，后者可以被诸如氰基硼氢化钠的还原剂还原为胺(参见例如，Gildersleeve等人,(2008)Bioconjug Chem 19(7):1485-1490)。所得的HA不可与胰岛素反应，并且不能形成胰岛素糖化加合物。

具体地，本文提供稳定的复合制剂组合物，其在为或约为32℃-40℃的温度稳定持续至少3天和/或在搅拌下稳定持续至少3小时，其包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是为或约为或至少600U/mL；10U/mL-1000U/mL的速效胰岛素，特别是至少或约100U/mL；浓度为或约为120mM-200mM的NaCl；pH为或约为6.5-7.5；抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物；和一种或多种其它稳定剂，诸如透明质酸酶抑制剂，使得保留至少50％的初始乙酰透明质酸降解酶活性，诸如至少或约至少375U/mL的乙酰透明质酸降解酶活性。例如，所述复合制剂可包含浓度为或约为1mg/mL-20mg/mL的HA。所述稳定复合制剂也可包含：量为或约为1mM-100mM的缓冲剂(例如Tris)以维持pH范围为或约为pH 6.5；抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，例如，酚防腐剂(例如苯酚和/或间甲酚)，其总量作为在所述制剂中的质量浓度(w/v)百分比(％)是0.1％和0.4％或是0.1％-0.4％；表面活性剂(例如泊洛沙姆188)，作为质量浓度(w/v)百分比为或约为0.005％-1.0％；和任选的其它稳定剂。

例如，本文提供的在应力条件(例如32℃-40℃的升高的温度或搅拌)下稳定持续至少3天或3小时的复合制剂包含120mM-200mM(诸如150mM的NaCl至200mM的NaCl或160mM的NaCl至180mM的NaCl)的NaCl，例如为或约为120mM、130mM、140mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM的NaCl。并且，本文提供的在应力条件(例如32℃-40℃升高的温度或搅拌)下稳定持续至少3天或3小时的复合制剂具有6.5-7.5或6.5-7.2的pH，诸如为或约为6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.2、7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2或7.5±0.2的pH。

在本文的实例中，本文提供的在升高的温度(例如32℃-40℃)或搅拌的应力条件下稳定持续至少3天或3小时的复合制剂包含透明质酸(透明质酸；HA)，所述透明质酸的分子量为为5kDa-5,000kDa、5kDa-1,000kDa或约5kDa-约1,000kDa、5kDa-200kDa或约5kDa-约200kDa或者5kDa-50kDa或约5kDa-约50kDa。具体地，HA的分子量小于10kDa。HA可以是由二糖构成的寡糖，诸如2聚体-30聚体或4聚体-16聚体。胰岛素和乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如，PH20(例如rHuPH20))的复合制剂包含以下浓度的HA：为或约为1mg/mL-20mg/mL，诸如至少或约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL或更多的HA。示例性稳定复合制剂包含8mg/mL-12mg/mL或约8mg/mL-约12mg/mL(例如10mg/mL或约10mg/mL)的HA。在一些实例中，HA与乙酰透明质酸降解酶的摩尔比是或约是100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1或100:1或更低。

由于在升高的温度(例如32℃-40℃)或搅拌下稳定的复合制剂(诸如CSII制剂所期望的)与在上面的E.1.a部分中所述的复合制剂相比具有降低的pH和增加的盐浓度，它们可以由后者制备或衍生。这可以如下实现：例如，通过用具有低pH和高盐浓度的稳定化稀释剂稀释复合制剂(诸如在E.1.a部分中提供的适合用于MDI的任一种)。例如，所述稀释剂可以是具有较低pH的缓冲剂和防腐剂的高NaCl溶液。例如，所述稀释剂可包含：10mM-50mM的Tris或其它类似的缓冲剂；120mM-200mM的NaCl；0.1％-0.4％的防腐剂。可以在为或约为6.5-7.8的pH制备所述稀释剂。因此，可以提供并与稀释剂混合本文提供的在2℃-8℃或20℃-30℃稳定的稳定复合制剂，以提供在升高的温度(例如32℃-40℃)的应力条件下稳定持续至少3天或在搅拌下稳定持续至少3小时的复合制剂。

例如，可以用稳定化稀释剂稀释上面的E.1.a部分中的任意MDI复合制剂，得到这样的CSII制剂：其具有较低的胰岛素浓度，pH为6.8-7.0或约6.8-约7.0(诸如为或约为6.8、6.9或7.0)，和浓度为150mM-200mM或约150mM-约200mM的NaCl。

在其它实例中，在与稳定化赋形剂稀释剂混合以后，可以提供稳定的MDI复合制剂作为修改的高浓度MDI制剂，其包含较高的胰岛素浓度和较高的pH20浓度和较少的NaCl(为或约为80mM-150mM)和较低的缓冲能力(以提供可接受的张力)和较低pH。例如，所述较高的胰岛素浓度可以是，例如，120-500单位，诸如150、200或500单位(U)，并且所述较高的pH20浓度可以是6-25μg/mL、诸如6-25，6、7.5、10或25μg/mL。用稳定化稀释剂稀释修改的高浓度MDI制剂可以提供与在上面E.1.a部分中提供的任意MDI复合制剂相比具有更低pH(例如6.5-7.2)和增加的NaCl(140mM-200mM)的CSII制剂。

在另一实例中，可以低压冻干形式制备和储存本文在E.1.a部分中提供的任意MDI制剂。在即将在应力条件下使用之前，可以用具有较低pH(例如6.5-7.8)和增加的NaCl(120mM-200mM)的稳定化稀释剂稀释低压冻干的产物，得到与在上面E.1.a部分中提供的任意MDI复合制剂相比具有更低pH(例如6.5-7.8)和增加的NaCl(120mM-200mM)的CSII制剂。

但是，如本文中的实例所证实的，透明质酸不适合与在2℃-8℃储存的制剂一起使用，因为它会造成胰岛素在较低温度的聚集。因此，在上面的实例(其中由MDI制剂稀释产生CSII稳定制剂，并且MDI复合制剂或修改的浓MDI复合制剂不包含透明质酸酶抑制剂)中，在稳定化稀释剂中可包含透明质酸酶抑制剂，以便提供适当浓度的透明质酸酶抑制剂来维持所述复合制剂在应力条件下的稳定性：在升高的温度(例如32℃-40℃)下稳定持续至少3天，或在搅拌下稳定持续至少3小时。

c.示例性Lys-Lys复合制剂

本文提供稳定复合制剂，其包含：治疗有效量的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))、治疗有效量的速效胰岛素(诸如快速起效(例如速效)胰岛素类似物)和使得所述复合制剂稳定的量的Lys-Lys。通常，所述复合制剂是多剂量制剂，并且其也包含抗微生物有效量一种或多种防腐剂。所述复合制剂也可包含一种或多种其它稳定剂或赋形剂。这样的复合制剂在在2℃-8℃或约2℃-约8℃的温度稳定持续至少6个月，并且在在20℃-30℃或约20℃-约30℃的温度稳定持续至少14天(即2周)。具体地，这样的复合制剂在加速条件(诸如大于或约大于32℃(诸如35℃-40℃，特别是大于或约或为37℃或40℃)的升高的温度和/或搅拌条件)下稳定持续至少3小时，并且通常至少3天，所述复合制剂可以用于多剂量注射(MDI)用途或用于连续皮下胰岛素输注(CSII)方法。

下面描述了示例性稳定的包含Lys-Lys的制剂。下述稳定制剂仅仅是示例性的，并且提供可以从其进行微小调节的平台。要理解，可以对多种赋形剂和其它组分的浓度进行非常小的变化(例如所述浓度±15％)或对pH进行小变化，同时保留一些或全部胰岛素溶解度和稳定性和乙酰透明质酸降解酶稳定性。也可以通过添加或移除赋形剂进行其它变化。

例如，本文提供的复合制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是为或约为或至少为600U/mL；10U/mL-1000U/mL的速效胰岛素，并且特别是至少或约100U/mL；所述复合制剂还包含：浓度为或约为50mM-120mM(诸如50-80mM、80mM-100mM或100mM-120mM)的Lys-Lys，为或约为6.5-8.0(例如，6.5-7.8或6.8-7.8，诸如为或约为6.5-7.5、6.8-7.4或7.0-7.6)的pH，维持该pH范围的缓冲剂，抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物，和在储存(温度和时间)过程中保留至少50％的乙酰透明质酸降解酶活性并保留至少90％的胰岛素纯度、回收和/或效能的量的稳定剂。例如，本文提供的复合制剂包含0.0005％-1.0％(例如0.0005％-0.005％)的表面活性剂作为稳定剂。所述复合制剂可以任选地包含额外稳定剂、张力调节剂、抗氧化剂和/或其它赋形剂。例如，所述复合制剂包含浓度小于140mM(诸如为或约为0mM-100mM，例如为或约为0mM-50mM、10mM-40mM或20mM-30mM)的NaCl。

在一个实例中，示例性制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是至少或约至少或约600U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))；10U/mL-1000U/mL的赖谷胰岛素，特别是至少或约100U/mL的，50mM-105mM或约50mM-约105mM(例如至少或约至少50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM)的Lys-Lys；0mM-50mM或约0mM-约50mM的甲硫氨酸(例如为或约为5mM-20mM，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甲硫氨酸)；和0.0005％-0.005％或约0.0005％-约0.005％的聚山梨酯20，诸如0.001％-0.005％(例如至少或约至少0.0005％、0.0001％、0.005％或0.001％的聚山梨酯20)；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.25％的苯酚和质量浓度百分比为或约为0.05％-0.2％的间甲酚。制备的制剂的pH为或约为6.8-7.4(例如至少或约至少pH 6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4)。在其它实例中，包含浓度小于140mM的NaCl。例如，包含浓度小于100mM(诸如至少或约至少0mM-100mM，例如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM)的NaCl。

在另一实例中，示例性制剂包含：100U/mL-1000U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))，特别是至少或约至少或约600U/mL的乙酰透明质酸降解酶(诸如透明质酸酶，例如PH20(例如rHuPH20))；10U/mL-1000U/mL的赖脯胰岛素或门冬胰岛素，特别是至少或约100U/mL的，80mM-100mM或约80mM-约100mM(例如至少或约至少80mM、85mM、90mM、95mM或100mM)的Lys-Lys；0mM-50mM或约0mM-约50mM的甲硫氨酸(例如为或约为5mM-20mM，诸如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的甲硫氨酸)；0.0005％-0.005％或约0.0005％-约0.005％的聚山梨酯20，诸如0.001％-0.005％(例如至少或约至少0.0005％、0.0001％、0.005％或0.001％的聚山梨酯20)；和防腐剂，其包含质量浓度(w/v)百分比(％)为或约为0.01％-0.25％的苯酚和质量浓度百分比为或约为0.05％-0.2％的间甲酚苯酚。制备的制剂的pH为或约为6.8-7.4(例如至少或约至少pH 6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4)。在其它实例中，包含浓度小于140mM的NaCl。例如，包含浓度小于100mM(诸如至少或约至少0mM-100mM，例如至少或约至少5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM)的NaCl。

G.剂量和给药

可将本文提供的组合物(其为乙酰透明质酸降解酶的稳定制剂)配制为用于单次或多剂量给药的药物组合物。将乙酰透明质酸降解酶和速效胰岛素的复合制剂配制为用于多剂量给药的药物组合物。所述制剂和复合制剂可以通过任意适合的途径给药，所述途径例如胃肠外给药，其包括皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内和真皮内给药。通常，皮下给药本文提供的制剂或复合制剂。

通过在已知的体外和体内系统中试验制剂或复合制剂，可以经验性地确定治疗有效剂量，也可针对每一个体根据例如代谢、食物摄入和疾病严重性的此类因素进行个体化给药。所述制剂或复合制剂中乙酰透明质酸降解酶和/或所选择的胰岛素的浓度取决于例如复合物的吸收、失活和排泄率、复合物的理化特性、剂量安排、给药量以及本领域技术人员已知的其它因素。例如，对于包含胰岛素的复合制剂，要理解，准确的治疗剂量与个体血糖水平相关，并可如下经验性地确定：使用已知的算法或通过从体内或体外试验数据、个体的以往经历外推，计算碳水化合物以测定食物中的碳水化合物含量以及因此估计的餐时血糖增加和随后的胰岛素需求。应注意的是，浓度和剂量值可随每一名被治疗的个体不同。还要理解，对于任意具体的个体，应该根据个体需要和管理或监督制剂的给药的人员的专业判断随时调整具体给药方案，并且本文显示的浓度范围仅为示例性的，并且无意限制其范围。可通过标准的临床技术确定为治疗糖尿病病症而给药的所选胰岛素的量。此外，可应用体外测定法和动物模型帮助鉴定最优剂量范围。

因此，可凭经验确定的准确剂量可以取决于制剂或复合制剂中包含的具体乙酰透明质酸降解酶和/或胰岛素、给药方案和剂量安排、给药途径、待治疗的糖尿病类型、疾病的严重性和接受治疗的个体。通常，以达到血糖控制的量提供胰岛素。例如，为了达到餐后血糖控制，当在无乙酰透明质酸降解酶下递送胰岛素时，在餐前30分钟到5分钟，通常向糖尿病个体给药为或约为0.05U速效胰岛素每千克体重(U/kg)-1.0U/kg的快速推注。要理解，根据例如特定个体的代谢、食物的内含物和血糖水平适当地增加或减少该剂量。还要理解为了控制餐后血糖而递送胰岛素的时间可变得与进食时间更近或更远，并且在一些情况下可进行改变，从而在进餐时或进餐后递送胰岛素。

通常以0.05单位/kg-0.25单位/kg(例如0.10单位/kg)的剂量给药速效胰岛素，然而具体剂量各不相同。由于与乙酰透明质酸降解酶(诸如rHuPH20)复合配制的胰岛素的改善的药代动力学和药效动力学性质，可以比在没有乙酰透明质酸降解酶存在下给药的速效胰岛素更低的剂量给药所提供的复合制剂。通过将它作为与乙酰透明质酸降解酶的复合制剂来给药可以降低速效胰岛素的量的程度，取决于例如患者所患的糖尿病的类型和所述复合制剂中包含的胰岛素的类型。通常，当作为包含乙酰透明质酸降解酶的复合制剂给药时，向II型糖尿病患者给药的速效胰岛素的量的减少，大于当作为包含乙酰透明质酸降解酶的复合制剂给药时向I型糖尿病患者给药的速效胰岛素的量的减少。例如，在向I型糖尿病患者和II型糖尿病患者都给药0.20U/kg的速效胰岛素来控制餐后葡萄糖水平的情况中，可以向I型糖尿病患者给药0.15U/kg的与乙酰透明质酸降解酶复合配制的速效胰岛素来实现相同的或更好的血糖控制，可以向II型糖尿病患者给药0.10U/kg的与乙酰透明质酸降解酶复合配制的速效胰岛素来实现相同的或更好的血糖控制。

使用本文提供的包含乙酰透明质酸降解酶的复合制剂来控制餐后血糖水平的胰岛素胃肠外(诸如皮下)给药的示例性剂量范围为或约为0.05U/kg-0.50U/kg，诸如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg或1.0U/kg。具体剂量取决于疾病和个体。

除了控制餐后血糖，也可将本文提供的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂向糖尿病个体给药以达到整个白天和夜晚的血糖控制。为了提供持续血糖控制而给药的胰岛素剂量通常小于达到餐后血糖控制所需的剂量。然而，可根据血糖水平增加或减少剂量。为了提供连续血糖控制而作为包含乙酰透明质酸降解酶的复合制剂给药的胰岛素的胃肠外(诸如皮下)给药的示例性剂量范围为或约为0.001U/kg-0.30U/kg，诸如0.001U/kg、0.005U/kg、0.01U/kg、0.02U/kg、0.05U/kg-0.30U/kg，诸如0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.10U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.20U/kg、0.25U/kg、0.30U/kg、0.40U/kg、0.50U/kg或1.0U/kg。具体剂量取决于疾病、给药时间和个体。如有必要，可凭经验确定剂量。

要理解，准确剂量和治疗持续时间与进行治疗的糖尿病密切相关，并可使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验数据外推来经验性地确定。要注意剂量值还可随糖尿病严重性和其它因素(例如个体的代谢、食物摄入和体重)而变化。还要理解，对于任意具体的个体，应该根据个体需要和管理或监督组合物给药的人员的专业判断随时调整具体给药方案，并且本文显示的浓度范围仅为示例性并且无意限制包含它们的组合物和组合的范围或用途。根据个体和糖尿病状态，可每分钟、每数分钟、每小时、每天、每周、每月、每年或一次给药组合物。通常，选择给药方案以限制毒性和/或其它负面作用，如胰岛素过量。要注意，主治医师会知道如何以及何时终止治疗、中断治疗或将治疗调整到较低剂量。相反，如果临床响应不足(排除毒副作用)，主治医师也会知道如何以及何时将治疗调整到较高剂量。

给药方式

a.注射器或小瓶

可使用数种给药方式中的一种或多种胃肠外向个体给药本文提供的制剂或复合制剂，其包括但不限于，注射器、小瓶或适合单剂量或多剂量制剂的其它容器。例如，包括胰岛素注射器在内的一次性注射器可用于给药不连续的组合物注射，例如快速推注。可用于本文提供的组合物给药的注射器包括胰岛素注射器，其可被设计为容纳标准浓度的胰岛素制剂(包括100U/ml浓度的胰岛素制剂)，并且具有胰岛素单位标记以方便给药。

b.胰岛素笔

胰岛素笔是可用于给药本文提供的复合制剂的递送系统。胰岛素笔包括具有填充有待给药的组合物的可更换药筒的那些和具有不可更换的药筒的那些。具有不可更换的药筒的胰岛素笔通常在药筒用空后被丢弃。胰岛素笔使得能够以半个单位、一个单位或两个单位的增量给药，一般使用给药刻度盘或用于设定剂量的其它机制来测量增量(参见例如第5,947,934、6,074,372、6,110,149、6,524,280、6,582,404号美国专利)。然后通过连接在笔上的细针头递送复合制剂。胰岛素笔为本领域熟知的，并包括其它地方记载的那些，包括但不仅限于在第5,947,934、4,973,318、5,462,535、5,599,323、5,626,566、5,984,906、6,074,372、6,110,149、6,302,869、6,379,339和7,241,278号美国专利记载的那些。其它类似的给药装置(例如第5,947,934、6,074,372、6,110,149和6,379,339号美国专利所记载的那些)也可用于给药本文提供的组合物，其为胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，或者单独地为胰岛素组合物和乙酰透明质酸降解酶组合物。在一些实例中，胰岛素笔或类似装置还包含可测量个体血糖水平的传感器或监测器(参见例如WO2003047426)。

可用于或经改造后可用于递送本文提供的复合制剂的胰岛素笔和类似递送装置为本领域熟知的，其包括但不限于以商标

(Owen Mumford,Inc.)、Disetronic Pen(Disetronic Medical Systems)、

Pen(Eli Lilly and Company)、

Mix75/25Pen(Eli Lilly and Company)、

70/30Pen(Eli Lilly and Company)、

N Pen(Eli Lilly and Company)、

FlexPen(Novo Nordisk)、

3(Novo Nordisk)、

4(Novo Nordisk)、

Junior(Novo Nordisk)、

Mix 70/30FlexPen(Novo Nordisk)、

(Novo Nordisk)、

(Novo Nordisk)、

(Novo Nordisk)、

(Sanofi-Aventis)、

Pro2(Sanofi-Aventis)、

(Sanofi-Aventis)和

(Sanofi-Aventis)销售的那些。

c.胰岛素泵和其它胰岛素递送装置

可使用胰岛素递送装置(例如胰岛素泵或其它类似的连续输注装置)向糖尿病个体给药本文提供的复合制剂。胰岛素递送装置通常包含至少一个含有胰岛素制剂的一次性的容器、泵(包含任意控制器、软件、处理模块和/或电池)和一次性输注装置(包含用于皮下注射的插管或针头以及将插管或针头连接至胰岛素容器的导管)。为了与本文提供的稳定复合制剂一起使用，胰岛素递送装置可含有包含复合配制的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的容器。所述复合制剂可持续给药或快速推注给药。此外，胰岛素递送装置的使用者具有通过决定推注的进程(shaping the bolus)来影响胰岛素性质的能力。例如，可给药标准推注，其为类似于不连续注射的输注，因为所有的剂量被即刻泵出。持续推注(extendedbolus)为一段时间内的缓慢输注，其避免高起始剂量并延长组合物的作用。可使用胰岛素泵或其它连续递送系统给药包含标准推注和持续推注二者的组合推注。胰岛素递送装置为本领域已知的并记载于其它地方，其包括但不限于第6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,025,743和7,109,878号美国专利。胰岛素递送装置也可与葡萄糖监测器或传感器连接，和/或可包含基于血糖水平、食物中碳水化合物含量或其它摄入来计算推荐胰岛素剂量的装置。其它胰岛素递送装置可以为可植入的或可在个体外部。

d.连续输液泵系统

与本文的复合制剂一起使用的胰岛素递送装置包括胰岛素泵或能够连续皮下胰岛素输注的其它类似装置。胰岛素递送装置(包括开环系统和闭环系统)通常包含至少一个含有胰岛素复合制剂的一次性的容器、泵(包含任意控制器、软件、处理模块和/或电池)和一次性输液装置(包含用于皮下注射的插管或针头以及将插管或针头连接至胰岛素容器的导管)。闭环递送装置另外包含葡萄糖监测器或传感器。胰岛素递送装置可包含容纳胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的超速效胰岛素复合制剂的容器。

所述胰岛素复合制剂可持续和/或快速推注给药。使用者设定泵以在一天中连续地提供胰岛素制剂的稳定细流或“基础”量。泵也基于使用者摄入而在餐后和在血糖过高时释放额外(“推注”)剂量的胰岛素制剂。需要经常进行血糖监测以确定胰岛素剂量并确保适当地递送胰岛素。这可以通过手工监测或通过单独的或内含的葡萄糖监测器来实现。此外，胰岛素递送装置使用者具有通过决定推注的进程来影响胰岛素的性质的能力。例如，可以给药标准推注，它是与不连续注射类似的输注，因为所有的剂量被即刻泵出。持续推注为一段时间内的缓慢输注，其避免高起始剂量并延长组合物的作用。可使用胰岛素泵或其它连续递送系统给药包含标准推注和持续推注二者的组合推注。

胰岛素递送装置是本领域已知的并记载于其它地方，包括但不限于第6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,025,743和7,109,878号美国专利。胰岛素递送装置也可与葡萄糖监测器或传感器(例如，闭环系统)连接，和/或可包含基于血糖水平、食物中碳水化合物含量或其它摄入来计算推荐胰岛素剂量的装置。其它胰岛素递送装置可以为可植入的或可在个体外部。外部胰岛素输液泵的使用需要个体的谨慎选择、精确监测和彻底教育和长期进行的随访。该护理通常由健康专业人员的多学科小组提供，所述专业人员具有管理个体的胰岛素泵治疗专门的专业技术和经验。

i.开环系统

可以与本文提供的复合制剂一起使用开环系统。开环系统通常包含至少一个包含胰岛素制剂的一次性容器、泵(包括任意控制器、软件、处理模块和/或电池)和一次性输注装置(包含用于皮下注射的插管或针头以及将插管或针头连接至胰岛素容器的导管)。所述开环系统每数分钟输注小(基础)剂量，并输注患者手工设定的大(推注)剂量。但是，开环系统通常不包含葡萄糖监测器或传感器，因此不能对患者的血清葡萄糖水平的变化做出响应。本领域技术人员已知多种用于测量血糖水平的方法和装置。许多糖尿病患者用于亲自监测他们的血糖水平的常规技术包括：定期抽取血液，将血液应用于试验条，并且使用测热的、电化学的或测光度的检测来确定血糖水平。已经研发了多种用于连续或自动监测血流或间隙液中的分析物(诸如葡萄糖)的装置。这些装置中的一些使用电化学传感器，其被直接植入患者的血管中或皮下组织中。用于监测葡萄糖水平的示例性方法和装置包括但不限于在第5,001,054、5,009,230、5,713,353、6,560,471、6,574,490、6,892,085、6,958,809、7,299,081、7,774,145、7,826,879、7,857,760和7,885,699号美国专利(将其援引加入本文)中记载的那些。

胰岛素递送系统(诸如胰岛素泵)是本领域已知的并且可以用在开环系统中。示例性开环胰岛素递送装置(诸如上述的那些)包括但不限于在第4,562,751、4,678,408、4,685,903、4,373,527、4,573,994、6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,109,878、7,938,797和7,959,598号美国专利(将其援引加入本文)中描述的那些。可将这些系统和本领域技术人员可容易地鉴别的类似系统用于递送本文提供的复合制剂。胰岛素递送装置通常包含一个或多个容器，所述容器通常是一次性的，其包含胰岛素制剂，诸如本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂。在一些实例中，使用输注导管和插管或针头递送所述复合制剂。在其它实例中，所述输注装置直接附着于皮肤，并且所述复合制剂从输注装置穿过插管或针头直接流入体内，无需使用导管。在其它实例中，所述输注装置是在体内，并且可以任选地使用输注导管来递送所述复合制剂。

ii.闭环系统

闭环系统(有时称作人工胰腺)是特别关注的，用于与本文提供的复合制剂一起使用。闭环系统指具有集成的连续葡萄糖监测器、胰岛素泵或其它递送系统和控制器的系统，所述控制器包含根据血糖水平的实时测量连续计算控制血糖所需的胰岛素输注的数学算法。当其为优化的，这样的系统有助于连续的并且非常严格的血糖控制，类似于在健康的非糖尿病个体中观察到的天然胰岛素反应和血糖控制。然而，为了有效，要求闭环系统既可靠又准确的连续血糖监测，以及非常快速地递送胰岛素。例如，与皮下递送速效胰岛素相关的胰岛素吸收和起效的延迟可导致大的餐后血糖波动(Hovorka等人(2006)DiabeticMed.23:1-12)。由于胰岛素吸收、胰岛素起效、间质葡萄糖动力学(interstitial glucosekinetics)以及基于离体的监测系统(例如基于微量透析技术的那些)的传送时间引起的延迟可导致从胰岛素递送时间到其可检测的降糖作用峰值之间总共100分钟或更长的时间滞后(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23:1-12)。因此，一旦给药，胰岛素会继续增加它可测量的作用，持续接近2个小时。这使得使用闭环系统有效降低摄入食物后的血糖浓度变得复杂。首先，必须检测到葡萄糖升高。然而，这通常仅发生在约10-40分钟后。系统必须确定食物已被消化并给药合适剂量的胰岛素。长时间延迟和一旦给药后不能“撤回”胰岛素损害了该系统在“错误判断”胰岛素剂量后补偿的能力。通过使用速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂(例如本文提供的那些)，其可显示增加的吸收速率和水平以及药效学上的相关改善(参见例如US20090304665和WO2009134380)，可以至少部分地克服此类问题。速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂具有比单独的速效胰岛素减少的t_max(即更快地达到最大浓度)，并且比单独的速效胰岛素更快地开始控制血糖水平。该加快的吸收和起效速率缩短胰岛素起效与葡萄糖监测和摄入之间的延迟，得到可以更严格地控制血糖水平从而减少血糖波动的更有效的闭环系统。

闭环系统为本领域熟知的并记载于其它地方，其包括但不限于5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,669,663、6,740,072、7,267,665和7,354,420号美国专利(将其援引加入本文)。可将这些系统以及本领域技术人员可容易辨别的类似系统用于递送本文提供的复合制剂。闭环系统包含测量血糖水平的传感器系统、控制器和递送系统。这一集成系统被设计成模仿胰腺β细胞(β-细胞)，使得它以类似于完全功能的人β-细胞在响应身体中血糖浓度的变化时产生的浓度曲线来控制输注装置将胰岛素递送入个体中。因此，该系统模拟人体对血糖水平的天然胰岛素反应，并且不仅有效使用胰岛素并且还补偿(account for)其它身体功能，因为胰岛素既具有代谢作用又具有促有丝分裂作用。并且，使用闭环系统达到血糖控制不需要任意关于进餐的数量和时间的信息或其它因素即可达到。该系统可仅依赖于实时血糖测量。葡萄糖传感器产生表示体内血糖水平的传感器信号，并将该传感器信号提供给控制器。控制器接收传感器信号并产生传达至胰岛素递送系统的指令。胰岛素递送系统接收该指令，并响应该指令将胰岛素输注入体内。下文描述可用于递送本文提供的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂的闭环系统的示例性组件。要理解，本领域技术人员可以容易地识别用于与所述复合制剂一起使用的适合的闭环系统。该类系统在本领域已有所记载，其包括但不限于在第5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,669,663、6,740,072、7,267,665和7,354,420号美国专利中所描述的那些。本领域也单独地或在用于达到血糖控制的闭环系统的上下文中记载了此类系统的单个组件。要理解，本文提供的实例仅为示例性的，也可使用其它闭环系统或单个组件用于递送本文提供的复合制剂。

闭环系统包含持续发挥功能的葡萄糖传感器或监测器。这类装置可包含插入皮下并连接至通过射频遥测(radiofrequency telemetry)将葡萄糖数据无线发送到小接收器的小发射器的针头式传感器。在一些实例中，使用插入针头将传感器插入个体皮肤，一旦将传感器置于皮下组织就将所述插入针头移除并丢弃。插入针头有锋利的针尖和在插入皮肤的过程中容纳传感器的开口插槽(参见例如第5,586,553和5,954,643号美国专利)。闭环系统中使用的传感器可任选地包含三个暴露于皮下组织间质液(ISF)中的电极。这三个电极包含一个工作电极，一个参比电极和一个用于形成回路的对电极。当在工作电极和参比电极间提供一个合适的电压时，ISF提供两个电极之间的阻抗。模拟电流信号从工作电极流出通过人体到达对电极。工作电极的电压一般保持接地，参比电极的电压可保持在设定电压(V设定)，例如300-700mV。由电极间电压差激发的最显著的反应是葡萄糖的还原，因为它首先与葡萄糖氧化酶(COX)反应生成葡糖酸和过氧化氢(H₂O₂)。然后，H₂O₂在工作电极表面被还原为水(H₂O)和(O^-)。O^-从传感器电子组件吸引正电荷，从而排斥电子并引起电流流动。这导致模拟电流信号与和传感器电极接触的ISF中的葡萄糖浓度成比例(参见例如第7,354,420号美国专利)。

在一些实例中，使用多于一个传感器测定血糖。例如，当一传感器发生故障时，可使用多余的传感器并可由遥测特性监测器发送器电子元件告知个体。指示器也能够告知个体哪些传感器仍在工作和/或仍在工作的传感器的数量。在其它实例中，通过叠加(averaging)装置或其它装置组合传感器信号。此外，可使用不同类型的传感器。例如，可同时使用体内葡萄糖传感器和体外葡萄糖传感器来测量血糖。

可用于闭环系统中的葡萄糖传感器为本领域熟知的，并可被容易地识别，并任选地由本领域技术人员进一步修改。示例性体内葡萄糖传感器包括但不限于在第5,497,772、5,660,163、5,791,344、5,569,186和6,895,265号美国专利记载的那些。第6,011,984号美国专利记载了使用荧光的示例性葡萄糖传感器。葡萄糖传感器系统也可使用其它传感技术，包括光束、电导率、喷射取样(jet sampling)、微透析、微穿孔、超声取样、反向离子透入或其它方法(例如第5,433,197和5,945,676号美国专利和国际专利公开WO199929230)。在一些实例中，只有工作电极位于皮下组织并与ISF接触，对电极和参比电极位于体外并与皮肤接触。对电极和参比电极可位于监测器外壳表面并可保持在皮肤上作为遥测特性监测器的一部分。在其它实例中，使用其它装置将对电极和参比电极保持在皮肤上，例如在电极上缠金属线并将电极绑在皮肤上，将电极合并在接触皮肤的手表底面。另外，可将多于一个工作电极放入皮下组织以具有多余的电极。也可从个体体内收集间质液，并使其流过未植入体内的体外传感器。

控制器接收来自葡萄糖传感器的输入。将控制器设计为模仿胰腺β细胞(β-细胞)并向胰岛素递送装置提供指令以输注控制血糖所需的胰岛素量。控制器使用具有根据葡萄糖传感器检测到的葡萄糖水平计算所需胰岛素量的算法的软件。示例性算法包括近似地模仿β-细胞的那些，因为设计用于以最小化体内葡萄糖波动而不考虑胰岛素的递送量的算法可导致过多的体重增加、高血压和动脉粥样硬化。系统通常倾向于模仿体内胰岛素分泌模式并且将这一模式调整得与正常健康个体经历的体内β-细胞适应一致。可用于闭环系统的控制算法包括比例-积分-微分(PID)控制器所使用的那些。在一些系统中也可使用比例微分控制器和模仿预测控制(MPC)算法(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23:1-12)。示例性算法包括但不仅限于在Hovorka等人(Diabetic Med.(2006)23:1-12)、Shimoda等人(FrontMed Biol Eng(1997)8:197-211)、Shichiri等人(Artif.Organs(1998)22:32-42)、Steil等人(Diabetes Technol Ther(2003)5:953–964)、Kalatz等人(Acta Diabetol.(1999)36:215)以及第5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,740,042、6,669,663、6,740,072、7,267,665和7,354,420号美国专利和第20070243567号美国专利公开中记载的那些。

在一个实例中，在闭环系统中使用PID控制器。PID控制器通过从三个角度评估葡萄糖波动来持续调节胰岛素输注：与目标葡萄糖的偏离(比例分量)，环境葡萄糖(ambientglucose)和目标葡萄糖之间的曲线下面积(积分分量)和环境葡萄糖的变化(微分分量)。一般而言，体内β-细胞对葡萄糖变化的响应的特征在于“第一”和“第二”相胰岛素响应。可使用比例、加积分、加微分(PID)控制器模拟β-细胞的双相胰岛素响应(参见例如第7,354,420号美国专利)。

控制器产生对所需胰岛素递送的指令。胰岛素递送系统(例如胰岛素泵)为本领域已知的并可用于闭环系统中。示例性胰岛素递送装置(例如上文所描述的那些)包括但不限于在第4,562,751、4,678,408、4,685,903、4,373,527、4,573,994、6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,025,743和7,109,878号美国专利中记载的那些。胰岛素递送装置通常包含一个或多个容器，所述容器通常是一次性的，其包含胰岛素制剂，诸如本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂。在一些实例中，使用输注导管和插管或针头递送所述复合制剂。在其它实例中，所述输注装置直接附着于皮肤，并且所述复合制剂从输注装置穿过插管或针头直接流入体内，无需使用导管。在其它实例中，所述输注装置是在体内，并且可以任选地使用输注导管来递送所述复合制剂。闭环系统还可包含其它组件，其包括但不限于过滤器、校准器和发射器。

H.制备编码胰岛素或乙酰透明质酸降解酶及其多肽的核酸的方法

本文所述胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的多肽可通过本领域熟知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。多肽也可为化学合成的。例如，可化学合成胰岛素的A-链和B-链，然后通过二硫键例如经还原-再氧化反应交联。当通过重组方法制备多肽时，可使用本领域技术人员已知的任意用于鉴定编码期望的基因的核酸的方法。可使用本领域可用的任意方法从例如细胞或组织来源获得编码透明质酸酶的全长(即包含完整的编码区域)cDNA或基因组DNA克隆。经修饰的或变体胰岛素或乙酰透明质酸降解酶可从野生型多肽通过例如定点突变经工程化获得。

可使用本领域已知的任意可获得的用于克隆和分离核酸分子的方法克隆或分离多肽。这样的方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选，其包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。

可使用用于核酸扩增的方法来分离编码期望的多肽的核酸分子，所述方法包括例如聚合酶链式反应(PCR)法。可将包含核酸的物质用作原料，由其可分离期望的编码多肽的核酸分子。例如，可将DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病个体的样品用于扩增方法。核酸文库也可用作原料的来源。可设计引物以扩增期望的多肽。例如，可基于产生期望的多肽的表达的序列来设计引物。可基于多肽氨基酸序列的回译来设计引物。可对通过扩增生成的编码期望的多肽的核酸分子进行测序和验证。

另外的核苷酸序列可结合至编码多肽的核酸分子(包含连接基序列)，其包含用于将合成基因克隆到载体(例如蛋白表达载体)或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体的限制性内切核酸酶位点。此外，可通过操作将限定(specify)功能DNA元件的另外的核苷酸序列与编码多肽的核酸分子连接。这些序列的实例包括但不限于设计用于促进胞内蛋白质表达的启动子序列，和设计用于促进蛋白质分泌的分泌序列(例如异源信号序列)。这些序列为本领域技术人员已知的。也可将另外的核苷酸残基序列(例如限定蛋白质结合区域的碱基序列)与编码酶的核酸分子连接。这些区域包括但不限于促进或编码这样的蛋白质的残基序列，所述蛋白质促进将酶摄入到特异靶细胞，或者改变合成基因的产物的药代动力学。例如，可将酶与PEG基团连接。

此外，可加入标记或其它基团，例如以辅助多肽的检测或亲和纯化。例如，也可将另外的核苷酸残基序列(例如限定表位标记或其它可检测标记的碱基序列)与编码酶的核酸分子连接。这样的示例性序列包括编码His标记的核酸序列(例如，6xHis,HHHHHH；SEQ IDNO:54)或Flag Tag(DYKDDDDK；SEQ ID NO:55)。

然后可将已鉴定和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可使用本领域已知的大量的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或经修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这些载体包括但不限于噬菌体(例如λ衍生物)，或质粒(例如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物)或Bluescript载体(Stratagene,La Jolla,CA)。其它表达载体包括本文举例说明的HZ24表达载体。插入到克隆载体中可例如通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体来实现。可使用TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)实现插入。如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，可酶法修饰该DNA分子的末端。或者，可通过连接核苷酸序列(连接基)至该DNA末端来产生任意所需的位点；这些连接的连接基可包含编码限制性内切核酸酶识别序列的特定的化学合成的寡核苷酸。在备选方法中，被裂解的载体和蛋白质基因可通过同聚物加尾来修饰。可通过例如转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔将重组分子引入宿主细胞中，从而得到许多基因序列的拷贝。

可使用多种技术制备胰岛素(参见例如Ladisch等人(1992)Biotechnol.Prog.8:469-478)。在一些实例中，将编码前胰岛素原或胰岛素原多肽的核酸插入表达载体中。表达后，通过裂解信号序列和/或C肽的酶法或化学方法将前胰岛素原或胰岛素原多肽转化成胰岛素，得到经例如还原-再氧化反应通过二硫键交联的A链和B-链(参见例如Cousens等人,(1987)Gene 61:265-275,Chance等人,(1993)Diabetes Care 4:147-154)。在另一实例中，将编码胰岛素A-链和B-链的核酸插入一个或两个表达载体中用于从一个表达载体共表达为单一的多肽，或者从一个或两个表达载体表达为两个多肽。因此，可分别表达A-链和B-链多肽，然后组合以生成胰岛素，或可在缺乏C-链的情况下共表达。在A-链和B-链共表达为单一多肽的情况中，编码该亚基的核酸也可编码B-链和A-链之间的连接基或间隔基(例如下文描述的连接基或间隔基)。插入到表达载体中的核酸可包含例如编码胰岛素B-链、连接基(例如丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸连接基)以及A-链的核酸，导致表达例如“胰岛素B链-Ala-Ala-Lys-胰岛素A链”。

在特定的实施方案中，用包含分离的蛋白质基因、cDNA或合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生该基因的多个拷贝。因此，通过使转化体生长、从所述转化体中分离所述重组DNA分子，并且必要时从所述分离的重组DNA中回收插入的基因，可大量获得该基因。

1.载体和细胞

为了一个或多个期望的蛋白质(例如本文所述的任意蛋白质)的重组表达，可将包含编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或部分的核酸插入到合适的表达载体(即包含用于所插入的蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体)中。也可由酶基因和/或它们的侧翼区的天然启动子提供必要的转录和翻译信号。

本文也提供包含编码酶的核酸的载体。本文也提供包含所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，并且所述载体为任意适合用于其中的载体。

本文提供包含所述载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这些细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过使以上所述的细胞在该细胞表达编码的蛋白质的条件下生长并回收表达的蛋白质，将所述细胞用于产生其蛋白质。用于本文目的，例如，可将所述酶分泌到培养基中。

本文提供包含编码与天然或异源信号序列偶联的可溶性透明质酸酶多肽的核苷酸序列以及其多个拷贝的载体。可选择所述载体用于将所述酶蛋白表达在细胞中或使所述酶蛋白表达为分泌型蛋白。

可使用多种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒和其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；包含酵母载体的微生物，例如酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件具有不同的长度和特异性。根据所使用的宿主-载体系统，可使用许多适合的转录和翻译元件中的任一种。

可使用本领域技术人员已知的任意用于将DNA片段插入载体的方法构建包含嵌合基因(包含合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列)的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体(遗传重组)。编码蛋白质或其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可通过另一核酸序列调控，从而使该基因或其片段表达于用重组DNA分子转化的宿主中。例如，可用本领域已知的任意启动子/增强子来控制蛋白质的表达。在特定的实施方案中，启动子对于期望的蛋白质的基因而言不是天然的。可使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist和Chambon,Nature290:304-310(1981))、包含于劳氏肉瘤病毒3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人Cell 22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,Nature 296:39-42(1982))；原核表达载体，例如β-内酰胺酶启动子(Jay等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或tac启动子(DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983))；也参见在ScientificAmerican 242:74-94(1980)中的“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”；包含胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrera-Estrella等人,Nature303:209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人,Nucleic Acids Res.9:2871(1981))，以及光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人,Nature 310:115-120(1984))；来自酵母和其它真菌的启动子，例如Gal4启动子、乙醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子以及下列显示组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,Cell38:639-646(1984)；Ornitz等人,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7:425-515(1987))；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan等人,Nature 315:115-122(1985))，在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人,Cell 38:647-658(1984)；Adams等人,Nature 318:533-538(1985)；Alexander等人,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人,Cell 45:485-495(1986))，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人,Genes and Devel.1:268-276(1987))，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer等人,Science 235:53-58 1987))，在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,Genes and Devel.1:161-171(1987))，在髓样细胞中具有活性的β珠蛋白基因控制区(Magram等人,Nature 315:338-340(1985)；Kollias等人,Cell 46:89-94(1986))，在脑少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人,Cell 48:703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,Nature 314:283-286(1985))以及在下丘脑的促性腺激素细胞中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人,Science 234:1372-1378(1986))。

在特定的实施方案中，所使用的载体包含与编码期望的蛋白质或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸操作性地连接的启动子、一个或多个复制起点以及任选的一个或多个可选标记(例如抗生素抗性基因)。用于转化大肠杆菌(E.coli)细胞的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA；也可参见Qiagen出版的描述该系统的文献)。pQE载体具有用于提供重组蛋白在大肠杆菌中的严格调控的、高水平的表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和两个lac操作子阻抑模块，用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)、6XHis标记编码序列、t₀和T1转录终止子、ColE1复制起点以及用于使其具有氨苄西林抗性的β内酰胺酶基因。pQE载体能够将6xHis标记置于重组蛋白的N-端或C-端。这些质粒包括为全部三个阅读框提供多克隆位点并提供N-端6xHis标记的蛋白质的表达的pQE 32、pQE 30和pQE 31。用于转化大肠杆菌细胞的其它示例性质粒载体包括例如pET表达载体(参见第4,952,496号美国专利；可获自Novagen,Madison,WI；也可参见Novagen出版的描述该系统的文献)。这些质粒包括pET 11a，其包含T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操作子以及lac阻遏基因；pET 12a-c，其包含T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(Novagen,Madison,WI)，其包含用于使用His柱纯化的His-Tag^TM前导序列和允许在所述柱上纯化后进行裂解的凝血酶裂解位点、T7-lac启动子区和T7终止子。

示例性哺乳动物细胞表达载体为HZ24表达载体。该HZ24表达载体衍生自pCI载体骨架(Promega)。它包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。该表达载体也具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。

2.连接基

在一些实例中，通过生成具有连接基的A-链和B-链的多肽使得例如B-链的C-端通过短连接基与A-连的N-端结合而生成胰岛素。A-链和B-链可表达来自包含连接基的单个多肽，或可分别表达后通过连接基结合。根据所需性质选择连接基。连接基应足够长并且具有足够的柔性，使得A-链和B-链可以模拟胰岛素的天然构象。

连接基可为适合胰岛素A-链和B-链的任意部分。这些部分包括但不限于肽连接(peptidic linkage)；氨基酸键和肽键，通常包含一个至约60个氨基酸；化学连接基，例如异双功能(heterobifunctional)可裂解的交联连接基、光可裂解的(photocleavable)连接基和酸可裂解的(acid cleavable)连接基。

所述连接基可为肽。该肽连接基通常具有约2个至约60个氨基酸残基，例如约5个至约40个，或约10个至约30个氨基酸残基。肽连接基可方便地由核酸编码并在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达后被整合在融合蛋白中。在一个实例中，丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸(AAK)(SEQ ID NO:178)连接基由编码胰岛素B-链的核酸和编码A-链的核酸之间的核酸编码，从而在表达后产生“胰岛素B-链-AAK-胰岛素A链”多肽。肽连接基可为柔性间隔基氨基酸序列，例如单链抗体研究中已知的那些。这些已知的连接基的实例包括但不限于RPPPPC(SEQID NO:166)或SSPPPPC(SEQ ID NO:167)、GGGGS(SEQ ID NO:168)、(GGGGS)_n(SEQ ID NO:169)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:170)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:171)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:172)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:173)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:174)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:175)、SRSSG(SEQ IDNO:176)和SGSSC(SEQ ID NO:177)。

或者，所述肽连接基可为VM(SEQ ID NO:179)或AM(SEQ ID NO:180)，或所述肽连接基具有式AM(G_2-4S)_xAM所描述的结构，其中X为1-11的整数(SEQ ID NO:181)。另外的连接部分记载于例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883；Whitlow,M.等人(1993)Protein Engineering 6:989-995；Newton等人(1996)Biochemistry35:545-553；A.J.Cumber等人(1992)Bioconj.Chem.3:397-401；Ladurner等人(1997)J.Mol.Biol.273:330-337和第4,894,443号美国专利中。

在一些实例中，肽连接基由核酸编码并在宿主细胞(例如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达后被整合在B-链和A-链之间。在其它实例中，肽连接基为通过化学方法合成的。这可在与一个或多个A-链和B-链的合成分开的方案中进行，之后例如使用异双功能连接基将这些组件连接。或者，肽连接基可在胰岛素链之一的N-或C-末端合成，然后通过该肽连接基(例如异双功能连接基)将该链与另一条链连接。

本领域技术人员已知的任意连接基均可用于本文以连接胰岛素A-链和B-链。适用于化学连接这些链的连接基和键包括但不限于二硫键、硫醚键、受阻的二硫键(hindereddisulfide bond)以及游离反应性基团(例如氨基和巯基)之间的共价键。通过使用异双功能试剂在这些多肽之一或其二者上产生反应性巯基，然后使一个多肽上的巯基与另一多肽上的反应性巯基或氨基(反应性马来酰亚胺基团或巯基可与之结合)反应，来产生这些键。其它连接基包括酸可裂解的连接基，例如会在酸性更强的胞内小室中被裂解的二马来酰亚胺基乙氧基丙烷(bismaleimideothoxy propane)、酸不稳定的转铁蛋白缀合物和己二酸二酰肼；暴露于紫外线或可见光后被裂解的交联连接基以及例如人IgG1恒定区的多种结构域(例如CH1、CH2和CH3)的连接基(参见Batra等人(1993)Molecular Immunol.30:379-386)。在一些实施方案中，可包含数个连接基以利用所期望的各个连接基的性质。可通过将连接基与胰岛素A-链和B-链共价偶联插入化学连接基和肽连接基。下文所述的异双功能试剂可用于实现这样的共价偶联。也可通过表达编码B-链和A-链之间的连接基的DNA来连接肽连接基。

可用于连接胰岛素A-链和B-链的其它连接基包括：酶底物，例如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、凝血因子Xa底物以及肠激酶底物；可增加溶解度、柔性和/或胞内可裂解性的连接基，包括例如(gly_mser)_n和(ser_mgly)_n的连接基，其中m为1-6，优选1-4，更优选2-4，并且n为1-30，优选1-10，更优选1-4(参见例如PCT国际申请WO 96/06641,其提供示例性连接基)。在一些实施方案中，可包含数种连接基以利用所期望的各个连接基的性质。

3.表达

可通过本领域技术人员已知的包括体内和体外方法在内的任意方法制备胰岛素和乙酰透明质酸降解酶多肽。可在适于产生必需的量和形式的蛋白质(例如给药和治疗所需的)的任意生物体中表达所需蛋白。表达宿主包括原核生物和真核生物，例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞(包括人细胞系)和转基因动物。表达宿主可在它们的蛋白质产生水平以及所表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型上存在差异。可根据这些和其它因素，例如管理和安全考虑、生产成本和纯化的需要和方法选择表达宿主。

许多表达载体是本领域技术人员可用的和已知的，并可用于蛋白质表达。表达载体的选择会受到宿主表达系统的选择的影响。一般而言，表达载体可包含转录启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许进行转化细胞的筛选和维持的选择标记。在一些情况下，可使用复制起点来扩增所述载体的拷贝数量。

可溶性透明质酸酶多肽也可被用作或表达为蛋白融合物。例如，可生成酶融合物以向酶添加另外的功能性。酶融合物蛋白的实例包括但不限于信号序列、例如用于定位的标记(如his₆标记或myc标记)或用于纯化的标记(例如GST融合物)，以及用于引导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合物。

a.原核细胞

原核生物(特别是大肠杆菌)提供用于制备大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简单和快捷的技术。用于大肠杆菌的转化载体可包含诱导型启动子，这些启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达显示对宿主细胞的某种毒性的蛋白质。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调控的λPL启动子。

蛋白质(例如本文提供的任意蛋白质)可表达于大肠杆菌的胞质环境中。胞质为还原性环境并且对于一些分子而言，这可引起不溶性包涵体的形成。还原剂(例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇)以及变性剂(例如盐酸胍和尿素)可用于重新溶解蛋白质。另一种方法为将蛋白质表达于细菌的周质空间，其提供氧化环境以及类伴侣蛋白和二硫化物异构酶，并可引起可溶性蛋白质的产生。通常，将引导蛋白质到周质的前导序列与待表达的蛋白质融合。然后通过周质内的信号肽酶移除前导序列。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酶基因的pelB前导序列和得自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，周质表达使表达的蛋白可以渗漏到培养基中。蛋白质的分泌使得可以从培养基上清中快速并简单地纯化。非分泌型的蛋白质可通过渗透裂解从周质获得。与胞质表达相似，在一些情况中，蛋白质可变成不溶的，可使用变性剂和还原剂促进溶解和重新折叠。诱导和生长的温度也可影响表达水平和溶解度，通常使用25℃-37℃的温度。通常细菌产生非糖基化的(aglycosylated)蛋白质。因此，如果蛋白质的功能需要糖基化，可在从宿主细胞纯化后在体外增加糖基化。

b.酵母细胞

酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和毕赤氏酵母(Pichia pastoris)为可用于制备蛋白质(例如本文所述的任意蛋白质)的熟知的酵母表达宿主。可用附加型复制载体或通过利用同源重组进行的稳定的染色体整合来转化酵母。通常，使用诱导型启动子调控基因表达。该类启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，例如CUP1、AOX1或其它毕赤酵母启动子或其它酵母启动子。表达载体经常包含用于筛选和维持转化的DNA的选择标记，例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。表达于酵母中的蛋白质通常为可溶的。与伴侣蛋白(例如Bip)和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可提高表达水平和溶解度。此外，使用分泌信号肽融合物(例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号)以及与酵母细胞表面蛋白(例如Aga2p交配型粘附受体或Arxula adeninivorans的葡糖淀粉酶)的融合物可引导表达于酵母中的蛋白质以进行分泌。可以改造蛋白质酶(例如Kex-2蛋白酶)裂解位点，以在它们退出分泌途径时从表达的多肽移除融合的序列。酵母也能够在Asn-X-Ser/Thr基序进行糖基化。

c.昆虫细胞

昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达的昆虫细胞，可用于表达多肽，例如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质并且能够进行高等真核生物使用的多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，这提高了安全性，并减少了对真核表达调控方面的担忧。代表性的表达载体使用启动子进行高水平表达，例如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)以及昆虫细胞系，例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和大斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)的Sf9。为了高水平表达，紧接于病毒的多角体蛋白起始密码子的下游将待表达的分子的核苷酸序列融合。在昆虫细胞中，哺乳动物的分泌信号被准确加工并可用于将表达的蛋白质分泌到培养基中。此外，美洲粘虫(A7S)和大斑蝶(DpN1)细胞系产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。

昆虫细胞中的另一表达系统为使用稳定转化的细胞。例如Schneider 2(S2)细胞系、Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞(白纹伊蚊(Aedesalbopictus))的细胞系可用于表达。在用镉或铜进行重金属诱导的情况下，果蝇的金属硫蛋白启动子可用于诱导高水平表达。通常通过使用选择标记(例如新霉素和潮霉素)来维持表达载体。

d.哺乳动物细胞

哺乳动物表达系统可用于表达包括可溶性透明质酸酶多肽的蛋白质。通过病毒(例如腺病毒)感染，或通过直接DNA转移(例如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖)以及通过物理方法(例如电穿孔和显微注射)，可将表达构建体转移到哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多聚腺苷酸化元件。也可加入IRES元件，以允许与另一个基因(例如选择标记)的双顺反子表达。该类载体常常包含用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV-40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中具有活性。组织型和细胞型的启动子和增强子区也可用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自基因(例如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素控制区)的那些。选择标记可用于包含表达构建体的细胞的筛选和维持。选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可在甲氨蝶呤存在下进行表达以筛选出仅表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号转导分子(例如TCR-ζ和Fc_εRI-γ)的融合可引导蛋白质以活性状态在细胞表面直接表达。

哺乳动物表达可使用许多细胞系，其包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠的细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌型)和其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、SP2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。还可用适应无血清培养基的细胞系，无血清培养基有助于从细胞培养基中纯化分泌的蛋白。实例包括CHO-S细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,目录号11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham等人,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42。)。还可用适于在经优化用于最大表达的特殊培养基中生长的细胞系。例如，DG44 CHO细胞适于在化学成分明确的、不含动物产品的培养基中悬浮培养生长。

e.植物

转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质(如本文所述的任意蛋白质)。通常使用直接DNA转移(例如微粒轰击和PEG介导)转移进入原生质体以及用农杆菌介导的转化将表达构建体转移到植物中。表达载体可包含启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。通常将表达载体和转化技术在双子叶植物宿主(例如拟南芥(Arabidopsis)和烟草)以及单子叶植物宿主(例如玉米和水稻)之间进行区分。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子、泛素和UBQ3启动子。经常使用选择标记(例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶)来辅助转化细胞的筛选和维持。可将转化的植物细胞以细胞、聚集物(愈伤组织)维持在培养物中或再生成完整植物。转基因植物细胞也可包括经工程化以产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可能影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。

4.纯化技术

从宿主细胞中纯化包括胰岛素和乙酰透明质酸降解酶多肽或其它蛋白质在内的多肽的方法取决于所选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌型分子，通常在移除细胞后从培养基中纯化蛋白质。对于胞内表达，可裂解细胞，然后从提取物中纯化蛋白质。当将转基因生物(例如转基因植物和转基因动物)用于表达时，组织或器官可作为制备裂解细胞提取物的原料。此外，转基因动物制备可包括在奶或蛋中制备的多肽，可将其收集，如有必要，可使用本领域的标准方法提取蛋白质并进一步纯化。

可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来纯化蛋白质，例如胰岛素多肽或乙酰透明质酸降解酶多肽，这些技术包括但不仅限于SDS-PAGE、大小分级和尺寸排阻色谱法、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法)。也可使用亲和纯化技术以提高效率和制备物的纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体和其它分子可用于亲和纯化。也可改造表达构建体以向蛋白质添加亲和标记，如myc表位、GST融合蛋白或His₆，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和纯化。可通过包括凝胶电泳、正交HPLC法、染色和分光光度技术在内的本领域任意已知的方法评估纯度。

I.评价稳定性和活性的方法

可以使用测定法来评价本文提供的制剂或复合制剂(包括本文提供的包含速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂)的稳定性。这样的测定法可以评价复合制剂中的乙酰透明质酸降解酶的稳定性和活性和/或速效胰岛素的稳定性、活性和溶解度。这样的测定法可以用于，例如，通过在储存之前和此后在不同的时间点评价活性、溶解度和稳定性(例如聚集体形成等)，确定复合制剂在特定储存温度和条件下随时间的稳定性。所述测定法也可以用于对本文提供的制剂做出微小调节，同时保留两种活性剂的稳定性。

1.胰岛素

使用本领域熟知的方法和测定法，可以评价本文提供的胰岛素复合制剂的稳定性和溶解度。例如，可以通过目测评估、酸澄清、光学显微术、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、体内生物测定法以及变性和非变性尺寸排阻色谱法(SEC)，评价胰岛素稳定性和溶解度。在一个实例中，通过目测评估(包括颜色变化、澄清度、向包含本文提供的复合制剂的容器上的聚集体或团集和物质粘附或起霜的存在)，确定胰岛素溶解度和稳定性。通过酸澄清确证视觉变化，其中酸化以后溶解作用的缺乏确证不溶性的变性胰岛素在本文提供的复合制剂中的存在。还可以通过光学显微术和/或荧光背部照明的显微镜检查来确证在本文提供的胰岛素复合制剂中的视觉变化。例如，通过RP-HPLC(诸如在实施例3中描述的)，可以评价在本文提供的复合制剂中的速效胰岛素的表观溶解度。在实施例3中所述的方法中，将表观溶解度作为在多种条件和时间点下储存后的胰岛素回收百分比测量。与参比样品相比，确定回收百分比。另外，通过RP-HPLC可以确定胰岛素降解产物，诸如脱酰氨基胰岛素。在一个实例中，通过使用尺寸排阻色谱法测量聚集体的形成，评价在本文提供的复合制剂中的胰岛素稳定性(参见例如实施例4)。在该实施例中，使用SEC来确定高分子量蛋白质(即聚集体)的存在。

也可以使用本领域熟知的方法和测定法评价胰岛素活性。例如，可以在体外或在体内评价胰岛素(包括胰岛素组合物和复合制剂)作为治疗剂起作用的能力。例如，可进行本领域熟知的体外测定法以评价胰岛素结合胰岛素受体的能力。在一个实例中，进行竞争性结合测定，其中制备人胎盘细胞膜作为胰岛素受体的来源并在有或无未标记的胰岛素类似物的情况下与放射性标记的人胰岛素孵育。然后检测结合的放射性标记的胰岛素的量，以测定胰岛素类似物竞争结合的能力并计算胰岛素类似物与胎盘胰岛素受体的相对亲和力(参见例如，Weiss等人,(2001)J.Biol.Chem.276:40018-40024)。其它来源的胰岛素受体(包括其它天然地或重组地表达胰岛素受体的细胞)也可用于这类竞争性结合测定(Duttaroy等人,(2005)Diabetes 54:251-258)。

可体外评价胰岛素刺激葡萄糖摄入或实现其其它任意代表性的代谢结果的能力。为了测量胰岛素刺激的葡萄糖摄入，在有或无胰岛素的情况下将脂肪细胞与标记的葡萄糖(例如2-脱氧-D-[2,6-³H]葡萄糖或D-[U-¹⁴C]葡萄糖)一起孵育。然后测量掺入的放射性以测定存在或不存在胰岛素的情况下的葡萄糖摄入量(Louveau等人,(2004)JEndocrin.181:271-280,Duttaroy等人,(2005)Diabetes 54:251-258)。当评价胰岛素类似物的活性时，也可评价人胰岛素的活性并用于比较。也可进行体外测定法，以评价在胰岛素存在下H4IIE细胞中的葡萄糖生成(Wang等人,(2000)J.Bioche.,275:14717-14721,Duttaroy等人,(2005)Diabetes 54:251-258)。

也可进行使用糖尿病或健康的动物模型或人类个体的体内试验，以评价胰岛素(包括胰岛素组合物和复合制剂)的治疗活性。可将胰岛素向糖尿病动物模型给药以评价例如对血糖水平、循环胰岛素水平和血红蛋白A1c(HbA1c)的作用。当葡萄糖与血红蛋白结合(这发生在血糖水平升高时)时，形成血红蛋白A1c。可通过例如HPLC、ELISA、RIA或其它免疫测定法评价血液样品中的HbA1c水平，健康个体的正常HbA1c值为大约4.0％-6.2％。美国糖尿病协会建议，对于糖尿病患者，该值应低于7％(或在某些人中低于6％)以有助于预防糖尿病的并发症。可通过例如ELISA或RIA测量胰岛素水平。通常使用葡萄糖传感器或分析仪测量葡萄糖水平。

I型糖尿病动物模型包括非肥胖症糖尿病(NOD)小鼠和BioBreeding(BB)大鼠(Atkinson等人,(1999)Nature Med.5:601-604)。II型糖尿病动物模型包括但不限于分别具有瘦素基因或瘦素受体突变的ob/ob小鼠和db/db小鼠、KK小鼠、Nagoya-Shibata-Yasuda(NSY)小鼠、Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠和Gato-Katazaki(GK)大鼠(Cefalu(2006)ILARJournal 47:186-198)。在其它实例中，使用健康动物在有或无乙酰透明质酸降解酶的情况下试验胰岛素活性。

2.乙酰透明质酸降解酶

可使用本领域熟知的方法评价乙酰透明质酸降解酶的活性。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定法通过测量使酶与HA于37℃反应30min后剩余的未降解的透明质酸(或透明质酸，(HA)底物)来间接测定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United StatesPharmacopeia Convention,Inc,Rockville,MD)。在测定法中可使用透明质酸酶参比标准品(Hyaluronidase Reference Standard,USP)或国家处方集(NF)标准透明质酸酶溶液以确定以单位计的任意透明质酸酶的活性。在一个实例中，使用微浊度(microturbidity)测定法测量活性。它基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶性沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠(透明质酸)孵育，持续设定的时间段(例如10分钟)，然后通过加入酸化的血清白蛋白使未消化的透明质酸钠沉淀，来测量活性。在另外的生成时间后，在640nm处测量所得样品的浊度。透明质酸酶对透明质酸钠底物的活性导致的浊度降低是透明质酸酶活性的量度(参见例如实施例2)。

在另一实例中，使用微量滴定测定法测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶孵育后测量残留的生物素化的透明质酸(参见例如，Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269,第20050260186号美国专利公开)。透明质酸的葡糖醛酸残基上的游离羧基被生物素化，生物素化的透明质酸底物共价偶联到微量滴定板上。与透明质酸酶孵育后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应检测残留的生物素化的透明质酸底物，并和与已知活性的透明质酸酶标准品反应后获得的进行比较。其它测量透明质酸酶活性的测定法也为本领域已知并可用于本文的方法中(参见例如，Delpech等人,(1995)Anal.Biochem.229:35-41；Takahashi等人,(2003)Anal.Biochem.322:257-263)。

也可评价乙酰透明质酸降解酶作为扩散剂或分散剂的能力。例如，可在有或无乙酰透明质酸降解酶的情况下将锥虫蓝染料皮下注射到裸鼠每侧的侧面皮肤中。然后例如使用微测径器(microcaliper)测量染料面积以测定乙酰透明质酸降解酶作为分散剂的能力(第20060104968号美国专利公开)。可使用动物模型和/或人类个体(例如在临床试验背景下)体内评价透明质酸酶与另一药剂(例如胰岛素)的联合给药对该药剂的药代动力学和药效学性质的作用。可使用这些测定法中的任意一种将不为透明质酸酶的乙酰透明质酸降解酶的功能活性和透明质酸酶进行比较。这样做可以测定乙酰透明质酸降解酶的功能等价量。例如，可通过与锥虫蓝一起向小鼠腹侧皮肤注射乙酰透明质酸降解酶来评价它作为扩散剂或分散剂的能力，并且可测定达到与例如100单位的透明质酸酶参比标准品相同分散量所需的量。因此，所需的乙酰透明质酸降解酶的量功能上等价于100个透明质酸酶单位。

使用本领域已知的其它方法和测定法，也可以评价乙酰透明质酸降解酶在组合物中(诸如在本文提供的复合制剂中)的稳定性。例如，可以如下评价稳定性：如上面和在实施例2中所述测定透明质酸酶活性，如上所述的目测检查，随时间变化的回收百分比和蛋白质纯度(通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测得(参见例如实施例3))和表观熔化温度。通过RP-HPLC确定的蛋白质纯度是所述复合制剂中的主要乙酰透明质酸降解酶(例如，rHuPH20)相对于存在的所有透明质酸酶物质的百分比。回收百分比是，与参比样品相比，所述复合制剂中的透明质酸酶在不同的储存条件下随时间的相对百分比。在一个实例中，通过动态光散射测量颗粒的流体动力学半径(参见例如，实施例7.B)，测定在本文提供的复合制剂中的透明质酸酶的熔化温度。粒度的增加和熔化温度的降低表明透明质酸酶的变性和随后的聚集。通过RP-HPLC测量透明质酸酶(诸如rHuPH20)的氧化，可以测定在本文提供的复合制剂中的透明质酸酶稳定性。氧化百分比是主要峰(ox-1)和次要峰(ox-2)的峰面积的总和的量度(参见例如实施例10.B)。本领域技术人员已知的可以用于测定在本文提供的复合制剂中的透明质酸酶的稳定性的其它方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹法、核磁共振(NMR)光谱法、质谱法、圆二色性(CD)和基于染料的荧光测定法。

J.治疗用途

本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂可以用于治疗为其使用速效胰岛素的任意病症。可以皮下给药复合制剂来治疗顺从胰岛素治疗的任意病症。本部分提供速效胰岛素的示例性治疗用途。下文描述的治疗用途为示例性的，并且不限制本文描述的复合制剂的应用。治疗用途包括但不限于用于I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和用于危重患者的血糖控制的治疗。例如，可以在餐前以不连续的剂量(例如通过注射器或胰岛素笔)皮下给药速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，作为糖尿病患者的膳食胰岛素疗法以达到血糖控制。也可使用胰岛素泵或在闭环系统的内容物中，将复合制剂皮下或腹膜内给药，以在整个白天和夜间持续控制血糖水平和/或控制餐后血糖波动。鉴别这些疾病或病症在治疗医生的技术范围之内。

如上文所讨论的，通常为每例个体个体化具体剂量和治疗方案。如果需要，可凭经验确定或推断具体剂量、持续时间和治疗方案。例如，可将无乙酰透明质酸降解酶时的速效胰岛素的示例性剂量作为起点，以确定本文提供的复合制剂的合适剂量。可基于多种因素(例如个体体重、大体健康状况、年龄、所使用的具体化合物的活性、性别、饮食、代谢活性、血糖浓度、给药时间、排泄速率、药物联合、疾病的严重性和病程以及患者对疾病的倾向(disposition)和治疗医师的判断)来确定剂量水平。特别地，可测量血糖水平(例如通过血糖传感器测量)，并将其用于确定为达到血糖控制而要给药的胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的量。可用于基于本文提供的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂的吸收速率和吸收水平以及基于血糖水平来确定剂量的算法是本领域已知的。也可通过例如测定食物的碳水化合物含量来计算或调整用于餐后血糖控制的胰岛素剂量(参见例如，Bergenstal等人,(2008)Diabetes Care 31:1305-1310,Lowe等人,(2008)DiabetesRes.Clin.Pract.80:439-443,Chiesa等人,(2005)Acta Biomed.76:44-48)。

1.糖尿病

糖尿病(diabetes mellitus)(或糖尿病(diabetes))以葡萄糖代谢受损为特征。血糖来自吸收进入肠的碳水化合物，并由肝脏产生。升高的血糖水平刺激胰岛素释放。餐后葡萄糖内向通量(influx)可比所在两餐之间观察的肝脏葡萄糖生成高20-30倍。持续10分钟或约10分钟的早期胰岛素释放抑制肝脏葡萄糖生成，之后是较长(后期)的释放期，其持续两小时或更多并满足(cover)餐时碳水化合物内向通量。在两餐之间，持续的低胰岛素水平(即基础胰岛素)，满足正在进行的代谢需求，特别是调节肝脏葡萄糖输出以及脂肪组织、肌肉组织和其它靶位对葡萄糖的利用的代谢需求。糖尿病患者出现升高的血糖水平(高血糖症)。糖尿病可分为两大类：I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的特征为胰腺中胰岛的产生胰岛素的β-细胞损失，导致胰岛素缺乏。β-细胞缺乏的主要原因是T细胞介导的自身免疫。II型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，发生在β-细胞功能受损的患者中。这些患者有胰岛素抵抗或对胰岛素敏感性降低，伴有胰岛素分泌减少。II型糖尿病，最终可能发展成I型糖尿病。糖尿病还包括妊娠糖尿病。可向糖尿病患者给药胰岛素用于维持基础胰岛素水平并防止例如进食后的血糖波动。

a.I型糖尿病

I型糖尿病是T细胞依赖性自身免疫性疾病，其特征作为胰腺内分泌单位的胰岛的浸润和β-细胞破坏，导致胰岛素产生不足和高血糖症。最常在儿童和年轻人中诊断出I型糖尿病，但也可在任意年龄诊断出。除了低胰岛素水平和高血糖水平之外，I型糖尿病患者也可出现多尿、多饮、多食、视力模糊和疲劳。可根据空腹血糖水平达到或超过126mg/dL(7.0mmol/l)、例如在葡糖耐量试验中75g口服葡萄糖负荷后两小时血浆葡萄糖水平达到或超过200mg/dL(11.1mmol/l)和/或随机血浆葡萄糖水平达到或超过200mg/dL(11.1mmol/l)对患者作出诊断。

用于I型糖尿病患者的主要治疗为作为替代疗法的胰岛素给药，其通常与血糖监测相结合进行。如果没有足够的替代胰岛素，可形成糖尿病酮症酸中毒，其可导致昏迷或死亡。可使用例如注射器或胰岛素笔或胰岛素泵向患者皮下注射速效胰岛素以维持全天适合的血糖水平，以及控制餐后血糖水平。在一些情况中，可使用胰岛素泵(包括在闭环系统的内容物中)腹膜内递送胰岛素。因此，可以通过注射器、胰岛素笔或胰岛素泵或其它任意可用于递送胰岛素的装置，向I型糖尿病患者皮下或腹膜内给药本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。

b.II型糖尿病

II型糖尿病与胰岛素抵抗相关，并且在一些群体中也由胰岛素缺乏(β-细胞功能丧失)引起。在II型糖尿病中，缺失第1相胰岛素释放并且第2相释放被延迟并且不足。在II型糖尿病患者中，餐时和餐后发生在健康个体中的急剧大量的胰岛素释放被延迟、延长并且量不足，从而导致高血糖症。可向II型糖尿病患者给药胰岛素以控制血糖水平(Mayfield等人(2004)Am Fam Physican 70:489-500)。这可与其它治疗和治疗方案(包括节食、运动和其它抗糖尿病治疗剂(例如磺脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑啉二酮和α-糖苷酶抑制剂))联合。因此，可以通过注射器、胰岛素笔或胰岛素泵或其它任意可用于递送胰岛素的装置，向II型糖尿病患者皮下或腹膜内给药本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。

c.妊娠糖尿病

将之前从未患有糖尿病但在妊娠期间具有高血糖水平的孕妇诊断为患有妊娠糖尿病。这种类型的糖尿病影响全部孕妇的约1-14％(取决于所研究的群体)(Carr等人,(1998)Clinical Diabetes 16)。虽然潜在的诱因仍然未知，但似乎可能是在妊娠期间产生的激素降低了孕妇对胰岛素的敏感性。胰岛素抵抗机制可能是受体后缺陷，因为已经证明胰岛素敏感细胞的正常胰岛素结合。胰腺释放多出1.5-2.5倍的胰岛素以响应所引起的胰岛素抵抗增加。胰腺功能正常的患者可以满足这些要求。具有临界胰腺功能的患者难以增加胰岛素分泌并因此产生胰岛素水平的不足。因此，当胰岛素分泌延迟或不足时，妊娠糖尿病导致出现外周胰岛素抵抗增加。

可向妊娠糖尿病患者给药胰岛素来控制血糖水平。因此，可以通过注射器、胰岛素笔、胰岛素泵或人工胰腺或其它任意装置，向妊娠糖尿病患者皮下给药本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，以更迅速地控制血糖和胰岛素水平。

2.用于危重患者的胰岛素疗法

在医疗和/或手术中的危重患者中经常出现高血糖症和胰岛素抵抗，并且其与糖尿病和非糖尿病患者及具有外伤、中风、缺氧性脑损伤、急性心肌梗死、心脏术后和其它危重病因的患者的发病率和死亡率增加相关(McCowen等人(2001)Crit Clin.Care17:107-124)。已使用胰岛素治疗患有高血糖症的危重患者以控制血糖水平。这种治疗可以降低这组患者的发病率和死亡率(Van den Berghe等人(2006)N.Eng.J Med.354:449-461)。通常将胰岛素向患者静脉给药，例如由医生用注射器注射或使用胰岛素泵输注。在一些实例中，使用算法和软件计算剂量。因此，可向患有高血糖症的危重患者给药本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂，以控制血糖水平，由此缓解高血糖症并降低发病率和死亡率。

K.联合治疗

本文描述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的任意复合制剂可与其它治疗剂或操作(包括但不仅限于其它的生物制品和小分子化合物)联合给药、在其它治疗剂或操作(包括但不仅限于其它的生物制品和小分子化合物)之前、与其间歇地或在其之后给药。对于适于使用或已使用速效胰岛素治疗并且也可用其它药剂和治疗的任意疾病或病症(包括以上所有举例说明的那些)，所述复合制剂可与其联合使用。根据待治疗的疾病或病症，示例性联合包括但不限于与抗糖尿病药物的联合，所述抗糖尿病药物包括但不限于磺酰脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑啉二酮、α-糖苷酶抑制剂、肽类似物(包括胰高血糖素样肽(GLP)类似物、抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂)。在另一实例中，本文所述的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂可与一种或多种包括速效胰岛素和基础作用胰岛素在内的其它胰岛素联合给药、在一种或多种包括速效胰岛素和基础作用胰岛素在内的其它胰岛素之前、与其间歇地或在其之后给药。

L.制品和药盒

本文提供的速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂可包装为制品，所述制品包含：包装材料，有效控制例如糖尿病或危重病个体的血糖水平的药物组合物，以及标明所述复合制剂被用于控制血糖水平的标签。

本文提供的制品包括包装材料。用于包装药品的包装材料为本领域技术人员熟知的。参见例如第5,323,907、5,052,558和5,033,252号美国专利，它们各自以其整体援引加入。药品包装材料的实例包括但不限于塑料定型包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及任意适合所选的制剂和预期的给药和治疗方式的包装材料。

也可以将速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂以药盒的形式提供。药盒可包含本文描述的复合制剂和用于给药的物品。所述药盒也可包含其它药物组合物。在一个实例中，所述药盒可包含一种或多种本文提供的复合制剂和一种或多种其它胰岛素组合物，例如，包括结晶胰岛素在内的慢效胰岛素或中效胰岛素，或者它们的任意组合。速效胰岛素和乙酰透明质酸降解酶的复合制剂可与给药装置一起提供，所述给药装置例如注射器、胰岛素笔、泵或者插入胰岛素笔、泵或其它递送装置内的容器。所述药盒可任选包含使用说明书(包括剂量、给药方案)和给药方式说明书。药盒也可包含本文描述的复合制剂和用于诊断的物品。例如，该类药盒可包含葡萄糖监测器或传感器。

M.实施例

本文包含以下实施例仅用于说明目的，并且无意限制本发明的范围。

实施例1

胰岛素和胰岛素类似物储备物的制备

A.正规胰岛素

对于正规胰岛素，称量粉末(Organon Insulin API，重组人胰岛素SIHR 143)，并将其与适当量的水混合，直到溶液包含约10-25mg/mL的胰岛素。将1M HCl加入混浊的混合物中至HCl的终浓度为20mM。用搅拌棒轻轻混合溶液，直到胰岛素完全溶解，并加入250mM的Tris,pH 10.7(Trizma,目录号T6066,Sigma)至20mM的最终Tris浓度。使用1M NaOH调节pH，然后加入水，从而如在下面的每个单个实施例中所述配制胰岛素。该胰岛素包含大约13μg/mL的锌。

B.胰岛素类似物

对于胰岛素类似物(门冬胰岛素或赖脯胰岛素)，合并12小瓶(各10mL)市售产品(赖脯胰岛素:Eli Lilly

(赖脯胰岛素)100U/mL，批号A572364；门冬胰岛素:NovoNordisk,

(门冬胰岛素)，批号XS60195；赖谷胰岛素:

胰岛素)，并使用Amicon Ultracel-10K(赖脯胰岛素)或3K(门冬胰岛素)柱浓缩器浓缩，直到终浓度是初始浓度的约5倍。通过以蛋白质溶液体积的1/10加入1M醋酸钠(pH 5.3)和30mM氯化锌(ZnCl₂,EMD,目录号ZX0065-1)，沉淀胰岛素类似物。将溶液在冰上放置30分钟，随后在具有JS-5.3浮桶式转头的Avanti J-E Centrifuge(Beckman Coulter)中在5600rpm离心20分钟。缓慢倒出上清液，并将片状沉淀物再悬浮，并用20mM醋酸钠、2mM氯化锌(pH 5.5)溶液洗涤。如上所述，将再悬浮的溶液离心。将洗涤步骤重复共5次。用20mM醋酸钠(pH 5.5)进行最终的洗涤，以移除所有微量的氯化锌。用包含20mM HCl的水溶解所得的蛋白质糊。完全溶解后，将250mM Tris(pH 10.7)加至20mM的最终Tris浓度。调节所得的溶液的pH，从而如在下面的每个单个实施例中所述配制胰岛素类似物，并将蛋白质浓度调节至约15-20mg/mL。以此方式制备的胰岛素类似物通常具有约90％的收率，具有比原料低100倍的残余防腐剂浓度。

实施例2

rHuPH20的透明质酸酶活性的测定

使用比浊测定法测定rHuPH20(通过编码SEQ ID NO:1的氨基酸36-482的核酸在CHO细胞中的表达和分泌得到)的透明质酸酶活性。在前2种测定法(A和B)中，如下测量rHuPH20的透明质酸酶活性：与透明质酸钠(透明质酸)一起孵育可溶性rHuPH20，然后通过加入酸化的血清白蛋白来沉淀未消化的透明质酸钠。在第三种测定法(C)中，基于当透明质酸(HA)与西吡氯铵(CPC)结合时不溶性沉淀物的形成来测量rHuPH20透明质酸酶活性。在所有包含600 U/mL rHuPH20(5μg/mL)的测定法中，验收标准是酶活性高于375U/mL。

A.微浊度测定

在该测定法中，如下测量rHuPH20的透明质酸酶活性：将可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)一起孵育设定的时间段(10分钟)，然后通过加入酸化的血清白蛋白来沉淀未消化的透明质酸钠。在30分钟显影时段以后，在640nm测量得到的样品的浊度。由酶对透明质酸钠底物的活性引起的浊度降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。使用校正曲线(其用可溶性rHuPH20测定工作参比标准品的稀释液产生)进行该方法，并相对于该校正曲线做出样品活性测量。在酶稀释溶液中制备样品的稀释液。如下制备酶稀释溶液：将33.0±0.05mg水解明胶溶解在25.0mL的50mM PIPES反应缓冲液(140mM NaCl,50mM PIPES,pH 5.5)和25.0mL的无菌注射用水(SWFI；Braun,产品编号R5000-1)中，并将0.2mL 25％人血清白蛋白(US Biologicals)溶液稀释进混合物中，并涡旋30秒。这在使用的2小时内进行并保存于冰上直到使用。将样品稀释至约1-2U/mL。通常，每一步的最大稀释度不超过1:100，并且第一次稀释的起始样品体积不小于20μL。进行该测定法所需的最小样品体积为：正在处理的样品、FPLC组分:80μL；组织培养物上清液：1mL；浓缩物质80μL；纯化的或最后一步的物质：80μL。在低蛋白结合96孔板中一式三份进行稀释，并将30μL的各稀释液转移至Optilux黑色/透明底平板(BD BioSciences)。

在酶稀释溶液中制备浓度为2.5U/mL的已知可溶性rHuPH20的稀释液以生成标准曲线，并一式三份加入Optilux板中。稀释液包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。该板包含含有60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。然后将平板覆盖并在加热块上在37℃温热5分钟。移除覆盖物，并将平板振摇10秒。振摇后，将平板放回加热块，并给MULTIDROP 384 Liquid Handling Device提供温热的0.25mg/mL的透明质酸钠溶液(通过将100mg的透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解于20.0mL的SWFI中制备。通过在2-8℃轻轻旋转和/或振摇2-4小时将其混合或直到完全溶解)。将反应板转移至MULTIDROP 384并通过按压启动键将30μL的透明质酸钠分配至各孔来起始反应。然后将平板从MULTIDROP 384移出并振摇10秒钟，然后重新放上板盖转移至加热块上。将平板在37℃孵育10分钟。

通过给仪器提供血清工作溶液并将体积设置变为240μL(将25mL血清储备溶液[用9体积的500mM乙酸盐缓冲液稀释1体积的马血清(Sigma)，并用盐酸将pH调节至3.1]在75mL的500mM乙酸盐缓冲液中)，使MULTIDROP 384准备停止反应。将平板从加热块移除并放置于MULTIDROP 384上，并将240μL血清工作溶液分配至孔中。移除平板并在平板读数器上振摇10秒。又15分钟后，在640nm测量样品的浊度，并通过拟合标准曲线测定各样品的透明质酸酶活性(以U/mL计)。

通过用透明质酸酶活性(U/ml)除以蛋白质浓度(mg/mL)，计算比活(单位/mg)。

B.rHuPH20酶活性的浊度测定法

用酶稀释液[将66mg明胶水解产物(Sigma#G0262)溶解在50mL磷酸盐缓冲液(25mM磷酸盐,pH 6.3,140mM NaCl)和50mL去离子(DI)水中]稀释样品，以达到0.3-1.5U/mL的预期酶浓度。

将2个标有标准1、2、3、4、5或6的试管中的每一个和要分析的每个样品的双份试管(相应地标记)放入37℃的块式加热器中。向标准品试管中一式两份地加入下表所示体积的酶稀释液。将0.50mL HA底物溶液[1.0mL在去离子水中的5mg/mL透明质酸(ICN#362421)、9mL去离子水、10mL磷酸盐缓冲液]分配在所有标准和样品试管中。如下面表7所示，将一定体积的在酶稀释液中的1.5U/mL USP透明质酸酶标准品(USP#31200)分配在双份标准品试管中。当所有标准品试管已经结束时，将0.50mL的各个样品分配进双份样品试管中的每一个中。在37℃孵育30分钟，然后将4.0mL血清工作溶液{50mL血清储备溶液[1体积马血清(供体群，试验的细胞培养物，试验的杂交瘤培养物，USA起源)，9体积500mM乙酸盐缓冲液，调节至pH 3.1，在室温静置18-24小时，在4℃储存]+150mL 500mM乙酸盐缓冲液}加入标准品试管中，然后将其从块式加热器取出，在室温混合和放置。以此方式处理样品试管，直到处理所有标准和样品试管。

通过合并0.5mL酶稀释液、0.25mL去离子水、0.25mL磷酸盐缓冲液和4.0mL血清工作溶液，制备“空白”溶液。混合溶液，并将等分试样转移至一次性比色皿。该样品用于在640nm调零分光光度计。

在室温孵育30分钟以后，将得自每个标准品试管的等分试样依次转移至一次性比色皿，并测量在640nm的吸光度。对于双份样品试管，重复该操作。

通过绘制相对于观察的吸光度的透明质酸酶浓度(U/mL)，构建线性校正曲线。使用线性回归分析来拟合数据(排除0.0U/mL校准标准的数据)，并测定斜率、截距和相关系数(r²)。使用标准曲线回归方程式和观察的样品吸光度来确定样品浓度。

C.rHuPH20酶活性的浊度测定法

用于测定透明质酸酶活性和酶浓度的浊度法是基于当透明质酸(HA)与西吡氯铵(CPC)结合时形成的不溶性沉淀物。如下测量活性：将透明质酸酶与透明质酸一起孵育设定的时间段(30分钟)，然后通过加入CPC使未消化的透明质酸沉淀。在640nm测量所得的样品的浊度，由对HA底物的酶活性引起的浊度的降低是透明质酸酶效能的量度。使用校正曲线(用rHuPH20测定工作参比标准品的稀释液产生)进行该方法，并相对于校正曲线做出样品活性测量。该方法意图在稀释至约2U/mL的浓度以后分析溶液中的rHuPH20活性。定量范围为0.3-3U/mL，尽管对于常规试验而言，在1-3U/mL的范围得到最优性能。

通过将100mg±10mg明胶水解产物(Sigma#G0262)溶解在75mL反应缓冲溶液(140mM NaCl,50mM PIPES(1,4哌嗪双(2-乙基磺酸)),pH 5.3)游离酸(Mallinckrodt#V249)和74.4mL无菌冲洗用水(SWFI)中，并加入0.6mL的25％人血清白蛋白(HSA)，新鲜制备酶稀释液。如下制备分光光度计空白：将1.0mL酶稀释液加入试管中，并将它放在预热至37℃的加热块中。如下制备稀释的参比标准品：通过将120μL测定工作参比标准品加入至29.880mL酶稀释液中，一式三份地制备rHuPH20测定工作参比标准品的1:25稀释液。一式三份地制备每个样品的适当稀释液，以得到约2U/mL的溶液。

根据表8，将一定体积的酶稀释液一式三份地分配进标准品试管中。将500μL的1.0mg/mL透明质酸钠(Lifecore,#81，平均分子量为20-50kDa)在SWFI中的溶液分配进除了空白以外的所有试管中，并将试管放在37℃加热块中，持续5分钟。将在表7中指定的量的稀释的参比标准品加入适当的标准品试管中，混合，并返回加热块。将500μL每个样品一式三份地转移至适当的试管。开始第一个标准品试管以后30分钟，将4.0mL停止溶液(5.0mg/mL西吡氯铵(Sigma,目录号C-5460)溶解在SWFI中，并穿过0.22微米过滤器)加入所有试管(包括空白)，然后将其混合，并在室温放置。

在640nm固定波长将分光光度计设定“空白”。在室温孵育30分钟以后，将大约1mL标准品或样品转移至一次性比色皿，并在640nm读出吸光度。采用GRAPHPAD

计算机软件(Hearne Scientific Software)，使用在完全衰减后约束至0的指数式衰减函数，分析参比标准品和样品原始数据值。确定最优拟合标准曲线，并用于计算对应的样品浓度。

实施例3

RP-HPLC

在该实施例中，使用反相-HPLC(RP-HPLC)来测定胰岛素和胰岛素类似物的表观溶解度以及rHuPH20的纯度百分比。将表观溶解度测量为，相对于初始制剂/条件的胰岛素回收百分比。

参比标准品

对于正规胰岛素，使用

(正规胰岛素,100U)作为标准品。对于赖脯胰岛素，用1.72mL 0.01N HCl重构1小瓶的USP赖脯胰岛素，得到3.5mg/mL USP赖脯胰岛素(100U/mL)参比标准品。对于门冬胰岛素，用1.00mL 0.01N HCl重构1小瓶EP门冬胰岛素，得到3.89mg/mL EP门冬胰岛素参比标准品。对于rHuPH20，使用3种参比标准品，各自包含用适当量的样品稀释液(20mM Tris、130mM NaCl、0.01％的泊洛沙姆188，pH 7.3)稀释的50μg/mL rHuPH20样品(批号HUB0701EB)产生的2.5μg/mL、5.0μg/mL或7.5μg/mL rHuPH20。

防腐剂标准品

使用3种防腐剂参比标准品，各自包含0.05％的间甲酚/苯酚、0.10％的间甲酚/苯酚或0.15％的间甲酚/苯酚。

样品制备

如果需要，在样品稀释液中稀释样品，使得胰岛素/胰岛素类似物以100U/mL存在，并且rHuPH20以5μg/mL存在。通过在每个时间点从每个小瓶中取100μL，并在加载之前离心，制备样品。在使用之前，将样品在自动采样器中于4℃保存，并认为在制备后稳定持续3天。一式两份地试验所有样品。

对于胰岛素，为每次HPLC运行注射20μL。对于rHuPH20，为每次HPLC运行注射100μL。HPLC柱和方法参数如下面表9所示。HPLC梯度如下面表10所示。

A.胰岛素溶解度

为了测定表观溶解度，将胰岛素/胰岛素类似物主要峰和脱酰氨基峰的峰面积积分和合并到一起，以计算相对于标准品的百分比。将溶解度表示为相对于标准品的百分比，100％为120U/mL。使用

7.0(StatEase)和“历史数据”特征，处理数据。将胰岛素纯度百分比表示为主要胰岛素相对于所有胰岛素种类的百分比。

B.rHuPH20纯度百分比和回收百分比

将rHuPH20纯度百分比表示为rHuPH20相对于所有rHuPH20种类的百分比。将rHuPH20回收百分比表示为相对于标准品的百分比，100％为5μg/mL。目标规范是3-7μg/mL(60-140％)。

实施例4

尺寸排阻色谱法

在该实施例中，通过尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析胰岛素/rHuPH20制剂，以测定样品中存在的胰岛素和rHuPH20的高分子量蛋白质(HMWP)(即共价结合的聚集体)的相对量。对于变性SEC，流动相为在乙腈中的L-精氨酸和冰醋酸。对于非变性SEC(其如在实施例29的描述中所使用)，流动相为磷酸盐缓冲盐水。

A.变性SEC

1.参比标准品

使用

R(正规胰岛素,Lilly,浓的,NDC 0002-8501-01)或USP人胰岛素(USP目录号I1F270)和rHuPH20(批号HUA0703MA或HUB0701EB，它们的比活分别为120,000U/mg和110,000U/mg)作为参比标准品。以与预期的样品浓度(即100U/mL的胰岛素和5μg/mLrHuPH20)类似的浓度，制备包含胰岛素和rHuPH20的参比标准品。在25mM的Tris稀释液(pH7.3)中稀释液体制剂。在掺有TFA的Tris稀释液(2μL TFA/mL Tris)中稀释称量的量的USP人胰岛素。在使用之前，在10℃于HPLC小瓶中保存参比样品。

2.样品制备

如果需要，在Tris稀释液中稀释样品，使得胰岛素以1-100U/mL存在，并且rHuPH20以1-1000μg/mL存在。在使用之前，在10℃于HPLC小瓶中保存样品，持续至多3天。

3.HPLC准备

通过合并650mL 1.0mg/mL L-精氨酸、150mL冰醋酸和200mL乙腈，制备流动相。HPLC柱和方法参数如下面表11所示。rHuPH20峰在约13.8分钟出现，胰岛素峰在约20.2分钟出现。

B.非变性SEC

1.参比标准品

使用

100(赖脯胰岛素,Eli Lilly目录号VL-1510)、

100(门冬胰岛素,Novo Nordisk目录号750111)和rHuPH20(批号T09RD02[比活122,000U/mg]、HUA0703MA[比活120,000U/mg]或HUB0701EB[比活122,000U/mg])作为参比标准品。以与预期的样品浓度(即100U/mL的胰岛素和5μg/mL rHuPH20)类似的浓度，制备包含胰岛素和rHuPH20的参比标准品。在使用之前，在10℃于HPLC小瓶中保存参比样品。

2.样品制备

如果需要，在样品稀释液(20mM Tris、130mM NaCl、0.01％的泊洛沙姆188，pH7.3)中稀释样品，使得胰岛素以1-100U/mL存在，并且rHuPH20以1-20μg/mL存在。在使用之前，在10℃于HPLC小瓶中保存样品，持续至多3天。

3.HPLC准备

通过用HPLC级水稀释10X PBS，制备0.5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。HPLC柱和方法参数如下面表12所示。rHuPH20峰在约13分钟出现，胰岛素峰在约18.6分钟出现。

C.胰岛素纯度百分比

将胰岛素纯度百分比表示为胰岛素主要峰相对于总胰岛素峰的百分比。目标规范是小于2％的高分子量蛋白，即胰岛素聚集体。

实施例5

试验方法-重量克分子渗透浓度(osmolality)、浊度和pH

在该实施例中，描述用于测定胰岛素/胰岛素类似物和rHuPH20制剂的外观、重量克分子渗透浓度、浊度和pH的试验方法。这些试验方法用在以后的实施例中。

A.外观

1.目测分析

通过在1型玻璃小瓶中对胰岛素/rHuPH20溶液的定性目测分析，测定胰岛素/rHuPH20制剂的外观。通过与USP(或等价的)无菌冲洗用水(SWFI)的着色和澄清度进行对比，确定对溶液的着色和澄清度的评价。如果它的澄清度与SWFI的澄清度相同，则确定水溶液为澄清的。如果它具有SWFI的外观，则确定水溶液为无色的。在室温试验小瓶，并在涡旋和/或反转时注意不在溶液中造成不必要的湍流和/或气泡。如果需要，在试验之前用不脱落的或不含棉绒的拭纸和70％乙醇擦拭小瓶。操作如下：开启具有150W或更大灯的定向光源。在通风柜中制备样品。轻轻反转待试验的样品以确保同质性，然后使用无菌技术将>0.5mL转移至1型玻璃小瓶进行试验。以相同的方法制备SWFI样品。轻轻反转制备的试验样品和SWFI小瓶以确保同质性，注意不引入任何气泡。用光源以一定角度透过小瓶的底部照射，将试验样品和SWFI小瓶在白色背景上目测对比颜色。如果它具有与SWFI相同的外观，则认为溶液是无色的。用光源以一定角度透过小瓶的底部照射，将试验样品和SWFI小瓶在黑色背景上目测对比澄清度。如果它的澄清度与SWFI的澄清度相同，则认为溶液是澄清的。记录任何可见颗粒和/或异物的颜色、澄清度和存在以及程度。验收标准为澄清的无色溶液。

2.照明器方法

在该方法中，评价液体的澄清度和着色的程度，以确保(在视觉上)产品质量符合适用的外观规范。在专门设计的具有高强度光的检查室中相对于白色和黑色背景进行检查。如果液体的乳光与参比悬浮液I相比不是更显著的，则它是澄清的。如果水溶液具有水的外观或者没有比指定的参比溶液(参比溶液B9)更强着色，则它是无色的。

参比溶液的制备

通过混合如下面表13所示的稀HCl和EP颜色标准品B(Brown Standard Solution,Ricca Chemical,#2880)，制备颜色参比溶液。将参比溶液B₉、B₈、B₇、B₆保存在用塞子和外密封条(overseal)密封的2mL小瓶中。每天制备参比溶液。将2mL SWFI放入用塞子和外密封条密封的小瓶中，并保存多达1年。

如下制备澄清度参比溶液。如下制备主要乳白色悬浮液：将25mL六亚甲基四胺(2.5g在25mL SWFI中)和25mL硫酸肼(1g在100mL SWFI中)混合，并将溶液静置24小时。将悬浮液在玻璃容器中保存多达2个月。通过将45μL主要乳白色溶液稀释至2955μL SWFI中并混合均匀，制备标准溶液或乳光溶液。该溶液稳定3个月。通过混合如下面表13所示的标准或乳光和SWFI，制备参比悬浮液I和II。将参比悬浮液保存在用塞子和外密封条密封的2mL小瓶中，并每天制备。

如下制备产品样品：首先混合产品溶液，然后在100级通风柜中工作的同时，将2mL转移至小瓶。用塞子和外密封条密封小瓶。准备目测检查室，并检查光源的强度，以确保大于1750勒克司。通过目测检查，将产品样品与参比溶液和悬浮液进行对比。通过在白色背景上的水平观察，与SWFI和参比溶液B₆、B₇、B₈和B₉对比颜色。通过在黑色背景上的垂直观察，与参比悬浮液I和II对比澄清度。如下面表14所示记录着色程度、乳光的澄清度和程度。

B.渗透浓度

通过冰点降低测量，测定渗透浓度(重量克分子渗透浓度)。该试验方法意图用于分析具有100-500mOsm/kg水的渗透浓度的水溶液。冰点降低渗透压测定法包括：将待测溶液的样品吸量进试管中，并将该试管放入渗透计的冷却室中。使样品过冷(冷至低于冰点)，然后通过许多方法(即机械振动、超声振动、热冲击或通过加入固体种子颗粒)中的一种来接种(开始结晶)。由于在冷冻过程中释放的熔化热，样品温度升高至平衡；在此时，仅小部分水冻结，此后更多的水冻结，并且温度开始再次下降，在冷却曲线上产生平坦区域或平台。在平台处的温度是样品的冰点，并且可以如下转化成重量克分子渗透浓度单位(渗透浓度)：观察到1.0Osmole使水的冰点下降1.858℃，其中1.0Osmole＝1.0摩尔渗透压活性颗粒＝Φ(n)(C)，其中：

Φ＝渗透系数；

n＝从溶液中的每种分子的解离产生的颗粒的数目；和

C＝以mol/kg水计的每种分子的浓度。

在每次使用渗透计(MicroOsmette Freeze Point Osmometer,Model#5004,Precision Systems Inc.)之前，用500mOsm/kg和200mOsm/kg的标准品进行校准检查(0-2000mOsm/kg水)。在初始开启以后，允许10-15分钟的加热时间来使温度完全平衡。在每次使用之前，用KimWipe擦拭样品、探针和种子丝。通过将50μL的胰岛素/rHuPH20溶液吸量进清洁的干燥样品试管中，制备用于试验的样品。将试管放在冰箱孔中，并根据标准操作规程测量重量克分子渗透浓度。将该操作重复另外两次，为每个胰岛素/rHuPH20样品得到共3个独立结果。记录每个读数的原始数据，如果所有3个读数都在±5mOsm/kg内，则认为读数是有效的。报告每个样品的平均值。重量克分子渗透浓度基于制剂而变化，并在下面列出了每个单独实施例的验收标准。

C.浊度

通过在350nm测量胰岛素/rHuPH20溶液的吸光度来测定浊度。当光穿过溶液时，强度被溶液的吸收和光散射效应减弱。为了测量由溶液中的蛋白质引起的光散射效应，选择350nm的波长来避免蛋白质的吸收效应。散射光的量显著受分子/颗粒的浓度和大小影响。减去包含除了蛋白质以外的所有组分的空白溶液的OD350，以得到最终的读数。将200μL每个要测试的胰岛素/rHuPH20制剂的样品转移至96-孔UV平底微孔滴定板的3个相邻孔。将200μL每个样品的各自赋形剂混合物(不含蛋白)加入微孔滴定板的3个相邻孔，用作样品空白。使用SWFI(200μL)作为平板空白。在UV-Vis Spectramax384plus(Molecule Devices)平板读数器中读出每个样品的OD350。记录每个读数，取一式三份读数的平均值，并减去各个赋形剂空白的平均吸光度，记录得到的经空白调节的浊度。

D.pH

如在U.S.Pharmacopeia Compendial<791>(pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c791.html)中所述，测量pH。验收标准随制剂而变化，并在下面每个单独实施例中列出。一般而言，需要严格的pH控制(即±0.2)来确保胰岛素溶解度和PH20稳定性。但是，在未防腐的胰岛素中，胰岛素溶解度不受pH影响，因此验收标准的范围较大(即pH 7.0-7.8)。

实施例6

市售的胰岛素和胰岛素类似物制剂中的rHuPH20的稳定性

在该实施例中，通过测量在5℃和25℃储存后的rHuPH20酶活性，测定市售的胰岛素和胰岛素类似物制剂中的rHuPH20稳定性。简言之，在包含10mM Hepes和130mM NaCl的缓冲液(pH 7.0)中制备约1500U/mL的rHuPH20。随后，将0.4mL市售的

(每mL包含100U胰岛素、2.5mg/mL间甲酚和16mL甘油(Eli Lilly))或

(每mL包含100U胰岛素、3.15mg/mL间甲酚、16mg甘油、1.88mg Na₂HPO₄、0.0197mg锌离子(氧化锌)和微量的苯酚(Eli Lilly))加入至3.6mL rHuPH20溶液中以形成胰岛素-rHuPH20或胰岛素-类似物rHuPH20混合物(胰岛素产品的10倍稀释液，最终的rHuPH20浓度为1350U/mL)。将这些溶液在5℃和25℃储存至多1周。如上面的实施例2B中所述，在第0、1、2、3和7天测量rHuPH20酶活性。结果显示在下面的表15中。如表15所示，当在25℃孵育2天或更久时，

-rHuPH20(赖脯胰岛素-rHuPH20)组合丧失了50％的rHuPH20活性。对于在25℃储存的

-rHuPH20，没有观察到显著损失，推测是由于在该特定产品中更低的防腐剂水平和稀释因子。

实施例7

防腐剂对rHuPH20的影响

在该实施例中，评价多种常见胰岛素和胰岛素类似物防腐剂对rHuPH20的酶活性和稳定性的作用。如上面实施例2中所述，测量rHuPH20酶活性。在适用的情况下，如上面实施例4中所述，通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定rHuPH20稳定性。

A.rHuPH20酶活性

在该实施例中，在不同的浓度、温度和时间，评价常见胰岛素和胰岛素类似物防腐剂苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯对rHuPH20的酶活性的作用。将各个防腐剂(以在下面表16中所示的终浓度)加入到胰岛素/rHuPH20制剂中，所述制剂包含3.7mg/mL胰岛素(如在实施例1中详述的，使用Organon Insulin API[重组人胰岛素SIHR 143]粉末制备的储备溶液)和20μg/mL的在20mM的Tris/HCL(pH 7.1)和140mM的NaCl中的rHuPH20，并将样品在指定的温度孵育预定量的时间。

结果显示在下面的表16中，该表显示防腐剂和它的浓度、孵育时间和温度、以及rHuPH20酶活性。结果是温度依赖性的。当总防腐剂水平相对较高(>0.2％)时，在35℃孵育1周后，rHuPH20的酶活性显著下降。相比而言，在室温(25℃)和较低的防腐剂浓度下，rHuPH20维持它的相对活性，持续至少1个月。通常，随着防腐剂水平增加，rHuPH20酶活性降低。另外，在3种防腐剂中，似乎间甲酚对rHuPH20是最有害的，其次是苯酚和对羟基苯甲酸甲酯。

LOD:检测水平；¹对羟基苯甲酸甲酯在0.4％不可溶；²这些数字意外地低，当作“离群值”。

B.rHuPH20的表观熔化温度(Tm)

在该实施例中，通过使用动态光散射测量颗粒的流体动力学半径，来测定在有和没有间甲酚、对羟基苯甲酸丙酯或苯氧乙醇存在下的rHuPH20的熔化温度(Tm)。推测由于rHuPH20的变性和随后的聚集，粒度增加。随着温度增加，蛋白质会展开，这会导致聚集体形成。

简而言之，在25mM的Tris-HCL(pH 7.5)中将rHuPH20(Lot HuB,10mg/mL储备液)稀释至1mg/mL。将指定的防腐剂掺入来自100％储备溶液的PH20样品中。使用Malvern Zeta大小分检器Nano-ZS(作为递增温度的函数)，通过动态光散射测量Z-平均粒度。在每个温度在低容量石英比色皿(Helma,3.00mm)中共进行3次测量。温度从20℃开始，以2℃的增量，达到66℃的最终温度，在每个温度具有5分钟平衡时段。用配有仪器的173°反散射检测器测量光散射强度，并使用1.45的折射率(对于蛋白质样品)和使用1.33的折射率(对于水作为分散剂)，用DTS(分散技术软件)软件计算累积Z-平均颗粒数据。将温度轴上的拐点(在此处存在粒度的显著增加)视作蛋白质发生变性和开始聚集时的表观Tm(熔化温度)。

结果在下面的表17中显示，该表描述5种不同PH20制剂在不同温度的平均粒度，如下面表17所示。表17中的数据是每个点的3个测得量的平均值，具有2℃温度增量、5分钟平衡点。结果表明，rHuPH20的Tm从没有任何防腐剂时的高于40℃下降至在有0.25％的间甲酚存在下的26℃。使用差示扫描量热法(DSC)来测量有和没有间甲酚存在下的rHuPH20的Tm，观察到类似的趋势，但是，在有0.25％的间甲酚存在下，Tm仅下降约2℃。

C.对rHuPH20的结合亲和力

使用滴定荧光光谱法来测量防腐剂对rHuPH20的表观结合亲和力，以便进一步理解防腐剂如何与rHuPH20相互作用。在Legacy BioDesign,LLC(Johnstown,CO)进行该研究。

以粉末形式接收胰岛素类似物赖脯胰岛素(USP参比标准品,目录号1342321)和门冬胰岛素(EU参比标准品,目录号Y0000349)，并用857μL 18MΩ去离子水和23μL 1M HCl重构。将120μL 250mM的Tris(pH 10.65)加入每种标准溶液中，使pH达到7.4，并使体积达到1mL。通过用30mM的Tris pH 7.4稀释，制备2.5mL 1mg/mL的每种标准品溶液和2种胰岛素溶液。所有溶液在稀释时都是澄清且无色的，例外是USP赖脯胰岛素标准品，其在稀释后是浑浊的，但是在制备的1小时内变得澄清。用参比标准品和制备的物质，制备门冬胰岛素和赖脯胰岛素各自的2种样品。使用Aviv Model ATF105荧光分光光度计和Aviv 105软件1.3版本，收集1mg/mL胰岛素溶液的荧光发射波谱。向石英荧光试池装载2.5mL溶液用于各个测量。以4nm的带宽，在275nm进行激发。以1nm的分辨率，在340nm和280nm之间收集发射波谱。将PMT电压设定为850V，同时将参比(QC)PMT电压设定为250V。

数据表明，尽管在防腐剂和rHuPH20之间存在一些相互作用，3种测试的防腐剂(间甲酚、苯酚和苄醇)没有改变rHuPH20的结构。rHuPH20与防腐剂的相互作用的表观解离常数(K_D)是在40-3000μM的范围内，大多数数据通常在50-100μM范围内。数据也表明，尽管rHuPH20对酚类化合物是敏感的，这似乎是非特异性相互作用，并且高度依赖于环境温度。下述事实进一步支持非特异性相互作用的结论：结构上类似的化合物(苯丙氨酸)的添加不会保护rHuPH20免于由间甲酚或苯酚造成的降解(参见下面的E部分)。

D.其它常见防腐剂

为了确定rHuPH20是对所有防腐剂都敏感还是仅对胰岛素产品中常用的那些敏感，测试多种其它市售防腐剂对rHuPH20酶活性和稳定性的作用。另外，加入苯丙氨酸作为潜在稳定剂以评价防腐剂对rHuPH20活性的有害作用是否仅由存在于数种有害防腐剂上的酚环介导。假定苯丙氨酸可能能够与酚防腐剂竞争并提供稳定作用。

在这些研究中，将共100μg/mL rHuPH20加入基础制剂中，所述基础制剂包含25mM的Tris/HCL(pH 7.3)、140mM的NaCl、0.01％的聚山梨酯80和指定水平的所选防腐剂。为每种防腐剂选择的浓度主要是基于文献数据(参见例如，Kibbe,A.H.,(2000)Handbook ofPharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press；Powell等人,(1998)PDAJournal of Pharmaceutical Science and Technology)和已知在现有市售产品中存在的水平。

结果在下面的表18-20中显示。结果表明，氯己定盐和硫柳汞不会影响rHuPH20酶活性。与此相反，在25℃仅24小时以后，苯扎氯铵或4-氯-1-丁醇的加入造成了rHuPH20酶活性的显著下降。苯氧乙醇或间甲酚的加入以温度依赖性的方式造成rHuPH20活性的下降。在4℃，rHuPH20的活性与不包含防腐剂的对照样品大约相同，而在35℃，rHuPH20活性在少至48小时内消除(参见表20)。对羟基苯甲酸甲酯通常在25℃对rHuPH20酶活性几乎没有影响，或者在35℃影响较短时间段(例如24小时)，但是在35℃孵育6天后丧失所有酶活性。另外，与间甲酚或苯酚相比，对羟基苯甲酸甲酯是有效性更低的防腐剂。在有酚防腐剂(间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯)存在下，低浓度(5mM)或高浓度(50mM)的苯丙氨酸的加入没有影响rHuPH20活性的丧失。

由防腐剂的加入和升高的温度造成的酶活性的丧失主要归因于rHuPH20聚集体的形成。如下面表21-22所示，在35℃，通过尺寸排阻色谱法测得的主要峰的损失伴有rHuPH20酶活性损失(参见表21-22)。另外，当在35℃储存时，对于包含间甲酚的样品观察到显著的聚集体峰。常见防腐剂在升高的温度随时间造成rHuPH20活性的损失。鉴别出更相容的防腐剂，例如，硫柳汞和氯己定盐。

LOD:检测限度

E.防腐剂水平和抗微生物有效性

目前，针对设计用于多次给药的药物产品，不同的管理机构具有不同的抗微生物有效性药典标准。表23显示满足USP和EP标准的可注射药物的标准。因此，为了进一步评价防腐剂对rHuPH20的作用，必须确定满足不同标准所需的最小防腐剂浓度。

*从初始测量的接种物的Log₁₀单位减少；没有增加：与以前的测量值相比不超过0.5log₁₀单位增加。

为微生物有效性试验制备数批制剂，所述制剂包含不同水平的防腐剂和目标量的胰岛素和rHuPH20。由合约分析实验室(Quadrants Scientific,Inc.,San Diego,CA)根据EP和USP的指导进行试验。胰岛素/rHuPH20制剂包含：100U/mL的胰岛素(Organon InsulinAPI，重组人胰岛素SIHR 143)、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCL(pH 7.2)、150mM的NaCl和0.02％的泊洛沙姆188。如上面实施例1所述，制备胰岛素。测试包含不同防腐剂的制剂对黑曲霉菌、铜绿假单孢菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白念珠菌的抗微生物有效性。如下进行试验：1)将每类细菌的初始接种物(至少10⁵CFU/mL)加入样品中，和2)测量每类细菌在6小时、1天和7天时的CFU/mL。将原始数据(CFU/mL)转化成从测得的接种物的log 10单位减少。在37℃的温度测试制剂，并将每种生物体分别与每种制剂一起孵育。

结果在表24中显示，该表描述防腐剂的百分比和所述组合通过或未通过EPA、EPB和USP的抗微生物有效性标准。

*结果，基于7天的值。

为了测定满足USP抗微生物有效性标准的适合防腐剂水平，进行苄醇、苯酚和间甲酚的组合的进一步研究。该基础制剂包含：3.75mg/mL的胰岛素(Organon Insulin API，重组人胰岛素SIHR 143，并以与实施例1所详述的相同方式制备储备溶液)、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCL(pH 7.4)、140mM的NaCl和0.02％的泊洛沙姆188。结果在下面表25中显示，该表描述防腐剂的百分比和所述组合通过或未通过USP的抗微生物有效性标准。除了制剂#2以外，所有组合都通过了USP微生物有效性标准。

用苯酚和间甲酚的其它百分比组合，进行了类似的实验。结果在表26中显示。

PA：铜绿假单孢菌；EC：大肠杆菌；SA：金黄色葡萄球菌；N：黑曲霉菌；CA：白念珠菌。

实施例8

防腐剂组合和NaCl以及pH对胰岛素溶解度和rHuPH20酶活性的影响

A.防腐剂组合对rHuPH20酶活性的影响

在该实施例中，测试不同浓度的常见胰岛素和胰岛素类似物防腐剂的组合在30℃的温度持续1个月对rHuPH20酶活性的作用。将每种防腐剂(以下面表27所示的最终百分比)加入到包含100U/mL的胰岛素、5μg/mL(600U/mL)的rHuPH20、20mM的Tris/HCL(pH 7.2)、150mM的NaCl和0.02％的泊洛沙姆188的胰岛素/rHuPH20制剂中，并在T＝0和在30℃孵育1个月后测试样品。如在上面实施例1中所述制备胰岛素，并如在实施例2中所述制备rHuPh20。

结果在下面的表27中显示，该表描述防腐剂和它们的百分比，以及在T＝0和在30℃孵育1个月后的rHuPH20酶活性。结果表明，在有一种酚防腐剂或酚防腐剂组合存在下将胰岛素/rHuPH20在30℃孵育1个月，造成rHuPH20酶活性的下降。

在该实施例中，在不同的浓度、温度和孵育时间，测试苯酚和间甲酚的组合对rHuPH20酶活性的作用。将每种防腐剂(以下面表28中所示的最终百分比)加入到包含100U/mL的胰岛素、5μg/mL(600U/mL)的rHuPH20、20mM的Tris/HCL(pH 7.4)、50mM的NaCl、50mL的甘油、50mM的甲硫氨酸和0.01％的泊洛沙姆188的胰岛素/rHuPH20制剂中。

结果在下面的表28中显示，该表描述防腐剂和它们的百分比，以及在不同的孵育时间和温度的rHuPH20酶活性。如上面观察到的，储存温度对酶活性具有显著作用。不论防腐剂如何，与在25℃孵育的那些样品相比，在30℃或37℃孵育的样品的酶活性显著降低。另外，与苯酚相比，间甲酚对rHuPH20的活性更有害。随着间甲酚的百分比增加，rHuPH20的酶活性下降。

ND，未测定。

B.NaCl和pH对赖脯胰岛素溶解度和rHuPH20酶活性的影响

在该实施例中，采用全因子研究(full factorial stuy)设计来测定在有0.15％的间甲酚(间-甲酚)和0.15％的苯酚存在下NaCl和pH对赖脯胰岛素的溶解度和rHuPH20的酶活性的作用。评价4种不同的pH值和4种NaCl浓度，产生共16种样品。

除了pH和NaCl以外的所有组分保持恒定为120U/mL的赖脯胰岛素、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCl(Trizma,Sigma,目录号T6066)、0.15％的间甲酚、0.15％的苯酚、0.01％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188,Spectrum,目录号P1169)和0.1mM加入的ZnCl₂(EMD,目录号ZX0065-1)。测试的pH值是7.0、7.2、7.4和7.6。测试的NaCl浓度是50、80、110和140mM。防腐剂为苯酚(Riedel-dh Haen,16017,多重概要(multiple compendia))和间甲酚(Fluka,目录号65996)。在2-8℃储存0、0.25、0.5、1、3、5、9和12个月以后，测定每个样品的赖脯胰岛素回收百分比。在5℃储存2周、1、5、9和12个月、在25℃储存1周、2周和1个月、在30℃储存1周和2周以及在35℃储存1周以后，测量每个样品的rHuPH20酶活性。

为了制备16种样品，制备了4种储备溶液，每种储备溶液具有不同的NaCl浓度。如在上面实施例1中所述制备赖脯胰岛素，将最终的胰岛素pH设定为7.6。加入所有其它共有组分至它们的终浓度。然后用1N或0.1N NaOH将每种储备溶液的pH从7.6顺序地向下滴定至7.0。将pH的精确度控制在±0.02。每次达到指定的pH时，取出1mL溶液，并装入2mL 1型玻璃小瓶中。制备所有样品后，将它们在2-8℃保存，直到进行试验。如在上面实施例3中所述，经过下述修改，进行反相-HPLC(RP-HPLC)。流动相开始于75％的0.1％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液(A)和25％的0.1％的TFA在乙腈中的溶液(B)，历时16分钟以线性梯度达到68％A+32％B，保持4分钟，随后线性增加至100％B持续5分钟。

下面的表29描述在2-8℃储存12个月后的溶解度，将其表示为初始浓度(120U/mL)的残余百分比(％)。下面的表30-31描述在不同的温度在不同的时间点后的rHuPH20酶活性。下面的表32描述在不同的温度在不同的时间点后的rHuPH20回收百分比。下面总结赖脯胰岛素溶解度和rHuPH20活性的结果。

赖脯胰岛素溶解度

如下面的表29所示，赖脯胰岛素在低盐浓度和高pH是稳定的。例如，在pH 7.6，赖脯胰岛素在50和80mM的NaCl中稳定持续至少12个月，而它在140mM的NaCl中稳定持续仅2周。相比而言，在pH 7.0，赖脯胰岛素在50mM的NaCl中稳定持续仅5个月。在80、110或140mM的NaCl中仅1周以后，溶解度下降至低于65％。

rHuPH20酶活性

如下面的表29-30所示，rHuPH20在高盐浓度和低pH是稳定的。rHuPH20在5℃稳定持续12个月，尽管在50mM的NaCl中具有比在140mM的NaCl中更低的rHuPH20活性。在25℃，在pH 7.6仅1周以后和在更低pH 2周以后，在低盐浓度下的rHuPH20酶活性大幅降低。在30℃，rHuPH20仅在140mM的NaCl的浓度和7.0的pH保留有用的酶活性。在35℃，1周以后，未保留有意义的rHuPH20酶活性。

W＝周，M＝月，*低于检测限度。

W＝周,M＝月

W＝周，M＝月

实施例9

在不同防腐剂组合下NaCl和pH对胰岛素稳定性和rHuPH20酶活性的作用

在该实施例中，针对不同的储存条件，测定NaCl和pH对胰岛素(正规胰岛素)和/或胰岛素类似物(赖脯胰岛素或门冬胰岛素)稳定性和rHuPH20酶活性的作用，所述储存条件包括在2-8℃的短期和长期储存(7天、5个月或9个月)和在升高的温度(包括35℃、30℃和25℃)的短期储存(1个月或更少)。

基础制剂在下面的A-C部分中描述。对于每个单独研究，在保持组合物的其它组分相同的同时，改变pH和NaCl浓度。为了在每个预定防腐剂组合制备每种胰岛素/胰岛素类似物的样品，制备每种胰岛素和/或胰岛素类似物的4种储备溶液。如在上面实施例1中所述制备胰岛素和胰岛素类似物储备液，将最终的胰岛素pH设定为7.6。每种储备溶液包含适当水平的防腐剂和NaCl浓度(50、80、110或140mM)和加至它们的终浓度的所有其它共有组分。然后用1N或0.1N NaOH将每种储备溶液的pH从7.6顺序地向下滴定至最终目标pH。将pH的精确度控制在±0.02。每次达到指定的pH时，取出1mL溶液，通过0.2微米PES滤器过滤，并装入2mL 1型玻璃小瓶中。制备所有样品后，将它们在2-8℃保存，直到进行试验。

A.在2-8℃持续7天的NaCl和pH对胰岛素/胰岛素类似物溶解度的影响的全因子研究

在该实施例中，采用全因子研究设计以测定在有不同防腐剂组合存在下NaCl和pH对正规胰岛素和类似物赖脯胰岛素或门冬胰岛素的溶解度的影响。其它制剂组分(除了pH、NaCl和防腐剂以外)保持恒定为：120U/mL的胰岛素/胰岛素类似物,5μg/mL的rHuPH20(600U/mL),20mM的Tris/HCl(Trizma,Sigma,目录号T6066),0.02％的

F68(泊洛沙姆188,Spectrum,目录号P1169),和0.1mM的ZnCl₂(EMD,目录号ZX0065-1)。使用3种不同防腐剂水平的组合：1)0.15％的间甲酚(Fluka,目录号65996)和0.2％的苯酚(Riedel-dhHaen,16017,多重概要)；2)0.15％的间甲酚和0.15％的苯酚；和3)0.15％的间甲酚和0.2％的对羟基苯甲酸甲酯(Fluka,目录号85265)。对于每种防腐剂组合，产生6种pH水平和4种NaCl浓度水平的完全组合(共24种样品)。试验的pH值是6.6、6.8、7.0、7.2、7.4和7.6。试验的NaCl浓度是50、80、110和140mM。

如在上面实施例3中所述，进行经过下述改进的反相-HPLC(RP-HPLC)。流动相开始于75％的0.1％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液(A)和25％的0.1％的TFA在乙腈中的溶液(B)，历时16分钟以线性梯度达到68％A+32％B，保持4分钟，随后线性增加至100％B持续5分钟。结果在下面的表33-35中显示，所述表描述溶解度，将其表示为在2-8℃储存7天以后初始浓度(120U/mL)的残余百分比。表33描述赖脯胰岛素的结果。表34描述正规胰岛素的结果。表35描述门冬胰岛素的结果。

所有3种胰岛素/胰岛素类似物分子对pH和NaCl浓度的响应类似。在低pH和高NaCl浓度，胰岛素/胰岛素类似物形成晶体和沉淀物，如残余胰岛素/胰岛素类似物的百分比的降低所表明。通过目测检查验证这些结果。对于在50mM的NaCl的pH≥7.2、在80mM的NaCl的pH≥7.4和在110mM的NaCl的pH≥7.6，所有3种胰岛素/胰岛素类似物都可溶于所有防腐剂组合中。类似地，对于在140mM的NaCl的pH≤6.8和在80和110mM的NaCl的pH 6.6，所有3种胰岛素/胰岛素类似物不是充分可溶性的(观察的浓度<90U/mL或75％)。溶解度的准确趋势在3种胰岛素/胰岛素类似物之间变化。在试验的条件下，门冬胰岛素是最可溶性的，其次是赖脯胰岛素和正规胰岛素，后者是最低可溶性的。在防腐剂相容性方面也存在差异，其中门冬胰岛素和正规胰岛素最可溶于0.15％的苯酚和0.15％的间甲酚，并且赖脯胰岛素最可溶于0.15％的间甲酚和0.2％的对羟基苯甲酸甲酯。当盐浓度较低时，对羟基苯甲酸甲酯似乎是更好的防腐剂，但是，在较高盐浓度，没有观察到包含苯酚或对羟基苯甲酸甲酯的样品之间的差异。

在较高的(>110mM)NaCl浓度，即使在高pH，正规胰岛素没有完全溶解。表34确证胰岛素的低溶解度，在2-8℃仅7天以后，超过50％的试验条件具有低于90％的初始值的胰岛素浓度。降低苯酚浓度和/或用对羟基苯甲酸甲酯替代苯酚会略微增加溶解度。在这些实验下，伴随NaCl浓度的30mM增加的溶解度损失与0.2pH单位减少相当。这些数据证实，在5℃储存期间，高NaCl浓度会影响胰岛素溶解度，因此正规胰岛素制剂可能需要与胰岛素类似物相比降低的NaCl浓度和/或增加的pH。

B.使用降低的间甲酚水平的随访研究

在使用降低的间甲酚水平的简化随访研究中，进一步评价胰岛素溶解度。使用防腐剂水平的4种组合：1)0.1％的间甲酚和0.15％的苯酚；2)0.1％的间甲酚和0.2％的苯酚；3)0.1％的间甲酚和0.15％的对羟基苯甲酸甲酯；和4)0.1％的间甲酚和0.2％的对羟基苯甲酸甲酯。评价2种pH水平(7.3和7.1)和2种NaCl浓度(120mM和100mM)。其余的制剂组分保持恒定为：120U/mL的正规胰岛素、5μg/mL(600U/mL)的rHuPH20、20mM的Tris/HCl(Trizma,Sigma,目录号T6066)、0.02％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188,Spectrum,目录号P1169)和0.1mM的ZnCl₂(EMD,目录号ZX0065-1)。如上所述制备和测试制剂。

结果在下面的表36中显示。在有较低量的间甲酚存在下，和另外当用对羟基苯甲酸甲酯替代苯酚时，正规胰岛素的总溶解度略微增加。

C.pH和NaCl对rHuPH20和胰岛素稳定性的长期作用

在该实施例中，采用全因子研究设计来测定pH和NaCl对正规胰岛素和rHuPH20溶解度的影响，以鉴别使在2-8℃的胰岛素溶解度最大化和使在高防腐剂水平于室温或更高的温度的rHuPH20稳定性最大化的条件。将防腐剂水平设定为满足EP-A标准。评价4种NaCl浓度水平和4种pH水平，从而产生共16种样品。评价所述样品在短期加速条件(升高的温度)和2-8℃长期储存下的稳定性。

将正规胰岛素(100U/mL，如在上面实施例1中所述制备，最终pH为7.0)和5μg/mL的rHuPH20配制在包含20mM的Tris/HCl、0.1mM的ZnCl₂、0.01％的泊洛沙姆188、0.15％的间甲酚和0.2％的苯酚的共同缓冲液中。如上面在实施例3中所述，通过RP-HPLC测定溶解度。将溶解度表示为与标准品相比的相对百分比，100％为100U/mL。如上面在实施例2中所述，评价rHuPH20酶活性。使用RP-HPLC监测rHuPH20的总含量和纯度(参见上面的实施例3)。用Design Expert 7.0(StatEase)处理数据。用JMP 8.0软件进行ANOVA和相关分析。

结果在下面的表37-42中显示。表37-38描述rHuPH20酶活性，表39描述rHuPH20回收百分比。在短期加速条件下，pH、NaCl和储存温度影响rHuPH20酶活性，如下面的表37所示。在35℃储存1周后，没有残余有意义的rHuPH20活性。在30℃储存后的酶活性比35℃提高，但是唯一保留>375U/mL的制剂具有高NaCl浓度(140mM)和低pH(7.0)。一般而言，pH越高和盐浓度越低，酶活性越低。在25℃的储存温度，对rHuPH20酶活性的作用极大地减少，尽管保留针对30℃观察的趋势，特别是对于具有低盐和高pH的制剂。大多数制剂维持酶活性高于设定的在4周时间点时375U/mL的标准。在5℃，rHuPH20酶活性基本上没有损失，甚至在储存1个月以后。该趋势在2-8℃储存9个月期间持续，如在下面的表38中所见。总之，当在25℃或更低温度储存时，特别当保持NaCl浓度高于80mM时，rHuPH20维持酶活性。在高于25℃的温度，稳定性快速减少。使用RP-HPLC来监测rHuPH20的总含量和它的纯度。如下面表39所示，酶活性损失与rHuPH20含量损失相关(统计分析，p<0.001)。rHuPH20纯度分析揭示rHuPH20主要峰面积的相对峰面积纯度值没有显著趋势或差异(数据未显示)，表明纯度是一致的，因此活性的损失是由于总含量的损失。含量损失可能是由于在高防腐剂浓度和温度的蛋白解折叠，导致rHuPH20的聚集和沉淀。

表40-41描述在2-8℃长期储存后的胰岛素主要峰百分比和胰岛素回收百分比。在表38中，胰岛素回收百分比是基于胰岛素主要峰和脱酰氨基峰的总和。如表40所示，胰岛素主要峰百分比保持较高(约97％)，而无显著变化，表明该损失不是由于胰岛素的化学或物理降解，诸如脱酰胺化或聚集。小瓶的目测检查表明微小有光泽的粗粒或透明的结晶或结晶样颗粒的混合物，偶尔见到混浊的溶液。表41中的数据总结在每个时间点时在制剂溶液中剩余的胰岛素含量。相对于初始条件的胰岛素回收是溶解度的指征。胰岛素沉淀/结晶随测试的pH和NaCl浓度的范围变化。通常，当pH较低并且盐浓度较高(有利于rHuPH20活性的条件)时，胰岛素非常快速地形成晶体，并在数个月内达到平衡条件。在低盐浓度和高pH，结晶较慢，并且大多数胰岛素分子在9个月内保留在溶液中。胰岛素回收数据的统计分析(参见下面的表42)表明，pH、NaCl、时间、pH*NaCl和NaCl*时间都显著影响胰岛素溶解度。这些结果表明，胰岛素在延长时间段内的溶解度依赖于高pH(高于7.4)和低NaCl(小于80mM)，这与维持rHuPH20酶活性的条件正相反。

---低于检测水平

*回收百分比是基于与已知参比标准品相比，总测量峰面积。

*显著的

实施例10

胰岛素类似物制剂研发：与rHuPH20一起配制的胰岛素的稳定剂筛选

防腐剂保护免于可能由多次给药引起的胰岛素的潜在微生物污染。代表性防腐剂是间甲酚、苯酚和对羟基苯甲酸酯。这些防腐剂充当抗微生物剂，但是也起稳定化胰岛素的高级结构的作用。已经证实，酚防腐剂降低rHuPH20的稳定性(参见实施例7)。在该实施例中，针对它们在维持胰岛素/胰岛素类似物稳定性的同时在有酚防腐剂存在下防止rHuPH20降解的能力，筛选多种稳定剂。筛选的稳定剂包括常用的药物赋形剂，包括氨基酸和它们的衍生物、盐和缓冲剂物质、多元醇和其它化合物。通过rHuPH20酶活性和胰岛素溶解度来测定稳定性。具体的稳定作用包括防止吸附损失和/或rHuPH20的氧化和通过rHuPH20酶活性测得的总体稳定作用。

A.不同表面活性剂对rHuPH20酶活性的作用

针对它们保存rHuPH20制剂的能力，筛选数种常见的表面活性剂，即聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)和泊洛沙姆188(

F68)。所有制剂包含100μg/mL的rHuPH20(12,000U)和150mM的NaCl(pH 6.5)。所述制剂的表面活性剂和表面活性剂浓度和缓冲剂(组氨酸或磷酸盐)存在差异。将所述制剂在35℃搅拌10天，在第3和10天分析样品的rHuPH20活性。如上面在实施例2中所述测定rHuPH20酶活性。通过RP-HPLC和通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量rHuPH20的氧化峰(参见上面的实施例3和4)，测定rHuPH20稳定性。

制剂和rHuPH20酶活性的结果在下面的表43中显示。通过RP-HPLC测得的rHuPH20氧化的ANOVA分析表明，就表面活性剂类型、表面活性剂浓度、缓冲剂或搅拌时间而言，酶活性没有显著差异(F＝0.6832,p＝0.6397)。另外，SEC结果没有表明主要峰的大小的可检测的差异(数据未显示)。

rHuPH20氧化的结果在下面的表44中显示。结果表明，氧化峰面积随着表面活性剂水平和搅拌时间的增加而增加。已知聚山梨酯20包含可测量的量的过氧化物活性(参见例如，Donbrow等人,(1978)J.Pharm Sci.67(12):1676-1681，或Kibbe,A.H.编(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients.第3版,American PharmaceuticalAssociation&Pharmaceutical Press:Washington,DC&London,UK)。在该研究中，使用的聚山梨酯20是导致rHuPH20的高氧化的旧批；相比而言，泊洛沙姆188仅造成微量氧化。多变量方差分析表明搅拌时间以及表面活性剂类型和浓度影响rHuPH20的氧化水平(参见下面的表45)。并且，相互作用项是显著的，包括表面活性剂相对于浓度、表面活性剂相对于时间以及浓度相对于时间。

基于这些结果，表面活性剂加入到rHuPH20制剂中显然可以有效地减少rHuPH20的损失，推测是由于防止吸附损失和在空气-水界面处的可能变性。但是，加入表面活性剂的一个潜在缺点是，它可能增加rHuPH20的氧化。

*显著的

B.甲硫氨酸

1.甲硫氨酸防止rHuPH20氧化的作用

rHuPH20具有2个潜在氧化位点：Met458和Met35。“ox-1”峰对应于Met458，并且当通过RP-HPLC测定时是主要氧化峰。“ox-2”峰包含2个甲硫氨酸氧化。通过添加游离甲硫氨酸作为清除剂以与潜在氧化性化合物反应，可以防止甲硫氨酸氧化。

a.rHuPH20制剂

在该研究中，评价在有聚山梨酯20、聚山梨酯80和/或泊洛沙姆188存在下游离甲硫氨酸的添加对rHuPH20氧化的影响。每种制剂包含5μg/mL的rHuPH20、0.02％的指定表面活性剂、50mM磷酸盐(pH 6.5)、150mM的NaCl和甲硫氨酸(0-50mM)。将样品在30℃孵育72小时，并如在上面实施例3中所示通过RP-HPLC检查。结果在下面的表46中显示。统计分析在下面的表47中显示。结果表明，2mM浓度的甲硫氨酸防止rHuPH20的氧化。

*显著的

b.rHuPH20/胰岛素制剂

测试甲硫氨酸防止rHuPH20/胰岛素制剂中的rHuPH20氧化的能力。所述制剂包含100U/mL的胰岛素(Organon Insulin API，重组人胰岛素SIHR 143，如在实施例1中所述制备储备溶液)、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCL(pH 7.4)、80mM的NaCl、0.03％的泊洛沙姆188、0.1％的苯酚和0.1％的间甲酚，有或没有40mM的甲硫氨酸存在。将所述制剂在30℃孵育5周以评价rHuPH20的氧化峰。结果表明，与不含甲硫氨酸的制剂相比，在包含甲硫氨酸的制剂中，通过RP-HPLC测得显著更小的ox-1峰。

2.作为通用稳定剂的甲硫氨酸

进一步评价甲硫氨酸在较高的温度和防腐剂含量防止rHuPH20酶活性损失的能力。进行实验设计(DOE)响应面法研究(RSM)，以评价在不同NaCl浓度和pH水平时甲硫氨酸对rHuPH20酶活性的作用。基础制剂包含100U/mL的胰岛素(Organon Insulin API，重组人胰岛素SIHR 143，如在实施例1中所述制备储备溶液)、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCl、0.1％的间甲酚、0.1％的苯酚和0.01％的泊洛沙姆188。甲硫氨酸浓度范围在40-80mM变化，NaCl浓度范围在70-110mM变化，并且pH范围是7.2-7.6。将制剂在30℃孵育4周或在35℃孵育5天，并如上面实施例2中所述测定rHuPH20酶活性。

数据在下面的表48中显示。数据的统计分析在下面的表49-50中显示。数据表明，在30℃和35℃，NaCl的浓度对rHuPH20的稳定性具有显著影响。在35℃，pH具有显著影响。40-80mM的甲硫氨酸没有表现出对rHuPH20的稳定作用。跟踪研究表明，在有或没有甲硫氨酸存在下，结果是相同的。在30℃储存1个月后，对于1mM和20mM的甲硫氨酸，具有650U/mL的开始rHuPH20酶活性的制剂分别下降至525和522U/mL。因此，甲硫氨酸起抗氧化剂的作用，但是没有提高rHuPH20对防腐剂和热应力的总稳定性。

*显著的

*显著的

C.rHuPH20/胰岛素制剂的潜在稳定剂的筛选

筛选不同化合物在rHuPH20/胰岛素制剂中起蛋白质稳定剂作用的能力。赋形剂包括氨基酸和它们的衍生物、胺、多元醇、盐和缓冲剂和其它化合物(参见下面的表51)。筛选每种化合物(通常以2种浓度)对rHuPH20酶活性和胰岛素溶解度的作用。基础制剂通常包含100U/mL的胰岛素/胰岛素类似物、5μg/mL的rHuPH20、20mM的Tris/HCl、0.15％的间甲酚和0.2％的苯酚(pH 7.3±0.1)。使用包含100-140mM的NaCl的制剂作为参比制剂，并用潜在稳定剂替代制剂中的所有或部分NaCl。如上面在实施例2中所述，用在30℃孵育约1周的样品测量rHuPH20酶活性。通过RP-HPLC(参见上面实施例3)，用在5℃储存的样品评价胰岛素溶解度。

结果在下面的表51中显示。该评价是相对于NaCl的半定量。大多数测试化合物对胰岛素溶解度没有作用，其余测试化合物造成胰岛素溶解度的下降。之前的数据(参见实施例8-9)表明，pH和盐(可以潜在地影响溶液中的蛋白质的电荷的2种条件)影响胰岛素溶解度。在当前的筛选中，包含二价阳离子(Mg²⁺(氯化镁)和SO₄ ^2-(硫酸钠)和Lys-Lys)的分子或化合物造成胰岛素的严重沉淀。电荷排斥机制似乎对于保持胰岛素分子彼此相互作用而言可能是重要的。鉴别Lys-Lys、氯化镁和透明质酸寡聚体(HA,4-16聚体)为胜过NaCl的稳定化rHuPH20的分子。由于Lys-Lys和氯化镁都降低胰岛素溶解度的事实，不认为这些分子在高浓度时是可行的稳定剂。降低Lys-Lys的浓度将会减少它对胰岛素溶解度的影响。

D.HA寡聚体对rHuPH20/胰岛素制剂的作用

进一步检查HA寡聚体的稳定化rHuPH20/胰岛素制剂的能力。HA寡聚体是rHuPH20酶与透明质酸的反应的底物/产物，所以可能结合酶活性部位，由此产生稳定作用。进行实验设计(DOE)研究以研究pH、NaCl浓度和HA寡聚体浓度对总rHuPH20/胰岛素稳定性的影响。

基础制剂包含3.75mg/mL的胰岛素(Organon Insulin API，重组人胰岛素SIHR143，如在实施例1中所述制备储备溶液)、5μg/mL的rHuPH20、15mM的Tris/HCl、0.01％的ZnCl₂、0.01％的泊洛沙姆188、0.15％的苯酚和0.15％的间甲酚。评价共17种样品，包括3种不同的pH水平(7.1、7.3和7.5)、3种NaCl浓度(50、75和100mM)和3种HA寡聚体浓度(1、5.5和10mg/mL)。用在30℃孵育1周的样品或在2-8℃储存9个月的样品，测量rHuPH20酶活性。用在5℃储存9个月的样品，通过RP-HPLC测量rHuPH20氧化。用在2-8℃储存9个月的样品，通过RP-HPLC测量胰岛素含量。

制剂和结果如下面表52所示。将胰岛素含量表示为相对于USP参比标准品的回收百分比(％)。rHuPH20氧化峰面积百分比(％)是ox-1(主要)和ox-2(次要)峰的总和。统计分析在下面的表53中显示。如表53所示，当在30℃孵育1周后测量时，HA和NaCl浓度都对rHuPH20酶活性具有显著影响。随着NaCl和HA的浓度增加，rHuPH20酶活性也增加。当赋形剂浓度较高时，这是特别正确的，从而表明2种因素之间的显著相互作用(参见表53,P＝0.0150)。

*显著的

要指出，在之前几乎所有在没有HA存在下评价胰岛素/rHuPH20制剂的研究中，增加pH对rHuPH20酶活性具有显著的并且负面的作用，特别是在pH为6.0-8.0时。相比而言，在制剂中包含HA的本研究中，pH似乎对rHuPH20酶活性几乎没有作用或根本没有作用。因此，HA在胰岛素/rHuPH20制剂中的存在似乎减少或抵消较高pH对rHuPH20酶活性可具有的负面作用。

为了进一步评价HA作为稳定剂的有用性，用在2-8℃储存9个月的样品，通过RP-HPLC评价胰岛素含量。胰岛素含量数据和统计分析结果在下面的表54和55中显示。结果清楚地证实，pH和NaCl浓度对胰岛素溶解度的重要性(对于两种因素，p<0.0001)。随着pH增加，胰岛素溶解度增加。随着NaCl浓度增加，胰岛素溶解度降低。HA对胰岛素溶解度/含量的作用不是显著的(p＝0.2755)。因此，HA寡聚体可以是rHuPH20/胰岛素制剂或rHuPH20/胰岛素类似物制剂的赋形剂/稳定剂。

与不包含添加的HA的制剂相比，包含HA寡聚体的制剂的长期储存表现出rHuPH20氧化水平的显著增加。氧化水平似乎与HA浓度十分相关，但是与pH或NaCl浓度无关(参见下面的表55和56)。HA包含葡糖醛酸，后者可能是潜在氧供体，所以如果HA是最终的rHuPH20-胰岛素制剂中的赋形剂，可能需要抗氧化剂或氧清除剂。在该研究中，一些制剂被严重地氧化，然而酶活性保持相当完整(参见表55)，这确证氧化的rHuPH20仍然维持显著的酶活性。多变量统计分析表明长期低温储存的这些样品的rHuPH20酶活性显著受HA影响(p＝0.004，降低的酶活性)，但是不受pH或NaCl影响(p分别为0.1715和0.4766)(参见下面的表56)。

*显著的

*显著的

*显著的

实施例11

在对羟基苯甲酸甲酯存在下盐浓度、pH和缓冲液浓度对rHuPH20的作用

在该实施例中，使用Box-Behnken实验设计来测定对于rHuPH20在升高的温度，在酚防腐剂对羟基苯甲酸甲酯存在下的稳定性而言最优的pH、盐浓度(NaCl)和缓冲液浓度(Hepes)。在该实验设计(DOE)响应面法(RSM)实验中，检查3种因素(即不同浓度的缓冲剂和盐和pH)在加速条件下对rHuPH20活性的作用，其中使样品遭受应力(包括升高的温度和搅拌)。测量的响应包括酶活性和纯度/含量(通过反相-HPLC测得)。

该研究是基于DOE软件包

7.1.(StatEase,Minneapolis,MN)。在实验中使用的Hepes浓度、NaCl浓度和pH的范围和中点在下面的表57中列出。为了进行该研究，基于软件产生的随机序列制备共13种不同的制剂(具有5个重复的中心点)。每个样品包含100μg/mL的rHuPH20(得自10mg/mL的在组氨酸/HCl中的溶液，pH 6.5，130mM的NaCl)、0.20％的对羟基苯甲酸甲酯(Fluka,目录号85265)和0.025％的对羟基苯甲酸丙酯(American Custom Chemicals,San Diego,目录号CHEM-19713)，所述样品具有如下面表58中指出的不同浓度的Hepes(Calbiochem,目录号391338)和NaCl(EMD,SX0418-1)和pH。使用1.0N NaOH或HCl，调节pH。将溶液等分入2mL 1型玻璃小瓶(Wheaton,目录号223683)，所述玻璃小瓶具有橡胶塞子(Wheaton,目录号224100-072)，并用氧化铝帽密封，每种制剂2小瓶。将样品放入设定为35℃温度的保温箱中。对一组小瓶使用Titer Plate振荡器(LabLine)在600rpm搅拌3天(35+ag)。将另一组小瓶在没有搅拌下在35℃保持5天。在孵育时段后，对样品进行测试。

*：与参比样品相比，尺寸排阻色谱法(SEC)主要峰百分比。

如在上面实施例2b中所述，测量酶活性。通过测量与参比样品相比的主要峰的百分比，使用尺寸排阻色谱法(SEC)来评价纯度(参见上面实施例4)。使用下述条件进行SEC：1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Toso BioScience G2000SWXL柱，和设定为1mL/min的流速。如上所述收集数据，并按照DOE软件提供的样品序列将平均值报告和输入设计表中。数据在上面的表58中显示。

对于数据分析，如下分析原始数据。简而言之，将数据拟合进二次方程式模型中作为起始点。基于二次方程式模型进行ANOVA，但是通常需要降低参数，以便使得该模型更紧密地满足所有下述标准：模型显著水平P<0.05，失拟的p值(P>0.1)，足够的精度水平>4，和在经调节的R-平方的0.2内的预测R-平方。最后，检查残差分析和诊断图，以确保满足ANOVA假设。在一些情况下，需要转换数据以便满足那些标准；在那些情况下，通过适合的数学方程式转换原始数据，然后如前所述进行统计分析。为每个响应使用的模型的ANOVA检验模型在下面的表59中显示，该表指明响应、模型方程式、是否使用转化和转化的类型、模型P值和失拟P值.

*A-NaCl；B-Hepes缓冲剂；C-pH

A.在加速温度和搅拌下，pH、NaCl和缓冲液浓度对rHuPH20的作用

ANOVA模型表明，在过度搅拌下于35℃，缓冲液浓度对rHuPH20的酶活性和含量/纯度没有作用(参见上面的表59，响应1和2，其中所述模型方程式不包含缓冲剂)。预测rHuPH20在pH 6.5-7.3、在145-180mM的NaCl浓度下是最稳定的。在这些范围之外，模型预测的rHuPH20活性会下降，具体地，当pH是8.0时，和当盐浓度是为最低浓度(120mM)时。在这些加速条件下，测量的最高rHuPH20活性是约8100U/mL(在上面的表56中的STD 9)，这是基于100μg/mL酶预测的rHuPH20活性(约12,000U/mL)的约65％。如通过SEC所测定的，关于rHuPH20的纯度/含量观察到类似的结果，最稳定的制剂的主要峰含量的损失是预期值的约20％。

与对于rHuPH20含量/纯度而言最优的盐浓度和pH范围相比，对于rHuPH20酶活性而言最优的盐浓度和pH范围稍微更窄。因此，rHuPH20的酶活性对应力条件更敏感，因此表明rHuPH20的酶活性是表示稳定性的更好方法。

B.在没有搅拌时在加速温度，pH、NaCl和缓冲液浓度对rHuPH20的作用

数据表明，在更少的应力条件(即没有搅拌)下，观察到更小的酶活性降低和更少的主要峰损失。例如，对于更好的样品，观察到仅20％的活性损失(与在搅拌下孵育的样品的35％相比)，并观察到小于5％的主要峰损失(与在搅拌下孵育的样品的20％相比)。另外，ANOVA模型表明，盐浓度对酶活性没有显著影响。rHuPH20在小于6.5的pH保留酶活性，只要盐浓度是至少130mM。另外，在小于7的pH观察到最优酶活性。

实施例12

包含防腐剂的赖脯胰岛素/rHuPH20或门冬胰岛素/RHuPH20的稳定性研究6个月中间数据表

在该实施例中，在3种储存条件(5℃、25℃和30℃)下，评价不同的赖脯胰岛素/rHuPH20制剂随时间的稳定性。还在2种物理加速应力条件(多个冷冻/融化循环，并在25℃搅拌)下评价一种制剂。所述制剂的pH和防腐剂水平不同。通过测量一般外观和特征、rHuPH20酶活性和rHuPH20和胰岛素类似物纯度，评价稳定性。

赖脯胰岛素/rHuPH20制剂在下面的表60中显示。

将1mL每种制剂储存在USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，所述小瓶具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条。将每种制剂个别地在5±3℃、25±2℃和30±3℃孵育，并在0、0.5、1、2、3和6个月记录稳定性测得量。将制剂#2在25℃搅拌(在650rpm振摇)持续24小时。通过在-30℃冰柜和室温工作台之间交替储存条件，对制剂#2进行5个冷冻/融化循环。对于每个循环，将样品在每种条件下放置至少2小时(即在-30℃冰柜中2小时，取出并放在工作台上于室温保持2小时，视作1个循环)。

通过测量pH、外观、包括重量克分子渗透浓度、在350nm的浊度和定性观察、rHuPH20酶活性、rHuPH20的纯度百分比和回收百分比(通过RP-HPLC)、赖脯胰岛素的纯度百分比和回收百分比(通过RP-HPLC)和赖脯胰岛素的纯度百分比(通过非变性和变性SEC)(参见实施例2-5)，评价稳定性。对于重量克分子渗透浓度，稳定性验收标准为275±30mOsm/kg。对于外观，稳定性验收标准为：它是澄清的无色溶液。对于rHuPH20活性，稳定性验收标准为：该制剂表现出>375U/mL(基于>75U/μg)。对于通过RP-HPLC测得的rHuPH20回收百分比，可接受的目标规范为通过RP-HPLC测得3-7μg/mL(60-140％)。对于通过RP-HPLC测得的胰岛素纯度，可接受的目标规范为通过RP-HPLC测得≥90％纯度。对于通过RP-HPLC测得的胰岛素回收，可接受的目标规范为通过RP-HPLC测得90-100U/mL(90-110％)。对于通过非变性SEC测得的纯度百分比，可接受的目标规范为通过峰面积测得的≤2％的高分子量(HMWt)胰岛素种类。对于通过变性SEC测得的胰岛素纯度，可接受的目标规范为通过变性SEC的峰面积测得的≤2％的高分子量(HMWt)胰岛素种类。

结果在下面总结。确定在表60所示的赖脯胰岛素/rHuPH20制剂中，在T＝0配制具有低赖脯胰岛素含量的制剂#1、#2和#3(分别为91.22％、91.40％或91.30％)，而其它制剂包含大约100％的蛋白质含量。

1.3个月时间点

a.赖脯胰岛素

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定多达3个月时间点。在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于制剂#1-#3，赖脯胰岛素含量较低(大约91％目标回收)，但是这似乎是制剂制备误差，因为如在5℃所预期，回收百分比是恒定的。

在25±2℃，所有制剂中的rHuPH20是稳定的，例外是制剂#8，其低于在2-3个月之间的rHuPH20酶活性的375U/mL的目标规范。这不是意外的，因为制剂#8具有高pH和高防腐剂浓度，并且一般而言，rHuPH20在较低pH和较低防腐剂浓度更稳定。在3个月时间点之外，在所有制剂中的赖脯胰岛素于25℃通常是稳定的，但是纯度开始稍微下降，如大约1个月以后通过RP-HPLC所评价的。

在30±3℃，仅最低pH制剂(#1和#4，二者为pH 7.2)高于在30℃1个月后的rHuPH20酶活性的目标规范(>375U/mL)。制剂#2高于在30℃2周后的目标规范，但是低于1个月时的375U/mL。赖脯胰岛素在所有制剂中于30℃通常在目标规范内稳定持续3个月，但是与在25℃观察到的纯度相比，纯度存在稍微更大的下降。在30℃，纯度的下降伴有含量的下降，这在25℃是不明显的。在3个月时间点以后，终止30℃的条件。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定多达3个月时间点。

在3个月之外，rHuPH20满足在25±2℃保持的所有制剂的目标规范，例外是制剂#7，其低于在2-3个月之间的rHuPH20活性的375U/mL的目标规范。这是稍微意外的，因为制剂#7和#8除了pH值(分别为7.2和7.6)以外是相同的，并且一般而言，rHuPH20在较低pH更稳定。该意外的结果可能是由于下述事实：制剂#7起始于比目标(分别为600U/mL和100％)更低的活性(500U/mL)和含量(93.8％)，并且进一步得到制剂#7和#8的可接受的纯度值的支持。在3个月时间点之外，在所有制剂中的门冬胰岛素于25℃是稳定的，但是纯度和回收百分比存在稍微下降的趋势。与在25℃的那些相比，rHuPH20在保持在30±3℃的所有制剂中的稳定性更低。最低的pH制剂(#1和#4，二者为pH 7.2)和最低的总防腐剂制剂(#4和#5，总防腐剂水平＝0.175％)仍然高于在30℃1个月后的rHuPH20酶活性的目标规范。制剂#2在30℃1个月后刚好低于目标规范，并且制剂#6在1个月后稍微高于活性的目标规范，但是在2周后稍微低于该值。制剂#1-#6通常保留在30℃2周后的rHuPH20酶活性的目标规范内。门冬胰岛素在所有制剂中于30℃稳定在目标规范内保持3个月，但是与在25℃观察到的值相比，纯度和回收百分比存在稍微更大的下降趋势。在3个月时间点后，终止该研究的30±3℃部分。

2.6个月时间点

a.赖脯胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有试验制剂于5℃在6个月时间点是稳定的。如之前一起观察到制剂#1-#3的低赖脯胰岛素含量(大约91％目标回收)，但是回收百分比在5℃仍然是平坦的。

在25℃，对于制剂#1、#2、#4和#5，rHuPH20也继续是稳定的(>375 U/mL rHuPH20活性)。这些制剂都处于较低pH(7.2或7.4)，具有当前的USP的防腐剂水平(#1、#2：0.125％的苯酚、0.075％的间甲酚)或稍微更低的防腐剂水平(#4、#5：0.1％的苯酚、0.075％的间甲酚)。所有8种制剂在6个月时保持在rHuPH20回收百分比的目标规范内，但是就rHuPH20纯度和回收而言有明显降低(通过RP-HPLC)。在25℃3个月以后针对赖脯胰岛素观察到的降低的纯度(通过RP-HPLC)、含量(通过RP-HPLC)和纯度(通过非变性SEC)在6个月时更明显。通过变性SEC测定的纯度可以非常轻微地下降，但是所有主要峰值仍然>99.4％，所以直到此时，任何损失都是非常小的。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有试验制剂在6个月时间点时于5±3℃是稳定的。

对于保持在25±2℃超过6个月的4种制剂(#1、#2、#4和#5)，rHuPH20继续满足酶活性的目标活性规范(>375U/mL)。这些制剂都处于较低pH(7.2或7.4)，具有当前的USP的防腐剂水平(#1、#2：0.125％的苯酚、0.075％的间甲酚)或稍微更低的防腐剂水平(#4、#5：0.1％的苯酚、0.075％的间甲酚)。所有8种制剂在6个月时保持在rHuPH20回收百分比的目标规范内，但是就rHuPH20纯度和回收而言有明显降低(通过RP-HPLC)。就纯度(通过RP-HPLC)、含量(通过RP-HPLC)和纯度(通过非变性SEC)而言，在25℃3个月后观察到的门冬胰岛素的下降趋势在6个月时更明显。通过变性SEC测得的纯度可以是非常轻微向下的趋势，但是所有主要峰值仍然>99.5％，所以直到此时，任何损失都是非常小的。

3.加速条件-在25℃搅拌和冷冻/融化

a.赖脯胰岛素

在25℃搅拌24小时以后，制剂#2是混浊的。赖脯胰岛素对于两种条件而言是稳定的，尽管回收百分比在5个冻融循环以后下降至约75％。对于在25℃搅拌24小时的样品，rHuPH20满足目标活性规范(>375U/mL)。5个冷冻/融化循环后，rHuPH20是无酶活性的。

b.门冬胰岛素

在搅拌或冷冻/融化条件下，对于门冬胰岛素制剂#2，得到了与赖脯胰岛素制剂类似的结果。

实施例13

包含不同防腐剂的赖脯胰岛素/rHuPH20、门冬胰岛素/rHuPH20或赖谷胰岛素/rHuPH20的稳定性研究

2或3个月中间数据表

在该实施例中，在4种不同储存条件(5℃、15℃、25℃和30℃)下评价不同赖脯胰岛素-rHuPH20、门冬胰岛素-rHuPH20或赖谷胰岛素-rHuPH20制剂随时间的稳定性。所述制剂的差别在于pH、盐浓度和甘油浓度。通过测量一般外观和特征、rHuPH20酶活性和rHuPH20和胰岛素类似物纯度，评价稳定性。该研究意图提供在3种防腐剂水平(在市售的胰岛素制剂(Novolog)中包含的防腐剂水平或EP-B(欧洲药典)和USP(美国药典)的防腐剂水平)的3期临床开发的支持数据。

赖脯胰岛素/rHuPH20制剂在下面的表61中显示。门冬胰岛素/rHuPH20制剂在表62中显示。赖谷胰岛素/rHuPH20制剂在表63中显示。基础制剂包含3.5mg/mL的赖脯胰岛素或门冬胰岛素、600U/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCl、20mM的甲硫氨酸和0.01％的泊洛沙姆188。pH、NaCl浓度和甘油浓度在3种基础防腐剂浓度内变化。

对于表61和62中所示的赖脯胰岛素/rHuPH20和门冬胰岛素/rHuPH20制剂，制剂A1-A4具有市售的

防腐剂水平：0.15％的苯酚和0.172％的间甲酚；制剂B1-B5具有EP-B的防腐剂水平：0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚，并且制剂U1具有USP的防腐剂水平：0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚。

另外，对于在表63中所示的赖谷胰岛素/rHuPH20制剂，制剂1具有市售的

防腐剂水平：0.15％的苯酚和0.172％的间甲酚。制剂2具有EP-B的防腐剂水平：0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚。制剂3具有USP的防腐剂水平：0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚。制剂4-7具有

市售的防腐剂水平，并且与制剂1相比变化一种或多种因素。用黑体字样式表示制剂之间的变化。制剂4具有较高浓度的NaCl，并且制剂7具有不同的表面活性剂。制剂5和6与制剂4的差别在于甲硫氨酸浓度和pH。

在具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条的USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，在上面实施例12所述的不同温度储存和孵育1mL每种制剂。在不同时间记录稳定性测得量：t＝0、0.25、0.5、1、2、3、6或9个月。还通过测量pH、外观、rHuPH20酶活性、rHuPH20的纯度百分比和回收百分比(通过RP-HPLC)、赖脯胰岛素的纯度百分比和回收百分比(通过RP-HPLC)和赖脯胰岛素的纯度百分比(通过非变性和变性SEC)(参见实施例2-5和实施例12)来评价稳定性。稳定性验收标准或每种测试参数的目标规范与在实施例12中所述相同。如果结果表明≥初始水平的30％，在随后时间点仅评价样品。

结果在下面总结。

1.1个月时间点

a.赖脯胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定直到1个月时间点。在1个月时间点没有评价在15±2℃的制剂。

在1个月后，大部分保持在25±2℃的制剂中的rHuPH20是稳定的，例外的是制剂A1、A2、A4和B4。在25℃储存后，于2周至1个月时，制剂A1、A2和B4低于375U/mL的rHuPH20酶活性的目标规范，并且制剂A4于1-2周低于目标规范。这些制剂具有市售的Novolog或EP-B的防腐剂水平，具有高pH(pH 7.6)，这不利于rHuPH20稳定性。在25℃1个月以后具有<375U/mL透明质酸酶活性的单一EP-B制剂(B4)具有pH 7.6和低氯化钠浓度(50mM)，二者的组合不利于rHuPH20。pH 7.6的具有更高氯化钠浓度(80mM或100mM)的其它EP-B制剂都保留远高于在25℃1个月后的375U/mL的rHuPH20酶活性的目标水平。所有其它制剂远高于在25℃储存1个月以后的目标规范。在1个月时间点之后，在25℃在所有制剂中的赖脯胰岛素是稳定的，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比开始稍微下降。

与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20的稳定性更低。在30℃在1个月后USP制剂维持可接受的rHuPH20活性，但是市售的防腐剂(A1-A4)或EP-B(B1-B5)制剂都没有保持高于在30℃储存1周以后的目标规范。在30℃在所有制剂中的赖脯胰岛素稳定在目标规范内，持续1个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比稍微下降。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有制剂在5±3℃稳定直到1个月时间点。在1个月时间点没有评价在15±2℃的制剂。

在1个月后，保持在25±2℃的所有制剂中的rHuPH20是稳定的，例外是制剂A4和B4，其分别在1-2周和2周-1个月低于375U/mL的目标规范。这些制剂具有市售的

或EP-B的防腐剂水平，具有低盐(50mM)和高pH(7.6)，它们各自是不利于rHuPH20稳定性的条件。所有其它制剂都高于在25℃储存1个月以后的rHuPH20酶活性的目标规范。在1个月时间点之后，在25℃在所有制剂中的门冬胰岛素都是稳定的。门冬胰岛素总含量低于预期值，但是所述值从时间＝0是一致的。

与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性。USP制剂(U1)在1个月后于30℃维持可接受的rHuPH20活性。数种EP-B制剂在1周之后维持可接受的rHuPH20活性，但是在30℃储存1周以后，

防腐剂制剂都没有维持可接受的活性。对于在30℃的所有制剂，门冬胰岛素稳定在目标规范内持续1个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比存在可观察到的稍微下降趋势。

c.赖谷胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和赖谷胰岛素，所有制剂在5±3℃稳定直到1个月时间点。在1个月时间点没有评价在15±2℃的制剂。

在1个月之后，保持在25±2℃的所有制剂中的rHuPH20是稳定的。就rHuPH20活性和通过RP-HPLC测得的rHuPH20纯度而言，一些制剂存在一些稍微下降趋势。在1个月时间点之后于25℃在所有制剂中的赖谷胰岛素是稳定的，但是也表现出就纯度和回收百分比而言的稍微下降趋势。

与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性。在30℃1周以后，7种试验物中的4种没有满足>375U/mL的rHuPH20活性目标规范。在30℃，制剂6表现可接受的活性持续仅1周，制剂2表现可接受的活性持续2周，并且USP制剂(#3)维持可接受的rHuPH20活性(532U/mL)到1个月以后。在30℃在所有制剂中的赖谷胰岛素稳定在目标规范内持续1个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比和回收百分比存在可观察到的明显下降趋势。

2.2个月时间点

a.赖脯胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定直到2个月时间点。

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有试验物也在15±2℃稳定直到2个月时间点。rHuPH20酶活性可能存在一些非常轻微的下降趋势，但是稳定性没有其它明显的下降趋势。

在2个月之后，于25±2℃下市售防腐剂制剂(A1-A4)中的rHuPH20是不稳定的，但是制剂A3在1个月时具有良好活性(436U/mL)，并且在2个月时仅稍微低于预期的>375U/mL规范(361U/mL)。5种EP-B制剂中的4种(B1、B2、B3和B5)高于在25℃2个月以后的375U/mL目标规范，并且具有良好的rHuPH20纯度和回收。USP制剂(U1)也高于在25℃2个月以后的rHuPH20活性目标规范，具有510U/mL的值和相应的高纯度和回收值。在2个月时间点之后，于25℃在所有制剂中的赖脯胰岛素是稳定的，但是在1个月时发现的下降趋势继续。

如在1个月时发现的，与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性，并且所有A(市售的防腐剂)和B(EP-B防腐剂)制剂都远低于在30℃2个月时的rHuPH20活性目标规范。USP制剂在30℃在2个月之后刚好维持可接受的rHuPH20活性(375U/mL)，但是在1个月时间点降至低于规范(334U/mL)。这可能是由于rHuPH20活性测定法中的固有差异性或样品差异，但是仍然证实了在30℃的稳定性总体下降趋势。在30℃在所有制剂中的赖脯胰岛素稳定在目标规范内持续2个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比和回收以及通过非变性SEC测得的纯度百分比存在可观察的确定下降趋势。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有制剂在5±3℃稳定直到2个月时间点。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有试验也在15±2℃稳定直到2个月时间点。观察到rHuPH20酶活性、纯度和回收的稍微下降。

在2个月之后，于25±2℃，4种市售防腐剂制剂中的3种(A2、A3和A4)中的rHuPH20是不稳定的，但是制剂A1在2个月时具有可接受的活性(385U/mL)，并且试验物A3在2个月时仅稍微低于预期的>375U/mL规范(357U/mL)。5种EP-B制剂中的3种(B1、B2和B3)在25℃2个月以后仍然远高于375U/mL的rHuPH20酶活性目标规范，并且具有可接受的、但是非特征性地低于基于经验用类似制剂预期的rHuPH20纯度和回收。USP制剂(U1)在25℃2个月以后仍然远高于rHuPH20活性目标规范，具有444U/mL的值和可接受的纯度和回收。在2个月时间点之后，于25℃在所有制剂中的门冬胰岛素是稳定的，但是通过RP-HPLC和非变性SEC测得的纯度存在稍微下降趋势。

如在1个月时鉴别的，与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性，并且所有A和B制剂都远低于在30℃2个月时的rHuPH20酶活性目标规范。USP制剂(U1)在30℃于2个月之后具有可接受的rHuPH20活性(382U/mL)。USP制剂的rHuPH20纯度百分比和回收稍微低于如上所述基于经验用类似制剂预期的值，但是在可接受的限度内。在30℃在所有制剂中的门冬胰岛素稳定在目标规范内持续2个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比以及通过变性和非变性SEC测得的纯度百分比存在可观察的下降趋势。对于之前的时间点观察的低回收百分比不再是明显的，并且对于所有温度，通过RP-HPLC测得的门冬胰岛素的回收百分比的值在1-2个月之间略微增加(在30℃最明显)。

c.赖谷胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和赖谷胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定在目标规范内直到2个月时间点。

对于rHuPH20和赖谷胰岛素，所有试验物于15±2℃在2个月时间点稳定在目标规范内。对于rHuPH20活性和回收，2个月的数据通常稍微降低，但是纯度百分比保持相同，例外是制剂#5(没有加入甲硫氨酸)，其在2个月时具有显著更低的纯度百分比。赖谷胰岛素也在15℃稳定在目标规范内直到2个月时间点，在15℃2个月以后仅表现出稍微更低的值的纯度百分比和回收。

对于保持在25±2℃的7种制剂中的3种(#2、#3和#6)，在2个月以后的rHuPH20活性远高于初步规范(<375U/mL)，并且对于制剂#4，刚好高于规范。一般而言，这些制剂包含较低水平的防腐剂(#2和#3)或较高盐和较低pH(#6)。制剂#4(其刚好高于rHuPH20活性规范)具有本研究中最高的防腐剂和pH水平，但是也包含较高浓度的NaCl。就rHuPH20活性、纯度和含量而言，所有制剂存在下降趋势。在2个月时间点之后，在25℃在所有制剂中的赖谷胰岛素是稳定的，但是在1个月时发现的纯度和回收百分比的稍微下降趋势继续。

与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性。在30℃2个月以后，仅USP防腐剂水平的制剂(#3)满足>375U/mL的目标活性规范。制剂#3在2个月时间点时也表现出可接受的rHuPH20纯度和回收。在30℃在所有制剂中的赖谷胰岛素稳定在目标规范内持续2个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比和回收百分比存在可观察到的明显下降趋势。

3.3个月时间点

a.赖脯胰岛素

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有制剂在5±3℃稳定直到3个月时间点。通过RP-HPLC测得的rHuPH20纯度稍微低于预期值，但是这似乎是由于正常的测定法差异。在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒，例外是制剂A3，发现其包含“2个红色外来碎片”。

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有制剂在15±2℃满足所有目标规范直到3个月时间点。通过RP-HPLC测得的rHuPH20纯度也稍微低于预期值，其如前所述似乎是由于正常的测定法差异。通过非变性SEC测得的rHuPH20活性和赖脯胰岛素纯度存在一些稍微下降趋势，但是没有其它明显的下降趋势。

在3个月之外，于25±2℃在市售防腐剂制剂(A1-A4)中的rHuPH20是不稳定的。在25℃3个月以后，5种EP-B制剂中的4种(B1、B2、B3和B5)仍然高于375U/mL的rHuPH20酶活性目标规范，并且具有下降趋势、但是可接受的rHuPH20纯度和回收。USP制剂(U1)在25℃3个月以后仍然远高于rHuPH20活性目标规范，具有522U/mL的值和相应的高纯度和回收值。在3个月时间之后，在25℃在所有制剂中的赖脯胰岛素是稳定的，但是通过RP-HPLC和非变性SEC测得的赖脯胰岛素纯度的下降趋势是明显的。

如之前所发现，与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性，并且所有制剂在30℃3个月以后都低于rHuPH20活性目标规范。在30℃在所有制剂中的赖脯胰岛素稳定在目标规范内持续3个月，但是通过RP-HPLC测得的纯度百分比以及通过非变性SEC测得的纯度百分比存在明确的下降趋势。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有试验制剂在5±3℃稳定直到3个月时间点。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有制剂在15±2℃满足所有目标规范直到3个月时间点。rHuPH20活性、纯度和回收存在一些下降趋势。通过非变性SEC测得的门冬胰岛素纯度在2个月时间点稍微降低，但是如果这是下降趋势或正常测定法差异性，那么它是不明显的。

市售防腐剂制剂中的rHuPH20是不稳定的，但是制剂A1在3个月时仅稍微低于rHuPH20活性目标规范(<375U/mL)(369U/mL)。5种EP-B制剂中的3种(B1、B2和B3)在25±2℃3个月以后仍然远高于375U/mL目标规范，并且具有可接受的、但是出乎预料更低的rHuPH20纯度和回收(如在2个月总结中所提及的)。USP制剂(U1)在25℃3个月以后仍然远高于rHuPH20活性目标规范，具有492U/mL的值和可接受的纯度和回收。在3个月时间点之外，于25℃在所有制剂中的门冬胰岛素是稳定的，但是通过RP-HPLC和非变性SEC测得的纯度存在明显下降趋势。

如以前讨论的，与在25±2℃的那些相比，保持在30±2℃的所有制剂中的rHuPH20具有更低的稳定性。所有A和B制剂在30℃1个月时都低于rHuPH20活性目标规范。USP制剂(U1)在3个月时仅稍微低于预期的>375U/mL规范(371U/mL)，但是也具有低rHuPH20纯度百分比和回收百分比(通过RP-HPLC测得)。通过除了非变性SEC以外的所有技术测定，在30℃在所有制剂中的门冬胰岛素稳定在目标规范内持续3个月，所述非变性SEC表明所有制剂的大约97％的主要峰的非常轻微的下降。

4.6个月时间点

a.赖脯胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。在6个月时间点没有评价在30±2℃的制剂。

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有制剂在5±3℃和15±2℃稳定直到6个月时间点。所有制剂的rHuPH20活性和rHuPH20回收百分比存在一些稍微下降趋势。制剂A4在两种温度是最不稳定的。

仅制剂B3和U1满足在25±2℃的稳定性要求。这两种制剂具有7.4的pH和80mM的盐。其余的制剂具有小于375U/mL的rHuPH20酶活性。活性的损失与rHuPH20回收百分比的损失相符。非变性SEC表明赖脯胰岛素纯度百分比的稍微下降趋势。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。在6个月时间点没有评价在30±2℃的制剂。

对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有制剂在5±3℃和15±2℃稳定直到6个月时间点。所有制剂的rHuPH20活性和rHuPH20回收百分比存在一些稍微下降趋势。制剂A4在两种温度是最不稳定的。

仅制剂U1满足在25±2℃的稳定性要求。其余的制剂具有小于375U/mL的更低rHuPH20酶活性。活性的损失与rHuPH20回收百分比的损失相符。非变性SEC表明门冬胰岛素纯度百分比的稍微下降趋势。

5.9个月时间点

a.赖脯胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。在9个月时间点没有评价在25±2℃和30±2℃的制剂。

对于rHuPH20和赖脯胰岛素，所有制剂在5±3℃和15±2℃稳定直到9个月时间点。所有制剂的rHuPH20活性和rHuPH20回收百分比存在一些稍微下降趋势。如在6个月所观察到的，制剂A4在两种温度是最不稳定的。

b.门冬胰岛素

在所有时间点和温度，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。在9个月时间点没有评价在25±2℃和30±2℃的制剂。

对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有制剂在5±3℃和15±2℃稳定直到9个月时间点。所有制剂的rHuPH20活性和rHuPH20回收百分比存在一些稍微下降趋势。如在6个月所观察到的，制剂A4在两种温度是最不稳定的。

实施例14

门冬胰岛素-rHuPH20和赖脯胰岛素-rHuPH20的加速稳定性研究：冷冻/融化、搅拌和高储存温度

在该实施例中，在3种物理加速应力条件(多个冷冻/融化循环；在25℃搅拌，和在37℃的热应力)下评价不同门冬胰岛素-rHuPH20和赖脯胰岛素-rHuPH20制剂的稳定性。通过测量一般外观和特征、rHuPH20酶活性和rHuPH20和胰岛素类似物纯度，评价稳定性。

胰岛素类似物/rHuPH20制剂在下面的表64中显示。使用

样品(赖脯胰岛素，制剂4)和

样品(门冬胰岛素，制剂8)作为对照。基础制剂包含3.47mg/mL的赖脯胰岛素或3.5mg/mL的门冬胰岛素、600U/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCl和0.01％的泊洛沙姆188。制剂1和5另外包含50mM的NaCl、100mM的甲硫氨酸、0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚，pH为7.4。制剂2和6(EP-B制剂)另外包含80mM的NaCl、20mM的甲硫氨酸和50mM的甘油，具有EP-B的防腐剂水平：0.15％的苯酚和0.175％的间甲酚。制剂3和7(USP制剂)另外包含80mM的NaCl、20mM的甲硫氨酸和50mM的甘油，具有USP的防腐剂水平：0.13％的苯酚和0.075％的间甲酚。

将每种制剂暴露于下述加速降解条件：

(1)在25℃搅拌：将每种制剂保持在配有振荡器的25℃保温箱中。使小瓶在650rpm振荡下竖直站立。在振荡6、12和24小时以后，取出样品进行分析。在分析之前在2-8℃储存所有样品。

(2)多循环冷冻/融化：通过在-30℃冰柜和室温工作台之间交替的储存条件，使每种制剂经历5个冷冻/融化循环。对于每个循环，将样品在每种条件下放置至少2小时(即在-30℃冰柜中2小时，取出并放在工作台上在室温保持2小时，视作1个循环)。在1、3和5个循环以后取出样品，并在分析之前在2-8℃储存。

(3)热应力：将每种制剂保持在37℃保温箱中。在8、24和48小时以后取出样品，并在分析之前在2-8℃储存样品。

在应用应力条件之前和之后，进行分析。通过一整套分析测试(包括外观、重量克分子渗透浓度、pH、浊度、透明质酸酶酶活性、透明质酸酶纯度和胰岛素纯度、HWM纯度和含量)来表征所有制剂(关于测试方法，参见上面的实施例2-5和12)。稳定性验收标准或每种测试参数的目标规范与在实施例12中所述相同。结果在下面总结。

1.在25℃搅拌

EP-B制剂(#2和#6)和对照制剂(#4和#8)在所有时间点是澄清且无色的，且无颗粒。UPS制剂(#3和#7)在搅拌6小时以后是澄清且无色的，但是在12小时时间点之前已经形成沉淀。制剂#1和#5在6小时时间点时已经沉淀。

在所有时间点在所有制剂中的rHuPH20是稳定的，具有>375U/mL的酶活性。rHuPH20回收百分比在所有连续时间点稍微下降，但是所有制剂维持可接受的回收水平。门冬胰岛素和赖脯胰岛素在所有时间点是稳定的。

(门冬胰岛素)和

(赖脯胰岛素)对照在所有时间点是稳定的。

2.冷冻/融化

所有制剂在所有时间点是澄清且无色的，且无颗粒。1个冷冻/融化循环以后，尽管所有制剂和时间点的纯度百分比保持>95％，rHuPH20酶活性严重地减少(最高制剂#3具有168U/mL的活性)。对于大多数制剂，rHuPH20回收百分比低于可接受的水平。门冬胰岛素和赖脯胰岛素在所有时间点是稳定的。

(门冬胰岛素)和

(赖脯胰岛素)在所有时间点是稳定的。

3.在37℃的热应力

所有制剂在所有时间点是澄清且无色的，且无颗粒。在37℃8小时以后，制剂#1、#3、#5和#7具有可接受的rHuPH20酶活性(>375U/mL)。如rHuPH20活性的下降(低于375U/mL)和回收百分比的下降所证实，所有制剂的rHuPH20稳定性在所有连续时间点下降。门冬胰岛素和赖脯胰岛素在所有时间点是稳定的。

(门冬胰岛素)和

(赖脯胰岛素)对照在所有时间点是稳定的。

实施例15

HA寡聚体对胰岛素/rHuPH20制剂稳定性的作用

在该实施例中，评价HA寡聚体的添加对不同胰岛素/rHuPH20制剂的稳定性的作用。首先，在4种储存条件(5℃、25℃、30℃和35℃)下完成测试以评价随时间的稳定性。其次，测试在有不同防腐剂存在下HA寡聚体对rHuPH20稳定性的作用。第三，针对门冬胰岛素-rHuPH20制剂评价不同大小的HA寡聚体的稳定作用。

A.HA寡聚体对储存稳定性的作用

制剂包含不同量的HA(10、15或20mg/mL)。其它制剂包含15mg/mL的HA，其具有不同的pH、甘油和盐浓度。

胰岛素/rHuPH20制剂在下面的表65中显示。基础制剂包含3.5mg/mL胰岛素、600U/mL(5μg/mL)的rHuPH20、30mM的Tris/HCl、80mM的NaCl、20mM的甲硫氨酸和0.01％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188)，以及0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚，pH为7.4。制剂#2-#4分别另外包含10、15和20mg/mL的HA寡聚体。制剂#1和#6另外包含50mM的甘油，并且制剂#6包含15mg/mL的HA寡聚体。制剂#5和#7与制剂#3的差别在于它们的pH和NaCl浓度。评价另外3种不包含甲硫氨酸的制剂(#8-#10)，其各自包含3.5mg/mL的胰岛素、600U/mL的rHuPH20、15mg/mL的HA寡聚体、30mM的Tris/HCl、80mM的NaCl和0.01％的泊洛沙姆188以及0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚，pH为7.4。制剂#8另外包含20mM的甲硫氨酸，制剂#10另外包含50mM的甘油。

将1mL每种制剂储存在USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，所述小瓶具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条。将每种制剂分别在5±3℃、25±2℃、30±2℃和35±2℃孵育，并在时间t＝0、2、5、7和9天、1周和2周、1个月或2个月记录稳定性测得量。通过测量pH、外观、重量克分子渗透浓度、rHuPH20酶活性、rHuPH20含量(通过RP-HPLC)、胰岛素含量(通过RP-HPLC)和胰岛素纯度百分比(通过非变性SEC)来评价稳定性(参见实施例2-5和实施例12)。每种测试参数的稳定性验收标准或目标规范与在实施例12中所述相同。

1.5℃

所有包含至少15mg/mL HA寡聚体的制剂在5℃仅1周以后包含可见的颗粒。仅包含10mg/mL HA寡聚体或不含HA寡聚体的制剂在5℃2周以后是澄清且无色的，并且不包含颗粒，但是在1个月以后观察到颗粒。rHuPH20的所有试验制剂在5℃稳定直到2个月时间点。在5℃仅1个月以后，在包含20mg/mL HA寡聚体(#4)、具有较低pH(#5)和包含较高盐(#7)的制剂中的胰岛素是不稳定的。

2.25℃

在25℃仅1周以后，制剂#5(低pH)和#7(高盐)包含颗粒。其余的制剂都是澄清且无色的，并且不包含颗粒。对于rHuPH20和胰岛素，所有试验制剂在25℃稳定直到2个月时间点。

3.30℃

在30℃仅1周以后，制剂#5(低pH)和#7(高盐)包含颗粒。其余的制剂都是澄清且无色的，并且不包含颗粒。对于rHuPH20，所有包含HA的制剂在30℃稳定持续1个月。在2个月时间点之前，rHuPH20酶活性已经降至低于375U/mL的可接受水平。在1个月时间点时，所有制剂中的胰岛素是稳定的，在25℃2个月以后观察到稳定性的明显降低。在25℃，HA寡聚体的添加对rHuPH20稳定性具有明显积极作用，没有影响胰岛素的稳定性。

在时间零点和在25℃3天以后，测试制剂#8-#10的rHuPH20氧化。在25℃仅3天以后，包含50mM的甘油的制剂#10表现出增加的氧化。

4.35℃

对于rHuPH20，包含HA寡聚体的制剂在35℃稳定持续2天。在第5天，对于rHuPH20，仅包含15mg/mL HA寡聚体的制剂#3和#5(具有不同pH)是稳定的。在35℃仅2天以后，所有制剂中的rHuPH20含量较低。在35℃，HA寡聚体的添加对rHuPH20稳定性具有明显积极作用，没有影响胰岛素的稳定性。

B.防腐作用

1.USP防腐剂

在该实施例中，以通过测定rHuPH20的酶活性，来评价HA寡聚体稳定化包含USP水平的防腐剂的门冬胰岛素-rHuPH20或赖脯胰岛素-rHuPH20制剂的能力。测试制剂F1-F7。基础制剂包含3.5mg/mL的门冬胰岛素或赖脯胰岛素、600U/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCL(pH7.4)、5mM的甲硫氨酸、0.01％的泊洛沙姆188、0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚。制剂F1不包含门冬胰岛素。如上面在实施例2B中所述，测量rHuPH20酶活性。结果在下面的表66-67中显示。所有制剂在5℃稳定3天或6天。所有包含HA的制剂(不论它们的pH和NaCl浓度如何)具有比不包含HA的相同制剂更高的酶活性。如下面表66所示，在37℃随时间，包含10mg/mLHA的制剂F4具有比不包含HA的制剂F2和F3(在相同或更低pH)更高的rHuPH20酶活性。对于具有降低浓度的NaCl的制剂F5(参见下面的表67)，在制剂中的添加10mg/mL限制由较低NaCl浓度引起的rHuPH20活性的损失，所述较低NaCl浓度会使rHuPH20失稳(参见例如F3)。

2.EP-B水平防腐剂

在该实施例中，以通过测定rHuPH20的酶活性，来评价HA寡聚体稳定化包含EP-B水平的防腐剂的胰岛素-rHuPH20制剂的能力。基础制剂包含3.5mg/mL的胰岛素、600U/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCL(pH 7.4)、20mM的甲硫氨酸、0.01％的泊洛沙姆188、0.10％苯酚和0.15％的间甲酚。如在上面实施例2B中所述，测量rHuPH20酶活性。结果显示在下面的表68中。在35℃，包含HA的制剂(F2-F6)都具有比不包含HA的制剂F1更高的rHuPH20酶活性。在第9天，F1仅剩余约10％的酶活性，而制剂F2-F6(取决于它们的pH、HA和NaCl浓度)仍然具有约30％-60％的rHuPH20酶活性。对于更长期稳定性研究，在30℃孵育的这些制剂观察到类似的结果。如下面表68所示，在30℃3个月储存结束时，不包含HA的制剂F1保留约30％的rHuPH20酶活性；对于包含HA的所有其它制剂，平均而言，保留略高于50％的rHuPH20酶活性。

在更低温度，rHuPH20经历更少的热应力，这可以解释就包含和不含HA的制剂之间的相对酶活性变化而言的更小差异。要指出，在相同pH和NaCl条件下，rHuPH20活性与在该研究中试验的HA浓度无关。由于HA是rHuPH20的底物的事实，它的稳定化机制最可能与特异性的酶-底物结合作用相关联。该相互作用当然受2种分子之间的摩尔比影响。在特定底物：酶比率，达到最大稳定作用，并且更多的HA的加入未进一步提高活性。在该实施例中，稳定化5μg/mL的rHuPH20需要约10mg/mL的HA。

C.HA的分子量对稳定化rHuPH20的作用

在该实施例中，以通过测定rHuPH20的酶活性，来评价不同大小的HA寡聚体对门冬胰岛素-rHuPH20制剂的稳定作用。从Lifecore Biomedical(Minnesota,USA)获得3种不同分子量的透明质酸钠：6.4kDa(批次：GSP252-5-7)、74kDa(批次：GSP252-60-2)和234.4kDa(批次：002799)。将10mg每种HA加入1mL门冬胰岛素-PH20制剂中，所述制剂包含100U/mL门冬胰岛素、5μg/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCL(pH 7.4)、80mM的NaCl、50mM的甘油、20mM的甲硫氨酸、0.01％的泊洛沙姆188、0.10％的苯酚和0.15％的间甲酚。还在该研究中还包括不包含HA的制剂作为对照。将这些溶液在5℃和37℃孵育至多9天，以评价不同大小的HA对rHuPH20酶活性的稳定作用。如在上面实施例2B中所述，测量rHuPH20酶活性。

结果在下面的表69中显示。在37℃孵育3天以后，不包含HA的门冬胰岛素-rHuPH20制剂(F1)是无酶活性的。相比而言，制剂F2-F4保留约30％-40％的rHuPH20酶活性。一般而言，存在这样的趋势：更小的HA聚合物似乎提供比更大的HA更好的保护。这可能是由于单独的HA大小或由于HA与rHuPH20的摩尔比。

实施例16

门冬胰岛素/rHuPH20制剂的稳定性研究

在该实施例中，在2种储存条件(30℃和37℃)下和在加速条件(在25℃搅拌9天)下，评价不同的门冬胰岛素/rHuPH20制剂的稳定性。试验的胰岛素/rHuPH20制剂在下面的表70中显示。参比制剂(#7)包含3.5mg/mL的门冬胰岛素、600U/mL(5μg/mL)的rHuPH20、30mM的Tris/HCl、80mM的NaCl、50mM的甘油、20mM的甲硫氨酸和0.01％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188)，以及0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚，pH为7.4。制剂#1-#3测试0.13％的苯酚和0.12％的间甲酚的防腐剂水平，具有3种不同水平的稳定剂泊洛沙姆188。制剂#4-#6测试0.15％的苯酚和0.12％的间甲酚的防腐剂水平，具有3种不同水平的稳定剂泊洛沙姆188。制剂#8和#9另外包含10mg/mL的HA寡聚体，并且制剂#8具有更低水平的甘油(20mM)。制剂#10和#11包含更低水平的甲硫氨酸(5mM)，并且#11另外包含10mg/mL的HA寡聚体。

将1mL每种制剂储存在USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，所述小瓶具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条。将每种制剂分别在30±2℃和37±2℃孵育，并在时间t＝0、2、4、7和9天、2周、1个月或1.5个月记录稳定性测得量。对于每种制剂，在25℃使用Titer Plate振荡器(LabLine)在600rpm搅拌一组小瓶持续9天。也使

(门冬胰岛素)经历相同的搅拌条件作为对照。

通过测量pH、外观、重量克分子渗透浓度、rHuPH20酶活性、rHuPH20含量(通过RP-HPLC)和胰岛素含量(通过RP-HPLC)，来评价稳定性(参见实施例2-5和12)。稳定性参数的可接受的标准或目标规范与在实施例12中所述相同。

1.30℃

在30℃2周以后，所有制剂都是澄清且无色的，并且不包含颗粒。对于rHuPH20和门冬胰岛素，所有试验制剂在30℃稳定直到2周时间点，观察到所有制剂的稳定性随时间的稍微下降趋势。如与不包含HA寡聚体的制剂相比更高的酶活性和含量所证实，对于包含HA寡聚体的制剂(#8、#9、#11)，观察到对rHuPH20活性的稳定作用。另外，甘油和甲硫氨酸浓度的下降没有导致对这些制剂(#8、#9和#11)的稳定性的可见作用。

防腐剂浓度的对比表明，减少间甲酚的量和苯酚的量的适度增加对于rHuPH20稳定性是有益的，但是当苯酚浓度较高时，消除该益处。相比而言，防腐剂浓度的变化对门冬胰岛素稳定性几乎没有作用，因为对于所有制剂观察到门冬胰岛素含量的不大降低。例如，与包含0.15％的苯酚的制剂(#4-#6)相比，包含0.13％的苯酚的制剂(#1-#3)中的rHuPH20是更稳定的。与包含更低量的苯酚和更高量的间甲酚的参比制剂(#7)相比，包含增加浓度的苯酚和降低浓度的间甲酚的制剂(#1-#3)是更稳定的。相比而言，制剂#4-#6与参比制剂#7一样稳定。

2.37℃

在37℃9天以后，所有制剂都是澄清且无色的，并且不包含颗粒。对于包含HA寡聚体的制剂(#8、#9和#11)，观察到对rHuPH20活性的稳定作用，如与不包含HA寡聚体的制剂相比，在37℃2天以后更高的酶活性和含量所证实，尽管所述制剂都不具有可接受的rHuPH20酶活性水平。rHuPH20酶活性的损失与rHuPH20含量的损失有关。相比而言，对于包含HA寡聚体的制剂，门冬胰岛素含量表现出下降趋势，表明在有HA寡聚体存在下，在37℃门冬胰岛素是那样稳定。

类似于在25℃观察到的作用，防腐剂浓度的对比表明，减少间甲酚的量和苯酚的量的适度增加对于rHuPH20稳定性是有益的，但是当苯酚浓度较高时，消除该益处。相比而言，防腐剂浓度的变化对门冬胰岛素稳定性几乎没有影响，因为对于所有制剂观察到胰岛素含量的不大降低。

3.在25℃搅拌

在搅拌下于25℃，24或48小时以后，所有制剂中的rHuPH20和门冬胰岛素是稳定的，尽管包含HA寡聚体的制剂(#8、#9和#11)在24小时以后是混浊的。在搅拌下于25℃，24小时以后，

是稳定的。防腐剂浓度的变化对rHuPH20或门冬胰岛素稳定性没有作用。

实施例17

包含HA寡聚体和二价金属离子(Mg²⁺)的制剂

在该实施例中，在2种储存条件(在5℃5天和在37℃3-5天)下评价EP-B水平的防腐剂对rHuPH20酶活性的作用。所述制剂包含不同量的HA寡聚体和二价金属离子(Mg²⁺)。

rHuPH20制剂在下面的表71中显示。基础制剂包含600U/mL的rHuPH20、30mM的Tris/HCl、200mM的NaCl、5mM的甲硫氨酸、0.01％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188)，以及0.100％苯酚和0.150％的间甲酚，pH为6.8。制剂2和4另外包含10mg/mL的HA寡聚体，并且制剂3和5包含20mg/mL的HA寡聚体。制剂2和3另外包含3mM的Mg²⁺，并且制剂4和5包含10mM的Mg²⁺。

将1mL每种制剂储存在USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，所述小瓶具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条。将每种制剂分别在5℃和37℃孵育，并在时间t＝3、4和/或5天记录稳定性测得量。通过测量pH、外观、重量克分子渗透浓度、rHuPH20酶活性和rHuPH20含量(通过RP-HPLC)，评价稳定性(参见实施例2-3和5和实施例12)。上述每种参数的验收标准或目标规范与在实施例12中所述相同。

结果表明，所有制剂是澄清且无色的，且无颗粒。随着加入Mg²⁺后，渗量倾向于增加。对于所有制剂，rHuPH20酶活性和含量在5℃是稳定的。在37℃，rHuPH20酶活性在3天时和4天后下降，其是在375U/mL的可接受目标规范内。在5天以后，保留大约一半的初始rHuPH20酶活性。活性的下降与rHuPH20含量的下降相关。

实施例18

在5℃或37℃的USP防腐剂制剂研究

在该实施例中，在2种储存条件(在5℃4天和在37℃2、4、6、8和12天)下评价USP水平的防腐剂对rHuPH20酶活性的影响。所述制剂包含不同量的HA寡聚体和盐和不同的pH。rHuPH20制剂在下面的表72中显示。基础制剂包含600U/mL的rHuPH20、3.5mg/mL的门冬胰岛素、赖脯胰岛素或正规胰岛素、30mM的Tris/HCl、5mM的甲硫氨酸、0.01％的泊洛沙姆188(泊洛沙姆188)以及0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚。制剂1不包含胰岛素。制剂2-5包含门冬胰岛素，制剂6-9包含正规胰岛素，制剂10-13包含赖脯胰岛素。制备每种胰岛素类似物的4种基础制剂。制剂2、6和10分别与3、7和11相同，具有不同的pH(7.0相对于7.2)。制剂3、8和12分别与4、9和13相同，具有不同的NaCl。这些制剂另外包含10mg/mL的HA寡聚体。

将1mL每种制剂储存在USP 1型硼硅酸盐2mL玻璃小瓶中，所述小瓶具有氯化丁基橡胶塞子和铝封条。将每种制剂分贝在5℃和37℃孵育，并在时间t＝2、4、6、8和/或12天记录稳定性测得量。通过测量pH、外观、重量克分子渗透浓度、rHuPH20酶活性、rHuPH20含量(通过RP-HPLC)、胰岛素含量(通过RP-HPLC)来评价稳定性(参见实施例2-3、5和12)。每种测试参数的稳定性的可接受标准和目标规范与在实施例12中所述相同。

结果表明，在5℃或37℃12天以后，制剂1和所有门冬胰岛素制剂(#2-5)是澄清且无色的，且无颗粒。在5℃6天以后，在制剂6和8-9和11-13中观察到晶体，并且在5℃仅2天以后，在制剂10中观察到晶体。

在5℃4天以后，所有制剂是稳定的。赖脯胰岛素制剂(#10-13)在37℃稳定持续8天，而胰岛素制剂(#6-9)在37℃仅稳定持续2天(例外是#7)。门冬胰岛素制剂(#2-5)在37℃稳定持续4-6天。对于在37℃的所有制剂，rHuPH20含量随时间下降。所有制剂的胰岛素含量随时间下降。

实施例19

不同防腐剂水平的抗微生物有效性试验

在该实施例中，为微生物有效性试验制备数批制剂，所述制剂包含不同水平的防腐剂和目标量的胰岛素和rHuPH20。由合约分析实验室(Quadrants Scientific,Inc.,SanDiego,CA和Lancaster Laboratories,Lancaster,PA)根据EP和USP的指导进行测试。测试包含不同防腐剂的制剂对细菌(铜绿假单孢菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)和真菌(黑曲霉菌和白念珠菌)的抗微生物有效性。如下进行试验：1)将每种细菌的初始接种物(至少10⁵CFU/mL)加入样品中，和2)测量每种细菌或真菌在24小时、7天和14天时的CFU/mL。将原始数据(CFU/mL)转化成从测得的接种物的log 10单位减少。在37℃的温度测试制剂。

所有制剂包含100U/mL的胰岛素或胰岛素类似物和5μg/mL的rHuPH20。其余的组分在制剂之间变化，使得可以对比不同组分的作用。结果在表73中总结，该表总结了不同制剂组分对抗微生物有效性的作用。中性作用表示指定的组分和浓度对抗微生物有效性没有作用。例如，当对比2种差别仅在于胰岛素类似物(即门冬胰岛素或赖脯胰岛素)的制剂时，胰岛素类似物对抗微生物有效性具有中性作用。取决于制剂，NaCl浓度对抗微生物有效性具有中性或负面作用。

实施例20

表达可溶性rHuPH20的细胞系的制备

用HZ24质粒(显示于SEQ ID NO:52)转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如第7,76,429和7,781,607号美国专利和第2006-0104968号美国公开)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体包含pCI载体骨架(Promega)、编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482(SEQID NO:49)的DNA、来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)、嵌合体内含子以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA包含在编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位点1处的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列，以及在编码对应于SEQ ID NO:1所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位点482的酪氨酸的DNA之后的终止密码子，之后为BamHI限制酶切位点。因此，构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)得到由CMV启动子驱动的单一mRNA物种(species)，其编码被内部核糖体进入位点(IRES)分隔开的人PH20的氨基酸1-482(显示于SEQ ID NO:3)和小鼠二氢叶酸还原酶氨基酸1-186(列于SEQID NO:53)。

将生长在添加了4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的GIBCO改良CD-CHO培养基中的未转染DG44 CHO细胞以0.5x10⁶细胞/ml接种至准备用于转染的摇瓶中。使细胞在加湿培养箱中于37℃、在5％CO₂中、120rpm的摇动下生长。在转染前测试指数生长的未转染DG44 CHO细胞的活力。

将未转染的DG44 CHO细胞培养物的六千万个活细胞沉淀(pelleted)并在0.7mL2x转染缓冲液(2x HeBS:40mM Hepes、pH 7.0、274mM的NaCl、10mM KCl、1.4mM Na₂HPO₄、12mM葡萄糖)中重悬至2×10⁷个细胞的密度。向每一等份重悬细胞中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化进行线性化)，然后将细胞/DNA溶液在室温下转移至0.4cm间距的BTX(Gentronics)电穿孔小槽中。用与细胞混合的无质粒DNA进行阴性对照电穿孔。以330V和960μF或350V和960μF的电容放电对细胞/质粒混合物进行电穿孔。

电穿孔后将细胞从小槽移出并转移至5mL添加了4mM谷氨酰胺和18ml/LPlurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的改良CD-CHO培养基中，使细胞在加湿培养箱中在六孔组织培养板的孔中于37℃、在5％、CO₂中生长2天而不进行筛选。

电穿孔后两天，从各孔移除0.5mL组织培养基并使用实施例2描述的微浊度测定法测试透明质酸酶活性的存在。

从组织培养孔收集来自转染2(350V)的细胞、计数并稀释至每mL 1×10⁴-2×10⁴个活细胞。将0.1mL的等份细胞悬浮液转移至五个96孔圆底组织培养板的每一个孔中。将一百微升包含4mM GlutaMAX^TM-1添加物(GIBCO^TM,Invitrogen Corporation)并且不含次黄嘌呤和胸苷添加物的CD-CHO培养基(GIBCO)加入包含细胞的孔中(终体积0.2mL)。

鉴定来自5个培养板的在无甲氨蝶呤的情况下生长的十个克隆。

在培养基中扩增六个HZ24克隆并以单细胞悬浮液形式转移至摇瓶中。使用二维无限稀释法将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10接种至96-孔圆底组织培养板中，其中相对于板从上到下1:2并且横向1:3稀释细胞，从左上角的孔以5000个细胞开始。使稀释的克隆生长于每孔500个未转染DG44 CHO细胞的背景中以提供在培养基中初始几天必要的生长因子。每个亚克隆制备10板，5个板包含50nM甲氨蝶呤，5个板不含甲氨蝶呤。

克隆3D3产生24个可见的亚克隆(13个来自无甲氨蝶呤处理，11个来自50nM甲氨蝶呤处理)。在24个亚克隆中的8个的上清液中测量到显著的透明质酸酶活性(>50单位/mL)，并将这8个亚克隆扩增至T-25组织培养瓶中。在50nM甲氨蝶呤存在下扩增分离自甲氨喋呤处理方案的克隆。在摇瓶中在500nM甲氨喋呤中进一步扩增克隆3D35M得到产生超过1000单位/ml的克隆(克隆3D35M；或Gen1 3D35M)。然后制备3D35M细胞的原始细胞库(MCB)。

实施例21

制备包含可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞

使实施例20描述的Gen1 3D35M细胞系适应更高的甲氨蝶呤水平以产生第2代(Gen2)克隆。从已建立的包含甲氨蝶呤的培养物中将3D35M细胞接种至包含4mM GlutaMAX-1^TM和1.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中。通过在37℃、7％CO₂加湿培养箱中在46天的时间里生长和传代9次，使细胞适应更高的甲氨蝶呤水平。通过在含有包含2.0μM甲氨蝶呤的培养基的96-孔组织培养板中进行有限稀释克隆出已扩增的细胞群。约4周后，鉴定克隆并选择克隆3E10B用于扩增。使3E10B细胞在包含4mM GlutaMAX-1^TM和2.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。产生3E10B细胞系的原始细胞库(MCB)并冷冻，用于后续研究。

通过在包含4mM GlutaMAX-1^TM和4.0μM甲氨喋呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞继续进行细胞系的扩增。在第12次传代后，将细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。融化一小瓶RCB并培养在包含8.0μM甲氨蝶呤的培养基中。5天后，培养基中的甲氨蝶呤浓度增加到16.0μM，接着18天后增加到20.0μM。通过在含有包含4mM GlutaMAX-1^TM和20.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基的96孔组织培养板中进行有限稀释克隆出来自包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中的第8次传代的细胞。5-6周后鉴定克隆并选择克隆2B2用于在包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中扩增。第11次传代后，将2B2细胞冷冻在小瓶中用作研究细胞库(RCB)。

所得2B2细胞为表达可溶性人PH20重组体(rHuPH20)的二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)DG44 CHO细胞。可溶性PH20以约206拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20-特异性探针对Spe I-消化的、Xba I-消化的和BamH I/Hind III-消化的基因组2B2细胞DNA进行的DNA印记分析显示以下限制酶切消化特征：用Spe I消化的DNA具有～7.7kb的一条主要杂交带和四条小杂交带(～13.9、～6.6、～5.7和～4.6kb)；用Xba I消化的DNA具有～5.0kb的一条主杂交带和两条小杂交带(～13.9和～6.5kb)；用BamH I/HindIII消化的2B2 DNA观察到～1.4kb的一条单一杂交带。mRNA转录物的序列分析表明所得的cDNA(SEQ ID NO:56)与参比序列(SEQ ID NO:49)相同，除了1311位处的一个碱基对差异，经观察其为胸苷(T)而不是预期的胞嘧啶(C)。这是沉默突变，不影响氨基酸序列。

实施例22

A.在300L生物反应器细胞培养物中制备Gen2可溶性rHuPH20

融化一小瓶HZ24-2B2并通过36L旋转瓶在添加了20μM甲氨蝶呤和GlutaMAX-1^TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中从摇瓶扩增。简而言之，在37℃水浴中融化一小瓶细胞，加入培养基并将细胞离心。将细胞重悬于包含20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37℃、7％CO₂培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩增至40mL。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至125mL旋转瓶中，培养物体积为100mL。将烧瓶在37℃、7％CO₂孵育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至250mL旋转瓶中，培养物体积为200mL，并将烧瓶在37℃、7％CO₂孵育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至1L旋转瓶中，培养物体积为800mL，并于37℃、7％CO₂孵育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至6L旋转瓶中，培养物体积为5000mL，并于37℃、7％CO₂孵育。当细胞密度达到大于1.5x10⁶细胞/mL时，将培养物扩增至36L旋转瓶中，培养物体积为32L，并于37℃、7％CO₂孵育。

将400L生物反应器灭菌并加入230mL CD-CHO培养基。使用前，检查是否污染。将约30L细胞从36L旋转瓶转移至400L生物反应器(Braun中，接种密度为每ml4.0×10⁵活细胞并且总体积为260L。参数为：温度设定点，37℃；叶轮速度40-55RPM；容器压力3psi；空气喷射0.5-1.5L/Min.；空气覆盖：3L/min。每天从生物反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生和保留。并且，在运行期间加入营养物补料。第120小时(第5天)，加入10.4L Feed#1Medium(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1^TM+83mL/LYeastolate+33mg/L rHuInsulin)。第168小时(第7天)，加入10.8L Feed#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1^TM+167mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36.5℃。第216小时(第9天)，加入10.8L Feed#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/LGlutamax-1^TM+250mL/L Yeastolate+1.80g/L丁酸钠)，并将培养温度变为36℃。第264小时(第11天)，加入10.8L Feed#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1^TM+250mL/LYeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度变为35.5℃。观察到加入补料培养基显著增加生产最后阶段可溶性rHuPH20的产生。在第14天或15天或当细胞活力下降至低于40％时收获生物反应器。该方法得到每ml 17,000单位的终生产率，并具有一千两百万细胞/mL的最大细胞密度。收获时，对培养物取样用于支原体、生物负载以及体外和体内病毒、透射电子显微术(TEM)和酶活性的检测。

通过蠕动泵将培养物泵出通过四个并行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，所述模块各包含一层4-8μm级的硅藻土和一层1.4-1.1μm级的硅藻土，然后为纤维素膜，接着通过第二个单一的Millistak过滤系统(Millipore)，其包含一层0.4-0.11μm级的硅藻土和一层<0.1μm级的硅藻土，之后通过纤维素膜，然后通过0.22μm终端滤器进入具有350L容量的无菌一次性软袋。向收集的细胞培养液中添加10mM EDTA和10mM的Tris至pH 7.5。使用四个Sartoslice TFF 30kDa分子量截留(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorius)通过正切流动过滤(TFF)设备将培养物浓缩10×，然后通过与10mM Tris、20mM Na₂SO₄(pH 7.5)的10×缓冲液交换进入0.22μm终端滤器进入50L无菌储存袋。

将已浓缩和透析过滤的收获物进行病毒灭活。病毒灭活前，制备10％Triton X-100、3％三(正丁基)磷酸酯(TNBP)的溶液。在临近Q柱纯化前在36L玻璃反应器中将已浓缩、透析过滤的收获物暴露于1％Triton X-100、0.3％TNBP，持续1小时。

B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化

制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。收集洗涤样品用于pH、电导率和内毒素(LAL)测定法的测量。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na₂SO₄(pH 7.5)平衡柱子。病毒灭活后，将已浓缩、透析过滤的收获物以100cm/hr的流速上样至Q柱。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na₂SO₄(pH 7.5)和10mM Hepes、50mM NaCl(pH 7.0)洗涤柱子。用10mM Hepes、400mM NaCl(pH 7.0)将蛋白质洗脱至0.22μm的终端滤器进入无菌袋。检测洗脱物样品的生物负载、蛋白质浓度和透明质酸酶活性。在交换开始和结束时读取A₂₈₀吸光度读数。

然后进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备Phenyl-Sepharose(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素(LAL测定法)测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl₂(pH 7.0)平衡柱子。向来自Q sepharose柱的蛋白质洗脱物中添加2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl₂储备溶液，以分别得到5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。以100cm/hr的流速将蛋白质上样至PS柱并收集柱流出液。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl₂(pH7.0)以100cm/hr洗涤柱子，并将洗涤液加入收集的流出液中。与柱洗涤液合并，使流出液通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。对流出液进行取样用于生物负载、蛋白质浓度和酶活性的检测。

制备氨基苯基硼酸酯柱(ProMedics)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素(LAL测定法)测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡柱子。以100cm/hr的流速将包含纯化的蛋白质的PS流出液上样至氨基苯基硼酸酯柱。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵(pH7.0)洗涤柱子。用20mM N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、0.5M硫酸铵(pH 9.0)洗涤柱子。用20mMN,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、100mM氯化钠(pH 9.0)洗涤柱子。用50mM Hepes、100mM NaCl(pH6.9)洗脱蛋白质并通过无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。

制备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液并检测pH、电导率和内毒素(LAL测定法)。用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂(pH 7.0)平衡柱子。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质中加入终浓度5mM磷酸钾和0.1mM CaCl₂，并以100cm/hr的流速上样至HAP柱。用5mM磷酸钾(pH 7)、100mM NaCl、0.1mM CaCl₂洗涤柱子。然后用10mM磷酸钾(pH 7)、100mMNaCl、0.1mM CaCl₂洗涤柱子。用70mM磷酸钾(pH7.0)洗脱蛋白质并通过0.22μm无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。

然后将HAP纯化的蛋白质通过病毒移除滤器。首先，通过用2L 70mM磷酸钾(pH7.0)洗涤制备无菌Viosart滤器(Sartorius)。使用前，对已过滤的缓冲液进行取样用于pH和导电率检测。通过蠕动泵将HAP纯化的蛋白质泵出通过20nM病毒移除滤器。将在70mM磷酸钾(pH 7.0)中的已过滤蛋白质通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。检测已过滤病毒的样品的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征。也检测样品的与方法相关的杂质。

然后使用10kD分子量截留(MWCO)Sartocon Slice正切流动过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白质浓缩至10mg/mL。首先通过用10mM组氨酸、130mM NaCl(pH6.0)洗涤来制备滤器，并对渗透物取样用于pH和电导率检测。浓缩后，取样浓缩的蛋白质并检测蛋白质浓度和酶活性。对浓缩蛋白质进行6×缓冲液交换至终缓冲液：10mM组氨酸、130mM NaCl(pH 6.0)。缓冲液交换后，将浓缩的蛋白质通过0.22μm滤器进入20L无菌储存袋。对蛋白质取样并检测蛋白质浓度、酶活性、游离巯基、寡糖特征和重量克分子渗透浓度。

然后将无菌过滤的大量蛋白质以20mL无菌分装质30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)中。然后将小瓶迅速冷冻并保存于-20±5℃。

实施例23

赖氨酰基赖氨酸作为rHuPH20的稳定剂的作用

测试赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys或二赖氨酸)在升高的温度稳定化rHuPH20的能力。如下面在表76中所述，制备8种制剂。作为对照，测试Hylenex^TM(包含167U/mL rHuPH20、12.5mM Na₂PO₄、145mM NaCl、1mg/mL HSA、2.7mM CaCl₂、0.1％EDTA(pH 7.4)；命名为F1)。制备包含170U/mL rHuPH20、0.01％吐温80和不同赋形剂/稳定剂的其余制剂，如表76所示。向每种试验制剂中，加入50、100或150mM浓度的Lys-Lys二盐酸盐(H-Lys-Lys-OH HCl；RnDChem#G-2675)。由于使用盐酸盐形式的Lys-Lys，重量克分子渗透浓度在组合物之间变化，如下面表76中所示。

将所有制剂装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶中，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞并用氧化铝封条密封。将小瓶在3种不同温度(5℃、25℃和40℃)孵育至多3个月。取决于温度，在时间0、1周、2周、1个月、2个月和3个月测试样品(参见表77-79)。在每个测试点，从保温箱取出样品，并如实施例2所述测试透明质酸酶活性。

结果在下面的表77-79中显示，该表描述了以U/mL计的透明质酸酶活性。对于在5℃或25℃储存的样品，观察到rHuPH20活性的微小下降，但是所有样品维持至少135U/mL透明质酸酶活性(表77和78)。此外，没有观察到包含Lys-Lys的组合物和不包含Lys-Lys的组合物之间的透明质酸酶活性的显著差异。对于在40℃储存的样品，所有样品具有随时间降低的酶活性。不包含Lys-Lys的制剂F1和F2具有透明质酸酶活性的最大下降。在40℃2周以后，制剂F1和F2的活性低于135U/mL。在40℃，包含任意浓度的Lys-Lys的制剂都维持它们的活性高于135U/mL持续至少1个月。

实施例24

低浓度的赖氨酰基赖氨酸对rHuPH20稳定性的作用

在升高的温度针对低浓度的赖氨酰基赖氨酸和pH对rHuPH20活性的作用，测试不同的rHuPH20制剂。评价3种不同的Lys-Lys浓度(10、30和50mM)和3种不同的pH(6.5、7.0和7.5)，产生共9种样品。试验制剂在下面的表80中显示。作为对照，测试Hylenex^TM(在实施例23中显示；F1)。制备制剂F2至F10都目标为约160U/mL rHuPH20、10mM L-甲硫氨酸(Spectrum#M1441)和0.01％聚山梨酯80(Baker#4117-04)和不同量的H-Lys-Lys-OH HCl(RnD Chem#G-2675)和NaCl(Baker#3628)。使用1N NaOH(EMD#SX0607H-6)调节pH。调节NaCl浓度，使得所有制剂具有大约相同的重量克分子渗透浓度(300mOsm/Kg)。将所有制剂穿过0.2微米滤器进行无菌过滤。

以0.5mL/小瓶，将所有制剂装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶中，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。将小瓶在40℃孵育至多8周。在时间0和1、2、3、4和8周，测试样品。在每个测试点，从保温箱取出样品，并如在实施例2中所述测试透明质酸酶活性。

结果在下面的表81中显示，该表描述了透明质酸酶活性(U/mL)和相对于时间0的活性比。无论pH如何，制剂F2-F9(都包含Lys-Lys)显示出比参比制剂F1提高的rHuPH20稳定性。在包含10、30或50mM Lys-Lys的样品之间没有观察到显著差异，表明添加10mM Lys-Lys足以提高rHuPH20在40℃的稳定性。与所有具有较低pH(6.5或7.0)的样品相比，具有较高pH(7.5)的制剂具有降低的酶活性。例如，对于具有6.5或7.0的pH的样品，在40℃孵育4周以后的透明质酸酶活性保留高于80％的初始活性，而具有7.5的pH的样品仅保留约70％的初始活性。4周以后，参比rHuPH20样品(F1)保留小于50％的rHuPH20活性。

实施例25

在rHuPH20/胰岛素复合制剂中，赖氨酰基赖氨酸对rHuPH20活性和胰岛素稳定性的作用

评价赖氨酰基赖氨酸的稳定化包含rHuPH20和胰岛素类似物的复合制剂的能力。所述制剂在下面的表82中显示。所有制剂包含600U/mL的rHuPH20、3.5mg/mL的赖谷胰岛素、30mM的Tris HCL、5mM的甲硫氨酸、0.001％的聚山梨酯20(pH 7.2)和作为防腐剂的0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚(EP-B的防腐剂水平)。制剂F5、F1、F2和F3包含50mM的NaCl和分别0mM、20mM、40mM和80mM的Lys-Lys。制剂F4包含更高浓度的NaCl(140mM)，并且不包含Lys-Lys。用NaCl将制剂F3和F4的重量克分子渗透浓度调至大约相同。

将每种制剂等分成1.0mL，并装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。在5℃和37℃孵育小瓶。在第3和6天取出样品，并测试透明质酸酶酶活性、pH、重量克分子渗透浓度和外观，如在实施例2和3中所述。

加入赖氨酰基赖氨酸没有影响外观，因为所有制剂是澄清且无色的，没有可见的颗粒，表明胰岛素稳定。试验制剂的透明质酸酶活性(从标准曲线外推)在下面的表83中显示。在5℃孵育6天以后，所有制剂保留透明质酸酶活性。在37℃3天以后，仅制剂F3(其包含80mM Lys-Lys)保留一些透明质酸酶酶活性。在37℃6天以后，F3已经丧失大部分透明质酸酶酶活性。当控制重量克分子渗透浓度大致相当时(如在制剂F3和F4中)，Lys-Lys是比NaCl更好的rHuPH20稳定剂，如增加的透明质酸酶活性所证实。

实施例26

在rHuPH20/胰岛素复合制剂中，赖氨酰基赖氨酸和NaCl对rHuPH20稳定性的作用的对比

对于赖氨酰基赖氨酸和NaCl对rHuPH20稳定性的作用，测试胰岛素和rHuPH20的复合制剂。将试验制剂制成具有相同离子强度，但是一种制剂包含赖氨酰基赖氨酸和NaCl，另一种制剂仅包含NaCl。具体地，制备3组具有不同离子强度水平的赖谷胰岛素和rHuPH20制剂。制剂在下面的表84中显示。所有制剂包含600U/mL的rHuPH20、3.5mg/mL的赖谷胰岛素、30mM的Tris HCL、5mM的甲硫氨酸、0.001％的聚山梨酯20(pH 7.2)和作为防腐剂的0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚(EP-B的防腐剂水平)。制剂F1、F3和F5包含如下面的表84所示的赖氨酰基赖氨酸和NaCl。制剂F2、F4和F6仅包含NaCl。测试制剂的实际pH和重量克分子渗透浓度。

将每种制剂等分成1.0mL，并装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。在5℃和30℃孵育小瓶至多4周。在第6天以及2周和4周后取出样品，并测试透明质酸酶酶活性，如在实施例2中所述。

结果在下面的表85中显示，该表描述了在测试当天的透明质酸酶酶活性(U/mL)以及相对于在T0表现出的活性的透明质酸酶活性百分比(相对于T0的百分比)。基于相对于T0的相对活性，进行响应于孵育时间、赖氨酰基赖氨酸浓度和离子强度的rHuPH20酶活性的多变量分析，并通过JMP v.8.02(SAS Institutes)进行分析。与具有较低离子强度的制剂(F1和F2)相比，具有较高离子强度的制剂(F5和F6)保留更高的透明质酸酶酶活性(p<0.001)。此外，包含赖氨酰基赖氨酸的制剂具有比不含赖氨酰基赖氨酸的制剂明显更高的活性(p＝0.04)。透明质酸酶酶活性损失速率与离子强度负相关，表明较高的离子强度可以显著降低降解速率。对于在相同离子强度的溶液(例如F5和F6)，在2周时间以后没有观察到显著差异，但是在30℃4周以后，观察到透明质酸酶酶活性的显著差异，包含赖氨酰基赖氨酸的F5保留91％的活性，但是不包含赖氨酰基赖氨酸的F6仅保留75％的活性。对于较低离子强度的制剂观察到相同的趋势，与不含赖氨酰基赖氨酸的制剂相比，包含赖氨酰基赖氨酸的制剂具有增加的活性。

实施例27

赖氨酰基赖氨酸作为缓冲剂的作用和温度对rHuPH20/胰岛素复合制剂的pH变化的作用

通过用赖氨酰基赖氨酸替代Tris，评价赖氨酰基赖氨酸在包含rHuPH20和胰岛素的复合制剂中用作缓冲剂的能力。所述试验制剂在下面的表86中显示。将所有制剂制备成包含600U/mL的rHuPH20、3.5mg/mL的赖谷胰岛素、5mM的甲硫氨酸、0.001％的聚山梨酯20(pH 7.2)和作为防腐剂的0.1％的苯酚和0.15％的间甲酚(EP-B的防腐剂水平)。每种制剂包含30、50、80或105mM的赖氨酰基赖氨酸(Biopeptide,G-2675,批号1037762)。没有制剂包含Tris HCl。加入NaCl将最终重量克分子渗透浓度调至380±30mOsm。

将每种制剂等分成1.0mL，并装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。在5℃和37℃孵育小瓶。在第1、4和6天取出样品，并如实施例2和3所述测试透明质酸酶酶活性、pH和重量克分子渗透浓度。还通过制备随着加入的滴定剂(1N NaOH；EMD,目录号SX0607H-6，批号HC067239)的量而变化的pH的滴定曲线，测试每种制剂以评价赖氨酰基赖氨酸用作pH6.5-8.0的目标pH范围的缓冲剂的能力。

结果在表87中显示，该表描述了重量克分子渗透浓度和透明质酸酶酶活性。如之前的实施例所证实的，Lys-Lys稳定化制剂中的rHuPH20，因为透明质酸酶活性随着Lys-Lys浓度升高而更少地下降。此外，在类似的离子强度水平，赖氨酰基赖氨酸能够比NaCl更强地稳定化rHuPH20。

下面的表88描述在不同温度的pH和温度对pH的作用。用NaOH滴定赖氨酰基赖氨酸揭示，赖氨酰基赖氨酸可以在6.5-8.0的pH范围内用作缓冲剂，特别是在较高浓度(例如80或105mM)。如表88所示，温度效应(dpH/dT)或pH变化与温度变化之比保持恒定在-0.033U/℃，这稍微高于对于Tris所报道的值(-0.028U/℃)。理想的缓冲剂具有较大的温度效应，因为在较低的储存温度(例如2-8℃)，胰岛素受益于较高pH，而在较高的温度，rHuPH20受益于较低的pH。因此，证实赖氨酰基赖氨酸是包含胰岛素和rHuPH20的制剂中的最优缓冲剂和稳定剂。

实施例28

在5℃、30℃和37℃包含赖氨酰基赖氨酸的胰岛素复合制剂中的rHuPH20随时间的稳定性

测试赖氨酰基赖氨酸稳定化包含USP水平的防腐剂的胰岛素类似物-rHuPH20复合制剂的能力。所述制剂在下面的表89中显示。每种制剂包含600U/mL的rHuPH20、3.5mg/mL的胰岛素类似物(赖谷胰岛素或门冬胰岛素)、5mM的甲硫氨酸、0.001％的表面活性剂(泊洛沙姆188或聚山梨酯20)和USP水平的防腐剂(0.125％的苯酚和0.075％的间甲酚)。对于每种胰岛素类似物，2种制剂pH为7.0，2种制剂pH为7.2。此外，在每种pH，一种制剂仅包含100mM的赖氨酰基赖氨酸，而另一种制剂包含30mM的NaCl和80mM的赖氨酰基赖氨酸。作为门冬胰岛素的对比，制备包含30mM的Tris/HCl的F9。

将每种制剂等分成1.0mL，并装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，所述小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。在5℃、30℃和37℃孵育小瓶至多4周。取出如在表90和91中所示的样品，并如在实施例2中所述测试rHuPH20酶活性。结果在下面的表90和91中显示，所述表描述了以U/mL计的透明质酸酶酶活性。

*F68＝泊洛沙姆188(

F68)；PS20＝聚山梨酯20。

1.rHuPH20-赖谷胰岛素复合制剂

如表90所示，对于rHuPH20-赖谷胰岛素制剂，在5℃和30℃，所有制剂的透明质酸酶活性保持恒定。在37℃，在所有制剂中观察到透明质酸酶活性随时间的下降。在测试的时间段内，确定制剂是稳定的，因为制剂都不具有低于375U/mL的透明质酸酶活性。

2.rHuPH20-门冬胰岛素复合制剂

如表91所示，对于rHuPH20-门冬胰岛素制剂，所有制剂在5℃稳定，持续多达3个月。在30℃，所有包含赖氨酰基赖氨酸的制剂稳定持续多达4周，而制剂F9(不包含Lys-Lys)表现出透明质酸酶活性的损失。在37℃，所有制剂具有随时间降低的透明质酸酶活性，下降速率取决于制剂。例如，在37℃6天以后，制剂F5(具有100mM Lys-Lys和pH 7.0)具有比制剂F8(具有80mM Lys-Lys和pH 7.2)更高的活性。在该时间点和温度，不包含赖氨酰基赖氨酸的制剂F9丧失几乎全部透明质酸酶活性。

实施例29

在搅拌和热应力下，人血清白蛋白(HSA)或赖氨酰基赖氨酸对rHuPH20的稳定性的作用

在加速条件(包括搅拌和热应力)下，测试rHuPH20制剂的稳定性。所述制剂在下面的表92中显示。每种制剂包含160U/mL的rHuPH20、12.5mM的磷酸钠(pH 7.0)和145mM的NaCl。每种制剂另外包含人血清白蛋白(HSA)、CaCl₂、EDTA、聚山梨酯80、甲硫氨酸和赖氨酰基赖氨酸中的一种或多种，如下面表92中所示。

将每种制剂等分成1.5mL，并装入2mL USP 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，该小瓶具有13mm 4432/50灰色橡胶塞，并用氧化铝封条密封。在研究中排除包含可见颗粒的小瓶。在搅拌和热应力下测试制剂。对于搅拌研究，将每种制剂的2个样品在25℃孵育并在650rpm搅拌72小时。对于热应力研究，将每种制剂的4个样品在40℃孵育至多4周，每周取样。

如在实施例2中所述，测试所有样品的透明质酸酶活性。使用MicroFlow Imaging(MFI)，检测不溶性和可溶性颗粒的存在。为此，用Micro-Flow Imaging instrumentModel4200(Brightwell Technologies,Inc.,Ottawa,Canada)，测量每种rHuPH20制剂或对照样品。在每次运行之前，穿过0.22微米滤器过滤空白缓冲液，并冲洗系统以提供清洁背景并优化照明。为了平衡系统，在分析之前分配至少2mL样品。使用蠕动泵以170μL/min的流速流过1ml样品。放大率设置为5X，以能够检测在1-100μm范围内的颗粒，具有100μm的分析深度场。对颗粒计数，并由机器自动地记录，以颗粒数/mL报告。使用包含rHuPH20，但是没有经过搅拌的缓冲液和/或制剂作为对照。还如在实施例4中所述，进行尺寸排阻色谱法。结果在下面的表93-95中显示。

1.透明质酸酶活性

表93描述透明质酸酶活性(U/mL)和相对于时间0(T0)的活性百分比。结果表明，在40℃8天以后，与包含HSA的制剂F1、F2和F3相比，不包含HSA的制剂(F4、F5和F6)具有降低的透明质酸酶活性。在40℃15天以后，包含Lys-Lys的制剂F7保留最高水平的透明质酸酶活性。

搅拌应力后，包含至少0.04％的聚山梨酯80和10mM的甲硫氨酸的制剂保留透明质酸酶活性，包含Lys-Lys的制剂也是如此。制剂F1-F4具有轻微降低的透明质酸酶活性。总之，制剂F7(包含Lys-Lys)在热应力测试和搅拌测试下表现出最大保留的rHuPH20酶活性。

2.聚集的蛋白质或不溶性聚集体的存在

表94描述以颗粒数目/mL计，每个微米尺寸范围的颗粒数(不溶性聚集体)。例如，使用MFI测试的微米尺寸范围是：颗粒(p)大于5微米(μm)，但是小于10μm(5≤p<10)、10≤p<25、25≤p<50和p≥50。制备不包含rHuPH20的F1和F4的对照制剂，F2、F4和F6样品的对照制剂是没有被搅拌的相同制剂。

HSA的存在或缺失不影响未搅拌的对照样品，各自具有大约相同的颗粒数。搅拌后，包含HAS，但是缺少聚山梨酯80的制剂(F1和F2)具有比所有其它制剂明显更多的颗粒，所述其它制剂包括F3，其与F2的唯一差别在于加入聚山梨酯80。加入更多聚山梨酯80(F5和F6相对于F4)在减少聚集体形成中没有显著作用。包含Lys-Lys的制剂F7在搅拌后具有最小数目的不溶性聚集体。

p-粒度(微米)

3.尺寸排阻色谱法

还通过尺寸排阻色谱法测量可溶性聚集体。表95描述以mAu*min计的可溶性聚集体(高分子量聚集体)和总峰面积的百分比。制剂F4至F7包含过少的蛋白质以致于通过尺寸排阻色谱法不可检测。包含HSA的制剂F1-F3在25℃搅拌以后表现出低水平的高分子量聚集体。加入聚山梨酯80减少聚集体的总数(F3相对于F1或F2)。

HMW＝高分子量

由于修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，所以本发明仅由随附的权利要求的范围来限定。

Claims (20)

1.组合物，其包含：

表面活性剂；

抗氧化剂；

治疗有效量的透明质酸酶；和

赖氨酰基赖氨酸(Lys-Lys)，其量足以使得所述透明质酸酶比除了其中不包含所述Lys-Lys之外均相同的组合物中的透明质酸酶更稳定，其中所述Lys-Lys浓度是5mM-300mM，包括端值。

2.权利要求1的组合物，其中所述Lys-Lys浓度是5mM-120mM，包括端值。

3.权利要求1的组合物，其中所述Lys-Lys浓度是50mM-150mM，包括端值。

4.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸酶的浓度为至少30U/mL。

5.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸酶的浓度为10U/mL-20,000U/mL，包括端值。

6.权利要求1的组合物，其中所述表面活性剂的量作为在所述组合物中的质量浓度w/v百分比是0.0005％-1.0％，包括端值。

7.权利要求1的组合物，其中所述表面活性剂选自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。

8.权利要求6的组合物，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80。

9.权利要求1的组合物，其被缓冲至pH范围为6.5-8.0，包括端值，其中缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐和柠檬酸盐。

10.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸酶是在中性pH具有活性的可溶性透明质酸酶。

11.权利要求10的组合物，其中所述可溶性透明质酸酶为可溶性PH20多肽，其选自羊PH20、牛PH20和可溶性人PH20，其中所述可溶性人PH20缺少所有或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚结合序列。

12.权利要求11的组合物，其中所述PH20多肽由在SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中任一个所示的氨基酸序列组成。

13.权利要求11的组合物，其中所述可溶性透明质酸酶是C-端截短的PH20，其由在SEQID NO：4-9中任一个所示的氨基酸序列组成，并且其是可溶性并且在中性pH具有活性的。

14.权利要求5的组合物，其中所述透明质酸酶的浓度为10U/mL-5,000U/mL，包括端值。

15.权利要求1的组合物，其中：

所述组合物的pH是6.5-7.2；并且

所述组合物包含：

量为100U/mL-500U/mL的透明质酸酶，包括端值；

浓度为5mM-30mM的Lys-Lys，包括端值；

浓度小于140mM的NaCl；

质量浓度w/v百分比(％)为0.01％-0.05％的表面活性剂，包括端值，所述表面活性剂为聚山梨酯80；

浓度为5mM-20mM的甲硫氨酸，包括端值；和

浓度为5mM-50mM的磷酸钠，包括端值。

16.权利要求1的组合物，其中所述抗氧化剂的浓度为5mM-50mM，包括端值。

17.权利要求1的组合物，其中所述Lys-Lys浓度是30mM-120mM，包括端值。

18.权利要求16的组合物，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。

19.权利要求1的组合物，其被缓冲至pH范围为6.5-8.0，包括端值。

20.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述组合物用于多剂量给药，并且包含抗微生物有效量的防腐剂或多种防腐剂的混合物。