CN1802432A - 昆虫胰凝乳蛋白酶及其抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及一种新的胰凝乳蛋白酶，其对植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂展示抗性。更具体地，本发明提供了一种胰凝乳蛋白酶，当进食花烟草(Nicotiana alata)的丝氨酸蛋白酶抑制剂时，其在棉铃虫和澳洲棉铃虫昆虫幼虫肠道中被上调。因此，该新胰凝乳蛋白酶代表了拮抗剂鉴别的靶，所述拮抗剂包括被提议可有效地用于对照棉铃虫的种的抑制剂，所述棉铃虫种群形成了植物中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂抗性。所述胰凝乳蛋白酶拮抗物可以局部应用到植物，或者，当处于蛋白质形式时，可以在植物细胞中以遗传方式产生。所述拮抗物可以在基因表达或蛋白质活性水平上发挥作用。

Description

昆虫胰凝乳蛋白酶及其抑制剂
发明背景
发明领域
本发明通常涉及一种新的胰凝乳蛋白酶，其对植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂展示抗性。更具体地，本发明提供了一种胰凝乳蛋白酶，当进食花烟草(Nicotiana alata)丝氨酸蛋白酶抑制剂时，其在棉铃虫(Helicoverpa armigera)和澳洲棉铃虫(Helicoverpapunctigera)昆虫幼虫的肠道中被上调。因此，该新胰凝乳蛋白酶代表了用于识别拮抗物的靶，所述拮抗剂包括被提议可有效地用于对照棉铃虫的种(Helicoverpa spp.)群体的抑制剂，该群体已形成了对在植物中产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗性。胰凝乳蛋白酶的拮抗物可以局部应用到植物，或者，当处于蛋白质的形式时，可以在植物细胞中通过遗传的手段产生。拮抗物可以在基因表达或蛋白质活性的水平上发挥作用。
现有技术的描述
也将在本说明书中提到的出版物的文献细节收集在说明书最后。
在本说明书中，对任何现有技术的参考不是而且也不应该被视为承认或任何形式的暗示该现有技术构成了任何国家的公知常识的一部分。
观赏性烟草，花烟草，的雌性生殖组织和受损叶片积聚了大量的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PI)，用于预防害虫和病原体(Atkinson等，植物细胞5：203-213，1993)。这些6kDa的PI积聚在液泡中(Miller等，植物细胞11：1499-1508，1999)，并源于体内40.3kDa前体蛋白质的翻译后修饰。PI蛋白质的前体(称为“NaPI”)由高序列同一性的6个重复区域组成(图1)，每一个都具有潜在的PI反应位点。对该6个重复的前体蛋白质的加工出乎意料地发生在重复区域内而不是重复区域之间的位点。完全去除包含在每一重复区域内的连接体序列(Glu-Glu-Lys-Lys-Asn)[SEQ ID NO：1]产生了5个邻近的6kDa抑制剂(C1和T1-T4)以及一个新的双链胰凝乳蛋白酶抑制剂(C2)，其由N端和C端肽片段的二硫键连接形成(Heath等，EuropeanJournal of Biochemistry 230(1)：25-257，1995；Lee等，NatureStructural Biology 6(6)：526-530，1999)。已采用1H-NMR技术研究了C1、T1-T4和C2的结构(Nielson等，J.Mol.Biol.242：231-243，1994；Nielson等，Biochemistry 34：14304--14311，1995；Lee等，1999，出处同前)。
花烟草也具有与NaPI相关的第二基因，其编码了密切相关的前体蛋白质，具有4个而不是6个重复域(Miller等Plant Mol.Biol.42：329-333，2000)。该前体也在体内被加工，导致释放3个邻近的6kDa抑制剂(C1、T4和T5)和双链抑制剂C2(图1)。三个抑制剂(C1、C2和T4)与从6个域的前体释放的那些相同。已经为其它茄科植物包括烟草(N.tabacum)(Balandin等，Plant Mol.Biol.27：1197-1204，1995)、N.glutinosa(Choi等，Biochim.etBiophys.Acta 1492：211-215，2000)、L.esculentum(Taylor等，Plant Mol.Biol.23：1005-1014，1993)和Capsicum annum(Moura和Ryan，Plant Physiol.126：289-298，2001；Antcheva等，Protein Sci.10：2280-2290，2001)描述了相关的多域前体。
几个研究组已经报道了丝氨酸蛋白酶抑制剂对昆虫消化蛋白酶活性的影响并暗示出它们由植物产生，用于预防昆虫害虫和微生物的破坏性作用(Ryan，Annu.Rev.Phytopathol.28：425-449，1990；Gatehouse等，用于农作物保护的植物基因操作，农业生物技术，No.7，Eds.Gatehouse，Hilder & Boulter，International U.K.，pp.155-181，1992)。专门进食一种特定宿主植物的昆虫通常对该植物产生的丝氨酸PI具有抵抗力，但对非宿主产生的PI敏感(Broadway和Villani，Entomol.Expo.Appl.76：303-312，1995；Broadway，J.Insect.Physiol.41：107-116，1995)。因此，有兴趣将编码丝氨酸P I的基因从非宿主移入农作物以增强抗虫性，并降低对化学杀虫剂的依赖性。近来，然而，几个研究组已报道了摄食大量PI后，某些昆虫具有可改变蛋白水解酶在其中肠内的相对比例的能力(Broadway，1995，出处同前；Jongsma等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(17)：8041-8045，1995a)。例如，Broadway(1995，出处同前)发现某些鳞翅目昆虫可产生两类主要的胰蛋白酶样蛋白酶，其一对来自甘蓝叶的PI不敏感。摄食甘蓝PI后，昆虫增加了不受PIs影响的那类胰蛋白酶的生产，并因此能够不受阻碍地生长和发育。Jongsma及其合作者(1995，出处同前)采用进食来自马铃薯(PotII)和烟草的PI的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫进行了类似观察。在这些条件下，调节这些蛋白酶分泌的因素是未知的。
这些研究显示，对于长期的植物保护，专用于昆虫肠道中的一种或两种蛋白酶的PI将具有有限的用途。在转基因植物中，编码花烟草PI的基因比其它植物的PI对于增强抗虫性具有潜在的优势。大多数植物丝氨酸PI仅含有一个或两个抑制域，而花烟草PI前体具有4个或六个(图1)。因此，有潜能设计花烟草PI的各个域以提供对抗昆虫肠道中的几种蛋白酶的抑制活性。
已经部分表征了几种鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)和直翅目(Orthoptera)的中肠蛋白酶。在大多数鳞翅目物种中，内蛋白酶活性主要是由于丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶)，并且半胱氨酸和金属蛋白酶是不可检测的(Christeller等，Insect Biochem.Molecul.Biol.22：_735-746，1992；Terra和Ferreira，Comp.Biochem.Physiol.109：1-62，1994；Xu和Qin，J.Econ.Entomol.87：334-338，1994；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25：63-71，1995a；Johnston等，Insect Biochem.21：389-397，1991；Johnston等，Insect Biochem.Molec.Biol.25(3)：375-383，1995)。也已经识别了外肽酶和亮氨酸氨肽酶(Christeller等，1992，出处同前；Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25(1)：49-61，1995b)。
仅部分理解PI对昆虫的作用机理。描述了3种反应：
(i)严重延缓了生长，但肠道蛋白水解活性不减弱。Broadway和Duffey(J.InsectPhysiol.32：673-680，1986a；Broadway和Duffey，J.Insect Physiol.32：827-833，1986b)发现进食PI的昆虫具有显著减小的生长率，这与肠道中总蛋白水解活性的降低无关。事实上，肠道蛋白水解活性经常增加。他们暗示出一种反馈机理在起作用，其引起过量产生蛋白酶，并依次导致损耗含有硫的氨基酸。对于其它昆虫，在长期摄食PI后，已经纪录了这种现象(Burgess等，Entomol.Exp.App.61：123-130，1991；De Leo等，Plant Physiol.118：997-1004，1998；Markwick等，J.Economic Entomology 91(6)：1265-76，1998)。
(ii)严重延缓了生长，同时肠道中蛋白水解活性降低。Broadway(1995，出处同前)发现鳞翅目物种小地老虎(Agrotis ipsilon)(黑切根虫)在暴露于大豆胰蛋白酶抑制剂后减小了生长并延缓了化蛹，并且通过分泌PI不敏感蛋白酶不响应。这些昆虫的全部肠道蛋白水解活性降低70％。进食“弹性蛋白酶抑制剂”的幼鳕蛾幼虫(鳞翅目：卷蛾科)也延缓了生长和发育，这与肠道中弹性蛋白酶活性的减弱有关(Markwick等，Journal of Economic Entomology 88(1)：33-39，1995)。
(iii)补充肠道蛋白酶对生长变化无影响。一些昆虫可以通过诱导一种新蛋白酶活性补偿对一组蛋白酶的抑制。鳞翅目昆虫的基因组含有一定范围的丝氨酸蛋白酶基因，并且昆虫可以修改特异性同功酶的表达以适合饮食成分(Bown等，Insect Biochem.Molec.Biol.27：625-638，1997；Broadway，J.Insect.Physiol.43(9)：855-874，1997)。已经采用Northern印迹分析对来自棉铃虫、玉米夜蛾(H.zea)和小地老虎(Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31：645-657，2001a；Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31：633-644，2001b)的RNA检测了补充肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶时的变化(Bown等，1997，出处同前；Gatehouse等，InsectBiochem.Molecul.Biol.27：929-944，1997)。对于棉铃虫(Harsulkar等，Insect Physiol.121：497-506，1999；Patankar等，Insect Biochem.& Mol.Biol.31：453-464，2001)、Spodopterafrugiperda(Paulillo等，J.Econ.Entomol.93：892-896，2000)、玉米夜蛾和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Broadway，Arch.InsectBiochem.Physiol.32(1)：39-53，1996)，也已经通过采用电泳分离同功酶观察了在蛋白质水平上的相应变化。有时，特异性同功酶被上调，并且偶而观察到先前未检测到的蛋白酶。
近来，Mazumdar-Leighton和Broadway(2001a，出处同前)证明了在转录水平上调节玉米夜蛾中的PI不敏感胰蛋白酶的产生，并可以利用转录调节剂放射菌素取消。Broadway及其同事检查到当玉米夜蛾和粉纹夜蛾幼虫进食含有1％SBTI的人工食物48h后肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的变化(Broadway，1996，出处同前)。摄食SBTI后，胰蛋白酶活性增加，并且酶谱上的蛋白酶带型显示了相对补充蛋白酶的变化。研究人员表明SBTI在体外可以抑制来自对照幼虫的肠道提取物中74％的胰蛋白酶活性，但在消耗SBTI的幼虫中仅为3％的肠道胰蛋白酶活性。它们暗示出酶谱上的新蛋白酶带(对于玉米夜蛾为1个新带，并且对于粉纹夜蛾为6个新带)可能为SBTI不敏感的胰蛋白酶或SBTI不敏感的胰凝乳蛋白酶，并推断出通过摄食SBTI而增强这些新蛋白酶的产生。玉米夜蛾和小地老虎采用Northern印迹分析进行的进一步研究显示出摄食SBTI导致编码胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的mRNAs转录诱导(Mazumdar-Leighton和Broadway，2001a，出处同前；Mazumdar-Leighton和Broadway，2001b，出处同前)，尽管不确定这些蛋白酶是否是对SBTI不敏感的。
摄食SBTI后，在玉米夜蛾中诱导的新胰蛋白酶转录物被称为HzT15(Mazumdar-Leighton和Broadway，2001b，出处同前)。近来，从玉米夜蛾肠道纯化对几种蛋白酶抑制剂不敏感的第一昆虫消化酶，相应于由HzT15编码的蛋白质(Volpicella等，Eur.J.Biochem.270：10-19，2003)。作者鉴定出在横跨相对于PI抑制性胰蛋白酶的这种对PI不敏感的胰蛋白酶结构模型表面之电荷分布方面的几个区别，但是不能确定引起抗性的结构变化。
直到近来，一直假定胰凝乳蛋白酶对鳞翅目中蛋白质消化的贡献相当小，并且因而大多数生化研究集中于表征胰蛋白酶。该问题的提出是由于最初使用了适用于哺乳动物但根本或不适用于鳞翅目酶的胰凝乳蛋白酶的合成底物。鳞翅目胰凝乳蛋白酶优选具有至少4个氨基酸的合成底物，以占据酶上的S1-S4结合亚位，而哺乳动物胰蛋白酶在具有特异于S1结合位点的1个氨基酸的较短底物上有活性。即，昆虫胰凝乳蛋白酶看来具有伸长的底物结合位，需要至少4个氨基酸用于有效的分析。最近的研究已表明胰凝乳蛋白酶确实对PI摄食进行响应，并值得更详细的研究。当来自棉铃虫的幼虫进食由马铃薯蛋白酶抑制剂II、大豆胰蛋白酶抑制剂、aprotin(胰蛋白酶抑制剂)或马铃薯蛋白酶抑制剂I中任一种组成的食物时，在所有的情况下，胰凝乳蛋白酶mRNA的水平增加，而胰蛋白酶mRNA降低(Gatehouse等，1997，出处同前)。其它报道也提到优先于胰蛋白酶上调胰凝乳蛋白酶(Bown等，1997，出处同前；Wu等，Molecular Breeding 3：371-380，1997)。Mazumdar-Leighton和Broadway(2001a，出处同前)在玉米夜蛾幼虫肠道中检测到胰凝乳蛋白酶活性，并发现SBTI抑制95％的来自对照昆虫肠道的胰凝乳蛋白酶，但是仅抑制35％的来自预先暴露于食物中的SBTI的昆虫肠道的活性。
因此，在补充肠道蛋白酶时，摄食蛋白酶抑制剂可以引起强烈的变化，其允许昆虫适应食物并存活。在进食人工食物和转基因植物的昆虫中，暴露于PI后，已经检测到在补充蛋白酶时的变化。调节这些变化的开关仍然是未知的，并且响应随物种、PI及其浓度以及基本食物而变。不清楚为什么一些抑制剂诱导这种响应而其它的则不诱导。然而，很清楚，一些幼虫在遗传上预先适应了PI，这是由于预先暴露于一种特定抑制剂对于待产生抗性的昆虫不是必需的(Broadway，1996，出处同前)。
需要确定和研究对PI不敏感的新昆虫蛋白酶，并利用这些来筛选蛋白酶拮抗物，以便研制可有效地用于对照昆虫生长、维持、发育和/或存活的试剂。
发明概述
贯穿整个说明书，除非上下文另有需要，词语“包括”或变形如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所述的元素或整数或元素组或整数组，但并不排除任何其它元素或整数或元素组或整数组。
核苷酸和氨基酸序列用一种序列标识符数目(SEQ ID NO：)表示。SEQ ID NO：在数字上相应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。表1中提供了所有的序列标识符。在说明书末尾提供了序列表。
本发明提供了一种来自棉铃虫的种的新胰凝乳蛋白酶，本文中称为“HpCh5”。提及“HpCh5”包括所有的变体、衍生物、同系物和类似物，以及胰凝乳蛋白酶的HpCh5家族成员。HpCh5变体的例子包括蛋白酶抑制剂(PI)的敏感形式。这种敏感形式尤其可以在第192位携带天冬酰胺或谷氨酰胺，取代精氨酸。本文中，采用单一氨基酸命名法，这种取代称为“R192N/Q”，或采用3字母的氨基酸代码，称为“Arg 192 Asn/Gln”。HpF5的其它衍生物包括HpF5的信号序列。
HpCh5胰凝乳蛋白酶由一种被称为“HpF5”的核苷酸序列编码。同样，提及“HpF5”包括其变体、同系物及类似物。术语“HpF5”包括染色体组序列以及cDNA序列。HpCh5的氨基酸序列如SEQ IDNO：2表示。N端活性肽的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：3。HpF5的编码区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：4表示，编码活性肽的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：5，并且其全部的5’-3’序列显示为SEQ ID NO：6。HpCh5通常被表征为基本上对来自花烟草的PI的抑制不敏感。
HpCh5的变体和同系物包括在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少75％的氨基酸同一性的分子。HpF5的变体和同系物包括在最佳比对后具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少约75％的相似性的核苷酸序列，或者在低严格条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的一种核苷酸序列。
相应地，本发明一方面提供了包含核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码来自棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI展示抗性。
本发明另一方面提供了从棉铃虫的种分离的胰凝乳蛋白酶。其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI展示抗性，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物。
本发明提供的化合物可抑制HpCh5或其变体以及HpCh5胰凝乳蛋白酶家族的同系物或成员，或可抑制HpF5基因或其变体和同系物的表达。
化合物可以为化学类型的化合物，如喷洒或施加到植物的那些，或者为基因类型的分子，其可以局部施加或在植物细胞中生成。HpCh5或HpF5拮抗物也可以为现有植物PI的修饰形式。
因此，本发明提供的方法通过应用或分散HpCh5活性或HpF5基因表达的拮抗物，用于抑制植物的虫害，或用于延缓昆虫生长和发育。
拮抗物包括结合并抑制HpCh5的化合物以及由植物细胞产生并随后被昆虫摄入的反义或有义核酸分子。
提及″拮抗物″包括提及抑制剂。
本发明还提供了遗传修饰的植物，其被设计以产生HpCh5或HpF5拮抗物。提及“植物”包括单子叶植物或双子叶植物，并可以为从遗传转化的愈伤组织或组织或该植物的后代再生的植物。本发明还提供了来自本发明的遗传修饰的植物的种子和其它生殖物质。
本文中预期的植物包括棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李属、高粱属植物、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、木豆、鹰嘴豌豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(Dianthus)(观赏用植物)和天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、紫花苜蓿、羽扇豆、蚕豆、青豆、花生、菜籽油、金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花、蜡菊属(Helichrysum)(观赏用植物)、小麦、大麦、燕麦、黑小麦、胡罗卜、洋葱兰科植物、蔷薇属和/或矮牵牛花。
本发明还提供了编码马铃薯来源的蛋白酶抑制剂的核酸分子，例如但不局限于Pot1A和Pot1B或其同系物或衍生物，以及包括并能够表达相同的转基因植物。
本发明另一方面构思了一种用于筛选昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂的方法，所述昆虫胰凝乳蛋白酶对NaPI如HpCh5的抑制不敏感。该方法通常涉及在存在潜在抑制剂时检测胰凝乳蛋白酶活性。方便地在体外进行接触分析，尽管棉铃虫和/或澳洲棉铃虫的用途也包括在本发明中。本发明也预期采用该分析识别的分离抑制剂。
表1中提供了贯穿说明书使用的所有序列标识符。
                               表1
                        所有的序列标识符
 SEQ ID NO：   说明
 1   连接体序列
 2   HpCh5的氨基酸序列[图12]
 3   HpCh5的活性肽的氨基酸序列[图12]
 4   HpF5的成熟胰凝乳蛋白酶域的编码区域的核苷酸序列[图12]
 5   HpF5的活性肽的核苷酸序列[图12]
 6   与3’UTR一起编码活性肽和HpCh5成熟胰凝乳蛋白酶域的核苷酸序列[图12]
 7   BamHI寡核苷酸引物
 8   HindIII寡核苷酸引物
 9   对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶HpCh5的N端序列[表7，图11B]
 SEQ ID NO：   说明
 10   Fw2ResChy引物[表7，图11B]
 11   FwResChym引物[表7，图11B]
 12   Hc 35PQE-60-Fw引物
 13   Hc 35PQE-60-Rv引物
 14   基因特异性有义引物
 15   基因特异性反义引物
 16   StPotIA有义引物
 17   StPotIB有义引物
 18   StPotIA/B反义引物
 19   FWBacRECH1(5’-3’)引物
 20   FWBacRECH2(5’-3’)引物
 21   RvRECH(3’-5’)引物
 22   来自花烟草的6域PI前体的N端氨基酸序列[图1C]
 23   来自花烟草的6域PI前体的C1肽氨基酸序列[图1C]
 24   来自花烟草的6域PI前体的T1肽氨基酸序列[图1C]
 25   来自花烟草的6域PI前体的T2和T3肽氨基酸序列[图1C]
 26   来自花烟草的6域PI前体的T4肽氨基酸序列[图1C]
 27   来自花烟草的6域PI前体的C端氨基酸序列[图1C]
 28-31   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽片段的氨基酸序列[图5B]
 32   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72966)[图7]
 33   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72959)[图7]
 34   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72960)[图7]
 35   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72958)[图7]
 36   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72952)[图7]
 37   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(CAA72951)[图7]
 38   FWG1引物[图8]
 39   RVG4引物[图8]
 40   Y79Fw引物[图8]
 41   Y72Fw引物[图8]
 42   Y72Rv引物[图8]
 43   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(F1Apcr)[图9]
 44   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(F1Bpcr)[图9]
 45   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(F2Bpcr)[图9]
 SEQ ID NO：   说明
 46   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(F3pcr)[图9]
 47   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(F4pcr)[图9]
 48   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh1AI)[图10]
 49   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh1BI)[图10]
 50   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh2A)[图10]
 51   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh2B)[图10]
 52   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh3A)[图10]
 53   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh4I)[图10]
 54   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh4II)[图10]
 55   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(Rech1a)[图11A]
 56   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(Rech1b)[图11A]
 57   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族1a)[图11A]
 58   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族1b)[图11A]
 59   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族2b)[图11A]
 60   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族2a)[图11A]
 61   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族3)[图11A]
 62   来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的肽的氨基酸序列(族4)[图11A]
 63   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh1AI)[图13]
 64   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh1BI)[图13]
 65   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh2B)[图13]
 66   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh2A)[图13]
 67   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh3)[图13]
 68   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh4I)[图13]
 69   澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列(HpCh5)[图13]
 70   人脑胰蛋白酶的氨基酸序列(胰蛋白酶IV)[图13]
 71   来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列[图14]
 72   来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列[图14]
 73   牛胰凝乳蛋白酶B的氨基酸序列(BOV CHB)[图15]
 74   牛胰凝乳蛋白酶A的氨基酸序列(BOV CHA)[图15]
 75   来自澳洲棉铃虫的氨基酸序列(HpCh2A)[图15]
 76   来自澳洲棉铃虫的氨基酸序列(HpCh5)[图15]
 77   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){StPotIB}[图24]
 78   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){X67950}[图24]
 SEQ ID NO：   说明
 79   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){R01052}[图24]
 80   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){M17108}[图24]
 81   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){StPotIA}[图24]
 82   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){K03290}[图24]
 83   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){Z12619}[图24]
 84   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){X78988}[图24]
 85   马铃薯抑制剂I族的氨基酸序列(PotI){EILXCH}[图24]
 86   编码内质网肽的核苷酸序列[图28]
 87   内质网肽的氨基酸序列[图28]
 88   FwBacRECH1引物的核苷酸序列[图28]
 89   FwBacRECH2引物的核苷酸序列[图28]
 90   HpF5的核苷酸序列，其中加入了编码内质网信号的DNA[图28]
 91   HpCh5的氨基酸序列，其中加入了内质网信号[图28]
 92   RvRECH引物的核苷酸序列[图28]
 93   HpCHY1的氨基酸序列[图4C]
附图简述
图1的图显示了杆状病毒表达的澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的温度稳定性。通过在40℃和70℃之间以5℃的间隔培养100μL等份的试样而比较了50mM醋酸钠中的小牛胰凝乳蛋白酶(◆)和HpF5(▲)。在冰上迅速冷却受热的样品后，于30℃下，通过用底物培养10μL bc或50μL HpF5，一式两份进行活性分析。残留活性以未经处理的对照组的活性百分数表示。
图2的图显示了进食低蛋白质扁豆人工食物或棉花叶人工食物的澳洲棉铃虫幼虫的生长，存在或不存在0.26％(重量/体积)的NaPI。对重量增加(mg)监测21天。对于进食两种人工食物的幼虫均以相同的速度生长，并且当存在NaPI时，生长被延缓。(A)幼虫生长。(B)进食棉花人工食物21天后幼虫的相对尺寸，存在或不存在0.26％的NaPI。在进食NaPI的20只幼虫中，仅有5只存活，并且21天后，所有这5只的重量低于对照幼虫。(C)NaPI对肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。当每只澳洲棉铃虫幼虫达到晚期第四/早期第五的发育龄期时提取肠道，并且在分析胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性前制备肠道提取物。来自进食对照棉花叶人工食物(CC)的各个幼虫的提取物以灰色显示，进食含有0.26％(重量/体积)NaPI(NC)的相同食物的幼虫以黑色显示。仅有4只测试幼虫存活到第五龄，而大多数对照幼虫存活。所有分析均一式两份进行。采用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性，采用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。活性单位以405nm/min/mg肠道提取物蛋白质的吸光度变化(±标准偏差)表示。相对于对照组，在来自进食NaPI幼虫的提取物中，胰蛋白酶的活性几乎被取消，尽管胰凝乳蛋白酶活性在4只进食NaPI的幼虫中的2只中较低。(D)在虫粪中，NaPIs对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。从进食棉花叶人工食物的每只幼虫收集虫粪，并且制备排泄物的提取物。在来自进食对照食物(CC)的幼虫的提取物中，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性以灰色显示，进食含有0.26％(重量/体积)NaPI(NC)的相同食物的幼虫以黑色显示。需要指出的是，在该分析中包括幼虫CC16和NC13的虫粪，但被排除在图2C之外，这时因为在制备提取物期间肠道被损伤。一式两份进行所有的分析。采用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性，并采用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。活性单位以405nm/min/mg排泄物的提取物蛋白质的吸光度变化(±标准偏差)表示。在来自进食NaPI的幼虫的提取物中，很明显胰蛋白酶的活性可以忽略，尽管相对于对照组胰凝乳蛋白酶活性被提高。(E)在对照组和进食NaPI的幼虫的虫粪中的胰蛋白酶水平。在15％(重量/体积)SDS-PAGE上分析虫粪提取物，并转移到硝化纤维素上。采用兔抗HpTRY1血清(1∶2000稀释)作为初级抗体，接着是二级抗体驴抗兔IgG-辣根过氧化酶偶联物(1∶2000稀释)来探查硝酸纤维素滤膜。利用增强的化学发光(ECL)试剂和Hyperfilm ECL X射线照片显现免疫反应的蛋白质。相对于对照组，在摄食NaPIs(NC)的幼虫虫粪中的胰蛋白酶显著增加(上表)，但是无活性(下表)，可能是因为它与NaPIs复合。相比之下，在对照幼虫(CC)的虫粪中，胰蛋白酶为有活性的，即使存在的量低于抗体的检测水平。(F)在进食NaPI的幼虫肠道中产生对NaPI不敏感的蛋白酶。将幼虫的肠道提取物进行抑制分析，以确定对NaPI不敏感的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。在存在或不存在80nM NaPI抑制剂时，将每种提取物于30℃下预培养30min(T1单体用于胰蛋白酶分析，C1单体用于胰凝乳蛋白酶分析)，之前加入底物以启动反应。不含抑制剂的提取物分析结果以灰色(对照幼虫)和黑色(进食NaPI幼虫)显示。含有抑制剂的提取物分析结果为带点的。一式两份进行所有的分析。活性单位以底物水解405nm/min/mg提取物蛋白质(±标准偏差)表示。(A)用T1抑制胰蛋白酶的活性。利用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性。(B)用C1抑制胰凝乳蛋白酶的活性。利用SAAPFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性。在对照幼虫的提取物中，T1几乎完全抑制胰蛋白酶活性，指示了这些幼虫不产生对NaPI不敏感的胰蛋白酶。来自进食NaPI幼虫的提取物含有可忽略的胰蛋白酶活性，但是该活性不能被T1抑制。在6只对照幼虫的提取物中，C1不抑制胰凝乳蛋白酶的活性，并且在对照组的剩余部分中仅部分抑制肠胰凝乳蛋白酶，指示出受控昆虫含有对C1不敏感的胰凝乳蛋白酶。在来自进食NaPI幼虫的提取物中，大多数的胰凝乳蛋白酶活性可以归因于对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。当用80nM胰凝乳蛋白酶预培养来自对照组和进食NaPI幼虫的提取物时，所有的胰凝乳蛋白酶活性均被取消。
图3的图显示出各种蛋白酶抑制剂对来自澳洲棉铃虫的未分离的肠道提取物中的胰凝乳蛋白酶活性的影响。在采用胰凝乳蛋白酶底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺培养前，将蛋白酶抑制剂与1μg来自未分离的肠道提取物的蛋白质混合。抑制以对照样品中的总活性百分数表示。
图4的照片显示出来自澳洲棉铃虫肠道的NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶的纯化和N端序列。(A和B)利用具有固定化的C1抑制剂的亲和柱，在纯化的不同阶段，采用蛋白质凝胶分析片段(图1)。(A)15％(重量/体积)SDS-聚丙烯酰胺凝胶，装有(a)未分级分离的肠道提取物(b)和(c)未键合的蛋白质。(B)12.5％(重量/体积)SDS-聚丙烯酰胺凝胶，装有(d)清洗级分(e)键合到C1柱的蛋白质。(C)在泳道(e)中，～24kD蛋白质的N端序列。
图5的图显示出来自澳洲棉铃虫的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的纯化和N端序列。(A)胰凝乳蛋白酶的PVDF印迹(i)从马铃薯抑制剂柱洗脱。在变性条件下，从基质中共洗脱马铃薯抑制剂II(ii)和马铃薯抑制剂I(iii)。(B)从PVDF印迹中获得的N端氨基酸序列。Rechla为获得的4个序列中最丰富的。
图6的图显示出pH和多种底物对来自澳洲棉铃虫中肠的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶活性的影响。SA2PF-pNA，N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺；SA2PL-pNA，N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺；MA2PM-pNA，N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Met-对硝基苯胺。
图7的图显示出设计用于扩增来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的寡核苷酸引物。从GenBank数据库中的DNA序列预测来自棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的排列。NCBI蛋白质数据库访问号在序列左边。将相应于寡核苷酸引物的区域加框，并将扩增方向用箭头显示。
图8的图显示出在RT-PCR扩增棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶时采用的寡核苷酸序列。
图9的图显示出来自扩增编码澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的cDNAs的PCR产物。从肠道mRNA制备的cDNA的PCR扩增为5种不同的胰凝乳蛋白酶产生了局部序列。将被翻译的序列进行排列，并将相应于PCR引物的区域框起来。
图10的图显示出来自澳洲棉铃虫的预测的胰凝乳蛋白酶的氨基酸序列排列。催化残基以实心三角形()标记。高度保守的活性位点图用灰色高亮显示。在所有的胰凝乳蛋白酶中，保守的二肽R-I(↓↓)为被提议的用胰蛋白酶切割活性肽的位点。位于底物结合口袋并具有底物特异性的残基以符号、§、#显示。在所有的胰凝乳蛋白酶中，半胱氨酸(●)残基为高度保守的。
图11的图显示出设计用于扩增编码对NaPI不敏感的来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶的cDNA的寡核苷酸引物。(A)将2种对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端序列与从cDNA克隆预测的棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶进行比较。独特区域F1和F2为带阴影的。(B)寡核苷酸引物互补于不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端的独特区域。
图12的图形显示出核苷酸序列和从编码不敏感的胰凝乳蛋白酶的cDNA推导的氨基酸序列。不敏感的胰凝乳蛋白酶cDNA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。得自被纯化蛋白质的N端序列的氨基酸序列为灰色阴影。以箭头显示用胰蛋白酶进行的内蛋白水解切割的假定位点。在核苷酸序列中，双划线区域指用于PCR扩增的简并引物的位置。聚腺苷酸化作用信号序列为单划线的，并且星号标记终止密码子。假定的活性肽的推导的氨基酸序列计为-40到-1，接着是成熟域(+1)。相应于催化残基的3种氨基酸以符号#标记。胰凝乳蛋白酶底物特异性残基，丝氨酸，位于初级底物结合口袋的底部，用符号§来标记。
图13显示出澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶族的比对，显示出序列同一性。来自澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的5个族的成员的ClustalW比对。蛋白质序列以单字母代码给出。相同的氨基酸为黑色，相似的氨基酸为灰色。在右侧计数氨基酸，并且引入间隙以使排列最大化。对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶为族5的成员，并由185位的唯一一个精氨酸残基来表征(带箭头的)。人胰蛋白酶IV在类似位置也含有一个精氨酸残基(带箭头的)。
图14显示出将澳洲棉铃虫对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶与来自棉铃虫的同系物一起比对，其在185位也具有一个精氨酸残基。
图15显示出从澳洲棉铃虫为不敏感的(HpCh5)和敏感(HpCh2A)胰凝乳蛋白酶推导的蛋白质序列，对准小牛胰凝乳蛋白酶同工型A和B。采用ClustalW，将澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶HpCh2A和HpCh5对准牛胰凝乳蛋白酶同工型A和B。编号系统(排除间隔)符合用于牛胰凝乳蛋白酶的Greer命名法(Proteins7：317-34，1990)。遍及序列的圆点表示保守的残基。灰色阴影区域代表组成表面环的残基，其包含在底物或抑制剂的识别和结合中。初级底物结合口袋由标记为S1A、S1B和S1C的区域形成。S1’位点由环35和60形成。黑框标记HpF5序列中的残基，其与其它胰凝乳蛋白酶中在相应位置的氨基酸明显不同。采用Greer，1990，出处同前命名法，这些残基为Asp36、Arg63、Thr72、Pro83、Gly109、Ileu120、129和130之间的Glu插入物、Glu134、Ser145、Arg192和Pro207。通过自催化切割，将框起来的氨基酸从牛胰凝乳蛋白酶中去除，导致形成α-胰凝乳蛋白酶。
图16的图显示出在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶HpCh2A的结构模型中的几个表面环大于在牛胰凝乳蛋白酶中的同源环。将澳洲棉铃虫F2A胰凝乳蛋白酶(灰色)的结构模型层压到来自Bos taurus(黑色)的a-胰凝乳蛋白酶结构上。在昆虫胰凝乳蛋白酶模型中，在底物识别中包含的表面环60、35和142较大。观察到胰凝乳蛋白酶底物特异性残基，丝氨酸189，其位于初级底物结合口袋的底部，为一个填充有范德华力半径图的空间。
图17显示出当与C1一起建模时，表面看来很容易容纳敏感性胰凝乳蛋白酶HpCh2A的谷氨酰胺192(Greer，1990，出处同前命名法，图15)。敏感性胰凝乳蛋白酶HpCh2A(灰色)与蛋白酶抑制剂C1(黑色)络合的结构模型。用箭头表示谷氨酰胺192的侧链。Gln192附近的C1残基以棍形表示(黑色)。
图18的图显示出围绕络合到C1的敏感和不敏感的胰凝乳蛋白酶的残基192的环境对比。图17显示了框区的放大图。不敏感的胰凝乳蛋白酶(B)的精氨酸192表面看来与C1抑制剂的残基不协调，相比之下，与敏感胰凝乳蛋白酶(A)的谷氨酰胺192无明显冲突。
图19的图形显示出当不敏感的胰凝乳蛋白酶络合到1类马铃薯蛋白酶抑制剂时，围绕精氨酸192的环境(PotIB，图24)。(A)不敏感的胰凝乳蛋白酶HpCh5(灰色)与马铃薯I类蛋白酶抑制剂PotI(黑色)络合的结构模型。(B)围绕Arg 192的区域的放大图(B中的框区)。标记精氨酸192的侧链。在Arg 192附近的PotI残基显示为棍形(黑色)。
图20的照片显示出在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达胰凝乳蛋白酶克隆HpF2B，用于产生多克隆抗体。(A)在用考马斯兰染色的12.5％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上诱导HpCh2B后，在0-5hr的时间点分离总的细胞溶菌产物。泳道用诱导后的小时数标记，并且箭头显示具有正确的预测分子质量的被诱导蛋白质的位置。(B)面板1：在Talon树脂(BD Biosciences Clontech)上纯化细菌表达的HpCh2B，在15％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上分离，并用考马斯兰染色。面板2：将与面板1相同的样品转移到硝化纤维素上，并用抗HpCh2B抗体免疫染色。(C)通过SDS-PAGE分离数量减少的(200、150、100、75、50、25、20、10、0ng)细菌表达的胰凝乳蛋白酶HpCh2B，并用银染色，以及采用抗胰凝乳蛋白酶HpCh2B抗体检测相同凝胶的蛋白质印迹(1/2500)。澳洲棉铃虫抗体具有的检测限为20ng细菌表达的蛋白质。
图21的照片显示出抗体特异性，培养对抗来自澳洲棉铃虫的细菌表达的对NaPI不敏感的(HpCh5)和敏感(HpCh2B)的胰凝乳蛋白酶。采用SDS-PAGE，在12.5％(重量/体积)聚丙烯酰胺凝胶上分离细菌表达的对NaPI不敏感的(R)和敏感(C)的胰凝乳蛋白酶，并且(A)用考马斯兰染色，(B)用α-His标签抗体进行免疫印迹，(C)采用抗体免疫印迹到HpCh2B胰凝乳蛋白酶(α-RC)，以及(D)采用抗体免疫印迹到HpCh5胰凝乳蛋白酶(α-SC)。
图22显示出纯化来自马铃薯块茎的PotI。通过酸提、硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化来自马铃薯块茎(Russet Burbank)的PotI。(A)银染色的SDS-PAGE。泳道1：分子尺寸标记物(kDa)，泳道2：集中对照的PotI，含有来自G-75柱的片段，泳道3：航道2的免疫印迹，利用了在兔中培养的抗体到连接到匙孔血蓝蛋白的PotI的商业制品(Calbiochem)。确定PotI为单带，近似质量为6kDa。(B)来自A的集中对照的G-75片段的RP-HPLC。峰1、2和3为PotI同工型，峰4为污染的蛋白质。
图23的图显示出将棉铃虫幼虫生长在含有NaPI和PotI人工食物中。进食棉花叶人工食物使棉铃虫幼虫生长，存在或不存在0.26％(重量/体积)NaPI或0.26％(重量/体积)NaPI和0.26％(重量/体积)PotI。从马铃薯块茎纯化PotI(var Russet Burbank)，参见图22。在每种食物上使用了25只幼虫。在孵化后的第7、10、12、14和17天测量幼虫的重量。在第17天，仅食用NaPI的幼虫为对照组的84％，并且食用NaPI和PotI的幼虫为对照组的34％。2只进食对照食物的幼虫死亡，7只进食NaPI食物的幼虫死亡，并且6只进食NaPI和PotI食物的幼虫死亡。
图24显示出预测的StPotIA和StPotIB的氨基酸序列排列，具有马铃薯抑制剂I族成员。马铃薯抑制剂I族的几种成员的ClustalW排列。X67950：马铃薯cDNA，(Beuning和Christeller，Plant Physiol 102：1061，1993)，P01052：马铃薯蛋白质(Richardson和Cossins，FEBS Letters，52：161，1975)，M17108：马铃薯染色体组序列(Cleveland等，Plant Mol.Biol.8：199-207，1987)，K03290：番茄(Graham等，J.Biol.Chem.，260：6555-6560，1985)Z12619：烟草(Lindhorst等，Plant Mol.Biol.21：985-992，1993)，X78988：玉米(Jose Cordero等，Plant J.6：141-150，1994)，EILXCH：leech(See Muller等，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.358：1105-1117，1977)。*P1反应位点。StPotIA和StPotIB与来自马铃薯的其它族成员类似。然而，StPotIA在41-44位具有另外4个氨基酸，在来自番茄(K03290)的受伤诱导的PotI中也发现如此。StPotIB在P1位具有一个蛋氨酸，其对于马铃薯分离物是共有的。StPotIA在P1位具有一个丙胺酸，这对于来自马铃薯的PotI分离物还未报道，但出现在来自玉米的PotI分离物中(X78988)。
图25的图显示出纯化大肠杆菌表达的StPotIA和StPotIB。采用融合到StPot1A和StPotIB的N端HIS标签和金属亲和树脂接着是RP-HPLC来纯化StPot1A和StPotIB。经RP-HPLC分离后的图。采用线性梯度为0-100％的缓冲液B(80％(体积/体积)乙腈，0.1％(体积/体积)TFA)，流速为1ml/min，洗脱蛋白质超过60min。(A)StPotIA，(B)StPotIB。保留时间为36min时，在一个主峰中洗脱出StPotIA(60％缓冲液B)，并且保留时间为25min时，在一个主峰中洗脱出StPotIB(42％缓冲液B)。采用SDS-PAGE分析峰，并用银染色(在A中的插入物)。泳道1为StPotIA(pk1)，泳道2为StPotIB(pk2)，并且泳道3为来自马铃薯块茎的经纯化的PotI。StPotIA和StPotIB到从块茎分离的Pot1同工型混合物(6kDa)具有不同的表观迁移率(10kDa)，这是由于位于N末端的其它HIS-标签表位。
图26的图显示出细菌表达的StPotIA和StPotIB对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的抑制。采用纯化的PotI抑制来自澳洲棉铃虫肠道的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。(A)底物SA2PFpNA，发育时间30min，(B)底物SA2PLpNA，培养30min。来自马铃薯块茎的PotI同工型混合物(圆圈)、StPotIA(正方形)、StPotIB(三角形)。StPotIA、StPotIB和来自马铃薯块茎的PotI为对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的良好抑制剂。
图27的图显示出使棉铃虫幼虫生长在表达NaPI和PotI的转基因棉花上。将转基因棉花cv Coker 315用于采用棉铃虫的生物测定中。将30只幼虫食用对照的未变形Coker 315、转基因系1(NaPI)、转基因系2(StPot1A)或转基因植物3(NaPI X StPot1A)的叶子。在孵化后第7天测量幼虫的重量。(A)幼虫生长。在第7天，食用表达NaPI的叶的幼虫为食用未变形叶的对照幼虫重量的86％。食用表达StPotIA的叶的幼虫为对照组的92％，并且食用表达NaPI和StPotIA的叶的幼虫为对照组的46％。(B)摄食NaPI和PotI对肠道胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的影响。在每次实验中，集中对照来自幼虫的肠道并制备提取物。一式两份进行所有的分析。利用BApNA底物测定胰蛋白酶的活性(黑色)，并且用SA2PFpNA底物测定胰凝乳蛋白酶的活性(灰色)。活性单位以405nm/min/ug肠道提取物蛋白质的吸光度变化表示。相对于对照组，在食用表达NaPI和NaPI+StPotIA的叶的幼虫提取物中，胰蛋白酶的活性减小。在食用表达NaPI或NaPI+StPotIA的叶的幼虫提取物中，胰凝乳蛋白酶的活性增加，并在仅食用StPotIA的幼虫提取物中减小。
图28的图显示出核苷酸序列和从编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的HpF5 cDNA推导的氨基酸序列，以及寡核苷酸引物的位置，用于向HpCh5加入一个内质网序列。将FwBacRBCH1引物用于加ER信号序列的第一半和一个不活动突变，将A变为G，以破坏BamHI切割位点。FwBacRECH2引物将用于ER信号的译码序列的剩余部分和一个BamHI切割位点加入到序列的3’端。在组氨酸标签前加入ER信号，以便能够在细胞处理后通过金属亲合色谱法纯化被表达的蛋白质。加入的氨基酸为灰色阴影。
图29的照片显示出在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达胰凝乳蛋白酶克隆HpF5。在12.5％(重量/体积)SDS-PAGE凝胶上分离被表达的蛋白质，并采用α-HpCh5-抗体(A)RCDNA进行免疫印迹。通过用20μl bacmid DNA转染HIGH FIVE(商标)昆虫细胞而产生HpCh5。对照组；将被bacmid DNA转染的(pFastBac载体)昆虫细胞用不含HpF5插入物的pFastBac载体调换；用未被调换的bacmid DNA转染(蓝色菌落)昆虫细胞；(单独的细胞)未被转染的昆虫细胞；单独用CELFECTIN(注册商标)处理的(Cellfectin)昆虫细胞；阳性对照+为细菌表达的HpCh5，具有一个六组氨酸标签。(B)采用被病毒RC24、48和72感染的HIGH FIVE(商标)昆虫细胞产生HpCh5。用HpF5重组病毒感染后24、48和72小时收集介质。对照组24、48和72。来自用病毒处理过的细胞的、从未转染的bachmid(蓝色菌落)制备的介质用于24、48和72小时。阳性对照为细菌表达的HpCh5，具有一个六组氨酸标签。
发明详述
部分地断定本发明为识别和克隆一种新的昆虫胰凝乳蛋白酶分子，以术语“HpCh5”表示。本文中，将编码HpCh5的cDNA称作“HpF5”。分离该分子可允许识别和设计一系列的产品，其有效地用于控制棉铃虫的种和其它昆虫的生长、发育和/或全部的生物适合度。这些产品通常作为HpCh5功能或HpF5基因表达的拮抗物，并有效地用作昆虫控制剂。
HpCh5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2表示。HpF5的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和6表示。
本文中，提及“HpCh5”应当理解为提及HpCh5的所有形式，包括，例如，源于HpF5 mRNA的其它剪接的任何肽同工型、HpCh5的突变体或多态性变体、HpCh5的任何翻译后的修饰形式或HpCh5的任何非翻译后的修饰形式，以及在其它昆虫物种或菌株中的任何同系物。术语“HpCh5”也包括胰凝乳蛋白酶分子的HpCh5族成员。在没有特别指定的时，本文中提及HpCh5包括其衍生物、同系物、类似物、化学等价物及模仿物。提及HpCh5也指提及任何在最佳比对后具有与SEQID NO：2至少75％的氨基酸同一性的变体。HpCh5变体的实例包括对PI敏感的变体，如特别是具有一个Arg 192 Gln或Arg 192 Asn取代的那些。其它变体包括HpCh5的N端信号序列，如SEQ ID NO：3所定义的，并且由如SEQ ID NO：5表示的核苷酸序列编码。所述变体包括一种含有氨基酸序列的信号序列，其在最佳比对后具有与SEQ IDNO：3至少约75％的相似性，或被一种具有与SEQ ID NO：5至少约75％的同一性的核苷酸序列编码，或被一种在最佳比对后能够杂交到SEQID NO：5的核苷酸序列编码。
提及“HpF5”应当理解为提及HpF5的所有形式，包括任何cDNA同工型、染色体组形式、突变体和HpF5的多态变体，以及任何来自其它物种或昆虫菌株的同系物。术语“HpF5”也包括编码HpCh5或HpCh5类型的胰凝乳蛋白酶的基因的HpF5族成员。在未特别指定时，本文中，提及HpF5包括提及HpF5的衍生物，以及一种具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少约75％的同一性的核苷酸序列，或者在严格性低的条件下，能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的一种核苷酸序列。被定义为SEQ ID NO：3并且被SEQ IDNO：5编码的HpF5的信号序列也包括其变体。如上所示，所述变体包括一种信号序列，该信号序列在最佳比对后具有与SEQ ID NO：3至少约75％的相似性，和/或被一种在严格性低的条件下能够杂交到SEQID NO：5上的核苷酸序列编码，和/或被一种在最佳比对后具有与SEQID NO：5至少约75％的同一性的核苷酸序列编码。
在描述本发明的细节前，将要理解，除非另有规定，本发明不局限于特定的组分制剂、制造方法、施用方案等，由于这些可以变化。也要理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施例，并非用于限制。
必须指出，如在说明书中所用的，单数形式的“一个”包括复数方面，除非上下文清楚地另有规定。因此，例如，提及“试剂”或“拮抗物”包括一种单一的试剂或拮抗物以及两种或多种试剂或拮抗物等。
在描述和请求保护本发明时，根据下面提出的定义使用以下术语。
术语“化合物”、“试剂”、“活性试剂”和“活性剂”在本文中相互交替使用，指一种化学的化合物，其抑制HpCh5的活性或相应于HpF5的染色体组基因的表达。该术语也包括那些活性试剂在农业上或园艺上的活性成分，在本文中专门提到的，包括不局限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用术语“化合物”、“试剂”、“活性试剂”或“活性剂”时，将要理解为这包括试剂本身，以及在农业上或园艺上可接受的、生理学上的活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“化合物”并非仅被解释为一种化学化合物，而是扩展至肽、多肽和蛋白质以及遗传分子如RNA、DNA及其化学类似物。
因此，本发明预期的化合物可有效地用于下调HpCh5的活性，或下调相应于HpCh5的染色体组基因的表达。术语“下调”包括抑制HpCh5的活性。抑制HpCh5或降低其水平具有降低或延缓昆虫生长的作用。抑制HpCh5的活性或HpF5的基因表达可以通过在植物中产生抑制剂而发生，其随后被昆虫摄食，或者所述抑制剂可以局部应用到植物，或喷洒或者另外散布到昆虫或昆虫源。这样，植物可以产生核酸分子，当被昆虫摄食时，其干扰HpF5的表达。供选地，植物可以产生能够抑制HpCh5的PI。在另一供选的方式中，HpCh5抑制剂为非蛋白质的化学物质，被施加到植物表面，或被植物的根系统吸收。本文中，提及“植物”不排除树或来自植物(或树)的培养组织(例如愈伤组织)。
提及化合物、试剂和活性剂也包括化合物、试剂或活性剂的组合。所述组合物可以制备在多部分的农业或园艺组合物中，在分散或顺序使用前，将它们混合在一起。
如本文中使用的，术语试剂的“有效量”、“杀虫有效量”和“昆虫静态有效量”指足量的试剂以减小或延缓昆虫的生长和发育和/或杀死或抑制昆虫。
采用“农业上可接受的”或“园艺上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂指的是一种媒介，其包括一种非环境中的或者植物或非目标昆虫不期望的物质。载体可以包括赋形剂和其它添加剂，如稀释剂、洗涤剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
如本文中所用的，与植物或根除昆虫有关的术语“处理”指降低植物虫害症状的严重性，或者试剂应用到一组昆虫，导致其延缓生长、发育、生物适合度或保持良好状态。
本发明的化合物可以为大的或小的分子、核酸分子(包括反义的或有义的分子)、肽、多肽或蛋白质或混合分子，如RNAi-或siRNA-复合物、核酶或DNA酶。
术语“核酸分子”也包括“遗传分子”，并包括发夹结构，如包括RNAi-介导的转录后基因沉默或甲基化介导的沉默的那些。
相应地，本发明一方面提供了一种分离的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括编码一种新胰凝乳蛋白酶蛋白质或其衍生物、同系物或模仿物的核苷酸序列，其中，所述胰凝乳蛋白酶对花烟草的PI不敏感。
更具体地，本发明涉及一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括一种核苷酸序列或与一种核苷酸序列互补的核苷酸序列，其编码了一种基本上如SEQ ID NO：2或其衍生物、同系物或模仿物表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少约75％或更大的同一性或如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6表示的一种核苷酸序列，或一种具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少约75％或更大的相似性的核苷酸序列，或一种在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了一种分离的胰凝乳蛋白酶(棉铃虫的种)。其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物展示抗性。
更具体地，分离的胰凝乳蛋白酶包含一种如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少约75％的相似性的一种氨基酸序列。
如本文中所用的，术语“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上，在被对比的序列之间的精确同一性。当在核苷酸水平上有非同一性时，“相似性”包括序列间的区别，其形成在结构、功能、生化和/或构象水平上相互相关的不同氨基酸。当在氨基酸水平上有非同一性时，“相似性”包括在结构、功能、生化和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在特别优选的实施例中，在同一性水平上将核苷酸和氨基酸序列进行对比，而不是相似性。
用于描述两种或多种多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“对比窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分数”、“序列同一性百分数”、“基本上相似”和“基本的同一性”。“参考序列”至少为12个，但常见的是15-18个，并经常是至少25个或更多，如30个单体单位，在长度上包括核苷酸和氨基酸残基。因为两种多核苷酸可以每个都包括(1)在两种多核苷酸之间为相似的一种序列(即仅全部多核苷酸序列的一部分)，以及(2)在两种多核苷酸之间有分歧的一种序列，在两种(或多种)多核苷酸之间的序列对比典型地是通过比较“对比窗”上的两种多核苷酸序列而实现，以确定并比较序列相似性的本地区域。典型地，“对比窗”指12个邻近残基的概念片段，其与参考序列进行对比。与参考序列相比(其不包括增加或删除)，对比窗可以包括约20％或更小的增加或删除(即间隙)，以便最佳排列两种序列。通过计算机执行算法，可以进行对准对比窗的最佳排列序列(在Wisconsin遗传软件包释放7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机组，575Science Drive Madison，WI，USA)，或通过检查和最佳排列(即在对比窗上导致最高的同源百分数)，由选取的各种方法中的任何一种产生。也可以参考程序的BLAST族，例如，由Altschul等所公开的(核酸研究.25：3389-3402，1997)。可以在Ausubel等的单元19.3中发现对序列分析的详细讨论(“分子生物中的当前纪录”JohnWiley & Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)。
如本文中所用的，术语“序列相似性”和“序列同一性”指对比窗上在核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的基础上，序列的相同或功能上或结构上的相似程度。因此，例如，通过在对比窗上比较两种最佳排列的序列计算“序列同一性百分数”，测定在两种序列中出现相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数，以生产匹配位置数，用对比窗(即，窗尺寸)中的位置总数去除以匹配位置数，并将结果乘以100以生产序列同一性百分数。为实现本发明的目的，“序列同一性”将被理解为指用DNASIS计算机程序计算的“匹配百分数”(对于windows，为版本2.5；购自Hitachi软件工程有限公司，South San Francisco，California，USA)，利用了标准偏差，如在与软件一起的参考手册中使用的。相似的注释应用在相关的序列相似性上。术语“相似性”特别有效地用于描述氨基酸序列对比。术语“同一性”特别有效地用于描述核苷酸序列对比。
提及至少约75％的同一性或75％的相似性包括同一性和相似性百分数大于75％，如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
本文中，提到低严格性指从至少约0到至少约15％(体积/体积)的甲酰胺(包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％和14％(体积/体积)甲酰胺)以及从至少约1M到至少约2M的盐，用于杂交，以及至少约1M到至少约2M的盐，用于清洗条件。通常，低严格性为从约25-30℃到约42℃。温度可以改变，并且较高的温度用于取代甲酰胺，和/或生成供选的严格性条件。当需要时，可以应用供选的严格性条件，如介质严格性，其包括并包含从至少约16％(体积/体积)到至少约30％(体积/体积)的甲酰胺，以及从至少约0.5M到至少约0.9M的盐，用于杂交，和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，用于清洗条件，或者高严格性，其包括并包含从至少约31％(体积/体积)到至少约50％(体积/体积)的甲酰胺，并从至少约0.01M到至少约0.15M的盐，用于杂交，以及至少约0.01M到至少约0.15M的盐，用于清洗条件。通常，在Tm＝69.3+0.41(G+C)％下进行清洗(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)。然而，误配的碱基对数目每增加1％，双链DNA的Tm降低1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。在这些杂交条件下，甲酰胺为优选的。相应地，特别优选的严格性水平为如下所定义的：在25-42℃下，低严格性为6×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS；在20℃-65℃的温度范围内，中等严格性为2×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS；在温度至少为65℃时，高严格性为0.1×SSC缓冲液，0.1％(重量/体积)SDS。
本发明另一方面预期了一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物，包括一种基本上如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6表示的核苷酸序列，或一种具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少75％或更大的相似性的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物，或者在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式并编码一种基本上如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的核苷酸序列或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少75％或更大的同一性的，该核酸分子编码对花烟草的蛋白质抑制剂不敏感的胰凝乳蛋白酶核苷酸序列。
本发明另一方面预期一种核酸分子，包括一种基本上如SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6表示的核苷酸序列。编码HpCh5的核酸分子优选脱氧核糖核酸序列，如cDNA序列或染色体序列。染色体序列也可以包括外显子或内含子。染色体序列也可以包括启动子区域或其它的调节区域。本发明还预期HpF5的分离的内含子和外显子，如植物细胞中包含在遗传网络内的那些。
根据本发明这一方面，本文中，核酸分子相应于HpF5。根据本发明，已经测定了该cDNA编码蛋白质，所述蛋白质在胰凝乳蛋白酶基因族组中定义了一个新的胰凝乳蛋白酶族，家族5，并且在本文中该蛋白质指HpCh5。提及“HpF5”也包括基因的染色体组形式。在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因族中，如表2所示，同源性水平有变化。族5由HpF5举例说明，并且最类似于族2A，为73％，并且最不类似于族4，为＜20％。不希望以任何方式限制本发明，通过N端的两种独特性序列伸展(F1和F2)以及通过相应于NaPI敏感胰凝乳蛋白酶的6个氨基酸取代来举例说明HpCh5。这些取代中的5个表面看来未落入功能上的有意义区域，然而，第6个取代与一个β-链相关，该链形成初级底物结合口袋的壁。对于S1域，该取代的位置和从谷氨酰胺转化为精氨酸为极不寻常的，所述S1域以排列非极性残基为主，所述残基限定了胰凝乳蛋白酶的特异性。
                           表2
澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因族成员间的蛋白质序列同一性百分
                            数
因此，本发明提供了一种具有胰凝乳蛋白酶活性的分离蛋白质，其基本上不受来自花烟草的PI抑制。相应地，本发明另一方面涉及一种从如下列表中选择的分离蛋白质：
(i)一种新的胰凝乳蛋白酶蛋白质，或其衍生物、同系物或模仿物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对花烟草蛋白酶抑制剂不敏感；
(ii)一种蛋白质，具有基本上如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少75％或更大的同一性的序列；
(iii)一种蛋白质，由一种基本上如SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6表示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物编码，或由一种具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少75％的相似性的核苷酸序列编码，或一种编码基本上如SEQ ID NO：2表示的一种氨基酸序列或其衍生物、同系物或模仿物的序列，或在最佳比对后具有与SEQ IDNO：2至少75％或更大的相似性的序列；
(iv)一种蛋白质，由一种核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码，包括一种基本上如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6表示的核苷酸序列，或其衍生物、同系物或类似物，或者在严格性低的条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6上并编码一种基本上如SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的核苷酸序列，或其衍生物、同系物或模仿物，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少75％或更大的相似性的序列。
(v)一种新的胰凝乳蛋白酶蛋白质，或其衍生物、同系物或模仿物，具有一个精氨酸，用于取代初级底物结合口袋中的天冬酰胺或谷氨酰胺。
本发明公开了一种新胰凝乳蛋白酶的氨基酸和相应的cDNA序列，该酶对由茄属物种如花烟草产生的Type II丝氨酸蛋白酶抑制剂不敏感。因此，其可以用作一种控制携带该不敏感蛋白酶的昆虫之试剂的靶。已经显示了抑制HpCh5活性的许多化合物，并且作为优选的实施例，在表3中可发现这些化合物的列表。
                          表3
多种蛋白酶抑制剂对来自澳洲棉铃虫的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶
                和牛胰凝乳蛋白酶的活性影响
  抑制剂   测试的最大浓度   抑制％   IC50
  不敏感的μM   BCμM   不敏感的   BC   不敏感的μM   BCμM
  NaPI   10   4   0％   100％   ＞10   0.04
  胰凝乳蛋白酶   0.05   0.1   100％   100％   0.004   0.004
  PotI   5   5   100％   100％   0.12   0.02
  Bowman Birk   10   5   100％   100％   0.24   0.06
  利马豆   ＞20   5   89％   100％   3   0.2
  SBTI   ＞20   ＞20   82％   94％   33   13
  PMSF   1000   2000   100％   100％   33   13
  亮肽素   ＞4000   ＞4000   96％   52％   140   2400
SBTI，大豆胰蛋白酶抑制剂；PMSF，苯甲基磺酰氟；Bowman Birk，大豆Bowman Birk抑制剂；利马豆，利马豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)；PotI，马铃薯蛋白酶I型抑制剂。牛胰凝乳蛋白酶(BC)。
未将这些化合物中任何一种的作用模式限制到任何一种活性，3D模型被用于研究PotI和肽的结合能力，该肽被NaPI的C1域编码到对NaPI不敏感的和对NaPI敏感的昆虫胰凝乳蛋白酶上。
从cDNA克隆HpF2A(对NaPI敏感的)和HpF5(对NaPI不敏感的)推导的氨基酸序列被建模在Solenopsis invicta(火蚁)和Bostaurus(牛)胰凝乳蛋白酶的结构上，得自Research Collaboratory，用于结构生物信息学(RCSB)蛋白质数据库。
预测棉铃虫胰凝乳蛋白酶采用了与所有的胰凝乳蛋白酶报道的可在数据库中获得的相似结构。建模结构具有典型的丝氨酸蛋白酶折叠，由两种6链的反平行β圆筒组成，具有位于两个域之间的催化三分体。在哺乳动物胰凝乳蛋白酶中，某些表面环被切割(环142)，但是在昆虫胰凝乳蛋白酶中保持完整。因此，需要火蚁胰凝乳蛋白酶结构(Botos等，J.Mol.Biol.298：895-901，2000)以帮助精细调整棉铃虫胰凝乳蛋白酶模型中这些表面环的定向。在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶中，两个表面环60和142相当大(图15，16)。
将C1与对NaPI敏感和对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶一起建模，以研究在对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶中，什么样的残基可能参与抑制剂结合丧失。先前采用1H NMR测定了胰凝乳蛋白酶抑制剂C1的结构(Nielson等，1994，出处同前)，但还没有在蛋白酶络合物中进行测定。因此，来自Solanum tuberosum的相关蛋白酶抑制剂PCI-1与来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶B复合(Greenblatt等，J.Mol.Biol.205：201，1989)提供了一种引导复合物排列的适当基础。C1胰凝乳蛋白酶复合物的能量最小化显示出在可能的24个假定的接触残基中，Arg192(胰凝乳蛋白酶编号系统)作为唯一的可能候补物质可引起这种抗性。含有与C1复合的Arg192残基、对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(Greer命名法，Greer，Proteins 7：317-34，1990。图15)不能正确地能量最小化，这是由于Arg192和C1之间的空间接触，然而，在与C1复合的Na-PI敏感胰凝乳蛋白酶中，Gln192残基不引起所述问题，这是由于其尺寸小得多。图17显示出在C1-HpF2A胰凝乳蛋白酶络合物中围绕Gln192的结合区域的近视图。很清楚，Gln192不与抑制剂分子上的任何区域冲突。然而，与C1-HpCh5胰凝乳蛋白酶模型中的共有Arg残基的对比证明了没有足够的空间容纳该大得多的C1中的Thr5和Ala9相接触的残基。而且，将StPot1A抑制剂建模到HpCh5显示出对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶可以容纳Arg192残基，与由StPot1A抑制该胰凝乳蛋白酶一致(图19)。
总之，来自棉铃虫物种的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶在第192位天冬酰胺或谷氨酰胺的位置具有一个精氨酸，其延伸入S1结合口袋，并且表面看来干扰C1结合。而且，很清楚，该Arg残基不干扰PotI结合，这与观察的PotI为比NaPI抑制剂更加有效的昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂的结果一致。从马铃薯块茎纯化大量的PotI抑制剂(图22)以评价NaPI和PotI对棉铃虫幼虫生长的组合作用(图23)。生物测定证实PotI显著增强了NaPI抑制剂的活性。一起食用NaPI和PotI的毛虫(分别为0.26和0.34％(重量/体积))为发育第五龄期的对照幼虫尺寸的34％，然而，仅进食NaPIs的毛虫为对照组尺寸的约84％。
因此，本发明另一方面提供了一种用于调节昆虫中HpCh5或其同系物或变体活性的方法，所述方法包括将HpCh5蛋白质或其同系物或变体与有效量的一种试剂接触一段时间，并且是在足以降低或增加HpCh5活性的条件下。
本发明另一方面提供了一种用于调节昆虫中HpF5或同系物或变体的表达的方法，所述方法包括将HpF5或其同系物或变体与有效量的试剂在足以降低或增加HpF5表达的条件下接触一段时间。
根据这些和其它方面，优选的目标昆虫为棉铃虫物种和其它鳞翅目物种。此外，被保护的植物包括对棉铃虫、澳洲棉铃虫、玉米夜蛾和H.virescens敏感的那些。所述植物包括对棉铃虫敏感的植物，如棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李属、高粱属植物、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、木豌豆、鹰嘴豌豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(观赏用植物)、天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、紫花苜蓿、羽扇豆、蚕豆、青豆、花生、菜籽油、金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花和蜡菊属(观赏用植物)。
本文中预期的其它植物包括谷类(如小麦、大麦、燕麦、黑小麦等)、园艺植物(例如苹果、胡罗卜、洋葱等)、装饰用植物(如兰科植物、蔷薇属、矮牵牛花等)和树。
因此，本发明预期了筛选化合物方法，其抑制或作为HpCh5活性或HpF5基因表达的拮抗物。例如，一种方法涉及将候选化合物与HpCh5接触。筛选方法包括检验(i)存在化合物和HpCh5的复合物，或(ii)HpF5 cDNA或染色体组DNA的表达水平改变。检验的一种形式涉及竞争结合分析。在所述竞争结合分析中，HpCh5典型地被标记。从任何推定的复合物中分离游离的HpCh5，并且游离(即未复合的)标记物的数量为被测试剂与HpCh5结合的一种量度。也可以测定结合的而不是游离的HpCh5的数量。也可能标记化合物而不是HpCh5，并在存在和不存在被测化合物时，测定结合到目标的化合物的数量。所述化合物可以抑制HpCh5。对于结合并抑制HpF5或其mRNA转录的化合物，可以采用一种相似的方法。
用于试剂筛选的其它技术提供了可高通量筛选对HpCh5具有适当结合亲和力的化合物，并详细描述在Geysen中(国际专利公开文本WO 84/03564)。简单地说，在固态底物如塑料插头或一些其它表面上合成大量不同的小肽测试化合物。将肽测试化合物与HpCb5进行反应并清洗。随后，采用本领域公知的方法检测结合的HpCh5分子。该方法可以用于筛选非肽、化学物质。因此，该方面扩展至组合的方法，包括噬菌体展示，以筛选HpCh5拮抗物。
被纯化的HpCh5可以直接涂敷到平板上，用于前述的试剂筛选技术。然而，也可以利用HpCh5的非中和抗体，以便将HpCh5固定到固定相上。
活的动物如棉铃虫和/或澳洲棉铃虫也可以被用在喂养试验中，以寻找潜在的抑制剂。
本发明也预期竞争试剂筛选分析的用途，所述方法中，能够特异性地结合HpCh5的中和抗体与测试化合物竞争，以结合到HpCh5或其片段上。以这种方式，抗体可以被用于检测存在任何共享HpCh5的一种或多种抗原决定簇的肽。
然而，另一有用的化学修饰化合物类似物来源可以被用于诱导生化或遗传途径的反馈抑制，以产生真实的HpCh5。
本文中预期的HpCh5类似物包括但不局限于修饰侧链，包括在肽、多肽或蛋白质合成期间的非天然氨基酸和/或其衍生物的掺入，以及使用交联剂和其它方法将结构限制强加到HpCh5上。
本发明预期的HpCh5侧链修饰的实例包括修饰氨基基团，如通过与醛反应，接着是用NaBH4还原进行还原性烷基化；用甲基乙酰亚氨酯进行脒化；用乙酸酐酰化；用氰酸盐甲氨酰化氨基基团；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苄基化氨基基团；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐酰化氨基基团；以及采用吡哆醛-5-磷酸吡哆化赖氨酸，接着是用NaBH4还原。
通过与试剂如2，3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛形成杂环缩合物，可以修饰精氨酸残基的胍基团。
可以通过形成O-酰基异脲以及随后的衍生化，例如为相应的由碳二亚胺活化修饰羧基。
巯基可以采用如下方法被修饰，如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧基甲基化；过甲酸氧化为磺基丙氨酸；与其它巯基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺进行反应；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯基磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞化合物形成汞化合物衍生物；在碱性pH下与用氰酸盐进行甲氨酰化。
色氨酸残基可以被修饰，例如，通过用N-溴琥珀酰亚胺氧化，或者用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤化物烷基化吲哚环。另一方面，可以通过采用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变酪氨酸残基。
通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化，可以实现对组氨酸残基的咪唑环的修饰。
在肽合成期间，掺入非天然的氨基酸和衍生物的实例包括但不局限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基氨基乙酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或D-氨基酸同工型。表4显示了本文预期的非天然氨基酸的列表。
                                    表4
                            非常规氨基酸的代码
  非常规的氨基酸   代码   非常规的氨基酸   代码
  α-氨基丁酸α-氨基-α-甲基丁酸氨基环丙基羧酸氨基异丁酸氨基降冰片-羧酸环己基丙氨酸环戊基丙氨酸D-丙氨酸D-精氨酸D-天门冬氨酸D-半胱氨酸D-谷氨酰胺D-谷氨酸D-组氨酸D-异亮氨酸D-亮氨酸D-赖氨酸D-蛋氨酸D-鸟氨酸D-苯丙氨酸D-脯氨酸D-丝氨酸D-苏氨酸D-色氨酸   AbuMgabuCproAibNorbChexaCpenDalDargDaspDcysDglnDgluDhisDileDleuDlysDmetDornDpheDproDserDthrDtrp   L-N-甲基丙氨酸L-N-甲基精氨酸L-N-甲基天冬酰胺L-N-甲基天冬氨酸L-N-甲基半胱氨酸L-N-甲基谷氨酰胺L-N-甲基谷氨酸L-N 甲基组氨酸L-N-甲基异亮氨酸L-N-甲基亮氨酸L-N-甲基赖氨酸L-N-甲基蛋氨酸L-N-甲基正亮氨酸L-N-甲基正缬氨酸L-N-甲基鸟氨酸L-N-甲基苯丙氨酸L-N-甲基脯氨酸L-N-甲基丝氨酸L-N-甲基苏氨酸L-N-甲基色氨酸L-N-甲基酪氨酸L-N-甲基缬氨酸L-N-甲基乙基甘氨酸L-N-甲基-叔丁基甘氨酸L-正亮氨酸L-正缬氨酸   NmalaNmargNmasnNmaspNmcysNmglnNmgluNmhisNmileNmleuNmlysNmmetNmnleNmnvaNmornNmpheNmproNmserNmthrNmtrpNmtyrNmvalNmetgNmtbugNleNva
  D-酪氨酸D-缬氨酸D-α-甲基丙氨酸D-α-甲基精氨酸D-α-甲基天冬酰胺D-α-甲基天冬氨酸D-α-甲基半胱氨酸D-α-甲基谷氨酰胺D-α-甲基组氨酸D-α-甲基异亮氨酸D-α-甲基亮氨酸D-α-甲基赖氨酸D-α-甲基蛋氨酸D-α-甲基鸟氨酸D-α-甲基苯丙氨酸D-α-甲基脯氨酸D-α-甲基丝氨酸D-α-甲基苏氨酸D-α-甲基色氨酸D-α-甲基酪氨酸D-α-甲基缬氨酸D-N-甲基丙氨酸D-N-甲基精氨酸D-N-甲基天冬酰胺D-N-甲基天冬氨酸D-N-甲基半胱氨酸D-N-甲基谷氨酰胺D-N-甲基谷氨酸D-N-甲基组氨酸D-N-甲基异亮氨酸D-N-甲基亮氨酸D-N-甲基赖氨酸N-甲基环己基丙氨酸D-N-甲基鸟氨酸N-甲基甘氨酸N-甲基氨基异丁酸N-(1-甲基丙基)甘氨酸N-(2-甲基丙基)甘氨酸D-N-甲基色氨酸   DtyrDvalDmalaDmargDmasnDmaspDmcysDmglnDmhisDmileDmleuDmlysDmmetDmornDmpheDmproDmserDmthrDmtrpDmtyDmvalDnmalaDnmargDnmasnDnmaspDnmcysDnmglnDnmgluDnmhisDnmileDnmleuDnmlysNmchexaDnmornNalaNmaibNileNleuDnmtrp   α-甲基-氨基异丁酸α-甲基-γ-氨基丁酸α-甲基环己基丙氨酸α-甲基环戊基丙氨酸α-甲基-α-萘基丙氨酸α-甲基青霉胺N-(4-氨基丁基)甘氨酸N-(2-氨基乙基)甘氨酸N-(3-氨基丙基)甘氨酸N-氨基-α-甲基丁酸α-萘基丙氨胺酸N-苄基甘氨酸N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸N-(2-羧乙基)甘氨酸N-(羧甲基)甘氨酸N-环丁基甘氨酸N-环庚基甘氨酸N-环己基甘氨酸N-环癸基甘氨酸N-环十二烷基甘氨酸N-环辛基甘氨酸N-环丙基甘氨酸N-环十一烷基甘氨酸N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸N-(3-胍基丙基)甘氨酸N-(1-羟基乙基)甘氨酸N-(羟基乙基))甘氨酸N-(咪唑基乙基))甘氨酸N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸N-甲基-γ-氨基丁酸D-N-甲基蛋氨酸N-甲基环戊基丙氨酸D-N-甲基苯基丙氨酸D-N-甲基脯氨酸D-N-甲基丝氨酸D-N-甲基苏氨酸N-(1-甲基乙基)甘氨醇   MaibMgabuMchexaMcpenManapMpenNgluNaegNornNmaabuAnapNpheNglnNasnNgluNaspNcbutNchepNchexNcdecNcdodNcoctNcproNcundNbhmNbheNargNthrNserNhisNhtrpNmgabuDnmmetNmcpenDnmpheDnmproDnmserDnmthrNval
  D-N-甲基酪氨酸D-N-甲基缬氨酸γ-氨基丁酸L-叔丁基甘氨酸L-乙基甘氨酸L-同型苯丙氨酸L-α-甲基精氨酸L-α-甲基天冬酰胺L-α-甲基半胱氨酸L-α-甲基谷氨酰胺L-α-甲基组氨酸L-α-甲基异亮氨酸L-α-甲基亮氨酸L-α-甲基蛋氨酸L-α-甲基正缬氨酸L-α-甲基苯丙氨酸L-α-甲基丝氨酸L-α-甲基色氨酸L-α-甲基缬氨酸N-(N-(2，2-二苯基乙基)氨甲酰甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基-乙基氨基)环丙烷   DnmtyrDnmvalGabuTbugEtgHpheMargMaspMcysMglnMhisMileMleuMmetMnvaMpheMserMtrpMvalNnbhmNmbc   N-甲基-α-萘基丙氨酸N-甲基青霉胺N-(对羟基苯基)甘氨酸N-(硫代甲基)甘氨酸青霉胺L-α-甲基丙氨酸L-α-甲基天冬酰胺L-α-甲基-叔丁基甘氨酸L-甲基乙基甘氨酸L-α-甲基谷氨酰胺L-α-甲基同型苯丙氨酸N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸L-α-甲基赖氨酸L-α-甲基正亮氨酸L-α-甲基鸟氨酸L-α-甲基脯氨酸L-α-甲基苏氨酸L-α-甲基酪氨酸L-N-甲基同型苯丙氨酸N-(N-(3，3-二苯基丙基)   NmanapNmpenNhtyrNcysPenMalaMasnMtbugMetgMgluMhpheNmetMlysMnleMornMproMthrMtyrNmhpheNnbhe
可以使用交联剂，例如，为了稳定3D构型，采用了同型双功能团的交联剂，如双功能团的酰亚胺酯，其具有(CH2)n间隔基团，其中n＝1到n＝6，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，和异双功能团的试剂，其通常含有一个氨基反应部分，如N-羟基琥珀酰亚胺和其它基团特异性的反应部分，如马来亚氨或二巯基部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。此外，肽可以在构型上被限制，例如，通过掺入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键，并通过引入共价键(如在N和C末端之间、在两个侧链之间或在一个侧链和N或C末端之间形成酰胺键)而形成环肽或类似物。
所述类似物，尤其是如果它们保留活性，或甚至是HpCL5分子本身，可以具有类似应用，如在洗衣粉或去污剂中。
本发明另一方面预期了任何化合物，其与HpCh5或其衍生物或变体结合或者发生其它的相互作用，或者诱导HpCh5合成的反馈抑制，导致HpCh5的活性或水平下调。
本发明也有效地用于筛选其它可减小HpF5表达的化合物。可以采用多种试剂筛选技术，如本文和在国际公开号WO 97/02048中描述的那些。
化合物拮抗物包括HpCh5的变体，如包括如上所示类似物的氨基酸残基的变体。在一种实施方案中，所述靶为HpCh5多肽。术语“多肽”指氨基酸的聚合物及其同系物，并且不指产品的特定长度，因此，肽、寡肽和蛋白质包含在多肽的定义内。该术语也不排除多肽的修饰，例如，糖基化、酰化、磷酸化等。该定义包括，例如，含有氨基酸的一种或多种类似物的多肽(包括，例如，非天然的氨基酸，如表4给出的那些)或具有取代的连接的多肽。
一种被确定为HpCh5功能或HpF5基因活性拮抗物的物质可以是天然的肽或非肽。非肽“小分子”由于其可感知的稳定性而经常优选用于许多农业的或园艺的目的。
从化合物设计HpCh5的模拟拮抗物时，通常要采取几个步骤。首先，确定化合物的特定部分，该部分在测定目标特性时为关键性的和/或重要的。在肽的情况下，可以通过系统地改变肽中的氨基酸残基，例如通过依次取代每一残基而进行。肽的丙氨酸扫描通常被用于精炼这些肽基序。构成化合物活性区域的这些部分或残基被称为其“基础化学团(agrichemicaphore)”。
一旦发现基础化学团，根据其物理性质如立体化学、键合、尺寸和/或电荷建立结构模型，利用了从许多来源获得的数据，例如光谱技术、x射线衍射数据和NMR。计算分析、相似性谱图(其模型基础化学团的电荷和/或体积，而不是原子之间的键合)和其它技术可以被用在该建模过程中。
在该方法的变形例中为HpCh5和与其结合之化合物的三维结构。在结合时，在HpCh5或其拮抗物改变构型的情况中，这是尤其有用的，使得在设计模仿物时，模型考虑该因素。建模可以被用于产生与线性序列或三维构型发生相互作用的抑制剂。
随后选择模板分子，于其上可以接枝模仿药效基团的化学基团。可以方便地选择模板分子和接枝于其上的化学基团，使基础化学团容易合成，并有可能在农业上或园艺上为可接受的。供选地，当基础化学团以肽为基础时，通过环化肽增加其刚性，以获得进一步的稳定性。可以随后筛选采用该方法发现的基础化学团，以察看它们是否具有HpCh5拮抗性，或它们在多大程度上展示拮抗性。可以随后进行进一步的优化或修饰，以获得一种或多种用于检测的最终试剂。
然而，本发明另一方面提供了一种用于检测试剂的方法，该试剂能够结合或者与HpCh5结合位或其功能等同物结合，所述方法包括利用计算机上的(in-silico)3D建模确定结合到HpCh5的化合物，并且尤其是不受精氨酸192的干扰。
合理的HpCh5拮抗物设计目标是产生HpCh5结构类似物或与HpCh5发生相互作用的小分子的结构类似物(例如，拮抗物或抑制剂)，以改造如更加抑制HpCh5的试剂。例如参见Hodgson(Bio/Technology 9：19-21，1991)。在一种方法中，首先通过x射线晶体学、计算机建模或者最典型地通过上述方法的组合，测定HpCh5的三维结构。通过基于胰凝乳蛋白酶的结构建模，也可以获得有关多肽结构的有用信息。一种合理的药物设计实例为开发HIV蛋白酶抑制剂(Erickson等，Science 249：527-533，1990)。此外，采用丙氨酸扫描可以分析目标分子(Wells，Methods Enzymol.202：2699-2705，1991)。在该技术中，氨基酸残基被Ala取代，并且测定其对肽活性的影响。采用这种方式分析肽的每一个氨基酸残基，以确定肽的重要区域。
此外，包括拮抗物的化合物可以定向到HpCh5的特定位置或区域或结构域。
也可能分离HpCh5特异性抗体，并随后解析其晶体结构。原理上，该方法产生一种基础核(agricore)，随后的试剂设计可以以此为基础。有可能通过产生针对功能抗体的抗独特型的抗体(anti-ids)完全绕过蛋白质晶体学方法。作为一种镜像的镜像，预期anti-ids的结合位点为原始受体的类似物。Anti-id可以随后被用于从化学或生物学产生的肽库的库中鉴定和分离肽。被选择的肽将随后作为基础化学团。
胰凝乳蛋白酶克隆HpF2B在融合C-末端的6组氨酸(6.H)标签的大肠杆菌中被表达，并在Talon金属亲和树脂上纯化至均一(图20)，用于注入兔中以产生多克隆抗体。经纯化产物的N端测序证实了胰凝乳蛋白酶HpCh2B的表达。第四次用抗原加强免疫后，收集血清，并在细菌表达的蛋白质和未分级分离肠道提取物的蛋白质印迹上进行测试。抗体检测到以1∶2500的比例稀释的全长重组胰凝乳蛋白酶以及几种破裂产物。也采用抗HpCh2B抗体染色未分级分离的肠道提取物和键合到C1亲和柱的蛋白质样品，所述抗HpCh2B抗体用于检测酶的成熟的天然形式。
通过将免疫印迹与银染色SDS-PAGE凝胶对比，将被纯化的6H.HpCh2B用于测试抗HpCh2B抗体的检测限。抗体检测到20ng细菌表达的胰凝乳蛋白酶原，并且也确定了从澳洲棉铃虫肠道分离的天然的胰凝乳蛋白酶的成熟形式。
编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(HpCh5)的cDNA(HpF5)以相似方式在大肠杆菌中表达，除了所述6组氨酸标签融合到被表达的蛋白质的N端。针对细菌表达的胰凝乳蛋白酶HpCh2B产生的多克隆抗血清与蛋白质印迹上细菌表达的NaPI不敏感胰凝乳蛋白酶(HpCh5)不发生交叉反应(图21)。类似地，针对HpCh5产生的抗血清不结合到HpCh2B。显示出这些抗血清可以被用于特异性地区分并监测未分级分离的肠道提取物中对NaPI不敏感和敏感的胰凝乳蛋白酶的水平。
相应地，本发明另一方面涉及HpCh5和HpCh2B抗体，包括催化抗体。
本发明另一方面提供了一种方法，用于分离胰凝乳蛋白酶的单个同工型，所述方法包括：
(i)首先，采用苯甲脒-琼脂糖对昆虫肠道提取物进行亲合色谱，以结合胰蛋白酶；
(ii)进一步利用固定化的花烟草丝氨酸蛋白酶抑制剂C1对未结合蛋白质进行亲合色谱，以结合所有的NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶；以及
(iii)采用固定化的PotI和PotII或胰凝乳蛋白酶对来自步骤(ii)的洗脱物进行亲合色谱，以结合残留物。随后用8M尿素洗脱假定的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。
本发明扩展至一种用于HpF5或其同系物或变体的下调表达的遗传方法。该方法利用核酸分子或具有遗传成分的分子(例如RNAi)诱导转录前后的基因沉默。
术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、染色体组DNA、合成形式和混合的聚合物，有义和反义链，并可以化学地或生物化学地被修饰，或可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员人容易理解的。这种修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物(如吗啉环)取代一种或多种天然出现的核苷酸、核苷酸间修饰如不带电的连键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、带电的连键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、冗余部分(例如多肽)、嵌合剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和被修饰的连键(例如α-异头核酸等)。也包括模仿多核苷酸能力的合成分子，以通过氢键和其它的化学相互作用结合到指定序列。所述分子为本领域公知的，并包括，例如，肽键取代分子主链中的磷酸酯键的那些。
反义多核苷酸序列，例如，有效地用于HpF5的沉默转录。而且，可以将含有全部或部分HpF5基因座位的多核苷酸载体以有义或反义方向置于启动子的控制下，并引入细胞。细胞内这种有义或反义结构的表达干扰靶转录和/或翻译。而且，也可以采用共抑制(即采用有义抑制)和诱导RNAi或siRNA的机理。供选地，反义或有义分子可以直接施用。在所述后一实施方案中，反义或有义分子可以配制在组合物中，并随后通过任何数量的单元施用到靶细胞。
对反义和有义分子的改变涉及利用吗啉代，其为包括吗啉核苷酸衍生物和二硫代磷酰胺酯键合的寡核苷酸(例如，Summerton和weller，Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7：187-195，1997)。将所述化合物注入胚中并观察mRNA干扰的影响。
在一实施方案中，本发明采用了如寡核苷酸和类似物种的化合物，用于调节编码HpCh5的核酸分子的功能或作用，即寡核苷酸诱导转录或转录后的基因沉默。这通过提供如下寡核苷酸而完成，其特异性地与编码抑制剂的一种或多种核酸分子杂交。可以将寡核苷酸直接提供到细胞或在细胞内产生。如本文中所用的，为了方便，术语“靶核酸”和“编码HpCh5的核酸分子”用于包括编码抑制剂的DNA、从所述DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA或其部分)，以及得自所述RNA的cDNA。本发明的化合物与其靶核酸的杂交通常被称为“反义”。因此，被认为包含在实施本发明一些优选实施例中的优选机理在本文中指“反义抑制”。所述反义抑制典型地基于以氢键为基础的寡核苷酸链或节段的杂交，从而，至少一个链或节段被切割、降解或者成为不可操作的。因此，目前，对于所述反义抑制，优选靶定特定的核酸分子及其功能。
待干扰的DNA功能可以包括复制和转录。复制和转录，例如，可以来自一个内生的细胞模板、载体、质粒结构或其它。将被干扰的RNA功能可以包括以下功能，如将RNA平移到蛋白质翻译位点、将RNA平移到细胞内远离RNA合成位点的位点，从RNA翻译蛋白质、剪接RNA以产生一种或多种RNA物种，以及涉及RNA的催化活性或复合形式，其可以由RNA从事，或者被其促进。
在本发明的上下文中，“杂交”指使寡聚化合物的互补链成对。在本发明中，优选的成对机理涉及氢键键合，可以为Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合，在寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基之间(核碱基)。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核碱基，其通过形成氢键成对。杂交可以发生在变化着的环境中。
当化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能引起活性损失时，反义化合物为可特异性地杂交的，并且存在足够程度的互补性，以避免在预期的特异性结合的条件下，反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。
如本文中所用的“互补的”指在寡聚化合物的两种核碱基之间精确配对的能力。例如，如果位于寡核苷酸(寡聚化合物)某位置的核碱基能够与位于靶核酸某位置的核碱基氢键键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则寡核苷酸和靶核酸之间的氢键位置被视为互补位置。当每个分子中有足够数目的互补位置被能以氢键相互键合的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为相互互补的。因此，术语“可特异性地杂交”和“互补的”用于显示在足够数目的核碱基中足够程度的精确配对或互补性，从而，在寡核苷酸和靶核酸之间出现稳定特异性的结合。
根据本发明，化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、备择的剪接物、引物、探针和杂交到靶核酸的至少一部分的其它寡聚化合物。这样，可以以单链、双链、圆形或发夹寡聚化合物的形式引入这些化合物，并可以含有结构元素如内部或末端的突起或环。一旦被引入系统，本发明的化合物可以引起一种或多种酶或结构上的蛋白质发生作用，以影响靶核酸的修饰。所述酶的一种非限制性实例为RNAse H，一种细胞核酸内切酶，其切割RNA：DNA双链的RNA链。本领域公知的是，“类DNA”的单链反义化合物引起RNAse H。因此，激活RNase H导致切割RNA目标，从而大大增强了寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。对于其它的核糖核酸酶，如在酶的RNAse III和核糖核酸酶L族中的那些，已经假定有相似的作用。
尽管反义化合物的优选形式为单链反义寡核苷酸，在许多物种中，已经表明引入双链结构如双链RNA(dsRNA)分子诱导有效的、特异性的由反义介导的基因或其相关基因产品的功能降低。
在本发明的上下文中，术语“寡聚化合物”指包括许多单体单元的聚合物或低聚物。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模仿物、嵌合体、类似物和同系物的低聚物或聚合物。该术语包括由天然出现的核碱基组成的寡核苷酸、糖和共价核苷间(骨架)键合以及具有非天然出现的功能相似部分的寡核苷酸。由于预期的特性如增强的细胞吸收、对于靶核酸的增强的亲和性以及存在核酶时的增加的稳定性，所述被修饰或取代的寡核苷酸经常优选天然形式。
尽管寡核苷酸为本发明化合物的优选形式，本发明也包括化合物的其它族，包括但不局限于寡核苷酸类似物和模仿物，如本文中描述的那些。
本领域公知的开放阅读框架(ORF)或“编码区域”指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，为一个可以有效靶向的区域。在本发明的上下文中，一个区域为基因内的区域，包括基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子。
其它目标区域包括5’未翻译区域(5’UTR)，本领域公知的是指在来自翻译起始密码子的5’方向的mRNA部分，并因此包括位于mRNA(或基因上的相应的核苷酸)的5’帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸，以及3’未翻译区域(3’UTR)，本领域公知的是指在来自翻译终止密码子的3’方向的mRNA部分，并因此包括mRNA(或基因上的相应的核苷酸)的翻译终止密码子和3’端之间的核苷酸。mRNA的5’帽位点包括一个N7-甲基化的鸟苷残基，通过5’-5’三磷酸酯键合结合到mRNA的5’-大多数残基上。mRNA的5’帽区域被视为包括5’帽结构本身以及邻近帽位点的前50个核苷酸。也优选靶向5’帽区域。
尽管一些真核mRNA转录子为直接被翻译的，许多含有一个或多个已知的“内含子”区域，在其被翻译前从转录中被切除。剩余(并因此，被翻译的)区域为已知的“外显子”，并且剪接以形成一种连续的mRNA序列。靶向位点，即内含子-外显子结合点或外显子-内含子结合点，也可以特别地用于疾病中包含异常剪接或疾病中包含过量产生一种特异性剪接产品的情况下。由于重排或删除而引起的异常融合结合点也是优选的目标位点。通过从不同的基因来源剪接两种(或多种)mRNAs的过程而产生的mRNA转录为公知的“融合转录”。也已知利用靶向到如DNA或前mRNA的反义化合物，可以有效地靶向内含子。
如本领域公知的，核苷为碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基。最普通的两类所述杂环碱基为嘌呤和嘧啶。核苷酸为还包括共价连接到核苷的糖部分的磷酸基团的核苷。对于那些包括呋喃基戊糖的核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将邻近的核苷逐一共价连接，以形成一种线性聚合化合物。反过来，该线性聚合的化合物各个端可以进一步被连接，以形成圆形化合物，然而，线性化合物通常为优选的。此外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并且可以因此以一种方式折叠，以产生全部或部分的双链化合物。在寡核苷酸中，通常提到磷酸基团形成寡核苷酸的核苷间骨架。RNA和DNA的正常键合或骨架为3’到5’的磷酸二酯键。
为了局部传输反义化合物，这些寡核苷酸可以含有被修饰的骨架或非天然的核苷间键。如在说明书中定义的，具有被修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留了磷原子的那些，以及在骨架中不具有磷原子的那些。为了说明书的目的，以及有时在本领域中被参考，在其核苷间骨架中不具有磷原子的被修饰寡核苷酸也可以被视为寡核苷。
本文中，其内含有一个磷原子的被修饰寡核苷酸骨架优选包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和包含3’-亚烷基磷酸酯的其它烷基磷酸酯、5′-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、次膦酸酯、包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，具有正常的3’-5’键，其2’-5’连接的类似物，和具有反转极性的那些，其中，一种或多种核苷酸间键为3’-3’、5’-5’或2’-2’键。优选的具有反转极性的寡核苷酸包括一个位于最3’-的核苷酸间键处单个的3’-3’键，即单个的反转核苷残基，其可以为无碱基的(缺少核碱基或在该位置具有一个羟基基团)。也包括各种盐、混合的盐以及游离酸形式。
在一种备选的实施方案中，包括DNA“疫苗”的遗传结构被用于产生植物细胞中的反义或有义分子。而且，上述许多优选特征适用于有义核酸分子。
本发明另一方面涉及一种用于控制昆虫群体的方法，所述方法包括将有效量的试剂施用到昆虫一段时间，并且是在足以抑制HpF5表达或足以抑制HpCh5活性的条件下，其中，所述调节导致所述昆虫的生物适合度降低。
在本发明的一种优选实施例中，试剂为可结合到HpCh5的初级底物结合口袋的试剂，并且不受在第192位发现的精氨酸残基的影响。
提及“生物适合度降低”应当理解为昆虫中的变化，包括但是不局限于体重和/或生育能力的变化。优选地，这些变化被理解为体重和/或生育能力均降低。因此，生物适合度降低包括其生长和发育降低。
另一方面，本发明提供了一种用于检测能够调节HpCh5或其功能等价物或衍生物功能的试剂的方法，所述方法包括将推定的试剂施用到含有所述HpCh5或其功能等价物或衍生物的昆虫，并检测与调节HpCh5或其功能等价物或衍生物的功能有关的活性表型变化。
提及“施用”HpCh5的调节剂到指以任何便利的方式传输调节剂。在农业的框架中，这有可能包括，但是不局限于：
(i)作为喷雾剂或粉末制剂中的活性成分的试剂的传输；或者
(ii)产生作为蛋白质或植物中代谢途径产物的试剂。
在本发明的优选实施例中，试剂施用是通过将编码所述试剂的核酸引入到植物中，用于随后的表达和产生试剂。另一种优选的实施例为制成喷雾剂或粉末制剂，以所述试剂为活性成分。
“引入”试剂将被理解为涵盖本领域公知的在植物中进行遗传变化的所有方式。这些包括但是不局限于植物转化方法，如微粒轰击、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、电穿孔和病毒转染；植物繁殖技术和天然植物基因的突变形成。
相应地，在本发明的上下文中，将编码HpF5的反义或有义形式或者编码HpCh5活性或HpF5表达的抑制剂的核酸分子可操作性地连接到启动子，通常在载体或其它适当的介质中，用于引入到植物基因组。供选地，现有的PI可以被克隆和修饰，以使其对HpCh5为有活性的。
本发明还提供了一种遗传修饰的植物，其包含能够产生HpCh5或HpF5基因表达的拮抗物之细胞。在一种特别有用的实例中，棉花或其它农作物被设计以产生PotI或PotI和NaPI的组合。本文中，提及“PotI”和“NaPI”包括提及衍生物、变体和同系物，包括对PotI或NaPI中的一种或多种域的修饰。
本文中，提及“启动子”为其最广义的含义，并包括经典染色体组基因的转录调节序列，包含精确转录开始所必需的TATA盒，含有或不含CCAAT盒序列和其它调节元素(即上游的活化序列、增强子和沉默子)，其相应于发育的和/或外部刺激物或以组织特异性方式改变基因表达。启动子通常，但不是必需的，设置在上游或5’，或结构基因区域，它调节其表达。而且，包含启动子的调节元素通常位于基因转录的开始位点的2kb内。
在本文中，术语“启动子”也用于描述合成的或融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞中核酸分子的表达。
优选的启动子可以含有一种或多种特异性调节元素的额外拷贝，以进一步增强有义分子的表达，和/或改变所述有义分子的空间表达和/或时间表达。例如，赋予铜可诱导性的调节元素可以被放置在异源的启动子序列附近，该序列驱动有义分子的表达，从而在所述分子的表达上赋予铜的可诱导性。
将核酸分子置于启动子序列的调控下指将所述分子放置成使其表达被启动子序列控制。启动子通常设置到它们所控制的基因的5’(上游)。在异源启动子/结构基因组合的结构中，通常优选将启动子设置成离基因转录开始位点的距离大约与启动子和在其自然框架中其控制的基因，即启动子来源的基因之间的距离相同。如本领域公知的，在不损失启动子功能的前提下，可以适应距离的一些改变。相似地，就受其控制的待放置的异源基因而言，优选的放置调节序列元件被定义为将元件放置在其自然框架，即启动子来源的基因中。再次，如本领域公知的，也可以出现距离上的一些改变。
相应于细胞，发生表达的组织或器官，或者相应于发生表达的发育阶段，或相应于外部的刺激物(如生理应激)，或病原体，或金属离子或其它，启动子可以组成性地或有差异地调节HpF5或其变体或同系物的表达。
优选地，启动子能够调节核酸分子在植物细胞、组织或器官中的表达，至少在目标基因被表达期间，并且也更优选立即先于在所述细胞、组织或器官中出现可检测的HpF5基因表达。
相应地，强的组成型启动子特别用于本发明的目的，或者可以通过病毒感染或出现HpF5基因表达而被诱导的启动子。
植物可操作的启动子特别优选用于本发明的构建体中。适当的启动子的实例包括pCaMV 35S(Fang等，Plant Cell 1：141-150，1989)、PEGL1(Hajdukiewicz等，Plant Mol.Biol.25：989-994，1994)、III类几丁酶(Samac和Shah，Plant Cell 3：1063-1072，1991)、pin2(Keil等，EMBO J.8：1323-1330，1989)、PEP羧化酶(Pathirana等，Plant J.12：293-304，1997；MAP激酶(Schoenbeck等，Molec.Plant-Microbe Interact，1999)、MSV(Legavre等，第五次植物分子生物学国际会议，Singapore，1997)、pltp(Hsu等，Plant Sci.143：63-70，1999)、pmpi(Cordero等，有关Rockefeller基金的大米生物技术的国际项目的会议，Malacca，Malaysia，1997)或谷氨酸胺合酶(Pujade-Renaud等，PlantPhysiol.Biochem.35：85-93，1997)。
在本文中，术语“可操作性的连接”或“可操作性地控制”或相似术语应当被视为表示在细胞、组织、器官或整个植物中核酸分子表达受控于与其在空间上连接的启动子序列。
构建体优选含有其它调节元件，用于有效的转录，例如，转录终止序列。
术语“终止子”指一种转录单元末端的DNA序列，其为转录终止信号。终止子为3’-非被翻译的DNA序列，通常含有一个聚腺苷酸化信号，其促进将聚腺苷酸序列加入到初级转录物的3’-端。在植物细胞中有活性的终止子为公知的并描述在文献中。它们可以从细菌、真菌类、病毒、动物和/或植物中分离或从头合成。
如启动子序列，终止子可以为任何终止子序列，其在希望被使用的细胞、组织或器官中为可操作的。
特别适用于本发明的合成基团的终止子的实例包括SV40聚腺苷酸化信号、HSV TK聚腺苷酸化信号、CYC1终止子、ADH终止子、SPA终止子、根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S基因的终止子、来自玉米(Zea mays)的玉米醇溶蛋白基因终止子、Rubisco小的亚单位基因(SSU)基因终止子序列、亚三叶草钝化(subcloverstunt)病毒(SCSV)基因序列终止子、任何rho独立的大肠杆菌终止子、或1acZ α终止子，或其它。
在特别优选的实施方案中，终止子为SV40聚腺苷酸化信号或HSV TK聚腺苷酸化信号，其在动物细胞、组织和器官中为可操作的，在植物细胞、组织或器官中为有活性的章鱼碱合酶(OCS)或胭脂碱合酶(NOS)终止子，或在原核细胞中为有活性的lacZ a-终止子。
本领域技术人员将意识到，其它的终止子序列可以适用于实施本发明。所述序列可以很容易被使用，无任何过度的实验。
用于将构建体引入(即转染或转化)细胞的手段为本领域技术人员公知的。
前述构建体能够进一步被修饰，例如，通过包含标记物核苷酸序列，所述序列编码了一种可检测的标记物酶或其功能上的类似物或衍生物，以便于检测在细胞、组织或器官中被表达的合成基因。根据该实施方案，标记物核苷酸序列将以可译形式存在并被表达。
本领域技术人员将意识到如何产生本文描述的构建体和当希望那样时，在预期的条件下，在特定的细胞或细胞类型中用于其表达的必要条件。特别是，本领域技术人员公知的是实施本发明所需的遗传操作可能需要在原核细胞中如大肠杆菌细胞或植物细胞或动物细胞中繁殖本文描述的遗传构建体或其衍生物。
本发明的构建体可以以线性DNA不加修饰地被引入适当的细胞、组织或器官，任选包含在一种适当的载体，如细胞、病毒微粒或脂质体等中。为了产生遗传构建体，将核酸(例如HpF5)插入到适当的载体或游离基因分子中，如噬菌体载体、病毒载体或质粒、装配型质粒或人工染色体载体，其能够在随后被引入的宿主细胞、组织或器官中被维持和/或复制和/或表达。
相应地，本发明另一方面提供了一种遗传构建体，其至少包括一种如本文中描述的遗传元件，以及一种或多种复制和/或可选的标记物基因序列的来源。
通常，从那些包含在遗传构建体中的遗传序列中物理分离适用于细菌的复制或可选的标记物基因的来源，其旨在被表达或转移到植物细胞中，或整合入植物细胞的基因组。
如本文中所用的，术语“可选的标记物基因”包括任何赋予其上被表达的细胞上的表型的基因，以便于识别和/或选择细胞，其被本发明的遗传构建体或其衍生物转染或转化。
本文中预期的适当可选标记物基因包括氨苄青霉素-抗性基因(Ampr)、四环素-抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素-抗性基因(Kanr)、zeocin抗性基因(Zeocin为博来霉素族药物，为InVitrogenCorporation的商标)、赋予抗生素aureobasidin A的抗性的AURI-C基因、膦丝菌素-抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素-抗性基因、β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、氯霉素酰基转移酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白质编码基因或荧光素酶基因，或其它。
优选地，可选的标记物基因为nptII基因或Kanr基因或绿色荧光蛋白质编码基因(GFP)。
本领域技术人员将意识到其它可选的标记物基因，可有效地用于实施本发明，并且本发明不受可选标记物基因的本性限制。
本发明扩展至所有的遗传构建体，基本上如本文描述的，其还包括用于在原核生物或真核生物中维持和/或复制所述遗传构建体和/或将所述遗传构建体或其一部分整合入真核细胞或生物的基因组中的遗传序列。
前述的标准方法可以被用于将构建体引入细胞、组织或器官，例如，脂质体介导的转染或转化、采用减毒的病毒颗粒或细菌细胞转化细胞、细胞交配、转化或转染步骤为本领域技术人员公知的。
其它用于将重组DNA引入到植物组织或细胞的手段包括，但是不局限于，利用CaCl2进行转化及其变体、直接将DNA摄入原生质体、PEG-介导的原生质体摄入、微粒轰击、电穿孔、微量注射DNA、微粒轰击组织外植体或细胞、用核酸对组织真空浸润，或者在植物的情况下，由T-DNA-介导的从农杆菌转移到植物组织。
对于细胞的微粒轰击，将微粒推入细胞以产生转化细胞。任何适当的轰击细胞转化方法和设备可以被用于实施本发明。Stomp等(美国专利号5,122,466)以及Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050)公开了示范性的设备和步骤。当采用轰击转化步骤时，遗传构建体可以掺入质粒，其能够在将被转化细胞中进行复制。
适用于所述系统的微粒实例包括1-5μm的金球。采用任何适当的技术，如沉淀，可以将DNA结构沉积到微粒上。
在本发明的又一实施方案中，本文描述的遗传构建体适于掺入于在其中表达的细胞的基因组。本领域技术人员将意识到，为了实现将遗传序列或遗传构建体整合入宿主细胞的基因组，可能需要某些其它的遗传序列。在植物的情况下，通常需要来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA的左和右边界序列。
本发明进一步扩展至包括该构建体或其部分的分离细胞、组织或器官。本发明还延伸到源于所述细胞、组织和器官的再生组织、器官和整个生物，以及其繁殖体和后代以及种子和其它繁殖材料。
例如，植物可以在含有激素的介质上从转化的植物细胞或组织或器官再生，并且再生的植物可以采用多种形式，如转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性转化体(例如所有细胞被转化以含有表达盒)；转化的和未转化组织的接枝(例如，在柑桔属物种中，转化的根茎接枝到未转化的幼芽)。转化的植物可以采用多种手段繁殖，如通过无性繁殖或传统的繁殖技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自花授精，以产生纯合的第二代(或T2)转化植物，并且T2植物进一步通过经典的繁殖技术繁殖。
本文中预期的植物包括棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李属、高粱属、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、鹰嘴豌豆、木豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(观赏用植物)、天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、羽扇豆、蚕豆、青豆、花生、菜籽油、金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花、蜡菊属(观赏用植物)、小麦、大麦、燕麦、黑小麦、胡罗卜、洋葱，兰科植物、蔷薇属和矮牵牛花。
本发明另一方面涉及不敏感的胰凝乳蛋白酶(作为一种可选的标记物)用于转化昆虫。目前，用于昆虫种系转化的方法涉及用包括转位因子、目的基因和可选标记物的遗传构建体注射昆虫胚。采用包括目的基因和一种可选标记物的病毒载体，也可以实现昆虫体细胞的转化(Peloquin等，J.Cot.Sci.5：114-120，2001)。目前，采用昆虫的白眼突变体进行大多数的昆虫转化，以允许检测常用的可选标记物。典型地，可选的标记物为互补白眼突变或增强的绿色荧光蛋白质(EGFP)基因。在果蝇(Drosophila)中，白眼突变由突变等位基因如ω1118等位基因引起。通过引入等位基因，其赋予正常的眼睛色素沉着，如白色(Lidholm等，Genetics 134：859-868，1993)或微白(Lozovskaya等，Genetics 142：173-177，1996)，使这些个体可以回复到正常的(红色)眼睛色素沉着。ω1118突变体向正常的眼睛色素沉着的转变作为引入载体的标记物。以相似的方式，EGFP已经被用于指示载体存在。再次，使用了具有无色眼睛的昆虫，并且在这些昆虫的眼睛中检测EGFP表达(Hediger等，Insect Mol.Biol.10：113-119，2001)。
本领域常用的可选标记物需要解剖昆虫，以检查眼睛的色素沉着或EGFP荧光，其为耗时的，并需要破坏性的昆虫取样。本发明提供了一种用于选择被转化个体的手段，不需要昆虫解剖或检查各个昆虫。这将允许恢复活的转化体，并提供了一种不费力的手段，可一次筛选大量的推定转化体。此外，本发明提供了一种用于选择转化体的手段，其不依赖于白眼突变体的可得性。
本发明预期HpF5或其编码NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的衍生物、同系物或类似物在昆虫转化载体中作为一种可选的标记物的用途。该载体(包括HpF5)将有效地用于选择任何昆虫的转化体，所述转化体容易受花烟草的C1丝氨酸蛋白酶抑制剂的影响。预期的昆虫可以天然地耐受C1，或者可以为容易受NaPI影响的突变体，或者为天然地对NaPI有抵抗力的昆虫的基因修饰的容易受NaPI影响的菌株。在本发明特别优选的实施例中，所述载体的昆虫宿主为鳞翅目。
采用本领域公知的常见分子生物技术，编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的HpF5或其衍生物、同系物或类似物可以掺入任何昆虫转化载体中。一旦转化，昆虫将转录HpF5并产生HpCh5，对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。随后，通过将花烟草的C1蛋白酶抑制剂掺入昆虫的食物中选择转化的个体。在这种情况下，载体中不携带由HpF5编码的不敏感胰凝乳蛋白酶的个体将死亡，并且携带编码HpF5的载体的那些将对C1不敏感。
相应地，本发明提供了包括杆状病毒载体的昆虫转化载体，所述载体含有HpF5或其衍生物、同系物或类似物，作为一种可选的标记物。载体可以以任何目的用于昆虫中。非限制性的实例包括：基因克隆、基因表达和基因敲除。其内可掺入作为可选标记物的HpF5的昆虫转化载体的特定实例包括，但是不局限于：利用PIggyBac可活动元件的那些(Hediger等，2001，出处同前)；以P元件基载体(Cripps等，J.Cell Biol.126：689-699，1994)；以hobo元件基载体(Lozovskaya等，1996，出处同前)；以mariner元件基载体(Lidholm等，1993，出处同前)；以及病毒载体，如pTE/3′2J(Peloquin等，2001，出处同前)。
通过以下非限定性的实施例进一步描述本发明。
                        实施例1
摄食花烟草蛋白酶抑制剂对棉铃虫的种的生长和发育的影响
试验了花烟草PI对消化酶以及澳洲棉铃虫和棉铃虫幼虫的生长和发育的影响(Heath等，J.Insect Physiol.43：833-842，1997)。在采用14C-酪蛋白为底物进行的体外分析中，PI抑制肠道蛋白酶总活性的73％。当掺入人工食物中时，PI延缓了澳洲棉铃虫(Heath等，1997，出处同前)(图2A和2B)和棉铃虫的生长和发育。当来自两物种的幼虫进食转基因烟草(N.tabacum)时，取得了类似的结果，所述烟草在0.2％-0.5％可溶性蛋白质的水平上表达花烟草PIs(Heath等，1997，出处同前)。
摄食NaPI(C1、C2和T1-T4)改变了肠道以及澳洲棉铃虫幼虫的排泄物中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的相对活性。当暴露于NaPI后，肠道以及排泄物中胰蛋白酶的活性大大降低或被取消，然而，胰凝乳蛋白酶活性经常不受影响或被增强(图2C和2D)。在进食NaPI的幼虫的排泄物中，缺少胰蛋白酶活性并非是由于胰蛋白酶的产生减少。事实上，蛋白质印迹被用于证明这些昆虫已经过度地产生了应签PIs的胰蛋白酶，但它完全被失活(图2E)。
有趣的是，在摄食NaPIs后产生的胰凝乳蛋白酶不受NaPIs的抑制，然而，由对照昆虫(未暴露于NaPIs)产生的一些胰凝乳蛋白酶为可抑制的(图2F)。在对照昆虫中，抑制程度在个体间变化，并处从约75％到完全无抑制。这提示棉铃虫的幼虫产生不同类别的胰凝乳蛋白酶；一些为可被NaPIs抑制的(对PI敏感的)，并且一些为不可抑制的(对PI不敏感的)。因此，表面看来，摄食NaPIs可抑制棉铃虫幼虫肠道中的胰蛋白酶活性，但是，如果幼虫产生对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶，它们可以不受严重影响。在后来的实验中，从澳洲棉铃虫幼虫移出肠内物质，所述幼虫用扁豆食物喂大，未添加蛋白酶抑制剂。肠胰凝乳蛋白酶活性被NaPI抑制剂(C1、C2、T1--T4)抑制约80％，并被单独C1抑制70％(图3)。来自大豆的Bowman Birk和胰蛋白酶抑制剂以及利马豆胰蛋白酶抑制剂也未能取消所有的胰凝乳蛋白酶活性，然而，活性完全被马铃薯PotI抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制。利用该信息制备一系列亲和柱，以识别和纯化来自澳洲棉铃虫幼虫肠道的对NaPI不敏感的和敏感的胰凝乳蛋白酶。
生物测定用人工食物喂养的棉铃虫幼虫
扁豆食物
用基于扁豆的人工食物喂养澳洲棉铃虫幼虫(Teakle等，Journal of Invertebrate Pathology 46：166-173，1985)。1升食物包括58.5g扁豆、14g琼脂、700ml水、35g Tortula酵母、50g麦芽、3.5g抗坏血酸、1.1g山梨酸、2.2g对羟基苯甲酸甲基酯、0.2g氨苄青霉素、0.2g链霉素、16mgprochloraz。将豆在水中浸泡过夜，排干水并变为均匀分布的微粒细糊。加入麦芽、酵母和300ml水。将琼脂溶解在400mL沸水中，并加入到所述混合物中。在加入剩余成分前，将混合物冷却至50℃。将混合的食物倒入盘中，并在成形后立即使用，或于-20℃下保存不超过2星期。将检测的食物添加NaPI(0.26％(重量/体积))，并且对照食物具有等量的酪蛋白。将20个新出生的新虫加入到每种食物中，并且每2天纪录死亡率。在第6天纪录到重量增加，并随后在每个第二天作纪录。将幼虫饲养在1.5ml的eppendorf微量离心管中(1个幼虫/试管)直到第8天，此时，将它们转移到各个带盖子的塑料容器中(SOLO[商标]塑料部分杯，28mL)。起初，用少量食物(40mg)喂养幼虫，并被所需量取代，以提供一种连续的供应。将幼虫保存在25±1℃的控温房间内，16∶8(L∶D)。
棉花叶食物
从棉花植物的新鲜小叶制备棉花叶人工食物(cultivar Coker315)，所述植物生长在无昆虫、无杀虫剂的26℃(±2℃)控温箱中，光管理为16∶8(L∶D)。采摘后，立即将叶冷冻在液氮中并冻干。干燥后，将叶在研钵和研杵中制成细粉末。采用与扁豆人工食物相同的方式来制备棉花叶人工食物，使用了从马铃薯叶人工食物改造的处方(Gatehouse等，J.Insect Physiol.45(6)，545-558，1999)。100克棉花叶人工食物含有3g棉花叶粉末、0.08mL亚麻子油、2g酵母、0.016mL麦芽油、2.4g麦芽、0.028g氨苄青霉素、3.2g抗坏血酸、0.028g链霉素、0.08g山梨酸、3.2g琼脂、0.16g paraben(防霉剂)，加入NaPI或酪蛋白至所需的百分数(重量/体积)。
制备各个肠道和虫粪提取物
于4℃下进行所有的工作。将来自幼虫的每个肠道切开，并放于1.5mL的微量离心管中，其含有500μL 冰冷的10mM Tris-HCl，pH8。采用微研杵(Eppendorf)将肠道及肠道内容物制成均匀分布的颗粒。通过在13,000g离心4min去除不溶物，并将上清液保存于-80℃。以相同的方式制备虫粪提取物，采用了200mg虫粪/mL缓冲液。利用Bradford方法(Bradford，Anal Biochem 72：248-254，1976)，以来自Bio-Rad的试剂和BSA作为标准物质，测定总的蛋白质浓度。
胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性
在pH10的50mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS缓冲液)中测定肠道蛋白酶活性，对于胰蛋白酶，利用生色底物N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺(BApNA)，并且对于胰凝乳蛋白酶活性，利用N-琥珀酰-L-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(SA-2PFpNA)。底物为新鲜制备的，作为在10％(重量/体积)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的1mM溶液，50mM CAPS缓冲液，pH10。按照Heath等(Eur.J.Biochem.230(1)：250-257)的方法一式两份或一式三份进行分析。不含酶的空白溶液被用于说明任何自发的底物降解。于30℃下在SpectraMax 250微量滴定板读数器上(MolecularDevices)30min后，在405nm纪录对硝基苯胺的释放。
由NaPI抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性
采用上述的标准胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分析进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制测定，除了在加入底物前，将样品于30℃下用T1或C1抑制剂(80nM)预培养30min，以启动反应。如Heath等，1999，出处同前所述，NaPI单体T1和C1为HPLC纯的。
存在和不存在蛋白酶抑制剂时的胰凝乳蛋白酶分析
制备肠道提取物
去除各个肠道前，采用乙酸乙酯杀死第4龄幼虫，随后将其在研钵和研杵中变为匀浆的[(重量/体积)]50mM Tris-HC1，pH8.0含有100μM苯甲脒中。于4℃下，通过在20,000rpm下离心15min去除不溶物，并采用Bradford方法测定总的蛋白质浓度(Bradford，Anal Biochem 72：248-254，1976)，以来自BioRad的试剂和BSA作为标准物质。
分析
将含有约1μg缓冲液可溶性蛋白质的未分级分离的肠道提取物加入到10μL CAPS缓冲液中(0.5M，3-[环己基氨基]-1-丙磺酸，pH10)，并在96孔微量滴定板的各个孔中制成最终体积为100μL。加入处于一定浓度范围的蛋白酶抑制剂，并于25℃下培养15min。将牛胰凝乳蛋白酶(100ng)用作活性和抑制的阳性对照。随后，加入生色的人工底物SAAPFpNA(N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-4-硝基苯胺)至最终浓度为1mM，并且采用SpectraMax250微量滴定板读数器(Molecular Devices)在405nm测量底物的水解。
蛋白酶抑制剂
利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBTI)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、大豆Bowman-Birk抑制剂(SBBI)和胰凝乳蛋白酶全部购自Sigma-Aldrich Pty.Ltd。马铃薯抑制剂I购自Calbiochem-Novabiochem，或从马铃薯块茎纯化(实施例6)。马铃薯抑制剂I和II的粗混合物也得自马铃薯。采用Atkinson等，1993，出处同前和Heath等，1995，出处同前描述的方法纯化花烟草蛋白酶抑制剂(NaPIs)。从细菌表达培养物中纯化胰凝乳蛋白酶抑制剂C1。抑制剂的纯度由SDS-PAGE和银染进行评估。
                        实施例2
分离来自澳洲棉铃虫肠道的NAPI敏感和不敏感胰凝乳蛋白酶
对棉铃虫胰凝乳蛋白酶进行的大多数已公布的工作集中于cDNA克隆或测量未分级分离的肠道提取物中的酶活性。对纯化来自棉铃虫或其它鳞翅目物种的胰凝乳蛋白酶少有报道。Johnston及同事(1995，出处同前)描述了采用离子交换技术局部纯化来自棉铃虫(H.armigera)的胰凝乳蛋白酶。Peterson及同事(Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774，1995)通过采用亲合色谱法在色氨酸甲基酯上提纯来自鳞翅目Manduca sexta的中肠胰凝乳蛋白酶，并且Valiatis等(Insect Biochemistry and Molecular Biology 9：405-415，1999)利用固定化的马铃薯蛋白酶抑制剂I(PotI)从西部云杉蚜虫中分离胰凝乳蛋白酶。没有人曾描述从另一个中分离各个胰凝乳蛋白酶同功酶的方法，并且未描述从单一物种中分离两种胰凝乳蛋白酶，其中，一种同功酶可被一种特定蛋白酶抑制剂抑制，而另一种则为不可抑制的。
制备纯酶以及N端测序
将来自80个第四龄幼虫的中肠切开，并制备缓冲液可溶性提取物。肠道提取物通过重复穿过苯甲脒-琼脂糖亲和柱而消耗胰蛋白酶。收集未键合的蛋白质，并施加到由固定化的胰凝乳蛋白酶抑制剂C1组成的亲和柱上(图1)，所述抑制剂C1采用细菌表达系统产生。预期该柱特异性地结合对NaPI敏感的胰凝乳蛋白酶。将不结合到该柱的蛋白质施加到第三亲和柱上，柱由固定化的马铃薯Type I(PotI)和Type II抑制剂(PotII)组成或者由胰凝乳蛋白酶组成。该柱被设计成捕获不结合到C1柱的胰凝乳蛋白酶，即，NaPI不敏感胰凝乳蛋白酶。用8M尿素洗脱键合到亲和柱的蛋白质，并且在转移到PVDF膜用于N端测序前，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(图4和5)。
获得了N端序列的约30个氨基酸，其证实该蛋白质确为胰凝乳蛋白酶，并且敏感和不敏感的胰凝乳蛋白酶为不同基因的产物(图4和5)。
制备消耗了胰蛋白酶的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶以及对NaPI敏感的胰凝乳蛋白酶，用于生化分析
将来自100个第四龄幼虫的中肠切开，并制备缓冲液可溶性提取物。肠道提取物通过穿过亲和柱的通道消耗对NaPI敏感的蛋白酶，柱由固定化的NaPI蛋白质(C1、C2、T1-T4)组成。所有的胰蛋白酶和对NaPI敏感的胰凝乳蛋白酶键合到柱上，对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶不键合。制备未键合的物质用于研究pH最佳值、底物偏好以及一定范围的蛋白酶抑制剂对NaPI不敏感的蛋白酶活性的影响。图6显示了pH对不敏感的胰凝乳蛋白酶活性的影响。低于pH6，酶为无活性，并且在pH10-12，活性最大，与其在幼虫的碱性中肠中的作用一致。使用7种不同的商用底物测定了用于酶分析的最好底物。最好的底物为N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)，随后是N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺(sAAPL-pNA)和N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Met-对硝基苯胺(mAAPM-pNA)。N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(sAAA-pNA)、苯甲酰-tyr-p-NA、Ac-Pro-Leu-Ser-p-NA和Ac-Asn-Gly-Ile-Pro-p-NA不是底物。
测试了几种蛋白酶抑制剂对不敏感的胰凝乳蛋白酶活性的抑制能力。对于所有的分析，采用的缓冲液为pH10的500mM CAPS、75mM NaCl、2.5mM MgCl2。在加入底物前，将抑制剂预先于30℃下用100ng牛胰凝乳蛋白酶培养30min，或所需的肠胰凝乳蛋白酶量以产生与100ng牛胰凝乳蛋白酶相同的吸光度(需要指出的是，棉铃虫酶已消耗胰蛋白酶和敏感的胰凝乳蛋白酶，但仍含有其它的肠道蛋白质)。室温下，在测量405nm的吸光度前，继续培养另外30min。PotI为最好的蛋白质抑制剂，并且NaPI不抑制(表3)。
实验方案
苯甲脒柱
苯甲脒-琼脂糖(1mL)购自ICN Biomedicals，并含有35微摩尔苯甲脒/ml凝胶。
产生C1-亲和柱
利用寡核苷酸引物从pNa-PI-2-cDNA(Atkinson等，1993，出处同前)扩增编码NaPI(图1，Atkinson等，1993，出处同前)的C1域的DNA，引物中掺入BamH1(5’GACCAGCCGGATCCGATCGGATATGCACCAAC)[SEQ ID NO：7]和HindIII(3’GGAGCCAAGCCAAGCTTTGAACGCG GGCAAACTC)[SEQ ID NO：8]位点，用于克隆为入pQE表达载体(Qiagen)。将PCR产物亚克隆入pCR(注册商标)2.1-TOPO载体(Invitrogen)，随后用BamH1和HindIII切除，并连接入pQE-30载体。表达载体在被表达的蛋白质的N端包含一个6组氨酸标记，用于金属亲和纯化。C1/pQE-30构建体被转化为化学感受态的大肠杆菌菌株M15(Qiagen)，其根据Inoue等，基因96：23-28，1990的方法制备。细菌表达培养物生长并根据在QiaExpress manual(Qiagen)中略述的步骤进行诱导。通过采用1mM IPTG诱导来实现6H.C1重组蛋白质的表达。以每小时的时间间隔从培养物中去除样品(1ml)，采用离心收集并重新悬浮在1X SDS填充缓冲液中(100μL)，用于SDS-PAGE分析。
根据厂商的方案，在变性条件下，采用Talon金属亲和树脂(2mL)纯化重组的C1抑制剂(BD Biosciences Clontech)。从亲和基质中洗脱C1，并利用SDS-PAGE检测以证实纯度。在相同条件下进行后几轮表达，并采用Talon树脂提纯来自总共2L培养物中的C1。当清洗去除未键合的蛋白质后，残留的C1抑制剂键合到Talon树脂的，其随后被用作亲和柱，以提纯来自肠道制品的胰凝乳蛋白酶。
马铃薯抑制剂I和马铃薯抑制剂II亲和柱
根据厂商的方案，使溴化氰活化的琼脂糖4B(1g)膨胀并进行清洗。将马铃薯I和II抑制剂的混合物(10mg)溶解在偶联缓冲液中[0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3]，与凝胶悬浮物混合，并在端对端(end-over-end)混合器中于4℃培养过夜。在封闭缓冲液中[0.1M Tris-HCl，pH8.0]冲洗凝胶几次以去除过量的配合基。清洗后，将偶联的琼脂糖与新鲜的封闭缓冲液混合，并于4℃培养过夜。将凝胶浆转移到柱上(Amersham Biosciences)，并采用5倍柱容量的偶联缓冲液随后是5倍柱容量的冲洗缓冲液[0.1MNaOAc，0.5M NaCl，pH4.0]交替地进行清洗(x3)。最后，用偶联缓冲液充分清洗基质，并于4℃下保存在20％(体积/体积)乙醇中。
胰凝乳蛋白酶亲和柱
根据厂商的说明书，将胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich)固定化于EAH琼脂糖-4B上(1.5ml；Sigma-Aldrich)。将胰凝乳蛋白酶(10mg)溶解在500μL冰醋酸中，随后加入1mL蒸馏水，并用稀释的NaOH将pH调至4.5。在将EDC[N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]缓慢加至最终浓度为0.1M前，将凝胶悬浮物和胰凝乳蛋白酶溶液混合。于4℃下，在采用Milli-Q过滤的水清洗凝胶前，将凝胶悬浮物混合过夜，以去除过量的配基和未反应的碳二亚胺，并且于4℃下将凝胶基质保存在20％[(体积/体积)]乙醇中。
纯化对NaPI敏感和不敏感的胰凝乳蛋白酶
在10ml肠道提取物缓冲液中(20mM CAPS pH10，350mM NaCl)采用研钵和研杵将来自保存于-80℃下的第五龄幼虫的80个肠道匀浆。4℃下，在15,000g下将肠道提取物离心15min，并通过注射器过滤器(0.45μM；Millipore)过滤上清液，随后，在施加到苯甲脒亲和柱前，简短地保存在冰上。
将过滤的肠道提取物通过苯甲脒柱5次以去除胰蛋白酶。在采用20mL提取缓冲液冲洗柱前，将未键合的片段(10mL)通过C1亲和柱(x3)，并且将键合的蛋白质用8M尿素pH8.0冲洗(5mL)。在采用10倍柱容量的缓冲液[20mM CAPS pH10，0.5M NaCl]清洗前，将未结合到C1柱的蛋白质施加到马铃薯抑制剂I和II亲和柱上，并采用8M尿素pH8.0(5mL)洗脱键合的蛋白质。
分析亲和纯化的肠道蛋白质：SDS-PAGE
采用TCA沉淀来浓缩肠道蛋白质样品(5-10μg)，并重新悬浮在0.2M NaOH中(10μL)。加入SDS-PAGE样品缓冲液(50mMTris-HCl，pH6.8，2％(重量/体积)SDS，10％(体积/体积)丙三醇，5％(体积/体积)β-巯基乙醇，0.1％(重量/体积)]溴酚蓝)，并且在采用MiniProtean II电泳设备(Bio-Rad)在200伏下于12.5％(重量/体积)还原聚丙烯酰胺凝胶上进行分离前，将样品加热到100℃ 5min。大范围或肽分子尺寸的标记物(Bio-Rad)被用于估计相对分子量。电泳后，通过采用考马斯亮兰R-250(0.1％(重量/体积)，在40％(体积/体积)甲醇、10％(体积/体积)醋酸中)染色60min而使蛋白质可视化，接着在40％(体积/体积)甲醇、10％(体积/体积)醋酸中退色，或者转移到硝酸纤维素(0.22μM pore size；Micron Separations Inc。)或Sequi-印迹聚偏二氟乙烯膜(PVDF；Bio-Rad)。
免疫印迹和N端测序
电泳后，在采用Mini Trans-印迹设备(BioRad)在100V下60min将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(0.22μM孔尺寸；MicronSeparations Inc。)前，使凝胶在转移缓冲液(192mM氨基乙酸，48mM Tris-碱基，20％(体积/体积)甲醇)中平衡10min。简单地在TBS(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)中清洗膜，随后用酰胺黑(以1∶50稀释0.1％(重量/体积)酰胺黑、40％(体积/体积)甲醇、10％(体积/体积)醋酸)染色以证实蛋白质转移，并目视分子尺寸标记物。随后在RT时，通过采用3％(重量/体积)脱脂奶粉(Dutchjug)在TBST[0.1％(重量/体积)Tween-20在TBS中]中培养1h封闭印迹，接着用α-胰凝乳蛋白酶抗体(HpCH2B；在3％(重量/体积)脱脂奶粉的TBST中以1∶5000稀释)培养1h。硝酸纤维素印迹随后在TBST中被冲洗3次(5min)，并在RT时，用二级抗体(抗兔IgG偶联的辣根过氧化酶，在TBST中以1∶5000稀释；AmershamBiosciences)培养1小时。用TBST清洗膜3次(5min)，并且根据厂商的说明书，利用增强的化学发光(ECL)试剂和Hyperfilm ECLX射线照片(Amersham Biosciences)使免疫反应的蛋白质可视化。
为获得N端序列，采用Mini Tr ans-印迹细胞(BioRad)在100V下45min，将样品转移到在电印迹缓冲液(10mM CAPS，10％(体积/体积)甲醇，0.01％(重量/体积)SDS，pH11)中平衡的Sequi-印迹PVDF膜上(BioRad)。转移后，在Milli-Q水中简单地冲洗膜，采用考马斯亮兰染色(0.1％考马斯兰R-250，1％(体积/体积)醋酸，40％(体积/体积)甲醇)并随后退色(50％(体积/体积)甲醇)。最后，为了进行N端测序，在切除适当的蛋白质前，用水冲洗膜并干燥。
                     实施例3
   克隆编码来自澳洲棉铃虫的肠胰凝乳蛋白酶的cDNA
采用两种方法获得了编码澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶的cDNA。两种方法均采用了PCR扩增从澳洲棉铃虫幼虫提取的中肠mRNA产生的cDNA，该澳洲棉铃虫幼虫处于发育的第四晚龄期和第五早龄期。
利用互补于棉铃虫(H.armigera)胰凝乳蛋白酶的高度保守区域的寡核苷酸分离胰凝乳蛋白酶克隆
Bown及其同事(1997，出处同前)已经描述了几种编码棉铃虫(H.armigera)胰凝乳蛋白酶的cDNA克隆。图7显示了预测的蛋白质和互补于寡核苷酸的区域(图8)，选择其用于PCR扩增来自澳洲棉铃虫的胰凝乳蛋白酶cDNA。将PCR产物克隆和测序，获得了5种不同的胰凝乳蛋白酶序列(F1Apcr、F1Bpcr、F2Bpcr、F3pcr和F4pcr，图9)。这些PCR产物被用于筛选cDNA文库，所述文库从第四龄晚期和第五龄早期的幼虫分离的中肠mRNA中制备。分离了7种编码胰凝乳蛋白酶的不同cDNA克隆，其基于序列同一性被分为4族(图10，表2)。这些胰凝乳蛋白酶与Bown等，1997，出处同前描述的棉铃虫胰凝乳蛋白酶共享高序列同一性，并具有为H.virescens和玉米夜蛾报道的小数目的胰凝乳蛋白酶序列(表6)。由图10中显示的全长克隆编码的胰凝乳蛋白酶特征性地编码了具有大约292-295氨基酸的酶原，包括假定的由信号肽预测程序PSORTII预测的具有16-17个残基的氨基-末端信号肽。在几种活性胰凝乳蛋白酶的N端存在残基IVGG(位置62-65)导致预测活性肽长度上处于35-44个残基的范围内，在从cDNA克隆预测的酶原上。而且，这些活性肽在其C-末端始终具有二肽精氨酸-异亮氨酸暗示了胰蛋白酶在激活胰凝乳蛋白酶中的作用。对于每一被翻译蛋白质的成熟域之序列同一性。在表2中显示。族4为分歧最多的，与其它族具有小于20％的同一性，而族2和3共享最大的相似性，分数为约85％。从NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶获得的N端序列(图4)与来自族2的编码胰凝乳蛋白酶的cDNA克隆预测的N端序列相匹配。对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端序列未表现在由cDNA克隆表现的胰凝乳蛋白酶的4族中。
                          表5
        在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶基因族成员之间
     (仅成熟的胰凝乳蛋白酶域)的蛋白质序列同一性(％)
                          表6
澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶与来自其它棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶
                        密切相关
  澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶   GenBank登记号   物种   氨基酸序列同一性％
  HpCh1AI   Y12273AF237417   H.armigera烟蚜夜蛾(Heliothisvirescens)   9286
  HpCh1BI   Y12273AF237417   H.armigera烟蚜夜蛾   9188
  HpCh2A   Y12287Y12280Y12281AF233734   H.armigeraH.armigeraH.armigera玉米夜蛾   97959594
  HpCh2B   Y12287Y12280Y12281   H.armigeraH.armigeraH.armigera   929190
  HpCh3   Y12279Y12287   H.armigeraH.armigera   9682
  HpCh4I   Y12272   H.armigera   89
  HpCh5   AAO75039Y12281   草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)H.armigera   8074
采用BLAST搜索引擎获得了最类似于澳洲棉铃虫的蛋白质序列。列出了Genbank登记号。比较了成熟的活性蛋白质，并且测定了蛋白质序列同一性的百分数。
不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端区域具有两个独特的序列伸展，指定为F1和F2，用于设计用以PCR扩增编码不敏感胰凝乳蛋白酶的DNA的寡核苷酸(图11)。采用包括大多数蛋白质编码区域的F1寡核苷酸获得DNA的一个641bp片段。该PCR产物被用于筛选澳洲棉铃虫中肠文库中的全长克隆。在被筛选的50,000个空斑中，大约有0.2％强烈地杂交到PCR产物。选择10个空斑，识别并测序一个全长克隆(图12)。921bp克隆具有一个828bp开放式用读框，并且推导出的蛋白质的残基41-76与得自纯化蛋白质的N端序列相匹配(图12)。克隆缺乏5’信号肽序列，但是与其它胰凝乳蛋白酶克隆相比，显示出活性肽为全长的。预测活性酶在长度上为236氨基酸，质量为24.2kDa。通过比较每个澳洲棉铃虫cDNAs的成熟域来测定蛋白质的序列同源性。族2和族3为与HpCh5(Rechla)最相似的，分别具有约72％和70％的同一性。族1成员共享53-57％的同一性，而族4与HpCh5具有约20％的同一性。在被翻译的和蛋白质数据库中，利用NCBI工具进行全面的Blast搜索未产生显著性匹配。不敏感的胰凝乳蛋白酶属于棉铃虫(H.Chymotrypsin)胰凝乳蛋白酶的一个新族，被指定为族5(图13)。图14中，在棉铃虫(H.armigera)中肠EST数据库中进行的blast搜索匹配到一个克隆，其具有大于97％的序列同一性和100％的序列相似性。
将牛胰凝乳蛋白酶A和B以及对NaPI敏感胰凝乳蛋白酶(HpCh2A)与不敏感的胰凝乳蛋白酶(HpCh5)进行对比，以确定可变性区域，其可能涉及低亲和结合C1(图15)。
在比对中被识别的10个取代基表面看来未落入功能上的显著区域，然而第11个取代与一个β-链相关，其形成初级底物结合口袋的壁。对于S1域，该取代的位置和转化为精氨酸为高度不寻常的，所述S1主要排列为非极性残基，限定了胰凝乳蛋白酶的特异性。
实验方案
制备RNA
在去除肠道并快速冷冻在液氮中前，冷麻痹50只第四晚期和第五早期龄的幼虫。存在液态N2时，采用研钵和研杵将50个肠道研磨细粉末，并保存于-70℃下。根据厂商的方案，将肠道组织(100mg)加入到1mL TRIZOL(商标)试剂中(Life Technologies)，并且纯化和定量总RNA。
RT-PCR扩增胰凝乳蛋白酶基因
采用ClustalW将来自H.armigera的胰凝乳蛋白酶基因进行比对，并且识别高度保守区域以设计胰凝乳蛋白酶特异性引物。个别地设计到棉铃虫克隆(CAA72951)的引物，这是由于与其它胰凝乳蛋白酶序列的高水平分歧。采用提供的方案，将正向引物与RVG4一起使用，以利用反转录酶聚合酶链反应扩增基因片段(RT-PCR；Superscript预扩增系统，Gibco BRL)。凝胶纯化PCR产物(Qiagen凝胶提取试剂盒)，亚克隆入TOPO PCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen)，并转化入化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene)，根据Inoue等，1990，出处同前的方法制备。利用QIAprep(注册商标)SpinMiniprep试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。
产生和筛选澳洲棉铃虫肠道cDNA文库：
文库制品
利用常规方案，从RNA(1.0mg)分离PolyA+mRNA。结合到polyA尾部的生物素化寡核苷酸(dT)引物标识于转录物后，其随后被捕获在链亲和素顺磁性微粒上(PolyATract(注册商标)，mRNA分离系统，Promega)。纯化的mRNA(5μg)被用于构建cDNA文库，按照厂商的说明书，采用Lambda ZAP-cDNA合成试剂盒和Zap-cDNAGigapackIII金包装提取物(Stratagene)。被扩增的文库滴度为2.8×1010pfu/mL。
标记探针
采用MEGAPRIME(商标)DNA标记系统标记(Amersham LifeSciences)，用[α-32P]dCTP(Amersham Life Sciences)单独标记RT-PCR产物(50ng)。根据厂商的方案，采用微型Bio-spin P-30色谱柱(BioRad)去除未掺入的放射性标记的核苷酸。通过沸腾使双链的被标记探针变性(5min)，在冰上冷却，并随后加入到杂交溶液中(如下)。
筛选cDNA文库
利用10个(15cm)培养皿/探针进行初步筛选，具有约50,000个噬菌体/板。制备微量板用于随后的空斑提取，并用与Lambda ZapcDNA合成试剂盒一起提供的说明书(Stratagene)在杂交前进行膜处理。膜(Hybond-N；Amersham Biosciences)在50ml 2x PIPES(0.8M NaCl，16mM哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)，pH6.5)50％(体积/体积)甲酰胺、0.5％(重量/体积)SDS和100μg/mL鲱鱼精DNA(Boehringer Manningham)中于42℃下预杂交3小时。预杂交后，将培养液用50ml 50％(体积/体积)甲酰胺、2x PIPES缓冲液、0.5％(重量/体积)SDS和100μg/mL含有标记探针的变性鲱鱼精DNA代替，并于42℃下放置过夜。室温下，在它们被印迹在3mm Whatman纸上并于-70℃下采用加强筛选暴露到X射线照片(Kodak XAR-5)48小时前，将杂交膜在2X SSPE/0.1％(重量/体积)SDS中清洗3次，以及室温下在0.2X SSPE/0.1％(重量/体积)SDS中清洗2次。
由于拥挤并因此在阳性克隆和非特异性空斑之间重叠，进行第二次筛选以分离单独的克隆。对于每个探针，使用了2个8.5cm微量平板，每个具有50个空斑。如同为初步筛选所描述的，进行第二次筛选。
用各个RT-PCR产物进行探测从每次筛选中选择至少50个具有不同强度的阳性空斑。将每个空斑转移到1.5mL含有1mL SM缓冲液(0.1M NaCl，8mM MgSO4·7H2O，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.01％(重量/体积)明胶)和氯仿(20μL)的微量离心管中，并保存于4℃下。起初，为每一探针切除10个空斑，并采用ExAssist/SOLR系统(Stratagene)转化入pBluescriptII SK(-)噬菌粒。将被切除的噬菌粒转化入化学感受态大肠杆菌菌株XL1-兰细胞，制备质粒DNA并行测序。
DNA测序和分析
根据采用核酸内切酶BamHI、XhoII、KpnI、SacI、SacII和SalI(Promega)的组合而获得的限制片段模式，对cDNA克隆进行分组。在Monash University的Micromon测序工具(Melbourne)或在悉尼的Royal Prince Alfred Hospital的SUPAMAC处，采用M13通用引物对RT-PCR产物和cDNA插入物在两个方向上测序。采用由NorthCarolina州立大学的Tom Hall编写的BioEdit v5.0.9.1软件编辑序列数据，其可在如下网址自由获得：www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html。采用生物技术信息国家中心(NCBI)的BLASTN搜索工具估计序列同源性，并利用ClustalW version 1.4.网络蛋白质序列分析工具进行进一步的多重序列排列(NPSA；http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align_clustalw.pl)(Combet等，TIBS.25：147-150，2000)。
基于程序‘PSORT II’的网络可在Tokyo大学的人基因组中心使用(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)，被用于预测信号肽切割点。UTRscan被用于检测cDNA克隆的3′未被翻译区域的功能元素[Pesole，Trends Genet，15：378，1999]( http://bighost. area.ba.cnr.it/BIG/UTRScan/)。
分离编码对NaPI-不敏感的胰凝乳蛋白酶的部分cDNA克隆
将先前纯化的用于产生cDNA文库的RNA样品解冻，并用作随后的RT-PCR反应模板。将2个5′简并性引物(5)设计到N端氨基酸序列的独特区域，并与3’引物RVG4一起使用。采用来自Stratagene的SuperScriptII预扩增系统实现第一链cDNA合成，并接着是采用Perkin Elmer温度循环仪PCR扩增靶cDNA[25个循环，94℃下1min，48℃下1min以及72℃下1min，随后在72℃下7min]。在1％(重量/体积)琼脂糖凝胶(SEAKEM(注册商标)BioWhittaker(Molecular Applications)上分离PCR产物；采用Concert纯化系统(Gibco)，将约650bp的带切除并纯化。将部分cDNA克隆入TOPO PCR2.1-TA载体(Invitrogen)，并转化入大肠杆菌菌株XL-BL1(Stratagene)。
分离不敏感的胰凝乳蛋白酶cDNA克隆
利用根据上述技术克隆的部分片段筛选从第四龄幼虫肠道制备的cDNA库。
                        实施例4
            同源模型化澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶
在Bos taurus(小牛)和火蚁胰凝乳蛋白酶的结构上，将从cDNA克隆HpF2B(敏感的)和HpF5(不敏感的)推导的氨基酸序列模型化，所述结构得自用于结构生物信息与(RCSB)蛋白质数据库位点的Research Collaboratory(http://www.rcsb.org/pdb/)。预测棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶采用了与那些为所有的胰凝乳蛋白酶结构报道的可在PDB databank上利用的相似结构。模型结构由常见的丝氨酸蛋白酶折叠组成，所述丝氨酸蛋白酶折叠由2个6链的反平行β桶组成，具有位于两个域之间的催化三分体。在澳洲棉铃虫胰凝乳蛋白酶中，两个表面环60和142相当大(图15和16)。由于建模的局限性，在几个表面环中出现了少量的不明确，其中一些在哺乳动物胰凝乳蛋白酶中被切割(环142)，但是在昆虫胰凝乳蛋白酶内保持完整。仅报道的昆虫胰凝乳蛋白酶的晶体结构来自火蚁，Soenopsisinvicta(Botos等，Journal of Molecular Biology298：895-901，2000)并且其被用于有助于精细化表面环在棉铃虫的种胰凝乳蛋白酶模型上的定向。
将C1与敏感和不敏感的胰凝乳蛋白酶一起建立模型，以研究用精氨酸取代谷氨酰胺(或天冬酰胺)192(Greer命名法，图15)是否将影响棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶的结合能力。预先利用1H NMR测定胰凝乳蛋白酶抑制剂(C1)的结构(Nielson等，1994，出处同前)。C1复合物的结构未解析，并且因此，相关的来自Solanum tuberosum的蛋白酶抑制剂PCI-1与来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶B复合(Greenblatt等，1989，出处同前)提供了结构模型的基础。图17显示在C1-HpF2B胰凝乳蛋白酶复合物中围绕Gln192的结合区域。HpF2B和C1的预测模型显示出谷氨酰胺192与抑制剂分子上的任何区域不冲突。然而，与不敏感胰凝乳蛋白酶中的共有精氨酸残基的对比暗示出存在有限的空间以容纳这个大得多的残基(图18)。建模浏览程序‘Spdbv’预测Arg 192与C1的苏氨酸5直接冲突。确定PotI为来自澳洲棉铃虫的不敏感胰凝乳蛋白酶的强抑制剂，并且因此，与不敏感的胰凝乳蛋白酶一起建模(图19)。不象C1，当结合到不敏感的胰凝乳蛋白酶时，PotI很容易容纳精氨酸192。
总之，来自棉铃虫的种的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶在天冬酰胺或谷氨酰胺的第192位上具有一个精氨酸，其延伸入S1结合口袋中，并且表面看来干扰C1的结合。而且，很清楚，该精氨酸残基不干扰PotI的结合，与观察结果即PotI为比NaPI抑制剂更加有效的昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂一致。
                        实施例5
针对来自澳洲棉铃虫的NaPI可抑制的以及对NaPI不敏感的胰凝
             乳蛋白酶的多克隆抗血清产生和表征
在大肠杆菌中表达胰凝乳蛋白酶克隆HpF2B，其融合C-末端的6组氨酸(6.H)标签，并在Talon金属亲和树脂上纯化到均匀(图20)，用于注入兔中以产生多克隆抗体。被纯化的产物之N端测序证实了NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶(HpCh2B)的表达。第四次用抗原加强免疫后，收集血清并在细菌表达的蛋白质和未分离的肠道提取物的蛋白质印迹上进行测试。抗体检测到以1∶2500的比例稀释的全长重组胰凝乳蛋白酶以及几种降解产物。也采用抗HpCh2B抗体染色未分级分离的肠道提取物和键合到C1亲和柱的蛋白质样品，所述抗体检测酶的成熟的天然形式。
通过将免疫印迹与银染色的SDS-PAGE凝胶进行对比，将被纯化的6H.HpCh2B用于测定抗HpCh2B抗体的检测限。该抗体检测到20ng  细菌表达的胰凝乳蛋白酶原，并且也识别从澳洲棉铃虫肠道分离的天然胰凝乳蛋白酶的成熟形式。
编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(HpCh5)的cDNA(HpF5)在大肠杆菌中以相似的方式表达，除了组氨酸标签融合到被表达的蛋白质的N端。针对细菌表达的NaPI抑制性胰凝乳蛋白酶(HpCh2B)产生的多克隆抗血清不与蛋白质印迹上细菌表达的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(HpCh5)发生交叉反应(图21)。类似地，并对HpCh5培养的抗血清不结合到HpCh2B。显示出这些抗血清可以被用于特异性地区分并监测在未分级分离的肠道提取物中对NaPI不敏感的和敏感的胰凝乳蛋白酶的水平。
实验方案
制备用于免疫抗原
采用两种寡核苷酸(表7)通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码NaPI敏感胰凝乳蛋白酶的cDNA克隆‘HpF2B’(图11)，所述寡核苷酸在cDNA的5’和3’端分别包含NcoI和BglII限制性位点。
                        表7
针对不敏感的胰凝乳蛋白酶蛋白质的N端的2个独特区域设计简
并性引物。在氨基酸序列中通过匹配的字体显示了引物位置
  对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的N端序列IVGGSLSSVGQIPYQAGLVIDLAGGQAVCGGSLISA[SEQ ID NO：9]
  引物名称   寡核苷酸序列5’-3’
  Fw2ResChy   TC(AGCT)GT(AGCT)GG(AGCT)CA(AG)AT(ACT)CC[SEQ IDNO：10]
  FwResChym   GT(AGCT)AT(ACT)GA(CT)CT(AGCT)GC(AGCT)GG(AGCT)GG[SEQID NO：11]
                                 表8
            用于胰凝乳蛋白酶HpF2B的细菌表达的PCR扩增引物
  引物名称   限制性位点   序列
  5’Hc35PQE-60Fw   NcoI   TTA ACC ATG GTG ATC GAC CTC[SEQ ID NO：12]
  Hc35PQE-60Rv   BglII   GAT GAG ATC TGA GAC GTT GGT TG[SEQ ID NO：13]
被扩增的区域由前肽和胰凝乳蛋白酶原的成熟域组成，但缺乏假定的分泌信号。在PCR扩增产物和pQE-60表达载体(Qiagen)上利用NcoI和BglII酶(Promega)进行消化。pQE-60载体在被表达蛋白质的C-末端提供了His-标签。利用WIZARD(注册商标)DNA整理系统(Promega)纯化每种限制消化物，并随后采用标准分子生物技术连接载体和胰凝乳蛋白酶插入物(Sambrook和Russell，分子克隆实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，第3版，2001)。在被转化入大肠杆菌菌株XL1-Blue之前，于65℃下将连接混合物加热10min。利用QIAPREP(注册商标)Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA，用于测序以及随后变为大肠杆菌细胞系M15(Qiagen)。
根据在QiaExpress手册(Qiagen)中详细描述的方法，在变性条件下进行重组胰凝乳蛋白酶原的表达和纯化。通过SDS-PAGE估计被表达的胰凝乳蛋白酶原的纯度，并且重组蛋白质的同一性由N端测序证实。制备用于注射的胰凝乳蛋白酶包括通过针对50mM Tris-HClpH8.0透析去除尿素。在该过程中，大多数蛋白质积聚起来。通过离心收集积聚的蛋白质，并重新悬浮在1mL 50mM Tris-HCl中，pH8.0，用于注射。利用SDS-PAGE和考马斯染色，通过将10μL亚样品与一系列牛胰蛋白酶标准物(Sigma)进行对比而约计蛋白质的浓度。
PCR扩增编码对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的cDNA克隆‘HpF5’(图12)，方法基本如上对克隆HpF2B描述的，除了正向引物(FwpMalRECH)在被表达的蛋白质N端掺入组氨酸标签，反向引物(RvRECH)含有一个终止密码子，并因此防止从pQE-60表达载体在C-末端掺入组氨酸标签。
                      实施例6
     采用PotI抑制剂和棉铃虫的种幼虫进行生物测定
从马铃薯块茎纯化大量的PotI抑制剂，以评价NaPI和PotI对棉铃虫幼虫生长的组合影响。生物测定证实了加入PotI显著增强NaPI抑制剂的活性。一起进食NaPI和PotI的毛虫(分别为0.26和0.34％(重量/体积))为在发育的第五龄期的对照幼虫尺寸的34％，然而，仅进食NaPIs的毛虫为对照组尺寸的约84％。基于这些结果，我们决定克隆编码PotI抑制剂的基因，用于转移到棉花植物。利用从马铃薯块茎分离的mRNA和受伤的马铃薯叶分离了两种PotI基因(PotIA和PotIB)。这些cDNA克隆被用于组建用于PotI蛋白质细菌表达的载体。细菌产生的PotI蛋白质完全抑制了从澳洲棉铃虫幼虫分离的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。两种PotI基因都包含在用于棉花转化的构建体中。来自马铃薯块茎的纯化PotI抑制剂被用于产生特异性抗体，用于监测由转基因植物产生的PotI水平。
实验方案
纯化来自马铃薯块茎的PotI抑制剂
将马铃薯块茎(2Kg，Solanum tuberosum var Russet Burbank)切成方块，并在2升50mM H2SO4中于4℃下浸泡过夜。在搅拌机中将组织匀浆，并且通过两层Miracloth过滤接着是离心而去除不溶物(13,000rpm，15min，4℃)。在离心分离(13,000rpm，12min，4℃)沉淀物前，用10M NaOH将上清液调至pH7.8，在沸水中加热30min并冷却。在将它们施加到Sephadex G75柱前(85×2.54cm)，用硫酸铵(80％饱和)沉淀可溶性蛋白质，通过离心收集并再次溶解在凝胶过滤缓冲液中(150mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8)。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和采用牛胰凝乳蛋白酶的抑制分析确定含有PotI的洗脱片段(50mL)。集中含有PotI的片段，透析并冻干。在连接166检测器(Beckman)的系统金HPLC(Beckman，Fullerton，CA)上，通过反向-HPLC检测这些合并的级分中的蛋白质。在BrownleeAquapore RP300 C8柱(4.6×100mm；Perkin-Elmer)上进行分析RP-HPLC。利用线性梯度为0-100％(体积/体积)的缓冲液B(60％[体积/体积]乙腈，在0.089％[体积/体积]三氟醋酸中)，以1mL min-1的流速，将蛋白质洗脱超过40min(图22)。通过N端测序和质谱证实了PotI蛋白质的同一性，并且识别了至少两种PotI同工型。
棉铃虫幼虫通过进食含有NaPI和PotI的人工食物生长
将从马铃薯块茎分离的PotI蛋白质和从花烟草(N.alata)柱头分离的NaPI肽掺入基于人工食物的棉花叶中，并喂给棉铃虫新生儿(图23)。PotI对幼虫的生长具有加性作用。与对照幼虫相比，仅进食NaPI的幼虫的生长被抑制16％，然而，与对照幼虫相比，同时进食NaPI和PotI的幼虫的生长被抑制75％(图23)。
分离编码马铃薯蛋白酶抑制剂1(Pot1)的cDNA
采用反转录酶-PCR和来自马铃薯块茎或受伤的马铃薯叶的总RNA合成马铃薯蛋白酶抑制剂I cDNA。采用Thermoscript RT-PCR与寡(dT)20引物(Life Technologies)制备第一链cDNA。随后，采用基因特异性引物5′CGG-GAT-CCA-TGG-AGT-CAA-AGT-TTG-C-3′[SEQID NO：14](有义)和5′-GCG-TCG-ACG-CTT-AAG-CCA-CCC-标签-G-3′[SEQ ID NO：15](反义)扩增PotI cDNA序列，所述引物被设计成退火到已公布的PotI染色体组序列M17108的开放式读取框架的5′和3′端(Cleveland等，Plant Mol.Biol.8：199-207，1987)，并分别包括限制位BamHI和SalI。
分离两种PotI同系物。StPotIA得自受伤的叶RNA，StPotIB得自块茎RNA。StPotIA和StPotIB cDNA共享92.6％的核酸序列同一性，并共享86％的氨基酸序列同一性(图25)。
在图24中显示了预测的氨基酸序列以及与马铃薯抑制剂I族其它成员的对比。StPotIB与来自马铃薯块茎的已公布PotI序列非常相似，并在P1反应位点共享蛋氨酸。相比之下，StPotIA在P1含有丙氨酸残基，并且在位置41-44也具有额外4个氨基酸。对于其它的马铃薯PotI分离物，未报道在该位置的其它氨基酸，尽管已在来自番茄的伤口诱导PotI中发现。
StPotIA和StPotIB在大肠杆菌中的表达
采用PCR扩增编码PotI但没有内质网信号序列(在StPotIA中为氨基酸37-111，并且在StPotIB中为37-107)的DNA。采用的引物为5′-CGG-GAT-CCA-AGG-AAT-CGG-AAT-CTG-3′[SEQ ID NO：16](StPotIA有义)、5′-CGG-GAT-CCA-AGG-AAT-TTG-AAT-GC-3′[SEQ IDNO：17](StPotIB有义)和5′-CGA-GCT-CTT-AAG-CCA-CCC-标签-G-3′[SEQ ID NO：18](StPotIA/B反义)。起初，在用BamHI和SacI切除前，将PCR产物克隆入pGEM T-Easy载体(Promega)，并连接入细菌表达载体pQE30(Qiagen)，其在被表达的蛋白质的N端提供了一个6x His-标签。
His-标记的PotI蛋白质在大肠杆菌中表达(对于StPotIA，为BR21 DE3 Codon Plus菌株(Stratagene)，对于StPotIB，为M15菌株(Qiagen))。用1mM IPTG诱导细胞，通过离心采集并溶解在8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl中，pH8.0。通过在10,000g离心5min去除细胞碎片，并且通过金属-亲合色谱法在Talon树脂(Clontech)上从上清液中纯化His-标记的PotI。利用8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-C1，pH4.0，从树脂洗脱结合的蛋白质，并通过SDS-PAGE监测洗脱。通过RP-HPLC进一步纯化StPotIA和StPotIB蛋白质(图25)，采用N端测序和质谱证实它们的同一性。
由StPotIA和StPotIB抑制来自澳洲棉铃虫的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶
在133mM pH10.0的CAPS缓冲液中，通过采用不同量的StPotIA和StPotIB(0-600nM)于30℃下在96孔微量滴定板中对NaPI不敏感的蛋白酶(10μL)预培养，测定StPotIA和StPotIB对来自澳洲棉铃虫的NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶的抑制活性。预先培养30min后，通过加入底物(SA2PfpNA、SA2PLpNA或SA2PMpNA)至在100μL最终体积中培养物的最终浓度为1mM而开始培养。30或60min后，在405nm测量吸光度。
StPotIA、StPotIB和从马铃薯块茎分离的PotI同工型混合物抑制了澳洲棉铃虫肠道提取物中NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶(图26)。通过加入300nM StPotIA、StPotIB或从块茎分离的PotI同工型，抑制了至少75％的由NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶引起的SA2PFpNA或SA2PLpNA水解。对SA2PMpNA水解的抑制较低(40％)。
产生表达NaPI和StPotIA的转基因棉花
制备两种基因构建体(pHEX2和pHEX6)，用于转化棉花(Gossypium hirsutum)。pHEX2由35S启动子组成，其驱动具有35S终止子的NaPI基因，插入到二元载体pBIN 19中(Bevan，核酸研究earch，12：8711-8721，1984)。pHEX6由35S启动子组成，其驱动具有35S终止子的StPotIA基因，插入到二元载体pBIN 19中。
采用Umbek等(Biotechnology，5：263-266，1987)的方法生产转基因棉花，方法有所改变。采用含有所需的二元载体的根癌农杆菌菌株LBA 4404共培养棉花Cv Coker 315的胚轴部分。在介质上诱导愈伤组织，所述介质由MS盐、维他命B5、3％葡萄糖、0.9g/L MgCl2(六水合物)、1.9g/L硝酸钾、2g/L Gelrite、0.1mg/L激动素、0.1mg/L 2，4-D、500mg/L羧苄青霉素、35mg/L卡那霉素组成。通过将愈伤组织生长在相同介质上而诱导胚胎形成的愈伤组织，但不含激素。将胚切除并培养在皮氏培养皿中的介质上(Stewart和Hsu，Planta 137：113-117，1977)。将已产生根和真叶的发芽胚转移到容器中以进一步发育，并随后转移到土壤中，并生长在27℃的生长室中。
产生表达NaPI和StPotIA的转基因棉花
为了产生表达两种基因的植物，将来自表达NaPI的转基因系的花粉用于对来自表达StPotIA的植物的花授粉，并收集种子。通过免疫印迹分析确定后代植物(植物3)表达两种基因。
在采用棉铃虫的生物测定中，使用了来自植物3的叶(图27)。与对照组相比，尽管在叶中NaPI或StPotIA的表达仅导致对幼虫生长的小抑制，但表达两种蛋白质对幼虫的生长具有增强效应。
                      实施例7
                HpCh5的杆状病毒表达
将信号肽序列加到HpCh5
尽管HpF5克隆编码了带有活化域的HpCh5的全部胰凝乳蛋白酶原序列，但它不编码用于将蛋白质正确靶向内质网(ER)所需的信号肽。对于杆状病毒表达，利用两种相应于来自HpCh2A的ER信号肽的19个氨基酸的重叠寡核苷酸，将ER信号序列加入到HpF5cDNA(图10)。在两步PCR中，将ER信号序列加入到HpCh5的预活化和成熟域(表9)。
                              表9
              用于将ER信号序列加到HpCh5的PCR扩增引物
  引物  序列
  FWBacRECH1(5’-3’)  TTG GCT TTC GCC GCG GTC GTC TCC GCG AGG AAC GGG TCCC[SEQ ID NO：19]
  FWBacRECH2(5’-3’)  GGA TCC ATG AAA CTC TTG GCT GTG ACT CTA TTG GCT TTCG[SEQ ID NO：20]
  RvRECH(3’-5’)  G ATC AAC GGC CAG CTC TAA AAG CTT[SEQ ID NO：21]
第一PCR使用了引物FwBacRECH1和RvRECH以及HpF5 cDNA模板，以加入ER信号序列的第一半。第二PCR使用了FwBacRECH2和RvRECH，并以第一PCR反应的产物为模板。在每一步骤中，电泳后，在用于随后的PCR前，在0.7％(重量/体积)的琼脂糖凝胶上纯化扩增产物。
将HpF5/ER克隆入pFastBac载体
将具有ER信号序列的HpF5 cDNA(HpF5/ER)亚克隆入PCR(注册商标)-2.1 TOPO载体(Invitrogen)并在Micromon测序，DNA测序工具，Monash University，Victoria，Australia。在用BamHI和HindIII消化并连接入pFastBac载体(Invitrogen)以及转化入大肠杆菌XL1兰细胞前，将具有正确序列的重组体用EcoRI消化，并进行凝胶纯化。
将pFastBac/HpF5/ER构建体移入大肠杆菌DH10Bac细胞
采用PCR和限制消化筛选大肠杆菌XL1 Blue细胞以确定在pFastBac载体(pFastBac/HpF5/ER)中存在HpF5/ER cDNA。在阳性转化体上进行微制备。将大肠杆菌DH10Bac感应细胞在冰上解冻，其含有bacmid DNA和用于将HpF5/ER移入bacmid DNA所需的辅助质粒。将大约1ng pFastBac/HpF5/ER重组质粒加入到细胞中(150μL)，并在轻微混合后，将混合物转移到预先冷冻的GENE PULSER(注册商标)/E.COLI(商标)脉冲试管。将试管放置在电穿孔设备(BioRad)上，并施加1.7Amps的脉冲。随后加入LB(1mL)，并且将样品转移到10mL的带帽试管中，并允许在振动式恒温箱(190rpm)上于37℃下4小时恢复。在将100μL每种稀释液均匀地喷洒到LB琼脂微量板上前，回收样品并利用LB介质连续地稀释(10-1、10-2和10-3)，其含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和40μg/mL IPTG，预先于37℃下培养48小时。以相同的方式处理不含插入物的pFastBac载体，并用作对照组。
分离重组的bacmid DNA
通过存在与兰克隆对照的白克隆而检测到pFastBac/HpF5/ER载体和bacmid DNA之间的重组，指示了在lacZα基因中的破坏。为证实重组是稳定的，将克隆在选择的介质上重新划线，并培养24小时。白克隆被用于接种10mL LB介质，其含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素和10μg/mL四环素，用于分离重组的bacmidDNA。对选为对照组的蓝色菌落(非重组体)进行相同的步骤。于37℃下，将细胞生长过夜，并在190rpm振动。在14,000×g将培养物离心5min。丢弃上清液，并将小球重新悬浮在0.3ml的溶液I中(15mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，100μg/mL RNaseA]。随后，加入溶液II(0.2N NaOH，1％(重量/体积)SDS)，轻微混合并在室温下培养5min。缓慢加入醋酸钾(0.3mL，3M，pH5.5)，并且将样品放在冰上10min，之前，将它们在14,000×g离心10min以去除厚的白色沉淀物。随后，将上清液转移到1.5mL含有0.8ml无水异丙醇的微量离心管中，并倒置混合。在冰上10min后，室温下，将样品在14,000×g离心15min。去除上清液，并采用0.5mL的70％(体积/体积)乙醇将沉淀清洗两次。随后，在去除70％(体积/体积)乙醇前，在14,000×g将样品室温离心5min，并将DNA沉淀通风干燥。接着将DNA溶解在60μL TE缓冲液中(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，并保存于-20℃下直到需要。通过在0.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶上进行电泳而测定bacmid，在TAE缓冲液(40mM Tris-醋酸盐、1mM EDTA、pH8)中制备，在23V下12小时，具有λDNA/HindIII片段标记物(MBI片段)。也利用具有M13正反向引物的PCR筛选bacmid。
用重组的bacmid DNA转染HIGH FIVE(商标)细胞
在具有50单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素(JRHBiosciences)的2ml EX-细胞(商标)405介质中，将大约9×105个HIGH FIVE(商标)昆虫细胞放入6井微量板的35-mm孔中(NUNCLON(商标)Δ表面)。于27℃孔将细胞放置1小时，以允许它们连接到微量板。为每个转染制备2份溶液，每份加入不同量的bacmid微制品(5、10或20μL)；溶液A：在100μL EX-细胞(商标)405介质中微制备bacmid DNA，不含抗生素，和溶液B：在100μL EX-细胞(商标)405介质中有6μL细胞FECTIN(注册商标)试剂(Gibco BRL)，不含抗生素。将溶液A和B混合，并在室温下培养1小时，接着加入0.8mL选择游离介质。当细胞附着在微量板后，用2mL不含抗生素的介质清洗一次。从细胞中去除介质，并用含有溶液的DNA代替。在将转染混合物抽出并用2mL含有抗生素的介质取代前，将细胞在27℃的恒温箱中培养5小时。进一步于27℃下将细胞培养72小时。
在24、48和72小时后，将2mL上清液转移到10mL无菌带帽试管中，并在500×g离心5min。将含有病毒的上清液转移到一个新试管，并于4℃避光保存直至使用。
用重组的杆状病毒微粒感染昆虫细胞
为每一转染设立2个10mL的培养物。用100μl收集的病毒(～2×107pfu/mL)感染每个培养物。在24、48和72小时收集被感染的细胞。随后，利用HpCh5抗体，通过免疫印迹分析来分析这些样品的蛋白质表达。
                        实施例8
                   HPCH5的杆状病毒表达
用于ER信号序列的引物设计
原始的HpF5 cDNA克隆不编码ER信号序列。尽管对于细菌表达不需要ER信号序列，但它对杆状病毒表达却是必需的。因此，采用来自胰凝乳蛋白酶族2A的DNA序列构建ER信号序列，其与胰凝乳蛋白酶族5最密切相关。
通过与两个编码部分ER信号序列的引物进行的PCR反应而加入序列。FwBacRECH1引物具有一个沉默突变，用于去除BamHI限制消化位点和编码半个ER信号序列。FwBacRECH2引物编码ER信号序列的剩余部分并引入一个BamHI限制位点(图28)。
扩增和将HpCh5连接入pFastBac载体
利用引物FwBacRECH1和RvRECH以及模板HpF5cDNA的PCR生产～900bp的产物。进行利用该PCR产物以及FwBacRECH2和RvRECH引物的第二PCR以生产～930bp的产物，其用编码带有ER信号序列的HpCh5蛋白质。在转染入TOP10感应细胞前，将扩增产物亚克隆入pCR(注册商标)-2.1 TOPO载体(Invitrogen)。采用M13正反向引物筛选克隆以确定存在插入物。采用EcoRI随后是BamHI和HindIII对分离质粒的消化限制产生了具有预期尺寸～930bp的产物。
接着，将～930bp片段连接入pFastBac载体，以产生pFastBac/HpF5/ER。通过采用BamHI和HindIII的限制消化和采用FwBacRECH2和RVRECH引物的PCR，证实存在插入到pFastBac载体中的HpF5 cDNA(表9)。含有插入物的质粒被送往Micromon，用于DNA测序。
分析Bacmid DNA
将重组的pFastBac载体转染进入DH10Bac细胞导致插入bacmid DNA中的HpF5转座。从转染的细胞中分离重组的bacmid DNA，并在0.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶上进行分离。
通过采用M13正反向引物的PCR分析来检验HpF5 cDNA插入物。利用对HpF5/ER cDNA的引物和M13进一步分析预期的～3300bp片段，以确保插入物处于正确的方向。随后，阳性的bacmid DNA被用于昆虫细胞的转染。
病毒形成和在杆状病毒表达系统中产生HpCh5
3种不同浓度的bacmid DNA被用于转染昆虫细胞，以产生杆状病毒。转染后，在收集含有该病毒的培养基之前，将细胞在27℃下培养72小时。采用用于生产HpCh5蛋白质的α-HpCh5抗体，通过免疫印迹分析来检测培养基，显示出产生了病毒(图29A)。许多对照组被用于监测转染。这些对照组包括单独的pFastBac载体、来自蓝色菌落的DNA转染、仅具有细胞FECTIN(注册商标)的细胞培养物和未转染的细胞(图29A)。含有病毒的培养基被用于后来的实验中，以便大规模地感染更多的昆虫细胞，并进行72小时期间的时程，以监测HpCh5表达的调节(图29B)。
本领域技术人员将会理解，除特别描述的那些之外，本文描述的本发明容许有变化和修改。将要理解，本发明包括所有的这些变化和修改。本发明也包括在说明书中参照或显示的所有步骤、特征、组合物和化合物，个别地或共同地，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何及所有组合。
                         参考文献
Altschul等，核酸研究.25：3389-3402，1997
Antcheva等，Protein Sci.10：2280-2290，2001
Atkinson等，植物细胞5：203-213，1993
Ausubel等，“分子生物学的当前协议”John Wiley & Sons Inc，1994-1998，Chapter 15，1998
Balandin等，Plant Mol.Biol.27：1197-1204，1995
Beuning和Christeller，Plant Physiol 102：1061，1993
Bevan，核酸研究，12：8711-8721，1984
Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974
Botos等，J.Mol.Biol.298：895-901，2000
Botos等，Journal of Molecular Biology 298：895-901，2000
Bown等，Insect Biochem.Molec.Biol.27：625-638，1997
Bradford，Anal Biochem 72：248-254，1976
Broadway和Duffey，J.Insect Physiol.32：673-680，1986a
Broadway和Duffey，J.Insect Physiol.32：827-833，1986b
Broadway和Villani，Entomol.Expo.Appl.76：303-312，1995
Broadway，Arch.Insect Biochem.Physiol.32(1)：39-53，1996
Broadway，J.Insect.Physiol.41：107-116，1995
Broadway，J.Insect.Physiol.43(9)：855-874，1997
Burgess等，Entomol.Exp.App.61：123-130，1991
Choi等，Biochim.et Biophys.Acta 1492：211-215，2000
Christeller等，Insect Biochem.Molecul.Biol.22：735-746，1992
Cleveland等，Plant Mol.Biol.8：199-207，1987
Combet等，TIBS.25：147-150，2000
Cordero等，有关Rockefeller基金的大米生物技术国际项目会议，Malacca，Malaysia，1997
Cripps等，J.Cell Biol.126：689-699，1994
DeLeo等，Plant Physiol.118：997-1004，1998
Erickson等，科学249：527-533，1990
Fang等，植物细胞1：141-150，1989
Gatehouse等，农作物保护的植物遗传操作：农业生物技术No.7，Eds.Gatehouse，Hilder & Boulter，International U.K.，pp.155-181，1992
Gatehouse等，J.Insect Physiol.45(6)，545-558，1999
Gatehouse等，Insect Biochem.Molecul.Biol.27：929-944，1997
Graham等，J.Biol.Chem.，260：6555-6560，1985
Greenblatt等，J.Mol.Biol.205：201，1989
Greer，蛋白质7：317-34，1990
Hajdukiewicz等，Plant Mol.Biol.25：989-994，1994
Harsulkar等，Plant Physiol.121：497-506，1999
Heath等，European Journal of Biochemistry 230(1)：250-257，1995
Heath等，J.Insect Physiol.43：833-842，1997
Hediger等，Insect Mol.Biol.10：113-119，2001
Hsu等，Plant Sci.143：63-70，1999
Johnston等，Insect Biochem.21：389-397，1991
Johnston等，Insect Biochem.Molec.Biol.25(3)：375-383，1995
Jongsma等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(17)：8041-8045，1995a
Jose Cordero等，Plant J.6：141-150，1994
Keil等，EMBO J.8：1323-1330，1989
Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25(1)：49-61，1995b
Lee和Anstee，Insect.Biochem.Molec.Biol.25：63-71，1995a
Lee等，Nature Structural Biology 6(6)：526-530，1999
Legavre等，第5次植物分子生物学国际会议，新加坡，1997
Lidholm等，Genetics 134：859-868，1993
Lindhorst等，Plant Mol.Biol.21：985-992，1993
Lozovskaya等，Genetics 142：173-177，1996
Markwick等，J.Economic Entomology 91(6)：1265-76，1998
Markwick等，J.Economic Entomology 88(1)：33-39，1995
Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962
Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31：645-657，2001a
Mazumdar-Leighton和Broadway，Insect Biochem.Mol.Biol.31：633-644，2001b
Miller等，植物细胞11：1499-1508，1999
Miller等，Plant Mol.Biol.42：329-333，2000
Moura和Ryan，Plant Physiol.126：289-298，2001
Nielson等，生物化学34：14304-14311，1995
Nielson等，J.Mol.Biol.242：231-243，1994
Patankar等，Insect Biochem.& Mol.Biol.31：453-464，2001
Pathirana等，Plant J.12：293-304，1997
Paulillo等，J.Econ.Entomol.93：892-896，2000
Peloquin等，J.Cot.Sci.5：114-120，2001
Pesole，Trends Genet，15：378，1999
Peterson等，Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774，1995
Pujade-Renaud等，Plant Physiol.Biochem.35：85-93，1997
Richardson和Cossins，FEBS Letters，52：161，1975
Ryan，Annu.Rev.Phytopathol.28：425-449，1990
Samac和Shah，植物细胞3：1063-1072，1991
Schoenbeck等，Molec.Plant-Microbe Interact，1999
Seemuller等，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.358：1105-1117，1977
Stewart和Hsu，Planta 137：113-117，1977
Summerton和Weller，反义和核酸药物发展7：187-195，1997
Taylor等，Plant Mol.Biol.23：1005-1014，1993
Teakle等，Journal of Invertebrate Pathology 46：166-173，1985
Terra和Ferreira，Comp.Biochem.Physiol.109：1-62，1994
Valiatis等，昆虫生物化学和分子生物学29：405-415，1999
Volpicella等，Eur.J.Biochem.270：10-19，2003
Wells，Methods Enzymol.202：2699-2705，1991
Wu等，分子繁殖3：371-380，1997
Xu和Qin，J.Econ.Entomol.87：334-338，1994
                           序列表
<110>Hexima Limited
     La Trobe University
     Dunse，Kerry，Michelle(US ONLY)
     Heath，Robyn，Louise(US ONLY)
     Anderson，Marilyn，Anne(US ONLY)
<120>新昆虫酶及其抑制剂
<130>12440340/EJH
<150>US 60/465,054
<151>2003-04-23
<160>93
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>肽
<400>1
Glu Glu Lys Lys Asn
1               5
<210>2
<211>219
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>2
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Ala Ser Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe Thr Val Val Leu Val Met His Gly
    50                  55                  60
Ser Trp Thr Pro Ser Leu Ile Arg Asn Asp Val Ala Val Ile Arg Leu
65                  70                  75                  80
Gly Thr Asn Val Ala Thr Ser Asn Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu Pro
                85                  90                  95
Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala Leu Ala
            100                 105                 110
Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser Asp Thr Gly Ser Ile Ser Ser Asn Gln
        115                 120                 125
Ala Leu Ser His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Arg
    130                 135                 140
Asn Ser Phe Pro Leu Leu Ile Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
                165                 170                 175
Val Thr Arg Asn Asn Arg Pro Leu Leu Ile Gly Ile Thr Ser Phe Gly
            180                 185                 190
Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val
        195                 200                 205
Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gly Gln Leu
    210                 215
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>3
Val His Leu Glu Asp Ser Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Trp Gly
1               5                   10                  15
Tyr Leu Thr Lys Phe Gly Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ile Arg Asn Ala
            20                  25                  30
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Arg
        35                  40
<210>4
<211>708
<212>DNA
<213>棉铃虫
<400>4
atcgtcggtg gttcattgtc cagtgtcgga cagatccctt accaggctgg tctcgtcatt     60
gacttagcag gtggccaggc tgtctgcgga ggctccctga tcagcgcttc ccgcgtactg    120
accgctgctc actgctggtt cgacggccaa aaccaggcct ggagattcac cgttgttctt    180
ggttccacca ccttgttctc tggcggtacc agaatcccta catccaatgt tgttatgcac    240
ggaagctgga ctcctagcct tatccgtaac gatgttgccg taatcagatt gggcaccaac    300
gtagcaacct caaacaccat tgccatcatc gctctaccca gcggcagcca gatcaacgag    360
aacttcgccg gtgaaaccgc cctcgcctcc ggcttcggtc tcaccagtga caccggcagc    420
atctccagca accaggctct gagccacgtc aacctgccag tgatcaccaa cgctgtgtgc    480
agaaattcat tccccctgct gatccaggac tctaacattt gcaccagcgg tgccaacggc    540
aggagcactt gccgcggtga ctccggcggt cctctcgtcg tcaccaggaa caacagacca    600
ctcttgatcg gtatcacctc tttcggatct gcccgcggtt gccaagttgg atctcccgct    660
gccttcgcca gagtcacctc ttacatcagc tggatcaacg gccagctc                 708
<210>5
<211>120
<212>DNA
<213>棉铃虫
<400>5
gttcacctcg aggattctat tgatctggaa gatattaccg cttggggata cctcaccaaa     60
ttcggtattc cagaagctga gaaaatccgc aacgctgaag aagctagctc tgctagcagg    120
<210>6
<211>921
<212>DNA
<213>棉铃虫
<400>6
gttcacctcg aggattctat tgatctggaa gatattaccg cttggggata cctcaccaaa     60
ttcggtattc cagaagctga gaaaatccgc aacgctgaag aagctagctc tgctagcagg    120
atcgtcggtg gttcattgtc cagtgtcgga cagatccctt accaggctgg tctcgtcatt    180
gacttagcag gtggccaggc tgtctgcgga ggctccctga tcagcgcttc ccgcgtactg    240
accgctgctc actgctggtt cgacggccaa aaccaggcct ggagattcac cgttgttctt    300
ggttccacca ccttgttctc tggcggtacc agaatcccta catccaatgt tgttatgcac    360
ggaagctgga ctcctagcct tatccgtaac gatgttgccg taatcagatt gggcaccaac    420
gtagcaacct caaacaccat tgccatcatc gctctaccca gcggcagcca gatcaacgag    480
aacttcgccg gtgaaaccgc cctcgcctcc ggcttcggtc tcaccagtga caccggcagc    540
atctccagca accaggctct gagccacgtc aacctgccag tgatcaccaa cgctgtgtgc    600
agaaattcat tccccctgct gatccaggac tctaacattt gcaccagcgg tgccaacggc    660
aggagcactt gccgcggtga ctccggcggt cctctcgtcg tcaccaggaa caacagacca    720
ctcttgatcg gtatcacctc tttcggatct gcccgcggtt gccaagttgg atctcccgct    780
gccttcgcca gagtcacctc ttacatcagc tggatcaacg gccagctcta aaatatcgaa    840
cattttgcca tatctacaga gatattttga aatacgttaa tttaaataaa tattttattt    900
attcaaaaaa aaaaaaaaaa a                                              921
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BamHI寡核苷酸引物
<400>7
gaccagccgg atccgatcgg atatgcacca ac                                   32
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HindIII寡核苷酸引物
<400>8
 ggagccaagc caagctttga acgcgggcaa actc                                34
<210>9
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗性胰凝乳蛋白酶N-端序列
<400>9
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Ala
        35
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fw2ResChy引物
<400>10
tcagctgtag ctggagctca agatactcc                                       29
<210>11
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FwResChym引物
<400>11
gtagctatac tgactctagc tgcagctgga gctgg                                35
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Hc35PQE-6-Fw引物
<400>12
ttaaccatgg tgatcgacct c                                               21
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Hc35PQ-60-Rv引物
<400>13
gatgagatct gagacgttgg ttg                                            23
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因特异性有义引物
<400>14
cgggatccat ggagtcaaag tttgc                                           25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因特异性反义引物
<400>15
gcgtcgacgc ttaagccacc ctagg                                           25
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>StPOTIA有义引物
<400>16
cgggatccaa ggaatcggaa tctg                                            24
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>StPOTIB有义引物
<400>17
cgggatccaa ggaatttgaa tgc                                             23
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>StPOTIA/B反义引物
<400>18
cgagctctta agccacccta gg                                              22
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FWBacREcHI(5′-3′)引物
<400>19
ttggctttcg ccgcggtcg ctccgcgagg aacgggtccc                            40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FWBacRECH2(5′-3′)引物
<400>20
ggatccatga aactcttggc tgtgactcta ttggctttcg                           40
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RvRECH(3′-5′)引物
<400>21
gatcaacggc cagctctaaa agctt                                           25
<210>22
<211>53
<212>PRT
<213>肽
<400>22
Met Ala Val His Arg Val Ser Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Phe Gly
1               5                   10                  15
Met Ser Leu Leu Val Ser Asn Val Glu His Ala Asp Ala Lys Ala Cys
            20                  25                  30
Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser
        35                  40                  45
Glu Glu Lys Lys Asn
    50
<210>23
<211>58
<212>PRT
<213>肽
<400>23
Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pr0 Arg Ile Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn
    50                  55
<210>24
<211>58
<212>PRT
<213>肽
<400>24
Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Ile Cys Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Asn
    50                  55
<210>25
<211>58
<212>PRT
<213>肽
<400>25
Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn
    50                  55
<210>26
<211>58
<212>PRT
<213>肽
<400>26
Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn
    50                  55
<210>27
<211>54
<212>PRT
<213>肽
<400>27
Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr
1               5                   10                  15
Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser Glu Tyr Ala
            20                  25                  30
Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn Asp Leu Gln Lys
        35                  40                  45
Ser Lys Val Ala Val Ser
    50
<210>28
<211>36
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>28
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Ala
        35
<210>29
<211>29
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>29
Ile Val Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ile Gly Gln Ile Pro Tyr Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Phe Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys
            20                  25
<210>30
<211>29
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>30
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Val Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Ser Phe Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys
            20                  25
<210>31
<211>29
<212>PRT
<213>棉铃虫
<400>31
Ile Val Gly Gly Ser Val Thr Thr Leu Asp Ala Tyr Pro Thr Ile Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Tyr Asn Phe Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys
            20                  25
<210>32
<211>295
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>32
Met Lys Leu Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Arg Asn Ile Asp Leu Glu Asp Val Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Tyr Asp Tyr His Thr Lys Ile Gly Ile Pro Leu Ala Glu Lys Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Ala Glu Glu Glu Ala Glu Arg Asn Pro Ser Arg Ile Val Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Ash
                85                  90                  95
Asn Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg Leu Phe Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His Gly Ser Trp
    130                 135                 140
Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn Leu Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Glu Leu Asn Asn Asn Phe Asn Gly Ala Thr Ala Val Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Ser Val Asp Gly Asn Leu Arg His
        195                 200                 205
Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Thr Val Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly GlyPro Leu Val Val Thr Ser Asn
                245                 250                255
Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly
            260                 265                 270
Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe Ile
        275                 280                 285
Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
    290                 295
<210>33
<211>292
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>33
Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Val Ser Ala Arg Asn
1               5                   10                  15
Ile Asp Leu Glu Asp Val Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Tyr Asp
            20                  25                  30
Tyr His Thr Lys Ile Gly Ile Pro Leu Ala Glu Lys Ile Arg Ala Ala
        35                  40                  45
Glu Glu Glu Ala Glu Arg Asn Pro Ser Arg Ile Val Gly Gly Ser Thr
    50                  55                  60
Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Ala Thr Phe
65                  70                  75                  80
Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Asn Arg Arg
                85                  90                  95
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn Gln Ala Arg
            100                 105                 110
Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg Leu Phe Ser Gly Gly Thr
        115                 120                 125
Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His Gly Ser Trp Asn Pro Asn
    130                 135                 140
Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn Leu Pro Ser Asn Val Ala
145                 150                 155                 160
Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asn Glu Leu
                165                 170                 175
Asn Asn Asn Phe Asn Gly Ala Thr Ala Val Ala Ser Gly Phe Gly Leu
            180                 185                 190
Ala Arg Asp Gly Gly Ser Val Asp Gly Asn Leu Arg His Val Asn Leu
        195                 200                 205
Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Thr Val Ser Phe Pro Gly Ile Ile
    210                 215                 220
Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Gly Thr Cys
225                 230                 235                 240
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Ser Asn Asn Arg Arg
                245                 250                 255
Ile Leu Ile Gly Val Thr Pro Phe Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val
            260                 265                 270
Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe Ile Ser Trp Ile
        275                 280                 285
Asn Gln Arg Leu
    290
<210>34
<211>295
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>34
Met Lys Leu Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Arg Asn Ile Asp Leu Glu Asp Val Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Tyr Asp Tyr His Thr Lys Ile Gly Ile Pro Leu Ala Glu Lys Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Ala Glu Glu Glu Ala Glu Arg Asn Pro Ser Arg Ile Val Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Thr Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
                85                  90                  95
Asn Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg Leu Phe Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His Gly Ser Trp
    130                 135                 140
Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Asn Leu Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Glu Leu Asn Asn Asn Phe Asn Gly Ala Thr Ala Val Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Phe Gly Leu Ala Asn Asp Gly Gly Ser Val Asp Gly Asn Leu Arg His
        195                 200                 205
Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Thr Val Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Ser Asn
                245                 250                 255
Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly
            260                 265                 270
Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe Ile
        275                 280                 285
Ser Trp Ile Asn Asn Leu Leu
    290                 295
<210>35
<211>276
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>35
Ile Asn His Glu Ala Val Val Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Tyr Gly
1               5                   10                  15
Tyr His Thr Lys Val Gly Ile Pro Leu Ala Glu Glu Ile Arg Ile Ala
            20                  25                  30
Glu Leu Glu Ala Ser Arg Asn Pro Ser Arg Ile Val Gly Gly Ser Ser
        35                  40                  45
Ala Ser Leu Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Ile Asn Leu
    50                  55                  60
Pro Leu Gly Gln Ser Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Gln Arg Arg
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn Gln Ala Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Thr Val Ile Leu Gly Ser Ile Asn Leu Tyr Phe Gly Gly Thr
            100                 105                 110
Arg Leu Asn Ser Asn Ser Val Val Met His Gly Ser Trp Asn Pro Asn
        115                 120                 125
Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Asn Leu Pro Ser Asn Val Gly
    130                 135                 140
Thr Ser Asn Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asn Glu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Gln Phe Ala Gly Phe Thr Ala Thr Ala Ser Gly Phe Gly Arg
                165                 170                 175
Thr Arg Asp Gly Gly Ser Val Ser Pro Thr Leu Asn His Val Asn Leu
            180                 185                 190
Pro Val Ile Thr Asn Asn Val Cys Trp Gln Ser Phe Pro Leu Tyr Ile
        195                 200                 205
Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys
    210                 215                 220
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Ser Asn Asn Arg Arg
225                 230                 235                 240
Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Asp Arg Gly Cys Gln Val
                245                 250                 255
Gly Ala Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile
            260                 265                 270
Asn Gln Arg Leu
        275
<210>36
<211>292
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>36
Met Lys Leu Phe Leu Gly Val Cys Leu Thr Leu Ala Val Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Glu Ile Ala Thr Pro Asp Ala Asp Ser Pro Val Phe Gly Tyr
            20                  25                  30
His Ala Lys Phe Gly Ile Ala Glu Ala Ala Arg Ile Lys Ser Ala Glu
        35                  40                  45
Glu Val Gln Ser Phe Asn Gly Gln Arg Ile Val Gly Gly Ser Ile Thr
    50                  55                  60
Asn Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe
65                  70                  75                  80
Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser His Asn Arg Leu
                85                  90                  95
Val Thr Ala Ala His Cys Lys Ser Asp Gly Val Leu Thr Ala Asn Ser
            100                 105                 110
Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Asn Thr Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Ile Asn Thr Asn Asp Val Val Met His Pro Asn Trp Asn Pro Asn Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Asn Asp Ile Ala Val Leu Arg Ile Ser Ser Val Ser Phe Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Ile Gln Pre Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asp Glu Leu Asn Asn
                165                 170                 175
Leu Phe Val Gly Ala Asn Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Arg Thr Ser
            180                 185                 190
Asp Ser Gly Ser Ile Gly Thr Asn Gln Gln Leu Ser Ser Val Thr Ile
        195                 200                 205
Pro Val Ile Thr Asn Ala Gln Cys Ala Ala Val Tyr Gly Ser Gly Phe
    210                 215                 220
Val His Ala Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr
225                 230                 235                 240
Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Val Asp Ser Asn Asn Arg
                245                 250                 255
Lys Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Tyr Gly Ala Gln Ala Gly Cys Ala
            260                 265                 270
Ala Gly Phe Pro Ala Ala Phe Ala Arg Vel Thr Ser Phe Val Asp Trp
        275                 280                 285
Val Gln Ser Gln
    290
<210>37
<211>257
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>37
His Asn Lys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Ala Asn Arg Ile
1               5                   10                  15
Thr Phe Val Val Arg Phe Gly Leu Thr Asn Leu Thr Arg Pro Glu Ile
            20                  25                  30
Leu Val Glu Ser Ala Asn Lys Tyr Ile His Pro Asp Tyr Asp Glu Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Gly Val Gln Thr Ala Asp Leu Ala Leu Val Gly Leu Asp His
    50                  55                  60
His Ile Glu Tyr Ser Ala Asn Val Gln Pro Ser Arg Leu Met Ser Ser
65                  70                  75                  80
Ala Gln Lys Asn Ile Asn Tyr Glu Gly Ile Gln Met Ile Val Ser Gly
                85                  90                  95
Phe Gly Arg Thr Asp Asp Leu Trp Asn Gly Gly Ala Ala Ser Glu Ile
            100                 105                 110
Leu Leu Trp Val Tyr Gln Arg Gly Val Ser Asn Glu Glu Cys Leu Arg
        115                 120                 125
Trp Tyr Pre Thr Ser Gln Val Ile Lys Glu Glu Thr Ile Cys Ala Gly
    130                 135                 140
Tyr Trp Asp Asn Pro Ser Gln Ser Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Pro Leu Thr Ile Ile Asp Ala Asp Gly Glu Arg Thr Gln Val Gly Ile
                165                 170                 175
Val Ser Phe Gly Ser Thr Ala Gly Cys Asn Ser Pro Phe Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Tyr Val Arg Pro Gly His Tyr His Asp Trp Phe Thr Glu Val Thr Gly
        195                 200                 205
Ile Asn Phe Asp Trp Asp Ser Asp Ala Ile Ile Pro Gly Ser Ser Glu
    210                 215                 220
Ser Glu Glu Asp Gly Ser Asn Pro Ser Ser Glu Glu Asp Ala Gly Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Ser Glu Glu Glu Glu Ala Pro Glu Lys Val Arg Val Val Glu
                245                 250                 255
Tyr
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FWG1引物
<400>38
tcccttacca ggcgctgtc                                                  19
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RVG4引物
<400>39
tctggcgaag gcagcagg                                                   18
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y79Fw引物
<400>40
ctgctagcct cggacaattc                                                 20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y72Fw引物
<400>41
ctggagtgca gactgctgac                                                 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Y72Rv引物
<400>42
ggatgatggc gtcgctgtcc                                                 20
<210>43
<211>213
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>43
Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val
1               5                   10                  15
Cys Gly Ala Ser Leu Ile Pro His Asn Arg Leu Val Thr Ala Ala His
            20                  25                  30
Cys Lys Ser Asp Gly Val Leu Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val Val Leu
        35                  40                  45
Gly Ser Asn Thr Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Ile Asn Thr Asn Asp
    50                  55                  60
Val Val Met His Pro Asn Trp Asn Pro Ser Thr Ala Ala Asn Asp Ile
65                  70                  75                  80
Ala Val Met Arg Ile Ser Ser Val Ser Phe Ser Asn Val Ile Gln Pro
                85                  90                  95
Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asp Glu Leu Asn Asn Leu Phe Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Arg Thr Ser Asp Gly Gly Ser Ile
        115                 120                 125
Gly Ser Asn Gln Gln Val Ser Ser Val Thr Ile Pro Val Ile Thr Asn
    130                 135                 140
Asp Glu Cys Ala Ala Val Tyr Gly Ser Ala Phe Val His Ser Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ile Cys Thr Ser Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser
                165                 170                 175
Gly Gly Pro Leu Ala Ile Asp Ser Asn Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly
            180                 185                 190
Val Thr Ser Tyr Gly Ala Gln Ala Gly Cys Ala Ala Gly Leu Pro Ala
        195                 200                 205
Ala Phe Ala Arg Lys
    210
<210>44
<211>213
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>44
Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val
1               5                   10                  15
Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser His Asn Arg Leu Val Thr Ala Ala His
            20                  25                  30
Cys Lys Phe Asp Gly Val Met Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val Val Leu
        35                  40                  45
Gly Ser Asn Thr Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Ile Asn Thr Asn Asp
    50                  55                  60
Val Val Met His Pro Asn Trp Asn Pro Ser Thr Val Ala Asn Asp Ile
65                  70                  75                  80
Ala Val Ile Arg Ile Ser Ser Ile Val Phe Asn Asn Val Ile Gln Pro
                85                  90                  95
Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asp Glu Leu Asn Asn Leu Phe Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Arg Thr Ser Asp Ser Gly Gly Ile
        115                 120                 125
Gly Thr Asn Gln Gln Leu Ser Ser Val Thr Ile Pro Val Ile Thr Asn
    130                 135                 140
Ala Glu Cys Ala Ala Val Tyr Gly Pro Ala Phe Val His Asp Thr Asn
145                 150                 155                 160
Ile Cys Thr Ser Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser
                165                 170                 175
Gly Gly Pro Leu Ala Val Asp Ser Asn Asp Lys Lys Ile Leu Ile Gly
            180                 185                 190
Val Thr Ser Tyr Gly Ala Ala Asp Gly Cys Ala Ala Gly Phe Pro Ala
        195                 200                 205
Ala Ser Pro Glu Arg
    210
<210>45
<211>177
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>45
Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Ala Asn Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val
1               5                   10                  15
Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Gln Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His
            20                  25                  30
Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu
        35                  40                  45
Gly Ser Val Arg Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Leu Asp Thr Ala Ser
    50                  55                  60
Val Val Met His Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile
65                  70                  75                  80
Ala Met Ile Asn Leu Pro Ser Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala
                85                  90                  95
Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Asn Phe Asn Gly
            100                 105                 110
Ala Thr Ala Thr Ala Ser Gly Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Val Asp Gly Asn Leu Arg His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala
    130                 135                 140
Val Cys Thr Val Ser Phe Pro Gly Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ile Cys
145                 150                 155                 160
Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
                165                 170                 175
Pro
<210>46
<211>217
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>46
Ser Ala Ser Leu Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Ile Asn
1               5                   10                  15
Leu Pro Leu Gly Gln Ser Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Gln Arg
            20                  25                  30
Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn Gln Ala
        35                  40                  45
Thr Ser Leu Thr Val Ile Leu Gly Ser Ile Asn Leu Phe Phe Gly Gly
    50                  55                  60
Thr Arg Leu Asn Ser Asn Ser Val Val Met His Gly Ser Trp Asn Pro
65                  70                  75                  80
Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Asn Leu Pro Ser Asn Val
                85                  90                  95
Gly Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asn Glu
            100                 105                 110
Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Phe Thr Ala Thr Ala Ser Gly Phe Gly
        115                 120                 125
Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Val Ser Pro Thr Leu Asn His Val Asn
    130                 135                 140
Leu Pro Val Ile Thr Asn Asn Val Cys Trp Gln Ser Phe Pro Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Gln Ser Thr Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Gly Thr
                165                 170                 175
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Ser Asn Asn Arg
            180                 185                 190
Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Asp Arg Gly Cys Gln
        195                 200                 205
Val Gly Ala Pro Ala Ala Phe Ala Arg
    210                 215
<210>47
<211>170
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>47
Ser Gly Val Gln Thr Ala Asp Leu Ala Leu Val Gly Leu Asp Gln Glu
1               5                   10                  15
Ile Glu Tyr Ser Ala Asn Val Gln Pro Ser Arg Leu Met Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Gln Lys Asn Ile Asn Tyr Glu Gly Ile Gln Met Ile Val Ser Gly Phe
        35                  40                  45
Gly Arg Thr Asp Asp Leu Trp Asn Gly Gly Ala Ala Ser Glu Ile Leu
    50                  55                  60
Leu Trp Val Tyr Gln Arg Gly Val Ser Asn Glu Glu Cys Leu Arg Trp
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Thr Ser Gln Val Ile Lys Glu Gln Thr Ile Cys Ala Gly Tyr
                85                  90                  95
Trp Asp Asn Pro Ser Gln Ser Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
            100                 105                 110
Leu Thr Ile Ile Asp Ala Asp Gly Glu Arg Thr Gln Val Gly Ile Val
        115                 120                 125
Ser Phe Gly Ser Thr Ala Gly Cys Asn Ser Pro Phe Pro Ser Gly Tyr
    130                 135                 140
Val Arg Pro Gly His Tyr His Asp Trp Phe Thr Glu Val Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Asn Phe Asp Trp Asp Ser Asp Ala Ile Ile
                165                 170
<210>48
<211>279
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>48
Ala Val Ser Ala Val Glu Ile Gly Thr Pro Asp Ala Asp Ser Pro Val
1               5                   10                  15
Phe Gly Tyr His Ala Lys Phe Gly Ile Pro Glu Ala Ala Arg Ile Lys
            20                  25                  30
Ser Ala Glu Glu Val Gln Ser Phe Asn Gly Gln Arg Ile Val Gly Gly
        35                  40                  45
Ser Ile Thr Asp Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile
    50                  55                  60
Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser His
65                  70                  75                  80
Asn Arg Leu Val Thr Ala Ala His Cys Lys Ser Asp Gly Val Leu Thr
                85                  90                  95
Ala Asn Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Asn Thr Leu Phe Phe Gly
            100                 105                 110
Gly Thr Arg Ile Asn Thr Asn Asp Val Val Met His Pro Asn Trp Asn
        115                 120                 125
Pro Ser Thr Ala Ala Asn Asp Ile Ala Val Met Arg Ile Ser Ser Val
    130                 135                 140
Ser Phe Ser Asn Val Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asp Glu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Leu Phe Val Gly Ala Asn Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly
                165                 170                 175
Arg Thr Ser Asp Gly Gly Ser Ile Gly Ser Asn Gln Gln Val Ser Ser
            180                 185                 190
Val Thr Ile Pro Val Ile Thr Asn Asp Glu Cys Ala Ala Val Tyr Gly
        195                 200                 205
Ser Ala Phe Val His Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Gly Gly
    210                 215                 220
Lys Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Val Asp Ser
225                 230                 235                 240
Asn Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Tyr Gly Ala Gln Ala
                245                 250                 255
Gly Cys Ala Val Gly Leu Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe
            260                 265                 270
Val Ser Trp Val Gln Ser Gln
        275
<210>49
<211>292
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>49
Met Lys Leu Phe Leu Gly Val Cys Leu Ala Leu Ala Val Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Val Glu Ile Gly Thr Pro Glu Ala Gly Ser Pro Val Phe Gly Tyr
            20                  25                  30
His Ala Lys Phe Gly Ile Ala Glu Ala Ala Arg Ile Lys Ser Ala Glu
        35                  40                  45
Glu Val Gln Ser Phe Asn Gly Gln Arg Ile Val Gly Gly Ser Ile Thr
    50                  55                  60
Asn Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe
65                  70                  75                  80
Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser His Asn Arg Leu
                85                  90                  95
Val Thr Ala Ala His Cys Lys Phe Asp Gly Val Mer Thr Ala Asn Ser
            100                 105                 110
Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Asn Thr Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Ile Asn Thr Asn Asp Val Val Met His Pro Asn Trp Asn Pro Ser Thr
    130                 135                 140
Val Ala Asn Asp Ile Ala Val Ile Arg Ile Ser Ser Ile Val Tyr Asn
145                 150                 155                 160
Asn Val Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asp Glu Leu Asp Asn
                165                 170                 175
Leu Phe Val Gly Ala Asn Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Arg Thr Ser
            180                 185                 190
Asp Ser Gly Gly Ile Gly Thr Asn Gln Gln Leu Ser Ser Val Thr Ile
        195                 200                 205
Pro Val Ile Thr Asn Ala Glu Cys Ala Ala Val Tyr Gly Pro Ala Phe
    210                 215                 220
Val His Asp Thr Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr
225                 230                 235                 240
Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Val Asp Ser Asn Asp Lys
                245                 250                 255
Lys Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Tyr Gly Ala Ala Asp Gly Cys Ala
            260                 265                 270
Ala Gly Phe Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe Val Ser Trp
        275                 280                 285
Val Gln Ser Gln
    290
<210>50
<211>295
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>50
Met Lys Leu Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Val Ser
1                5                  10                  15
Ala Arg Asn Ile Asp Leu Glu Asp Val Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Tyr Asp Tyr His Thr Lys Ile Gly Ile Pro Leu Ala Glu Glu Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Ala Glu Glu Glu Ala Glu Arg Asp Pro Ser Arg Ile Val Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Asn Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
                85                  90                  95
Gln Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg Leu Phe Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Arg Leu Asp Thr Ala Ser Val Val Met His Gly Ser Trp
    130                 135                 140
Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn Leu Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Glu Leu Asn Asn Asn Phe Asn Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Ser Val Asp Gly Asn Leu Arg His
        195                 200                 205
Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Thr Val Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Asn Ser Asn
                245                 250                 255
Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly
            260                 265                 270
Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Phe Ile
        275                 280                 285
Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
    290                 295
<210>51
<211>295
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>51
Met Lys Leu Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Arg Asn Ile Asp Leu Glu Asp Val Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Ala Tyr Asp Tyr His Thr Lys Ile Gly Ile Pro Leu Ala Glu Lys Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Ala Glu Glu Glu Ala Glu Arg Asn Pro Ser Arg Ile Val Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ser Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
                85                  90                  95
Val Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg Leu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Thr Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His Gly Ser Trp
    130                 135                 140
Asn Pro Asn Leu Val Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn Leu Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu Pro Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Glu Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Val Ile Asp Gly Asn Leu Arg His
        195                 200                 205
Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Ser Gln Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Leu Ile Gln Ala Ser Asn Val Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Asn Ser Asn
                245                 250                 255
Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly
            260                 265                 270
Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Ser Ser Tyr Ile
        275                 280                 285
Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
    290                 295
<210>52
<211>234
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>52
Ile Val Gly Gly Ser Ser Ala Ser Leu Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ile Asn Leu Pro Leu Gly Gln Ser Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Gln Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Arg Asn Gln Ala Thr Ser Leu Thr Val Ile Leu Gly Ser Ile Asn
    50                  55                  60
Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Leu Asn Ser Asn Ser Val Val Met Gln
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Asn
                85                  90                  95
Leu Pro Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Phe Thr Ala Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Val Ser Pro Thr
    130                 135                 140
Leu Asn His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Asn Val Cys Trp Gln
145                 150                 155                 160
Ser Phe Pro Leu Tyr Ile Gln Ser Thr Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Asn Gly Arg Gly Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val
            180                 185                 190
Thr Ser Asn Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser
        195                 200                 205
Asp Arg Gly Cys Gln Val Gly Ala Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr
    210                 215                 220
Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
225                 230
<210>53
<211>296
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>53
Met Ala Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Phe Val Leu Gly Tyr Val
l               5                   10                  15
Gln Gly Gly Leu Leu Asn Ala Asp Pro Ala Ile Ile Glu Asp Leu Arg
            20                  25                  30
Asp Ala Glu Phe Ser Ser Gly Ser Arg Ile Val Ala Gly Trp Pro Ala
        35                  40                  45
Val Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Leu Arg Met Val Ser Ala
    50                  55                  60
Ile Gly Gly Val Ser Ser Cys Gly Cys Ser Leu Ile His Asn Lys Trp
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Ala Asn Arg Ile Thr Phe Val Val
                85                  90                  95
Arg Phe Gly Leu Thr Asn Leu Thr Arg Pro Glu Ile Leu Val Glu Ser
            100                 105                 110
Thr Asn Lys Tyr Ile His Pro Glu Tyr Asp Glu Ile Arg Ala Gly Val
        115                 120                 125
Gln Thr Ala Asp Leu Ala Leu Val Gly Leu Asp His Glu Ile Glu Tyr
    130                 135                 140
Ser Ala Asn Val Gln Pro Ser Arg Leu Met Ser Ser Ala Gln Lys Asn
145                 150                 155                 160
Ile Asn Tyr Glu Gly Ile Gln Met Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr
                165                 170                 175
Asp Asp Leu Trp Asn Gly Gly Ala Ala Ser Glu Ile Leu Leu Trp Val
            180                 185                 190
Tyr Gln Arg Gly Val  Ser Asn Glu Glu Cys Leu Arg Trp Tyr Pro Thr
        195                  200                 205
Ser Gln Val Ile Lys Glu Gln Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Trp Asp Asn
    210                 215                 220
Pro Ser Gln Ser Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Thr Ile
225                 230                 235                 240
Ile Asp Ala Asp Gly Glu Arg Thr Gln Ser Arg Tyr Cys Glu Leu Arg
                245                 250                 255
Ile His Cys Trp Asn Ala Ala His Ser Pro Gln Gly Tyr Val Arg Pro
            260                 265                 270
Gly His Tyr His Asp Trp Phe Thr Glu Val Thr Gly Ile Asn Phe Asp
        275                 280                 285
Trp Asp Ser Asp Ala Ile Ile Pro
    290                 295
<210>54
<211>365
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>54
Met Ala Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Phe Val Leu Gly Tyr Val
1               5                   10                  15
Gln Gly Gly Leu Leu Asn Ala Asp Pro Ala Ile Ile Glu Asp Leu Arg
            20                  25                  30
Asp Ala Glu Phe Ser Ser Phe Ser Arg Ile Val Ala Gly Trp Pro Ala
        35                  40                  45
Val Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Leu Arg Met Val Ser Ala
    50                  55                  60
Ile Gly Gly Val Ser Ser Cys Gly Cys Ser Leu Ile His Asn Lys Trp
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Ala Asn Arg Ile Thr Phe Val Val
                85                  90                  95
Arg Phe Gly Leu Thr Asn Leu Thr Arg Pro Glu Ile Leu Val Glu Ser
            100                 105                 110
Thr Asn Lys Tyr Ile His Pro Glu Tyr Asp Glu Ile Arg Ala Gly Val
        115                 120                 125
Gln Thr Ala Asp Leu Ala Leu Val Gly Leu Asp Gln Glu Ile Glu Tyr
    130                 135                 140
Ser Ala Asn Val Gln Pro Ser Arg Leu Met Ser Ser Ala Gln Lys Asn
145                 150                 155                 160
Ile Asn Tyr Glu Gly Ile Gln Met Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr
                165                 170                 175
Asp Asp Leu Trp Asn Gly Gly Ala Ala Ser Glu Ile Leu Leu Trp Val
            180                 185                 190
Tyr Gln Arg Gly Val Ser Asn Glu Glu Cys Leu Arg Trp Tyr Pro Thr
        195                 200                 205
Ser Gln Val Ile Lys Glu Gln Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Trp Asp Asn
    210                 215                 220
Pro Ser Gln Ser Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Thr Ile
225                 230                 235                 240
Ile Asp Ala Asp Gly Glu Arg Thr Gln Val Gly Ile Val Ser Ser Asp
                245                 250                 255
Pro Leu Leu Asp Ala Thr Val His Ser Pro Arg Val Thr Ser Pro Gly
            260                 265                 270
His Tyr His Asp Gly His Arg Gly Asp Arg His Gln Leu Arg Leu Gly
        275                 280                 285
Gln Arg Arg His Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ser Ser Leu Arg Ala Ala
    290                 295                 300
Ile Leu Pro Leu Glu Ser Ser Arg Ala Phe Ile Arg Arg Asn Gln Ser
305                 310                 315                 320
Ser Phe Arg Gly Gly Leu Cys Gln Pro Pro Arg Phe Pro Thr Arg Thr
                325                 330                 335
Val Pro Thr His Leu Pro Arg Arg Thr Leu Ala Ala Pro Pro Ser Glu
            340                 345                 350
Glu Glu Glu Ala Pro Glu Lys Val Arg Val Val Glu Tyr
        355                 360                 365
<210>55
<211>36
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>55
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
l               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Ala
        35
<210>56
<211>30
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>56
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Val Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Ser Phe Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly
            20                  25                  30
<210>57
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>57
Ile Val Gly Gly Ser Ile Thr Asp Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser His Asn
        35
<210>58
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>58
Ile Val Gly Gly Ser Ile Thr Asn Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser His Asn
        35
<210>59
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>59
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Ser Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Val Arg
        35
<210>60
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>60
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Asn Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser
             20                  25                  30
Leu Leu Asn Gln Arg
        35
<210>61
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>61
Ile Val Gly Gly Ser Ser Ala Ser Leu Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Gln Ser Val Cys Gly Gly Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Asn Gln Arg Arg
        35
<210>62
<211>37
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>62
Ile Val Ala Gly Trp Pro Ala Val Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Met Val Ser Ala Ile Gly Gly Val Ser Ser Cys Gly Cys
            20                  25                  30
Ser Leu Ile His Asn
        35
<210>63
<211>235
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>63
Ile Val Gly Gly Ser Ile Thr Asp Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser His Asn Arg Leu Val Thr Ala Ala His Cys Lys Ser Asp
        35                  40                  45
Gly Val Leu Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Asn Thr
    50                  55                  60
Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Ile Asn Thr Asn Asp Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Pro Asn Trp Asn Pro Ser Thr Ala Ala Asn Asp Ile Ala Val Met Arg
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Val Ser Phe Ser Asn Val Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Gly Asp Glu Leu Asn Asn Leu Phe Val Gly Ala Asn Ala Leu Ala
        115                 120                 125
Phe Gly Phe Gly Arg Thr Ser Asp Gly Gly Ser Ile Gly Ser Asn Gln
    130                 135                 140
Gln Val Ser Ser Val Thr Ile Pro Val Ile Thr Asn Asp Glu Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Val Tyr Gly Ser Ala Phe Val His Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
            180                 185                 190
Ala Ile Asp Ser Asn Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Tyr
        195                 200                 205
Gly Ala Gln Ala Gly Cys Ala Ala Gly Leu Pro Ala Ala Phe Ala Arg
    210                 215                 220
Val Thr Ser Phe Val Ser Trp Val Gln Ser Gln
225                 230                 235
<210>64
<211>235
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>64
lle Val Gly Gly Ser Ile Thr Asn Ile Ala Asn Val Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Thr Ile Phe Ile Phe Gln Ser Val Cys Gly Ala Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser His Asn Arg Leu Val Thr Ala Ala His Cys Lys Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Val Met Thr Ala Ash Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Asn Thr
    50                  55                  60
Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Ile Asn Thr Asn Asp Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Pro Asn Trp Asn Pro Ser Thr Val Ala Asn Asp Ile Ala Val Ile Arg
                85                  90                  95
Ile Ser Ser Ile Val Tyr Asn Asn Val Ile Gln Pro Ile Ala Leu Pro
            100                 105                 110
Ser Gly Asp Glu Leu Asp Asn Leu Phe Val Gly Ala Asn Ala Leu Ala
        115                 120                 125
Ser Gly Phe Gly Arg Thr Ser Asp Ser Gly Gly Ile Gly Thr Asn Gln
    130                 135                 140
Gln Leu Ser Ser Val Thr Ile Pre Val Ile Thr Asn Ala Glu Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Val Tyr Gly Pro Ala Phe Val His Asp Thr Asn Ile Cys Thr Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Gly Gly Lys Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
            180                 185                 190
Ala Val Asp Ser Asn Asp Lys Lys Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Tyr
        195                 200                 205
Gly Ala Ala Asp Gly Cys Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ala Phe Ala Arg
    210                 215                 220
Val Thr Ser Phe Val Ser Trp Val Gln Ser Gln
225                 230                 235
<210>65
<211>234
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>65
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Ser Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Val Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Arg Asn Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg
    50                  55                  60
Leu Tyr Ser Gly Gly Thr Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Val Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn
                85                  90                  95
Leu Pro Ser Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Ala Thr Ala Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Val Ile Asp Gly Asn
    130                 135                 140
Leu Arg His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Phe Pro Gly Leu Ile Gln Ala Ser Asn Val Cys Thr Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Asn Gly Arg Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser
        195                 200                 205
Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Ser
    210                 215                 220
Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
225                 230
<210>66
<211>234
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>66
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Asn Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Gln Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Arg Asn Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg
    50                  55                  60
Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Leu Asp Thr Ala Ser Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Met Ile Asn
                85                  90                  95
Leu Pro Ser Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Asn Phe Asn Gly Ala Thr Ala Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Ser Val Asp Gly Asn
    130                 135                 140
Leu Arg His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Phe Pro Gly Ile Ile Gln Ser Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Asn Gly Arg Ser Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser
        195                 200                 205
Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr
    210                 215                 220
Ser Phe Ile Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
225                 230
<210>67
<211>282
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>67
Ile Val Gly Gly Ser Ser Ala Ser Leu Gly Gln Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Gln Ser Val Cys Gly Gly Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Asn Gln Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly
        35                  40                  45
Ile Val Ala Gly Trp Pro Ala Val Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Gly
    50                  55                  60
Ser Leu Arg Met Val Ser Ala Ile Gly Gly Val Ser Ser Cys Gly Cys
65                  70                  75                   80
Ser Leu Ile His Asn Lys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Ala
                85                  90                  95
Asn Arg Asn Gln Ala Thr Ser Leu Thr Val Ile Leu Gly Ser Ile Asn
            100                 105                 110
Leu Phe Phe Gly Gly Thr Arg Leu Asn Ser Asn Ser Val Val Met His
        115                 120                 125
Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Ile Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Asn
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro Ile Ala Leu
145                 150                 155                 160
Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Phe Thr Ala Thr
                165                 170                 175
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Val Ser Pro Thr
            180                 185                 190
Leu Asn His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Asn Val Cys Trp Gln
        195                 200                 205
Ser Phe Pro Leu Tyr Ile Gln Ser Thr Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala
    210                 215                 220
Asn Gly Arg Gly Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val
225                 230                 235                 240
Thr Ser Asn Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe Gly Ser
                245                 250                 255
Asp Arg Gly Cys Gln Val Gly Ala Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr
            260                 265                 270
Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
        275                 280
<210>68
<211>256
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>68
Ile Val Ala Gly Trp Pro Ala Val Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Met Val Ser Ala Ile Gly Gly Val Ser Ser Cys Gly Cys
            20                  25                  30
Ser Leu Ile His Asn Lys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Ala
        35                  40                  45
Asn Arg Ile Thr Phe Val Val Arg Phe Gly Leu Thr Asn Leu Thr Arg
    50                  55                  60
Pro Glu Ile Leu Val Glu Ser Thr Asn Lys Tyr Ile His Pro Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ile Arg Ala Gly Val Gln Thr Ala Asp Leu Ala Leu Val Gly
                85                  90                  95
Leu Asp His Glu Ile Glu Tyr Ser Ala Asn Val Gln Pro Ser Arg Leu
            100                 105                 110
Met Ser Ser Ala Gln Lys Asn Ile Asn Tyr Glu Gly Ile Gln Met Ile
        115                 120                 125
Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr Asp Asp Leu Trp Asn Gly Gly Ala Ala
    130                 135                 140
Ser Glu Ile Leu Leu Trp Val Tyr Gln Arg Gly Val Ser Asn Glu Glu
145                 150                 155                 160
Cys Leu Arg Trp Tyr Pro Thr Ser Gln Val Ile Lys Glu Gln Thr Ile
                165                 170                 175
Cys Ala Gly Tyr Trp Asp Asn Pro Ser Gln Ser Ser Cys Gln Gly Asp
            180                 185                 190
Ser Gly Gly Pro Leu Thr Ile Ile Asp Ala Asp Gly Glu Arg Thr Gln
        195                 200                 205
Ser Arg Tyr Cys Glu Leu Arg Ile His Cys Trp Asn Ala Thr Ala His
    210                 215                 220
Ser Pro Gln Gly Tyr Val Arg Pro Gly His Tyr His Asp Trp Phe Thr
225                 230                 235                 240
Glu Val Thr Gly Ile Asn Phe Asp Trp Asp Ser Asp Ala Ile Ile Pro
                245                 250                 255
<210>69
<211>236
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>69
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Ala Ser Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Thr Thr
    50                  55                  60
Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Ile Pro Thr Ser Asn Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Thr Pro Ser Leu Ile Arg Asn Asp Val Ala Val Ile Arg
                85                  90                  95
Leu Gly Thr Asn Val Ala Thr Ser Asn Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala Leu
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser Asp Thr Gly Ser Ile Ser Ser Asn
    130                 135                 140
Gln Ala Leu Ser His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Arg Asn Ser Phe Pro Leu Leu Ile Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
            180                 185                 190
Val Val Thr Arg Asn Asn Arg Pro Leu Leu Ile Gly Ile Thr Ser Phe
        195                 200                 205
Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg
    210                 215                 220
Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gly Gln Leu
225                 230                 235
<210>70
<211>224
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>70
Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Glu Glu Asn Ser Leu Pro Tyr Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu
            20                  25                  30
Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Thr Arg Ile Gln Val
        35                  40                  45
Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Lys Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe
    50                  55                  60
Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His Pro Lys Tyr Asn Arg Asp Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile
                85                  90                  95
Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala
            100                 105                 110
Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Leu Ser Phe Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Lys Cys Leu Asp Ala Pro Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ala Glu Cys Lys Ala Ser Tyr Pro Gly Lys Ile Thr Asn Ser Met
145                 150                 155                 160
Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Arg Asp
                165                 170                 175
Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Val Val Ser
            180                 185                 190
Trp Gly His Gly Cys Ala Trp Lys Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr Lys
        195                 200                 205
Val Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Ser
    210                 215                 220
<210>71
<211>275
<212>PRT
<213>H.armigera
<400>71
Val His Leu Glu Asp Ser Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Trp Gly
1               5                   10                  15
Tyr Leu Thr Lys Phe Gly Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ile Arg Asn Ala
            20                  25                  30
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Arg Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Leu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Asp Leu Ser Gly
    50                  55                  60
Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ser Arg Val Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe
                 85                  90                  95
Thr Val Val Leu Gly Ser Thr Thr Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Ile
            100                 105                 110
Ala Thr Ser Asn Val Val Met His Gly Ser Trp Thr Pro Ser Leu Ile
        115                 120                 125
Arg Asn Asp Val Ala Val Ile Arg Leu Gly Thr Asn Val Gly Thr Ser
    130                 135                 140
Asn Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu Pro Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu
145                 150                 155                 160
Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser
                165                 170                 175
Asp Ser Gly Ser Ile Ser Ser Asn Gln Ala Leu Ser His Val Asn Leu
            180                 185                 190
Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Arg Ser Ser Phe Pro Leu Leu Ile
        195                 200                 205
Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys
    210                 215                 220
Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Arg Asn Ser Arg Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ile Gly Ile Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val
                245                 250                 255
Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile
            260                 265                 270
Asn Gly Gln
        275
<210>72
<211>275
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>72
Val His Leu Glu Asp Ser Ile Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Trp Gly
1               5                   10                  15
Tyr Leu Thr Lys Phe Gly Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ile Arg Asn Ala
            20                  25                  30
Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Arg Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Leu Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly
    50                  55                  60
Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ser Arg Val Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe
                85                  90                  95
Thr Val Val Leu Gly Ser Thr Thr Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Ile
            100                 105                 110
Pro Thr Ser Asn Val Val Met His Gly Ser Trp Thr Pro Ser Leu Ile
        115                 120                 125
Arg Asn Asp Val Ala Val Ile Arg Leu Gly Thr Asn Val Gly Thr Ser
    130                 135                 140
Asn Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu Pro Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu
145                 150                 155                 160
Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser
                165                 170                 175
Asp Thr Gly Ser Ile Ser Ser Asn Gln Ala Leu Ser His Val Asn Leu
            180                 185                 190
Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys Arg Asn Ser Phe Pro Leu Leu Ile
        195                 200                 205
Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys
    210                 215                 220
Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Val Thr Arg Asn Asn Arg Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ile Gly Ile Thr Ser Phe Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val
                245                 250                 255
Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile
            260                 265                 270
Asn Gly Gln
        275
<210>73
<211>230
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>73
Ile Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Gln Asp Ser Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile
            20                  25                  30
Ser Glu Asp Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Thr Thr Ser
        35                  40                  45
Asp Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gln Gly Ser Ser Ser Glu Lys
    50                  55                  60
Ile Gln Lys Leu Lys Ile Ala Lys Val Phe Lys Asn Ser Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Thr Ile Asn Asn Asp Ile Thr Leu Leu Lys Leu Ala Thr Pro
                85                  90                  95
Ala Gln Phe Ser Glu Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Asp
            100                 105                 110
Glu Asp Phe Pro Ala Gly Met Leu Cys Ala Thr Thr Gly Trp Gly Lys
        115                 120                 125
Thr Lys Tyr Asn Ala Leu Lys Thr Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Thr
    130                 135                 140
Leu Pro Ile Val Ser Asn Thr Asp Cys Arg Lys Tyr Trp Gly Ser Arg
145                 150                 155                 160
Val Thr Asp Val Met Ile Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys
                165                 170                 175
Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gln Lys Asn Gly Ala Trp
            180                 185                 190
Thr Leu Ala Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ser Thr Cys Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Thr Pro Ala Val Tyr Ala Arg Val Thr Ala Leu Met Pro Trp Val Gln
    210                 215                 220
Glu Thr Leu Ala Ala Asn
225                 230
<210>74
<211>230
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>74
Ile Val Asn Gly Glu Glu Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Gln Asp Lys Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile
            20                  25                  30
Asn Glu Asn Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Thr Thr Ser
        35                  40                  45
Asp Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gln Gly Leu Glu Thr Glu Asp
    50                  55                  60
Thr Gln Val Leu Lys Ile Gly Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Phe Ser
65                  70                  75                  80
Ile Leu Thr Val Arg Asn Asp Ile Thr Leu Leu Lys Leu Ser Thr Ala
                85                  90                  95
Ala Ser Phe Ser Gln Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Ser
            100                 105                 110
Asp Asp Phe Ala Ala Gly Thr Thr Cys Val Thr Thr Gly Trp Gly Leu
        115                 120                 125
Thr Arg Tyr Thr Asn Ala Asn Thr Pro Asp Arg Leu Gln Gln Ala Ser
    130                 135                 140
Leu Pro Leu Leu Ser Asn Thr Asn Cys Lys Lys Tyr Trp Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Ile Lys Asp Ala Met Ile Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys
                165                 170                 175
Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Gln Asn Gly Ala Trp
            180                 185                 190
Thr Leu Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ser Thr Cys Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Thr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Ala Leu Val Asn Trp Val Gln
    210                 215                 220
Gln Thr Leu Ala Ala Asn
225                 230
<210>75
<211>237
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>75
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Ala Ser Phe Ala Ser Gly Gln Gly Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Val Arg Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Arg Asn Gln Ala Arg Ser Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Val Arg
    50                  55                  60
Leu Tyr Ser Gly Gly Thr Arg Leu Asn Thr Ala Ser Val Val Met His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Asn Pro Asn Leu Val Arg Thr Ile Asn Asn Asp Ile Ala
                85                  90                  95
Met Ile Asn Leu Pro Ser Asn Val Ala Thr Ser Gly Asn Ile Ala Pro
            100                 105                 110
Ile Ala Leu Pro Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asn Gln Phe Ala Gly Ala
        115                 120                 125
Thr Ala Thr Ala Ser Gly Phe Gly Leu Ala Arg Asp Gly Gly Val Ile
    130                 135                 140
Asp Gly Asn Leu Arg His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val
145                 150                 155                 160
Cys Ser Gln Ser Phe Pro Gly Leu Ile Gln Ala Ser Asn Val Cys Thr
                165                 170                 175
Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Gln Gly Gly Asp Ser Gly Gly
            180                 185                 190
Pro Leu Val Asn Ser Asn Asn Arg Arg Ile Leu Ile Gly Val Thr Ser
        195                 200                 205
Phe Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala
    210                 215                 220
Arg Val Ser Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gln Arg Leu
225                 230                 235
<210>76
<211>236
<212>PRT
<213>澳洲棉铃虫
<400>76
Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Ser Ala Ser Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe Asp
        35                  40                  45
Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Thr Thr
    50                  55                  60
Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Leu Asn Ile Pro Ser Ser Asn Met His
65                  70                  75                  80
Gly Ser Trp Asn Pro Ser Leu Ile Arg Asn Asp Val Ala Val Ile Arg
                85                  90                  95
Leu Gly Thr Asn Val Ala Thr Ser Asn Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala Leu
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser Tyr Thr Gly Ser Ile Ser Ser Asn
    130                 135                 140
Gln Ala Leu Ser His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Arg Asn Ser Phe Ser Leu Leu Ile Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
            180                 185                 190
Val Val Thr Arg Asn Asn Arg Pro Leu Leu Ile Gly Val Thr Ser Phe
        195                 200                 205
Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala Arg
    210                 215                 220
Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gly Gln Leu
225                 230                 235
<210>77
<211>107
<212>PRT
<213>肽
<400>77
Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
Ser Phe Glu Thr Leu Met Ala Arg Lys Glu Ser Asp Gly Pro Glu Val
            20                  25                  30
Ile Glu Leu Leu Lys Glu Phe Glu Cys Asn Gly Lys Gln Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu Ile Ile Glu Lys
    50                  55                  60
Glu Asn Ser Leu Ile Asn Asn Val Gln Ile Leu Leu Asn Gly Ser Pro
65                  70                  75                  80
Val Thr Met Asp Tyr Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Asp Asn Ile
                85                  90                  95
Leu Gly Ser Val Val Gln Ile Pro Arg Val Ala
            100                 105
<210>78
<211>107
<212>PRT
<213>肽
<400>78
Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
Ser Phe Glu Thr Leu Leu Ala Arg Lys Glu Ser Asp Gly Pro Glu Val
            20                  25                  30
Ile Glu Leu Leu Lys Glu Phe Glu Cys Asn Gly Lys Gln Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu Ile Ile Glu Lys
    50                  55                  60
Glu Asn Ser Leu Ile Asn Asn Val Gln Ile Leu Leu Asn Gly Ser Pro
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Asp Tyr Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Asp Asn Ile
                85                  90                  95
Leu Gly Ser Val Val Gln Ile Pro Arg Val Ala
            100                 105
<210>79
<211>71
<212>PRT
<213>肽
<400>79
Lys Glu Phe Glu Cys Asp Gly Lys Leu Gln Trp Pro Glu Leu Ile Gly
1               5                   10                  15
Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu Ile Ile Glu Lys Gln Asn Ser Leu
            20                  25                  30
Ile Ser Asn Val His Ile Leu Leu Asn Gly Ser Pro Val Thr Met Asp
        35                  40                  45
Phe Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Asp Asp Ile Leu Gly Ser Val
    50                  55                  60
Val Gln Ile Pro Arg Val Ala
65                  70
<210>80
<211>106
<212>PRT
<213>肽
<400>80
Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
Ser Phe Glu Thr Leu Leu Ala Arg Lys Glu Ser Asp Gly Pro Glu Val
            20                  25                  30
Ile Glu Leu Gln Lys Glu Phe Glu Cys Asn Gly Lys Gln Arg Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Gly Ile Ile Glu Lys
    50                  55                  60
Glu Asn Ser Leu Ile Thr Asn Val Gln Ile Leu Leu Asn Gly Ser Pro
65                  70                  75                  80
Val Thr Met Asp Tyr Arg Ser Asn Arg Val Arg Leu Phe Asp Asn Ile
                85                  90                  95
Leu Gly Asp Val Val Gln Ile Pro Arg Val
            100                 105
<210>81
<211>111
<212>PRT
<400>81
Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
Ser Phe Glu Thr Leu Met Ala Arg Lys Glu Gly Asp Gly Ser Glu Val
            20                  25                  30
Ile Lys Leu Leu Lys Glu Ser Glu Ser Glu Ser Trp Cys Lys Gly Lys
        35                  40                  45
Gln Phe Trp Pro Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu
    50                  55                  60
Ile Ile Glu Lys Glu Asn Pro Ser Ile Asn Asp Val Pro Ile Ile Leu
65                  70                  75                  80
Asn Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Phe Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu
                85                  90                  95
Phe Asp Asn Ile Leu Gly Asp Val Val Gln Ile Pro Arg Val Ala
            100                 105                 110
<210>82
<211>111
<212>PRT
<213>肽
<400>82
Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
Ser Phe Glu Thr Leu Met Ala Arg Lys Glu Ile Asp Gly Pro Glu Val
            20                  25                  30
Ile Glu Leu Leu Lys Glu Phe Asp Ser Asn Leu Met Cys Glu Gly Lys
        35                  40                  45
Gln Met Trp Pro Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu
    50                  55                  60
Ile Ile Glu Lys Glu Asn Pro Ser Ile Thr Asn Ile Pro Ile Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ser Gly Ser Pro Ile Thr Leu Asp Tyr Leu Cys Asp Arg Val Arg Leu
                85                  90                  95
Phe Asp Asn Ile Leu Gly Phe Val Val Gln Met Pro Val Val Thr
            100                 105                 110
<210>83
<211>107
<212>PRT
<213>肽
<400>83
Met Val Lys Phe Ala His Val Val Ala Phe Leu Leu Leu Ala Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile Gln Pro Leu Thr Ala Arg Asp Leu Glu Ile Asn Val Leu Gln Leu
            20                  25                  30
Asp Val Ser Gln Ser Gly Cys Pro Gly Val Thr Lys Glu Arg Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Gly Thr Pro Ala Lys Phe Ala Met Gln Ile Ile Gln Lys
    50                  55                  60
Glu Asn Pro Lys Leu Thr Asn Val Gln Thr Ile Leu Asn Gly Gly Pro
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Asp Leu Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Val Asn Val
                85                  90                  95
Leu Asp Phe Ile Val Gln Thr Pro Gln Ile Gly
            100                 105
<210>84
<211>73
<212>PRT
<213>肽
<400>84
Met Ser Ser Thr Glu Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Lys Thr Ser
1               5                   10                  15
Trp Pro Glu Val Val Gly Leu Ser Val Glu Asp Ala Lys Lys Val Ile
            20                  25                  30
Leu Lys Asp Lys Pro Asp Ala Asp Ile Val Val Leu Pro Val Gly Ser
        35                  40                  45
Val Val Thr Ala Asp Tyr Arg Pro Asn Arg Val Arg Ile Phe Val Asp
    50                  55                  60
Ile Val Ala Gln Thr Pro His Ile Gly
65                  70
<210>85
<211>70
<212>PRT
<213>肽
<400>85
Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu Lys Ser Phe Pro Glu Val Val Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Asp Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro Gln Tyr
            20                  25                  30
Asp Val Tyr Phe Leu Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu Arg
        35                  40                  45
Tyr Asn Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro Gly Thr Asn Val Val Asn
    50                  55                  60
His Val Pro His Val Gly
65                  70
<210>86
<211>60
<212>DNA
<213>肽
<400>86
ggatccatga aactcttggc tgtgactcta ttggctttcg ccgcggtcgt ctccgcgagg     60
<210>87
<211>18
<212>PRT
<213>肽
<400>87
Met Lys Leu Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Arg
<210>88
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FwBacREcH2引物
<400>88
ggatccatga aactcttggc tgtgactcta  ttggctttcg                          40
<210>89
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FwBacRECH2引物
<400>89
ttggctttcg ccgcggtcgt ctccgcgagg aacgggtccc                           40
<210>90
<211>864
<212>DNA
<213>肽
<400>90
aacggatccc accatcacca tcaccatgtt cacctcgagg attctattga tctggaagat     60
attaccgctt ggggatacct caccaaattc ggtattccag aagctgagaa aatccgcaac    120
gctgaagaag ctagctctgc tagcaggatc gtcggtggtt cattgtccag tgtcggacag    180
atcccttacc aggctggtct cgtcattgac ttagcaggtg gccaggctgt ctgcggaggc    240
tccctgatca gcgcttcccg cgtactgacc gctgctcact gctggttcga cggccaaaac    300
caggcctgga gattcaccgt tgttcttggt tccaccacct tgttctctgg cggtaccaga    360
atccctacat ccaatgttgt tatgcacgga agctggactc ctagccttat ccgtaacgat    420
gttgccgtaa tcagattggg caccaacgta gcaacctcaa acaccattgc catcatcgct    480
ctacccagcg gcagccagat caacgagaac ttcgccggtg aaaccgccct cgcctccggc    540
ttcggtctca ccagtgacac cggcagcatc tccagcaacc aggctctgag ccacgtcaac    600
ctgccagtga  tcaccaacgc  tgtgtgcaga aattcattcc  ccctgctgat  ccaggactct    660
aacatttgca  ccagcggtgc  caacggcagg agcacttgcc  gcggtgactc  cggcggtcct    720
ctcgtcgtca  ccaggaacaa  cagaccactc ttgatcggta  tcacctcttt  cggatctgcc    780
cgcggttgcc  aagttggatc  tcccgctgcc ttcgccagag  tcacctctta  catcagctgg    840
atcaacggcc  agctctaaaa  gctt                                             864
<210>91
<211>287
<212>PRT
<213>肽
<400>91
Asn Gly Ser His His His His His His Val His Leu Glu Asp Ser Ile
1               5                   10                  15
Asp Leu Glu Asp Ile Thr Ala Trp Gly Tyr Leu Thr Lys Phe Gly Ile
            20                  25                  30
Pro Glu Ala Glu Lys Ile Arg Asn Ala Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser
        35                  40                  45
Arg Ile Val Gly Gly Ser Leu Ser Ser Val Gly Gln Ile Pro Tyr Gln
    50                  55                  60
Ala Gly Leu Val Ile Asp Leu Ala Gly Gly Gln Ala Val Cys Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ile Ser Ala Ser Arg Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Phe
                85                  90                  95
Asp Gly Gln Asn Gln Ala Trp Arg Phe Thr Val Val Leu Gly Ser Thr
            100                 105                 110
Thr Leu Phe Ser Gly Gly Thr Arg Ile Pro Thr Ser Asn Val Val Met
        115                 120                 125
His Gly Ser Trp Thr Pro Ser Leu Ile Arg Asn Asp Val Ala Val Ile
    130                 135                 140
Arg Leu Gly Thr Asn Val Ala Thr Ser Ash Thr Ile Ala Ile Ile Ala
145                 150                 155                 160
Leu Pro Ser Gly Ser Gln Ile Asn Glu Asn Phe Ala Gly Glu Thr Ala
                165                 170                 175
Leu Ala Ser Gly Phe Gly Leu Thr Ser Asp Thr Gly Ser Ile Ser Ser
            180                 185                 190
Asn Gln Ala Leu Ser His Val Asn Leu Pro Val Ile Thr Asn Ala Val
        195                 200                 205
Cys Arg Asn Ser Phe Pro Leu Leu Ile Gln Asp Ser Asn Ile Cys Thr
    210                 215                 220
Ser Gly Ala Asn Gly Arg Ser Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Leu Val Val Thr Arg Asn Asn Arg Pro Leu Leu Ile Gly Ile Thr Ser
                245                 250                 255
Phe Gly Ser Ala Arg Gly Cys Gln Val Gly Ser Pro Ala Ala Phe Ala
            260                 265                 270
Arg Val Thr Ser Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Gly Gln Leu Lys Leu
    275                 280                 285
<210>92
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RvRECH引物
<400>92
gatcaacggc cagctctaaa agctt                                           25
<210>93
<211>15
<212>PRT
<213>肽
<400>93
Ile Val Gly Gly Ser Thr Ser Ser Leu Gly Ala Thr Pro Thr Gln
1               5                   10                  15

Claims (48)

1.一种分离的核酸分子，包含一种核苷酸序列，其编码来自棉铃虫的种的胰凝乳蛋白酶，或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物，其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的蛋白酶抑制剂(PI)展示抗性。
2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ IDNO：2至少约75％相似性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6表示，或者为在最佳比对后具有与SEQID NO：4或SEQ ID NO：6至少约7 5％同一性的核苷酸序列，或者为在低严格条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的核苷酸序列。
5.根据权利要求4的分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO：4表示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1的分离的核酸分子，其编码所述胰凝乳蛋白酶的变体，其中，所述变体为N端信号序列，包含如SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：3至少约75％相似性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：5表示，或者为在最佳比对后具有与SEQ ID NO：5至少75％同一性的核苷酸序列，或者为在低严格条件下能够杂交到SEQ IDNO：5或其互补形式的核苷酸序列。
8.根据权利要求1的分离的核酸分子，其编码所述胰凝乳蛋白酶的一个变体，其中，所述变体在第192位包含不是精氨酸的氨基酸。
9.根据权利要求8的分离的核酸分子，其中，所述变体在第192位包含谷氨酰胺。
10.一种载体，包含权利要求1-9中任一项的核酸分子。
11.根据权利要求8的载体，其中所述载体为表达载体。
12.根据权利要求10的载体，其中，所述表达载体在原核细胞中为可操作的。
13.根据权利要求11的载体，其中，所述表达载体在真核细胞中为可操作的。
14.根据权利要求13的载体，其中，所述真核细胞为昆虫细胞。
15.根据权利要求14的载体，其中，所述载体为杆状病毒载体。
16.一种遗传修饰的细胞，包括权利要求1-9中任一项的核酸分子。
17.根据权利要求16的遗传修饰的细胞，其中，所述细胞为原核细胞。
18.根据权利要求16的遗传修饰的细胞，其中，所述细胞为真核细胞。
19.一种来自棉铃虫的种的分离的胰凝乳蛋白酶，其中，所述胰凝乳蛋白酶对来自花烟草的PI或所述胰凝乳蛋白酶的变体、衍生物、同系物或类似物展示抗性。
20.根据权利要求19的分离的胰凝乳蛋白酶，包含如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，或在最佳比对后具有与SEQ ID NO：2至少约75％相似性的氨基酸序列。
21.根据权利要求20的分离的胰凝乳蛋白酶，包含如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。
22.根据权利要求19的分离的胰凝乳蛋白酶，由在最佳比对后具有与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少约75％同一性的核苷酸序列编码，或者由在低严格条件下能够杂交到SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或其互补形式的核苷酸序列编码。
23.根据权利要求22的分离的胰凝乳蛋白酶，其由如SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列编码。
24.根据权利要求19的分离的胰凝乳蛋白酶，其中，所述变体为N端信号序列。
25.根据权利要求24的分离的胰凝乳蛋白酶，其中，所述信号序列包含如SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，或者包含在最佳比对后与之具有至少75％相似性的氨基酸序列。
26.根据权利要求19的由变体编码的分离的胰凝乳蛋白酶，所述变体在第192位包含不是精氨酸的氨基酸。
27.根据权利要求19的由变体编码的分离的胰凝乳蛋白酶，所述变体在第192位包含谷氨酰胺。
28.由权利要求1-9中任一项的核酸分子编码的分离的胰凝乳蛋白酶。
29.如权利要求19-28中任一项的胰凝乳蛋白酶的拮抗物。
30.根据权利要求29的拮抗物，其中，所述拮抗物与所述胰凝乳蛋白酶在第192位或在靠近第192位的氨基酸残基上结合或相互作用。
31.根据权利要求29或30的拮抗物，其中，所述拮抗物为PotI。
32.一种包含权利要求29或30的拮抗物的组合物。
33.一种包含权利要求29或30的拮抗物的抗昆虫组合物。
34.一种遗传修饰的植物，包含能够产生如权利要求19-26中任一项的胰凝乳蛋白酶之拮抗物或表达如权利要求19-26中任一项的核酸分子的细胞。
35.一种遗传修饰的植物，包含能够产生胰凝乳蛋白酶-HpCh5的拮抗物或HpF5基因表达的细胞。
36.根据权利要求34或35的遗传修饰的植物，其中，所述植物为单子叶植物。
37.根据权利要求34或35的遗传修饰的植物，其中，所述植物为双子叶植物。
38.根据权利要求34或35的遗传修饰的植物，其中，所述植物为农作物、蔬菜或观赏用植物或树。
39.根据权利要求34或35的遗传修饰的植物，其中，所述植物产生PotI。
40.根据权利要求37的遗传修饰的植物，其中，所述植物为棉花、甜玉米、番茄、烟草、piniento、马铃薯、向日葵、柑桔属、李子、高粱属植物、韭、大豆、紫花苜蓿、菜豆、木豆、鹰嘴豌豆、朝鲜蓟、curcurbits、莴苣、石竹属(观赏用植物)、天竺葵、灯笼果、玉米、亚麻和亚麻子、紫花苜蓿、羽扇豆、  蚕豆、青豆、花生、菜籽油、  金鱼草、樱桃、向日葵、金盏花、蜡菊属(观赏用植物)、小麦、大麦、  燕麦、  黑小麦、胡罗卜、洋葱、兰科植物、蔷薇属和矮牵牛花。
41.根据权利要求40的遗传修饰的植物，其中，所述植物为棉花植物。
42.权利要求34-41中任一项的遗传修饰的植物，包含编码Pot1A和/或Pot1B的核酸分子。
43.来自权利要求34-42中任一项的植物的种子或其它繁殖材料。
44.一种用于调节HpCh5或其同系物或变体在昆虫中的活性的方法，  所述方法包括将HpCh5蛋白质或其同系物或变体与有效量的一种试剂在足以降低或增加HpCh5活性的条件下接触一段时间。
45.一种用于调节HpF5或同系物或变体在昆虫中的表达的方法，所述方法包括将HpF5或其同系物或变体与有效量的一种试剂在足以降低或增加HpF5表达的条件下接触一段时间。
46.一种用于分离胰凝乳蛋白酶的单个同工型的方法，所述方法包括：
(i)首先，采用苯甲脒琼脂糖进行昆虫肠道提取物的亲合色谱，以结合胰蛋白酶；
(ii)进一步用固定化的花烟草丝氨酸蛋白酶抑制剂C1对未结合的蛋白质进行亲合色谱，以结合所有的NaPI可抑制性胰凝乳蛋白酶；以及
(iii)用固定化的PotI和PotII或胰凝乳蛋白酶对来自步骤(ii)的洗脱物进行亲合色谱，以结合残留物；随后用8M尿素洗脱推定的对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶。
47.一种用于从棉铃虫的种中筛选对NaPI不敏感的胰凝乳蛋白酶拮抗物的方法，所述方法包括将同一胰凝乳蛋白酶与潜在的拮抗物接触并筛选胰凝乳蛋白酶活性。
48.一种采用权利要求47的方法所鉴别的分离的抑制剂。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110494569A (zh) * 2016-11-14 2019-11-22 联邦科学技术研究组织 蛋白酶传感器分子
CN110551707A (zh) * 2019-10-17 2019-12-10 山西大学 一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法
CN113166231A (zh) * 2018-10-10 2021-07-23 诺维信公司 胰凝乳蛋白酶抑制剂变体及其用途

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002229407C1 (en) 2001-02-08 2005-09-01 Hexima Limited Plant-derived molecules and genetic sequences encoding same and uses therefor
CA2653404C (en) 2006-05-25 2015-06-30 Hexima Limited Multi-gene expression vehicle
US20080050776A1 (en) * 2006-05-26 2008-02-28 Kenneth Neet Stable mutated pro nerve growth factors
BRPI0810233A2 (pt) * 2007-04-20 2014-10-29 Hexima Ltd Defensina de planta quimérica, método para produzir uma planta transgênica, planta transgênica, parte, progenia ou semente, métodos para reduzir um efeito tóxico de expressão de defensina em uma planta transgênica, e par aumentar a resistência a fingos em ma variedade de planta, e em uma variedade de algodão.
AR075257A1 (es) 2008-02-01 2011-03-23 Hexima Ltd Sistema de proteccion de plantas contra la infeccion por agentes patogenos
UY32035A (es) * 2008-08-05 2010-01-29 Hexima Ltd Sistemas antipatogenos
US9889184B2 (en) 2008-08-05 2018-02-13 Hexima Limited Anti-pathogen systems
SG192063A1 (en) 2011-02-07 2013-08-30 Hexima Ltd Modified plant defensins useful as anti-pathogenic agents
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
EA201400031A1 (ru) * 2011-06-17 2014-07-30 Галозим, Инк. Стабильные составы на основе фермента, разрушающего хиалуронан
JP2013192526A (ja) * 2012-03-22 2013-09-30 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質溶液、このタンパク質溶液のプロテアーゼ活性の回復方法及びこのタンパク質溶液を含有する洗剤組成物
CN104400672B (zh) * 2014-10-29 2017-02-22 桂林融通科技有限公司 金属结合剂金刚石砂轮
JP7454575B2 (ja) 2018-07-25 2024-03-22 インヴァイオ サイエンシズ インターナショナル ゲーエムベーハー 注入システム、注入器具及びそのための方法
AU2021212298A1 (en) 2020-01-29 2022-09-22 Invaio Sciences International Gmbh Injection systems, injection tools and methods for same
MX2022015209A (es) 2020-06-02 2023-01-05 Invaio Sciences Int Gmbh Colocadores de puntas y adaptadores de puntas para instalar herramientas de inyeccion para partes de plantas.
US20240081195A1 (en) 2021-01-29 2024-03-14 Invaio Sciences International Gmbh Plant injection systems and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3135541A1 (de) 1981-09-08 1983-03-24 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Kallikrein-trypsin-inhibitor-(bpti)-derivate, traegergebundene bpti-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung zur herstellung der reinen enzyme trypsin, chymotrypsin und kallikrein
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5122466A (en) 1989-06-13 1992-06-16 North Carolina State University Ballistic transformation of conifers
ATE291624T1 (de) 1992-12-16 2005-04-15 Hexima Ltd Ein proteinase inhibitor, vorläufer davon und genetische sequenzen dafür kodierend
US5646040A (en) 1995-06-30 1997-07-08 Millennium Pharmaceutical, Inc. Mammalian tub gene

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110494569A (zh) * 2016-11-14 2019-11-22 联邦科学技术研究组织 蛋白酶传感器分子
CN113166231A (zh) * 2018-10-10 2021-07-23 诺维信公司 胰凝乳蛋白酶抑制剂变体及其用途
CN110551707A (zh) * 2019-10-17 2019-12-10 山西大学 一种纯化中性或碱性蛋白酶的方法

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