CN1564869A - 编码新型异戊二烯基蛋白酶的植物多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供编码植物异戊二烯基蛋白酶多肽、其片断和同系物的新多核苷酸。还提供载体、宿主细胞、抗体和用于制备所述多肽的重组方法。本发明还提供编码植物启动子、多肽、其片断和同系物的新多核苷酸。本发明还涉及应用此新型植物多肽鉴定、预防多种植物疾病和/或病症、和/或赋予对这些疾病和/或病症的抗性(尤其是抗旱性)的方法。
Description
技术领域
本发明提供编码植物异戊二烯基蛋白酶(prenyl protease)多肽、其片断和同系物的新多核苷酸。还提供载体、宿主细胞、抗体和用于制备所述多肽的重组方法。本发明还涉及应用这些新型植物多肽鉴定、预防多种植物疾病和/或病症、和/或赋予对这些疾病和/或病症的抗性(尤其是抗旱性)，和/或操作种子贮存化合物(尤其是油、糖和蛋白质)的量的方法。
发明背景
干旱是植物生长和生产能力的一个最大的限制因素。由于干旱导致的作物(例如大豆、玉米、水稻和棉花)产量损失是一个显著的经济学因素。而且，在全球的许多国家，干旱还导致食物断缺。开发抗干旱作物是一个可能有效地缓解其中一些不利情况的策略。
用于开发耐旱性新植物品系的传统植物育种策略相对缓慢，而且需要在特定耐旱性品系与期望的商业品系之间进行杂交。由此，有限的耐旱性种质资源以及远缘植物物种间在杂交时的不相容性成为传统育种面临的显著问题。相反，植物遗传转化和可赋予特定表达模式的有用基因的存在使得可以使用转基因方法制备耐旱植物。
植物在其整个生命周期中会暴露于环境水分减少的情况。大多数植物已进化出对抗这些枯水情况的策略。然而，如果出现程度严重而且持续时间长的干旱条件，则植物的发育、生长以及大多数农作物的产量会受到极度影响。
与生长在正常条件下的植物相比，干旱胁迫植物的生理有显著改变。大多数改变和它们的原因仍未得以表征。对于脱水感知和细胞变化之间的过程，脱落酸(ABA)起着中心的介导作用。一旦细胞脱水开始，ABA将迅速增加。这种增加将导致气孔关闭，由此减少了蒸腾作用引起的水分损失。
种子中的贮存脂是从碳水化合物来源的前体合成的。植物的确在细胞溶胶中具有完整的糖酵解途径(Plaxton，1996，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47：185-214)，而且已经证实菜籽油菜的质体中也存在完整的途径(Kang & Rawsthorne 1994，PlantJ.6：795-805)。蔗糖是碳和能量的主要来源，其从叶向发育中的种子运输。在种子的贮存期，蔗糖在细胞溶胶中被转化以提供代谢前体葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。这些物质被运送到质体中并转化为作为脂肪酸主要合成前体的乙酰CoA。尽管参与脂、脂肪酸和淀粉的酶促代谢步骤的几种核酸已经得以克隆和鉴定，但可能有大量的此类植物核酸仍有待鉴定。对几种菜籽油菜(oilseed)植物和其它突变植物的表型分析揭示了参与植物脂代谢的几种推测蛋白质，但现有技术还没有描述这些蛋白质的基因组定位或编码它们的核酸序列。
激酶和磷酸酶对蛋白质磷酸化的调节被认为是一种通用的细胞控制机制(Cohen 1992，Trends Biochem.Sci.17：408-413)，而且Ca2+和钙调素信号常通过Ca2+和钙调素依赖性激酶和磷酸酶进行转导(Roberts & Harmon 1992，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43：375-414)。冈田酸是一种蛋白磷酸酶抑制剂，已发现其可影响赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)途径(Kuo等，1996，Plant Cell8：259-269)。尽管GA和ABA信号转导的分子基础仍十分不清楚，但似乎十分明确的是这两种植物激素参与了种子发育中的整个调节过程(例如，Ritchie & Gilroy 1998，Plant Physiol.116：765-776；Arenas-Huertero等，2000，Genes Dev.14：2085-2096)。同样，植物激素乙烯(例如Zhou等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10294-10299；Beaudoin等，2000，Plant Cell 2000：1103-1115)和生长素(例如，Colon-Carmona等，2000，Plant Physiol.124：1728-1738)也参与控制植物发育。
已经明确，对于ABA在脱水信号转导链(1)中的介导作用而言，蛋白质的法呢基化(在蛋白质的C端添加15-碳链)及随后的加工是极为重要的。简而言之，蛋白质的法呢基化是ABA诱导的气孔关闭所必须的，由此也是控制水分丧失所必须的。
蛋白质法呢基化是一个三步骤酶促反应，如图1所示。era1鼠耳芥(Arabidopsis)突变体的耐旱表型由法呢基转移酶(FTase)(该酶是蛋白质法呢基化途径的第一个酶)β亚基中的无效突变引起。
目前，植物文献中尚没有描述相应于参与蛋白质法呢基化的其它酶，即异戊二烯基蛋白酶(PrPase)和甲基化酶的克隆的序列。因此，本领域需要鉴定编码这些蛋白质法呢基化酶的植物基因，以便为制备耐脱水条件(例如，干旱)的植物提供另一种可能性。
发明概述
本发明提供编码展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)和玉米(Zea mays)的完全活性异戊二烯基肽酶多肽或其片断的新多核苷酸。
本发明还提供构建耐旱植物的通用方法。所述方法可以一般性地应用于所有的植物。
本发明还提供鼠耳芥属FTase基因的启动子。该启动子在保卫细胞中有最强的表达，即其是保卫细胞特异性启动子。
本发明另一方面提供用于在酵母中生产大量鼠耳芥属PrPase的酵母表达载体。
本发明还描述了可用于转化鼠耳芥属、菜籽油菜(Rapeseed)、大豆和玉米植物的转化载体。
本发明还包括在ATCC进行了保藏的编码本发明多肽的多核苷酸。
而且，本发明提供了应用本发明多核苷酸和多肽构建具有期望性状的转基因植物的方法，所述期望性状包括但不限于增强的植物防卫、耐旱性、耐盐性、耐紫外线(uv)能力、增强的花发育、萜烯合成和增加的种子贮存化合物(例如油、糖和蛋白质)形成。
本发明还提供鼠耳芥属USP基因的启动子。该基因在种子发育阶段有最强的表达，即，它是种子特异性启动子。本发明提供特异针对本发明多肽的抗体。而且，本发明还提供使用本发明抗体在功能上以及形态上调节植物表型的方法。最后，本发明为更具体地精细化本发明多核苷酸和/或多肽的功能提供了方法。
本发明部分地通过提供5种植物来源的PrPase的分离的多核苷酸和多肽序列满足了本领域的需要。即，我们描述了来自藓类植物展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的PrPase、两种来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PrPase序列，一种来自大豆(Glycine max)的PrPase以及一种来自玉米(Zea mays)的PrPase。
而且，本发明提供了第一结果，该结果提示鼠耳芥属植物中降低的PrPase mRNA量(即，降低的PrPase基因表达)直接与增加的耐旱性(与未转化对照植物相比而言)相关。本发明还描述了通过降低PrPase表达构建耐旱性菜籽油菜、大豆和玉米植物株系的方法。
PrPase活性在真核生物(从人到低等植物)中的保守性有力地提示，PrPase酶是一种必需酶并存在于所有的真核生物中。因此，本发明描述的构建耐旱性植物的方法将一般性适用于所有的植物。
早先描述的鼠耳芥属PrPase的ORF(AF007269(GenBank登录号，基因＝“A_IG002N01.21”)，从24979至28076)是通过计算机程序(Genfinder(P.Green和L.Hillier，www.ncbi.nlm.nih.gov))预测的并存放在GenBank数据库中。如图13所示，它并未反映该基因的真实ORF。这清楚地表明两个AtPrPase1-2都是新序列。
植物分子伴侣的法呢基化明确参与这些蛋白质在胁迫反应中的生物学功能。法呢基化途径的过表达导致对热、干旱和盐胁迫的耐受性增加。此外，蛋白质的法呢基化还参与细胞周期控制的正调节。蛋白质法呢基化的增加导致细胞增殖增加，最终导致生长增加和种子贮存化合物的积累增加。
而且，本发明提供编码植物PrPase多肽，其片断和同系物的新多核苷酸。还提供载体、宿主细胞、抗体和生产所述多肽的重组方法。本发明还涉及应用这些新植物多肽鉴定、预防多种植物疾病和/或病症和/或赋予对它们的抗性、和/或增加种子贮存化合物的量的方法。
附图简述
图1：蛋白质法呢基化途径的示意图。该图标出了参与蛋白质法呢基化途径的已知酶以及它们的功能关系。为了举例说明的目的，预期的靶蛋白质用点线表示；而实线表示添加在靶蛋白质C端“CaaX”位置处的15个碳原子链。此15-碳链通过法呢基转移酶(Ftase)添加到保守半胱氨酸(C)上。而后三个氨基酸残基(aaX)被异戊二烯基肽酶(PrPase)切断。最后，甲基化酶对修饰的半胱氨酸进行甲基化产生蛋白质法呢基化途径的最终活性产物。
图2显示本发明的来自展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的部分PrPase的多核苷酸序列(SEQ ID NO：10)(克隆ID号：PpPrPase1)。该多核苷酸序列含有1398个核苷酸。
图3显示SEQ ID NO：1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。该多肽序列含有394个氨基酸。氨基酸的标准单字母缩写被用于描述该推导的氨基酸序列。
图4：本发明的来自拟南芥的全长PrPase(AtPrPase1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)(克隆ID号：AtPrPase1)。该多核苷酸序列含有1275个核苷酸。
图5：SEQ ID NO：3的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。该多肽序列含有424个氨基酸。氨基酸的标准单字母缩写被用于描述该推导的氨基酸序列。
图6：本发明的来自拟南芥的全长PrPase(AtPrPase2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)(克隆ID号：AtPrPase2)。该多核苷酸序列含有1275个核苷酸。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5是在如下核苷酸位置处存在8个核苷酸差异的两种全长鼠耳芥属AtPrPase：276，504，1046，1062，1068，1141，1182和1190。
图7：SEQ ID NO：5的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。该多肽序列含有424个氨基酸。氨基酸的标准单字母缩写被用于描述该推导的氨基酸序列。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6是在如下氨基酸位置处存在3个氨基酸差异的两种全长鼠耳芥属AtPrPase：349，381和397。
图8：本发明的来自大豆的全长PrPase(GmPrPase1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)(克隆ID号：GmPrPasel)。该多核苷酸含有1434个核苷酸。
图9：SEQ ID NO：7的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。该多肽序列含有400个氨基酸。氨基酸的标准单字母缩写被用于描述该推导的氨基酸序列。
图10：本发明的来自玉米的部分PrPase(ZmPrPase1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)(克隆ID号：ZmPrPase1)。该多核苷酸含有1301个核苷酸。
图11：SEQ ID NO：9的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。该多肽序列含有329个氨基酸。氨基酸的标准单字母缩写被用于描述该推导的氨基酸序列。
图12A-D：SEQ ID NOs：2，4，6，8，10和酿酒酵母(Saccharomycescerevisies)PrPase(Swiss-Prot登录号#P47154)及人PrPase(Swiss-Prot登录号#O75844)的氨基酸多序列比对(CLUSTAL W算法，Blosum62评分矩阵)。活性位置以阴影表示。
图13：鼠耳芥属PrPase的计算机预测(Genefinder(P.Green和L.Hillier，
www.ncbi.nlm.nih.gov))和实验证实的(SEQ ID NO：4和6)ORF的外显子/内含子结构的比较。这些外显子在两个克隆中均顺序编号。相应的外显子彼此上下排列。连接内含子的线不具有生物学意义。在制造该图时，在序列中引入了中断。
图14：含有不同植物启动子控制鼠耳芥属PrPase反义基因表达的植物表达载体pBPSRC003，pBPSRC005和pBPSGB01的图示。在pBPSRC003中，反义PrPase基因的表达受到组成型超启动子(super-promoter)(Ni等，The Plant Journal 7：661-76(1995))的控制。而此同一基因的表达在pBPSRC005中由保卫细胞特异性启动子KST1(G.Plesch等，未发表的结果)驱动，在pBPSGB01中由种子特异性启动子USP(未知种子蛋白，Baumlein等，Mol Gen Genet225：459-467，1991)驱动。图中的成分是：aacCI庆大霉素抗性基因(Hajdukiewicz等，1994，Plant Molecular Biology 25：989-94)，NOS启动子(Becker等，1992 Plant Molecular Biology 20：1195-7)，g7T终止子(Becker等，1992)，NOSpA终止子(Jefferson等，EMBO J 6：3901-7，1987)和nptII(新霉素磷酸转移酶II)卡那霉素抗性基因，AtAct2-I肌动蛋白启动子，OCS3章鱼碱合成酶(MacDonald等，Nucleic Acids Res.19：5575-5581)终止子，种子特异性USP启动子，NOSpA终止子(Jefferson等，EMBO J 6：3901-7，1987)。
图15A-B：本发明的鼠耳芥属AtPrPase1启动子的核苷酸序列(启动子/AtPrPase1)SEQ ID NO：11(克隆ID号：启动子/AtPrPase1)。该多核苷酸含有2047个核苷酸。
图16：本发明PrPase多肽(SEQ ID NOs：2，4，6，8，10)和酵母PrPase(Swiss-Prot登录号#P47154)及人PrPase(Swiss-Prot登录号#O75844)的氨基酸序列比对(fasta：两两比对，Blosum62评分矩阵，缺口开放罚分：10，缺口延伸罚分：0.1)。一致性百分数和相似性百分数的数值显示在括弧中。
发明详述
参考如下对本发明优选实施方案的详细描述和此处包括的实施例，可以更容易地理解本发明。
本发明一方面涉及分离的核酸分子，其编码Physcomitrellapatens、拟南芥、大豆和玉米的PrPase酶的完全活性多肽或部分。而且，本发明还涉及来源于上述克隆的核酸片断，以及能够使用所述核酸片断作为探针在杂交实验中从所述生物以及其它生物分离出的其它核酸片断。
本发明描述了通过降低PrPase基因活性构建耐旱植物和/或增加植物种子中贮存化合物的量的原理。此处对该策略在拟南芥、菜籽油菜、大豆及玉米中的应用作了阐明，但其应用并不限于这些植物。实现此策略的唯一条件是从靶植物中分离出相应的PrPase基因。应用本文所述克隆从其它植物中分离出相应的PrPase基因是本领域技术人员明了的。
PrPase可以通过(但不限于)如下示例性方式来减少：(a)反义基因表达抑制，(b)PrPase的定向抗体，和(c)使用例如锌指来源的转录因子定向工程化地实现对启动子的抑制。
在本发明的另一方面，描述了鼠耳芥属PrPase的启动子。该启动子是保卫细胞特异的并可以用于在植物中构建耐旱性、气体交换调节等性状。
本发明可以通过提供新的在农作物中设计耐旱性的策略，尤其是利用前所未知的植物来源PrPase克隆，对本领域作出巨大贡献。这可以通过降低转化植物细胞(优选但不限于保卫细胞)中所述基因的表达来实现。
而且，细菌分子伴侣(chaperone)DnaJ的法呢基化对于细胞在高温的生长是必需的(Wickner，S.等，1991，Nature 350：165-7)。该分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明的多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性。优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
蛋白质的法呢基化正面地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因，即法呢基转移酶的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211：182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长，及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有如下用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽过表达可以通过加速细胞分裂而用于增加植物的生长。
还可以使用本发明多核苷酸表达用于分析、表征和农业用途的重组蛋白质；表达可用于产生针对本发明多肽的抗体的重组蛋白；作为(例如，优先地，或非优先地)表达相应蛋白质的组织的标记；作为Southern凝胶的杂交标记；作为辅助育种的遗传标记；作为RFLP标记；作为基因分型(品种等)的标记，而且最少可以使用所编码的蛋白质作为分子量标记。
本发明多核苷酸还可以用作染色体标记或标签(当被标记时)以鉴定染色体、对相关基因在染色体中的位置进行作图，或用作突变植物的内源性DNA序列的比较参照物以鉴定等位基因变体和/或自发的或生物的突变。
本发明多核苷酸还可用于制备遗传指纹图谱，用于筛选和制备与“基因芯片”或其它支持物结合的寡聚物，包括用以检查特定基因的表达方式，用于区分内含子和/或外显子边界，用于鉴定拼接和/或等位变体，以及用作诊断工具以鉴定发育阶段、疾病状态和/或营养水平。
本发明还包括能够在严紧或非严紧条件下与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸。该杂交可以用于鉴定本发明多核苷酸的定向进化同源物(orthologs)、同系物、等位变体、变体和/或突变体。此外，还可以通过使用指向本发明多核苷酸序列的寡核苷酸，和在植物细胞或组织样品上进行PCR，将本发明的多核苷酸用于克隆本发明多核苷酸的定向进化同源物、同系物、等位变体、变体和/或突变体。
本发明包括能够与本发明多核苷酸和多肽结合(例如在受体-配体相互作用中)的蛋白质、核酸或其它分子的鉴定。本发明多核苷酸还可以用于相互作用捕获试验(interaction trap assay)(例如，参见Ozenberger和Young(Mol.Endocrinol.9(10)：1321-9(1995)；和Ann N Y Acad Sci.，7；766：279-81，(1995))。
本发明多核苷酸和多肽的潜在用途包括营养上的(例如作为氨基酸补充物)，作为碳源、作为氮源、作为糖源，调节植物防卫活性，调节信号转导，调节代谢物转运(例如碳、氮流等)，赋予对非生物胁迫(水、干旱、寒冷、盐等)的耐受性和/或抗性，赋予对异生素胁迫的耐受性和/或抗性，以及发育控制(例如产量、开花期等)。
本发明多核苷酸和多肽可以用作探针鉴定和分离相应于本发明多核苷酸的全长cDNA和/或基因组DNA、用作探针杂交和发现新的相关DNA序列、用作探针以定位克隆此序列或相关序列、用作探针在发现其它新多核苷酸的方法中“扣除(subtract out)”已知序列、用作探针以定量基因表达、以及用作微阵列的探针。
此外，本发明多核苷酸和多肽可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个膜结构域(membrane domain)。
而且，在优选实施方案中，本发明提供进一步精细改进本发明多核苷酸和/或多肽的生物学功能的方法。
具体地，本发明提供使用本发明多核苷酸和多肽鉴定本发明的定向进化同源物、同系物、变体和/或等位变体的方法。还提供使用本发明多核苷酸和多肽鉴定本发明的完整编码区、本发明的非编码区、本发明的调节序列和本发明的分泌形式、成熟形式、原形式(pro-form)、前原形式(prepro-form)的方法。
在优选实施方案中，本发明为鉴定本发明多核苷酸和多肽中的固有糖基化位点，及随后改变、缺失和/或添加所述位点以获得大量期望特征提供了方法，其中所述期望特征包括，但不限于，增加蛋白质折叠、抑制蛋白质聚集、调节向细胞器的胞内运输、增加对蛋白水解的抗性、调节蛋白抗原性、和介导细胞间粘着。
在其它优选实施方案中，本发明提供使用分子进化来进化本发明多核苷酸和多肽的方法，以期构建和鉴定出具有期望结构、功能和/或生理特征的新变体。
在另一些优选实施方案中，本发明为现有用于功能确定的实验方法和程序提供了条件。这些方法包括，但不限于，将克隆点在阵列上、微阵列技术、基于PCR的方法和可以使用来自我们的克隆的序列信息构建引物或杂种配偶体(hybrid partner)的其它方法。
本文中，术语“环境胁迫”是指任何亚最适生长条件，包括但不限于与盐度、干旱、温度、金属、化学物质、病原体和氧化胁迫或其组合相关的亚最适条件。在优选实施方案中，所述环境胁迫可以是盐度、干旱或温度，或其组合，尤其是可以是高盐度、低水分或低温。也应理解，本说明书和权利要求书中使用的单数形式可以指一个或多个，这取决于该词所在上下文。因此，例如，提及“细胞”时，可以指可以利用至少一个细胞。
本文中，术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链或支链、单链或双链或其杂合体形式的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂合体。这些术语还包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译序列：编码区5’端上游至少约1000个核苷酸的序列以及基因编码区3’端下游至少约200个核苷酸的序列。还可以在反义序列、dsRNA和核酶配对中使用较不常用的碱基，例如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其它。例如，已证实，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔(propyne)类似物的多核苷酸可以以高亲和力结合RNA并作为基因表达的有效反义抑制剂。还可以进行其它修饰，例如修饰磷酸二酯主链，或RNA的核糖基团的2’羟基。反义多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸组成，或可以含有混合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明多核苷酸可以通过任何方式产生，包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、RT-PCR和体外或体内转录。
“分离的”核酸分子是指这样的核酸分子，其基本上与其天然来源中的其它核酸分子(即，编码其它多肽的序列)相分离。优选地，“分离的”核酸不含有在其天然复制子中天然位于其侧翼的某些序列(即，位于该核酸5’和3’端的序列)。例如，克隆的核酸被认为是分离的。在多种实施方案中，分离的PPSRP核酸分子可以含有在其来源细胞基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的不到约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。如果核酸通过人为干预已发生改变，或被置于非其天然位点的座位或位置上，或者如果核酸通过农杆菌感染被引入细胞中，则该核酸也被认为是分离的。而且，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，可以不含有与其天然相关的一些其它细胞物质，或通过重组技术生产时的培养基、或通过化学方式合成时的化学前体或其它化学物质。
特别要从“分离的核酸”定义中排除的是：以体外核酸制品或转染的/转化的宿主细胞制品形式存在的天然染色体(例如染色体铺展物(chromosome spread))、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其中所述宿主细胞为体外非均质制品或作为非均质的单集落群体进行接种。特别还要排除的是其中特定核酸在载体分子的插入核酸中的占有量不足5％的上述文库。进而特别要排除全细胞基因组DNA或全细胞RNA制品(包括经机械剪切或酶促消化的全细胞制品)。甚至进而特别要排除如下电泳分离的体外制品形式或非均质混合物形式的全细胞制品，在该制品中本发明核酸在电泳介质中没有进一步与异质核酸分离(即，在琼脂糖凝胶或尼龙印迹中通过从非均质条带群中切除单一条带而进一步分离)。
本发明多核苷酸和多肽
1号基因编码的多肽的性质
SEQ ID NO：2(图3)提供的该基因的多肽是由SEQ ID NO：1(图2)的多核苷酸序列编码的，和/或是由保藏克隆PpPrPase1所含多核苷酸编码的，其与人和酵母异戊二烯基肽酶(见图12A-D)在核苷酸和氨基酸水平上显著同源。基于此同源性，本发明多肽可能与异戊二烯基肽酶具有至少一些共同的生物学活性。本发明多核苷酸和多肽有多种用途，包括但不限于赋予植物耐旱性和/或耐盐性。本发明多核苷酸还可以用于例如鉴定全长PpPrPase1。而且，针对本发明多肽的拮抗剂可以用于杀真菌用途。
细菌分子伴侣DnaJ的法呢基化是细菌在高温下生长所必需的(Wickner，S.等，1991 Nature 350：165-7)。此分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明的多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性。优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。在一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
蛋白质的法呢基化正向地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因，即法呢基转移酶的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211；182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增殖增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有多种用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PpPrPase1多肽过表达，通过加速细胞分裂而促进植物的生长。
尽管所编码的多肽已被认为可能与异戊二烯基蛋白酶具有至少一些相同的生物学活性，但确定该克隆的确切生物学功能的许多方法是本领域已知的或在本文其它地方有描述。简而言之，该克隆的功能可以通过应用微阵列方法学确定。可以将PpPrPase1克隆以及本发明的其它克隆排列在微阵列上以获得表达谱。随用于和载片杂交的多核苷酸探针的不同，特定基因的表达改变可以提供有关该基因在研究条件下的功能的其它信息。例如，当使用的多核苷酸探针来自经冷处理的组织时，所观察到的表达水平的增加或降低可能指示例如在调节耐寒性方面的功能。对于PpPrPase1，应使用脱水组织或遭受到其它生物或非生物胁迫(热、干旱、高光照、高盐等)的组织提取RNA制备探针。
此外，本发明蛋白质的功能可以通过例如应用定量PCR方法学进行评价。例如，实时定量PCR将能够跟踪特定基因在植物发育周期的整个过程中的表达。定量PCR方法学仅仅需要从每个重要发育阶段(萌发3天的幼苗、1周龄幼苗[根、芽和茎]；开花前的根、叶和茎，花[不同部分]；和/或发育的胚)得到极少量的组织来进行这些实验。因此，本发明包括应用定量PCR方法学对本发明多肽的生物学功能作精细化分析。本发明还包括相应于SEQ ID NO：1(图2)提供的多核苷酸序列的定量PCR探针。
本发明蛋白质的功能还可以通过酵母中的互补实验进行评价。例如，对于PrPrPase1克隆，转化异戊二烯基蛋白酶活性缺陷酵母并评价其生长能力可以为PpPrPase1克隆具有异戊二烯基蛋白酶活性提供有力的证据。可以用于评价本发明多核苷酸和多肽的功能的其它试验条件和方法是本领域已知的，其中一些在本文的其它地方进行了公开。
或者，可以通过破坏Synecosystis中该多肽的同系物，测定该编码多肽的生物学功能。蓝细菌(蓝绿藻)被认为是植物叶绿体的前身。它具有光合系统和许多使人会联想到植物代谢过程的其它代谢过程。这些过程常常是许多商业除草剂的靶标，而且该生物被广泛用于研究多类除草剂的作用模式。Synechocystis是研究得最好的一种蓝细菌。除了大多数对于蓝细菌而言的共性外，它还提供了许多其它优点。Synechocystis具有天然的遗传转化系统，由此适用于一些已充分表征的系统(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli))的有力而成熟的遗传和分子操作(例如定向基因破坏，基因置换等)也可以应用于其上。最重要的是，Synechocystis的完全基因组序列信息是现成的，这就为快速鉴定和克隆目的基因，以及通过遗传和分子手段阐明基因功能提供了途径。
而且，本发明多肽的生物学功能还可以通过应用反义和/或有义方法学和由此产生的转基因植物进行确定。转基因植物中特定基因的有义向或反义向表达可以分别导致该特定基因具有较高或较低的表达水平。改变基因的内源性表达水平可以导致观察到特定表型，然后可以使用此表型得到有关该基因功能的提示。可以使用强的遍在启动子在植物的所有细胞中在所有的时间使该基因过表达或表达不足，或可以使用已充分表征的组织特异性启动子(即，根启动子或花特异性启动子)使该基因在植物的一个或多个不连续部分表达，或可以使用诱导型和/或发育调节的启动子使该基因在发育的特殊时间表达。
对于PpPrpase1转基因植物，如果正常生长条件下没有显示出表型，则可以通过在胁迫条件(脱水、存在高盐、或其它生物或非生物胁迫，如冷、热、干旱、高光照等)下观察植物了解该基因的功能。对于种子贮存化合物，可以通过对油、糖和蛋白质的生化分析(见实施例34)来了解该基因的功能。因此，本发明包括应用反义和/或有义方法学构建转基因植物以精细化本发明多肽的生物学功能。
在优选实施方案中，本发明包括如下N端缺失突变体：
SEQ ID NO：2的 L1-D394，K2-D394，L3-D394，S4-D394，N5-
D394，L6-D394，P7-D394，A8-D394，P9-D394，L10-D394，K11-D394，G12-D394，
I13-D394，V14-D394，S15-D394，Q16-D394，E17-D394，K18-D394，F19-D394，E20-
D394，K21-D394，A22-D394，Q23-D394，A24-D394，Y25-D394，S26-D394，L27-
D394，D28-D394，K29-D394，S30-D394，R31-D394，F32-D394，H33-D394，F34-
D394，V35-D394，H36-D394，A37-D394，A38-D394，V39-D394，N40-D394，I41-
D394，V42-D394，E43-D394，E44-D394，S45-D394，A46-D394，I47-D394，L48-
D394，L49-D394，L50-D394，G51-D394，L52-D394，L53-D394，P54-D394，W55-
D394，A56-D394，W57-D394，D58-D394，K59-D394，S60-D394，G61-D394，S62-
D394，L63-D394，V64-D394，G65-D394，K66-D394，L67-D394，G68-D394，F69-
D394，D70-D394，E71-D394，K72-D394，S73-D394，E74-D394，I75-D394，L76-
D394，Q77-D394，T78-D394，L79-D394，S80-D394，F81-D394，L82-D394，A83-
D394，V84-D394，T85-D394，T86-D394，L87-D394，W88-D394，S89-D394，Q90-
D394，I91-D394，L92-D394，E93-D394，L94-D394，P95-D394，F96-D394，S97-
D394，L98-D394，Y99-D394，S100-D394，T101-D394，F102-D394，V103-D394，
I104-D394，E105-D394，A106-D394，R107-D394，H108-D394，G109-D394，F110-
D394，N111-D394，K112-D394，Q113-D394，T114-D394，I115-D394，W116-D394，
L117-D394，F118-D394，L119-D394，R120-D394，D121-D394，M122-D394，I123-
D394，M124-D394，G125-D394，L126-D394，A127-D394，L128-D394，M129-D394，
M130-D394，V131-D394，V132-D394，G133-D394，P134-D394，P135-D394，I136-
D394，V137-D394，S138-D394，A139-D394，I140-D394，I141-D394，Y142-D394，
I143-D394，V144-D394，Q145-D394，N146-D394，G147-D394，G148-D394，P149-
D394，Y150-D394，L151-D394，A152-D394，L153-D394，Y154-D394，L155-D394，
W156-D394，A157-D394，F158-D394，M159-D394，L160-D394，L161-D394，L162-
D394，S163-D394，L164-D394，V165-D394，L166-D394，M167-D394，A168-D394，
L169-D394，Y170-D394，P171-D394，V172-D394，L173-D394，I174-D394，A175-
D394，P176-D394，L177-D394，F178-D394，N179-D394，T180-D394，F181-D394，
T182-D394，P183-D394，L184-D394，P185-D394，E186-D394，G187-D394，Q188-
D394，L189-D394，R190-D394，A191-D394，K192-D394，I193-D394，E194-D394，
K195-D394，L196-D394，A197-D394，S198-D394，S199-D394，L200-D394，D201-
D394，F202-D394，P203-D394，L204-D394，K205-D394，K206-D394，L207-D394，
F208-D394，V209-D394，I210-D394，D211-D394，G212-D394，S213-D394，T214-
D394，R215-D394，S216-D394，S217-D394，H218-D394，S219-D394，N220-D394，
A221-D394，Y222-D394，M223-D394，Y224-D394，G225-D394，F226-D394，Y227-
D394，N228-D394，S229-D394，K230-D394，R231-D394，I232-D394，V233-D394，
L234-D394，Y235-D394，D236-D394，T237-D394，L238-D394，I239-D394，S240-
D394，Q241-D394，C242-D394，K243-D394，N244-D394，E245-D394，E246-D394，
E247-D394，V248-D394，V249-D394，A250-D394，V251-D394，I252-D394，A253-
D394，H254-D394，E255-D394，L256-D394，G257-D394，H258-D394，W259-D394，
K260-D394，L261-D394，S262-D394，H263-D394，T264-D394，M265-D394，Y266-
D394，S267-D394，F268-D394，L269-D394，A270-D394，M271-D394，Q272-D394，
V273-D394，L274-D394，T275-D394，L276-D394，L277-D394，Q278-D394，F279-
D394，G280-D394，G281-D394，Y282-D394，T283-D394，L284-D394，V285-D394，
R286-D394，N287-D394，S288-D394，S289-D394，G290-D394，L291-D394，F292-
D394，L293-D394，S294-D394，F295-D394，G296-D394，F297-D394，S298-D394，
T299-D394，Q300-D394，P301-D394，V302-D394，L303-D394，I304-D394，G305-
D394，L306-D394，I307-D394，L308-D394，F309-D394，Q310-D394，H311-D394，
T312-D394，I313-D394，M314-D394，P315-D394，F316-D394，H317-D394，H318-
D394，L319-D394，V320-D394，S321-D394，F322-D394，A323-D394，L324-D394，
N325-D394，L326-D394，L327-D394，S328-D394，R329-D394，A330-D394，F331-
D394，E332-D394，F333-D394，Q334-D394，A335-D394，D336-D394，A337-D394，
F338-D394，A339-D394，R340-D394 S341-D394，L342-D394，G343-D394，Y344-
D394，R345-D394，E346-D394，P347-D394，L348-D394，R349-D394，A350-D394，
G351-D394，L352-D394，I353-D394，K354-D394，L355-D394，Q356-D394，E357-
D394，E358-D394，N359-D394，L360-D394，S361-D394，A362-D394，M363-D394，
N364-D394，T365-D394，D366-D394，P367-D394，W368-D394，Y369-D394，S370-
D394，A371-D394，Y372-D394，H373-D394，H374-D394，S375-D394，H376-D394，
P377-D394，P378-D394，L379-D394，V380-D394，E381-D394，R382-D394，L383-
D394，Q384-D394，A385-D394，L386-D394，D387-D394，E388-D394，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
在优选实施方案中，本发明包括如下C端缺失突变体：
SEQ ID NO：2的 L1-D394，L1-T393，L1-K392，L1-K391，L1-
S390，L1-T389，L1-E388，L1-D387，L1-L386，L1-A385，L1-Q384，L1-L383，L1-
R382，L1-E381，L1-V380，L1-L379，L1-P378，L1-P377，L1-H376，L1-S375，L1-
H374，L1-H373，L1-Y372，L1-A371，L1-S370，L1-Y369，L1-W368，L1-P367，L1-
D366，L1-T365，L1-N364，L1-M363，L1-A362，L1-S361，L1-L360，L1-N359，L1-
E358，L1-E357，L1-Q356，L1-L355，L1-K354，L1-I353，L1-L352，L1-G351，L1-
A350，L1-R349，L1-L348，L1-P347，L1-E346，L1-R345，L1-Y344，L1-G343，L1-
L342，L1-S341，L1-R340，L1-A339，L1-F338，L1-A337，L1-D336，L1-A335，L1-
Q334，L1-F333，L1-E332，L1-F331，L1-A330，L1-R329，L1-S328，L1-L327，L1-
L326，L1-N325，L1-L324，L1-A323，L1-F322，L1-S321，L1-V320，L1-L319，L1-
H318，L1-H317，L1-F316，L1-P315，L1-M314，L1-I313，L1-T312，L1-H311，L1-
Q310，L1-F309，L1-L308，L1-I307，L1-L306，L1-G305，L1-I304，L1-L303，L1-V302，
L1-P301，L1-Q300，L1-T299，L1-S298，L1-F297，L1-G296，L1-F295，L1-S294，L1-
L293，L1-F292，L1-L291，L1-G290，L1-S289，L1-S288，L1-N287，L1-R286，L1-
V285，L1-L284，L1-T283，L1-Y282，L1-G281，L1-G280，L1-F279，L1-Q278，L1-
L277，L1-L276，L1-T275，L1-L274，L1-V273，L1-Q272，L1-M271，L1-A270，L1-
L269，L1-F268，L1-S267，L1-Y266，L1-M265，L1-T264，L1-H263，L1-S262，L1-
L261，L1-K260，L1-W259，L1-H258，L1-G257，L1-L256，L1-E255，L1-H254，L1-
A253，L1-I252，L1-V251，L1-A250，L1-V249，L1-V248，L1-E247，L1-E246，L1-
E245，L1-N244，L1-K243，L1-C242，L1-Q241，L1-S240，L1-I239，L1-L238，L1-
T237，L1-D236，L1-Y235，L1-L234，L1-V233，L1-I232，L1-R231，L1-K230，L1-
S229，L1-N228，L1-Y227，L1-F226，L1-G225，L1-Y224，L1-M223，L1-Y222，L1-
A221，L1-N220，L1-S219，L1-H218，L1-S217，L1-S216，L1-R215，L1-T214，L1-
S213，L1-G212，L1-D211，L1-I210，L1-V209，L1-F208，L1-L207，L1-K206，L1-
K205，L1-L204，L1-P203，L1-F202，L1-D201，L1-L200，L1-S199，L1-S198，L1-
A197，L1-L196，L1-K195，L1-E194，L1-I193，L1-K192，L1-A191，L1-R190，L1-
L189，L1-Q188，L1-G187，L1-E186，L1-P185，L1-L184，L1-P183，L1-T182，L1-
F181，L1-T180，L1-N179，L1-F178，L1-L177，L1-P176，L1-A175，L1-I174，L1-L173，
L1-V172，L1-P171，L1-Y170，L1-L169，L1-A168，L1-M167，L1-L166，L1-V165，L1-
L164，L1-S163，L1-L162，L1-L161，L1-L160，L1-M159，L1-F158，L1-A157，L1-
W156，L1-L155，L1-Y154，L1-L153，L1-A152，L1-L151，L1-Y150，L1-P149，L1-
G148，L1-G147，L1-N146，L1-Q145，L1-V144，L1-I143，L1-Y142，L1-I141，L1-
I140，L1-A139，L1-S138，L1-V137，L1-I136，L1-P135，L1-P134，L1-G133，L1-V132，
L1-V131，L1-M130，L1-M129，L1-L128，L1-A127，L1-L126，L1-G125，L1-M124，
L1-I123，L1-M122，L1-D121，L1-R120，L1-L119，L1-F118，L1-L117，L1-W116，L1-
I115，L1-T114，L1-Q113，L1-K112，L1-N111，L1-F110，L1-G109，L1-H108，L1-
R107，L1-A106，L1-E105，L1-I104，L1-V103，L1-F102，L1-T101，L1-S100，L1-Y99，
L1-L98，L1-S97，L1-F96，L1-P95，L1-L94，L1-E93，L1-L92，L1-I91，L1-Q90，L1-
S89，L1-W88，L1-L87，L1-T86，L1-T85，L1-V84，L1-A83，L1-L82，L1-F81，L1-S80，
L1-L79，L1-T78，L1-Q77，L1-L76，L1-I75，L1-E74，L1-S73，L1-K72，L1-E71，L1-
D70，L1-F69，L1-G68，L1-L67，L1-K66，L1-G65，L1-V64，L1-L63，L1-S62，L1-G61，
L1-S60，L1-K59，L1-D58，L1-W57，L1-A56，L1-W55，L1-P54，L1-L53，L1-L52，L1-
G51，L1-L50，L1-L49，L1-L48，L1-I47，L1-A46，L1-S45，L1-E44，L1-E43，L1-V42，
L1-I41，L1-N40，L1-V39，L1-A38，L1-A37，L1-H36，L1-V35，L1-F34，L1-H33，L1-
F32，L1-R31，L1-S30，L1-K29，L1-D28，L1-L27，L1-S26，L1-Y25，L1-A24，L1-Q23，
L1-A22，L1-K21，L1-E20，L1-F19，L1-K18，L1-E17，L1-Q16，L1-S15，L1-V14，L1-
I13，L1-G12，L1-K11，L1-L10，L1-P9，L1-A8，L1-P7，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
许多多核苷酸序列，如EST序列，是公众可获得的并可通过序列数据库得到。其中一些序列与SEQ ID NO：1相关，并且在本发明概念形成之前就可以公开获得。优选将这些相关多核苷酸具体地排除在本发明的范围之外。列出所有的相关序列将是繁琐的。因此，优选将包含通式a-b描述的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸排除在本发明之外，其中a是SEQ ID NO：1的1至1398之间的整数，b是第15至1398间的整数，在此a和b相应于SEQ ID NO：1中所示核苷酸残基的位置，而且b大于或等于a+14。
2号基因编码的多肽的性质
SEQ ID NO：4(图5)提供的该基因的多肽是由SEQ ID NO：3(图4)的多核苷酸序列编码的，和/或是由保藏克隆AtPrPase1所含多核苷酸编码的，其与人和酵母异戊二烯基肽酶(见图12A-D)在核苷酸和氨基酸水平上显著同源。基于此同源性，此本发明多肽可能与异戊二烯基肽酶具有至少一些共同的生物学活性。此本发明多核苷酸和多肽(包括激动剂)有多种用途，包括但不限于赋予植物尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。或者，也可以使用针对此本发明多肽的拮抗剂赋予植物，尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。
在一个优选实施方案中，本发明还包括AtPrPase1基因的启动子(SEQ ID NO：11，图15A-B)。该启动子具有多种用途，包括但不限于指导目的基因在植物保卫细胞中表达。目的基因可以是任何植物内源性基因、非植物来源(例如病毒、哺乳动物、人、合成的、分子进化的、细菌、真菌等)的基因、报道基因、标记基因、期望的输入性状、期望的产出性状、能够赋予植物特定表型的基因、本发明的一个或多个基因、抗体基因、针对本发明多肽的抗体基因、反义基因、以及本领域已知的和/或本文公开的其它基因。
细菌分子伴侣DnaJ的法呢基化是细菌在高温下生长所必需的(Wickner，S.等，1991 Nature 350：165-7)。此分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明此多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性，优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。在一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
蛋白质的法呢基化正向地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因，即法呢基转移酶的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211；182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增殖增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有多种用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽过表达，通过加速细胞分裂而促进植物的生长。
尽管该编码多肽被认为可能与异戊二烯基蛋白酶具有至少一些相同的生物学活性，但确定该克隆的确切生物学功能的许多方法是本领域已知的或描述在本文其它地方。简而言之，该克隆的功能可以通过应用微阵列方法学确定。可以将AtPrPase1克隆以及本发明的其它克隆排列在微阵列上以获得表达谱。随用于和载片杂交的多核苷酸探针的不同，特定基因的表达改变可以提供有关该基因在研究条件下的功能的其它信息。例如，当使用的多核苷酸探针来自经冷处理的组织时，所观察到的表达水平的增加或降低可能指示例如在调节耐寒性方面的功能。对于AtPrPase1，应使用脱水组织或遭受到其它生物或非生物胁迫(热、干旱、高光照、高盐等)的组织提取RNA制备探针。
此外，此蛋白质的功能可以通过例如应用定量PCR方法学进行评价。例如，实时定量PCR将能够跟踪特定基因在整个植物发育周期中的表达。定量PCR方法学仅仅需要从每个重要发育阶段(萌发3天的幼苗、1周龄幼苗[根、芽和茎]；开花前的根、叶和茎，花[不同部分]；和/或发育的胚)得到极少量的组织来进行这些实验。因此，本发明包括应用定量PCR方法学对该多肽的生物学功能作精细化分析。本发明还包括相应于SEQ ID NO：3(图4)提供的多核苷酸序列的定量PCR探针。
该蛋白质的功能还可以通过酵母中的互补实验进行评价。例如，对于AtPrPase1克隆，转化异戊二烯基蛋白酶活性缺陷酵母并评价其生长能力可以为AtPrPase1克隆具有异戊二烯基蛋白酶活性提供有力的证据。可以用于评价本发明多核苷酸和多肽的功能的其它试验条件和方法是本领域已知的，其中一些在本文的其它地方进行了公开。
或者，可以通过破坏Synecosystis中该多肽的同系物，测定该编码多肽的生物学功能。蓝细菌(蓝绿藻)被认为是植物叶绿体的前身。它具有光合系统和许多使人会联想到植物代谢过程的其它代谢过程。这些过程常常是许多商业除草剂的靶标，而且该生物已经被广泛用于研究多类除草剂的作用模式。Synechocystis是研究得最好的一种蓝细菌。除了大多数对于蓝细菌而言的共性外，它还提供了许多其它优点。Synechocystis具有天然的遗传转化系统，由此适用于一些已充分表征的系统(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)的有力而成熟的遗传和分子操作(例如定向基因破坏，基因置换等)也可以应用于其上。最重要的是，Synechocystis的完全基因组序列信息是现成的，这就为快速鉴定和克隆目的基因，以及通过遗传和分子手段阐明基因功能提供了途径。
而且，本发明该多肽的生物学功能还可以通过应用反义和/或有义方法学和由此产生的转基因植物进行确定。转基因植物中特定基因的有义向或反义向表达可以分别导致该特定基因具有较高或较低的表达水平。改变基因的内源性表达水平可以导致观察到特定表型，然后可以使用此表型得到有关该基因功能的提示。可以使用强的遍在启动子在植物的所有细胞中在所有的时间使该基因过表达或表达不足，或可以使用已充分表征的组织特异性启动子(即，根启动子或花特异性启动子)使该基因在植物的一个或多个不连续部分表达，或可以使用诱导型和/或发育调节的启动子使该基因在发育的特殊时间表达。
对于AtPrpase1转基因植物，如果正常生长条件下没有显示出表型，则可以通过在胁迫条件(脱水、存在高盐、或其它生物或非生物胁迫，如冷、热、干旱、高光照等)下观察植物或种子贮存化合物的生化分析了解该基因的功能。因此，本发明包括应用反义和/或有义方法学构建转基因植物以精细化本发明多肽的生物学功能。
在优选实施方案中，本发明包括如下N端缺失突变体：
SEQ ID NO：4的 M1-D424，A2-D424，I3-D424，P4-D424，F5-
D424，M6-D424，E7-D424，T8-D424，V9-D424，V10-D424，G11-D424，F12-D424，
M13-D424，I14-D424，V15-D424，M16-D424，Y17-D424，I18-D424，F19-D424，
E20-D424，T21-D424，Y22-D424，L23-D424，D24-D424，L25-D424，R26-D424，
Q27-D424，L28-D424，T29-D424，A30-D424，L31-D424，K32-D424，L33-D424，
P34-D424，T35-D424，L36-D424，P37-D424，K38-D424，T39-D424，L40-D424，
V41-D424，G42-D424，V43-D424，I44-D424，S45-D424，Q46-D424，E47-D424，
K48-D424，F49-D424，E50-D424，K51-D424，S52-D424，R53-D424，A54-D424，
Y55-D424，S56-D424，L57-D424，D58-D424，K59-D424，S60-D424，Y61-D424，
F62-D424，H63-D424，F64-D424，V65-D424，H66-D424，E67-D424，F68-D424，
V69-D424，T70-D424，I71-D424，L72-D424，M73-D424，D74-D424，S75-D424，
A76-D424，I77-D424，L78-D424，F79-D424，F80-D424，G81-D424，I82-D424，L83-
D424，P84-D424，W85-D424，F86-D424，W87-D424，K88-D424，M89-D424，S90-
D424，G91-D424，A92-D424，V93-D424，L94-D424，P95-D424，R96-D424，L97-
D424，G98-D424，L99-D424，D100-D424，P101-D424，E102-D424，N103-D424，
E104-D424，I105-D424，L106-D424，H107-D424，T108-D424，L109-D424，S110-
D424，F111-D424，L112-D424，A113-D424，G114-D424，V115-D424，M116-D424，
T117-D424，W118-D424，S119-D424，Q120-D424，I121-D424，T122-D424，D123-
D424，L124-D424，P125-D424，F126-D424，S127-D424，L128-D424，Y129-D424，
S130-D424，T131-D424，F132-D424，V133-D424，I134-D424，E135-D424，S136-
D424，R137-D424，H138-D424，G139-D424，F140-D424，N141-D424，K142-D424，
Q143-D424，T144-D424，I145-D424，W146-D424，M147-D424，F148-D424，I149-
D424，R150-D424，D151-D424，M152-D424，I153-D424，K154-D424，G155-D424，
T156-D424，F157-D424，L158-D424，S159-D424，V160-D424，I161-D424，L162-
D424，G163-D424，P164-D424，P165-D424，I166-D424，V167-D424，A168-D424，
A169-D424，I170-D424，I171-D424，F172-D424，I173-D424，V174-D424，Q175-
D424，K176-D424，G177-D424，G178-D424，P179-D424，Y180-D424，L181-D424，
A182-D424，I183-D424，Y184-D424，L185-D424，W186-D424，A187-D424，F188-
D424，M189-D424，F190-D424，I191-D424，L192-D424，S193-D424，L194-D424，
V195-D424，M196-D424，M197-D424，T198-D424，I199-D424，Y200-D424，P201-
D424，V202-D424，L203-D424，I204-D424，A205-D424，P206-D424，L207-D424，
F208-D424，N209-D424，K210-D424，F211-D424，T212-D424，P213-D424，L214-
D424，P215-D424，D216-D424，G217-D424，D218-D424，L219-D424，R220-D424，
E221-D424，K222-D424，I223-D424，E224-D424，K225-D424，L226-D424，A227-
D424，S228-D424，S229-D424，L230-D424，K231-D424，F232-D424，P233-D424，
L234-D424，K235-D424，K236-D424，L237-D424，F238-D424，V239-D424，V240-
D424，D241-D424，G242-D424，S243-D424，T244-D424，R245-D424，S246-D424，
S247-D424，H248-D424，S249-D424，N250-D424，A251-D424，Y252-D424，M253-
D424，Y254-D424，G255-D424，F256-D424，F257-D424，K258-D424，N259-D424，
K260-D424，R261-D424，I262-D424，V263-D424，L264-D424，Y265-D424，D266-
D424，T267-D424，L268-D424，I269-D424，Q270-D424，Q271-D424，C272-D424，
K273-D424，N274-D424，E275-D424，D276-D424，E277-D424，I278-D424，V279-
D424，A280-D424，V281-D424，I282-D424，A283-D424，H284-D424，E285-D424，
L286-D424，G287-D424，H288-D424，W289-D424，K290-D424，L291-D424，N292-
D424，H293-D424，T294-D424，T295-D424，Y296-D424，S297-D424，F298-D424，
I299-D424，A300-D424，V301-D424，Q302-D424，I303-D424，L304-D424，A305-
D424，F306-D424，L307-D424，Q308-D424，F309-D424，G310-D424，G311-D424，
Y312-D424，T313-D424，L314-D424，V315-D424，R316-D424，N317-D424，S318-
D424，T319-D424，D320-D424，L321-D424，F322-D424，R323-D424，S324-D424，
F325-D424，G326-D424，F327-D424，D328-D424，T329-D424，Q330-D424，P331-
D424，V332-D424，L333-D424，I334-D424，G335-D424，L336-D424，I337-D424，
I338-D424，F339-D424，Q340-D424，H341-D424，T342-D424，V343-D424，I344-
D424，P345-D424，L346-D424，Q347-D424，H348-D424，P349-D424，V350-D424，
S351-D424，F352-D424，G353-D424，L354-D424，N355-D424，L356-D424，V357-
D424，S358-D424，R359-D424，A360-D424，F361-D424，E362-D424，F363-D424，
Q364-D424，A365-D424，D366-D424，A367-D424，F368-D424，A369-D424，V370-
D424，K371-D424，L372-D424，G373-D424，Y374-D424，A375-D424，K376-D424，
D377-D424，L378-D424，R379-D424，P380-D424，T381-D424，L382-D424，V383-
D424，K384-D424，L385-D424，Q386-D424，E387-D424，E388-D424，N389-D424，
L390-D424，S391-D424，A392-D424，M393-D424，N394-D424，T395-D424，D396-
D424，P397-D424，L398-D424，Y399-D424，S400-D424，A401-D424，Y402-D424，
H403-D424，Y404-D424，S405-D424，H406-D424，P407-D424，P408-D424，L409-
D424，V410-D424，E411-D424，R412-D424，L413-D424，R414-D424，A415-D424，
I416-D424，D417-D424，G418-D424，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
在优选实施方案中，本发明包括如下C端缺失突变体：
SEQ ID NO：4的 M1-D424，M1-T423，M1-K422，M1-K421，
M1-D420，M1-E419，M1-G418，M1-D417，M1-I416，M1-A415，M1-R414，M1-
L413，M1-R412，M1-E411，M1-V410，M1-L409，M1-P408，M1-P407，M1-H406，
M1-S405，M1-Y404，M1-H403，M1-Y402，M1-A401，M1-S400，M1-Y399，M1-
L398，M1-P397，M1-D396，M1-T395，M1-N394，M1-M393，M1-A392，M1-S391，
M1-L390，M1-N389，M1-E388，M1-E387，M1-Q386，M1-L385，M1-K384，M1-
V383，M1-L382，M1-T381，M1-P380，M1-R379，M1-L378，M1-D377，M1-K376，
M1-A375，M1-Y374，M1-G373，M1-L372，M1-K371，M1-V370，M1-A369，M1-
F368，M1-A367，M1-D366，M1-A365，M1-Q364，M1-F363，M1-E362，M1-F361，
M1-A360，M1-R359，M1-S358，M1-V357，M1-L356，M1-N355，M1-L354，M1-
G353，M1-F352，M1-S351，M1-V350，M1-P349，M1-H348，M1-Q347，M1-L346，
M1-P345，M1-I344，M1-V343，M1-T342，M1-H341，M1-Q340，M1-F339，M1-I338，
M1-I337，M1-L336，M1-G335，M1-I334，M1-L333，M1-V332，M1-P331，M1-Q330，
M1-T329，M1-D328，M1-F327，M1-G326，M1-F325，M1-S324，M1-R323，M1-F322，
M1-L321，M1-D320，M1-T319，M1-S318，M1-N317，M1-R316，M1-V315，M1-
L314，M1-T313，M1-Y312，M1-G311，M1-G310，M1-F309，M1-Q308，M1-L307，
M1-F306，M1-A305，M1-L304，M1-I303，M1-Q302，M1-V301，M1-A300，M1-I299，
M1-F298，M1-S297，M1-Y296，M1-T295，M1-T294，M1-H293，M1-N292，M1-
L291，M1-K290，M1-W289，M1-H288，M1-G287，M1-L286，M1-E285，M1-H284，
M1-A283，M1-I282，M1-V281，M1-A280，M1-V279，M1-I278，M1-E277，M1-D276，
M1-E275，M1-N274，M1-K273，M1-C272，M1-Q271，M1-Q270，M1-I269，M1-
L268，M1-T267，M1-D266，M1-Y265，M1-L264，M1-V263，M1-I262，M1-R261，
M1-K260，M1-N259，M1-K258，M1-F257，M1-F256，M1-G255，M1-Y254，M1-
M253，M1-Y252，M1-A251，M1-N250，M1-S249，M1-H248，M1-S247，M1-S246，
M1-R245，M1-T244，M1-S243，M1-G242，M1-D241，M1-V240，M1-V239，M1-
F238，M1-L237，M1-K236，M1-K235，M1-L234，M1-P233，M1-F232，M1-K231，
M1-L230，M1-S229，M1-S228，M1-A227，M1-L226，M1-K225，M1-E224，M1-I223，
M1-K222，M1-E221，M1-R220，M1-L219，M1-D218，M1-G217，M1-D216，M1-
P215，M1-L214，M1-P213，M1-T212，M1-F211，M1-K210，M1-N209，M1-F208，
M1-L207，M1-P206，M1-A205，M1-I204，M1-L203，M1-V202，M1-P201，M1-Y200，
M1-I199，M1-T198，M1-M197，M1-M196，M1-V195，M1-L194，M1-S193，M1-
L192，M1-I191，M1-F190，M1-M189，M1-F188，M1-A187，M1-W186，M1-L185，
M1-Y184，M1-I183，M1-A182，M1-L181，M1-Y180，M1-P179，M1-G178，M1-
G177，M1-K176，M1-Q175，M1-V174，M1-I173，M1-F172，M1-I171，M1-I170，M1-
A169，M1-A168，M1-V167，M1-I166，M1-P165，M1-P164，M1-G163，M1-L162，
M1-I161，M1-V160，M1-S159，M1-L158，M1-F157，M1-T156，M1-G155，M1-K154，
M1-I153，M1-M152，M1-D151，M1-R150，M1-I149，M1-F148，M1-M147，M1-
W146，M1-I145，M1-T144，M1-Q143，M1-K142，M1-N141，M1-F140，M1-G139，
M1-H138，M1-R137，M1-S136，M1-E135，M1-I134，M1-V133，M1-F132，M1-T131，
M1-S130，M1-Y129，M1-L128，M1-S127，M1-F126，M1-P125，M1-L124，M1-D123，
M1-T122，M1-I121，M1-Q120，M1-S119，M1-W118，M1-T117，M1-M116，M1-
V115，M1-G114，M1-A113，M1-L112，M1-F111，M1-S110，M1-L109，M1-T108，
M1-H107，M1-L106，M1-I105，M1-E104，M1-N103，M1-E102，M1-P101，M1-D100，
M1-L99，M1-G98，M1-L97，M1-R96，M1-P95，M1-L94，M1-V93，M1-A92，M1-
G91，M1-S90，M1-M89，M1-K88，M1-W87，M1-F86，M1-W85，M1-P84，M1-L83，
M1-I82，M1-G81，M1-F80，M1-F79，M1-L78，M1477，M1-A76，M1-S75，M1-D74，
M1-M73，M1-L72，M1-I71，M1-T70，M1-V69，M1-F68，M1-E67，M1-H66，M1-V65，
M1-F64，M1-H63，M1-F62，M1-Y61，M1-S60，M1-K59，M1-D58，M1-L57，M1-S56，
M1-Y55，M1-A54，M1-R53，M1-S52，M1-K51，M1-E50，M1-F49，M1-K48，M1-
E47，M1-Q46，M1-S45，M1-I44，M1-V43，M1-G42，M1-V41，M1-L40，M1-T39，M1-
K38，M1-P37，M1-L36，M1-T35，M1-P34，M1-L33，M1-K32，M1-L31，M1-A30，
M1-T29，M1-L28，M1-Q27，M1-R26，M1-L25，M1-D24，M1-L23，M1-Y22，M1-
T21，M1-E20，M1-F19，M1-I18，M1-Y17，M1-M16，M1-V15，M1-I14，M1-M13，
M1-F12，M1-G11，M1-V10，M1-V9，M1-T8，M1-E7，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
许多多核苷酸序列，如EST序列，是公众可获得的并可通过序列数据库得到。其中一些序列与SEQ ID NO：3相关，并且在本发明概念形成之前就可以公开获得。优选将这些相关多核苷酸具体地排除在本发明的范围之外。列出所有的相关序列将是繁琐的。因此，优选将包含通式a-b描述的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸排除在本发明之外，其中a是SEQ ID NO：3的1至1275之间的整数，b是第15至1275间的整数，在此a和b相应于SEQ ID NO：3中所示核苷酸残基的位置，而且b大于或等于a+14。
3号基因编码的多肽的性质
SEQ ID NO：6(图7)提供的该基因的多肽是由SEQ ID NO：5(图6)的多核苷酸序列编码的，和/或是由保藏克隆AtPrPase2所含多核苷酸编码的，其与人和酵母异戊二烯基肽酶(见图12A-D)在核苷酸和氨基酸水平上显著同源。基于此同源性，此本发明多肽可能与异戊二烯基肽酶具有至少一些共同的生物学活性。此本发明多核苷酸和多肽(包括激动剂)有多种用途，包括但不限于赋予植物，尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。或者，也可以使用针对此本发明多肽的拮抗剂赋予植物，尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性，和/或增加种子贮存化合物的量。
细菌分子伴侣DnaJ的法呢基化是细菌在高温下生长所必需的(Wickner，S.等，1991 Nature 350：165-7)。此分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明此多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性，优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。在一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
蛋白质的法呢基化正向地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因，即法呢基转移酶的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211；182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增殖增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有多种用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明AtPrPase2多肽过表达，通过加速细胞分裂而促进植物的生长。
尽管该编码多肽被认为可能与异戊二烯基蛋白酶具有至少一些相同的生物学活性，但确定该克隆的确切生物学功能的许多方法是本领域已知的或描述在本文其它地方。简而言之，该克隆的功能可以通过应用微阵列方法学确定。可以将AtPrPase2克隆以及本发明的其它克隆排列在微阵列上以获得表达谱。随用于和载片杂交的多核苷酸探针的不同，特定基因的表达改变可以提供有关该基因在研究条件下的功能的其它信息。例如，当使用的多核苷酸探针来自经冷处理的组织时，所观察到的表达水平的增加或降低可能指示例如在调节耐寒性方面的功能。对于AtPrPase2，应使用脱水组织或遭受到其它生物或非生物胁迫(热、干旱、高光照、高盐等)的组织提取RNA制备探针。
此外，此蛋白质的功能可以通过例如应用定量PCR方法学进行评价。例如，实时定量PCR将能够跟踪特定基因在整个植物发育周期中的表达。定量PCR方法学仅仅需要从每个重要发育阶段(萌发3天的幼苗、1周龄幼苗[根、芽和茎]；开花前的根、叶和茎，花[不同部分]；和/或发育的胚)得到极少量的组织来进行这些实验。因此，本发明包括应用定量PCR方法学对该多肽的生物学功能作精细化分析。本发明还包括相应于SEQ ID NO：5(图6)提供的多核苷酸序列的定量PCR探针。
该蛋白质的功能还可以通过酵母中的互补实验进行评价。例如，对于AtPrPase2克隆，转化异戊二烯基蛋白酶活性缺陷酵母并评价其生长能力可以为AtPrPase2克隆具有异戊二烯基蛋白酶活性提供有力的证据。可以用于评价本发明多核苷酸和多肽的功能的其它试验条件和方法是本领域已知的，其中一些在本文的其它地方进行了公开。
或者，可以通过破坏Synecosystis中该多肽的同系物，测定该编码多肽的生物学功能。蓝细菌(蓝绿藻)被认为是植物叶绿体的前身。它具有光合系统和许多使人会联想到植物代谢过程的其它代谢过程。这些过程常常是许多商业除草剂的靶标，而且该生物已经被广泛用于研究多类除草剂的作用模式。Synechocystis是研究得最好的一种蓝细菌。除了大多数对于蓝细菌而言的共性外，它还提供了许多其它优点。Synechocystis具有天然的遗传转化系统，由此适用于一些已充分表征的系统(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)的有力而成熟的遗传和分子操作(例如定向基因破坏，基因置换等)也可以应用于其上。最重要的是，Synechocystis的完全基因组序列信息是现成的，这就为快速鉴定和克隆目的基因，以及通过遗传和分子手段阐明基因功能提供了途径。
而且，本发明多肽的生物学功能还可以通过应用反义和/或有义方法学和由此产生的转基因植物进行确定。转基因植物中特定基因的有义向或反义向表达可以分别导致该特定基因具有较高或较低的表达水平。改变基因的内源性表达水平可以导致观察到特定表型，然后可以使用此表型得到有关该基因功能的提示。可以使用强的遍在启动子在植物的所有细胞中在所有的时间使该基因过表达或表达不足，或可以使用已充分表征的组织特异性启动子(即，根启动子或花特异性启动子)使该基因在植物的一个或多个不连续部分表达，或可以使用诱导型和/或发育调节的启动子使该基因在发育的特殊时间表达。
对于AtPrpase2转基因植物，如果正常生长条件下没有明显表型，则可以通过在胁迫条件(脱水、存在高盐、或其它生物或非生物胁迫，如冷、热、干旱、高光照等)下观察植物或种子贮存化合物(油、糖、蛋白质等)的生化分析了解该基因的功能。因此，本发明包括应用反义和/或有义方法学构建转基因植物以精细化本发明多肽的生物学功能。
在优选实施方案中，本发明包括如下N端缺失突变体：
SEQ ID NO：6的 M1-D424，A2-D424，I3-D424，P4-D424，F5-
D424，M6-D424，E7-D424，T8-D424，V9-D424，V10-D424，G11-D424，F12-D424，
M13-D424，I14-D424，V15-D424，M16-D424，Y17-D424，I18-D424，F19-D424，
E20-D424，T21-D424，Y22-D424，L23-D424，D24-D424，L25-D424，R26-D424，
Q27-D424，L28-D424，T29-D424，A30-D424，L31-D424，K32-D424，L33-D424，
P34-D424，T35-D424，L36-D424，P37-D424，K38-D424，T39-D424，L40-D424，
V41-D424，G42-D424，V43-D424，I44-D424，S45-D424，Q46-D424，E47-D424，
K48-D424，F49-D424，E50-D424，K51-D424，S52-D424，R53-D424，A54-D424，
Y55-D424，S56-D424，L57-D424，D58-D424，K59-D424，S60-D424，Y61-D424，
F62-D424，H63-D424，F64-D424，V65-D424，H66-D424，E67-D424，F68-D424，
V69-D424，T70-D424，I71-D424，L72-D424，M73-D424，D74-D424，S75-D424，
A76-D424，I77-D424，L78-D424，F79-D424，F80-D424，G81-D424，I82-D424，L83-
D424，P84-D424，W85-D424，F86-D424，W87-D424，K88-D424，M89-D424，S90-
D424，G91-D424，A92-D424，V93-D424，L94-D424，P95-D424，R96-D424，L97-
D424，G98-D424，L99-D424，D100-D424，P101-D424，E102-D424，N103-D424，
E104-D424，I105-D424，L106-D424，H107-D424，T108-D424，L109-D424，S110-
D424，F111-D424，L112-D424，A113-D424，G114-D424，V115-D424，M116-D424，
T117-D424，W118-D424，S119-D424，Q120-D424，I121-D424，T122-D424，D123-
D424，L124-D424，P125-D424，F126-D424，S127-D424，L128-D424，Y129-D424，
S130-D424，T131-D424，F132-D424，V133-D424，I134-D424，E135-D424，S136-
D424，R137-D424，H138-D424，G139-D424，F140-D424，N141-D424，K142-D424，
Q143-D424，T144-D424，I145-D424，W146-D424，M147-D424，F148-D424，I149-
D424，R150-D424，D151-D424，M152-D424，I153-D424，K154-D424，G155-D424，
T156-D424，F157-D424，L158-D424，S159-D424，V160-D424，I161-D424，L162-
D424，G163-D424，P164-D424，P165-D424，I166-D424，V167-D424，A168-D424，
A169-D424，I170-D424，I171-D424，F172-D424，I173-D424，V174-D424，Q175-
D424，K176-D424，G177-D424，G178-D424，P179-D424，Y180-D424，L181-D424，
A182-D424，I183-D424，Y184-D424，L185-D424，W186-D4 24，A187-D424，F188-
D424，M189-D424，F190-D424，I191-D424，L192-D424，S193-D424，L194-D424，
V195-D424，M196-D424，M197-D424，T198-D424，I199-D424，Y200-D424，P201-
D424，V202-D424，L203-D424，I204-D424，A205-D424，P206-D424，L207-D424，
F208-D424，N209-D424，K210-D424，F211-D424，T212-D424，P213-D424，L214-
D424，P215-D424，D216-D424，G217-D424，D218-D424，L219-D424，R220-D424，
E221-D424，K222-D424，I223-D424，E224-D424，K225-D424，L226-D424，A227-
D424，S228-D424，S229-D424，L230-D424，K231-D424，F232-D424，P233-D424，
L234-D424，K235-D424，K236-D424，L237-D424，F238-D424，V239-D424，V240-
D424，D241-D424，G242-D424，S243-D424，T244-D424，R245-D424，S246-D424，
S247-D424，H248-D424，S249-D424，N250-D424，A251-D424，Y252-D424，M253-
D424，Y254-D424，G255-D424，F256-D424，F257-D424，K258-D424，N259-D424，
K260-D424，R261-D424，I262-D424，V263-D424，L264-D424，Y265-D424，D266-
D424，T267-D424，L268-D424，I269-D424，Q270-D424，Q271-D424，C272-D424，
K273-D424，N274-D424，E275-D424，D276-D424，E277-D424，I278-D424，V279-
D424，A280-D424，V281-D424，I282-D424，A283-D424，H284-D424，E285-D424，
L286-D424，G287-D424，H288-D424，W289-D424，K290-D424，L291-D424，N292-
D424，H293-D424，T294-D424，T295-D424，Y296-D424，S297-D424，F298-D424，
I299-D424，A300-D424，V301-D424，Q302-D424，I303-D424，L304-D424，A305-
D424，F306-D424，L307-D424，Q308-D424，F309-D424，G310-D424，G311-D424，
Y312-D424，T313-D424，L314-D424，V315-D424，R316-D424，N317-D424，S318-
D424，T319-D424，D320-D424，L321-D424，F322-D424，R323-D424，S324-D424，
F325-D424，G326-D424，F327-D424，D328-D424，T329-D424，Q330-D424，P331-
D424，V332-D424，L333-D424，I334-D424，G335-D424，L336-D424，I337-D424，
I338-D424，F339-D424，Q340-D424，H341-D424，T342-D424，V343-D424，I344-
D424，P345-D424，L346-D424，Q347-D424，H348-D424，L349-D424，V350-D424，
S351-D424，F352-D424，G353-D424，L354-D424，N355-D424，L356-D424，V357-
D424，S358-D424，R359-D424，A360-D424，F361-D424，E362-D424，F363-D424，
Q364-D424，A365-D424，D366-D424，A367-D424，F368-D424，A369-D424，V370-
D424，K371-D424，L372-D424，G373-D424，Y374-D424，A375-D424，K376-D424，
D377-D424，L378-D424，R379-D424，P380-D424，A381-D424，L382-D424，V383-
D424，K384-D424，L385-D424，Q386-D424，E387-D424，E388-D424，N389-D424，
L390-D424，S391-D424，A392-D424，M393-D424，N394-D424，T395-D424，D396-
D424，L397-D424，L398-D424，Y399-D424，S400-D424，A401-D424，Y402-D424，
H403-D424，Y404-D424，S405-D424，H406-D424，P407-D424，P408-D424，L409-
D424，V410-D424，E411-D424，R412-D424，L413-D424，R414-D424，A415-D424，
I416-D424，D417-D424，G418-D424，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
在优选实施方案中，本发明包括如下C端缺失突变体：
SEQ ID NO：6的 M1-D424，M1-T423，M1-K422，M1-K421，
M1-D420，M1-E419，M1-G418，M1-D417，M1-I416，M1-A415，M1-R414，M1-
L413，M1-R412，M1-E411，M1-V410，M1-L409，M1-P408，M1-P407，M1-H406，
M1-S405，M1-Y404，M1-H403，M1-Y402，M1-A401，M1-S400，M1-Y399，M1-
L398，M1-L397，M1-D396，M1-T395，M1-N394，M1-M393，M1-A392，M1-S391，
M1-L390，M1-N389，M1-E388，M1-E387，M1-Q386，M1-L385，M1-K384，M1-
V383，M1-L382，M1-A381，M1-P380，M1-R379，M1-L378，M1-D377，M1-K376，
M1-A375，M1-Y374，M1-G373，M1-L372，M1-K371，M1-V370，M1-A369，M1-
F368，M1-A367，M1-D366，M1-A365，M1-Q364，M1-F363，M1-E362，M1-F361，
M1-A360，M1-R359，M1-S358，M1-V357，M1-L356，M1-N355，M1-L354，M1-
G353，M1-F352，M1-S351，M1-V350，M1-L349，M1-H348，M1-Q347，M1-L346，
M1-P345，M1-I344，M1-V343，M1-T342，M1-H341，M1-Q340，M1-F339，M1-I338，
M1-I337，M1-L336，M1-G335，M1-I334，M1-L333，M1-V332，M1-P331，M1-Q330，
M1-T329，M1-D328，M1-F327，M1-G326，M1-F325，M1-S324，M1-R323，M1-F322，
M1-L321，M1-D320，M1-T319，M1-S318，M1-N317，M1-R316，M1-V315，M1-
L314，M1-T313，M1-Y312，M1-G311，M1-G310，M1-F309，M1-Q308，M1-L307，
M1-F306，M1-A305，M1-L304，M1-I303，M1-Q302，M1-V301，M1-A300，M1-I299，
M1-F298，M1-S297，M1-Y296，M1-T295，M1-T294，M1-H293，M1-N292，M1-
L291，M1-K290，M1-W289，M1-H288，M1-G287，M1-L286，M1-E285，M1-H284，
M1-A283，M1-I282，M1-V281，M1-A280，M1-V279，M1-I278，M1-E277，M1-D276，
M1-E275，M1-N274，M1-K273，M1-C272，M1-Q271，M1-Q270，M1-I269，M1-
L268，M1-T267，M1-D266，M1-Y265，M1-L264，M1-V263，M1-I262，M1-R261，
M1-K260，M1-N259，M1-K258，M1-F257，M1-F256，M1-G255，M1-Y254，M1-
M253，M1-Y252，M1-A251，M1-N250，M1-S249，M1-H248，M1-S247，M1-S246，
M1-R245，M1-T244，M1-S243，M1-G242，M1-D241，M1-V240，M1-V239，M1-
F238，M1-L237，M1-K236，M1-K235，M1-L234，M1-P233，M1-F232，M1-K231，
M1-L230，M1-S229，M1-S228，M1-A227，M1-L226，M1-K225，M1-E224，M1-I223，
M1-K222，M1-E221，M1-R220，M1-L219，M1-D218，M1-G217，M1-D216，M1-
P215，M1-L214，M1-P213，M1-T212，M1-F211，M1-K210，M1-N209，M1-F208，
M1-L207，M1-P206，M1-A205，M1-I204，M1-L203，M1-V202，M1-P201，M1-Y200，
M1-I199，M1-T198，M1-M197，M1-M196，M1-V195，M1-L194，M1-S193，M1-
L192，M1-I191，M1-F190，M1-M189，M1-F188，M1-A187，M1-W186，M1-L185，
M1-Y184，M1-I183，M1-A182，M1-L181，M1-Y180，M1-P179，M1-G178，M1-
G177，M1-K176，M1-Q175，M1-V174，M1-I173，M1-F172，M1-I171，M1-I170，M1-
A169，M1-A168，M1-V167，M1-I166，M1-P165，M1-P164，M1-G163，M1-L162，
M1-I161，M1-V160，M1-S159，M1-L158，M1-F157，M1-T156，M1-G155，M1-K154，
M1-I153，M1-M152，M1-D151，M1-R150，M1-I149，M1-F148，M1-M147，M1-
W146，M1-I145，M1-T144，M1-Q143，M1-K142，M1-N141，M1-F140，M1-G139，
M1-H138，M1-R137，M1-S136，M1-E135，M1-I134，M1-V133，M1-F132，M1-T131，
M1-S130，M1-Y129，M1-L128，M1-S127，M1-F126，M1-P125，M1-L124，M1-D123，
M1-T122，M1-I121，M1-Q120，M1-S119，M1-W118，M1-T117，M1-M116，M1-
V115，M1-G114，M1-A113，M1-L112，M1-F111，M1-S110，M1-L109，M1-T108，
M1-H107，M1-L106，M1-I105，M1-E104，M1-N103，M1-E102，M1-P101，M1-D100，
M1-L99，M1-G98，M1-L97，M1-R96，M1-P95，M1-L94，M1-V93，M1-A92，M1-
G91，M1-S90，M1-M89，M1-K88，M1-W87，M1-F86，M1-W85，M1-P84，M1-L83，
M1-I82，M1-G81，M1-F80，M1-F79，M1-L78，M1-I77，M1-A76，M1-S75，M1-D74，
M1-M73，M1-L72，M1-I71，M1-T70，M1-V69，M1-F68，M1-E67，M1-H66，M1-V65，
M1-F64，M1-H63，M1-F62，M1-Y61，M1-S60，M1-K59，M1-D58，M1-L57，M1-S56，
M1-Y55，M1-A54，M1-R53，M1-S52，M1-K51，M1-E50，M1-F49，M1-K48，M1-
E47，M1-Q46，M1-S45，M1-I44，M1-V43，M1-G42，M1-V41，M1-L40，M1-T39，M1-
K38，M1-P37，M1-L36，M1-T35，M1-P34，M1-L33，M1-K32，M1-L31，M1-A30，
M1-T29，M1-L28，M1-Q27，M1-R26，M1-L25，M1-D24，M1-L23，M1-Y22，M1-
T21，M1-E20，M1-F19，M1-I18，M1-Y17，M1-M16，M1-V15，M1-I14，M1-M13，
M1-F12，M1-G11，M1-V10，M1-V9，M1-T8，M1-E7，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
许多多核苷酸序列，如EST序列，是公众可获得的并可通过序列数据库得到。其中一些序列与SEQ ID NO：5相关，并且在本发明概念形成之前就可以公开获得。优选将这些相关多核苷酸具体地排除在本发明的范围之外。列出所有的相关序列将是繁琐的。因此，优选将包含通式a-b描述的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸排除在本发明之外，其中a是SEQ ID NO：5的1至1275之间的整数，b是第15至1275间的整数，在此，a和b相应于SEQ ID NO：5中所示核苷酸残基的位置，而且b大于或等于a+14。
4号基因编码的多肽的性质
SEQ ID NO：8(图9)提供的该基因的多肽是由SEQ ID NO：7(图8)的多核苷酸序列编码的，和/或是由保藏克隆GmPrPase1所含多核苷酸编码的，其与人和酵母异戊二烯基肽酶(见图12A-D)在核苷酸和氨基酸水平上显著同源。基于此同源性，此本发明多肽可能与异戊二烯基肽酶具有至少一些共同的生物学活性。此本发明多核苷酸和多肽(包括激动剂)有多种用途，包括但不限于赋予植物尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。或者，也可以使用针对此本发明多肽的拮抗剂赋予植物，尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。
细菌分子伴侣DnaJ的法呢基化是细菌在高温下生长所必需的(Wickner，S.等，1991 Nature 350：165-7)。此分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明此多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性，优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。在一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
在另一实施方案中，可以通过使用种子特异性启动子(例如未知种子蛋白质USP的启动子)使本发明PrPase多肽在植物中过表达，增加种子贮存化合物的量。而且，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物种子贮存化合物的量。
蛋白质的法呢基化正向地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因，即法呢基转移酶的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211；182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增殖增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有多种用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明GmPrPase1多肽过表达，通过加速细胞分裂而促进植物的生长。
尽管该编码多肽被认为可能与异戊二烯基蛋白酶具有至少一些相同的生物学活性，但确定该克隆的确切生物学功能的许多方法是本领域已知的或描述在本文其它地方。简而言之，该克隆的功能可以通过应用微阵列方法学确定。可以将GmPrPase1克隆以及本发明的其它克隆排列在微阵列上以获得表达谱。随用于和载片杂交的多核苷酸探针的不同，特定基因的表达改变可以提供有关该基因在研究条件下的功能的其它信息。例如，当使用的多核苷酸探针来自经冷处理的组织时，所观察到的表达水平的增加或降低可能指示例如在调节耐寒性方面的功能。对于GmPrPase1，应使用脱水组织或遭受到其它生物或非生物胁迫(热、干旱、高光照、高盐等)的组织提取RNA制备探针。而且，应使用种子发育不同阶段(早、中、晚)提取RNA制备探针。
此外，此蛋白质的功能可以通过例如应用定量PCR方法学进行评价。例如，实时定量PCR将能够跟踪特定基因在整个植物发育周期中的表达。定量PCR方法学仅仅需要从每个重要发育阶段(萌发3天的幼苗、1周龄幼苗[根、芽和茎]；开花前的根、叶和茎，花[不同部分]；和/或发育的胚)得到极少量的组织来进行这些实验。因此，本发明包括应用定量PCR方法学对该多肽的生物学功能作精细化分析。本发明还包括相应于SEQ ID NO：7(图8)提供的多核苷酸序列的定量PCR探针。
该蛋白质的功能还可以通过酵母中的互补实验进行评价。例如，对于GmPrPase1克隆，转化异戊二烯基蛋白酶活性缺陷酵母并评价其生长能力可以为GmPrPase1克隆具有异戊二烯基蛋白酶活性提供有力的证据。可以用于评价本发明多核苷酸和多肽的功能的其它试验条件和方法是本领域已知的，其中一些在本文的其它地方进行了公开。
或者，可以通过破坏Synecosystis中该多肽的同系物，测定该编码多肽的生物学功能。蓝细菌(蓝绿藻)被认为是植物叶绿体的前身。它具有光合系统和许多使人会联想到植物代谢过程的其它代谢过程。这些过程常常是许多商业除草剂的靶标，而且该生物已经被广泛用于研究多类除草剂的作用模式。Synechocystis是研究得最好的一种蓝细菌。除了大多数对于蓝细菌而言的共性外，它还提供了许多其它优点。Synechocystis具有天然的遗传转化系统，由此适用于一些已充分表征的系统(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)的有力而成熟的遗传和分子操作(例如定向基因破坏，基因置换等)也可以应用于其上。最重要的是，Synechocystis的完全基因组序列信息是现成的，这就为快速鉴定和克隆目的基因，以及通过遗传和分子手段阐明基因功能提供了途径。
而且，本发明多肽的生物学功能还可以通过应用反义和/或有义方法学和由此产生的转基因植物进行确定。转基因植物中特定基因的有义向或反义向表达可以分别导致该特定基因具有较高或较低的表达水平。改变基因的内源性表达水平可以导致观察到特定表型，然后可以使用此表型得到有关该基因功能的提示。可以使用强的遍在启动子在植物的所有细胞中在所有的时间使该基因过表达或表达不足，或可以使用已充分表征的组织特异性启动子(即，根启动子或花特异性启动子)使该基因在植物的一个或多个不连续部分表达，或可以使用诱导型和/或发育调节的启动子使该基因在发育的特殊时间表达。
对于GmPrPase1转基因植物，如果正常生长条件下没有明显表型，则可以通过在胁迫条件(脱水、存在高盐、或其它生物或非生物胁迫，如冷、热、干旱、高光照等)下观察植物或种子贮存化合物(油、糖、蛋白质等)的量的生化分析了解该基因的功能。因此，本发明包括应用反义和/或有义方法学构建转基因植物以精细化本发明多肽的生物学功能。
在优选实施方案中，本发明包括如下N端缺失突变体：
SEQ ID NO：8的 M1-C400，A2-C400，F3-C400，P4-C400，Y5-
C400，M6-C400，E7-C400，A8-C400，V9-C400，V10-C400，G11-C400，F12-C400，
M13-C400，I14-C400，L15-C400，M16-C400，Y17-C400，I18-C400，F19-C400，E20-
C400，T21-C400，Y22-C400，L23-C400，D24-C400，V25-C400，R26-C400，Q27-
C400，H28-C400，R29-C400，A30-C400，L31-C400，K32-C400，l33-C400，P34-
C400，T35-C400，L36-C400，P37-C400，K38-C400，T39-C400，L40-C400，E41-
C400，G42-C400，V43-C400，I44-C400，S45-C400，Q46-C400，E47-C400，K48-
C400，F49-C400，E50-C400，K51-C400，S52-C400，R53-C400，A54-C400，Y55-
C400，S56-C400，L57-C400，D58-C400，K59-C400，S60-C400，H61-C400，F62-
C400，H63-C400，F64-C400，V65-C400，H66-C400，E67-C400，F68-C400，V69-
C400，T70-C400，I71-C400，V72-C400，T73-C400，D74-C400，S75-C400，T76-C400，
I77-C400，L78-C400，Y79-C400，F80-C400，G81-C400，V82-C400，L83-C400，P84-
C400，W85-C400，F86-C400，W87-C400，K88-C400，K89-C400，S90-C400，G91-
C400，D92-C400，F93-C400，M94-C400，T95-C400，I96-C400，A97-C400，G98-
C400，F99-C400，N100-C400，A101-C400，E102-C400，N103-C400，E104-C400，
I105-C400，L106-C400，H107-C400，T108-C400，L109-C400，A110-C400，F111-
C400，L112-C400，A113-C400，G114-C400，L115-C400，M116-C400，I117-C400，
W118-C400，S119-C400，Q120-C400，I121-C400，T122-C400，D123-C400，L124-
C400，P125-C400，F126-C400，S127-C400，L128-C400，Y129-C400，S130-C400，
T131-C400，F132-C400，V133-C400，I134-C400，E135-C400，A136-C400，R137-
C400，H138-C400，G139-C400，F140-C400，N141-C400，K142-C400，Q143-C400，
T144-C400，P145-C400，W146-C400，L147-C400，F148-C400，F149-C400，R150-
C400，D151-C400，M152-C400，L153-C400，K154-C400，G155-C400，I156-C400，
F157-C400，L158-C400，S159-C400，V160-C400，I161-C400，I162-C400，G163-
C400，P164-C400，P165-C400，I166-C400，V167-C400，A168-C400，A169-C400，
I170-C400，I171-C400，V172-C400，I173-C400，V174-C400，Q175-C400，K176-
C400，G177-C400，G178-C400，P179-C400，Y180-C400，L181-C400，A182-C400，
I183-C400，Y184-C400，L185-C400，W186-C400，V187-C400，F188-C400，T189-
C400，F190-C400，G191-C400，L192-C400，S193-C400，I194-C400，V195-C400，
M196-C400，M197-C400，T198-C400，L199-C400，Y200-C400，P201-C400，V202-
C400，L203-C400，I204-C400，A205-C400，P206-C400，L207-C400，F208-C400，
N209-C400，K210-C400，F211-C400，T212-C400，P213-C400，L214-C400，P215-
C400，D216-C400，G217-C400，Q218-C400，L219-C400，R220-C400，E221-C400，
K222-C400，I223-C400，E224-C400，K225-C400，L226-C400，A227-C400，S228-
C400，S229-C400，L230-C400，N231-C400，Y232-C400，P233-C400，L234-C400，
K235-C400，K236-C400，L237-C400，F238-C400，V239-C400，V240-C400，D241-
C400，G242-C400，S243-C400，T244-C400，R245-C400，S246-C400，S247-C400，
H248-C400，S249-C400，N250-C400，A251-C400，Y252-C400，M253-C400，Y254-
C400，G255-C400，F256-C400，F257-C400，K258-C400，N259-C400，K260-C400，
R261-C400，I262-C400，V263-C400，L264-C400，Y265-C400，D266-C400，T267-
C400，L268-C400，I269-C400，Q270-C400，Q271-C400，C272-C400，K273-C400，
D274-C400，D275-C400，E276-C400，E277-C400，I278-C400，V279-C400，A280-
C400，V281-C400，I282-C400，A283-C400，H284-C400，E285-C400，L286-C400，
G287-C400，H288-C400，W289-C400，K290-C400，L291-C400，N292-C400，H293-
C400，T294-C400，V295-C400，Y296-C400，T297-C400，F298-C400，V299-C400，
A300-C400，M301-C400，Q302-C400，I303-C400，L304-C400，T305-C400，L306-
C400，L307-C400，Q308-C400，F309-C400，G310-C400，G311-C400，Y312-C400，
T313-C400，L314-C400，V315-C400，R316-C400，N317-C400，S318-C400，A319-
C400，D320-C400，L321-C400，Y322-C400，R323-C400，S324-C400，F325-C400，
G326-C400，F327-C400，D328-C400，T329-C400，Q330-C400，P331-C400，V332-
C400，L333-C400，I334-C400，G335-C400，L336-C400，I337-C400，I338-C400，
F339-C400，Q340-C400，H341-C400，T342-C400，V343-C400，I344-C400，P345-
C400，L346-C400，Q347-C400，Q348-C400，L349-C400，V350-C400，S351-C400，
F352-C400，G353-C400，L354-C400，N355-C400，L356-C400，V357-C400，S358-
C400，R359-C400，S360-C400，F361-C400，E362-C400，F363-C400，Q364-C400，
A365-C400，D366-C400，G367-C400，F368-C400，A369-C400，K370-C400，K371-
C400，L372-C400，G373-C400，Y374-C400，A375-C400，S376-C400，G377-C400，
L378-C400，R379-C400，G380-C400，G381-C400，L382-C400，V383-C400，K384-
C400，L385-C400，Q386-C400，E387-C400，E388-C400，N389-C400，L390-C400，
S391-C400，A392-C400，M393-C400，N394-C400，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
在优选实施方案中，本发明包括如下C端缺失突变体：
SEQ ID NO：8的 M1-C400，M1-S399，M1-C398，M1-P397，
M1-D396，M1-T395，M1-N394，M1-M393，M1-A392，M1-S391，M1-L390，M1-
N389，M1-E388，M1-E387，M1-Q386，M1-L385，M1-K384，M1-V383，M1-L382，
M1-G381，M1-G380，M1-R379，M1-L378，M1-G377，M1-S376，M1-A375，M1-
Y374，M1-G373，M1-L372，M1-K371，M1-K370，M1-A369，M1-F368，M1-G367，
M1-D366，M1-A365，M1-Q364，M1-F363，M1-E362，M1-F361，M1-S360，M1-
R359，M1-S358，M1-V357，M1-L356，M1-N355，M1-L354，M1-G353，M1-F352，
M1-S351，M1-V350，M1-L349，M1-Q348，M1-Q347，M1-L346，M1-P345，M1-I344，
M1-V343，M1-T342，M1-H341，M1-Q340，M1-F339，M1-I338，M1-I337，M1-L336，
M1-G335，M1-I334，M1-L333，M1-V332，M1-P331，M1-Q330，M1-T329，M1-D328，
M1-F327，M1-G326，M1-F325，M1-S324，M1-R323，M1-Y322，M1-L321，M1-
D320，M1-A319，M1-S318，M1-N317，M1-R316，M1-V315，M1-L314，M1-T313，
M1-Y312，M1-G311，M1-G310，M1-F309，M1-Q308，M1-L307，M1-L306，M1-
T305，M1-L304，M1-I303，M1-Q302，M1-M301，M1-A300，M1-V299，M1-F298，
M1-T297，M1-Y296，M1-V295，M1-T294，M1-H293，M1-N292，M1-L291，M1-
K290，M1-W289，M1-H288，M1-G287，M1-L286，M1-E285，M1-H284，M1-A283，
M1-I282，M1-V281，M1-A280，M1-V279，M1-I278，M1-E277，M1-E276，M1-D275，
M1-D274，M1-K273，M1-C272，M1-Q271，M1-Q270，M1-I269，M1-L268，M1-
T267，M1-D266，M1-Y265，M1-L264，M1-V263，M1-I262，M1-R261，M1-K260，
M1-N259，M1-K258，M1-F257，M1-F256，M1-G255，M1-Y254，M1-M253，M1-
Y252，M1-A251，M1-N250，M1-S249，M1-H248，M1-S247，M1-S246，M1-R245，
M1-T244，M1-S243，M1-G242，M1-D241，M1-V240，M1-V239，M1-F238，M1-
L237，M1-K236，M1-K235，M1-L234，M1-P233，M1-Y232，M1-N231，M1-L230，
M1-S229，M1-S228，M1-A227，M1-L226，M1-K225，M1-E224，M1-I223，M1-K222，
M1-E221，M1-R220，M1-L219，M1-Q218，M1-G217，M1-D216，M1-P215，M1-
L214，M1-P213，M1-T212，M1-F211，M1-K210，M1-N209，M1-F208，M1-L207，
M1-P206，M1-A205，M1-I204，M1-L203，M1-V202，M1-P201，M1-Y200，M1-L199，
M1-T198，M1-M197，M1-M196，M1-V195，M1-I194，M1-S193，M1-L192，M1-
G191，M1-F190，M1-T189，M1-F188，M1-V187，M1-W186，M1-L185，M1-Y184，
M1-I183，M1-A182，M1-L181，M1-Y180，M1-P179，M1-G178，M1-G177，M1-
K176，M1-Q175，M1-V174，M1-I173，M1-V172，M1-I171，M1-I170，M1-A169，M1-
A168，M1-V167，M1-I166，M1-P165，M1-P164，M1-G163，M1-I162，M1-I161，M1-
V160，M1-S159，M1-L158，M1-F157，M1-I156，M1-G155，M1-K154，M1-L153，M1-
M152，M1-D151，M1-R150，M1-F149，M1-F148，M1-L147，M1-W146，M1-P145，
M1-T144，M1-Q143，M1-K142，M1-N141，M1-F140，M1-G139，M1-H138，M1-
R137，M1-A136，M1-E135，M1-I134，M1-V133，M1-F132，M1-T131，M1-S130，M1-
Y129，M1-L128，M1-S127，M1-F126，M1-P125，M1-L124，M1-D123，M1-T122，
M1-I121，M1-Q120，M1-S119，M1-W118，M1-I117，M1-M116，M1-L115，M1-
G114，M1-A113，M1-L112，M1-F111，M1-A110，M1-L109，M1-T108，M1-H107，
M1-L106，M1-I105，M1-E104，M1-N103，M1-E102，M1-A101，M1-N100，M1-F99，
M1-G98，M1-A97，M1-I96，M1-T95，M1-M94，M1-F93，M1-D92，M1-G91，M1-S90，
M1-K89，M1-K88，M1-W87，M1-F86，M1-W85，M1-P84，M1-L83，M1-V82，M1-
G81，M1-F80，M1-Y79，M1-L78，M1-I77，M1-T76，M1-S75，M1-D74，M1-T73，M1-
V72，M1-I71，M1-T70，M1-V69，M1-F68，M1-E67，M1-H66，M1-V65，M1-F64，M1-
H63，M1-F62，M1-H61，M1-S60，M1-K59，M1-D58，M1-L57，M1-S56，M1-Y55，
M1-A54，M1-R53，M1-S52，M1-K51，M1-E50，M1-F49，M1-K48，M1-E47，M1-
Q46，M1-S45，M1-I44，M1-V43，M1-G42，M1-E41，M1-L40，M1-T39，M1-K38，M1-
P37，M1-L36，M1-T35，M1-P34，M1-L33，M1-K32，M1-L31，M1-A30，M1-R29，
M1-H28，M1-Q27，M1-R26，M1-V25，M1-D24，M1-L23，M1-Y22，M1-T21，M1-
E20，M1-F19，M1-I18，M1-Y17，M1-M16，M1-L15，M1-I14，M1-M13，M1-F12，M1-
G11，M1-V10，M1-V9，M1-A8，M1-E7，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
许多多核苷酸序列，如EST序列，是公众可获得的并可通过序列数据库得到。其中一些序列与SEQ ID NO：7相关，并且在本发明概念形成之前就可以公开获得。优选将这些相关多核苷酸具体地排除在本发明的范围之外。列出所有的相关序列将是繁琐的。因此，优选将包含通式a-b描述的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸排除在本发明之外，其中a是SEQ ID NO：7的1至1434之间的任何整数，b是第15至1434间的整数，在此，a和b相应于SEQ ID NO：7中所示核苷酸残基的位置，而且b大于或等于a+14。
5号基因编码的多肽的性质
SEQ ID NO：10(图11)提供的该基因的多肽是由SEQ ID NO：9(图10)的多核苷酸序列编码的，和/或是由保藏克隆ZmPrPase1所含多核苷酸编码的，其与人和酵母异戊二烯基肽酶(见图12A-D)在核苷酸和氨基酸水平上显著同源。基于此同源性，此本发明多肽可能与异戊二烯基肽酶具有至少一些共同的生物学活性。此本发明多核苷酸和多肽及其激动剂和/或片段有多种用途，包括但不限于赋予植物尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。该多核苷酸还具有多种用途，包括鉴定全长ZmPrPase1。或者，也可以使用针对此本发明多肽的拮抗剂赋予植物，尤其是鼠耳芥属植物耐旱性和/或耐盐性。
细菌分子伴侣DnaJ的法呢基化是细菌在高温下生长所必需的(Wickner，S.等，1991 Nature 350：165-7)。此分子伴侣的法呢基化是其完全活性所必需的。在植物大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)中，ANJ1是DnaJ的同系物，可以被热和盐处理诱导(Zhu，J.-K.等，1993，The Plant Cell 5：341-9)。该酶是法呢基化的靶标。已证实，植物分子伴侣的法呢基化增加可以导致这些酶具有更高的生物学活性，由此导致植物对胁迫的耐受性增加。因此，本发明此多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括赋予植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。或者，本发明的拮抗剂可以具有多种用途，包括调节植物对生物和/或非生物胁迫(包括，但不限于热、干旱和盐胁迫)的易感性，优选本发明拮抗剂增加植物对热、干旱和盐胁迫的抗性。在一个实施方案中，可以使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明PrPase多肽在植物中但非保卫细胞中过量表达，以提高植物的干旱和盐耐受性。
蛋白质的法呢基化正向地参与细胞周期的控制(Ziegelhoffer等，2000，PNAS 97：7633-8)。参与蛋白质法呢基化的基因(即法呢基转移酶)的突变可导致鼠耳芥属植物中细胞增殖受到抑制(Bonetta等，2000，Planta 211；182-90)。植物中法呢基化途径(即，异戊二烯基肽酶)的组成型过表达可导致细胞增殖增加及植物生长增加。本发明多核苷酸和多肽，包括其激动剂和/或片断，具有多种用途，包括调节植物生长及潜在地调节植物的产量，优选增加植物生长。此外，本发明拮抗剂可以具有多种用途，这些用途包括调节植物生长和/或产量，优选增加植物的生长和产量。再一实施方案中，可以通过使用组成型启动子(例如35S，或本文公开的其它启动子)使本发明ZmPrPase1多肽过表达，通过加速细胞分裂而促进植物的生长。
尽管相信该编码多肽可能与异戊二烯基蛋白酶具有至少一些相同的生物学活性，但确定该克隆的确切生物学功能的许多方法是本领域已知的或描述在本文其它地方。简而言之，该克隆的功能可以通过应用微阵列方法学确定。可以将ZmPrPase1克隆以及本发明的其它克隆排列在微阵列上以获得表达谱。随用于和载片杂交的多核苷酸探针的不同，特定基因的表达改变可以提供有关该基因在研究条件下的功能的其它信息。例如，当使用的多核苷酸探针来自经冷处理的组织时，所观察到的表达水平的增加或降低可能指示例如在调节耐寒性方面的功能。对于ZmPrPase1，应使用脱水组织或遭受到其它生物或非生物胁迫(热、干旱、高光照、高盐等)的组织提取RNA制备探针。
此外，此蛋白质的功能可以通过例如应用定量PCR方法学进行评价。例如，实时定量PCR将能够跟踪特定基因在整个植物发育周期中的表达。定量PCR方法学仅仅需要从每个重要发育阶段(萌发3天的幼苗、1周龄幼苗[根、芽和茎]；开花前的根、叶和茎，花[不同部分]；和/或发育的胚)得到极少量的组织来进行这些实验。因此，本发明包括应用定量PCR方法学对该多肽的生物学功能作精细化分析。本发明还包括相应于SEQ ID NO：9(图10)提供的多核苷酸序列的定量PCR探针。
该蛋白质的功能还可以通过酵母中的互补实验进行评价。例如，对于ZmPrPase1克隆，转化异戊二烯基蛋白酶活性缺陷酵母并评价其生长能力可以为ZmPrPase1克隆具有异戊二烯基蛋白酶活性提供有力的证据。可以用于评价本发明多核苷酸和多肽的功能的其它试验条件和方法是本领域已知的，其中一些在本文的其它地方进行了公开。
或者，可以通过破坏Synecosystis中该多肽的同系物，测定该编码多肽的生物学功能。蓝细菌(蓝绿藻)被认为是植物叶绿体的前身。它具有光合系统和许多使人会联想到植物代谢过程的其它代谢过程。这些过程常常是许多商业除草剂的靶标，而且该生物已经被广泛用于研究多类除草剂的作用模式。Synechocystis是研究得最好的一种蓝细菌。除了大多数对于蓝细菌而言的共性外，它还提供了许多其它优点。Synechocystis具有天然的遗传转化系统，由此适用于一些已充分表征的系统(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)的有力而成熟的遗传和分子操作(例如定向基因破坏，基因置换等)也可以应用于其上。最重要的是，Synechocystis的完全基因组序列信息是现成的，这就为快速鉴定和克隆目的基因，以及通过遗传和分子手段阐明基因功能提供了途径。
而且，本发明多肽的生物学功能还可以通过应用反义和/或有义方法学和由此产生的转基因植物进行确定。转基因植物中特定基因的有义向或反义向表达可以分别导致该特定基因具有较高或较低的表达水平。改变基因的内源性表达水平可以导致观察到特定表型，然后可以使用此表型得到有关该基因功能的提示。可以使用强的遍在启动子在植物的所有细胞中在所有的时间使该基因过表达或表达不足，或可以使用已充分表征的组织特异性启动子(即，根启动子或花特异性启动子)使该基因在植物的一个或多个不连续部分表达，或可以使用诱导型和/或发育调节的启动子使该基因在发育的特殊时间表达。
对于ZmPrPase1转基因植物，如果正常生长条件下没有显示出表型，则可以通过在胁迫条件(脱水、存在高盐、或其它生物或非生物胁迫，如冷、热、干旱、高光照等)下观察植物了解该基因的功能。因此，本发明包括应用反义和/或有义方法学构建转基因植物以精细化本发明多肽的生物学功能。
在优选实施方案中，本发明包括如下N端缺失突变体：
SEQ ID NO：10的 T1-D329，R2-D329，L3-D329，S4-D329，A5-
D329，E6-D329，N7-D329，E8-D329，I9-D329，I10-D329，H11-D329，T12-D329，
L13-D329，A14-D329，F15-D329，L16-D329，A17-D329，G18-D329，S19-D329，
M20-D329，V21-D329，W22-D329，S23-D329，Q24-D329，I25-D329，T26-D329，
D27-D329，L28-D329，P29-D329，F30-D329，S31-D329，L32-D329，Y33-D329，S34-
D329，T35-D329，F36-D329，V37-D329，I38-D329，E39-D329，A40-D329，R41-
D329，H42-D329，G43-D329，F44-D329，N45-D329，K46-D329，Q47-D329，T48-
D329，I49-D329，W50-D329，L51-D329，F52-D329，I53-D329，R54-D329，D55-
D329，M56-D329，I57-D329，K58-D329，G59-D329，I60-D329，L61-D329，L62-
D329，S63-D329，M64-D329，I65-D329，L66-D329，G67-D329，P68-D329，P69-
D329，I70-D329，V71-D329，A72-D329，A73-D329，I74-D329，I75-D329，Y76-
D329，I77-D329，V78-D329，Q79-D329，I80-D329，G81-D329，G82-D329，P83-
D329，Y84-D329，L85-D329，A86-D329，I87-D329，Y88-D329，L89-D329，W90-
D329，G91-D329，F92-D329，M93-D329，F94-D329，V95-D329，L96-D329，A97-
D329，L98-D329，L99-D329，M100-D329，M101-D329，T102-D329，I103-D329，
Y104-D329，P105-D329，I106-D329，V107-D329，I108-D329，A109-D329，P110-
D329，L111-D329，F112-D329，N113-D329，K114-D329，F115-D329，T116-D329，
P117-D329，L118-D329，P119-D329，E120-D329，G121-D329，V122-D329，L123-
D329，R124-D329，E125-D329，K126-D329，I127-D329，E128-D329，K129-D329，
L130-D329，A131-D329，A132-D329，S133-D329，L134-D329，K135-D329，F136-
D329，P137-D329，L138-D329，K139-D329，K140-D329，L141-D329，F142-D329，
V143-D329，V144-D329，D145-D329，G146-D329，S147-D329，T148-D329，R149-
D329，S150-D329，S151-D329，H152-D329，S153-D329，N154-D329，A155-D329，
Y156-D329，M157-D329，Y158-D329，G159-D329，F160-D329，F161-D329，K162-
D329，N163-D329，K164-D329，R165-D329，I166-D329，V167-D329，L168-D329，
Y169-D329，D170-D329，T171-D329，L172-D329，I173-D329，Q174-D329，Q175-
D329，C176-D329，S177-D329，N178-D329，E179-D329，D180-D329，E181-D329，
I182-D329，V183-D329，S184-D329，V185-D329，I186-D329，A187-D329，H188-
D329，E189-D329，L190-D329，G191-D329，H192-D329，W193-D329，K194-D329，
L195-D329，N196-D329，H197-D329，T198-D329，V199-D329，Y200-D329，S201-
D329，F202-D329，V203-D329，A204-D329，V205-D329，Q206-D329，L207-D329，
L208-D329，M209-D329，F210-D329，L211-D329，Q212-D329，F213-D329，G214-
D329，G215-D329，Y216-D329，T217-D329，L218-D329，V219-D329，R220-D329，
S221-D329，S222-D329，K223-D329，D224-D329，L225-D329，F226-D329，G227-
D329，S228-D329，F229-D329，G230-D329，F231-D329，K232-D329，D233-D329，
Q234-D329，P235-D329，V236-D329，I237-D329，I238-D329，G239-D329，L240-
D329，I241-D329，I242-D329，F243-D329，P244-D329，H245-D329，T246-D329，
I247-D329，I248-D329，P249-D329，I250-D329，Q251-D329，H252-D329，L253-
D329，L254-D329，S255-D329，F256-D329，R257-D329，L258-D329，N259-D329，
L260-D329，V261-D329，S262-D329，R263-D329，A264-D329，F265-D329，E266-
D329，F267-D329，Q268-D329，A269-D329，D270-D329，A271-D329，F272-D329，
A273-D329，K274-D329，N275-D329，L276-D329，G277-D329，Y278-D329，A279-
D329，P280-D329，Q281-D329，L282-D329，R283-D329，A284-D329，A285-D329，
L286-D329，V287-D329，K288-D329，L289-D329，Q290-D329，E291-D329，E292-
D329，N293-D329，L294-D329，S295-D329，A296-D329，M297-D329，N298-D329，
T299-D329，D300-D329，P301-D329，W302-D329，Y303-D329，S304-D329，A305-
D329，Y306-D329，H307-D329，Y308-D329，S309-D329，H310-D329，P311-D329，
P312-D329，L313-D329，V314-D329，E315-D329，R316-D329，L317-D329，Q318-
D329，A319-D329，L320-D329，E321-D329，D322-D329，S323-D329，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
在优选实施方案中，本发明包括如下C端缺失突变体：
SEQ ID NO：10的 T1-D329，T1-E328，T1-K327，T1-K326，T1-
D325，T1-D324，T1-S323，T1-D322，T1-E321，T1-L320，T1-A319，T1-Q318，T1-
L317，T1-R316，T1-E315，T1-V314，T1-L313，T1-P312，T1-P311，T1-H310，T1-
S309，T1-Y308，T1-H307，T1-Y306，T1-A305，T1-S304，T1-Y303，T1-W302，T1-
P301，T1-D300，T1-T299，T1-N298，T1-M297，T1-A296，T1-S295，T1-L294，T1-
N293，T1-E292，T1-E291，T1-Q290，T1-L289，T1-K288，T1-V287，T1-L286，T1-
A285，T1-A284，T1-R283，T1-L282，T1-Q281，T1-P280，T1-A279，T1-Y278，T1-
G277，T1-L276，T1-N275，T1-K274，T1-A273，T1-F272，T1-A271，T1-D270，T1-
A269，T1-Q268，T1-F267，T1-E266，T1-F265，T1-A264，T1-R263，T1-S262，T1-
V261，T1-L260，T1-N259，T1-L258，T1-R257，T1-F256，T1-S255，T1-L254，T1-
L253，T1-H252，T1-Q251，T1-I250，T1-P249，T1-I248，T1-I247，T1-T246，T1-H245，
T1-P244，T1-F243，T1-I242，T1-I241，T1-L240，T1-G239，T1-I238，T1-I237，T1-
V236，T1-P235，T1-Q234，T1-D233，T1-K232，T1-F231，T1-G230，T1-F229，T1-
S228，T1-G227，T1-F226，T1-L225，T1-D224，T1-K223，T1-S222，T1-S221，T1-
R220，T1-V219，T1-L218，T1-T217，T1-Y216，T1-G215，T1-G214，T1-F213，T1-
Q212，T1-L211，T1-F210，T1-M209，T1-L208，T1-L207，T1-Q206，T1-V205，T1-
A204，T1-V203，T1-F202，T1-S201，T1-Y200，T1-V199，T1-T198，T1-H197，T1-
N196，T1-L195，T1-K194，T1-W193，T1-H192，T1-G191，T1-L190，T1-E189，T1-
H188，T1-A187，T1-I186，T1-V185，T1-S184，T1-V183，T1-I182，T1-E181，T1-
D180，T1-E179，T1-N178，T1-S177，T1-C176，T1-Q175，T1-Q174，T1-I173，T1-
L172，T1-T171，T1-D170，T1-Y169，T1-L168，T1-V167，T1-I166，T1-R165，T1-
K164，T1-N163，T1-K162，T1-F161，T1-F160，T1-G159，T1-Y158，T1-M157，T1-
Y156，T1-A155，T1-N154，T1-S153，T1-H152，T1-S151，T1-S150，T1-R149，T1-
T148，T1-S147，T1-G146，T1-D145，T1-V144，T1-V143，T1-F142，T1-L141，T1-
K140，T1-K139，T1-L138，T1-P137，T1-F136，T1-K135，T1-L134，T1-S133，T1-
A132，T1-A131，T1-L130，T1-K129，T1-E128，T1-I127，T1-K126，T1-E125，T1-
R124，T1-L123，T1-V122，T1-G121，T1-E120，T1-P119，T1-L118，T1-P117，T1-
T116，T1-F115，T1-K114，T1-N113，T1-F112，T1-L111，T1-P110，T1-A109，T1-
I108，T1-V107，T1-I106，T1-P105，T1-Y104，T1-I103，T1-T102，T1-M101，T1-
M100，T1-L99，T1-L98，T1-A97，T1-L96，T1-V95，T1-F94，T1-M93，T1-F92，T1-
G91，T1-W90，T1-L89，T1-Y88，T1-I87，T1-A86，T1-L85，T1-Y84，T1-P83，T1-G82，
T1-G81，T1-I80，T1-Q79，T1-V78，T1-I77，T1-Y76，T1-I75，T1-I74，T1-A73，T1-
A72，T1-V71，T1-I70，T1-P69，T1-P68，T1-G67，T1-L66，T1-I65，T1-M64，T1-S63，
T1-L62，T1-L61，T1-I60，T1-G59，T1-K58，T1-I57，T1-M56，T1-D55，T1-R54，T1-
I53，T1-F52，T1-L51，T1-W50，T1-I49，T1-T48，T1-Q47，T1-K46，T1-N45，T1-F44，
T1-G43，T1-H42，T1-R41，T1-A40，T1-E39，T1-I38，T1-V37，T1-F36，T1-T35，T1-
S34，T1-Y33，T1-L32，T1-S31，T1-F30，T1-P29，T1-L28，T1-D27，T1-T26，T1-I25，
T1-Q24，T1-S23，T1-W22，T1-V21，T1-M20，T1-S19，T1-G18，T1-A17，T1-L16，T1-
F15，T1-A14，T1-L13，T1-T12，T1-H11，T1-I10，T1-I9，T1-E8，T1-N7，
还提供编码这些多肽的多核苷酸序列。
许多多核苷酸序列，如EST序列，是公众可获得的并可通过序列数据库得到。其中一些序列与SEQ ID NO：9相关，并且在本发明概念形成之前就可以公开获得。优选将这些相关多核苷酸具体地排除在本发明的范围之外。列出所有的相关序列将是繁琐的。因此，优选将包含通式a-b描述的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸排除在本发明之外，其中a是SEQ ID NO：9的1至1301之间的任何整数，b是第15至1301间的整数，在此，a和b相应于SEQ ID NO：9中所示核苷酸残基的位置，而且b大于或等于a+14。
表1
| 基因号 | cDNA克隆ID | ATCC保藏号Z和日期 | 载体 | NT SEQID.No. | 克隆序列的总NT | 起始密码子的5’NT | ORF的3’NT | 氨基酸SEQ IDNO.Y | ORF的总氨基酸数 |
| 1. | PpPrPase1 | XxxxxxXx/xx/xx | pCR2.1 | 1 | 1398 | 33 | 1214 | 2 | 394 |
| 2. | AtPrPase1 | XxxxxxXx/xx/xx | pCR2.1 | 3 | 1275 | 1 | 1272 | 4 | 424 |
| 3. | AtPrPase2 | XxxxxxXx/xx/xx | pCR2.1 | 5 | 1275 | 1 | 1272 | 6 | 424 |
| 4. | GmPrPase1 | XxxxxxXx/xx/xx | pCR2.1 | 7 | 1434 | 233 | 1432 | 8 | 400 |
| 5. | ZmPrPase1 | XxxxxxXx/xx/xx | pCR2.1 | 9 | 1301 | 1 | 987 | 10 | 329 |
表1总结了相应于上述各“基因号”的信息。标识为“NT SEQ IDNO：X”的核苷酸序列是由获自表1中标识为“cDNA克隆ID”的克隆以及，在某些情况下，其它相关DNA克隆的部分同源(“重叠”)序列装配产生的。将这些重叠序列组装成高度冗余的单一连续序列(通常在每个核苷酸位置都具有几个重叠序列)，由此导致标识为SEQ ID NO：X的最终序列。
cDNA克隆ID在所述日期进行了保藏，并被给予相应的保藏号，列在“ATCC保藏号：Z和日期”中。“载体”是指此cDNA克隆ID中所包含的载体类型。pCR2.1获自Invitrogen公司。
“克隆序列的总NT数”是指以“基因号”标识的克隆重叠群中的总核苷酸数目。保藏克隆可以含有SEQ ID NO：X的全部或大部分序列。SEQ ID NO：X的推测起始密码子(甲硫氨酸)的核苷酸位置标识为“ORF的起始密码子的5’NT”。
翻译的氨基酸序列(起始于甲硫氨酸)标识为“氯基酸SEQ IDNO：Y”，但使用已知的分子生物学技术也可以容易地翻译出其它阅读框。这些其它的开放阅读框产生的多肽也是本发明具体考虑的。
SEQ ID NO：Y的开放阅读框中的氨基酸总数标识为“ORF的总氨基酸数”。
SEQ ID NO：X(其中X可以是序列表中公开的任何一个多核苷酸序列)和翻译的SEQ ID NO：Y(其中Y可以是序列表中公开的任何一个多肽序列)对于本领域熟知的和下文描述的多种用途而言是足够精确的，也就是说是适合的。例如，可以使用SEQ ID NO：X设计核苷酸杂交探针检测SEQ ID NO：X中包含的核酸序列或保藏克隆中包含的cDNA。还可以用这些探针和生物样品中的核酸分子杂交，由此使得本发明可以用于多种法医学和诊断方法。类似地，可以使用标识为SEQ IDNO：Y的多肽，例如以制备能特异地和含有该多肽的蛋白质及表1中标识的cDNA克隆所编码的蛋白质结合的抗体。
然而，测序反应产生的DNA序列可能含有测序错误。在产生的DNA序列中这些错误的形式有错误测定的核苷酸、或插入或缺失。这些错误插入或缺失的核苷酸可造成预测的氨基酸序列的阅读框发生读框移位。在这些情况中，即使所产生的DNA序列可能与实际DNA序列有大于99.9％的一致性(例如，超过1000个碱基的开放阅读框中的一个碱基插入或缺失)，预测的氨基酸序列也将与实际氨基酸序列不同。
因此，对于要求核苷酸序列或氨基酸序列精确性的那些申请，本发明不仅提供标识为SEQ ID NO：X的产生的核苷酸序列以及标识为SEQ ID NO：Y的预测的翻译氨基酸序列，还提供保藏在ATCC的含有本发明cDNA的质粒DNA样品，见表1。每个保藏克隆的核苷酸序列都可以容易地通过使用已知方法测序保藏克隆进行确定。然后可以从这些保藏物验证预测的氨基酸序列。而且，特定克隆编码的蛋白质的氨基酸序列也可以通过肽测序或通过在包含保藏cDNA的适宜宿主细胞中表达该蛋白质、收集该蛋白质并测定其序列，直接地予以确定。
本发明还涉及相应于SEQ ID NO：X、SEQ ID NO：Y或保藏克隆的基因。此相应基因可以使用本文公开的序列信息根据已知方法进行分离。这些方法包括从公开的序列制备探针或引物和从适当的基因组物质来源鉴定或扩增此相应基因。
本发明还提供物种同系物(species homologs)、等位变体和/或定向进化同源物。根据本文所公开序列或ATCC保藏克隆的序列信息，本领域技术人员可以使用本领域熟知的方法获得相应于SEQ ID NO：X、SEQ ID NO：Y或保藏克隆的全长基因(包括，但不限于全长编码区)、等位变体、拼接变体、定向进化同源物和/或物种同系物的基因的多核苷酸序列。例如，可以通过制备相应于本文提供的序列的5’、3’或内部区域的探针或引物以及筛选适宜核酸来源寻找等位变体和/或期望同系物，分离出等位变体和/或物种同系物。
本发明的多肽可以以任何适当的方式制备。这些多肽包括分离的天然多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的组合产生的多肽。用于制备这些多肽的方法是本领域熟知的。
多肽可以是蛋白质形式，或可以是更大蛋白，例如融合蛋白的一部分(见下文)。在重组生产中将如下额外氨基酸序列包括在内常常是有利的，这些额外氨基酸序列含有分泌或前导序列、原序列、可辅助纯化的序列(如多个组氨酸残基)或可提高稳定性的额外序列。
本发明多肽优选以分离的形式提供，且优选是基本上纯的形式。使用本文所述技术或本领域已知技术，例如Smith和Johnson，Gene 67：31-40(1998)描述的一步法重组制备的多肽版本可以是基本上纯的。还可以从天然、合成或重组来源使用本文描述的程序或本领域已知的程序，例如针对全长形式的蛋白质的本发明抗体，纯化本发明多肽。
本发明提供包含如下成分的多核苷酸，或由如下成分组成的多核苷酸，所述成分是标识为SEQ ID NO：X的序列和/或ATCC保藏号：Z中提供的cDNA。本发明还提供包含如下成分或由如下成分组成的多肽，所述成分是标识为SEQ ID NO：Y的序列和/或ATCC保藏号Z中提供的cDNA编码的多肽。本发明还提供编码包含如下成分或由如下成分组成的多肽的多核苷酸，所述成分是标识为SEQ ID NO：Y的多肽序列和/或ATCC保藏号Z中包含的cDNA编码的多肽序列。
优选地，本发明指向这样的多核苷酸，其包含标识为SEQ ID NO：X的序列和/或ATCC保藏号：Z中提供的cDNA或由它们组成，而且其序列长度小于或等于5兆碱基对、1兆碱基对、0.5兆碱基对、0.1兆碱基对、50,000碱基对、20,000碱基对或10,000碱基对。
本发明包括具有与本文公开的本发明多核苷酸互补的序列的多核苷酸。这些序列可以和SEQ ID NO：X公开的序列、保藏物中包含的序列、和/或编码SEQ ID NO：Y公开序列的核苷酸序列互补。
本发明还包括能够优选地在降低的严紧条件下，更优选地在严紧条件下，最优选地在高度严紧条件下与本文所述多核苷酸杂交的多核苷酸。严紧条件的实例显示在下表2中：高度严紧条件是指至少与例如条件A-F具有相同严紧性的那些条件；严紧条件至少与例如条件G-L具有相同严紧性；而降低的严紧条件至少与例如条件M-R具有相同严紧性。
表2
| 严紧性条件 | 多核苷酸杂种± | 杂种长度(bp) | 杂交温度和缓冲液 | 洗涤温度和缓冲液 |
| A | DNA:DNA | ＞或等于50 | 65℃；1×SSC-或42℃；1×SSC，50％甲酰胺 | 65℃；0.3×SSC |
| B | DNA:DNA | ＜50 | Tb*；1×SSC | Tb*；1×SSC |
| C | DNA:RNA | ＞或等于50 | 67℃；1×SSC或45℃；1×SSC，50％甲酰胺 | 67℃；0.3×SSC |
| D | DNA:RNA | ＜50 | Td*；1×SSC | Td*；1×SSC |
| E | RNA:RNA | ＞或等于50 | 70℃；1×SSC或50℃；1×SSC，50％甲酰胺 | 70℃；0.3×SSC |
| F | RNA:RNA | ＜50 | Tf*；1×SSC | Tf*；1×SSC |
| G | DNA:DNA | ＞或等于50 | 65℃；4×SSC或45℃；4×SSC，50％甲酰胺 | 65℃；1×SSC |
| H | DNA:DNA | ＜50 | Th*；4×SSC | Th*；4×SSC |
| I | DNA:RNA | ＞或等于50 | 67℃；4×SSC或45℃；4×SSC，50％甲酰胺 | 67℃；1×SSC |
| J | DNA:RNA | ＜50 | Tj*；4×SSC | Tj*；4×SSC |
| K | RNA:RNA | ＞或等于50 | 70℃；4×SSC | 67℃；1×SSC |
| 或40℃；6×SSC，50％甲酰胺 | ||||
| L | RNA:RNA | ＜50 | Tl*；2×SSC | Tl*；2×SSC |
| M | DNA:DNA | ＞或等于50 | 50℃；4×SSC或40℃6×SSC，50％甲酰胺 | 50℃；2×SSC |
| N | DNA:DNA | ＜50 | Tn*；6×SSC | Tn*；6×SSC |
| O | DNA:RNA | ＞或等于50 | 55℃；4×SSC或42℃；6×SSC，50％甲酰胺 | 55℃；2×SSC |
| P | DNA:RNA | ＜50 | Tp*；6×SSC | Tp*；6×SSC |
| Q | RNA:RNA | ＞或等于50 | 60℃；4×SSC或45℃；6×SSC，50％甲酰胺 | 60℃；2×SSC |
| R | RNA:RNA | ＜50 | Tr*；4×SSC | Tr*；4×SSC |
：“杂种长度”是指进行杂交的多核苷酸中发生杂交的区域的预期长度。当与未知序列的多个核酸杂交时，假定杂种分子是进行杂交的本发明多核苷酸的杂种分子。当与已知序列的多核苷酸杂交时，杂种长度可以通过比对两个多核苷酸的序列并确定具有最佳序列互补性的区域或多个区域以确定。用于比对两个或多个多核苷酸序列和/或确定两个多核苷酸序列之间的一致性百分数的方法是本领域熟知的(见，DNA*Star软件包中的MegAlign程序等)。
：SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以替代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后进行15分钟洗涤。杂交和洗涤中可以再包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片断化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和不超过50％的甲酰胺。
*Tb-Tr：对于预期长度少于50个碱基对的杂种分子，杂交温度应比该杂种分子的解链温度Tm少5-10℃，此处Tm是根据如下等式确定的。对于长度少于18个碱基对的杂种分子，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度介于18和46个碱基对之间的杂种分子，Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂种分子中的碱基数目，而[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC，[Na+]＝0.165M)。
±：本发明包括用PNA或修饰的多核苷酸替代任何一个或多个DNA或RNA杂种配偶体。这些修饰的多核苷酸是本领域已知的，并且在本文的其它地方作了更为具体的描述。
对于多核苷酸杂交，严紧条件的其它实例可以参见例如Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9和11章；以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel等编，John Wiley and Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4部分，特此并入这里作为参考。
优选地，这些杂交多核苷酸与和其杂交的本发明多核苷酸具有至少70％序列一致性(更优选至少80％一致性；最优选至少90％或95％一致性)，此处，通过比较为最大化重叠部分和一致性且最小化序列缺口进行比对后的杂交多核苷酸，确定序列一致性。一致性的确定是本领域熟知的，并更为具体地在本文的其它地方作了讨论。
本发明包括将PCR方法学应用于本发明的多核苷酸序列、ATCC保藏克隆和/或编码本发明多肽的cDNA。用于扩增核酸的PCR技术描述在US专利4,683,195和Saiki等，Science，239：487-491(1988)。例如，PCR可以包括如下步骤：变性模板核酸(如果是双链)，使引物和靶标退化，和聚合。在扩增反应中探测的或用作模板的核酸可以是基因组DNA、cDNA、RNA或PNA。可以使用PCR扩增基因组DNA中的特异序列、特异RNA序列和/或从mRNA转录产生的cDNA。有关PCR技术的一般应用(包括具体方法参数)的参考文献包括Mullis等，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，(1987)；Ehrlich(编)，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989；Ehrlich等，Science，252：1643-1650，(1991)；和“PCR Protocols，A Guide to Methodsand Applications”，Innis等编，Academic Press，纽约(1990)。
信号序列
本发明还包括包含SEQ ID NO：Y的多肽序列、SEQ ID NO：X多核苷酸编码的多肽、和/或保藏克隆中cDNA编码的多肽，或由它们组成的成熟形式的多肽。本发明还包括编码本发明成熟形式多肽的多核苷酸，例如，SEQ ID NO：X的多核苷酸序列，和/或保藏克隆的cDNA中提供的多核苷酸序列。
根据信号假说，真核细胞分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链开始跨越粗糙内质网向外运输，该序列即从成熟蛋白质上切割下来。大多数真核细胞以相同的特异性切割分泌的蛋白质。然而，在一些情况下，分泌蛋白的切割并不完全统一，这就导致两种或多种成熟蛋白。而且，长期以来就已知，分泌蛋白的切割特异性最终决定于完整蛋白的一级结构，即它是多肽的氨基酸序列所固有的。
目前已有方法可以预测蛋白质是否具有信号序列，以及该序列的切割位点。例如，McGeoch(Virus Res.3：271-286(1985))的方法使用来自完整(未切割的)蛋白质的短N端带电荷区域和随后的不带电荷区域的信息。von Heinje，Nucleic Acids Res.14：4683-4690(1986)的方法使用来自切割位点周围残基(典型地-13至+2)的信息，此处，+1指示分泌蛋白质的氨基端。这些方法预测已知哺乳动物分泌蛋白的切割位点的准确性在75％-80％之间。(von Heinjie，同上)。然而，对于给定的蛋白质，这两个方法并不总是产生相同的预测切割位点。
已建立的用于鉴定信号序列位置以及其切割位点的方法是HenrikNielsen等开发的SignalP程序(v1.1)(Protein Engineering 10：1-6(1997))。该程序基于von Heinjie开发的算法，并提供了增加预测准确性的其它参数。
更近来，开发了藏匿Markov模型(hidden Markov model)(H.Neilson等，Ismb 1998；6；122-30)，该模型被加入到最近的SingalP(v2.0)中。此新方法通过区分信号肽和不切割的信号锚，增加了鉴定切割位点的能力。本发明包括将其中公开的方法应用于预测本发明任一多肽序列的信号肽位置，包括切割位点。
然而，本领域普通技术人员明了，切割位点有时会随生物体的不同而不同，不可能进行绝对肯定的预测。因此，本发明多肽可以含有信号序列。包含信号序列的本发明多肽在预测的切割位点的5个残基内(即，+或-5残基，或优选地在第-5，-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3，+4或+5位残基)起始N端。类似地，也应当意识到，在一些情况下，从分泌蛋白上切下信号序列并不是完全统一的，这就导致一种以上的分泌蛋白。这些多肽和编码这些多肽的多核苷酸均是本发明所考虑的。
而且，通过以上分析鉴定到的信号序列可能不一定预示天然信号序列。例如，天然信号序列可能位于该预测的信号序列的再上游。然而，该预测的信号序列可能能够指导分泌蛋白向ER运输。尽管如此，本发明仍提供SEQ ID NO：X多核苷酸序列和/或保藏克隆的cDNA中包含的多核苷酸序列在哺乳动物细胞(例如COS细胞，见下述)中表达时产生的成熟蛋白。这些多肽和编码这些多肽的多核苷酸是本发明考虑的。
多核苷酸和多肽变体
本发明还包括本文在SEQ ID NO：X中公开的多核苷酸序列、其互补链和/或保藏克隆中包含的cDNA序列的变体(例如，等位变体，定向进化同系物等)。
本发明还包括SEQ ID NO：Y中公开的和/或保藏克隆编码的多肽序列和/或其片断的变体。
“变体”是指与本发明多核苷酸或多肽不同，但保留了其基本性质的多核苷酸或多肽。一般地，变体与本发明多核苷酸或多肽在整体上极为相似，并在许多区域中是一致的。
本发明还指向这样的多核苷酸序列，其包含与如下非限制性实例有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的多核苷酸序列或作为备选方案由这样的序列组成，所述实例是：SEQ ID NO：X所示序列中编码区的多核苷酸序列，所述编码区的互补链，保藏克隆的cDNA中提供的多核苷酸序列，所述保藏cDNA的互补链，编码SEQ ID NO：Y所标识的多肽的多核苷酸序列，编码保藏克隆中提供的cDNA的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括此处提供的任一个多核苷酸序列的多核苷酸片断。
本发明还包括与本发明提供的任一个多核苷酸序列(包括前述多核苷酸片断)在严紧或较低严紧杂交条件下杂交的多核苷酸序列。本发明还包括与本发明多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列编码的多肽。
本发明包括包含如下氨基酸序列或作为备选方案由这样的序列组成的多肽序列，所述氨基酸序列与如下非限制性实例具有至少70％、80％、98％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性：SEQ ID NO：Y标识的多肽序列、保藏克隆中提供的cDNA编码的多肽序列、和/或此处提供的任一个多肽的多肽片断。
具有与本发明参考核苷酸序列至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸，旨在指该核酸的核苷酸序列与参考序列相比除了可能在编码该多肽的参考序列的每100个核苷酸中包括不超过5个点突变外，两者是一致的。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的核酸，可以对参考序列中不超过5％的核苷酸进行缺失或替代为另一种核苷酸，或者可以在该参考序列中插入数目不超过参考序列总核苷酸数目5％的核苷酸。查询序列(query sequence)可以是表1中提及的完整序列，ORF(开放阅读框)、或本文中指明的任何片断。
实际上，可以使用已知的计算机程序常规地确定任何特定核酸分子或多肽是否与本发明核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。确定查询序列(本发明序列)和被试序列之间的最佳整体匹配性(又称作整体序列比对)的优选方法有CLUSTALW计算机程序(Thompson，J.D.等，Nucleic Acid Research，2(22)：4673-4680，(1994))，该程序以Higgins，D.G.等的算法(计算机在生物科学中的应用(ComputerApplication in the Biosciences，CABIOS)，8(2)：189-191，(1992))为基础。在序列比对时，查询序列和被试序列都是DNA序列。可以通过将U转化成T以比较RNA序列。所述整体序列比对的结果以一致性百分数形式给出。为计算一致性百分数，在CLUSTALW的DNA序列比对中使用的优选参数是：矩阵＝BLOSUM，k-tuple＝1，最大对角线数目(number of top diagonal)＝5，缺口罚分＝3，缺口开放罚分10，缺口延伸罚分＝0，评分方法＝百分数，窗口大小＝5或被试核苷酸序列的长度(无论哪一个更短)。
如果由于5’或3’缺失而非由于内部缺失，被试序列比查询序列短，则必须对结果进行人工校正。这是因为CLUSTALW程序在计算一致性百分数时并不考虑被试序列的5’和3’截短。对于相对于查询序列而言在5’端或3’端截短的被试序列，通过计算查询序列中位于被试序列的5’和3’(未匹配/对齐)的碱基的数目在查询序列总碱基数目中的百分数来校正一致性百分数。可以通过CLUSTALW序列比对的结果确定核苷酸是否匹配/对齐。然后，从使用以上CLUSTALW程序和指定参数计算出的一致性百分数中扣除该百分数，得到最终的百分一致性分数。此经校正的分数正是可以用于本发明目的的分数。对于人为校正百分一致性分数这一目的，仅计算CLUSTALW比对时位于被试序列5’和3’碱基之外、与查询序列不匹配/比对的碱基。
例如，将90个碱基的被试序列和100个碱基的查询序列对齐，以确定一致性百分数。由于被试序列的5’端缺失，因此CLUSTALW比对显示5’端头10个碱基不匹配/对齐。这10个未配对的碱基占该序列的10％(未匹配的5’和3’端的碱基数目/查询序列总碱基数目)，故从CLUSTALW程序计算出的百分一致性分数中扣除10％。如果剩余90个碱基完全匹配，则最终的一致性百分数将是90％。再如，将90个碱基的被试序列和100个碱基的查询序列进行比较。此次缺失是内部缺失，这样在被试序列的5’和3’没有与查询序列不匹配/对齐的碱基。在这种情况下，CLUSTALW计算的一致性百分数不用进行人为校正。再次重申，进行人为校正的仅是与查询序列不匹配/对齐的被试序列5’和3’的碱基。对于本发明的目的，不再需要其它的人为校正。
具有与本发明查询氨基酸序列至少例如95％“一致”的氨基酸序列的多肽，旨在指被试多肽的氨基酸序列与查询序列相比除了可能在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括不超过5个氨基酸改变外，两者是一致的。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％一致的氨基酸序列的多肽，可以在被试序列中进行不超过5％氨基酸残基的插入、缺失或替代为另一种氨基酸。参考序列中的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基端位置或两个末端位置之间的任何地方，独个地分散在参考序列的残基中或以一个或多个连续组的方式分散在参考序列中。
实际上，可以使用已知的计算机程序常规地确定任何特定多肽是否与例如表1提及的氨基酸序列(SEQ ID NO：Y)或保藏克隆所含cDNA编码的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。确定查询序列(本发明序列)和被试序列之间的最佳整体匹配性(又称作整体序列比对)的优选方法有CLUSTALW计算机程序(Thompson，J.D.等，Nucleic AcidResearch，2(22)：4673-4680，(1994))，该程序以Higgins，D.G.等的算法(计算机在生物科学中的应用(Computer Application in theBiosciences，CABIOS)，8(2)：189-191，(1992))为基础。在序列比对时，查询序列和被试序列都是DNA序列。可以通过将U转化成T以比较RNA序列。所述整体序列比对的结果以一致性百分数形式给出。为计算一致性百分数，在CLUSTALW的DNA序列比对中使用的优选参数是：矩阵＝BLOSUM，k-tuple＝1，最大对角线数目(number of topdiagonal)＝5，缺口罚分＝3，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝0，评分方法＝百分数，窗口大小＝5或被比较核苷酸序列的长度(无论哪一个更短)。
如果由于N或C端缺失而非由于内部缺失，被试序列比查询序列短，则必须对结果进行人工校正。这是因为CLUSTALW程序在计算整体一致性百分数时并不考虑被试序列的N和C端截短。对于相对于查询序列而言在N端或C端截短的被试序列，通过计算查询序列中位于被试序列的N和C端(未与相应被比较残基匹配/对齐)的残基的数目在查询序列总残基数目中的百分数来校正一致性百分数。可以通过CLUSTALW序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后，从使用以上CLUSTALW程序和指定参数计算出的一致性百分数中扣除该百分数，得到最终的百分一致性分数。此最后的百分一致性分数正是可以用于本发明目的的分数。对于人为校正百分一致性分数这一目的，仅考虑位于被试序列N和C端、与查询序列不匹配/对齐的残基。即，仅考虑位于被试序列的N和C最远端残基之外的查询残基位置。
例如，将90个氨基酸残基的被试序列和100个残基的查询序列对齐，以确定一致性百分数。由于被试序列的N端缺失，因此CLUSTALW比对显示N端头10个残基不匹配/对齐。这10个未配对的残基占该序列的10％(未匹配的N和C端残基的数目/查询序列总残基数目)，故从CLUSTALW程序计算出的百分一致性分数中扣除10％。如果剩余90个残基完全匹配，则最终的一致性百分数将是90％。再如，将90个残基的被试序列和100个残基的查询序列进行比较。此次缺失是内部缺失，这样在被试序列的N和C端没有与查询序列不匹配/对齐的残基。在这种情况下，CLUSTALW计算的一致性百分数不用进行人为校正。再次重申，进行人为校正的仅是CLUSTALW比对中展示出的位于被试序列N和C末端之外与查询序列不匹配/对齐的残基位置。对于本发明的目的，不再需要其它的人为校正。
变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。尤其优选含有造成沉默替代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的多核苷酸变体。由于遗传密码的简并性通过沉默替代产生的核苷酸变体是优选的。而且，还优选其中有5-10、1-5或1-2个氨基酸发生了任何组合方式的替代、缺失或添加的变体。制备多核苷酸变体可以有多种原因，例如为特定宿主优化密码子表达(将mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌优选的密码子)。
天然存在的变体被称作“等位变体”，其是指在生物体染色体上占据指定座位的基因的几种可供选择形式中的一种。(Genes II，Lewin，B.，编，John Wiley & Sons，纽约(1985))。这些等位变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上改变并包括在本发明内。或者，可以通过诱变技术或通过直接合成制备非天然变体。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以制备变体以改善或改变本发明多肽的特征。例如，可以从蛋白质的N端或C端缺失一个或多个氨基酸而基本上不丧失生物学功能。Ron等，J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993)的作者报道了甚至在缺失3、8或27个氨基端氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白质。类似地，γ干扰素在从羧基端缺失8-10个氨基酸残基后表现出高达10倍的活性(Dobeli等，J.Biotechnology 7：199-216(1988))。
而且，大量证据证实，变体常能保持与天然蛋白质相似的生物学活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 268：2105-22111(1993))对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们使用随机诱变产生了3,500多个IL-1a突变体，就该分子的整个长度而言每个变体上平均有2.5个氨基酸改变。在每一个可能的氨基酸位置上检查多个突变。研究者发现，“该分子的大部分均可以发生改变而几乎不对[结合或生物学活性]造成影响”。实际上，在检查的3,500多个核苷酸序列中，仅23个独特的氨基酸序列产生活性显著不同于野生型的蛋白质。
而且，即使从多肽的N端或C端缺失一个或多个氨基酸导致一种或多种生物学功能改变或丧失，其它的生物学活性也仍可以保持。例如，从N端或C端除去蛋白质的不足大多数的残基后，缺失变体诱导和/或结合识别该蛋白质的抗体的能力将仍可能得以保持。缺少蛋白质N端或C端残基的特定多肽是否能保持此免疫原活性，可以容易地通过此处描述的或其它本领域已知的常规方法确定。
因此，本发明还包括显示出实质上的生物学活性的多肽变体。这些变体包括根据本领域已知的一般规则选择以致对活性几乎不产生影响的缺失、插入、倒位、重复和替代。例如，Bowie等，Science247：1306-1310(1990)中提供了关于如何制备表型沉默氨基酸替代的指导，其中作者指出，有两种主要的策略可用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。
第一个策略利用进化过程中自然选择造成的氨基酸替代耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可以鉴定出保守的氨基酸。这些保守氨基酸可能对于蛋白质的功能是重要的。相反，耐受自然选择的氨基酸替代位置表明，这些位置对于蛋白质功能是不关键的。因此，可以修饰耐受氨基酸替代的位置而仍能保持蛋白质的生物学活性。
第二个策略使用遗传工程向克隆基因的特定位置引入氨基酸改变以鉴定对蛋白质功能关键的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(在分子的每个残基位置引入单丙氨酸突变)。(Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989).)然后可以检测所获突变分子的生物学活性。
正如该作者指出的，这两个策略揭示了蛋白质令人惊奇的耐受氨基酸替代。作者进一步指出了在蛋白质某些氨基酸位置哪些氨基酸改变可能是允许的。例如，大多数隐蔽(在蛋白质三级结构内部)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链一般几乎不具有保守特征。而且，耐受性保守氨基酸替代涉及脂肪族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；酸性残基Asp和Glu的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代；碱性残基Lys、Arg和His的替代；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的替代；以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。
除了保守性氨基酸替代外，本发明变体还包括，但不限于如下情况：(i)用一个或多个非保守氨基酸残基进行替代，此时，替代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的，或(ii)用一个或多个具有取代基基团的氨基酸残基进行替代；或(iii)使成熟多肽与另一成分，如增加多肽稳定性和/或溶解性的成分(例如聚乙二醇)融合；或(iv)使多肽与其它的氨基酸，例如IgG Fc融合区肽、前导或分泌序列、或利于纯化的序列融合。从此处的教导，这些变体多肽被认为属于本领域技术人员的范围。
例如，含有带电荷氨基酸替代为其它带电荷或中性氨基酸的氨基酸替代的多肽变体可能产生具有改良特征(如较少的聚集)的蛋白质。药物制剂的聚集不仅会使活性降低而且会由于聚集物的免疫原活性导致清除增加。(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36：838-846(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377(1993)。)
而且，本发明还包括通过对如下分子应用分子进化(“DNA改组”)方法学构建的多肽变体：SEQ ID NO：X公开的多核苷酸、保藏物中提交的克隆的序列、和/或编码SEQ ID NO：Y所公开多肽的cDNA。该DNA改组技术是本领域已知的，在本文其它地方进行了更具体的描述(例如，WPC，Stemmer，PNAS，91：10747(1994))和实施例20)。
本发明的另一实施方案涉及多肽，其包含本发明氨基酸序列并在氨基酸序列中含有至少一个，但不超过50个的氨基酸替代，甚至更优选不超过40个氨基酸替代，再更优选不超过20个氨基酸替代，甚至再更优选不超过20个氨基酸替代。当然，按优选性的递增顺序，高度优选的是具有如下氨基酸序列的肽或多肽，所述氨基酸序列包含本发明的氨基酸序列但含有至少1个，但不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸替代。在特定实施方案中，本发明氨基酸序列或其片断(例如，成熟形式和/或本文所述其它片断)中增加、替代和/或缺失的数目是1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150，优选保守性氨基酸替代。
多核苷酸和多肽片断
本发明涉及本发明多核苷酸的多核苷酸片断，以及由所述多核苷酸和/或片断编码的多肽。
本发明中，“多核苷酸片断”是指具有如下核酸序列的短多核苷酸，该核酸序列：是保藏克隆所包含的核酸序列的一部分，或编码保藏克隆中cDNA编码的多肽的核酸序列的一部分；是SEQ ID NO：X所示序列的一部分或其互补链，或是编码SEQ ID NO：Y多肽的多核苷酸序列的一部分。本发明核苷酸片断优选长至少约15nt，更优选至少约20nt，甚至更优选至少约30nt，甚至更优选至少约40nt，至少约50nt，至少约75nt或至少约150nt。例如，“长至少20nt”的片断旨在包括保藏克隆所含cDNA序列或SEQ ID NO：X所示核苷酸序列中的20个或更多个连续碱基。在此上下文中，“大约”包括具体指出的数值，在任一端或在两端多或少几个(5、4、3、2或1个)核苷酸的数值。这些核苷酸片断具有多种用途，包括但不限于作为本文所讨论的诊断探针和引物。当然，优选更大的片断(例如，50、150、500、600、2000个核苷酸)。
而且，本发明多核苷酸片断的代表性实例包括，例如，包含如下序列或者作为备选方案由如下序列组成的片断，所述序列为从SEQ IDNO：X或其互补链、或保藏克隆所含cDNA的大约第1-50，51-100，101-150，151-200，201-250，251-300，301-350，351-400，401-450，451-500，501-550，551-600，651-700，701-750，751-800，800-850，851-900，901-950，951-1000，1001-1050，1051-1100，1101-1150，1151-1200，1201-1250，1251-1300，1301-1350，1351-1400，1401-1450，1451-1500，1501-1550，1551-1600，1601-1650，1651-1700，1701-1750，1751-1800，1801-1850，1851-1900，1901-1950，1951-2000或2001到最末位核苷酸。在此上下文中，“大约”包括具体指出的范围，以及在任一端或在两端多或少几个(5，4，3，2或1个)核苷酸的范围。优选地，这些片断编码具有生物学活性的多肽。更优选地，这些多核苷酸可以用作本文所讨论的探针或引物。本发明还包括与这些核酸分子在严紧杂交条件或较低严紧条件下杂交的多核苷酸，以及这些多核苷酸编码的多肽。
本发明中，“多肽片断”是指为SEQ ID NO：Y所含氨基酸序列或保藏克隆所含cDNA编码的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列。蛋白质(多肽)片断可以是“独立式的”，或可以包含在一个更大多肽中构成其一个部分或一个区域，最优选作为一个单一的连续区域。本发明多肽片断的代表性实例包括，例如，包含如下序列或由如下序列组成的片断，所述序列为编码区的大约第1-20，21-40，41-60，61-80，81-100，102-120，121-140，141-160或161到最末位氨基酸。而且，多肽片断可以长大约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸。在此上下文中，“大约”包括具体指出的范围或数值，以及在任一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1个)氨基酸的范围或数值。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
优选的多肽片断包括全长蛋白质。进而优选的多肽片断包括从氨基或羧基端或从两端连续缺失一系列残基的全长蛋白质。例如，可以从全长多肽的氨基端缺失范围在1-60之间的任何数目的氨基酸。类似地，可以从全长蛋白质的羧基端缺失范围在1-30之间的任何数目的氨基酸。而且，优选以上氨基和羧基端缺失的任何组合。类似地，编码这些多肽片断的多核苷酸也是优选的。
还优选特征在于结构域或功能域的多肽和多核苷酸片断，例如包含α-螺旋和α-螺旋形成区、β-片层和β-片层形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两亲区域、β两亲区域、柔性区域、表面形成区域、底物结合区和高抗原指数区域的片段。属于保守域中的SEQ ID NO：Y的多肽片断尤其是本发明所考虑的。而且，本发明也考虑到编码这些域的多核苷酸。
其它优选的多肽片断是生物学活性片断。生物学活性片断是指表现出与本发明多肽的活性相似但不一定相同的活性的那些片断。这些片断的生物学活性可以包括改善的期望活性或降低的不期望的活性。编码这些多肽片断的多核苷酸也包括在本发明中。
在优选实施方案中，本发明多核苷酸片断编码的多肽所展示的功能性活性可以是典型地与本发明全长多肽相关的一种或多种生物学活性。这些生物学活性的例子包括：与结合全长蛋白质的同样抗体中的至少一个结合的片断能力、与结合全长蛋白质的同样蛋白质中的至少一个发生相互作用的片断能力、与全长蛋白质引起至少一种相同免疫应答的片断能力(即，造成免疫系统产生特异针对相同表位的抗体，等)、与全长蛋白质结合至少一种相同的多核苷酸的片断能力、与全长蛋白质的受体结合的片断能力、与全长蛋白质的配基结合的片断能力和与全长蛋白质多聚化的片断能力。然而，本领域技术人员将明了，一些片断可以具有期望的并与全长蛋白质的生物学活性完全不相关的生物学活性。本发明多肽(包括其片断、变体、衍生物和类似物)的功能性活性可以通过本领域技术人员的许多现有方法确定，这些方法中的一些在本文其它地方进行了描述。
表位和抗体
本发明中，“表位”是指在生物体，优选动物或植物中具有抗原和/或免疫原活性的多肽片断。本发明的一个优选实施方案涉及包含表位的多肽片断以及编码此片断的多核苷酸。抗体能结合的蛋白质分子的区域被定义为“抗原性表位”。相对的是，“免疫原性表位”定义为引起抗体应答(即，在动物体内)或防卫性应答(即，在植物体内)的蛋白质部分。(见，例如，Geyson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002(1983))。
可以通过本领域已知的常规方法制备表位片断。具有免疫原性的表位可以根据本领域熟知方法用于诱导抗体。这些表位可以和载体蛋白质例如白蛋白一起给予，或可以在无载体的情况下给予，只要该表位足够长(大于或等于25个氨基酸)即可。然而，已经发现，包含少至8-10个氨基酸的表位也能够引起免疫应答。本发明表位可以是来源于变性多肽(例如，存在于Western印迹中的多肽)的线性表位。
本发明中，抗原性表位优选包含具有至少7个，更优选至少9个，最优选约15至约30个氨基酸的序列。抗原性表位可以用于引起特异结合该表位的抗体，包括单克隆抗体。(见，例如，Wilson等，Cell37：767-778(1984)；Sutcliffe，J.G.等，Science 219：660-666(1983))。
此处所用术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够特异结合蛋白质的完整分子以及抗体片断(例如，Fab和F(ab’)2片断)。Fab和F(ab’)2片断缺少完整抗体的Fc片断，可以更快速地从动物或植物的循环系统中被清除，并可以比完整多肽具有较少的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。因此，优选这些片断，以及FAB或其它免疫球蛋白表达文库的产物。而且，本发明抗体包括嵌合的、单链的和人源化的抗体。
本发明还涉及对本发明多肽、多肽片断和多肽变体具有特异性的抗体。本发明抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、杂合缀合(hetero conjugate)抗体、嵌合抗体、单链抗体、轻链可变区、重链可变区、一个或多个互补决定区(CDR)、噬菌体展示来源的抗体(来源于Fab表达文库等的那些)、抗独特型抗体和具有酶促活性的那些抗体(即，催化抗体)。本发明抗体可以由目前已知的抗体同种型(例如，IgD、IgM，IgE，IgG，IgY和IgA等)、人IgA和IgG亚类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1或IgA2)或小鼠IgA和IgG亚类(例如，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA1或IgA2)中的任一种组成。
本发明抗体可以包括多核苷酸抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(Harlow等，抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，第2版(1988)，特此完整并入此处作为参考)。可以在哺乳动物或鸟类中，例如通过一次或多次注射免疫剂以及，如果期望的话，佐剂，引起多核苷酸抗体产生。为了本发明的目的，“免疫剂”可以定义为本发明的多肽，包括其片断、变体和/或衍生物，以及与异源多肽的融合物和本文所述其它形式的多肽。
典型地，免疫剂和/或佐剂可以通过多次皮下或腹膜内注射的方式注入动物体内，但也可以通过肌内途径和/或通过IV给予。免疫剂可以包括本发明多肽或其融合蛋白或变体。根据多肽的性质(即，疏水性百分数、亲水性百分数、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫剂和已知在免疫的哺乳动物体内具有免疫原性的蛋白质缀合在一起可能是有用的。该缀合包括通过给本发明多肽和免疫原性蛋白质衍生活性化学官能基团以致形成共价键的化学缀合，或基于融合蛋白的方法学或本领域技术人员已知的其它方法。该免疫原性蛋白质的实例包括，但不限于，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以根据宿主的种类使用多种佐剂增强免疫应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人用佐剂如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可以使用的佐剂的其它实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成海藻糖dicorynomycolate)。本领域技术人员无需过多实验即可选择出免疫操作方案。
本发明抗体可以包括单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，参见Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)和美国专利4,376,110；Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，第2版(1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)(Elsevier，N.Y.，91981))；或本领域技术人员已知的其它方法。可以用于制备单克隆抗体的其它方法实例包括，但不限于，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today 4：72；Cole等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.第77-96页)。该抗体可以是任何免疫球蛋白类型，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD和它们的任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或在体内培养。对于此，体内制备高滴度mAb是目前优选的制备方法。
在杂交瘤方法中，典型地用免疫剂免疫小鼠、人源化的小鼠、具有人免疫系统的小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物，以引起产生或能够产生特异结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。
免疫剂典型地可以包括本发明多肽或其融合蛋白。一般地，如果人源细胞是期望的时，使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果期望非人哺乳动物来源时，使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适宜的融合剂，例如聚乙二醇，使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)，第59-103页)。通常，永生化细胞系是转化的哺乳动物细胞，尤其是鼠、牛和人源的骨髓瘤细胞。一般使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可以在适宜的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种可抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质可抑制HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是能够充分融合、支持选出的抗体产生细胞稳定地高水平表达抗体、并对培养基如HAT培养基敏感的那些细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠源骨髓瘤细胞系，其可以从例如SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diego，California)和美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia)获得。正如整个说明书所暗示的，已经描述了产生人单克隆抗体的人杂交瘤和小鼠-人杂合杂交瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，纽约(1987)，第51-63页)。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在对抗本发明多肽的单克隆抗体。优选地，该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。这些技术是本领域已知的并属于本领域技术人员的范围。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Scatchard分析法(Munson和Pollart，Anal.Biochem.，107：220(1980))确定。
鉴定到期望的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆这些克隆并通过标准方法进行培养(Goding，同上)。对于此目的，适宜的培养基包括，例如，Dulbecco修饰的Eagle氏培养基和RPMI-1640。或者，可以在哺乳动物体内以腹水的形式体内培养杂交瘤细胞。
可以通过常规免疫球蛋白纯化法从培养基或腹水中分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体，这些方法的例子有A蛋白-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本领域技术人员明了，本领域有多种方法可以用于制备单克隆抗体，因此，本发明并不限于仅在杂交瘤中进行制备。例如，可以通过重组DNA方法，例如美国专利4,816,567中描述的方法制备单克隆抗体。在此上下文中，术语“单克隆抗体”是指来源于单个真核细胞、噬菌体或原核细胞克隆的抗体。编码本发明单克隆抗体的DNA可以容易地使用常规方法(例如，使用能够特异地与编码鼠源抗体重链和亲链、或来自人、人源化的或其它来源的抗体重链和亲链的基因结合的寡核苷酸探针)分离和测序。本发明杂交瘤细胞可以充当该DNA的优选来源。一旦得以分离后，可以将DNA置于表达载体中，然后用其转化宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或转化原本不能产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以实现在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。还可以修饰DNA，方法有例如用人重链和亲链恒定区的编码序列替换同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，或同上)，使免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接。可以用这种非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定区，或替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以构建嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如，一个方法涉及重组表达免疫球蛋白亲链和修饰的重链。重链通常可以在Fc区的任一位点处截短以便防止重链交联。或者，可以将有关的半胱氨酸残基替代为另一氨基酸残基或将其缺失掉以便防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术消化抗体以产生其片断，尤其是Fab片断。
本发明抗体还可以包括人源化抗体或完全人(人)抗体。人源化形式的非人(例如鼠)抗体是含有最少的非人免疫球蛋白来源序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片断(例如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔并具有期望的特异性、亲和性和容量的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基置换。人源化抗体还可以包含在受体抗体和输入的CDR或构架序列中均不存在的残基。一般地，人源化抗体可以包含至少一个，典型地两个可变区的基本上全部内容，其中CDR区的全部或基本上全部内容与非人免疫球蛋白的是相应的，而FR区的全部或基本上全部序列是人免疫球蛋白共有序列。最佳情况是，人源化抗体还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的一部分Fc(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。
使非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。一般地，人源化抗体在其中引入了非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称作“输入(import)”残基，典型地取自“输入”可变区。人源化可以基本上按Winter和同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用大鼠CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列来实现。因此，此“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中，实质上不足完整的人可变区被非人物种的相应序列替代。实践中，典型地人源化抗体是这样的人抗体，其中的一些CDR残基和可能地一些FR残基被替换为鼠抗体的类似位点的残基。
人抗体也可以使用本领域已知的多种技术制备，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227；381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.225：581(1991))。cole等和Boerder等的技术也可用于制备人单克隆抗体(cole等，Monoclonal Antiboides andCancer Therapy，Alan R.Riss(1985)；和Boerner等，J.Immunol，147(1)：86-95，(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白座位引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全被失活的小鼠体内，制备人抗体。一旦进行攻击后，可以观察到人抗体的产生，这在所有方面(包括基因重排、组装和抗体库构建)都极为类似在人体内观察到的情况。该方法的描述参见，例如，美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,106和如下科学出版物：Marks等，Biotechnol.10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnol.14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；Lonberg和Huszer，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
此外，可以使用开发用于制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312：604-608；Takeda等，1985，Nature，314：452-454)，其中来自具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适宜生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的这样一种分子，例如，具有来自鼠mAb的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的那些分子。(见，例如，Cabilly等，美国专利4,816,567；和Boss等，美国专利4,816,397，两篇文献均完整并入此处作为参考)。
本发明抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是具有针对至少两个不同的抗原的结合特异性的单克隆的，优选人的或人源化的抗体。在本发明中，其中一种结合特异性可以针对本发明多肽，而另一种可以针对任何其它抗原，优选针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细胞的表面蛋白等。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组制备是以两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达为基础的，其中这两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和亲链的随机组合，这些杂交瘤(四杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。类似方法公开在1993年5月13日出版的WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。
具有期望的结合特异性(抗原-抗体结合位点)的抗体可变区可以和免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含至少部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区进行。优选在融合物至少一个中存在包含亲链结合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)。可以将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果期望的话，免疫球蛋白亲链的DNA插入不同的表达载体，并共转化适宜的宿主生物。对于产生双特异性抗体的更多细节参见，例如Suresh等，Meth.In Enzym，121：210(1986)。
本发明还考虑杂合缀合抗体(heteroconjugate antibody)。杂合缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。此类抗体被提议例如用于使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/20373；和EP03089)。可以考虑使用合成蛋白质化学中的已知方法体外制备抗体，包括涉及交联剂的那些方法。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫酯键，构建免疫毒素。对于此目的，适宜的试剂包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺酸甲基酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)，以及公开在例如美国专利4,676,980中的那些。
针对本发明多肽的抗体的用途
本发明抗体具有多种用途。例如，该抗体可以用于诊断试验以检测样品中本发明多肽的存在或对其进行定量。此类诊断试验可以由至少两个步骤组成。第一，使用抗体处理样品，其中样品是组织(例如，动物，植物等)、生物学液体(例如，血液、尿液、韧皮部液体、木质部液体、植物分泌物等)、生物学提取物(例如，组织或细胞匀浆物等)、蛋白质微阵列(例如，见Arenkov P.等，Anal.Biochem.，278(2)：123-131(2000))或层析柱等。第二步，涉及定量与底物结合的抗体的量。或者，该方法可以还涉及第一步，将抗体通过共价、静电或可逆的方式与固相支持物结合，以及第二步，用结合的抗体处理以上或本文其它地方定义的样品。
多种诊断试验技术是本领域已知的，例如，竞争结合试验、直接或间接三明治试验和免疫沉淀试验，其可以在不均一或均一相中进行(Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，(1987)，第147-158页)。用于诊断试验中的抗体可以用可检测部分标记。可检测部分应能够产生(直接地或间接地)可检测信号。例如，可检测部分可以是放射性同位素，例如2H、14C、32P或125I，荧光或化学发光化合物，例如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明或萤光素，或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或辣根过氧化物酶。本领域已知的用于使抗体和可检测部分缀合的任何方法均可以使用，包括描述在如下文献中的那些方法：Hunter等，Nature，144：945(1962)；Dafvid等，Biochem，13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Metho.，40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30：407(1982)。
针对本发明多肽的抗体可以用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化此多肽。在此方法中，使用本领域熟知的方法，将抗特定多肽的抗体固定在适宜的支持物，例如Sephadex树脂或滤纸上。然后使固定化抗体与含有待纯化的多肽的样品接触，之后用适宜溶剂洗涤支持物除去样品中除期望多肽之外的基本上所有物质，而期望多肽与固定化抗体结合。最后，用另一适宜溶剂洗涤支持物将期望多肽从抗体上释放出来。
针对本发明多肽的抗体可用于抑制动物体内的过敏反应。例如，通过施用治疗上可接受剂量的本发明一种抗体或多种抗体或本发明抗体“鸡尾酒(cocktail)”，或还联合施用不同来源的其它抗体，动物在吞食某些抗原，尤其是植物抗原后就不会引起过敏应答。在一个典型例子中，已经证明来自Lycospersicum esculentum的番茄LEA凝集素当口服和i.n.施用给小鼠后可引起强免疫应答。因此，给小鼠施用抗LEA凝集素的抗体可以降低或完全消除对LEA凝集素的免疫应答，因为可以在LEA凝集素引起免疫应答之前将其有效地从循环中除去(例如，参见Lavelle EC等，Immunology，99(1)：30-7，(2000))。同样，也可以设想到克隆针对本发明多肽的抗体的编码基因，所述多肽具有在生物体内引起过敏和/或免疫应答的潜能，然后用所述抗体基因转化该生物以便其在生物体内表达(例如，组成型、诱导型等)。由此，该生物体将有效地抵抗由此免疫/过敏反应性多肽的吞入或存在引起的过敏应答。有关本发明的治疗和/或基因治疗应用的详细描述见本文的其它地方。
或者，可以在植物中制备本发明抗体(例如，克隆针对本发明多肽的抗体的基因，然后用包含所述基因的适宜载体转化植物以便在植物中组成型表达抗体)，随后让动物吞食此植物，由此使动物对抗体针对的特异抗原产生暂时的免疫(见，例如，美国专利5,914,123和6,034,298)。
在另一实施方案中，本发明抗体，优选多克隆抗体，更优选单克隆抗体，最优选单链抗体，可以用作抑制特定基因或多个基因在植物或生物体中的基因表达的手段。见，例如，Dow Agrosciences LLC的国际公开文本WO 00/05391(公布日2/3/00)。将这些方法应用于本发明抗体是本领域已知的，更具体的描述见本文其它地方(见，实施例14和15)。
在另一实施方案中，本发明抗体可以用于使本发明多肽多聚化。例如，某些蛋白质当以多聚体状态存在时可以具有增强的生物学活性(即，此增强的活性可能是由于该蛋白质的有效浓度增加由此更多的蛋白质可以出现在局部区域而造成的)。
融合蛋白
本发明的所有多肽均可以用以制备融合蛋白。例如，本发明多肽可以用作抗原性标签与第二蛋白融合。针对本发明多肽的抗体可以通过与本发明多肽结合用以间接地检测此第二蛋白。而且，由于某些蛋白基于运输信号靶向细胞位置，故本发明多肽一旦与其它蛋白融合后可以用作导向分子。
可以与本发明多肽融合的域的实例不仅包括异源信号序列，还包括其它异源功能区。该融合不一定需要是直接的，也可以通过接头序列进行。
而且，还可以设计融合蛋白质以改善本发明多肽的特征。例如，可以在本发明多肽的N端添加其它氨基酸，尤其是带电荷的氨基酸的区域，以提高从宿主细胞中纯化时或随后的操作和贮存中的稳定性和持久性。可以向本发明多肽添加肽部分以利于纯化。该区域可以在多肽最终制备完成前除去。类似地，可以在这些肽部分之间引入肽切割位点，再可以利用蛋白酶活性将所述肽从本发明蛋白质上除去。添加肽部分(包括肽切割位点)以利于多肽操作是本领域的熟知和常规技术。
而且，本发明多肽(包括片断和特别是表位)可以与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的部分恒定区或其部分(CH1，CH2，CH3和其任何组合，包括完整域和其部分)结合，导致嵌合多肽。这些融合蛋白质可以方便纯化，并表现出增加的体内半衰期。一个报道的实例描述了由人CD4多肽的头两个域与哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的不同域组成的嵌合蛋白质。(EP A 394,827；Traunecker等，Nature331：84-86(1988)。)具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白还可以比单体分泌蛋白或单纯的蛋白片断更为有效地结合并中和其它分子。(Fountoulakis等，J.Biochem.270：3958-3964(1995)。)
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应申请2045869)公开了包含免疫球蛋白分子恒定区不同部分以及另一人蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白的Fc部分对治疗和诊断是有益的，因此可以导致例如改善的药物动力学性质。(EP-A 0232 262。)或者，可以期望在表达、检测和纯化融合蛋白之后将Fc部分除去。例如，当融合蛋白用作免疫用的抗原时，Fc部分可能妨碍治疗和诊断。在药物开发中，例如，已将人蛋白质如hIL-5与Fc部分融合以利于高通量试验中鉴定hIL-5的拮抗剂。(参见，D.Bennett等，J.MolecularRecognition 8：52-58(1995)；K.Johanson等，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995)。)
而且，本发明多肽可以和标记序列(也称作“标签”)融合。由于可获得对此“标签”具有特异性的抗体，故这可以显著地方便本发明融合多肽的纯化和/或其鉴定，因为不需要本发明多肽的特异性抗体。此纯化可以采取亲和纯化的形式，由此存在能与表位标签结合的抗标签抗体或另一类型的亲和基质(例如，与流通柱的基质结合的抗标签抗体)。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是6组氨酸肽，例如尤其是，pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，其中有许多是可商业获得的。例如，正如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)中描述的，6组氨酸为方便地纯化融合蛋白提供了条件。另一对纯化有用的肽标签是“HA”标签，其相应于来源于流感血凝素蛋白的表位。(Wilson等，Cell 37：767(1984))。
本领域技术人员明了存在可以容易地替代以上提及的表位用于纯化和/或鉴定本发明多肽的其它“标签”(Jones C.等，J Chromatogr A.707(1)：3-22(1995))。例如，c-myc标签和其8F9，3C7，6E10，G4mB7和9E10抗体(Evan等，Molecular and Cellular Biology5：3610-3616(1985))；单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签和其抗体(Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990))；Flag肽，即，八肽序列DYKDDDDK(SEQ ID NO：17)(Hopp等，Biotech.6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等，Science，255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.chem.，266：15136-15166(1991))；T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Sci.USA，87：6363-6367(1990))；FITC表位(Zymed，Inc.)；GFP表位(Zymed，Inc.)；和罗丹明表位(Zymed，Inc.)。
本发明还包括本发明多肽与多达9个精氨酸的系列重复的编码区的连接。本发明还包括用多达9个精氨酸的系列重复化学衍生本发明多肽。最近证实，该标签在与多肽连接后可以充当通用通行证，从而允许化合物在不经额外衍生化或操作的情况下可到达细胞内部(Wender，P等，未发表的数据)。
包含本发明多肽(包括其片断和/或变体)的蛋白质融合物可以用于如下非限制性实例：蛋白质的亚细胞定位、通过免疫沉淀确定蛋白质-蛋白质相互作用、通过亲和层析纯化蛋白质、蛋白质的功能和/或结构表征。本发明还包括将半抗原特异性抗体用于以上针对表位融合蛋白提及的任一种用途。例如，可以对本发明多肽进行化学衍生化以结合半抗原分子(例如DNP(Zymed，Inc.))。由于可获得特异针对此半抗原的单克隆抗体，故可以容易地使用如免疫沉淀纯化此蛋白质。
本发明多肽，包括其片断和/或变体，以及针对该多肽、片断和/或变体的抗体均可以和多种已知的和仍待测定的毒素中的任一种融合，所述毒素的例子有篦麻毒素、皂草素(Mashiba H等，Ann N Y AcadSci.1999；886：233-5)、HC毒素(Tonukari NJ等，Plant Cell，2000年2月；12(2)：237-248)、BT内毒素或假单胞菌(Pseudomonias)内毒素。这些融合物可以用于将毒素递送至存在能够与本发明多肽结合的配基或蛋白的期望组织。
本发明包括针对本发明多肽(包括其变体和片断)的抗体和所述毒素的融合物以便将毒素递送至细胞内的特异位置、特异的植物组织和/或特异的植物物种。这些双功能抗体是本领域已知的，而描述其它有利的融合物(包括制备方法的例子)的综述可以参见P.J.Hudson，Curr.Opp.In Imm.11：548-557(1999)；该出版物以及其它引用的参考文献特此完整并入此处作为参考。在此上下文中，术语“毒素”可以扩展以包括任何异源蛋白、小分子、放射性核素、细胞毒性药物、脂质体、粘着分子、糖蛋白、配体、细胞或组织特异性配体、酶、生物活性剂、生物学应答调节物、抗真菌剂、激素、类固醇、维生素、肽、肽类似物、抗过敏剂、抗结核药(anti-tubercular agent)、抗病毒剂、抗生素、抗原生生物剂、螯合剂、放射性粒子、放射性离子、X射线造影剂、单克隆抗体、多克隆抗体和遗传物质。鉴于本公开，本领域技术人员可以确定任何具体的“毒素”是否可以用于本发明化合物中。以上列出的适宜“毒素”实例仅是示例性的，不旨在限制可以用于本发明中的“毒素”。
因此，以上任何融合物均可以使用本发明多核苷酸或多肽进行设计。
载体、宿主细胞和蛋白质制备
本发明还涉及含有本发明多核苷酸的载体、宿主细胞和通过重组技术制备多肽。所述载体可以是例如，噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能够复制的或是复制缺陷的。在后一情况下，通常病毒增殖仅发生在互补性宿主细胞中。
可以将多核苷酸与含有选择标记的载体连接以便在宿主中增殖。一般地，将质粒载体在沉淀物，例如磷酸钙沉淀中引入，或以与带电脂质一起形成的复合物引入。如果载体是病毒，则可以使用适宜的包装细胞系体外对其进行包装，然后转导宿主细胞。
本发明多核苷酸插入片断应可操作地与适宜启动子连接，所述启动子有如35S启动子、34S启动子、CMV启动子、λ噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac，trp，phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子，这仅提及了很少一些。此外，在一些情况下，可能期望或需要将组织特异性或细胞类型特异性启动子与本发明多肽可操作地连接。选择性地在特定组织或细胞类型中表达的适宜植物可表达启动子的实例是本领域熟知的，包括但不限于种子特异性启动子(例如，WO 89/03887)、器官原基特异性启动子(An等，PlantCell，8：15-30，(1996))、茎特异性启动子(Keller等，EMBO J.，7：3625-3633，(1988))、叶特异性启动子(Hudspeth等，Plant Mol.Biol.12：579-589，(1989))、叶肉特异性启动子(例如光诱导型核酮糖二磷酸羧化加氧酶启动子)、根特异性启动子(Keller等，GenesDevel.，3：1639-1646，(1989))、块茎特异性启动子(Keil等，EMBO J.，8：1323-13330，(1989))、脉管组织特异性启动子(Peleman等，Gene，84：359-369，(1989))、分生组织特异性启动子(例如，无茎分生组织(SHOOTMERISTEMLESS，STM)基因的启动子，Long等，Nature，379：66-69(1996))、原基特异性启动子(例如，金鱼草属(Antirrhinum)CycD3a基因启动子，Doonan等，“plant Cell Division”(Francis，Dutidz和Inze编)，Portlant Press，伦敦(1998))、花药特异性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956和WO 92/13957)、柱头特异性启动子(WO 91/02068)、degiscence-区特异性启动子(WO 97/13865)、种子特异性启动子(WO 89/03887)等。
可以与本发明多核苷酸可操作地连接的其它启动子可以参见McElroy和Brettel，Tibtech，第12卷，1994年2月。而且，大量的启动子目前已用于转化双子叶植物。这些启动子来自多种不同的来源。通常使用的一组启动子分离自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，其中它们起到驱动感染过程中整合到植物基因组中的T-DNA区段上携带的冠瘿碱合成酶基因表达的功能，这些启动子包括章鱼碱合成酶(ocs)启动子(L.Comai等，1985；C.Waldron等，1985)、甘露碱合成酶(mas)启动子(L.Comai等，1985；K.E.McBride和K.R.Summerfelt，1990)和胭脂碱合成酶(nos)启动子(M.W.Bevan等，1983；L.Herrera-Estrella等，1983，R.T.Fraley等，1983，M.De Block等，1984；R.Hain等，1985)。这些启动子在广泛的植物组织中均具有活性。
此外，如下出版物中公开的启动子也可以可操作地与本发明多核苷酸连接：美国专利5,623,067；5,712,112；5,723,751；5,723,754；5,723,757；5,744,334；5,750,385；5,750,399；5,767,363；5,783,393；5,789,214；5,792,922；5,792,933；5,801,027；5,804,694；5,814,618；5,824,857；5,824,863；5,824,865；5,824,866；5,824,872；和5,929,302；以及国际公布WO 97/49727，WO 98/00533，WO 98/03655，WO 98/07846，WO 98/08961，WO 98/08962，WO 98/10734，WO 98/16634，WO 98/22593，WO 98/38295，和WO98/44097；欧洲专利申请EP 0 846 770。
几种病毒启动子也可以用于驱动异源基因在双子叶植物中表达(J.c.Kridl和R.M.Goodman，1986)，并可以可操作地与本发明多核苷酸连接。花椰菜花叶病毒35S启动子是最常用于双子叶植物转化的启动子之一，这是因为它可以赋予基因在几乎所有组织中进行高水平表达(J.Odell等，1985；D.W.Ow等，1986：D.M.Shah等，1986)。还可以使用该启动子的修饰形式，包括具有两个串联35S启动子的构型(R.Kay等1987)和由35S启动子与甘露碱合成酶启动子串联组成的mas-35S启动子(L.Comai等，1990)。这两个启动子均可以比单拷贝的35S启动子驱动甚至更高水平的基因表达。目前已使用的其它病毒启动子包括花椰菜花叶病毒19S启动子(J.Paszkowski等，1984；E.Balazs等)和玄参花叶病毒的34S启动子(M.Sanger等，1990)。
或者，本发明多核苷酸插入片断可以可操作地与本领域已知的多种诱导型启动子中的任一种连接，这些启动子包括，但不限于：四环素诱导型启动子、小分子诱导型启动子、光诱导型启动子、化学化合物(例如防护剂、除草剂、糖皮质激素等)诱导型启动子、非生物胁迫诱导型启动子(例如，创伤、重金属、冷敏感启动子、热敏感启动子、盐敏感启动子、干旱敏感启动子、缺氧诱导型启动子(如EP1012317中公开的那些)等)、生物胁迫启动子(例如，病原体或害虫感染，包括真菌、病毒、细菌、昆虫、线虫、支原体和支原体样生物等引起的感染)。适于本发明的植物可表达诱导型启动子的实例有：线虫诱导型启动子(例如WO 92/21757和/或EP1007709中公开的那些)、真菌诱导型启动子(WO 93/19188，WO 96/28561)、化学诱导型鼠耳芥属(Arabidopsis)PR-1启动子(WO 98/03536)、WO 98/45445中公开的诱导型启动子、US专利5,804,693中公开的诱导型启动子、US专利5,821,398中公开的番茄软果诱导型启动子、应用糖皮质激素如地塞米松后可诱导的启动子、或应用四环素后抑制或激活的启动子(Gatz等，PNAS USA，85：1394-1397，(1988))。其它适宜诱导型启动子是本领域技术人员已知的。
此外，本发明多核苷酸插入片断可以可操作地与“人工”或嵌合启动子及转录因子连接。具体地，人工启动子可以包含反式作用转录因子所识别的顺式作用DNA序列元件的任何组合，或作为备选方案由其组成。优选地，顺式作用DNA序列元件和反式作用转录因子在植物中是有效的。而且，“人工”启动子的反式转录因子就其设计本身而言也可以是“人工的”或嵌合的，并可以充当所述“人工”启动子的激活物或抑制物。例如，本发明嵌合启动子可以包含一个或多个章鱼碱合成酶基因(OCS)的上游激活序列、基质附着区域(MAR)等。
表达构建体还可以含有转录起始和终止位点以及在转录区域中含有用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的转录本的编码部分优选在起始处包括翻译起始密码子并包括适当地位于待翻译的多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
此外，表达构建体还可以在表达构建体中包含5’前导序列。该前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Furest，T.R.和Moss，B.(1989)PNAS USA，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等，(1986))；MDMV前导序列(玉米矮缩花叶病毒)(Virology，154：9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.(1991)Nature，353：90-94)；苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling，S.A.和Gehrke，L.(1987)Nature，325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TW)(Gallie，D.R.等(1989)Molecular biology of RNA，第237-256页)；和玉米萎黄斑点病毒(maize chlorotic mottle virus，MCNW)前导序列(Lommel，S.A.等，(1991)Virology，81：382-385)。也参见，Della-Cioppa等(1987)Plant Physiology，8196506。还可以使用已知可增强翻译的其它方法，例如内含子等。
正如所指出的，表达载体优选包括至少一个选择标记。该标记包括，但不限于，用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶G418或新霉素抗性、卡那霉素抗性、潮霉素抗性、双丙氨酰膦抗性、sulfonoamide抗性、链霉素抗性、壮观霉素抗性、chlorosulfuron抗性、甘膦酸酯抗性和氨甲蝶呤抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素抗性、卡那霉素抗性或氨苄青霉素抗性基因。适宜的宿主细胞的代表性实例包括，但不限于细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC保藏号201178)；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；植物细胞，特别是来源于表3所列任一种植物的植物细胞和/或组织。用于上述宿主细胞的适宜培养基和培养条件是本领域已知的。
可以使本发明多核苷酸和多肽靶向叶绿体或造粉体进行表达。以此方式，表达构建体还将含有编码转运肽的多核苷酸序列，此序列与本发明多核苷酸可操作地连接以引导本发明多核苷酸向叶绿体转运。适宜的转运肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne等(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等(1989)J Biol.Chem.264：1754417550；della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84065060R.omer等(1993)Biochem.Biophys.Res Commun.196：1414-1421；和Shah等(1986)Science 233：478-481。
表达构建体还可以包含任何其它必需的调节序列，例如核定位信号(Kalderon等，(1984)Cell 39；499-509；和Lassner等(1991)Plant Molecular Biology 17：229-234)；植物翻译共有序列(Joshi，C.P.(1987)Nucleic Acids Research 15：6643-6653)、内含子(Luehrsen和Walbot(1991)Mol.Gen.Genet.225：81-93)等，它们将与本发明多核苷酸可操作地连接。
编码本发明蛋白质或多肽的多核苷酸序列可能在植物的遗传操作中尤其有用。这样，可以在用于目的植物中进行表达的表达盒中提供本发明多核苷酸。适当时，可以优化基因以便增加在转化植物中的表达。即，可以使用植物优选的密码子合成多核苷酸以便特异地针对特定物种提高表达。合成植物优选基因的方法是本领域现成的。见，例如，美国专利5,380,831、5,436,391和Murray等(1989)NucleicAcids Res.17：477-498，并入此处作为参考。
随目的DNA序列待在其中进行表达的物种的不同，可能期望合成具有植物优选密码子的序列，或作为备选方案具有叶绿体优选密码子的序列。植物优选密码子可以根据具体目的植物物种中最大量表达的蛋白质使用的最高频率密码子来确定。参见，EPA 0359472；EPA0385962；WO 91/16432；Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：3324-3328；和Murray等(1989)Nucleic Acids Research。以此方式可以对多核苷酸序列进行优化以便在任何植物中表达。应明了，可以优化或合成基因序列的全部或任何部分。即，也可以使用合成或部分优化的序列。
此外，可能期望通过合成含有优化密码子以致可以在特定靶植物细胞或组织中实现高效翻译的编码多核苷酸序列，选择性地在该植物特定靶细胞或组织中表达本发明多肽。该方法是本领域已知的，具体提供在PCT国际公布WO 00/42190(其特此并入此处作为参考)。
已知其它序列修饰也可以增强基因在细胞宿主中的表达。这些包括消除编码假聚腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子拼接位点信号、转座子样重复、和其它可能对基因表达有害的熟知序列。可以对序列的GC含量进行调整以达到指定细胞宿主的平均水平(这可以参考宿主细胞表达的已知基因来计算)。在可能时，可以修饰序列以避免预测的mRNA发夹二级结构。
优选用于细菌的载体包括可从QIAGEN公司获得的pQE70、pQE60和pQE-9；可从Stratagen Cloning Systems公司获得的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可从Pharmacia Biotech公司获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核细胞载体有可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。优选的酵母系统用表达载体包括，但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(所有均可从Invitrogen，Carlbad，CA获得)。
植物系统优选的表达载体包括，但不限于，Bin 19(ATCC保藏号：37327)、GA437(ATCC保藏号：37350)、pAK1003(ATCC保藏号：37425)、pAS2022(ATCC保藏号：37426)、pAS2023(ATCC保藏号：37427)、pAP2034(ATCC保藏号：37428)、pC22(ATCC保藏号：37493)、pHS24(ATCC保藏号：37841)、pHS85(ATCC保藏号：37842)、pPMl(ATCC保藏号：40172)、pGV3111SE(ATCC保藏号：53213)、pCGN978(ATCC保藏号：67064)、pFL61(ATCC保藏号：77215)、pGPTV-KAN(ATCC保藏号：77388)、pGPTV-HPT(ATCC保藏号：77389)、pGPTV-DHFR(ATCC保藏号：77390)、pGPTV-BAR(ATCC保藏号：77391)、pGPTV-BLEO(ATCC保藏号：77392)、和/或pPE1000(ATCC保藏号：87573)。本领域技术人员将明了，以上任一种载体均可以容易地接受修饰以包括或缺失可能对可操作性而言必需的特定元件。其它适宜载体是本领域技术人员容易明了的。
向宿主细胞中引入构建体可以通过如下方法实现：生物轰击转化(biolistic transformation)(Klein等，Nature，327：70-73(1987))、PEG介导的转染(Paskowski等，EMBO J.3：2717(1984))、磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔(Fromm等，PNAS USA 82：5824(1985))、转导、感染、根癌农杆菌指导的感染或其它方法。这些方法描述在许多标准实验室手册中，例如Davis等，Basic Methods in Molecular biology(1986)。
可以从重组细胞培养物中通过熟知方法回收并纯化本发明多肽，所述方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选使用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。
本发明多肽还可以回收自：从天然来源(无论其是直接分离的或是培养的)(包括体液、组织和细胞)纯化的产物；化学合成方法的产物；和利用重组技术在原核或真核宿主(包括，例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生的产物。
根据重组制备方法中使用的宿主的不同，本发明多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此外，本发明多肽还可以包括起始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况下这是由宿主所介导的过程导致的。因此，本领域熟知，在所有真核细胞中翻译起始密码子编码的N端甲硫氨酸一般会从所有的翻译后蛋白质上被高效地除去。在大多数原核生物中大多数蛋白质上的N端甲硫氨酸也可以被有效地除去，但对于某些蛋白质，此原核去除作用是无效的，这取决于与N端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质。
除了包括此处讨论的含有载体构建体的宿主细胞外，本发明还包括如下原代、继代和永生化宿主细胞，这些细胞已经经过改造缺失或替换了内源性遗传物质(例如编码序列)、和/或包括了与本发明多核苷酸可操作地连接并能激活、改变和/或扩增内源性多核苷酸的遗传物质(例如，异源多核苷酸序列)。例如，可以使用本领域已知的技术将异源控制区(例如启动子和/或增强子)与内源性多核苷酸序列通过同源重组方法可操作地连接起来，从而导致形成新的转录单位(见，例如，1997年6月27日颁发的美国专利5,641,670；1998年3月31日颁发的美国专利5,733,761；1996年9月26日公布的国际公布WO96/29411；1994年8月4日公布的国际公布WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342：435-438(1989)，所有这些公开均完整并入作为参考)。
此外，本发明多肽、类似物、衍生物和/片断可以通过化学方法进行合成。(见，例如，Merrifield，1963，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-2156)。例如，可以通过固相技术合成多肽，然后从树脂上将其切下并通过制备型高效液相色谱纯化(例如，见，Creighton，1983，Proteins，Structrure and Molecular Principles，W.H.Freeman和同事，N.Y.，第50-60页)。还可以使用肽合成仪合成多肽。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解方法；参见Creighton，1983，Proteins，Structrure and Molecular Principles，W.H.Freeman和同事，N.Y.，第34-49页；质谱肽测序，等)验证。而且，如果期望的话，可以以替代或添加的形式在本发明多肽中引入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物。非经典氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、以及通常的氨基酸类似物。而且，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)型的。
可以在蛋白质水平上操作本发明多肽序列。本发明包括在翻译期间或之后不同修饰的本发明多肽、其片断、衍生物或类似物，所述修饰有例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、被已知保护/封闭剂衍生化、蛋白酶剪切、与抗体分子或其它细胞配体连接，等。可以利用已知技术完成众多化学修饰中的任一种，所述技术包括，但不限于，利用氰溴酸、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异化学切割、乙酰化、配制(formulation)、氧化、还原、衣霉素存在时代谢合成等。
而且，本发明包括其它的翻译后修饰，包括，例如，添加N连接的或O连接的糖部分或链、添加可检测标记(其性质上可以是荧光素、放射性核素、酶)、添加带表位的肽片断(例如，FLAG、HA、GST、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白等)、结合亲和标签如生物素和/或链霉亲和素、氨基酸主链共价结合化学部分、多肽末端的N或C端加工(例如蛋白酶解加工)、缺失N端甲硫氨酸残基等。
而且，本发明包括本发明多肽的化学物质衍生化，优选此化学物质是亲水性聚合物残基。示例性亲水性聚合物，包括衍生物，可以是包括如下聚合物在内的那些：其中的重复单元含有一个或多个羟基基团的聚合物(多羟基聚合物)，包括，例如聚(乙烯醇)；其中的重复单元含有一个或多个氨基基团的聚合物(聚胺聚合物)，包括，例如，肽、多肽、蛋白质和脂蛋白，如白蛋白和天然脂蛋白；其中的重复单元含有一个或多个羧基基团的聚合物(聚羧基聚合物)，包括，例如，羧甲基纤维素、藻酸和其盐(如藻酸钠和藻酸钙)、糖胺聚糖和其盐(包括透明质酸的盐)、糖的磷酸化和磺酸化衍生物、遗传物质、如白介素-2和干扰素、以及硫代磷酸酯寡聚物；和其中的重复单元含有一个或多个糖部分的聚合物(多糖聚合物)，包括，例如，糖。
亲水聚合物的分子量可以改变，一般为大约50至大约5,000,000，优选具有大约100至大约50,000分子量的聚合物。更优选具有大约150至大约10,000分子量的聚合物，甚至更优选具有大约200至大约8,000分子量的聚合物。
可以用于使本发明多肽衍生化的其它优选聚合物包括，例如，聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯吡咯烷)、多氧聚合物(polyoxomer)、聚山梨糖酯和聚(乙烯醇)，尤其优选PEG聚合物。PEG聚合物中优选分子量为大约100至大约10,000的PEG聚合物。更优选分子量大约200至大约8,000的PEG聚合物，甚至更优选分子量分别为2,000、5,000和8,000的PEG2,000、PEG5,000和PEG8,000。基于本公开，除了以上例举的那些外，其它适宜的亲水聚合物是本领域技术人员容易明了的。一般地，使用的聚合物可以包括能够与本发明多肽通过烷基化或酰化反应连接的聚合物。
如同以上例举的各种聚合物一样，可以考虑聚合物残基除了含有例如典型地参与连接本发明多肽和聚合物残基的基团外，还含有官能团。这些官能团包括，例如，羧基、氨基、羟基和巯基。如果期望的话，聚合物残基上的这些官能团也可以与通常对该官能团具有反应性并能够辅助向体内特定组织(包括，例如患病组织)实施打靶的物质反应。可以和这些额外官能团反应的物质的实例包括，例如，蛋白质(包括抗体)、糖、肽、糖蛋白、糖脂、凝集素和核苷。
除了亲水聚合物的残基外，用于衍生本发明多肽的化学物质还可以是糖残基。可以被衍生化的糖的实例包括，例如，单糖或糖醇，例如赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、果糖、山梨糖醇、甘露糖醇和景天庚酮糖，优选的单糖是果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醇、山梨糖醇；和二糖，如乳糖、蔗糖、麦芽糖和纤维二糖。其它糖包括，例如，肌醇和神经节苷脂头部基团。基于本公开，除了以上例举的那些外，其它适宜的糖是本领域技术人员容易明了的。一般地，可以用于衍生化的糖包括能够通过烷基化或酰化反应与本发明多肽结合的糖。
而且，本发明还包括用例如脂(包括阳离子、阴离子、聚合的、带电荷的、合成的、饱和的、不饱和的脂，以及以上的任何组合，等)、稳定剂衍生本发明多肽。
本发明包括用例如可以起到稳定作用(例如增加多肽在溶液中的半衰期、使多肽的水溶性增加、增加多肽的亲水或疏水特征，等)的化合物衍生本发明多肽。可用作稳定物质的聚合物可以是天然、半合成(修饰的天然物质)或合成来源的。天然聚合物的例子包括天然多糖，如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如，菊粉)、果聚糖(levan)、岩藻聚糖(fucoidan)、角叉藻聚糖、半乳卡洛糖、果胶酸、果胶，包括直链淀粉、支链淀粉(pullulan)、糖元、支链淀粉(amylopectin)、纤维素、葡聚糖、糖精、葡萄糖、右旋糖、多聚葡萄糖、聚右旋糖(polydextrose)、石脐素、几丁质、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、藻酸、黄原胶、淀粉和各种其它天然均聚物或杂聚物，例如含有一个或多个如下醛糖、酮糖、酸或胺的那些：赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、右旋糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔洛糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、葡糖醛酸、葡糖酸、葡萄糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸，以及其天然衍生物。因此，适宜的聚合物包括，例如，蛋白质如白蛋白、聚藻酸盐和聚丙交酯-共-乙交酯聚合物。半合成聚合物的实例包括羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素和甲氧基纤维素。合成聚合物的实例包括聚磷腈、羟基磷灰石、氟代磷灰石聚合物、聚乙烯类(例如，聚乙二醇(包括，例如，称作Pluronics.RTM.的一类化合物，其可从BASF，Parsippany，N.J商购获得)、聚氧乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯)、聚丙烯类(例如，聚丙二醇)、聚氨基甲酸酯(例如，聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯氯和聚乙烯吡咯烷酮)、聚酰胺包括尼龙、聚苯乙烯、聚乳酸、氟化烃聚合物、氟化碳聚合物(例如，聚四氟乙烯)、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯，以及它们的衍生物。鉴于本公开，并联合本领域已知的知识，例如，Unger的美国专利5,205,290中描述和提及的那些知识(其公开特此完整地并入此处作为参考)，本领域技术人员将容易明了利用聚合物作为稳定化合物制备本发明的衍生化多肽的方法。
而且，本发明还包括对本发明多肽的其它修饰。这些其它修饰是本领域已知的，这些修饰(包括衍生方法，等)具体提供在美国专利6,028,066(特此完整地并入此处作为参考)。
多核苷酸的用途
本文鉴定的所有多核苷酸均可以以许多方式用作试剂。如下描述利用了已知的技术并应认为是示例性的。
本发明多核苷酸可以用于染色体鉴定。由于目前几乎没有基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记试剂存在，故亟需鉴定新的染色体标记。本发明多核苷酸均可以用作染色体标记。
简而言之，可以根据SEQ ID NO：X所示序列制备PCR引物(优选15-25bp)进行序列的染色体作图。可以使用计算机分析选择引物以便引物在基因组DNA中不跨越一个以上的预测外显子。然后可以使用这些引物PCR筛选含有单个人类染色体的体细胞杂种。仅含有相应于SEQID NO：X的人类基因的那些杂种可以产生扩增片断。
类似地，体细胞杂种为将多核苷酸PCR作图至特定染色体上提供了一种快速方法。可以使用一台热循环仪每天分配3或多个克隆。而且，可以使用特异染色体片断组实现多核苷酸的亚定位。可以使用的其它基因作图策略包括原位杂交、用标记的流式分拣染色体预筛选、和通过杂交预筛选以构建染色体特异性cDNA文库。
还可以使用中期染色体铺展物(chromosomal spread)的荧光原位杂交(FISH)实现本发明多核苷酸的精确染色体定位。此技术可以使用短至500或600碱基的多核苷酸；然而，优选2,000-4,000bp的多核苷酸。对于该技术的综述，参见，Verma等，“Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques”，Pergamon Press，纽约(1988)。
对于染色体作图，本发明多核苷酸可以单独使用(以标记单个染色体或该染色体上的单个位点)、或以组的方式使用(以标记多个位点和/或多个染色体)。优选的多核苷酸相应于cDNA的非编码区，这是因为编码区在基因家族中更有可能是保守的，这样就增加了染色体作图过程中的交叉杂交可能性。
一旦确定了将多核苷酸作图至精确染色体位置后，即可以在连锁分析中使用多核苷酸的此物理位置。连锁分析可以建立染色体位置和具体疾病表现之间的共遗传性。疾病作图数据是本领域已知的。假定1兆碱基作图分辨率和每20kb一个基因，则精确位于疾病相关染色体区域的一个cDNA可能是50-500个潜在致病基因中的一个。
因此，一旦建立共遗传性，则可以检查多核苷酸和相应基因在患病和未患病生物之间的差异。首先，可以在染色体铺展物中或通过PCR检查染色体上的可见结构改变，例如缺失或易位。如果没有结构改变，则确定点突变的存在。在一些或所有患病生物体中观察到的但在正常生物体中观察不到的突变，指示该突变可能引起此疾病。然而，需要对来自几个正常生物的多肽和相应基因进行完全测序以便将突变与多态性区分开来。如果鉴定到一个新的多态性，则可以利用此多态性多肽进行进一步的连锁分析。
而且，可以使用本发明多核苷酸评价患病生物与未患病生物相比所述基因的表达增加或降低。任何改变(改变的表达、染色体重排或突变)均可以用作诊断或预后标记。
因此，本发明还提供用于疾病诊断过程中的诊断方法，包括测量本发明多核苷酸在生物体的细胞或体液中的表达水平，和将测量的基因表达水平与多核苷酸的标准表达水平进行比较，由此与标准相比出现的基因表达水平增加或减少将指示疾病。
“测量本发明多核苷酸的表达水平”意在指定量或定性地测量或估计第一生物学样品中本发明多肽水平或编码该多肽的mRNA的水平，方法可以是直接的(例如，测定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对的(例如，与第二生物学样品中的多肽水平或mRNA水平进行比较)。优选地，测量或估计第一生物学样品中的多肽水平或mRNA水平，并与标准多肽水平或mRNA水平进行比较，所述标准采取自从未患病个体获得的第二生物学样品或通过计算未患病生物群体的平均水平来确定。正如本领域技术人员明了的，一旦已知了标准多肽水平或mRNA水平后，即可以将其重复地用作比较的标准。
“生物学样品”是指从生物体、体液、细胞系、组织培养物或含有本发明多肽或mRNA的其它来源获得的任何生物学样品。正如所指出的，生物学样品包括含有本发明多肽的体液(例如如下非限制性实例，韧皮部、木质部、分泌的液体、花蜜、根瘤液、附着器液体、溃疡液体、菌瘿液体、果汁、毛状体液体、液泡液、质体液、胞质溶胶液体、根渗出液、间质液等)和发现表达本发明多肽的其它组织来源(例如如下非限制性实例，根、茎、顶端分生组织、叶、花、足(pedals)等)。从植物获得活检组织和体液的方法是本领域熟知的。例如，分离植物细胞和组织的间质液体的方法可以参见，例如，国际公布WO 00/09725。当生物学样品包括mRNA时，则活检组织是优选的来源。
以上提供的方法优选用于诊断方法和/或试剂盒，其中多核苷酸和/或多肽与固相支持物结合。在一个示例性方法中，支持物可以是“基因芯片”或“生物芯片”，见美国专利5,837,832、5,874,219和5,856,174。而且，利用分离自测试对象的多核苷酸，本发明多核苷酸结合的基因芯片可以用于鉴定多核苷酸序列之间的多态性。了解此多态性(即，其位置以及其存在)对鉴定许多疾病(包括增殖性疾病和病症)的疾病座位是有益的。该方法描述在美国专利5,858,659和5,856,104中。以上提及的美国专利特此完整地并入此处作为参考。
本发明包括通过化学方式或本领域已知的其它方法以肽核酸(PNA)形式合成或复制的本发明多核苷酸。在将多核苷酸结合到固相支持物或基因芯片上时，PNA可用作优选的形式。为了本发明的目的，肽核酸(PNA)是聚酰胺类型的DNA类似物，相应于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的单体单元可商购获得(Perceptive Biosystems)。PNA中不存在某些DNA成分，如磷、磷氧化物或脱氧核糖衍生物。PNA可以特异并牢固地与互补DNA链结合并且不会被核酸酶降解，参见P.E.Nielsen，M.Egholm，R.H.Berg和O.Buchardt，Science 254，1497(1991)；和M.Egholm，O.Buchardt，L.Christensen，C.Behrens，S.M.Freier，D.A.Driver，R.H.Berg，S.K.Kim，B.Norden和P.E.Nielsen，Nature 365，666(1993)。实际上，PNA比DNA本身更强地与DNA结合。这可能是因为在两条链之间没有静电排斥作用，而且聚酰胺主链也更为灵活。鉴于此，PNA/DNA双链比DNA/DNA双链可以在更宽的严紧条件下结合，这就使得多重杂交更容易进行。由于PNA:DNA杂种具有更强的结合特征，故可以使用更小的探针(与DNA探针比较而言)。此外，单碱基错配更有可能使用PNA/DNA杂交来检测，这是因为PNA/DNA 15-聚物(mer)中的单个错配可使熔点(T.sub.m)降低8℃-20℃，而对于DNA/DNA 15聚体双链则降低4℃-16℃。而且，PNA中缺少带电荷的基团，这意味着杂交可以在低离子强度下进行，由此降低分析中盐造成的可能干扰。
除了上述这些，多核苷酸还可以通过形成三股螺旋或反义DNA或RNA用于控制基因表达。反义技术的讨论参见，例如，Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；“作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸”(Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression)，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。有关三股螺旋形成的讨论参见，例如，Lee等，Nucleic Acids Research 6：3073(1979)；Cooney等，Science 241：456(1988)；和Dervan等，Science251：1360(1991)。两种方法都依赖于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。对于这些技术，优选的多核苷酸通常是长20-40个碱基并与参与转录的基因区域(三股螺旋-见，Lee等，Nucl.Acids Res.6：3073(1979)；Cooney等，Science 241：456(1988)；和Dervan等，Science251：1360(1991))或mRNA本身(反义-Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；“作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸”，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))互补的寡核苷酸。最佳情况是，三股螺旋的形成导致DNA向RNA的转录发生关闭，而反义RNA的杂交阻断mRNA分子翻译成多肽。两种技术在模式系统中都是有效的，而且可以利用本文公开的信息设计反义或三股螺旋多核苷酸以尝试治疗或预防疾病。
本发明包括在本发明任何一种寡核苷酸、反义寡核苷酸、三股螺旋寡核苷酸、核酶、PNA寡核苷酸和/或多核苷酸的5’末端、3’末端或其它的任何位置可操作地添加连接核定位信号。见，例如，G.Cutrona等，Nat.Biotech.18：300-303，(2000)；特此并入此处作为参考。
本发明多核苷酸还可以用于基因治疗。基因治疗的一个目标是将正常基因插入具有缺陷基因的生物体中以尝试纠正遗传缺陷。本发明公开的多核苷酸提供了以高度精确的方式靶向该遗传缺陷的手段。另一目标是将宿主基因组中缺少的新基因插入其中，由此在宿主细胞中产生新的性状。在一个实例中，本发明多核苷酸序列可以用于构建相应于所述序列的嵌合RNA/DNA寡核苷酸，该寡核苷酸经特别设计可以例如在系统注射给植物后诱导宿主细胞的错配修复机制(Bartlett，R.J.等，Nat.Biotech.18：615-622(2000)，其特此完整地并入此处作为参考)。该RNA/DNA寡核苷酸可以经设计能纠正特定宿主株系中的遗传缺陷，和/或向植物宿主中引入期望性状(例如在相应于本发明多核苷酸的内源性基因内部引入特定的多态性，从而可以赋予对某些除草剂、杀虫剂、杀真菌剂等的抗性)。或者，可以使用本发明多核苷酸序列构建相应于所述序列的双螺旋寡核苷酸，该寡核苷酸经特别设计可以纠正某些宿主株系的遗传缺陷和/或向植物宿主中引入期望性状(例如在相应于本发明多核苷酸的内源性基因内部引入特定的多态性，从而可以赋予对某些除草剂、杀虫剂、杀真菌剂等的抗性)。使用双螺旋寡核苷酸的这些方法是本领域已知的，并包括在本发明内(见EP1007712，其特此完整地并入此处作为参考)。
本发明多核苷酸还可以用于从极少的生物学样品鉴定生物体。例如，美国军队正在考虑使用限制性片断长度多态性(RFLP)鉴定其人员。在此技术中，利用一种或多种限制性酶消化个体基因组DNA，然后在Southern印迹上探测以产生独特条带用于对人员进行鉴定。该方法不会有目前“身分识别牌”的局限性，该识别牌发生丢失、转变或被盗从而使阳性鉴定变得困难。本发明多核苷酸可以用作RFLP的另一DNA标记。
通过确定生物体基因组所选部分的真实DNA逐个碱基序列，本发明多核苷酸还可以用作RFLP的可替代方法。这些序列可以用于制备扩增和分离该所选DNA的PCR引物，然后可以对该DNA进行测序。使用该技术，由于每一个生物体均具有一套独特的DNA序列，故可以鉴定生物体。一旦确立了生物体的独特ID数据库，即可以从极为微小的组织样品正向鉴定该生物(活的或死的)。类似地，本发明多核苷酸可以用作多态性标记，以及鉴定转化的或未转化的植物细胞和/或组织。
目前还需要能够鉴定特定组织的来源的试剂。例如，在使用未知来源的组织时会造成此需要。适宜的试剂可以包含例如，从本发明序列制备的对特定组织具有特异性的DNA探针或引物。此类试剂组可以鉴定组织的物种和/或器官类型。类似地，可以使用这些试剂筛选组织培养物中的污染。而且，如上述，还可以使用此类试剂筛选和/或鉴定转化和未转化的植物细胞和/或组织。
而且，本发明多核苷酸、编码本发明多肽的多核苷酸、保藏物中所含cDNA(包括变体和/或其中的片断)均可以用于在植物中调节、抑制、增加、减少或引入如下非限制性性状：耐旱性、UV耐受性、花发育、萜烯合成、对非生物性胁迫的耐受性、对热胁迫的耐受性、对冷胁迫的耐受性、对营养胁迫的耐受性、对异生素胁迫的耐受性、蛋白质贮存能力、油贮存能力、氨基酸含量、氨基酸组成、糖贮存能力、油含量、油组成、糖含量、糖组成、纤维含量、纤维组成、代谢物含量、代谢物组成、维生素含量和/或维生素组成。本发明多核苷酸还可以用于调节植物产量、植物发育、植物分化、根的生长、根的形态、植物颜色、植物香味、植物气味、植物组织的可口性、植物的器官感觉性能，并可以用于治疗植物和/或植物防卫。而且，本发明多肽也可用于调节植物充当植物neutriceuticals、药物或phytoceutical的能力。或者，本发明多肽可以用于调节植物产生内源性或外源性(例如来自另一植物种、人、哺乳动物、动物、或其它生物)植物neutriceuticals、药物或phytoceutical的能力。在此上下文中，术语“植物”可以用于指任何植物细胞、植物组织、植物液体或植物部件，并包括植物感染结构，这可以包括，但不限于附着器、菌瘿、溃疡和/或结瘤。在此上下文中，术语“调节”可用以指定量或定性增加、降低、引入、抑制、完全消除或过表达上述及本文其它地方提及的特定性状或特征。
最少，本发明多核苷酸可以用作Southern凝胶的分子量标记、用作检测特定细胞类型中是否存在特定mRNA的诊断探针、用作探针在发现新多核苷酸的方法中“扣除”已知序列、用于选择和制备与“基因芯片”或其它支持物结合的寡聚物、用于通过DNA免疫技术制备抗DNA抗体、以及用作抗原引起免疫应答。
多肽的用途
可以通过多种方式利用这里鉴定的每种多肽。应该认为下面的说明是示例性的，而且利用了已知技术。
利用基于抗体的技术，可以用本发明多肽测定生物样品中蛋白质水平。例如，用经典免疫组织学方法可以研究组织中的蛋白质表达水平。(Jalkanen，M.，等J.Cell.Biol.101：976-985(1985)Jalkanen，M.，等J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。适合的抗体测定标记是本领域已知的，包括酶标记，如葡糖氧化酶，放射性同位素，如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)，锝(99mTc)和荧光标记，如荧光素，罗丹明，和生物素。
除了测定生物样品中蛋白质水平外，也可以通过成象体内检测蛋白质。用于蛋白质体内成象的抗体标记或标志包括通过X-放射显影，NMR或ESR可检测的那些抗体标记或标志。对于X-放射显影，适合的标记包括放射性同位素，如钡或铯，它们发出可检测的，但对受试者无明显损害的放射线。对于NMR和ESR，适合的标记包括带有可检测特征自旋的标记，如氘，它可以通过标记相关杂交瘤的营养物质掺入抗体。向生物体中引入(例如非肠道地，皮下地，或腹腔内地)用合适、可检测的成象部分如放射性同位素(例如，131I，112In，99mTc)，不透射线的物质，或通过核磁共振可检测的物质标记的蛋白质特异性抗体或抗体片段。受试者的大小和所用成象系统将决定产生诊断影像所需的成象部分的数量，这在本领域是可以理解的。在放射性同位素部分的情况下，注射的放射性活性量正常范围将是从约5到20毫居里的99mTc。然后，标记的抗体或抗体片段将优先在含有特异蛋白质的细胞位置处积累。在S.W.Burchiel等“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.”(Chapter 13 inTumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes主编，Masson Publishing Inc.(1982))中描述了体内肿瘤成象。这种方法同样可以用于植物。
因此，本发明提供了一种疾病诊断方法，包括(a)测定本发明多肽在生物体细胞或体液中的表达；(b)比较基因表达水平与标准基因表达水平，由此，与标准表达水平比较，测定的多肽基因表达水平的增加或减少预示疾病。
而且，本发明多肽可以用于疾病或疾病状态的治疗，检测和/或预防。例如，可以给生物体施用本发明多肽以替换缺乏或减少的多肽水平，以补充缺乏或减少的不同多肽的水平，以直接或间接抑制多肽的活性，以直接或间接(例如，通过结合受体)激活多肽的活性，通过与膜结合受体竞争自由配体以降低膜结合的受体的活性，或以产生期望的反应(例如，分化，生长，衰老，萌发的诱导等)。
类似地，与本发明多肽有关的抗体也可以用于治疗，预防和/或诊断疾病。例如，施用与本发明多肽有关的抗体能结合和减少多肽的过量产生。类似地，施用抗体，例如通过结合与膜(受体)结合的多肽能激活多肽。
至少，用本领域技术人员已知的方法，本发明多肽可以用做SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱的分子量标准参照物。做为评估宿主细胞转化的方法，多肽也可以用于产生抗体，接着抗体用于测定重组细胞的蛋白质表达。而且，本发明多肽也可以用于检测下面生物活性。转基因的方法
本发明的另一方面涉及治疗或预防失调，疾病和其它情况的基因治疗方法。基因治疗方法涉及向生物体，优选植物中导入核酸(DNA，RNA和反义DNA或RNA)序列以实现本发明多肽的表达。这个方法需要编码本发明多肽的多核苷酸与靶组织表达多肽必需的启动子和任何其它遗传元件可操作地连接。这种转基因和递送技术在本领域是已知的，参见例如，WO90/11092，在这里，并入这篇文献为参考文献。
因此，例如，可以离体条件下用多核苷酸(DNA或RNA)基因工程改造植物细胞，所述多核苷酸包含可操作地与本发明多核苷酸连接的启动子，然后将基因工程改造的细胞引回植物中以“治疗”缺陷。这种方法在本领域是已知的，同样可以用于植物。例如，参见Belldegrun等，J.Natl.Cancer Inst.，85：207-216(1993)；Ferrantini等，Cancer Research，53：107-1112(1993)；Ferrantini等，J.Immunology 153：4604-4615(1994)；Kaido，T.，等，Int.J.Cancer60：221-229(1995)；Ogura等，Cancer Research 50：5102-5106(1990)；Santodonato等，Human Gene Therapy 7：1-10(1996)；Santodonato等，Gene Therapy 4：1246-1225(1997)；和Zhang等，Cancer GeneTherapy 3：31-38(1996))，在这里，并入这些文献为参考文献。
如下文更详细所讨论的，可以通过递送物质到生物体细胞的任何方法，如生物轰击注射递送多核苷酸构建体进入植物组织(顶端分生组织，根，花，茎等等)。可以通过可接受的液体或含水载体递送多核苷酸构建体。
在一个实施方式中，以“裸”多核苷酸递送本发明多核苷酸。术语“裸”多核苷酸，DNA或RNA指没有任何递送载体的序列，所述递送载体起辅助，促进或有利于进入细胞的作用，包括病毒序列，病毒颗粒，脂质体制剂，脂质转染或沉淀试剂等等。然而，也可以在通过本领域技术人员已知方法制备的脂质体制剂和脂质转染制剂等中递送本发明多核苷酸。例如，在美国专利号5,593,972，5,589,466，和5,580,859中描述了这种方法，这里并入这篇文献为参考文献。
用在基因治疗方法中的本发明多核苷酸载体构建体优选是不整合进入宿主基因组，也不含有允许复制的序列的构建体。做为替代方案，本发明多核苷酸载体构建体可以整合进入宿主基因组，而且可以复制。适合的载体包括可从Stratagene得到的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；可从Pharmacia得到的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL；可从Invitrogen得到的pEF1/V5，pcDNA3.1，和pRc/CMV2。其它适合的载体对本领域技术人员是显而易见的。
本领域技术人员已知的任何强启动子都可以用于驱动本发明多核苷酸序列的表达。除了本领域已知和/或别处描述的任何其它启动子外，适合的启动子包括35S，34S，和肌动蛋白启动子。启动子也可以是本发明多核苷酸的天然启动子。
不同于其它基因治疗技术，引入裸核酸序列到靶细胞中的一个主要优点是在细胞中多核苷酸合成的短暂属性。研究表明，可以引入非复制的DNA序列到细胞中，以提供期望多肽的产生长达六个月。
优选的施用途径是通过非肠道注射途径进入组织的间隙空间。然而，也可以用其它的非肠道途径。此外，通过直接注射，可以递送裸DNA构建体到植物循环系统。
通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，在递送位点的直接针注射，局部施用，和所谓的“基因枪”，递送裸多核苷酸。这些递送方法在本领域是已知的。
也可以用递送载体，如病毒序列，病毒颗粒，脂质体制剂，脂质转染试剂，沉淀试剂等递送构建体。这些递送方法在本领域是已知的。
在一些实施方式中，在脂质体制剂中复合本发明多核苷酸构建体。用在本发明中的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷)，阴离子(带负电荷)和中性制剂。然而，因为在阳离子脂质体和多阴离子核酸间可以形成紧密电荷复合物，所以特别优选阳离子脂质体。已表明阳离子脂质体以起作用的形式介导质粒DNA的细胞内递送(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，84：7413-7416(1987)，这里并入这篇文献为参考文献)；mRNA的细胞内递送(Malone等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，86：6077-6081(1989)，这里并入这篇文献为参考文献)；纯化的转录因子的细胞内递送(Debs等，J.Biol.Chem.，265：10189-10192(1990)，这里并入这篇文献为参考文献)。
容易得到阳离子脂质体。例如，N[1-2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体特别有用，而且可以从GIBCO BRL，GrandIsland，N.Y.得到商标为Lipofectin的该脂质体(参见，Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，84：7413-7416(1987)，这里并入这篇文献为参考文献)。其它可以购得的脂质体包括转染剂(transfectace)(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
可以用本领域熟知技术从容易获得的材料制备其它阳离子脂质体。参见，例如，PCT公布号：WO 90/11092(这里并入这篇文献为参考文献)中DOTAP(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲铵)丙烷)脂质体合成的描述。在文献中(参见如Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，84：7413-7417，这里并入这篇文献为参考文献)说明了DOTMA脂质体的制备。可以用类似方法从其它阳离子脂质材料中制备脂质体。
类似地，如从Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)容易得到阴离子和中性脂质体，或用容易得到的材料可以容易地制备阴离子和中性脂质体。这种材料包括磷脂酰，胆碱，胆固醇，磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和其它。这些材料也可以与DOTMA和DOTAP起始材料以适合比率混合。
用这些材料制造脂质体的方法在本领域是已知的。例如，在有或无胆固醇添加的情况下，可以用购得的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的各种组合制造常规的脂质体。因此，例如，通过在氮气流中干燥DOPG和DOPC各50mg到超声处理小瓶中，可以制备DOPG/DOPC泡囊。在真空泵中放置样品过夜，第二天用去离子水水合样品。然后用配备有倒置杯子(水浴型)探针的Heat System Model 350超声发生器，在最大设定处，水浴在15EC循环时，在有盖的小瓶中超声样品2小时。作为替代方案，没有超声处理情况下产生多层泡囊，或通过核孔膜的挤出产生不连续大小的单层泡囊，可以制备带负电荷的泡囊。其它方法对本领域技术人员是已知和可得到的。
脂质体可以包括多层泡囊(MLVs)，小单层泡囊(SUVs)，或大单层泡囊(LUVs)，优选小单层泡囊(SUVs)。用本领域已知的方法制备各种脂质体核酸复合物。参见，例如，Straubinger等，Methods ofImmunology，101：512-527(1983)，这里并入这篇文献为参考文献。例如，可以通过在玻璃试管壁上沉淀薄层磷脂，随后用待被包裹材料的溶液水合沉淀的薄层磷脂，制备含有核酸的MLVs。通过MLVs的延长超声处理产生均质群的单层泡囊脂质体制备SUVs。将要包裹的材料加到预先形成的MLVs悬浮液中，然后超声。当用含有阳离子脂质的脂质体时，在适合的溶液，如无菌水或等渗缓冲溶液，如10mM Tris/NaCl中重悬浮干燥的脂质膜，超声，随后将预先形成的脂质体直接与DNA混合。由于带正电荷脂质体和阳离子DNA的结合，脂质体和DNA形成了非常稳定的复合物。发现SUVs可用于小核酸片段。通过本领域已知的许多方法制备LUVs。常用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta，394：483(1975)；Wilson等，Cell，17：77(1979))；乙醚注射(Deamer等，Biochim，Biophys.Acta，443：629(1976)；Ostro等Biochim.Biophys.Res.Commun.，76：836(1977)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348(1979))；去污剂透析(Enoch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：145(1979))；和反相蒸发(REV)(Fraley等，J.Biol.Chem.，255：10431(1980)；Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：145(1978)；Schaefer-Ridder等，Science，215：166(1982))，这里并入这些文献为参考文献。
一般地，DNA与脂质体的比率将从约10∶1到约1∶10。优选地，该比率将从约5∶1到约1∶5。更优选地，比率将从约3∶1到约1∶3。进一步更优选地，比率将是约1∶1。美国专利号5,676,954(这里并入为参考文献)对注射进小鼠中的与阳性脂质体载体复合的遗传物质做了报告。美国专利号4,897,355，4,946,787，5,049,386，5,459,127，5,589,466，5,693,622，5,580,859，5,703,055，和国际公布号：WO 94/9469(这里并入这些文献为参考文献)提供了用于转染DNA进入细胞和哺乳动物中的阳离子脂质。美国专利号5,589,466，5,693,622，5,580,859，5,703,055和国际公布号：WO 94/9469(这里并入这些文献为参考文献)提供了递送DNA-阳离子脂质复合物到哺乳动物的方法。这种方法对植物同样适用，而且属于本领域技术人员已知的范围。
在一些实施方式中，用包含RNA的逆转录病毒颗粒，离体或体内基因工程改造细胞，所述RNA包含编码本发明多肽的序列。以烟草基因组中副逆转录病毒(pararetrovirus)序列的鉴定为基础，检测到了出现在植物中的逆转录整合。因为这种检测到的整合出现在非常有限的整合位点，这种副逆转录病毒可能代表用于本发明多核苷酸的期望的遗传转化载体(Jakowitsch，J.，等，PANS96(23)：13241-6(1999)。
利用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞系的例子包括，但不限于如Miller，Human GeneTherapy，1：5-14(1990)中所述的PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN细胞系，这里完整并入所述的这篇文献为参考文献。通过本领域任何已知的方法，载体可以转导包装细胞系。这些方法包括，但不限于电穿孔，应用脂质体和CaPO4沉淀。在一个可替代方案中，逆转录病毒质粒载体可以包入脂质体中，或与脂质偶连，然后施用于宿主。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，所述感染性逆转录病毒载体颗粒包含编码本发明多肽的多核苷酸。然后在体外或体内，可以利用这种逆转录载体颗粒转导真核细胞。转导的真核细胞然后将表达本发明的多肽。
本发明也包括将反转录转座子应用于植物遗传转化。反转录转座子将优选代表具有已知植物宿主范围的反转录转座子和将包含编码本发明多肽的多核苷酸。本领域已知许多反转录转座子，Bennetzen JL，Trends Microbiol.，4(9)：347-53(1996)描述了一些反转录转座子，因此这里并入所述这篇文献为参考文献。
另一个基因治疗方法包括通过同源重组可操作地连接异源控制区和内源多核苷酸序列(例如，编码目的多肽序列)，(参见，例如美国专利号：5,641,670，1997年6月24日颁发；国际公布号：WO96/29411，1996年9月26日公布；国际公布号：WO 94/12650，1994年8月4日公布；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature，342：435-438(1989)。这种方法包括存在于靶细胞中的基因的激活，但这个基因在该细胞中正常不表达，或以比期望水平低的水平表达。
用本领域已知标准技术制备多核苷酸构建体，所述构建体包含在启动子侧翼有导向序列的启动子。这里描述了适合的启动子。导向序列与内源序列充分互补以允许启动子-导向序列与内源序列同源重组。导向序列非常靠近期望的内源多核苷酸序列的5’末端，这样当发生同源重组时，启动子将可操作地与内源序列连接。
可以用PCR扩增启动子和导向序列。优选地，扩增的启动子在5’和3’末端上含有不同的限制酶位点。优选地，第一导向序列3’末端含有与扩增的启动子5’末端相同的限制性酶位点，第二导向序列5’末端含有与扩增的启动子3’末端相同的限制性位点。消化扩增的启动子和导向序列，将它们连接在一起。
给细胞递送启动子-导向序列构建体，所述构建体或是作为裸多核苷酸，或与上文更详细描述的有利于转化的试剂，如脂质体，病毒序列，病毒颗粒，整个病毒，脂质转染试剂，沉淀试剂等结合。通过任何方法，包括直接针注射，静脉内注射，局部施用，输注，粒子加速器等，可以递送P启动子-导向序列。下文将更详细描述这些方法。
细胞摄取启动子-导向序列构建体。在构建体和内源序列间发生同源重组，这样内源序列置于启动子控制之下。然后，启动子驱动内源序列的表达。
优选地，编码本发明多肽的多核苷酸包含有利于蛋白质分泌的分泌信号序列。通常，信号序列位于待表达的多核苷酸的编码区，在编码区5’末端或5’末端之前。信号序列与目的多核苷酸可以是同源或异源的，与被转化的细胞可以是同源或异源的。此外，可以用本领域已知的方法化学合成信号序列。
只要任何上述多核苷酸构建体的任何施用方式引起了一个或多个分子以足以提供治疗效果的量表达，就可以用这种施用方式。这包括直接针注射，系统注射，输注，生物轰击注射器，粒子加速器(即“基因枪”)，明胶海绵储存，其它购得的储存材料，渗透泵(例如，Alza微型真空泵)，倾析或局部施用。例如，直接注射裸磷酸钙沉淀的质粒进入大鼠肝和大鼠脾脏或直接注射蛋白质包被的质粒进入门静脉引起了外源基因在大鼠肝中的基因表达。(Kaneda等，Science，243：375(1989))。而且，在植物中已经报道了裸DNA的直接注射，本发明包含裸DNA的直接注射(Davey MR，等Plant Mol.Biol，13(3)：273-85(1989)，和Potrykus I，Ciba Found Symp，154：198-212(1990))。
局部施用的优选方法是通过直接注射。优选地，与递送载体复合的本发明重组分子通过直接注射施用至或局部施用给生物体循环系统区域(例如韧皮部，木质部等)内。组合物局部施用给生物体循环系统区域内指注射组合物到生物体循环系统内数厘米，优选数毫米。
另一个局部施用方法是在外科创伤或嫁接处里或周围接触本发明多核苷酸构建体。例如，可以在伤口内的组织表面包被多核苷酸构建体或可以注射构建体进入伤口内的组织区。
在系统施用中有用的治疗组合物包括与本发明导向递送载体复合的本发明的重组分子。用于系统施用中适合的递送载体包括脂质体，所述脂质体含有靶向载体到特定位点的配体。
系统施用的优选方法包括注射，气雾剂，经皮的(局部的)递送。用本领域的标准方法可以进行注射。气雾剂递送也可以用本领域标准方法进行(参见，例如，Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，189：11277-11281(1992)，这里并入这篇文献为参考文献)。可以通过混合本发明多核苷酸构建体和亲脂试剂(例如，DMSO)进行局部递送，所述亲脂试剂具有通过皮肤的能力。
被递送物质的有效量的确定可能取决于许多因素，包括，例如该物质的化学结构和生物活性，植物或动物的年龄和重量，需要治疗的精确情况和其严重程度，及施用的途径。治疗的频率取决于许多因素，如每个应用施用的多核苷酸构建体的量，及多核苷酸和多肽的半衰期(即应用的有效期)。应为每个期望的应用确定确切的量，应用的次数和应用的时间。
可以给任何生物体，优选植物施用本发明的治疗组合物。除了本领域已知的和本文其它地方更具体地提到的其它植物(例如，表3)以外，优选的植物可以包括下面非限制性例子，包括大麦，燕麦，黑麦，高粱，豌豆，向日葵，烟草，棉花，矮牵牛，西红柿，嫩茎花椰菜，莴苣，苹果，李子，桔子和柠檬，而且更优选稻，玉米，conola，小麦，甜菜，甘蔗和大豆。
而且，本发明包含转基因细胞，包括但不限于引入了编码本发明多肽的基因的种子，生物体和植物。引入本发明多核苷酸，编码本发明多肽的多核苷酸，在保藏物中包含的cDNA，和/或其中片段和变异体的适合受体植物的非限制性例子列于下面表3。
表3
受体植物
| 俗名 | 科 | 拉丁名称 |
| 玉米 | 禾本科 | Zea mays(玉蜀黍) |
| 臼齿形玉米 | 禾本科 | Zea mays dentiformis |
| 硬质种玉米 | 禾本科 | Zea mays vulgaris |
| pop玉米 | 禾本科 | Zea mays microsperma |
| 质种玉米 | 禾本科 | Zea mays amylacea |
| 甜玉米 | 禾本科 | Zea mays amyleasaccharata |
| 甜玉米 | 禾本科 | Zea mays saccharate |
| 蜡质种玉米 | 禾本科 | Zea mays ceratina |
| 斯佩耳特小麦 | pooideae | Triticum spelta(斯佩耳特小麦) |
| 硬质小麦 | pooideae | Triticum durum(硬粒小麦) |
| 英国小麦 | pooideae | Triticum turgidum(圆柱小麦) |
| 大斯佩耳特小麦 | pooideae | Triticum spelta(斯佩耳特小麦) |
| 波兰小麦 | pooideae | Triticum polonium |
| Poulard小麦 | pooideae | Triticum turgidum(圆柱小麦) |
| 单粒小麦 | pooideae | Triticum monococcum(一粒小麦) |
| 小斯佩耳特小麦 | pooideae | Triticum monococcum(-粒小麦) |
| 软质小麦 | pooideae | Triticum aestivum(普通小麦) |
| 水稻 | 禾本科 | Oryza sativa(稻) |
| 美国野生水稻 | 禾本科 | Zizania aquatica(菰) |
| 澳大利亚水稻 | 禾本科 | Oryza australiensis |
| 印度水稻 | 禾本科 | Zizania aquatica(菰) |
| 红米 | 禾本科 | Oryza glaberrima |
| 塔斯卡洛拉(Tuscarora)水稻 | 禾本科 | Zizania aquatica |
| 西非水稻 | 禾本科 | Oryza glaberrima |
| 大麦 | pooideae | Hordeum vulgare |
| 阿比西尼亚中部(Abyssinianintermediate)大麦，也即不规则大麦 | pooideae | Hordeum irregulare |
| 野生二行大麦 | pooideae | Hordeum spontaneum(钝稃野大 |
| 麦) | ||
| 三叉大麦 | pooideae | Hordeum trifurcatum |
| 埃及大麦 | pooideae | Hordeum trifurcatum |
| 四行大麦 | pooideae | Hordeum vulgare polystichon |
| 六行大麦 | pooideae | Hordeum vulgare hexastichon |
| 两行大麦 | pooideae | Hordeum distichon(栽培二棱大麦) |
| abroma棉 | 双子叶植物纲 | Abroma augusta |
| 美国陆地棉 | 锦葵科(Malvaceae) | Gossypium hirsutum(陆地棉) |
| 亚洲树棉，即印度树棉 | 锦葵科 | Gossypium arboreum(树棉) |
| 巴西棉，即秘鲁棉，和pernambuco棉 | 锦葵科 | Gossypium barbadensebrasiliense(巴西海岛棉) |
| 草棉 | 锦葵科 | Gossypium herbaceum(草棉) |
| 长丝光木棉，长绒棉，海岛棉 | 锦葵科 | Gossypium barbadense(海岛棉) |
| 墨西哥棉，粗绒棉 | 锦葵科 | Gossypium hirsutum(陆地棉) |
| 大豆 | 豆科 | Glycine max(大豆) |
| 甜菜 | 藜科 | Beta vulgaris altissima |
| 甘蔗 | 木本植物 | Arenga pinnata(桄榔) |
| 番茄 | 茄科 | Lycopersicon esculentum(番茄) |
| 樱桃番茄 | 茄科 | Lycopersicon esculentumcerasiforme |
| 普通番茄 | 茄科 | Lycopersicon esculentumcommune |
| 醋栗番茄 | 茄科 | Lycopersiconpimpinellifolium |
| 灌木樱 | 茄科 | Physalis ixocarpa |
| Hyenas番茄 | 茄科 | Solanum incanum |
| 梨果番茄 | 茄科 | Lycopersicon esculentumpyriforme |
| 树番茄 | 茄科 | Cyphomandra betacea |
| 马铃薯 | 茄科 | Solanum tubrosum(马铃薯) |
| 西班牙马铃薯，甘薯 | 旋花科 | Ipomoea batatas(甘薯) |
| 普通黑麦 | Pooideae | Secale cereale(黑麦) |
| 山黑麦 | Pooideae | Secale montanum(山黑麦) |
| 铃状椒 | 茄科 | Capsicum annuum grossum |
| 野生种辣椒，即几内亚辣椒 | 茄科 | Capsicum annuum minimum |
| bonnet椒 | 茄科 | Capsicum sinense |
| 柿子(bullnose)椒，甜椒 | 茄科 | Capsicum annuum grossum |
| 五色椒 | 茄科 | Capsicum annuum cerasiforme |
| 串(cluster)椒，即红串(redcluster)椒 | 茄科 | Capsicum annuum fasciculatum |
| 天椒 | 茄科 | Capsicum annuum conoides |
| 山羊(goat)椒，即spur pepper | 茄科 | Capsicum frutescens(小米椒) |
| 荜拨 | 茄科 | Capsicum frutescens longum |
| 观赏性红椒，即皱纹(wrinkled)椒 | 茄科 | Capsicum annuum abbreviatum |
| 塔巴斯科红辣椒 | 茄科 | Capsicum annuum conoides |
| 莴苣 | 菊科 | Lactuca sativa(莴苣) |
| 莴笋，即直立莴苣 | 菊科 | Lactuca sativa asparagina |
| 蓝莴苣(blue lettuce) | 菊科 | Lactuca perennis(蓝化莴苣) |
| 蓝莴苣，菊苣 | 菊科 | Lactuca pulchella |
| 结球莴苣，即卷心莴苣 | 菊科 | Lactuca sativa capitata |
| 直立莴苣，长叶莴苣，罗马莴苣 | 菊科 | Lactuca sativa longifolia |
| 皱叶(crinkle，curled)莴苣，刈叶莴苣，散叶莴苣 | 菊科 | Lactuca sativa crispa |
| 芹菜 | 伞形科 | Apium graveolens dulce |
| 黄化(blanching)，即菜用芹菜 | 伞形科 | Apium graveolens dulce |
| 根(root)芹菜，芜菁根形芹菜 | 伞形科 | Apium graveolens rapaceum |
| 菜用茄子 | 茄科 | Solanum melongena(茄) |
| 高梁 | 蜀黍属 | 所有作物物种 |
| 苜蓿 | 豆科 | Medicago sativum |
| 胡萝卜 | 伞形科 | Daucus carota sativa |
| 蔓菜豆 | 豆科 | Phaseolus vulgarisvulgaris(菜豆) |
| 芽豆(sprouts bean) | 豆科 | Phaseolus aureus(直生刀豆) |
| 巴西蚕豆 | 豆科 | Canavalia ensiformis |
| 蚕豆 | 豆科 | Vicia faba(蚕豆) |
| 菜豆，四季豆，青刀豆，芸豆 | 豆科 | Phaseolus vulgaris(菜豆) |
| 埃及豆(Egyptian bean) | 豆科 | Dolichos lablab(扁豆) |
| 长豆，即裙带豆 | 豆科 | Vigna sesquipedalis(长豇豆) |
| 四棱豆 | 豆科 | Psophocarpus tetragonolobus(四棱豆) |
| 燕麦，即普通燕麦，分枝(side)燕麦，树形(tree)燕麦 | 燕麦属 | Sativa |
| 黑燕麦，即芒刺(bristle)燕麦，偏冠(lopsided)燕麦 | 燕麦属 | Strigosa |
| 芒刺燕麦 | 燕麦属 | |
| 豌豆，即菜用豌豆，嫩豌豆，壳(shelling)豌豆 | 豆科 | Pisum，sativum sativum |
| 豇豆 | 豆科 | Vigna sinensis(豇豆) |
| 食荚(edible podded)豌豆 | 豆科 | Pisum sativum axiphium |
| 灰豌豆 | 豆科 | Pisum sativum speciosum |
| 有翼(winged)豌豆 | 豆科 | Tetragonolobus purpureus |
| 皱粒豌豆 | 豆科 | Pisum sativum medullare |
| 向日葵 | 菊科 | Helianthus annuus(向日葵) |
| 笋瓜(Autumn，winter squash) | 双子叶植物纲 | Cucurbita maxima(笋瓜) |
| 密生西葫芦，即矮生西葫芦 | 双子叶植物纲 | Cucurbita pepo melopepo |
| 涡纹(turban)南瓜 | 双子叶植物纲 | Cucurbita maximaturbaniformis |
| 黄瓜 | 双子叶植物纲 | Cucumis sativus(黄瓜) |
| 非洲黄瓜，也是苦瓜 | Monordica charantia(苦瓜) | |
| 喷瓜，也是野黄瓜 | Ecballium elaterium(喷瓜) | |
| 野黄瓜 | Cucumis anguria | |
| 加利福尼亚杨 | 木本植物 | Populus trichocarpa |
| 欧洲黑杨， | Populus nigra(黑杨) | |
| 灰杨 | Populus canescens(银灰杨) | |
| 钻天杨 | Populus italica | |
| 银叶杨，也即白杨 | Populus alba(银白杨) | |
| 西部香脂扬 | Populus trichocarpa | |
| 烟草 | 茄科 | Nicotiana(烟草属) |
| 拟南芥 | 十字花科 | Arabidopsis thaliana(鼠耳芥) |
| 草皮草 | 黑麦草属 | |
| 草皮草 | Agrostis(剪股颖属) | |
| 草皮草的其它科 | ||
| 三叶草 | 豆科 |
生物学活性
本发明的多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂可以用于各种测试中以检测一个或多个生物学活性。如果这些多核苷酸和多肽确实在特定测试中显示了活性，则这些分子可能参与了与该生物活性相关的疾病。因此，能用该多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂治疗相关疾病。
过度增生性疾病
可以用本发明的多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂检测，预防和/或提供抗性抵抗过度增生疾病，失调，和/或病症，包括，但不限于溃疡，瘿瘤，肿瘤，附着孢等。通过直接或间接的相互作用，本发明多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂可以抑制失调的增生。做为替代方案，本发明的多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂可以增生能抑制过度增生失调的其它细胞。
用本发明和/或其蛋白质融合物或片段，通过基因治疗，一个优选实施方式利用了本发明的多核苷酸抑制异常细胞分裂。
因此，通过插入本发明多核苷酸到异常增生细胞中，本发明提供了治疗或预防细胞增生疾病，失调和/或其它情况的方法，其中所述多核苷酸阻抑所述的表达。
本发明的另一个实施方式提供了治疗或预防生物体中细胞增生疾病，失调，和/或其它情况的方法，包括给异常增生的细胞或细胞群施用本发明的一个或多个活性基因拷贝。在优选实施方式中，本发明多核苷酸是包含重组表达载体的DNA构建体，所述重组表达载体可有效表达编码所述多核苷酸的DNA序列。在本发明的另一个优选实施方式中，用逆转录病毒载体，或更优选地，植物的基于反转录转座子的载体向待处理的细胞中插入编码本发明多核苷酸的DNA构建体。在最优选实施方式中，病毒载体是缺陷的，不转化非增生细胞，仅仅转化增生细胞。而且，在优选实施方式中，可以通过外部刺激(即，磁的，特异小分子，化学物质，或药物的施用等)调节单独地，或与其它多核苷酸联合或融合地插入增生细胞的本发明多核苷酸，这些外部刺激作用于所述多核苷酸上游的启动子，诱导编码蛋白质产物的表达。同样地，可以基于所述的外部刺激表达调节(即，增加，减少，或抑制本发明的表达)本发明有益的治疗作用。
本发明多核苷酸可以用于阻抑增生基因或抗原的表达。“阻抑增生基因表达”是指该基因转录的抑制，基因转录物(前信使RNA)的降解，剪接的抑制，信使RNA的破坏，蛋白质翻译后修饰的阻止，蛋白质的破坏，或蛋白质正常功能的抑制。
对于给异常增生细胞的局部施用，可以通过本领域技术人员已知的任何方法，包括，但不限于转化，电穿孔，细胞的微注射，用载体，如脂质体，脂质转染试剂，或以裸多核苷酸的形式，或者说明书中所述的任何其它方法施用本发明的多核苷酸。可以通过已知的基因递送系统，如，但不限于逆转录病毒载体(Gilboa，J.Virology44：845(1982)；Hocke，Nature 320：275(1986)；Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：3014)，痘苗病毒系统(Chakrabarty等，Mol.Cell Biol.5：3403(1985))或本领域技术人员已知的其它有效的DNA递送系统(Yates等，Nature 313：812(1985))递送本发明的多核苷酸。这些参考文献仅仅是示例性的，特此并入为参考文献。为了特异性递送或转化异常增生的细胞和不伤害非分裂的细胞，优选利用本领域技术人员已知的逆转录病毒，和植物基于反转录转座子的载体(如本领域和本文其它地方所述)递送系统。因为逆转录病毒DNA整合要求宿主DNA复制，所以逆转录病毒由于缺乏其生命周期所需的逆转录病毒基因将不能自我复制。本发明多核苷酸利用这种逆转录递送系统将靶向所述基因和构建体于异常增生的细胞，而且将不伤害非分裂的细胞。
通过用影象装置可以直接给植物体中细胞增生失调/疾病位点递送本发明的多核苷酸，所述影象装置用于指导注射针直接到达疾病位点。也可以在嫁接等时，给疾病位点施用本发明的多核苷酸。
“细胞增生疾病”意思是影响器官，腔，或机体部分的任何一个或任何联合的任何疾病或失调，所述疾病或失调的特征在于细胞，细胞群，或组织的单个或多个局部异常增生。
只要本发明多核苷酸的量对治疗细胞的增生有生物抑制作用，就可以施用任何量的本发明多核苷酸。而且，可以给相同位点同时施用一个以上的本发明多核苷酸。“生物抑制”意思是部分或全部的生长抑制，及细胞的增生速率或生长率的降低。可以通过评估本发明多核苷酸对组织培养中靶或异常增生细胞生长，或植物和细胞培养中肿瘤生长的效果，或本领域技术人员已知的任何其它方法确定生物抑制的剂量。
本发明进一步涉及基于抗体的治疗，包括给植物施用抗多肽和抗多核苷酸的抗体以检测，预防，和/或提供抗性抵抗一个或多个所述的疾病，失调，和/或其它情况。在本文其它地方详细描述了产生抗多肽和抗多核苷酸抗体的多克隆和单克隆抗体的方法。如本领域所知和这里所述，可以在药物可接受的组合物中提供这种抗体。
可以治疗地使用本发明抗体的方法的概述包括在机体中局部或系统地结合本发明多核苷酸或多肽，或通过抗体的直接细胞毒性，例如，如通过补体(CDC)或效应细胞(ADCC)介导的抗体细胞毒性。下文将更详细描述这些方法中的一些方法。根据这里提供的教导，不用过多的试验，本领域技术人员将知道如何用本发明抗体进行诊断，检测或治疗目的。
具体地，本发明的抗体，片段和衍生物对于检测，预防，和/或提供抗性抵抗有或正在发展这里所述的细胞增生和/或分化疾病，失调，和/或其它情况的植物是有用的。这种治疗包括施用单或多剂量的抗体，或其片段，衍生物，或缀合物。
通过本发明抗体与例如起到增加与抗体相互作用的效应细胞数量或活性的其它单克隆或嵌合抗体联合，或与细胞激动素或植物生长因子联合，可以有利地利用本发明的抗体。
对于涉及的免疫测定法和与本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)有关的疾病，失调，和/或其它情况的治疗，优选应用高亲和性和/或体内有效抑制和/或中和性的抗本发明多肽或多核苷酸的抗体，其片段或区域。将优选对多核苷酸，或多肽(包括其片段)有亲和力的这种抗体，片段或区域。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M的那些。
通过细胞程序死亡的诱导，本发明的多肽，包括蛋白质融合，或其片段可以用于抑制增生细胞或组织。所述多肽可以直接或间接起作用以诱导增生细胞或组织的细胞程序死亡。在植物中已描述了细胞程序死亡，认为通过与动物中细胞程序死亡诱导类似的机理调节植物中细胞程序死亡(参见，例如，LoSchiavo F，等，Eur J Cell Biol.，79(4)：294-8(2000)；and Tian R，等，FEBS Lett.，474(1)：11-15(2000))。
而且，在本发明另一个优选实施方式中，所述多肽可以通过其它机理，如将激活细胞程序死亡的其它蛋白质(例如，caspase 3，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等)的激活，或通过单独地或与小分子药物或佐剂，如apoptonin，galectin，硫氧还蛋白，抗炎作用蛋白质联合刺激所述蛋白表达(参见，例如Mutat Res 400(1-2)：447-55(1998)，Med Hypotheses.50(5)：423-33(1998)，Chem Biol Interact.Apr24；111-112：23-34(1998)，J Mol Med.76(6)：402-12(1998)，Int JTissue React；20(1)：3-15(1998)，并入所有这些文献为参考文献)诱导细胞程序死亡。
在另一个实施方式中，本发明提供了递送包含本发明多肽的组合物(例如，含有与异源多肽，异源核酸，毒素或前体药物结合的多肽或多肽抗体的组合物)给表达本发明多肽的靶细胞的方法。通过疏水，亲水，离子和/或共价相互作用，本发明多肽或多肽抗体可以与异源多肽，异源核酸，毒素或前体药物结合。
本发明的多肽，蛋白质融合物或其片段在直接或间接增强增生细胞或组织对所述抗原和免疫原的免疫原性和/或抗原性方面是有用的。
传染疾病
传染因子可以抑制植物维持植物体内稳态和/或细胞体内稳态的全部能力。例如，传染因子可以抑制植物控制细胞分裂，分化，和发育；和从土壤中吸收矿物质和水，和这些物质在植物全身转移；光合作用和光合作用产物转位到使用或贮藏区域；合成化合物的新陈代谢；繁殖；和用于植物越冬和繁殖的食品贮藏等的能力。
引起疾病的因子常常削弱或破坏患病植物的受侵袭的细胞和组织。因此，降低或完全抑制了这种感染细胞和组织进行正常生理功能的能力，引起细胞或植物死亡。受侵袭组织的类型决定了受影响的生理功能。例如，根部的感染(例如，根腐烂)，干扰了从土壤中水分和营养物质的吸收；木质部导管的感染(例如，导管枯萎，溃疡等等)干扰了水或矿物质转位到植物的冠部；叶子的感染(例如，叶子斑点，枯萎病，花叶病)干扰了光合作用；皮层的感染(例如，皮层溃疡，韧皮部的病毒和支原体感染等)干扰了光合作用产物的向下的转位；花的感染(例如，细菌和真菌枯萎病，花的病毒，支原体，和真菌感染等)干扰了繁殖；果实的感染(例如，果实腐烂等等)干扰了繁殖或为新植物储备食品的贮藏。上面所列的感染特性和/或症状是示例性的，不应该解释为限制本发明。其它的感染性状是本领域已知的，在本文其它地方描述了一些感染性状(参见，例如，Agrios，G.N.，在“Plant Pathology”，第3版，Academic Press，Inc.，(1988)中；据此，这里完整地并入这篇文献为参考文献)。
病毒是能够引起疾病或症状的感染因子的一个实例，这些疾病或症状能被本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，和/或提供抗性抵抗。病毒的例子，包括但不限于下面的DNA和RNA病毒和病毒科：虫媒病毒属，腺病毒科，沙粒病毒科，动脉炎病毒属，双RNA病毒科，布尼亚病毒科，杯状病毒科，Circoviridae，冠状病毒科，登革热病毒，EBV，HIV，黄病毒科，嗜肝DNA病毒科(肝炎)，疱疹病毒科(如，巨细胞病毒，单纯疱疹，带状疱疹)，Mononegavirus(例如，副粘病毒科，麻疹病毒，弹状病毒科)，正粘病毒科(例如，甲型流感，乙型流感和副流感)，乳头瘤病毒，乳多空病毒科，细小病毒科，小RNA病毒科，痘病毒科(如天花，痘苗病毒)，呼肠孤病毒科(轮状病毒)，逆转录病毒科(HTLV-1，HTLV-II，慢病毒属)，和披膜病毒科(例如，风疹病毒)。其它病毒的例子，包括但不限于下面的烟草花叶病毒组(例如，烟草花叶病)，烟草脆裂病毒组(例如，烟草脆裂病毒)，大麦病毒组(例如，大麦条纹花叶病)，马铃薯X病毒组(例如，马铃薯X病毒)，香石竹潜病毒组(例如，香石竹潜病毒)，马铃薯Y病毒组(例如，马铃薯Y病毒)，线形病毒组(例如，甜菜黄化病毒)，玉米褪绿矮缩病毒，烟草坏死病毒，芜菁黄花叶病毒组(例如，芜菁黄花叶病毒)，番茄丛矮病毒组(例如，番茄丛矮病毒)，南方菜豆花叶病毒组(南方菜豆花叶病毒)，黄矮病毒组(例如大麦黄矮病毒)，豇豆花叶病毒组(例如，豇豆花叶病毒)，线虫传多面体病毒组(例如，烟草环斑病毒)，豇豆耳突花叶病毒，香石竹病毒组(例如，香石竹环斑病毒)，南瓜花叶病毒组(例如，黄瓜花叶病毒)，雀麦草花叶病毒组(雀麦草花叶病毒)，等轴不稳定环斑病毒组(例如，烟草线条病毒)，紫花苜蓿花叶病，番茄斑萎病毒，弹状病毒科(例如，莴苣坏死黄化病毒)，Rioviridae(例如，伤瘤病毒)，双生病毒群(例如，玉米线条病毒)，和花椰菜花叶病毒组(例如，花椰菜花叶病毒)。能感染植物或动物的其它病毒是本领域已知的(参见，例如，G.N.，Agrios，上文，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”，第4版，Lea and Febiger，Philadelphia，(1972)。
在这些科范围内的病毒能引起各种疾病和症状，一般包括，但不限于：花叶，环斑，矮缩，矮化，叶子卷曲，黄化，线条化，痘，耳突，肿瘤，茎陷斑，畸花(Aspermy)，不育，果实陷斑，茎的倒伏和变形；具体包括，但不限于烟草花叶病，菜豆花叶病，苹果花叶病，梨环形花叶病，玉米矮缩花叶病，郁金香碎色，烟草环斑，李属坏死环斑，洋榆环斑，菊环斑，丁香环斑，越桔环斑，甜菜黄化，小麦条纹花叶，烟草蚀纹，叶脉耳突，明脉症，沿脉变色，叶脉坏死，马铃薯叶片卷曲，葡萄扇叶，番茄带化，矮缩，香蕉束顶，柑橘衰退，可可豆肿枝，茎凹陷斑，苹果扁枝，梨粗皮，茎坏死，嫁接褐色线，樱桃黑溃疡，洋榆同心纹溃疡，柑橘木瘤，三叶草伤瘤，苹果赤褐色环，苹果疤状皮，梨石果，斑萎蔫等等。病毒也可以导致降低的光合作用，每片叶片降低的叶绿素，降低的光合作用，每片叶片降低的叶绿素，降低的叶绿素效率，植物激素产生的降低，降低的生长速率，降低的可溶氮，降低的碳水化合物水平，呼吸的增加或降低，异常的植物新陈代谢，减少水分的转位，减少的营养物质的保留，增加的蒸腾，降低的产量，植物的调节转录，植物的调节翻译，及异常的细胞新陈代谢。病毒感染引起的其它症状是本领域已知的(参见，例如，G.N.，Agrios，上文；Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”中，第4版，Lea和Febiger，Philadelphia，(1972)中；和在“Viral andRickettsial Infection of Animals”，编辑，Betts，A.O.，和York，C.J.，Academic Press，NY，(1967))。可以用本发明多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂直接或间接检测，预防，和/或提供抗性抵抗这些性状或疾病中任何一种。例如，当在植物中转基因过度表达时，本发明多核苷酸或多肽可以直接抑制失调或感染。做为替代方案，例如，本发明多核苷酸或多肽通过抑制病毒在植物间传播感染的能力，可以直接抑制失调或感染。
如上述所推断的，植物病毒感染可以通过多种机理传播，这些机理包括，但不限于：通过植物繁殖传播，通过汁液机械传播，种子传播，花粉传播，昆虫传播，螨传播，线虫传播，真菌传播，和菟丝子传播。可以用本发明多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂直接或间接检测，预防，抑制，和/或提供抗性抵抗任何一种这些病毒传播机理。
类似地，可以通过本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，和/或提供抗性抵抗能在植物或动物中引起疾病或症状的细菌因子。这种细菌因子的例子包括，但不限于下列：革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，细菌科或真菌类：芽孢杆菌科(例如，炭疽，梭菌属)，拟杆菌科，芽生菌，博德特氏菌属，疏螺旋体属(例如，布氏疏螺旋体)，布鲁氏杆菌，念珠菌，弯曲杆菌属，球孢子菌，隐球菌，Dermatocycoses，大肠杆菌(例如，产肠毒素大肠杆菌和肠出血大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli))，肠杆菌科(克雷伯氏菌属，沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌)，沙雷氏菌属，耶尔森氏菌属)，丹毒丝菌属，螺杆菌属，军团菌，钩端螺旋体，李斯特菌属，支原体目，麻风分支杆菌，霍乱杆菌，奈瑟氏球菌科(例如，不动杆菌属，淋菌，Menigococcal)，Meisseria meningitidis，巴斯德氏菌科感染(例如，放线杆菌属，Heamophilus(例如，Heamophilus influenza type B)，巴斯德氏菌属)，假单胞菌属，立克次氏体科，衣原体科，梅毒，志贺氏菌属，葡萄球菌，Meningiococcal，肺炎球菌，链球菌(例如，肺炎链球菌，B族链球菌)。细菌因子的其它例子包括，例如土壤杆菌属，棍状杆菌属，欧文氏菌属，假单孢菌属，黄单孢菌属，链霉菌属，土杆菌属，支原体属，无胆甾原体属和螺原体属。能够感染植物或动物的其它细菌因子的例子是本领域已知的(参见，例如G.N.Agrios，上文，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”，第四版，Lea和Febiger，Philadelphia，(1972))
在前述任何科范围内的细菌因子能引起各种疾病或症状，一般包括，但不限于：叶斑，叶枯萎，软腐(例如，果实，根，和贮藏器官的软腐)，萎蔫病，过度生长，疮痂，溃疡，小结节，瘿瘤，黄化，韧皮部坏死，X-疾病，束化和发根；具体地，例如，冠瘿瘤，细枝瘿瘤，甘蔗瘿瘤，马铃薯环腐，西红柿溃疡和萎蔫，香蕉萎蔫芽枯萎，插支腐烂，黑色脉序，鳞茎腐烂，柑橘溃疡，核桃疫，马铃薯疮痂，甘薯茎溃疡，烟草野火，菜豆枯萎，黄瓜角斑，棉花角斑，禾谷枯萎，草枯萎，西红柿细菌斑点，辣椒细菌斑点，有核果实细菌斑，细菌维管萎蔫，葫芦细菌萎蔫，梨火疫，苹果火疫，马铃薯环腐，茄属植物的南方细菌萎蔫，香蕉的Moko病，有核果实树的流胶病，葡萄的Pierce’s病，洋李叶灼，苜蓿细菌矮化，假性桃子，杏仁叶灼，截根苗矮缩，三叶草棒叶，翠菊黄化，巨芽，苹果疯枝，桃黄化，苹果胶木，梨衰退，洋榆韧皮坏死，椰子死黄，柑橘tubborn，降低的光合作用，每片叶片降低的叶绿素，降低的叶绿素效率，植物激素产量的降低，降低的生长速率，降低的可溶氮，降低的碳水化合物水平，呼吸的增加或降低，异常的植物新陈代谢，减少水分的转位，减少的营养物质的保留，增加的蒸腾，降低的产量，植物的调节转录，植物的调节翻译，及异常的细胞新陈代谢和玉米矮缩。细菌因子引起的其它症状和疾病在本领域是已知的(参见，例如G.N.，Agrios，上文，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”，第四版，Lea和Febiger，Philadelphia，(1972)中。可以直接或间接利用本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂检测，预防和/或抵抗这些症状或疾病中任一种。
类似地，用本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可以检测，预防能在植物或动物中引起疾病或症状的真菌因子，和/或提供给植物抗该真菌因子的抗性。这种真菌因子的例子包括，但不限于以下：放线菌目(例如，棒状杆菌属，分支杆菌属，诺卡氏菌属，新型隐球酵母，曲霉病，粘菌门(例如，粘菌纲(煤绒菌属，复囊钙皮菌属，绒孢菌属，绒泡粘菌目(Physarales)等)和根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)(根肿菌属(例如芸薹根肿菌)，多粘菌属(例如，P.gramminis等)，粉痂菌属(例如，粉疮痂菌(Spongosposasubteranea)等))，真菌门(例如，鞭毛亚门(Mastigomycotina)，壶菌纲(例如，芸苔油壶菌，玉蜀黍节壶菌，内生集壶菌，苜蓿尾囊壶菌等)，卵菌纲，水霉目(Saprolegniales)(例如，丝囊霉属等)，Peronosporales，Pythiaceae，腐霉属(例如，蔓延疫霉等)，白绣菌科(例如蔬菜白绣菌等)，霜霉科(例如葡萄生单轴霉，菸草霜霉，莴苣盘梗霉，禾生指梗霉和古巴拟霜霉菌等)，接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，根腐属(例如，葫芦笄霉等)，内囊霉目，内囊霉属，子囊菌亚门，半子囊菌纲，内孢霉目(例如，酿酒酵母等)，外囊菌属，Pytenomycetes，白粉菌目(例如，白粉菌属，Microsphaera，苹果白粉病柄球菌，蔷薇单丝壳菌(Spaerotheca pannosa)，葡萄白粉病钩丝壳霉等)，球壳菌目(例如Botryosphaeria obtusa，长啄壳属)，Diaporthe，寄生疫病霉，Eutypa armeniacae，苹果枯腐病霉，日规壳属(Gnomonia)，Hypoxylon mammatum，座坚壳菌属，黑腐皮壳菌属，炭角菌属，等)，肉座菌目(例如，紫瘢麦角菌，赤霉属，丛赤壳菌属等)，腔菌纲(Loculoascomycetes)，多腔菌目(例如，痂囊腔菌属等)，座囊菌目(Dothideales)(例如Capnodium，Didymella，皮委里球座菌，Microcyclus elei，Plowrightia morbosum等)，格孢腔菌目(Pleosporales)(例如，禾旋孢霉(Cochliobolussativus)，禾顶囊壳菌，核腔菌属，苹果黑星菌，等)，盘菌纲，星裂盘菌目(例如，槭斑痣盘菌)，柔膜菌目(例如，玫瑰双壳，Higginsiahiemalis，散斑壳菌属(Lophodermium)，果生链核盘菌，三叶草假盘菌(Pseudopeziza trifolii)，油菜核盘菌等)，半知菌亚门，腔孢纲(Coelomycetes)，球壳菌目(例如，豌豆壳二孢，盾壳霉属，壳囊孢属，玉米色二孢属，黑胫茎点霉，拟点霉属，叶点霉属，芹菜小壳针孢等)，黑盘孢目(例如，Celletotrichum，拜叶林氏棒盘孢(Coryneium beijerincki)，柱盘孢属，盘圆孢属，盘二孢属，Melanconium fuligenum，痂圆孢属等)，丝孢菌纲(Hyphomycetes)，Hyphales(例如，链格孢属，曲霉属(Asperigillus)，Bipolaris，dreschslerea，Excerophilum，灰葡萄孢属，尾孢属，Fulvia fulva褐孢属，镰刀属，白地霉，Graphium ulmi，Peniciuum，Phymatotrichumomnivorum，梨孢属(Pyricularia)，Spilocaea，基生根串株霉，木霉属，轮枝霉属等)，无孢纲(Agonomycetes)，无孢目(Agonomycetales)(例如，丝核菌属，小核菌属等)，担子菌亚门，半担子菌纲，Ustilaginales(例如，Sphaceltheca，腥黑粉菌属，洋葱条黑粉菌，黑粉菌属等)，夏孢锈菌目(例如Cronartium，Gymnosporangium juniperi-virginianae，亚麻栅锈菌，多胞锈菌属，柄锈菌属，疣顶单孢锈菌等)，层菌纲(Hymenomycetes)，外担子菌目(例如，外担子菌属等)，Aphyllochorales(例如Aethalia，伏革菌属，Heterobasidum，革褶菌属，隔孢伏革菌属，多孔菌属，卧孔菌属，裂褶菌属，韧革菌属等)，胶膜菌目(例如革菌(Thanatephorus)，核瑚菌(Typhula)等)，蘑菇目(例如蜜黄色假密环菌，小皮伞菌(Marasmius)，磷伞菌(Pholiota)，灰侧耳菌属等)，更具体地，子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门，接合菌门(Zygomycota)，卵菌门(Oomycota)，根肿菌门，隐匿柄锈菌，中国根霉(Rhizopuschinensis)，葡萄生单轴霉(Plasmo parayiticola)，甘蓝根肿菌，解淀粉欧文氏杆菌，柑桔痂囊腔菌，Phaeosphaeria nodorum，落花生球腔菌，伯克利球腔菌，Mycosphaerella fijiensis，禾生球腔菌，圆核腔菌，偃麦草核腔菌，Venturia carpophila，甘蓝黑斑病链格孢，菊池链格孢，苹果火星病链格孢，马铃薯早疫病链格孢，菾菜尾孢，黄瓜枝孢，番茄壳针孢，Blumaria graminis，二孢白粉菌，苹果白粉病柄球菌，苍耳单丝壳菌，葡萄白粉病钩丝壳霉，构巢裸孢壳，指状青霉，意大利青霉，稻恶苗赤霉菌，Nectria haematococca，大刀镰孢，尖孢镰孢，粉红镰孢，变绿胶霉，Botryotinia fuckeliana，Monilinia fructigena，Sclerotinia homoeocarpa，油菜核盘菌，Mollisia vallundae，葫芦病霉，酿酒酵母，粗糙链孢霉，禾顶囊壳菌，Magneporthe grisea，Monographella nivalis，Rhyncosporiumsecalis，Athelia rolfsii，Typhula incarnata，Thanatephoruscucumeris，茄属丝核菌，Hemileia Vastatrix，大麦柄锈菌，疣顶单孢锈菌，其它真菌因子在本领域是已知的(参见，例如G.N.，Agrios，上文，和G.C.Ainsworth，在“Fungal Diseases of Animals”，Commonwealth Agricultural Bureaux，Farmham Royal Bucks，England，(1959)，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”第4版，Lea and Febiger，Philadelphia，(1972))。
前述任何门，亚门，纲，目，属或种范围内的真菌因子可以引起各种疾病和症状，一般包括，但不限于：坏死，植物死亡，细胞死亡，营养不良，发育不全，矮化，增生(例如，根肿病，瘿，小突起，帚枝病，扭叶等)，肿瘤，叶斑，枯萎病，溃疡，顶枯，根腐，立枯病，基茎腐烂，软腐，干枯，炭疽病，疮痂病，衰落，萎蔫病，锈病，霉病和黑穗病；更具体地，子实体，马铃薯粉痂病，十字花科植物根肿病，马铃薯黑瘤病，紫花苜蓿冠瘿病，玉米褐斑病，种子腐烂病，幼苗立枯病，根和茎腐烂，枯萎病，块茎腐烂，白腐，upper side，霜霉病，大豆种子上的卵孢子，根霉软腐，根霉果实腐烂，瓜笄南瓜腐烂病，面包霉，芽腐病，茎腐病，颈腐，冠腐病，干腐病，黑荚果病，马铃薯晚期枯萎病，炭疽病，刺盘孢病，洋葱炭疽，麦角病，葡萄孢属病，维管束萎蔫病，荷兰榆树病害，赤霉病，核盘菌病，丝核菌病，菌核病，收获后果实和蔬菜的腐烂，降低的光合作用，每片叶片降低的叶绿素，降低的叶绿素效率，植物激素产量的降低，降低的生长速率，降低的可溶氮，降低的碳水化合物水平，呼吸的增加或降低，异常的植物新陈代谢，减少水分的转位，减少的营养物质的保留，增加的蒸腾，降低的产量，植物的调节转录，植物的调节翻译，及异常的细胞新陈代谢；特别是柑桔疮痂病，葡萄黑腐病，wheat septorianodorum blotch，花生早期叶斑病，香蕉黑叶条斑病，wheat septoriatritici blotch，大麦网斑病，cereal tan spot，苹果黑星病，桃子feckle，甘蓝黑斑病，苹果斑枯，西红柿和马铃薯早疫病，甜菜尾孢菌叶斑病，黄瓜疮痂病，番茄斑枯，小麦白粉病，大麦白粉病，黄瓜白粉病，苹果白粉病，黄瓜白粉病，葡萄白粉病，saporphyte，柑桔绿霉病，柑桔青霉病，水稻恶苗病，禾谷类headscab，黄瓜枯萎，西红柿镰刀菌萎蔫病，萝卜黄化镰刀菌病，稻立枯病，辣椒灰霉病，菜豆灰霉病，黄瓜灰霉病，葡萄灰霉病，万寿菊灰霉病，核果褐腐病，草皮硬币圆状斑病(turf dollar sport)，小麦眼斑病，黄瓜炭疽病，pestalotial叶斑，稻瘟病，草皮雪霉病，大麦云纹病，typhula blight，丝核菌立枯病，咖啡树锈病，小麦lead rust，大麦叶锈病，及菜豆锈病。本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可以直接或间接用于检测，预防这些症状或疾病中任何一种，和/或提供对这些症状或疾病中任何一种的抗性。具有感染植物或动物能力的其它真菌因子在本领域是已知的(参见，例如，G.N.，Agrios，上文，和G.C.Ainsworth，在“Fungal Diseases of Animals”，Commonwealth AgriculturalBureaux，Farmham Royal Bucks，England，(1959)，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”第4版，Lea and Febiger，Philadelphia，(1972))。
而且，引起能被本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，和/或提供抗性抵抗的疾病或症状的寄生虫包括但不限于下面的科或纲：变形虫病，巴倍虫病，球虫病，隐孢子虫病，Dientamoebiasis，马媾疫，体外寄生虫，梨形鞭毛虫病，蠕虫病，利什曼病，泰勒虫病，弓形体病，锥虫病，毛滴虫属，孢子虫类(例如，间日疟原虫，恶性疟原虫，三日疟原虫，和卵形疟原虫)。其它寄生因子的例子包括，例如，菟丝科(Cuscutaceae)(例如，菟丝子属(Cuscuta)，菟丝子等)，槲寄生科(Viscaceae)(例如，矮槲寄生(Arceuthobium)(松类矮槲寄生)，叶槲寄生(Phoradendron)(美国阔叶树纯槲寄生(American true mistletoes of broadleavedtrees))和槲寄生属(Viscum)(欧洲纯槲寄生(European truemistletoes))，列当科(Orobanchaceae)(例如，列当属(烟草列当))，和玄参科(Scrophulariaceae)(例如独脚金属(单子叶植物的独角金))。这些寄生物可以引起各种疾病或症状，包括但不限于：减少的水贮藏，减少的矿物质利用率，减少的碳水化合物的贮藏，减少的植物防卫，和对真菌，细菌，或病毒感染增加的易感性。其它的寄生疾病在本领域是已知的(参见，例如G.N.，Agrios，上文，和Jones，T.C.，在“Veterinary Pathology”，第4版，Lea和Febiger，Philadelphia，(1972)中。可以利用本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂检测，预防这些症状或疾病中任一种，和/或提供抗性抵抗这些症状或疾病中任一种。
尽管治疗或预防的方法可以包括给植物，种子，组织，或细胞施用有效量的多肽，但是用本发明多肽多或核苷酸和/或激动剂或拮抗剂治疗或预防的方法是本领域熟知的。作为替代方案，通过用本发明多核苷酸转化植物，种子，组织，或细胞可以提供治疗或预防，或从植物中取出细胞，转化，然后返回基因工程改造的细胞到植物中(离体治疗)。而且，可以用本发明多肽或多核苷酸做为抗原以产生抑制特定感染疾病病原性的抗体(例如抑制植物特异基因的表达或抑制对感染生物体的病原性关键的蛋白质)。此外，在修改或没有另外修改的情况下，用本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，提供抗性抵抗，或抑制感染因子的任何方法都可以用于检测，预防，提供抗性抵抗，或抑制人，动物，哺乳动物，或其它生物体的感染因子。
害虫耐受性
线虫类是能引起疾病或症状的一个例子，这些疾病或症状可以被本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，和/或提供抗性抵抗。线虫的例子包括，但不限：垫刃目(Tylenchida)，垫刃亚目，Tylenchoidia，Tylenchidea，垫刃线虫科，鳗线虫属，茎线虫属，矮化线虫科，矮化线虫属，短体线虫科，短体线虫属，穿孔线虫属，纽带线虫科，纽带线虫属，盘旋线虫属，螺旋线虫属，刺线虫科，刺线虫属，Heteroderoidea，Heterderidae，球异皮线虫属，异皮线虫属，根结线虫属，科布线虫科，科布线虫属，小盘旋线虫属，Criconematoidea，环线虫科，小环线虫属，鞘线虫属，针线虫科，针线虫属，小垫刃科，小垫刃线虫属，滑刃亚目，滑刃科，滑刃亚科，滑刃线虫属，伞滑刃线虫属，细杆滑刃线虫属，矛线目，长针线虫科，长针线虫属，剑线虫属，毛刺线虫科，副毛刺线虫属和毛刺线虫属。线虫门，目，亚目，总科，科，属，和种的其它成员是本领域已知的。
前述目，亚目，总科，科，属，和/或种范围内的线虫可以在植物中引起各种疾病和症状，一般包括，但不限于：根癌，根瘿，减慢的植物生长，植物营养不良，黄化，萎蔫，降低的产量，不良的产品质量，植物瘿，坏死斑，腐烂，叶和茎的扭曲或变形，异常的花发育；过度生长，生长障碍，囊肿和褪绿病。可以直接或间接用本发明的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂检测，预防这些症状或疾病中任一种，和/或提供对这些症状或疾病中任一种的抗性。线虫引起的其它疾病和/或病症是本领域已知的。
昆虫是能引起疾病或症状的害虫的另一个例子，这些疾病或症状可以被本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂检测，预防，和/或提供抗性抵抗。昆虫的例子包括，但不限于下列：选自鞘翅目，双翅目，膜翅目，鳞翅类，食毛目，同翅目，半翅目，正翅目(Orthroptera)，缨翅目，革翅目，等翅目，虱目，蚤目，毛翅目等，特别鞘翅目的昆虫。
可以直接或间接用本发明的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂检测，预防下列非限制性症状或疾病中的任一种，和/或提供对这些非限制性症状或疾病中任一种的抗性，所述非限制性症状或疾病是由主要作物昆虫害虫引起的，所述作物昆虫害虫是：玉米：Ostrinianubilalis，欧洲玉米螟；Agrotisipsilon，小地老虎；Helicoverpazea，谷实夜蛾；Spodoptera ftugiperda，草地粘虫；Diatraeagrandiosella，巨腐玉米螟；Elasmopalpus lignosellus，南美玉米苗斑螟；Diatraea saccharallis，小蔗杆草螟；Diabroticavirgifera，玉米根叶甲；Diabrotica barberi，长角叶甲；Diabroticaundecimpunctata howardi，十一星瓜叶甲；梳爪叩甲属(Melanotusspp.)，线虫；Cyclocephala borealis，圆头犀金龟(蛴螬)；Cyclocephala immaculata，圆头无斑犀金龟(蛴螬)；Popilliajaponica，日本弧丽金龟；Chaetocnema pulicaria，玉米铜色跳甲；Sphenophorus maidis，玉米尖隐喙象；Rhopalosiphummaidis，玉米缢管蚜；Anuraphis maidiradicis，玉米根蚜；Blissusleucopterus，美洲谷秆长蝽；Melanoplus femurrubrum，赤胫黑蝗；Malanoplus sanguinipes，血黑蝗；Delia platura，灰地种蝇；Agromyza parvicornis，玉米斑潜蝇；Anaphothrips obscrurus，玉米黄呆蓟马；Solenopsis milesta，窃叶蚁；Tetranychus urticae，二斑叶螨；Busseola Jusca，平米干夜蛾(AMB)；Sesamia calamistis，蛀茎夜蛾(AP13)；Eldana sacchharina，甘薯杆螟(ASB)；Chilopartellus，斑禾草螟(SSB)；Ostrinia furnacalis，亚洲玉米螟(OCB)；Sesamia nonagrioides，欧洲或北非玉米螟；Syrahum：Clilopartellus，斑禾草螟；Spodoptera ftugiperda，草地粘虫；Relicoverpa zea，玉米穗夜蛾；Elasmopalpus lignosellus，南美玉米苗斑螟；Agrotis subterranea，粒肤地老虎；Phyllophagacrinita，蛴螬；Eleodes，宽胸叩甲属(Conoderus)，和Aeolus spp.，线虫；Oulema melanopus，黑角负泥虫；Chaetocnema pulicaria，玉米铜色跳甲；Sphenophorus maidis，玉米尖隐喙象；Rhopalosiphummaidis，玉米缢管蚜；Siphaflava，美甘蔗伪毛蚜；Blissusleucopterus，美洲谷秆长蝽；Contarinia sorghicola，高粱康瘿蚊；Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，二斑叶螨；Schizaphis graminum，麦二叉蚜(蚜虫)；小麦：Pseudaletiaunipunctata，白点粘虫；Spodoptera ftugiperda，草地粘虫；Elasmopalpus lignosellus，南美玉米苗斑螟；Agrotis orthogonia，plae western cutworm；Oulema melanopus，黑角负泥虫；Hyperapunctata，三叶草叶象；Diabrotica undecimpunctata howardi，十一星瓜叶甲；俄罗斯麦蚜；Schizaphis graminum，麦二叉蚜；Sitobionavenae，麦长管蚜；Melanoplus femurrubrum，赤胫黑蝗；Melanoplusdifferentialis，异黑蝗；Malanoplus sanguinipes，血黑蝗；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Sitodiplosis niosellana，麦红吸浆虫；Meromyza americana，美洲麦杆蝇；Hylemya coarctata，wheat bulb fly；Frankliniella jusca，烟褐蓟马；Cephus cinctus，麦茎蜂；Eriophyes tulipae，郁金香瘿螨；向日葵：Suleimahelianthana，向日葵草芽小卷蛾；Homeosoma ellectellum，向日葵同斑螟；Zygoramma exclamationis，向日葵叶甲；Bothyrus gibbosus，胡萝卜金龟；Neolasioptera mur～feldtiana，向日葵籽瘿蚊；Cochylis hospes，向日葵细卷叶蛾；Rachiplusianu，agentinalooper；Smicromyx julvus，red sunflower seed weevil；Cylindrocopturus adspersus，密点细枝象；棉花：Heliothisvirescens，烟芽夜蛾；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；Spodopteraexigua，贪夜蛾；Pectinophora gossypiella，红铃麦蛾；Anthonomusgrandis，棉铃象；Aphis gossypii，棉蚜；Pseudatomoscelisseriatus，棉伪斑腿盲蝽；Trialeurodes abutilonea，结翅粉虱；Lygus lineolaris，美国牧草盲蝽；Melanoplus femurrubrum，赤胫黑蝗；Melanoplus differentialis，异黑蝗；Thrips tabaci，烟蓟马；Franklinkiella jusca，烟褐蓟马；Tetranychus cinnabarinus，朱砂叶螨；Tetranychus urticae，二斑叶螨；水稻：Diatraeasaccharalis，小蔗杆草螟；Spodoptera ftugiperda，草地粘虫；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；Colaspis brunnea，葡萄肖叶甲；Lissorhoptrus oryzophilus，稻水象；Sitophilus oryzae，米象；Nephotettix nigropictus，二条黑尾叶蝉；Blissus leucopterus，麦长蝽；Acrosternum hilare，拟绿蝽；Pseudoplusia includens，大豆夜蛾；Anticarsia gemmatalis，藜豆认蛾；Plathypena scabra，苜蓿绿夜蛾；Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Spodoptera exigua，贪夜蛾；Heliothis virescens，烟芽夜蛾；Helicoverpa zea，谷实夜蛾；Epilachna varivestis，墨西哥豆瓢虫；Myzus persicae，桃蚜；Empoasca jabae，马铃薯小叶蝉；Acrosternum hilare，拟绿蝽；Melanoplus femurrubrum，赤胫黑蝗；Melanoplus differentialis，异黑蝗；Delia platura，灰地种蝇；Sericothrips variabilis，大豆蓟马；Thrips tabaci，烟蓟马；Tetranychus turkestani，土耳其斯坦叶螨；Tetranychusurticae，二斑叶螨；大麦：Ostrinia nubilalis，欧洲玉米螟；Agrotisipsilon，小地老虎；Schizaphis graminum，麦二叉蚜；Blissusleucopterus，美洲谷秆长蝽；Acrosternum hilare，拟绿蝽；Euschistus servus，褐美洲蝽；Delia platura，灰地种蝇；Mayetioladestructor，小麦瘿蚊；Petrobia latens，麦岩螨；Oil Seed Rgpe；Brevicoryne brassicae，甘蓝蚜；菜跳甲属，Phyllotreta ssp.；披肩粘虫；Mamestra configurata；菜蛾；小菜蛾(Plutellaxylostella)；苜蓿：苜蓿环纹夜蛾，Autographa californica；大苜蓿耳喙象，Otiorhynchus ligusticii；苜蓿粉蝶，Coliaseurytheme；紫苜蓿潜蝇，Agronyza frontella；埃及苜蓿叶象，hyperabrunneipeonis；牧场沫蝉，Philaerius spumarius；苜蓿斑翅蚜，Theriophis meculata；三叶草叶象，Hypera punctata；豌豆蚜，Acyrthosiphon pisum；苜蓿无网蚜，Acyrthosiphor kondoi；苜蓿绿夜蛾，Plathypena scabia；车轴草根瘤象，Sitona hispidulus；苜蓿广肩小蜂，Brachophagus roddi；美洲牧草盲蝽，Lyguslineolaris；塞氏蝽，Chlorochroa sayi；藜豆认蛾，Anticarsiaftiegiperda；紫苜蓿叶象，Hypera postica；贪夜蛾属，Spodoptera；马铃薯小叶蝉，Empoasca jabae；大豆夜蛾，Psuedolusia includens；Three cornered alfalfal hopper，Spissistilus jestinus；等。其它的昆虫害虫在本领域是已知的。参见，例如，Manya B.Stoetzel(1989)Common Names of Insects & Related Organisms，EntomologicalSociety of America，在这里并入作为参考文献。
此外，本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可以用于检测，预防，和/或提供抗性抵抗其它植物害虫，包括，但不限于昆虫，herbacious species，真菌，细菌，病毒和在这里公开的其它害虫，例如，本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可以直接或间接调节(优选减少)生物合成，同化作用，和/或害虫生存所必需的营养物质的浓度。做为替代方案，本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可以调节(优选增加)代谢物和/或蛋白质的生物合成，所述代谢物和/或蛋白质具有减少生物合成，同化作用，和/或害虫生存所必需的营养物质的浓度的能力。一个例子涉及如下观测结果，即，有胆固醇氧化酶基因的植物对棉铃象虫(Anthonomus grandis grandis Boheman)幼虫有抗性(Purcell，JP.，Biochem Biophys ResCommun，196(3)：1406-13(1993))。因为胆固醇对大多数生物体(包括昆虫)是必需营养物质，所以具有调节胆固醇降解酶(包括胆固醇氧化酶)水平和/或活性的本发明的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂在提供抗性抵抗植物害虫方面是有用的。在另一个例子中已表明，表达某些latherogens的植物提供了对一些病原体的抗性。已鉴定了这种latherogens能干扰胶原蛋白的合成和/或聚集。
在另一个实施方式中，通过直接局部给期望保护的植物施用，可以利用本发明的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂直接或间接地检测，预防，和/或提供抗性抵抗这里所述的任何一种害虫和/或疾病。例如，最近市场已投放了几种以蛋白质和/或肽为基础的商购杀虫剂，当直接应用于植物，这些杀虫剂提供了对害虫广谱的杀虫抗性，例如可从EdenBioscience购得的Messenger，和源于Novartis Crop Protection的Actigard(Nat.Biotech.，18：595(2000))。Messenger是以解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovara)harpin基因(Wei，Z.，Science，257：85-88(1992))为基础的。已表明这种以蛋白质/肽为基础的杀虫剂激活植物的系统获得抗性(SAR)途径。尽管通过本发明的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂直接或间接激活SAR途径是优选的，本发明也包括提供抗性抵抗植物害虫的其它作用方式。局部施用(包括任何剂型要求)的方法将根据本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂中每一个的独特特性而改变。此外，提供对植物病原体抗性的本发明多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂也可以有其它有益的用途，例如，增强植物生长。
植物防卫
可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加植物抗环境或病原胁迫(例如，病毒的，真菌的，支原体的，细菌的，线虫的，除草剂，杀虫剂，酸雨，干旱，化学试剂等)的防卫机制。这种防卫机制可以是结构特征(即，起到抑制病原体，例如侵入植物或在植物中传播的物理屏障作用)和整个植物或单个细胞范围内的生物化学反应(例如，产生或对病原体有毒，或建立不允许病原体生存的环境的物质等)的联合。
结构上，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加毛状体的数量，增加蜡状分泌物或蜡质层的厚度和/或组分，增加角质膜(cuticle)的厚度和/或组分，改变表皮细胞壁的结构，改变气孔和皮孔的大小，形状和/或位置，诱导植物产生或增加厚壁细胞层(例如，木栓细胞层等)，增加外表皮细胞壁的厚度和/或组分，诱导离层的形成，诱导侵填体的形成，诱导树胶的产生和/或沉积，诱导细胞壁的外层薄壁组织细胞层增厚，诱导细胞壁增厚，诱导细胞壁内层的胼胝质乳突的沉积，诱导细胞和/或组织中坏死或过敏性防卫反应(即死亡)，诱导被氧化酚类化合物聚合为类似木质素的物质，以结构上干扰病原体的发育，和/或诱导细胞质防卫反应。
生物化学上，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂释放病原抑制剂进入植物环境中，释放对真菌有毒的渗出液，和/或释放酚类化合物(例如，原儿茶酸(protocatechioc acid)，邻苯二酚)。做为替代方案，也可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加植物细胞和组织中的酚类化合物的合成(绿原酸，咖啡酸，7-羟基-6-甲氧基香豆素，酚类化合物的氧化产物，植物抗毒素(关于植物抗毒素，参见，Bell等，Ann.Rev.Plant Physiol，32，1981)，菜豆蛋白，日齐素，菜豆双氢异黄酮，豌豆素，大豆抗毒素，棉酚，capsidiol等)，丹宁酸和/或皂角甙(番茄碱糖苷，燕麦碱)的合成。做为替代方案，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加植物水解酶(例如，葡聚糖酶，几丁质酶等)的表达，所述的植物水解酶可以引起病原体细胞壁等的降解。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂抑制宿主-病原体相互作用必需的识别因子(例如特异性寡糖，碳水化合物部分，受体，配体，蛋白质，糖蛋白质，凝集素等)的表达。例如，也可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂抑制做为病原毒素靶的蛋白质的表达，由此使得宿主对毒素不敏感。
在另一个实施方式中，可以用本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂抑制植物新陈代谢机器完成有效致病应答所需必需步骤的能力(例如，抑制植物核糖体识别病原体核酸，如病毒核酸的能力；和/或抑制植物DNA聚合酶机器识别和/或合成致病DNA的能力；或抑制植物催化诱导致病应答必需的特定酶促步骤的能力等)。
而在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂抑制许可致病感染所需的必需营养物质的产生或运输或保留(例如，抑制致病应答所需的非必要矿物质或维生素的运输等)。
在本发明的一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加酚类氧化酶(例如，多酚氧化酶，过氧化物酶)的表达或活性，增加苯丙氨酸氨裂解酶的表达或活性，增加能形成果胶盐或果胶复合物的蛋白质的活性或表达等。
在进一步的实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂直接或间接抑制诱发感染必需的致病蛋白质的活性(例如，抑制蛋白质，如水解酶的酶促活性，例如，抑制蛋白质与受体或配体的结合能力，抑制致病蛋白质的蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的相互作用等)。更具体地，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂直接或间接抑制例如野火毒素，诱导褪绿病的毒素，烟草丁香假单胞菌毒素，phaseoloyoxin，根瘤菌毒素，诱导萎蔫的细菌多聚糖，胞外多糖，糖肽毒素，肽毒素，丁香霉素，万寿菊菌毒素，长蠕孢苷，维多利长蠕孢毒素，玉蜀黍长蠕孢T-毒素，炭色长蠕孢毒素，periconia circinata毒素，phyllosticta maydis毒素，alternaria毒素，fusarial wilt毒素，蛇孢假壳素，helminthosporal，terpinoid毒素，壳梭孢菌素，梨孢毒素，collectotin，链格孢酸，腾毒素，毒植物素，zinniol，腾毒素，壳二孢素，腐皮壳菌素，栗疫病菌素，Didymella applanata毒素，Myrothecium roridum毒素，Leptosphaerulina briosiana毒素，纤细链格孢(Alternaria tenuis)酚类毒素，菾菜尾孢(Cercosporabeticola)毒素，棉黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)毒素，Phytophthora nicotianae var.parasitica毒素，Phytophthoramegasperma var.sojae毒素，Ceratocystis ulmi毒素，peptidorhamnomannan，葡萄串状匍柄霉(Stemphylium botryosum)毒素，Stemphylin，Stemphyloxin，圆核腔菌(Pyrenophora teres)毒素，N-(2-氨基-2-羧乙基)天冬氨酸，aspergillomarasmineA，和Rhynchosporosides毒素。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加或诱导含氰甙或酯的产生，增加具有水解含氰甙或酯能力的水解酶的活性或表达，增加具有释放氰化物进入植物细胞和组织能力的酶的活性或表达，增加具有解毒氰化物能力的酶(例如，甲酰胺水解酶(hydro-lyase)等)的活性或表达，和/或增加b-蛋白质的表达等。
在进一步的实施方式中，除了本发明任一多核苷酸的非编码5’或3’区，和/或其片段外，例如，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂在植物中产生病毒外壳蛋白质，细菌或真菌蛋白质，脂蛋白质，多糖，酵母RNA，聚阴离子，聚丙烯酸，柳酸，和/或2-氯乙基膦酸。当系统或局部施用这种蛋白质和/或化合物给植物时，已表明这种蛋白质和/或化合物诱导对植物病原体的局部抗性应答。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加或诱导次级代谢物的产生，所述次级代谢物包括但不限于下列：乙酰水杨酸，乌头碱，阿托品，野靛碱，germinine，强心甙(例如，牛角瓜甙，夹竹桃甙等)，鸭嘴花碱，奎宁，颠茄碱，紫杉碱，毒芹素，天仙子胺，除虫菊酯，鱼藤酮，樟脑等。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加或诱导非蛋白质氨基酸的产生，所述非蛋白质氨基酸包括但不限于下列：β-氰基丙氨酸，铃兰氨酸，刀豆氨酸，3，4-二羟苯丙氨酸等。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂增加或诱导萜烯产生，所述萜烯包括但不限于下列：1.8桉树脑，樟脑，α-蒎烯，β-蒎烯，莰烯，侧柏酮等。
在另一个实施方式中，可以用本发明的多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂直接或间接抑制感染因子，而不必增加植物防卫机制。
本发明包括增加植物防卫机制抵抗上述或本文其它地方所述环境或感染因子的任何方法中一个，两个，三个，四个或多个，包括其任何联合方法的应用。其它增加植物防卫机制的方法是本领域已知的。此外，一系列化合物和/或蛋白质可以做为通过利用本发明多核苷酸或多肽增加其产生或表达的靶标以增加植物防卫机制，这些化合物和蛋白质在本领域是已知的(参见，例如，Agrious，N.C.，上文；Goodman，R.N.，在“The Biochemistry and Physiology of Plant Disease”，中，University of Missouri Press，Columbia，1986；和Lambers，H.，等，在“Plant Physiological Ecology”，Spinger-Verlag，NewYork，(1998)中，在这里整体并入其为参考文献)。
植物激素
可以用本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂调节植物中(包括它的任何细胞，组织和/或器官等)的激素水平。可以被本发明直接或间接调节的激素的例子，一般包括，但不限于下列：植物生长素，吲哚乙酸，赤霉素，细胞分裂素，乙烯，脱落酸，多胺，茉莉酮酸类，晚香玉酮酸(tuberonic acid)，水杨酸，系统素，油菜素内酯，玉米素；更具体地，吲哚-3-乙酸，吲哚-3-丁酸，4-氯吲哚-3-乙酸，吲哚-3-乙酰-1-O-B-D-葡萄糖，吲哚-3-乙酰-肌醇，茉莉酮酸，甲基茉莉酮酸酯，激动素，包括上述激素的任何已知的衍生物等。在本文上下文中，调节应该用于指前述任一激素表达水平的量上的，或质的增加，减少，诱导或终止。其它植物激素的例子在本领域是已知的(参见，例如，Davies，P.J.，在“PlantHormones：Physiology，Biochemistry，and Molecular Biology”中，Kluwer Academic Publishers，Boston，1995；在这里已整体并入这篇文献为参考文献)。
具有调节植物生长素水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如刺激细胞增大，刺激茎生长，刺激形成层中细胞分裂，刺激韧皮部和木质部的分化，刺激插枝生根，刺激侧根发育，刺激根的分化，介导枝条和根对重力或光的弯曲(向性的)反应，抑制侧芽，叶片衰老的延迟，抑制或促进叶或果实脱落(通过乙烯)，诱导果实座果和生长，增强通过韧皮部的同化物转运，果实成熟的延迟，促进凤梨科植物开花，刺激花的生长，促进雌雄异株花的雌性特征，和刺激乙烯的产生。
具有调节植物赤霉素水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如刺激细胞分裂和细胞伸长，诱导过度伸长，诱导抽苔，诱导，诱导响应长日照的茎伸长，诱导发芽，在种子缺乏分层或锻炼情况下，诱导种子发芽，刺激α-淀粉酶的产生，诱导果实座果和生长，和诱导雌雄异株花的雄性。
具有调节植物细胞分裂素水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如在植物生长素存在的情况下诱导细胞分裂，诱导冠瘿瘤中细胞分裂，诱导顶端分生组织的细胞分裂，诱导快速分裂细胞的分裂，促进枝条起始生长，诱导芽形成，诱导侧芽生长，从顶端优势中释放侧芽生长，诱导细胞增大，诱导叶片扩展，增大气孔开放，刺激叶绿素的积累，诱导黄化质体到叶绿体的转化，和延迟叶片的衰老。
具有调节植物乙烯水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如解除植物的休眠，诱导枝条和根的生长和分化，诱导不定根形成，诱导叶片和果实脱落，诱导开花，诱导雌雄异株花的雌性特征，诱导花开放，诱导花和叶片衰老，诱导果实成熟，
具有调节植物脱落酸水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如气孔关闭，枝条生长的抑制，诱导种子中贮藏蛋白质的合成，抑制发芽谷粒中α-淀粉酶的产生，诱导休眠的一些方面，诱导蛋白酶抑制剂合成。
具有调节植物多胺水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如植物细胞和组织生长和发育的调节，调节大分子的合成，调节大分子的活性，稳定细胞质膜，减少创伤组织渗漏β-花青苷，保持离体大麦叶中的类囊体结构，抵消激素诱导的对细胞膜的作用，与核酸结合，保护细胞免受烷化剂作用，控制染色体浓缩，控制核膜在早前期的溶解，和调节tRNA’s的结构和功能。
具有调节植物茉莉酮酸酯水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如植物生长的抑制，种子发芽的抑制，衰老的促进，脱落的促进，块茎形成的促进，果实成熟的促进，色素形成的促进，卷须卷绕的促进，蛋白酶抑制剂的诱导，和抑制虫害。
具有调节植物水杨酸水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如热产生的诱导，通过病原相关蛋白质的诱导提供了对病原体的抗性，花寿命的增加，乙烯生物合成的抑制，种子发芽的抑制，创伤反应的抑制，消除植物对脱落酸的反应。
具有调节植物油菜素类固醇水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂对植物必然具有下面的，非限制性的作用：例如茎伸长的促进，根生长的抑制，根发育的抑制，乙烯生物合成的促进，和偏上生长的抑制。
本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以调节植物中上述激素的一种，两种，和多种，或任一联合。激素对植物，包括其细胞，组织和器官的其它作用是本领域已知的，而且不应该解释前述植物激素的作用为限制任何本发明多核苷酸或多肽的用途。
再生
可以用本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂分化，繁殖，和/或吸引细胞，引起组织再生。(参见，Science276：59-87(1997))。可以用组织再生修复，取代，和/或保护受环境损害(例如，除草剂，光致退色，酸雨，干旱，线虫，昆虫，化学试剂等)，疾病(例如，真菌，病毒，细菌，支原体等)，坏死，过敏反应，和/或细胞因子伤害而伤害的组织。
可以用本发明多核苷酸或多肽再生的组织包括组织(例如，顶端分生组织，侧枝，侧芽，叶片，木髓，维管形成层，茎，韧皮部，木质部，皮层，表皮，侧根，根分生组织，角质膜等)，还有细胞器和组成组分(液泡，线粒体，叶绿体，质体，溶酶体，过氧化物酶体，乙醛酸循环体，细胞质，内质网，核糖体，液泡膜，细胞核，核膜，胞间连丝，scherosomes，微体，原生细胞壁等)。
营养物质
通过许多不同的机理，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以用于调节植物的营养状态。本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以用于调节植物保留特定营养物质的能力，调节植物合成特定营养物质的能力，调节植物同化营养物质的能力，调节植物吸收或摄取特定营养物质的能力，调节植物转运转运特定营养物质的能力，调节植物贮藏特定营养物质的能力，调节植物在营养物质缺乏的情况下存活的能力，和预防，检测和/提供抗性抵抗营养物质缺乏症状或性状。
可以通过本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂调节的植物中营养物质的具体例子包括下列非限制性的营养物质：碳，氢，氧，氮，磷，硫，钾，钙，镁，硼，氯，铜，铁，锰，锌，钼，钴，硒，硅，钠，镍，水，二氧化碳，还有代谢副产物等，其它维持植物体内平衡必需的营养物质是本领域已知的。
具有调节植物硼水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，缓解或提供抗性抵抗下列非限制性的植物硼缺乏症状：末端叶片坏死，早熟叶片脱落层的形成，末端枝条节间缩短，顶端分生组织的变黑和/或死亡，根枝的缩短，植物矮化，植物矮缩，花发育的损害，种子发育损害等。
具有调节植物钙水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物钙缺乏症状：褪绿的叶片，叶片卷曲，茎或根分生组织的降解，分生组织的死亡，降低的根发育，减少的根纤维含量，减少的果实发育。
具有调节植物氨水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物氯缺乏症状：叶尖萎蔫，叶片褪绿，叶片金褐色变，接近萎蔫区域由上往下的叶片坏死等。
具有调节植物铜水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物铜缺乏症状：末端枝条萎蔫，末端枝条死亡，叶色褪色，植物细胞和组织胡萝卜素的减少，植物细胞和组织其它色素的减少等。
具有调节植物铁水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物铁缺乏症状：首先幼叶叶脉间白化褪绿，气生组织的褪绿，气生组织的坏死，叶片的白化，叶边缘和顶端的灼伤等。
具有调节植物镁水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物镁缺乏症状：首先在老叶片上有黄化或白化绿叶脉和叶网组织的斑点褪绿，叶萎蔫，缺乏萎蔫阶段的情况下形成了叶片脱落层，植物细胞和组织坏死等。
具有调节植物锰水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物锰缺乏症状：首先在幼叶上有黄化或白化绿叶脉和叶网组织的斑点褪绿，然后扩散到老叶，变黄的绿茎，茎的硬化和/或木质化，胡萝卜素的减少等。
具有调节植物钼水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物钼缺乏症状：叶淡黄色褪绿，叶片不能扩展等。
具有调节植物氮水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物氮缺乏症状：矮化幼小植物的生长，年幼植物变黄的绿叶，老叶的淡绿色叶接着黄化和干化或脱落，叶脉中花色素苷增加的积累，细茎，植物纺锤形外观，减少的开花等。
具有调节植物磷水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物磷缺乏症状：年幼植物的矮化，深蓝绿叶带有淡紫色，细长茎，叶片中花色素苷增加的积累，叶片坏死，顶端分生组织生长的停止，果实成熟的速率降低，植物成熟时的矮化等。
具有调节植物钾水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物钾缺乏症状：深绿叶，淡绿色的单子叶植物叶片，单子叶植物叶片的黄化条纹，叶片边缘的褪绿，老叶先出现叶坏死，叶脉的起皱，叶脉的currugating，叶脉的皱缩等。
具有调节植物硫水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物硫缺乏症状：首先沿着幼叶片叶脉出现淡绿到黄化的叶片，细长茎等。
具有调节植物锌水平能力的本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能预防，检测，减缓，和/或提供抗性抵抗下列非限制性植物锌缺乏症状：首先影响幼叶的叶片褪绿和/或叶片坏死，丛簇，叶片脱落层的早熟的形成，较老叶片叶脉间的发白褪绿条纹，单子叶植物上部叶片的白化，双子叶植物下部叶片的褪绿等。
植物营养物质缺乏的其它症状在本领域是已知的(参见，例如，Noggle，G.R.和Fritz，G.J.，在“Introductory PlantPhysiology”，第2版，Prentice-Hall，Inc.，Englewood Cliffs，1983中)。
在一个具体实施方式中，直接或间接地通过增加转运蛋白质，离子通道和/或离子载体蛋白质的活性，动力学，和/或表达，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能调节植物营养物质水平。
在另一个实施方式中，通过直接或间接增加或诱导溶解矿物质或稳定矿物质的化合物或螯合物(例如，柠檬酸，苹果酸，pisidic酸等)的分泌，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能调节植物营养物质水平。做为替代方案，该分泌的化合物可以是有机螯合化合物(例如，phytometallophore，参见例如，Cakmak等，PlantSoil，180：183-189，(1996))。可替代地，分泌的化合物是根渗出液，如有机酸(例如，乳酸，乙酸，蚁酸，丙酮酸，丁二酸，酒石酸，草酸，柠檬酸，异柠檬酸，乌头酸等)，碳水化合物，氨基酸，或能同化碳的多糖(参见，例如，Paul，E.A.，和Clark，F.E.，在“Soilmicrobiology and biochemistry”中，Academic Press，San Diego，(1989))。
在另一个实施方式中，通过直接或间接调节磷酸酶，硝酸还原酶，柠檬酸合成酶等的活性，动力学，和/或表达，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能调节植物营养物质水平。
在另一个实施方式中，通过调节植物的主动转运和/或被动转运机制，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能调节植物营养物质水平。做为替代方案，通过调节植物体内营养物质在组织间或内和/或细胞的转运(例如，通过韧皮部，木质部，桥粒等转运)，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可能能调节植物的营养物质水平。调节植物营养物质转运的其它机理在本领域是已知的(参见，例如Lambers，H.，等，在“Plant Physiological Ecology”中，Spinger-Verlag，New York，(1998)；因此整体并入其为参考文献)。
生物群丛
本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以增加植物直接或间接地起始和/或维持与其它生物体的生物群丛(bioticassociations)的能力。这种群丛在本质上可以是共生，非共生，内共生，大共生，和/或微共生的。一般地，本发明的多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以增加植物与真菌，细菌，地衣，菌根，蓝细菌，沟鞭藻和/或藻类，界，门，科，纲，属，和/或种中任何成员形成生物群丛的能力。
已知与植物形成生物群丛的具体的，非限制性的例子是：外生菌根(例如，Diperocarpaceae，松科，壳斗科，桃金娘科，杨柳科，桦科，豆科等的成员)，内生菌根，泡囊丛枝菌根(例如，绣球菌目的成员)，非菌根(例如，十字花科，石竹科，藜科，Lecythideceae，Proeaceae，帚灯草科，山榄科，荨麻科，蒺藜科等的成员)，共生N2固定生物(例如根瘤菌属，慢生根瘤菌属，中华根瘤菌属，中慢生根瘤菌属，田菁茎瘤菌属等的成员)，非共生的N2固定生物(例如固氮螺菌属)，内共生生物(例如，麦角菌科，子囊菌纲的成员)等。能与植物形成生物群丛的其它生物在本领域是已知的，而且包含在本发明中(参见，例如，Lambers，H.，等，在“Plant PhysiologicalEcology”中，Spinger-Verlag，New York，(1998)中；Raven，P.H.，等，在“Biology of Plants”中，第5版，Worth Publishers，NewYork，(1992)；因此在这里整体并入它们为参考文献)。
尽管可能包括有机酸，酚类化合物，营养物质的调节分泌，或宿主-生物体相互作用所需蛋白质(例如，受体，配体等)的增加表达，但是本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以增加植物直接或间接地起始和/或维持生物群丛的能力的机制是可变化的。其它的机制在本领域是已知的，而且包括在本发明中。
在可替代的实施方式中，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以减少植物与植物形成生物群丛的能力。这种减少可能是因为增加了植物利用，获得，贮藏，和/或合成生物体通过群丛供应给植物的必需营养物质的能力。
植物能抑制生物群丛生物体建群的机制是本领域已知的(参见，例如，Smith，S.E.，和Read，D.J.，在“Mycorrhizal Symbiosis”，Academic Press，London，1997等)。例如，在含低量磷的土壤中，植物可以和能提供磷的物种形成有益的共生集群。然而，在高磷含量的土壤中，这种集群可能被植物抑制。因此，例如通过使植物利用前述的非植物内源的机制吸收磷，本发明多核苷酸或多肽能增加植物在贫磷土壤中生存的能力。
信息素
在另一个实施方式中，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以增加植物合成和/或释放信息素的能力。这种信息素可以吸引以植物害虫或感染因子为食物的捕食性生物到植物附近。例如，最近对蚜虫豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的研究表明被蚜虫摄食改变了植物释放的挥发物组成，而且这些化合物对吃蚜虫的拟寄生物，Aphidiuservi起互利素的作用。其它的研究表明，植物释放的对蚜虫觅食反应的其它信息素，即(E)-β-金合欢烯，也可以吸引其它蚜虫捕食动物，如草蜻蛉(Chrysoperla carnea)和七星瓢虫(Coccinellaseptempunctata)。
本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以调节信息素，有信息素类似作用的挥发物，有种间激素作用的挥发物，有互利素作用的挥发物的生物合成和/或释放，具体地，和/或可以释放(E)-β-金合欢烯。做为替代方案，通过下面非限制性化合物的诱导，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以间接调节信息素的释放，所述化合物是来源于十八烷酸(octadecanoid)信号传导途径的化合物，结构不相关氨基酸缀合物如，细菌植物毒素coronatine，合成的indanoyl-异亮氨酸，或是亚麻酸的氨基酸缀合物，和/或挥发物类萜，如倍半或双萜类的成员。优选地，从植物释放，或通过本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂诱导的任何信息素和/或挥发物对捕食者和/或植物害虫有行为上的影响。植物释放的已知信息素或挥发物的其它例子是本领域已知的，所述信息素或挥发物对植物害虫捕食者和/或植物害虫有行为上的调节影响(参见，例如Boland W.，等，NovartisFound Symp，223：110-26(1999)；Wadhams LJ.，Novartis Found Symp，223：60-7(1999)；Tumlinson JH.，等，Novartis Found Symp，223：95-105(1999))。
在另一个实施方式中，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以调节呋喃酮类的生物合成。呋喃酮类是在各种植物中发现的天然存在的化合物，已证明其对许多生物有类似信息素的作用，抗细菌的作用，抗病毒的作用等。例如在蟑螂(Eurycolis florionda)(Walker)中5-甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮是雄性信息素，而且2，5-二甲基衍生物阻止了草莓上真菌的生长，是水果有吸引力香味的重要组分。红海藻(Delisea pulchra)(Greville)Montagne产生了一系列溴化呋喃酮类，后者通过干扰被细菌用于quorum感觉的酰化高丝氨酸内酯(AHL)信号途径而阻止细菌对植物的集群。此外，已表明呋喃酮类在细菌和病毒中有诱变特性，因此起到抗细菌和抗病毒的作用(Coli，Slaughter J.Biol Rev Camb Philos Soc，74(3)：259-76(1999))。
趋化性
本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以有趋化性活性。趋化性分子吸引或动员细胞到植物或动物体的特定位点，如发炎，感染或过度增生的位点。然后，被运员细胞能战胜和/或治愈特定的外伤或异常。
本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以增加特定细胞的趋化性活性。然后通过增加靶向植物体特定位置细胞的数量，这些趋化性分子可用于检测，预防，和/或缓解发炎，感染，过度增生疾病，失调和/或其它情况，或任何植物失调。例如，通过吸引细胞到受伤位置，可以用趋化性分子可用于治疗，预防，和/或诊断组织的伤口和其它外伤。
也考虑了本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以抑制趋化性活性。这些分子也可以用于检测，预防，和/或缓解疾病，失调和/或其它情况。因此，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以用做趋化性的抑制剂。
在可替代的实施方式中，本发明多核苷酸或多肽和/或激动剂或拮抗剂可以调节植物感觉植物邻居存在(即化学感应)的能力。这种化学感应调节可以存在感觉植物激素存在(例如，茉莉酮酸酯等)，热交换差，和/或种间感应化合物检测的形式(参见，例如，Boller，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，46：189-214，(1995))。
结合活性
可以用本发明多肽筛选结合该多肽的分子，或该多肽结合的分子。该多肽和分子的结合可以激活(激动剂)，增加，抑制(拮抗剂)，或减少结合的多肽或分子的活性。这种分子的例子包括抗体，寡核苷酸，蛋白质(例如，受体)，或小分子。
优选与多肽天然配体密切相关的分子，例如，配体的片段，或天然底物，配体，结构或功能模拟物。(参见，Coligan等，CurrentProtocols in Immunology 1(2)：第5章(1991).)。类似地，该分子可以与多肽结合的天然受体，或至少与能被多肽结合的受体片段(例如，活性位点)密切相关。在两种中任一种情况下，可以用已知技术合理地设计分子。
优选地，筛选这些分子包括产生表达多肽的适合细胞，所述多肽做为分泌的蛋白质表达或在细胞膜上表达。优选的细胞包括植物，酵母或大肠杆菌(E.coli)的细胞。然后，表达多肽的细胞(或含有表达多肽的细胞膜)优选与潜在含有所述分子的测试化合物接触以观察多肽或分子的结合，活性的刺激，或抑制。而且，通过应用酵母2或3杂交系统可以得到这种分子的鉴定(参见，例如，Wallach D，等CurrOpin Immunol.，10(2)：131-6，(1998))；Young KH.，Biol Reprod.，58(2)：302-11，(1998)；和Fernandes，PB.，Curr Opin Chem Biol.，2(5)：597-603(1998)；因此这里，这些文献整体，包括其中公开的方法和引用的参考文献一起并入为参考文献)。而且，可以通过应用其它筛选技术获得这种分子的鉴定，所述的其它筛选技术包括但不限于下列颁发的美国专利：5,284,746；5,576,210；5,691,188；5,846,819；和国际公布号：WO 95/34646；因此这里整体地并入这些文献，包括其中公开的方法及引用的参考文献为参考文献。
这种测试可以是简单地检测待测化合物与多肽的结合，其中通过标记检测结合，或在涉及与标记的竞争剂竞争试验中检测结合。而且，测试可以检测是否待测化合物引起了通过与多肽结合产生的信号。
做为替代方案，可以用无细胞制剂，吸附在固体载体的多肽/分子，化学物质库，或天然产物混合物进行测定。测试也可以简单地包括：混合待测化合物和含有多肽的溶液，检测多肽/分子活性或结合，及与标准对照比较多肽/分子活性或结合这些步骤。
优选地，用单克隆或多克隆抗体，ELISA测定法可以检测样品(例如，生物样品)中多肽水平或活性。通过直接或间接与多肽结合，或通过与多肽竞争底物，抗体可以检测多肽水平或活性。
做为受体鉴定的可替代方法，可以光亲和连接标记的多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制备物。通过PAGE分析分离交联物质，而且曝光于X-射线胶片上。可以切下含有多肽受体的标记复合物，分解为肽片段，进行蛋白质微量测序。用微量测序得到的氨基酸序列设计一套简并寡核苷酸探针筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
而且，可以利用基因改组，基序改组，外显子改组，和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)调节本发明多肽的活性，因此有效地产生本发明多肽的激动剂和拮抗剂。通常参见，美国专利号：5,605,793，5,811,238，5,830,721，5,834,252，和5,837,458和Patten，P.A.，等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，S.Trends Biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson L.O.，等，J.Mol.Biol.287：265-76(1999)；和Lorenzo，M.M.和Blasco，R.Biotechniques 24(2)：308-13(1998)(因此，并入这些专利和出版物中的每一个为参考文献)。DNA改组技术是本领域已知的，而且在本文其它地方更具体地描述了DNA改组技术。
可以用上述和本文别处所述的所有测定法做为诊断和预后的标志。用这些测定法发现的分子可以用于检测，预防，和/或提供抗性抵抗疾病，或通过激活或抑制多肽/分子在生物体中引起特定的结果(例如，导管生长等)。而且，测定法能发现可以抑制或增强适当操作的细胞或组织产生本发明多肽的因子。
因此，本发明包括鉴定与本发明多肽结合的化合物的方法，包括步骤：(a)温育候选结合化合物和多肽；和(b)检测是否出现结合。而且，本发明包括鉴定激动剂/拮抗剂的方法，包括步骤：(a)温育候选化合物和多肽，(b)测定生物活性，和(b)确定多肽的生物活性是否已经改变。
反义和核酶(拮抗剂)
在优选实施方式中，本发明包括与SEQ ID NO：X中所示多核苷酸序列，其互补链，和/或保藏克隆中含有的多核苷酸序列对应的拮抗剂。反义技术通过蛋白质mRNA的直接抑制引起特定蛋白质表达的调节(即，完全或部分抑制)。反义核酸可以是DNA，RNA，PNA，三重螺旋，四重螺旋，任何上述这些类型的嵌合混合物(例如，DNA:RNA，PNA:RNA，PNA:DNA等)的形式，而且可以是单链或双链。反义核酸通过与目的基因RNA结合调节基因表达，有效地抑制翻译。这种相互作用可以基于典型的Watson-Crick碱基对识别，或在三重或四重螺旋的情况下，可以基于Hoogsteen碱基对识别。
可以在生物体中瞬间产生反义核酸(例如，引入生物体细胞内的诱导或组成型表达载体中含有的序列)，在生物体中稳定产生反义核酸(例如，用转基因方法，包括病毒整合，引入生物体细胞内的诱导或组成型表达载体中含有的序列)，或可以外部施用反义核酸。为了使核酸起到反义作用，仅需要核酸与目的基因的有义RNA产物有序列同源性。施用反义核酸的许多方法，它们的组成和反义核酸设计是本领域已知的，而且包括在本发明中(参见，例如，Agrawal S，等，MolMed Today.2000年2月；6(2)：72-81；Yacyshyn BR，等，Can JGastroenterol.1999年11月；13(9)：745-51；Mrsny RJ.，J DrugTarget.1999；7(1)1-10；Toulme JJ，等，Nucleic Acids Symp Ser.1997；(36)：39-41.)Okano，Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors ofGene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)；和Copper SR，等，Pharmacol Ther.1999年5月到6月；82(2-3)：427-35)。同样地，已经研究发展了许多应用三重螺旋反义技术调节基因表达的方法(参见，例如，Gowers DM，等，Nucleic Acids Res.1999年4月1日；27(7)：1569-77；和Chan PP，等，J Mol Med.1997年4月；75(4)：267-82)。
反义技术在植物中有广泛的应用。例如，如Shimada，等，Theor.Appl.Genet.，86：665-672，(1993)；Kull，等，J.Genet.Breed.，49：67-76，(1995).，Slabs和Elborough，WO 97/07222；Knutzon，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2624-2628，(1992)，和Baulcombe DC.，Plant Mol Biol.1996年10月；32(1-2)79-88)所述，已表明反义RNA有效地下调各种植物基因。
本发明反义核酸包含与目的基因RNA转录物至少一部分互补的序列。虽然优选完全互补，但不是必需的。这里提到的序列“与至少一部分RNA互补”指有能与RNA杂交，形成稳定双链体的足够互补性的序列；因此在本发明双链反义核酸的情况下，可以检测双链体DNA的单链，或可以测定三链体形式。杂交能力将取决于反义核酸的互补程度和长度。一般地，杂交核酸越大，它可以包含的与本发明RNA序列错配的碱基越多，而且仍旧可以形成稳定双链体(可以的情况下，形成三链体)。通过用标准程序测定杂交复合物的熔点，本领域技术人员能够确定可容忍的错配程度。
与信使5’末端如5’非翻译序列，直到并包含AUG起始密码子互补的反义寡核苷酸在抑制翻译时应该最有效地工作。然而，已表明与mRNAs 3’非翻译序列互补的序列在抑制mRNAs翻译时同样是有效的。通常参见，Wagner，R.，Nature，372：333-335(1994)。因此，可以在反义方法中利用与本发明多核苷酸序列5’-或3’-非翻译，非编码区互补的寡核苷酸抑制内源mRNA的翻译。与mRNA 5’非翻译区互补的寡核苷酸应该包含AUG起始密码子的互补序列。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是翻译的不太有效的抑制剂，但是根据本发明可以使用。无论设计与mRNA的5’-，3’-还是编码区杂交，反义核酸长度应该至少是6个核苷酸，而且优选寡核苷酸的长度范围是6到约50个核苷酸。在具体的方面，寡核苷酸至少是10个核苷酸，至少是17个核苷酸，至少是25个核苷酸或至少是50个核苷酸。
可以在碱基部分，糖部分，或磷酸骨架修饰反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包含其它附加基团，如肽，或有利于跨细胞膜(参见，例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT公布号：WO 88/09810，1998年12月15日公布)或血-脑屏障(参见，例如，PCT公布号：WO 89/10134，1988年4月25日公布)转运的因子，杂交触发的切割剂(参见，例如，Krol等，1988，BioTechniques6：958-976)或嵌入剂(参见，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。
寡核苷酸也可以是肽核酸(“PNA”)，该肽核酸(“PNA”)以结合正常DNA碱基的连接N-(2-氨乙基)甘氨酸骨架为基础(Egholm等，1993，Nature 365：566-67)。该PNA服从特异的Watson-Crick碱基配对，但有较大的结合自由能和相应较高的熔解温度。可以完全从PNAs或从混合的PNA和DNA和/或RNA寡聚体构建适合的寡聚体。实际上，与同样序列的DNA:DNA或DNA:RNA嵌合体比较，PNA:DNA嵌合体有增加的溶解特性。更明显地，PNAs有置换DNA双螺旋中一条链的独特能力，因此，使得PNAs在反义应用中高度适合(Uhlmann E.，Biol Chem.1998年8月到9月；379(8-9)：1045-52)。
在优选实施方式中，寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸骨架，所述修饰的磷酸骨架选自：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代亚磷酰胺，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯，和formacetal或其类似物。
在另一个实施方式中，本发明反义寡核苷酸可以包含至少一个修饰的碱基部分，所述的修饰碱基部分选自，但不限于：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，和2，6-二氨基嘌呤。
在另一个实施方式中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的糖部分，所述修饰的糖部分选自，但不限于：阿拉伯糖，2-氟代阿拉伯糖，木酮糖和己糖。
在另一个实施方式中，反义寡核苷酸可以与另一个分子，如肽，杂交触发的交联因子，转运因子，杂交触发的切割因子等缀合。
可以通过本领域已知的标准方法，例如利用自动DNA合成仪(如从Biosearch，Applied Biosystems等购得)合成反义寡核苷酸。举例说明，可以通过Stein等(1988，Nucl.Acids Res.16：3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可以通过利用可控孔玻璃聚合物载体制备甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：7448-7451)等。
在具体实施方式中，寡核苷酸包含催化性RNA，或核酶(参见，例如，PCT国际公布WO 90/11364，1990年10月4日公布；Sarver等，1990，Science 247：1222-1225；Hasselhoff等，Nature342：76-79(1988))。已经利用核酶下调基因表达，而且最近用在植物蛋白质的下调中(参见，例如，PCT公布号WO 97/10328)。在另一个实施方式中，寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.15：6131-6148)，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
其它活性
在另一个实施方式中，用共抑制方法，本发明多肽，编码这些多肽的多核苷酸，其变异体，和/或片段可以用于抑制基因表达。尽管应用共抑制用于抑制植物基因表达已有记载和描述(例如，Seymour等，Plant.Mol.Biol.，23：1-9，(1993)，Brusslan等，Plant Cell，5：667-677，(1993)；Vaucheret等，Mol.Gen Genet.，248：311-317，(1995)；和Jorgensen等，Plant Mol.Biol.，31：957-973，(1996))，但是共抑制机理是未知的。共抑制包括建立组成型表达的载体构建体，所述构建体包含例如CaMV 35S启动子，期望抑制表达的第一基因(R)5’编码区，下游是符合读框的期望抑制表达的第二基因(S)的完整编码区和终止子。用这个载体对植物阳性转化(即，转基因植物)后，无论对于R或S，将都不能检测到可检测的mRNA表达(参见，Seymour，上文)。
本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂也可以增加或降低原生质体细胞，emyloblast细胞等的分化或增殖。
通常，本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂可以用于调节植物，植物细胞和真核细胞及生物体中程序化细胞死亡。通过本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂与调节生物体中程序化细胞死亡的关键基因或蛋白质间的直接或间接相互作用进行这种调节。在国际申请号：WO 00/04173中提供了程序化细胞死亡，特别是植物中程序化细胞死亡相互作用的特异靶(例如，多-ADP-核糖聚合酶(PARP)基因，特别是ZAP类的PARP基因等)。
本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂也可以用于调节植物的性状，如茎高，色素形成，胁迫耐性等。类似地，本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂也可以用于调节植物新陈代谢，所述新陈代谢影响能量的分解代谢，合成代谢，加工，利用和贮藏。
本发明多肽或多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂也可以用做食品添加剂或防腐剂，如增加或降低贮藏性能，脂肪含量，脂质，蛋白质，碳水化合物，维生素，矿物质，辅助因子或其它营养成分。
其它优选的实施方式
所述发明的其它优选实施方式包括分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：X核苷酸序列中至少约50个邻接核苷酸有至少95％同一性的核苷酸序列，其中X是表1中所定义的任何整数。
也优选这样的核酸分子，即其中所述邻接核苷酸序列包含在SEQID NO：X核苷酸序列中，如在表1中对SEQ ID NO：X所定义的，位置范围从大约“克隆的5’-NT”核苷酸位置开始到大约“克隆的3’-NT”核苷酸位置结束。
也优选这样的核酸分子，即其中所述邻接核苷酸序列包含在SEQID NO：X核苷酸序列中，如在表1中对SEQ ID NO：X所定义的，位置范围从大约“克隆ORF起始密码子的5’-NT”核苷酸位置开始到大约“克隆ORF的3’-NT”核苷酸位置结束。
也优选这样的核酸分子，即其中所述邻接核苷酸序列包含在SEQID NO：X核苷酸序列中，如在表1中对SEQ ID NO：X所定义的，位置范围从大约“信号肽第一AA的5’-NT”核苷酸位置开始到大约“克隆ORF的3’-NT”核苷酸位置结束。
也优选这样的分离核酸分子，即其包含与SEQ ID NO：X核苷酸序列中至少约150个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
进一步优选这样的分离核酸分子，即其包含与SEQ ID NO：X核苷酸序列中至少约500个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
进一步优选的实施方式是核酸分子，其包含与SEQ ID NO：X核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列，如表1对SEQ ID NO：X所定义的，从大约“克隆ORF的5’-NT”核苷酸位置开始到大约“克隆ORF的3’-NT”核苷酸位置结束。
进一步的优选实施方式是分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：X完整的核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
也优选在严格杂交条件下与核酸分子杂交的分离的核酸分子，其中所述的杂交核酸分子在严格杂交条件下不与有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的核酸分子杂交。
也优选包含DNA分子的物质组合物(composition of matter)，这DNA分子包含表1中cDNA克隆标识标示的cDNA克隆，其中DNA分子包含在ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏的材料中，而且如表1所示给出了所述cDNA克隆标识的ATCC保藏号。
也优选分离的核酸分子，其包含与cDNA克隆核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列，所述的cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识标示，其中DNA分子包含在给出了表1所示的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选分离的核酸分子，其中所述至少50个邻接核苷酸序列包含在所述cDNA克隆编码的完整开放可读框架序列的核苷酸序列中。
也优选分离的核酸分子，其包含与所述cDNA克隆编码的核苷酸序列中至少150个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
进一步优选的实施方式是分离的核酸分子，其包含与所述cDNA克隆编码的核苷酸序列中至少500个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
进一步优选的实施方式是分离的核酸分子，其包含与所述cDNA克隆编码的完整的核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
另一优选的实施方式是检测生物样品中核酸分子的方法，所述核酸分子包含与选自下面序列组的核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO：X核苷酸序列，其中X是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码的核苷酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识标示，并包含在具有表1所示所述cDNA克隆的ATCC保藏号的保藏物中；所述方法包括比较所述样品中至少一个核酸分子的核苷酸序列与选自所述组的核苷酸序列，和确定该样品中所述核酸分子的序列与所述选定的序列是否有95％的同一性的步骤。
也优选上述方法，其中所述比较序列的步骤包括确定该样品中核酸分子和包含选自所述组的所述序列的核酸分子间核酸杂交的程度。类似地，也优选上述方法，其中通过比较从所述样品中核酸分子所确定的核苷酸序列与选自所述组的所述核苷酸序列进行所述的序列比较步骤。核酸分子可以包含DNA分子或RNA分子。
进一步优选的实施方式是鉴定生物样品的物种，组织或细胞类型的方法，该方法包括检测所述样品中核酸分子的步骤，如果有核酸分子，其包含与选自下面序列组的核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO：X的核苷酸序列，其中X是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码的核苷酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识标示，并包含在具有表1所示所述cDNA克隆的ATCC保藏号的保藏物中。
鉴定生物样品的物种，组织或细胞类型的方法可以包括检测核酸分子的步骤，所述核酸分子包含至少2个核苷酸序列组成的试验组中的核苷酸序列，其中所述试验组中至少一个序列与选自所述序列组的序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％的同一性。
也优选诊断受检者与基因异常结构或表达相关的病理情况的方法，所述基因编码表1中所鉴定的蛋白质，所述方法包括检测从所述受检者得到的生物样品中核酸分子的步骤，如果有核酸分子，其包含与选自下面序列组的核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO：X核苷酸序列，其中X是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码的核苷酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识标示，并包含在具有表1所示所述cDNA克隆的ATCC保藏号的保藏物中。
该诊断病理情况的方法可以包括检测核酸分子的步骤，所述核酸分子包含至少2个核苷酸序列组成的试验组中的核苷酸序列，其中所述试验组中至少一个序列与选自所述序列组的核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％的同一性。
也优选包含分离的核酸分子的物质组合物，其中所述核酸分子的核苷酸序列包含至少2个核苷酸序列组成的试验组，其中试验组中至少一个序列与选自下面序列组的核苷酸序列中至少50个邻接核苷酸的序列有至少95％的同一性：SEQ ID NO：X核苷酸序列，其中X是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码的核苷酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识标示，并包含在具有表1所示所述cDNA克隆的ATCC保藏号的保藏物中。所述核酸分子可以包含DNA分子或RNA分子。
也优选分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：Y氨基酸序列中至少约10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数。
也优选多肽，其中所述邻接氨基酸的序列包含在SEQ ID NO：Y氨基酸序列位置范围“可读框(ORF)的总AA”中，如表1中对SEQ ID NO：Y所述。
也优选分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：Y氨基酸序列中至少约30个邻接氨基酸的序列有至少95％同一性的氨基酸序列。
进一步优选分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：Y氨基酸序列中至少约100个邻接氨基酸的序列有至少95％同一性的氨基酸序列。
进一步优选分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：Y完整氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列。
进一步优选分离的多肽，其包含与cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列中至少约10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选多肽，其中所述邻接氨基酸的序列包含在cDNA克隆编码的蛋白质的氨基酸序列中，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选分离的多肽，其包含与cDNA克隆编码蛋白质的氨基酸序列中至少约30个邻接氨基酸的序列有至少95％同一性的氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选分离的多肽，其包含与cDNA克隆编码蛋白质的氨基酸序列中至少约100个邻接氨基酸的序列有至少95％同一性的氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选分离的多肽，其包含与cDNA克隆编码蛋白质的氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
进一步优选与多肽特异结合的分离抗体，其中所述多肽包含与选自下面组中的氨基酸序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
进一步优选检测生物样品中多肽的方法，其中所述多肽包含与选自下面组的氨基酸序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中；所述方法包括比较所述样品中至少一个多肽分子的氨基酸序列与从所述组选定的序列，和确定在该样品中所述多肽分子的序列与所述至少10个邻接氨基酸的序列是否有至少90％的同一性的步骤。
也优选上述方法，其中比较所述样品中至少一个多肽分子的氨基酸序列与选自所述组的序列的步骤包括：检测该样品中多肽与抗体特异结合的程度，其中所述抗体特异性与下述多肽结合，所述多肽包含与选自下列组的序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选上述方法，其中通过比较从所述样品中多肽分子确定的氨基酸序列与选自所述组的所述氨基酸序列进行所述比较序列步骤。
也优选鉴定生物样品的物种，组织或细胞类型的方法，所述方法包括检测所述样品中多肽的步骤，如果有多肽，所述多肽包含与选自下面序列组的序列中至少约10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选上述鉴定生物样品的物种，组织或细胞类型的方法，所述方法包括检测多肽分子的步骤，所述多肽分子包含至少2个氨基酸序列组成的试验组中的氨基酸序列，其中所述试验组中至少一个序列与选自上述序列组的序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％的同一性。
也优选诊断与具有基因异常结构或表达的生物体相关的病理情况的方法，所述基因编码表1中所鉴定的蛋白质，所述方法包括检测从所述受检者得到的生物样品中多肽分子的步骤，所述多肽分子包含至少2个氨基酸序列组成的试验组中的氨基酸序列，其中所述试验组中至少一个序列与选自下列组的序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％的同一性：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
在上述任何一个方法中，检测所述多肽分子的步骤包括利用抗体。
也优选分离的核酸分子，其包含与编码多肽的核苷酸序列有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述多肽包含与选自下列组的序列中至少10个邻接氨基酸的序列有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；和cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
也优选分离的核酸分子，其中优化所述编码多肽的核苷酸序列以便在原核宿主中表达所述多肽。
也优选分离的核酸分子，其中所述多肽包含选自下列组的氨基酸序列：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数；cDNA克隆编码蛋白质的完整氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。
进一步优选制备重组载体的方法，包括在载体中插入任何上述分离的核酸分子。也优选这种方法产生的重组载体。也优选制备重组宿主细胞的方法，包括引入载体到宿主细胞中，还优选这种方法产生的重组宿主载体。
也优选制备分离多肽的方法，包括在一定条件下培养这种重组宿主细胞使得可以表达所述多肽，和回收所述多肽。也优选制备分离多肽的这种方法，其中所述重组宿主细胞是真核细胞，所述多肽是包含选自下列组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO：Y氨基酸序列，其中Y是如表1所定义的任何整数，SEQ ID NO：Y所述的“ORF的总AA”的位置定义在表1中；和cDNA克隆编码的蛋白质的氨基酸序列，所述cDNA克隆由表1中cDNA克隆标识(ID)标示，并包含在具有表1所示所述cDNA的ATCC保藏号的保藏物中。也优选这种方法产生的分离的多肽。
也优选治疗需要增加蛋白质活性水平的个体的方法，该方法包括给该个体施用包含有效增加该个体所述蛋白质活性水平量的本发明所述分离的多肽，多核苷酸或抗体的药物组合物。
上述应用在广泛的各种宿主中都有用途。这种宿主包括，但不限于：大麦，燕麦，黑麦，高粱，豌豆，向日葵，烟草，棉花，矮牵牛，西红柿，嫩茎花椰菜，莴苣，苹果，李子，柑橘和柠檬，而且更优选稻，玉米，conola，小麦，甜菜，甘蔗和大豆，还有本文其它地方提到的其它宿主。
已经概括地描述了本发明，通过参考下面的实施例，将更容易理解本发明，这些实施例是以示例的方式提供的，并不意味是限制性的。
实施例
优选实施方式的描述
实施例1 展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)培养物的生长
在本研究中，使用的是来自汉堡大学遗传研究部保藏中心(thecollection of the genetic studies section of the University ofHamburg)保藏的展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)(Hedw.)B.S.G.植物种。它们最初是来自于H.L.K.Whitehouse in Gransden Wood，Huntingdonshire(England)收集的株16/14，后者是由Engel(1968，Am J Bot 55，438-446)从孢子继代培养获得的。通过孢子繁殖或配子体再生使植物增殖。由单倍体孢子发育成原丝体，作为富含叶绿体的chloronema和叶绿体低的茎丝体，大约12天后在其上形成芽。它们长出带有精子器和卵子器的配子托。授精后，产生带有短蒴柄的二倍体孢子体和孢子囊，减数分裂后的孢子在其中成熟。
在人工环境室中，于空气温度25℃，光照强度55micromols-1m2(白光；Philips TL 65W/25荧光管)并以16/8小时亮/暗交替的条件下培养。所述的苔藓可用Knop培养基依照Reski和Abel(1985，Planta165，354-358)进行液体培养修饰或在添加了oxoid琼脂(Unipath，Basingstoke，England)的Knop固体培养基上培养。
用于分离RNA和DNA的原丝体在通气液体培养基中培养。所述的原丝体每9天粉碎一次，再转移到新鲜的培养基上。
实施例2-展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)总RNA和poly-(A)+RNA的分离及cDNA文库的构建
为进行转录研究，分离了总RNA和poly-(A)+RNA。按GTC-方法(Reski等1994，Mol.Gen.Genet.，244：352-359)从生长9天的野生型protonemata获得总RNA。
按制造商的建议利用Dyna BeadsR(Dynal，Oslo，Norway)分离Poly(A)+RNA。在确定了所述poly(A)+RNA或RNA的浓度之后通过添加1/10体积的3M醋酸钠pH4.6和2体积的乙醇沉淀，在-70℃条件下保存。
由拟南芥属(Arabidiopsis)种子制备RNA-″热″提取：
1.缓冲液，酶和溶液
-2M KCl
-蛋白酶K
-苯酚(用于RNA)
-氯仿∶异戊醇(苯酚∶氯仿1∶1；针对RNA调pH)
-4M LiCl，DEPC-处理
-DEPC-处理的水
-3M NaOAc，pH 5，DEPC-处理的
-异丙醇
-70％乙醇(用经DEPC-处理的水制备)
-悬浮缓冲液：0.5％SDS，10mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，因该溶液不能经DEPC-处理故用DEPC-处理的水配置
-抽提缓冲液：
0.2M硼酸钠
30mM EDTA
30mM EGTA
1％SDS*(2.5ml缓冲液加250μl 10％SDS-溶液)
1％脱氧胆酸盐(2.5ml缓冲液25mg)
2％PVPP(不溶的-2.5ml缓冲液50mg)
2％PVP 40K(2.5ml缓冲液中加50mg)
10mM DTT*
100mM-硫基乙醇*(新鲜配置，在通风橱中操作-5ml缓冲液用35μl 14.3M溶液)
2.抽提
加热提取缓冲液升温到80℃。在用液氮冷却的研钵中将组织研碎，将组织粉末转移到1,5ml的管中。在加入缓冲液前应保持组织冷冻，因此用预冷的刮铲转移上述组织，全过程始终保持所述的管在液氮中。向管中加入350μl预热的抽提缓冲液(用于100mg组织。对于较大的样品缓冲液的体积可达500μl)，涡旋，使管加热到80℃约1min。然后置于冰上。涡旋样品，再用电动研钵进行额外的研磨。
3.消化
加入蛋白酶K(0.15mg/100mg组织)，涡旋，在37℃下保持1小时。
4.第一次纯化
加入27μl 2M KCl。在冰上冷却10min。室温下12.000rpm离心10min。将上清液转入新的不含RNAase的管中进行一次酚抽提，然后进行氯仿∶异戊醇抽提。加入1体积异丙醇到上清液中，在冰上冷却10min。离心得RNA颗粒状物(RT条件下7000rpm，10min)。将颗粒状物再溶于1ml 4M LiCl，涡旋10到15min。离心5min得颗粒状RNA。
4.第二次纯化
将上述颗粒状物重悬于500μl重悬缓冲液中。加入500μl苯酚涡旋。添加250μl氯仿∶异戊醇，涡旋。旋转5min然后将上清液转移到一只新管中。重复氯仿∶异戊醇抽提直至界面变清。将上清液转移到一个新管中加入1/10体积的3M NaOAc，pH 5和600μl异丙醇。在-20下放置20min或更长。离心10min得RNA颗粒状物。用70％的乙醇清洗所得的颗粒状物一次。去除所有的乙醇然后将所述的颗粒状物溶解于15到20μl DEPC-水中。在260和280nm下测定以1∶200稀释物的吸光值以确定所得RNA的数量和质量。40μg RNA/ml＝1OD260。
为构建cDNA文库，用鼠白血病病毒反转录酶(Roche，Mannheim，Germany)和oligo-d(T)引物合成第一链，在12℃(2h)，16℃(lh)和22℃(lh)下与DNA聚合酶I，Klenow酶一起孵育和RNAseH消化合成第二链。于65℃(10min)下温育终止反应，然后转移到冰上。用T4 DNA-聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃下(30min)使双链DNA分子钝化。苯酚/氯仿抽提并过Sephadex G50离心柱去除核苷酸。用T4 DNA-连接酶(Roche，12℃，过夜)将EcoRI接头(Pharmacia，Freiburg，Germany)连接到cDNA末端，再通过多核苷酸激酶(Roche，37℃，30min)磷酸化。将所述混合物用低熔点琼脂糖凝胶分离。从所述凝胶中洗脱大于300bp的DNA分子，苯酚抽提，经Elutip-D-柱(Schleicher和Schuell，Dassel，Germany)浓缩，与载体臂相连后用Gigapack GoldKit(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)采用制造商的材料并按照它的说明包装到λZAPII噬菌体或λZAP-表达噬菌体中。
实施例3-展叶剑叶藓(Physcomitrlela patens)ESTs的测序和功能注释
如实施例2所述的cDNA文库依照标准的方法进行DNA测序，具体地说是通过ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(Perkin Elmer，Weiterstadt，德国)利用链终止法进行。通过体内大量切出，再转化，然后将DH10B涂布于琼脂平板上，从cDNA文库进行制备性的质粒回收，然后进行随机测序(材料和方法的详细描述来自Stratagene，Amsterdam，Netherlands)。质粒DNA由在含有氨苄青霉素的Luria-Broth培养基中过夜培养的大肠杆菌培养物通过Qiagene DNA制备机器人(Qiagen，Hilden)依照制造商的建议制备(参见Sambrook等(1989)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress：ISBN 0-87969-309-6))。测序引物的核苷酸序列如下：
Qiagen1：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′(SEQ ID NO：12)
Qiagen2：5′-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3′(SEQ ID NO：13)
Qiagen3：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′(SEQ ID NO：14)
用可由Bio-Max(Munich，Germany)购置的EST-MAX软件包对序列进行加工和注释。所述的程序几乎整合了所有对蛋白序列结构和功能表征重要的生物信息学方法。参见http：//pedant.mips.biochem.mpg.De。
整合到EST-MAX中的最重要的算法是：
FASTA：非常灵敏的数据库检索，评估统计学显著性；Pearson W.R.(1990)用FASTP和FASTA进行快速灵敏的序列比较MethodsEnzymol.183：63-98。
BLAST：非常灵敏的数据库检索，评估统计学显著性。Altschul S.F.，Gish W.，Miller W.，Myers E.W.，和Lipman D.J.基本局部对比检索工具。Journal of Molecular Biology 215：403-10。
PREDATOR：从单一和多重序列进行二级结构预测。Frishman，D.和Argos，P.(1997)在蛋白二级结构预测中具有75％的准确度Proteins，27：329-335。
CLUSTALW：多重序列对比。Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：通过序列加权，位点特异性的gap罚分和加权矩阵选择提高累积多重序列对比的灵敏度。Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680。
TMAP：由多重对比的序列进行跨膜区域的预测Persson，B.和Argos，P.(1994)利用多重序列对比预测蛋白中的跨膜节段。J.Mol.Biol.237：182-192。
ALOM2：由单一的序列预测跨膜区域。Klein，P.，Kanehisa，M.，和DeLisi，C.由序列属性进行蛋白功能预测：数据库的判别式分析。Biochim.Biophys.Acta 787：221-226(1984)。第2版，Dr.K.Nakai。
PROSEARCH：PROSITE蛋白序列模式的检测。Kolakowski L.F.Jr.，Leunissen J.A.M.，Smith J.E.(1992)ProSearch：用与蛋白结构和功能相关的常规表达模式快速检索蛋白序列。Biotechniques13，919-921。
BLIMPS：针对ungapped区段数据库的相似性检索。J.C.Wallace和Henikoff S.，(1992)。
PATMAT：序列，模式和区段查询和数据库的检索和提取程序，CABIOS 8：249-254.Bill Alford编写。
实施例4-相应于PrPase的拟南芥，大豆和玉米ORFs的鉴定
展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)，PpPrPase(SEQ ID NO：1)，在EST MAX中通过BLAST分析进行了鉴定。BLAST中最佳命中(tophit)的是拟南芥未知ORF。第二和第三命中的是人和酵母caax异戊二烯基蛋白酶。对未知拟南芥ORF的进一步分析揭示出它是用计算机程序Genefinder(P.Green和L.Hillier，www.ncbi.nlm.nih.gov)通过计算机分析预测的ORF。该ORF位于BAC克隆AF007269(GenBankaccession number，gene＝″A-IG002N01.21)的互补链24979到28076位。
用这一计算机预测的拟南芥AtPrPase cDNA作为query(查询)，BLAST在多种玉米和大豆数据库中检索已鉴定出一个玉米ZmPPaseEST(SEQ ID NO：9)和一个大豆GmPPase EST(SEQ ID NO：7)。
实施例5-克隆编码PrPase的拟南芥属cDNA
从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中分离总RNA
用稍加修改的Van Slogteren(1983 Plant Mol.Biol.2：321-333.)方法从14天龄的野生型拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中分离总RNA。用液氮使组织(200mg)冻结用研钵和捣棒研磨成细粉。用500ul预热至90℃的抽提缓冲液(苯酚：0.1M LiCl，100mM TrisHCl[pH8.0]，10mM EDTA，1％ SDS(w/v)[1∶1])抽提总RNA。将所得的混合物在90℃下进一步加热1min，然后涡旋5min。加250ul氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提蛋白，将所得的混合物涡旋5min，然后在Eppendorf离心机5414中于4℃13,000rpm离心15min。去除含水层，再重复抽提蛋白两次。加入1体积4mM LiCl，在4℃下沉淀RNA过夜。为收集RNA，将所述的混合物在Eppendorf centrifuge 5414中于4℃13,000rpm离心15min。将所得的颗粒状物重悬于250μl无菌的去离子水中。添加0.1体积3M醋酸钠(pH5.2)和2体积100％乙醇沉淀RNA。取一小份在Eppendorf centrifuge 5414中于4℃13,000rpm离心20min。用70％的乙醇洗所得的颗粒状物以去除其中的盐，再用speed vac干燥。将所得的颗粒状物重悬于25μl DEPC H2O中通过电泳分析其完整性。将所述的RNA于-70℃下贮存。
RT-PCR和拟南芥属AtPrPase的克隆
基于BAC克隆序列(GenBank accession number AF007269，gene＝″A_IG002N01.21″，complement 24979...28076)设计合成的寡核苷酸引物(MWG-Biotech)。
APP正向：5’CCGTTAACAGCCATGGCGATTCCTTTCATGGAA 3’(SEQ IDNO：15)
APP反向：5’GTCCCGGGACTTAATCTGTCTTCTTGTCTT 3’(SEQ ID NO：16)
为进行克隆，所设计的引物包含位于5’区域的HpaI位点和位于3’区域的XmaI位点。
第一链的合成是用AMV反转录酶(Roche，Mannheim，Germany)实现的。所得的单链cDNA用两基因特异的引物通过多聚酶链式反应(PCR)扩增。反应条件是高保真PCR系统(Roche)的标准条件。扩增反应的参数为：94℃下5min，然后经过94℃下40sec，50℃下40sec，72℃下1.5min，共5个循环。接下来是94℃下40sec，65℃下40sec，72℃下1.5min，共30个循环。在这些RT PCR条件下产生的片段长1.3kb。
所得的片段利用QIAquick Gel抽提Kit(Qiagen)经琼脂糖凝胶分离，然后依照制造商的建议连接到TOPO pCR 2.1载体(Invitrogen)上。将重组载体通过标准的技术转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。转化细胞经含有100μg/ml氨苄青霉素，0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙硫脲-β-D-半乳糖苷)LB琼脂中37℃过夜培养进行筛选。挑出白色的克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB中于37℃过夜培养。用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen)依照制造商的建议提取质粒DNA。
测序RT-PCR克隆的拟南芥AtPrPasel-2以获得其cDNA序列(SEQID NO：3和SEQ ID NO：5)。
实施例6-SM3614酵母(PrPase)突变体的体内互补
依照制造商的建议将含有拟南芥AtPrPasel cDNA片段从重组PCR2.1 TOPO载体中经EcoRI(Roche)消化切出。用QIAquick Gel抽提Kit(QIAgen)依制造商的建议将所得的片段从琼脂糖中切出，再连接到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，该载体同样经EcoRI消化并在连接前去磷酸化。
含有以正向处于酵母GAL1启动子之下的拟南芥AtPrPase1 cDNA的重组表达载体pYES2，依照Invitrogen的方法转移到酵母突变体SM3614(MATa rcelΔ∷TRP1 ste24D∷LEU2)(Tam等1998)中。所得的转化细胞在缺少尿嘧啶的完全添加物混合物(CSM)0.8％琼脂(Bio101，Inc.)上于30℃下生长两天进行筛选。挑出转化克隆制成在缺少尿嘧啶的CSM平板上含有经转化的SM3614斑的主平板，在所述的CSM平板中添加2％半乳糖以诱导拟南芥AtPrPase1表达。使上述主平板在30℃下生长两天。在不同的交配条件下，将所述的主平板复印到在添加了2％半乳糖的SD平板上的野生型酵母SM 1068(MATα lysj)菌苔上(Tam等1998，The Journal of Cell Biology，142，635-649)，在30℃下生长两天。
实施例7-编码PrPase的大豆和玉米cDNA的克隆
大豆和玉米cDNA文库的构建
为分离编码PrPase的克隆，依照制造商的建议用SMART RACEcDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)构建了大豆和玉米的cDNA文库。用在实施例5中获得的总RNA作为模板，3周龄的玉米叶和茎、大豆叶分别用于制备总RNA。
编码PrPase的大豆和玉米cDNAs的克隆
将实施例4中描述的数据库检索鉴定的ZmPrPase和GmPrPase的EST序列用来设计用于RACE的寡聚物。扩展的部分ZmPrPase amdGmPrPase序列是依制造商的建议用Advantage 2 PCR kit(ClontechLaboratories)和SMART RACE cDNA扩增kit(Clontech Laboratories)利用Biometra T3 Thermocycler，通过cDNA末端快速扩增多聚酶链式反应(RACE PCR)获得的。所用的基因特异的合成寡核苷酸引物(MWG-Biotech)是：
用于ZmPrPase：
5’RACE oligo：5’AGCAGCCACGATTGGTGGCCCCAAT 3’(SEQ ID NO：21)
3’RACE oligo：5’GGGCCACCAATCGTGGCTGCTATCA 3’(SEQ ID NO：22)
用于GmPrPase：
5’RACE oligo：5’CGCAGCCAGTCCTCATTGGGCTCATC 3’(SEQ ID NO：23)
3’RACE oligo：5’CGGATAGTTGAGGGAGGAAGCAAG 3’(SEQ ID NO：24)
编辑通过RACE反应获得的序列给出部分GmPrPase(SEQ ID NO：7)和部分ZmPrPase(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列。
实施例8-通过降低内源PrPase基因的活性构建耐旱的拟南芥属植物
二元载体的构建：pGMSG和pGMGG
用HindIII(Roche)消化pLMNC53(Mankin，2000，PHD thesis)载体，再用Klenow酶和0.1mM dNTPs(Roche)依制造商的建议填平末端。用QIAquick Gel抽提Kit(Qiagen)依制造商的建议从琼脂糖凝胶中抽提这一片段。然后用EcoRI(Roche)依制造商的建议消化经纯化的片段。用QIAquick Gel抽提Kit(Qiagen)依制造商的建议从琼脂糖凝胶中抽提这一片段。所得的1.4kb的片段，庆大霉素框，包括nos启动子，aacCI基因和g7终止子。
载体pBlueScript依制造商的建议用EcoRI和SmaI(Roche)消化。用QIAquick Gel抽提Kit(Qiagen)依制造商的建议从琼脂糖凝胶中抽提所得的片段。经消化的pBlueScript载体和庆大霉素框片段用T4DNA连接酶(Roche)依制造商的建议连接，连接各自的EcoRI位点，及连接平末端化的HindIII位点和SmaI位点。
用标准的技术将重组载体(pGMBS)转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。转化细胞经含有100μg/ml氨苄青霉素，0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙硫脲-ρ-D-半乳糖苷)LB琼脂中37℃过夜培养进行筛选。挑出白色的克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB中于37℃过夜培养。用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen)依照制造商的建议提取质粒DNA。用标准的分子生物学技术分析所得的克隆和制作限制性图谱(Sambrook等1989)。
pGMBS和plbxSuperGUS载体均用XbaI和Kpnl(Roche)依制造商的建议消化，从pGMBS中切出庆大霉素框，由plbxSuperGUS载体产生骨架。用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)依照制造商的建议抽提所得的片段。将两片段用T4 DNA连接酶(Roche)依制造商的建议连接。
用标准的技术将所得重组载体(pGMSG)转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。转化细胞经含有100μg/ml氨苄青霉素，0.8mgX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙硫脲-ρ-D-半乳糖苷)LB琼脂中37℃过夜培养进行筛选。挑出白色的克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB中于37℃过夜培养。用QIAprepSpin Miniprep Kit(Qiagen)依照制造商的建议提取质粒DNA。用标准的分子生物学技术分析所得的克隆和制作限制性图谱(Sambrook等1989)。
两pBinK载体均包含保卫细胞特异性的启动子KST1(BerndMuller-Rober，1999)，pGMSG载体用XbaI和SmaI依制造商的建议消化，从pBinK中切出KST1，由pGMSG产生骨架。依制造商的建议用QIAquick Gel抽提Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中抽提所得的片段。将这两个片段用T4 DNA连接酶(Roche)依制造商的建议连接。
用标准的技术将重组载体(pGMGG)转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。转化细胞经含有100μg/ml氨苄青霉素，0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙硫脲-β-D-半乳糖苷)LB琼脂中37℃过夜培养进行筛选。挑出白色的克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB中于37℃过夜培养。用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen)依照制造商的建议提取质粒DNA。用标准的分子生物学技术分析所得的克隆和制作限制性图谱(Sambrook等1989)。
植物二元载体的另一个例子是在其中克隆了LMP基因候选物的pBPS-GB1。所述的二元载体包含在AtAct2-I启动子控制之下的卡那霉素抗性基因，和在带有NOSpA终止子的候选物基因前面的USP种子特异的启动子。将部分或全长的LMP cDNA以正向或反向克隆到植物二元载体的USP种子特异的启动子后面。用标准的条件将包含有用基因的重组载体转化到Topl0细胞(Invitrogen)中。转化细胞在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂中37℃生长过夜。依制造商的建议用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qiagen)抽提质粒DNA。用标准的分子生物学技术分析所得的克隆和制作限制性图谱(Sambrook等1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)。
将拟南芥AtPrPasel亚克隆到二元载体中
用HpaI和XmaI(Roche)依制造商的建议消化重组的PCR2.1 TOPO载体，从中切出含拟南芥PPase cDNA的片段。依制造商的建议用QIAquick Gel抽提Kit(QIAgen)抽提所述片段，将其分别连接到用XmaI和Ec1136II切割并在连接前进行了去磷酸化的二元载体pGMSG和pGMGG中，以及在连接前用AsCI和PacI消化并带有USP启动子的二元载体pBPSGB01中。所得的重组pGMSG，和pGMGG载体包含拟南芥异戊二烯基蛋白酶，其以反向处于组成型的超启动子和保卫细胞特异启动子KST1的控制之下。所述的pBPSGB01载体包含正向和反向的拟南芥PPase cDNA，并受控于种子特异性USP启动子。
土壤杆菌属(Agrobacterium)转化
用标准的条件(Hoefgen和Willmitzer，1990)将所述的重组载体转化到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1和PMP90中。
植物转化
用标准的技术(Bechtold 1993，Acad.Sci.Paris.316：1194-1199，Bent等1994，Science 265：1856-1860)培养并转化拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)生态型C24和Col-2。
转化植物的筛选
依照标准的方法(Xiong等1999，Plant Molecular BiologyReporter 17：159-170)将种子消毒。将种子种到添加了1-3％蔗糖和50-150μg/ml庆大霉素的1/2 MS 0.6％琼脂中。在4℃下使平板上的种子春化2天。使种子在温度为22℃光照强度为55micromols-1m2(白光；Philips TL 65W/25荧光管)并提供24小时光照的人工环境室中萌发。7-14天后筛选转化的幼苗，并将其转移到添加了1％蔗糖的1/2 MS 0.6％琼脂平板上恢复1-5天。
耐旱筛选
依照下述的筛选方法筛选耐干旱性能有所提高的转化植物(将幼苗转移到干的无菌滤纸上使其干燥4小时。然后将幼苗置于1/2 MS0.6％琼脂平板上，两天后记录。
耐盐筛选
依照下述的筛选方法筛选耐盐性能有所提高的转化植物(将幼苗转移到添加了600mM NaCl的1/2 MS液体中培养2-4小时。然后将幼苗置于1/2 MS 0.6％琼脂平板上，两天后记录存活的幼苗)。
种子储藏化合物的筛选
依照实施例34中所述的方法(见下)筛选种子储藏化合物(油，糖，蛋白)有所提高的转化植物的T2和T3种子。
实施例9-通过降低内源GmPrPase基因的活性构建耐干旱的大豆植物
将克隆GmPrPase(SEQ ID NO：7)以反义方向克隆到pGMSG和pGMGG中。如下所述，这些构建体用于转化大豆。
用70％乙醇在室温下连续振荡4min对大豆种子进行表面消毒，接下来，用加入了0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)次氯酸钠连续振荡20min。然后用双蒸水将种子清洗4次，置于培养皿中湿润的无菌滤纸上于室温下放置6到39小时。剥去种子的外壳，从胚轴中分离子叶。检测上述的胚轴以确定分生组织区域没有被破坏。将切出的胚轴收集到半开放的无菌培养皿中空气干燥使水分含量低于20％(鲜重)，在密封的培养皿中备用。
从添加了适量抗生素(例如100mg/l链霉素，50mg/l卡那霉素)的LB固体培养基中的单菌落制备根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)培养物，将所述的单菌落在液体LB培养基中培养至600nm下的光密度为0.8。在室温下将细菌培养物经7000rpm离心7min得颗粒状物，重悬于添加了100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的MS(Murashige和Skoog，1962)培养基中。使用前将细菌培养物在这一预诱导培养基中于室温下培养2小时。处于约15％水分含量中的大豆合子种子胚的轴在室温下浸润于预诱导土壤杆菌属(Agrobacterium)悬浮培养物2小时。从浸润培养物中取出胚，将其转移到含有添加了2％蔗糖的MS培养基的培养皿于室温下黑暗中培养2天。或者，将胚置于培养皿中湿润的(液体MS培养基)无菌滤纸上并于与上述相同的条件下培养。这一阶段后将所述的胚转移到添加了500mg/L氨苄青霉素或300mg/L头孢噻肟固体或液体的MS培养基中以杀死土壤杆菌。用液体培养基浸润无菌的滤纸。将所述的胚在25℃150μmol m-2sec-1和12小时光周期下培养4周。胚生根后将其转移到无菌的metromix土中。在将体外培养的植物转移到土中之前洗去上述的培养基。使所述植物处于塑料盖中1周以促进驯化过程。然后将所述植物转移到生长室，在25℃，150μmol m-2sec-1光照强度和12小时光周期条件下培养80天。
依照实施例7中所述的方法筛选耐旱能力提高的植物，证明转基因的表达赋予了植物耐旱性。
实施例10-用AtPrPase1克隆降低内源PrPase基因的活性构建耐旱的菜籽油菜植物
依下述用构建体pBPSRC003和pBPSRC005转化菜籽油菜(rapeseed)。
实施例8中所述的植物转化方法也适用于芸苔属和其他作物。用70％乙醇在室温下连续振荡4min对canola种子进行表面消毒，接下来，用加入了0.05％(v/v)Tween的20％(v/v)次氯酸钠连续振荡20min。然后用双蒸水将种子清洗4次，置于培养皿中湿润的无菌滤纸上于室温下放置18小时。剥去种子的外壳在半开放的无菌培养皿中干燥过夜，在这一阶段中种子失去约85％的水分。然后将所述的种子与密封的培养皿中于室温下贮存备用。DNA构建体和胚浸润如实施例8所述。原始的转基因植物样品(TO)通过PCR分析以确定其T-DNA的存在。这些结果可通过Southern杂交确证，其中DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳后转移到带正电的尼龙膜上(Roche Diagnostics)。采用PCR DIG探针Synthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR制备用洋地黄毒苷标记的探针并依照制造商的建议使用。
依照实施例7中所述的方法筛选耐旱能力有所提高的植物，证明转基因的表达赋予了植物耐旱性。
实施例11-通过降低内源ZmPrPase基因的活性构建耐干旱的玉米植物
将克隆GmPrPase(SEQ ID NO：9)以反义方向克隆到载体pGMSG和pGMGG。如下所述这些构建体用于转化玉米。
用土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物浸润干胚也适用于玉米的胚轴。除了用玉米种子作为胚的来源之外，其他的实验方法与实施例8中所述的相同。
依照实施例7中所述的方法筛选耐旱能力有所提高的植物，说明转基因的表达赋予了植物耐旱性。
实施例12-AtPrPase1启动子的保卫细胞特异性表达
将AtPrPase(SEQ ID NO：11)的启动子区域克隆到pGMSG中替代超级启动子，以驱动报告基因GUS(Jefferson等，1987)。所得的构建体pBPSRC006如实施例7所述转化到拟南芥属植物中。
依照实施例7中所述的方法筛选保卫细胞特异染色的植物，说明转基因的表达赋予了保卫细胞特异的启动子活性。
实施例13-PrPase在植物中的过表达导致胁迫耐性和植物生长的提高
将克隆AtPrPase1(SEQ ID NO：3)，AtPrPase2(SEQ ID NO：5)以有义方向克隆到载体pGMSG中。分别如实施例7，8，9，和10所述将这些构建体用于转化拟南芥，大豆，菜籽油菜和玉米。
依照实施例7中所述的方法筛选胁迫耐性有所提高的植物，说明转基因的表达赋予了植物胁迫耐性。
进一步筛选生长速率提高的植物，说明转基因的表达赋予了生长速率提高。
实施例14-从保藏的样品中分离特定的克隆
对于任意给定的cDNA克隆，赋予了表1中列出的ATCC保藏号的样品中的保藏材料还可以包含一个或多个附加的质粒，每个质粒包含不同于给定克隆的cDNA克隆。因此，对于表1中鉴定的每一cDNA克隆，享有同一ATCC保藏号的保藏物包含至少一种质粒。典型地，表1中列出的每一种ATCC保藏样品包含大约等量(重量)的约1-10种质粒DNAs，每一种包含不同的cDNA克隆和/或部分cDNA克隆；但这种保藏样品可包含多于或少于2种cDNA克隆的质粒。
可用两种方法从表1中列出的质粒DNA保藏样品中分离特定的克隆。第一，用相应于SEQ ID NO：X的多核苷酸探针直接筛选克隆分离质粒。
尤其是用Applied Biosystems DNA合成仪依照报道的序列合成30-40核苷酸长度的多核苷酸。所述的寡核苷酸可以用，例如32P-(-ATP用T4多核苷酸激酶标记，并用常规的方法纯化。(例如Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Cold Spring，NY(1982).)。用本领域已知的技术将所述的质粒混合物转化到合适的宿主中，如上述的(如XL-1Blue(Stratagene))，所述技术如载体供应商，上文用引用的相关出版物或专利文献中提供的。将转化子涂布于1.5％琼脂平板(含有合适的筛选试剂，如氨苄青霉素)，每皿获得约150个转化子(菌落)。用常规的细菌菌落筛选法或其他本领域已知的方法通过尼龙膜筛选这些平皿(如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEdit.，(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pages 1.93to 1.104)。
作为替代方案，合成来自SEQ ID NO：X两端(即，表1中所定义的克隆的5’NT和3’NT界定的SEQ ID NO：X区域内)的17-20核苷酸长度的两引物，以保藏的cDNA质粒为模板扩增所需的cDNA。在常规的条件下进行聚合酶链式反应，例如25μl反应混合物0.5μg上述模板cDNA。常规的反应混合物是1.5-5mM MgCl2，0.01％(w/v)明胶，20μM每种dATP，dCTP，dGTP，dTTP，25pmol每种引物和0.25单位的Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪进行35个PCR(94℃下变性1min；55℃下退火1min；72℃下延长1min)，通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的产物，切出所需分子量的DNA带进行纯化。通过亚克隆和DNA产物测序证明所述的PCR产物是所选择的序列。
可用几种方法鉴定可能不存在于保藏克隆中的基因的5’或3’非编码和/或编码部分。这些方法包括但不限于过滤探测(filter probing)，用特定的探针进行克隆富集，和本领域已知的与5’和3’″RACE″方法类似或相同的方法。例如类似于5’RACE的方法可用于产生所需全长转录物的丢失5’末端(Fromont-Racine等，Nucleic Acids Res.21(7)：1683-1684(1993))。
简要地说，将特定的RNA寡核苷酸连接到推定含有全长基因RNA转录物的RNA群的5’末端。含有特异于连接的RNA寡核苷酸的引物和特异于已知的有用基因的序列的引物的引物对用于PCR扩增所需全长基因的5’部分。然后将这一扩增产物测序并用于产生全长的基因。
尽管poly-A+RNA可以使用，上述的方法由从有用来源中分离的总RNA开始。若需要从降解的破坏的RNA中清除5’的磷酸基团，其可能干扰后续的RNA连接酶的步骤，可用磷酸酶处理上述的RNA制品。此后应灭活磷酸酶，用烟酸焦磷酸酶处理所述的RNA以去除信使RNA5’末端的帽子结构。这一反应在去除了帽子结构的RNA的5’端留下5’磷酸基团，该RNA可通过T4 RNA连接酶与RNA寡核苷酸连接。
经修饰的RNA可用作利用基因特异的寡核苷酸合成第一链cDNA的模板。第一链合成反应可用作PCR扩增所需5’末端的模板，所述的PCR反应利用特异于所连接的RNA的寡核苷酸的引物和特异于已知有用基因序列的引物。然后将这一扩增产物测序确证所述的5’末端序列属于该有用基因。而且可以有利地优化RACE方法以提高分离出附加的5’或3’编码或非编码序列的可能性。多种优化RACE方法的方法都是本领域已知的，这些方法的详细描述参见B.C.Schaefer，Anal.Biochem.，227：255-273，(1995)。
实施例15-多肽的组织分布
用Sambrook等的文章及其他文献中所述的Northern blot试验确定本发明的多核苷酸的mRNA表达的组织分布。例如，由实施例1中所述方法产生的cDNA探针通过rediprimetm DNA标记系统(AmershamLife Scinece)依制造商的建议用P32标记。标记后用CHROMA SPINO-100柱(Clontech Laboratories，Inc.)依制造商的建议PT1200-1纯化所述的探针。经纯化的标记探针可用于检测多种组织中的mRNA表达。
依制造商的建议PT1190-1用ExpressHybtm杂交溶液(Clonetech)由标记的探针检测含有不同组织的结合mRNA的组织Northern印迹。可用已知的多种方法(如，Sambrook等)进行Northern印迹。杂交洗膜后，将膜固定并暴露于胶片于70℃下过夜，然后根据标准的程序显影所述胶片。
实施例16-多核苷酸的染色体作图
依照SEQ ID NO：X5’末端的序列设计寡核苷酸引物对。这一引物优选地跨越约100个核苷酸。然后将这一引物对用于下述条件下的多聚酶链式反应：95℃下30sec；56℃下1min；70℃下1min。将这一循环重复32次，接下来是一个70℃下5min的循环。植物DNA用作模板外加含有各染色体或染色体片段的体细胞杂种细胞板(Bios，Inc)。所述的反应在8％聚丙烯酰胺凝胶或3.5％琼脂糖凝胶上进行分析。染色体作图由在特定的体细胞杂种中存在约100bp PCR片段而确定。
实施例17-多肽的细菌表达
编码本发明的多肽的多核苷酸用相应于所述DNA序列5’和3’的寡核苷酸引物通过PCR扩增，如实施例1中所概括的，以合成插入片段。为了将所述的扩增产物克隆到表达载体中，用于扩增cDNA插入物的所述引物在其5’末端应优选地包含限制性位点，如BamHI和XbaI。例如，BamHI和XbaI相当于细菌表达载体pQE-9的限制性酶切位点(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)。这一质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)，细菌复制起点(ori)，IPTG-调节的启动子/操纵基因(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6-组氨酸尾(6-His)，和多克隆位点。
将所述的pQE-9载体用BamHI和XbaI酶切，然后将扩增片段连接到pQE-9载体并保持阅读框起始于细菌的RBS。用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，该菌株包含多拷贝的质粒pREP4，其表达lad阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过其在LB平板上的生长能力鉴定转化子，筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并通过酶切分析确证。
使含有所需构建体的克隆在添加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。所述的O/N培养物以1∶100到1∶250的比例接种大量培养物。使所述的细胞生长到光密度600(O.D.600)在0.4和0.6之间。加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)至终浓度为1mM。IPTG通过灭活lacI阻遏物诱导，清除P/O使基因的表达量提高。
使细胞再生长3到4小时，离心收集细胞(20min 6000Xg)。在4℃下搅拌3-4小时使所得的细胞颗粒状物溶于chaotropic试剂6摩尔的盐酸胍中。离心去除细胞碎片，将含有所述多肽的上清液装入镍-次氮基-三-乙酸(″Ni-NTA″)亲和树脂柱(购自QIAGEN，Inc.，supra)。以高亲和力结合到Ni-NTA树脂上的带有6xHis tag的蛋白可通过一步法纯化(详细内容参见：The QIAexpressionist(1995)QIAGEN，Inc.，见上)。
简要地说，将上清液上样于6M盐酸胍pH 8中的柱，该柱首先用10体积的6M盐酸胍，pH 8洗，然后用10体积6M盐酸胍pH 6洗，最后用6M盐酸胍pH 5洗脱所述的多肽。
经纯化的蛋白在磷酸盐缓冲液(PBS)或添加了200mM NaCl的50mM醋酸钠pH 6缓冲液中中透析复性。或者，所述的蛋白当固定于Ni NTA柱期间可成功地再折叠。推荐的条件是：用含蛋白酶抑制剂的500mMNaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH 7.4中的线性6M-1M梯度尿素复性。复性过程应在1.5小时或更长的时间内进行。复性后添加250mM咪唑洗脱所述的蛋白。最后在PBS或添加了200mM NaCl 50mM醋酸钠pH6缓冲液中的透析步骤将去除咪唑。经纯化的蛋白于4℃或冷藏于-80℃保存。
实施例18-从包含体中纯化多肽
下述可供选择的方法可用于纯化以包含体的形式在大肠杆菌中表达的多肽。除非特别说明所有的步骤均在4-10℃下进行。
大肠杆菌生产阶段完成后，将细胞培养物冷冻至4-10℃，连续在15,000rpm(Heraeus Sepatech)下离心收集细胞。在预期每单位细胞团中蛋白产量和所需纯化蛋白的基础上，将适当重量的细胞团悬浮于含有100mM Tris，50mM EDTA，pH 7.4的缓冲液中。用高速剪切搅拌器使所述的细胞成为均匀分布的悬液。
使所述溶液以4000-6000psi通过微流体化仪(microfluidizer)(Microfuidics，Corp.或APV Gaulin，Inc.)两次裂解细胞。使所述的组织匀浆与NaCl溶液混合至终浓度为0.5M NaCl，然后7000xg离心15min。用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH 7.4洗所得的颗粒状物。
将清洗后的包含体溶解于1.5M胍盐酸盐(GuHCl)2-4小时。然后7000xg离心15min，弃去所得的颗粒状物，将含有所述多肽的上清液于4℃温育过夜以进行进一步的GuHCl抽提。
高速离心(30,000xg)去除不溶颗粒，通过有力地搅拌快速混合GuHCl提取物和20体积的含有50mM钠，pH 4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的缓冲液使可溶于GuHCl的蛋白再折叠。在进一步的纯化步骤之前将再折叠的稀释蛋白溶液在4℃下不搅拌放置12小时。
为使再折叠的多肽溶液澄清，用预先制备的配有具有适当表面积的0.16μm膜过滤器(如，Filtron)的切线过滤装置，以40mM醋酸钠，pH 6.0平衡。将过滤后的样品上样于阳离子交换树脂(如，PorosHS-50，Perseptive Biosystems)。所述的柱用40mM醋酸钠，pH 6.0洗，用相同缓冲液中的250mM，500mM，1000mM，和1500mM NaCl以逐步的方式洗脱。连续检测洗脱液在280nm的吸光值。收集组分进一步通过SDS-PAGE分析。
合并含有所述多肽的组分并与4体积的水混合。将洗脱的样品上样于预先制备的一组串联的强阴离子(Poros HQ-50，PerseptiveBiosystems)和弱阴离子(Poros CM-20，Perseptive Biosystems)交换树脂柱。所述的柱用40mM醋酸钠，pH 6.0平衡。两柱均用40mM醋酸钠，pH 6.0，200mM NaCl洗。然后将所述的CM-20柱用10柱体积的范围从0.2M NaCl，50mM醋酸钠，pH 6.0到1.0M NaCl，50mM醋酸钠，pH 6.5线性梯度洗脱。在恒定的A280下检测流出物并收集所述组分。合并包含所述多肽的组分(通过例如16％SDS-PAGE确定)。
经过上述的再折叠和纯化步骤后所得的多肽应表现出高于95％纯度。上样5μg纯化蛋白跑16％SDS-PAGE凝胶经考马斯蓝染色应当没有主要的杂带出现。所述的经纯化的蛋白也可以测试其内毒素/LPS污染，依照LAL试验，典型的LPS含量低于0.1ng/ml。
实施例19-多肽在杆状病毒表达系统中的克隆和表达
在这一实施例中，质粒改组载体pAc373用于将多核苷酸插入杆状病毒以表达多肽。典型的杆状病毒表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，接下来是方便的限制性酶切位点，其可包含，例如BamHI，XbaI和Asp718。猿病毒40(″SV40″)聚腺苷酸位点常用于高效腺苷酸化。为便于筛选重组病毒，质粒包含以相同方向受控于弱果蝇启动子的来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，然后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。所插入基因的两侧都是病毒序列，以便于细胞介导的与野生型病毒DNA间的同源重组以表达有活力的病毒进而产生所述的多核苷酸。
本领域的技术人员可知，只要构建体为转录、翻译和分泌等提供适当的定位信号，包括信号肽或所需要的框内AUG，许多其他的杆状病毒载体如，pVL941和pAcIMl也可以用于替代上述的病毒载体。对这种载体的描述参见，例如Luckow等，Virology 170：31-39(1989)。
编码本发明的多肽的多核苷酸用相应于所述DNA序列5’和3’的寡核苷酸引物通过PCR扩增，如实施例1中所概括的，以合成插入片段。为了将所述的扩增产物克隆到表达载体中，用于扩增cDNA插入物的所述引物在其5’末端应优选地包含限制性位点。具体地，包含在保藏克隆中的cDNA序列，包括AUG起始密码子和在本文中其他部分已经鉴定出的天然相关的前导序列(如果适用的化)，可用实施例1中所述的PCR方法扩增。如果用天然存在的信号序列以产生蛋白，所述载体不需要包含第二信号肽。或者，用Summers等，″A Manual of Methods forBaculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，″TexasAgricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)中所述的标准方法，可修饰所述的载体使其包含杆状病毒前导序列。
用可商购的试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)将扩增片段从1％琼脂糖凝胶分离出来，再用适当的限制酶消化分离出的片段，并再次经1％琼脂糖凝胶纯化。
将所述质粒用相应的限制酶消化，可选择地通过本领域已知的方法用小牛肠道磷酸酶去磷酸化。用可商购的试剂盒(″Geneclean，″BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)将所述DNA从1％琼脂糖凝胶上分离出来。
所述的片段和去磷酸化质粒用T4 DNA连接酶连接在一起。将所述的混合物转化E.coli(大肠杆菌)HB101或其他合适的E.Coli宿主，如XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)细胞，然后将其涂布于培养平板上。通过消化来自不同克隆的DNA鉴定含有所述质粒的细菌，并通过凝胶电泳分析消化产物。通过DNA测序确定克隆片段的序列。
含有所述多核苷酸的5μg质粒与1.0μg可商购的线性杆状病毒DNA(″BaculoGoldtm杆状病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA)用Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417(1987)所述的脂质转染法共转化。1μg BaculoGoldtm病毒DNA和5μg质粒混合于含有50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologoes Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定板的孔中。然后加入10μl Lipofectin加90μl Grace’s培养基，混合，并于室温下温育15min。然后将转染混合物以滴加的方式加入接种于35mm含有1ml Grace’s无血清培养基的组织培养板中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中。所述的培养板在27℃下温育5小时。从培养板中去除转染溶液，加入1ml添加了10％胎牛血清的Grace’s培养基。然后在27℃下连续培养4天。
4天后，收集上清液如Summers和Smith(见上)所述进行空斑试验。用带有″Blue Gal″(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶以便于鉴定和分离表达gal的克隆，其产生兰色染色的空斑(这种类型的″空斑试验″也见于昆虫细胞培养和杆状病毒学的用户手册，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，9-10页)。适当培养后，用微移液管头(如Eppendorf)挑出兰色空斑。将含有重组病毒的琼脂重悬于含有200μl Grace’s培养基的微离心管中，含有重组杆状病毒的悬液用于转染接种于35mm平皿中的Sf9细胞。4天后，收集这些培养皿中的上清液贮存于4℃。
为证明所述多肽的表达，使Sf9细胞在添加了10％热灭活FBS的Grace’s培养基中生长。用包含所述多核苷酸的重组杆状病毒以约等于2的感染复数(″MOI″)转染所述细胞。如果放射性标记的蛋白是所需的，6小时后去除上述培养基，替换为去除了甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(获自Life Technologies Inc.，Rockville，MD)。42小时后加入5 uCi 35S-甲硫氨酸和5 uCi 35S-半胱氨酸(购自Amersham)。将所述细胞进一步培养16小时然后离心收集细胞。通过SDS-PAGE及随后的放射自显影(如果是放射性标记的话)分析上清液中和细胞内的蛋白。
纯化蛋白氨基末端序列的微测序可用于确定所产生蛋白的氨基端序列。
实施例20-多肽在哺乳动物细胞中的表达
本发明的多肽可在哺乳动物细胞中表达。典型的哺乳动物细胞表达载体包含介导mRNA转录的起始的启动子元件和蛋白编码序列和转录终止所需信号和转录本的聚腺苷酸化信号。其他的元件包含增强子，Kozak序列和两侧为RNA剪接供体和受体位点的插入序列。用早期和晚期SV40启动子、来自反转录病毒如，RSV，HTLVI，HIVI的长末端重复序列(LTRs)和巨细胞病毒(CMV)早期启动子可获得高效转录。但也可使用细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。
用于实施本发明的合适的表达载体包括，例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146)，pBC12MI(ATCC 67109)，pCMVSport 2.0，和pCMVSport 3.0载体。可用的哺乳动物宿主细胞包括，人Hela，293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1，Cos 7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
另外，所述的多肽可在使所述多肽整合到细胞染色体上的适当细胞系中表达。与选择标记，如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素的共转化便于鉴定和分离转化细胞。
也可扩增转化的基因以大量表达其所编码的蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记适用于带有几百甚至几千个拷贝有用基因的细胞系(参见，例如Alt，F.W.，等，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L.和Ma，C.，Biochem.et Biophys.Acta，1097：107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，Biotechnology9：64-68(1991).)。另一种有用的筛选标记是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，Biochem J.227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology 10：169-175(1992))。应用这些筛选标记，将所述的哺乳动物细胞在选择培养基上生长，并可筛选出高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体上的扩增基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞常用于产生蛋白。
本发明的多核苷酸可依照实施例1中概述的方法扩增。如果存在天然的信号肽序列，所述的载体可无需包含第二信号肽。或者，如果不使用天然存在的信号序列，可修饰所述的载体使其包含异源信号序列(参见例如WO 96/34891.)。用可商购的试剂盒(″Geneclean，″BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)将扩增片段从1％琼脂糖凝胶分离出来，再用适当的限制酶消化分离出的片段，并再次经1％琼脂糖凝胶纯化。
将所述的扩增片段用相同的限制性酶切在经1％琼脂糖凝胶纯化。将所述的分离片段和去磷酸化的载体用T4 DNA连接酶连接。转化E.coli HB101或其他合适的E.coli宿主，如XL-1 Blue，通过例如限制性酶切分析鉴定包含插入到质粒pC6中的片段的细菌。
缺乏有活性的DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转化。5μg的表达质粒与0.5μg的质粒pSVneo通过脂质转染试剂(Felgner等，supra)共转化。所述的质粒pSV2-neo包含显性的选择标记，来自Tn5的neo基因编码赋予包括G418在内的一组抗生素抗性的酶。将所述细胞接种到添加了1mg/ml G418的α-MEM培养基中。两天后将所述细胞用胰蛋白酶处理后接种到杂交瘤克隆平板(Greiner，Germany)中的添加了10，25，或50ng/ml氨甲蝶呤(metothrexate)加1mg/ml G418的α-MEM培养基中。10-14天后用胰蛋白酶处理单克隆，然后接种到含不同浓度氨甲蝶呤(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)的6-孔培养皿或10ml瓶中。将在最高氨甲蝶呤浓度下生长的克隆转移到新的含有更高浓度氨甲蝶呤(1μM，2μM，5μM，10mM，20mM)的6-孔平板中。重复相同的过程直到得到在100-200μM浓度下生长的克隆。分析所需基因产物的表达，例如，通过SDS PAGE和Western blot或反向HPLC分析。
除上述方法之外，其他的多肽，特别是本发明的多肽的表达方法是本领域已知的。例如，US Patent No.6,066,781(其在此处全文引入作为参考)描述了由可操作地与编码有用蛋白，在这里即本发明的多肽的多核苷酸序列相连的，相应于稻α-淀粉酶信号肽序列(MKNTSSLCLLLLVVLCSLTCNSGQA(SEQ ID NO：20))的一部分的N末端基元的编码多核苷酸组成的嵌合基因。这一信号肽序列能够可操作地取代本发明的多肽的天然的信号序列作为异源信号序列。这种产生本发明多肽成熟形式的方法也包含在本发明的范围内，其可单独使用或与本领域已知的和/或此处所公开的方法结合使用。
而且，近来通过遍在蛋白或黄瓜花叶病病毒外壳蛋白肽N-末端融合(参见WO 00/36129)在高等植物中获得了重组蛋白提高了的蛋白产量。这种方法可能适用于提高本发明的多肽在合适的植物宿主中的表达。
实施例21-融合蛋白
本发明的多肽优选地与其他蛋白相融合。这些融合蛋白可用于多种用途。例如将本发明的多肽与His-tag，HA-tag，蛋白A，IgG结构域，和麦芽糖结合蛋白融合以利于纯化(参见此处所述的实施例；或参见EP A 394,827；Traunecker，等，Nature 331：84-86(1988))。类似地，与IgG-1，IgG-3，和白蛋白融合以延长在体内的半衰期。将核定位信号与本发明的多肽相融合可将所述的蛋白靶定到特异的亚细胞部位，而共价异源二聚体或同源二聚体可提高或降低融合蛋白的活性。融合蛋白也可以形成具有一个以上功能的嵌合分子。最后与非融合蛋白相比，融合蛋白可以提高溶解度和/或稳定性。上述所有类型的融合蛋白都可以通过经修饰的下述方法获得，其概括了将多肽与IgG分子相融合。
简要地说，IgG分子的人Fc部分可利用跨越下述序列5’和3’末端的引物通过PCR扩增获得。这些引物还应当具有合适的限制性酶切位点以便于克隆到表达载体，优选哺乳动物表达载体中。需注意的是所克隆的多核苷酸不带有终止密码子，否则不能产生融合蛋白。
天然存在的信号序列可用于产生所述的蛋白(如果适用的话)。或者，如果不使用天然存在的信号序列，可修饰所述的载体使其包含异源信号序列。(参见例如WO 96/34891和/或US Patent(美国专利)No.6,066,781，同上)
人IgG Fc区域：
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC
CCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA
CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGT
GGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG
ACGGGGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA
CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT
GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
ACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC
CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAG
GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGT
GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA
TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO：18)
实施例22-由多肽产生抗体
可通过多种方法制备本发明的抗体(参见Current Protocols，第2章)。作为这种方法的一个实例，将表达本发明的多肽的细胞施用于动物，以诱导产生含多克隆抗体的血清。在优选的方法中，制备纯化所述的蛋白制剂使其基本上不含天然的杂质。将这种制剂导入动物以获得具有更高特异活性的多克隆抗血清。
在最优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其蛋白结合片段)。这种单克隆抗体可通过杂交瘤技术制备(Kohler等，Nature256：495(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling等，于：单克隆抗体和T-Cell杂交瘤，Elsevier，N.Y.，pp.563-681(1981).)。一般而言，这种方法包括用多肽，或优选地用多肽表达细胞免疫动物(优选小鼠)。将这种细胞在任意合适的组织培养基中培养；但优选地在添加了10％胎牛血清(在约56℃下灭活)，约10g/l非必需氨基酸，约1,000U/ml青霉素，和约100μg/ml链霉素的Earle’s改良Eagle培养基中培养所述的细胞。
提取这种小鼠的脾细胞，将其与适当的骨髓瘤细胞系相融合。依照本发明任何合适的骨髓溜细胞系均可使用；但优选使用亲本骨髓瘤细胞系(SP20)，其可获自ATCC。融合后所得的杂交瘤细胞在HAT培养基中选择性地维持，然后如Wands等(Gastroenterology80：225-232(1981).)所述通过有限稀释克隆。分析通过上述筛选获得的杂交瘤细胞以鉴定出能分泌与所述多肽相结合的抗体的克隆。
或者，能与所述多肽结合的其它的抗体可利用抗独特型抗体通过两步法产生。这种方法利用了抗体本身也是抗原的事实，因此可以获得与第二抗体相结合的抗体。依照这一方法，用蛋白特异性抗体免疫动物，优选小鼠。利用这些动物的脾细胞产生杂交瘤细胞，筛选所述的杂交瘤细胞以鉴定这样的克隆，其产生的抗体的与蛋白特异性抗体相结合的能力可被所述的多肽所封闭。这些抗体包括针对抗蛋白特异抗体的抗独特型抗体，其可用于免疫动物以诱导进一步的蛋白特异的抗体的形成。
可以理解的是本发明的抗体的Fab和F(ab’)2和其他片段均可根据此处所公开的方法使用。这些片段典型地利用酶，如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)通过蛋白水解切割产生。另外可应用重组DNA技术或通过合成化学产生蛋白结合片段。
在人体内应用抗体，优选使用″人源化的″嵌合单克隆抗体。这种抗体可利用来自产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体产生。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的(参见综述Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO 8702671；Boulianne等，Nature 312：643(1984)；Neuberger等，Nature 314：268(1985).)。
而且，在更优选的方法中，所述的直接针对本发明的多肽的抗体可在植物中产生。特定的方法在US Patent Nos.5,959,177，和6,080,560，中公开，该文献在此全部引入作为参考。该方法不仅描述了表达抗体的方法，还有在植物中组装外源多聚体蛋白(即抗体等)及接下来从植物中分泌所述抗体的方法。
实施例23-抗体介导的植物蛋白下调
对植物进行遗传修饰以调节特定的特性，引入新的特性或抑制内源特性的过程代表了农业研究中的一个重要的领域。近来，公开了利用抗体调节内源基因表达的新方法(参见国际公开号WO 00/05391，该文献在此全文引入作为参考)。在这一实例中，研究者利用直接针对所述植物蛋白的单链抗体构建体实现了对内源植物蛋白40-70％的抑制。
这一方法涉及产生单克隆抗体，明确地说是单链抗体，其特异于植物中的内源转运肽，以降低植物中稳定状态的这种转运肽的水平。
所述的方法包括下述的步骤：I)产生针对特定植物的单克隆抗体，II)克隆所述单克隆抗体的基因，III)构建表达载体，其含有p67前导肽下游所述单克隆抗体重链和轻链基因的融合体，后者受控于植物中的组成型启动子，IV)优化所述重链和轻链融合载体的密码子以便于其所编码的基因在植物中的表达，V)用所述的重链和轻链融合表达载体转化植物。
本领域的技术人员能够理解此处所描述的方法(WO 00/05391)并能够利用这种方法抑制本发明的任何多肽，包括其变异体或其片段的稳定态表达水平。本领域的技术人员能够理解任何植物蛋白的前导肽(即信号肽)均可用于构建重链轻链融合载体。本领域的技术人员还能够理解对不同的植物种可能需要使用不同的密码子，从而可按照特定植物种的需要决定如何优化所述重链轻链融合载体的密码子。
所述的方法不仅可以用于转运肽，也可用于分泌蛋白，膜蛋白，受体和配体。该方法也可以在植物中和其他抗体产生方法结合使用。例如，直接针对本发明的多肽的抗体可抑制植物中特定的性质，其可加强植物对病原体的防卫机制。因此，当这种抗体表达时，另一种抗体可与所述第一种抗体联合表达，其通过指导针对病原蛋白的抗体的表达来抑制植物病原体的致病性(例如，那些对引发感染至关重要的蛋白，如来自M.grisea的BUF1基因，阶段II不成熟唾液腺蛋白，其包括来自G.rostochiensis的svp30，scp31a，scp31b，scp32，scp32，scp39，和scp49(WO 96/22372)，等)。这种联合在所述的第二“抗病原体”抗体是直接针对病原体的抗体且其与毒性蛋白相结合时也是有意义的，所述的毒性蛋白可以是例如几丁质酶，葡聚糖酶，溶菌酶，BT，或大肠杆菌素F(参见WO 96/09398)等)。
如其他部分所述，该方法也能通过在植物中指导针对所述植物抗原的单链抗体构建体的产生，用作在人，哺乳动物，动物等中抑制对植物抗原的变态反应的手段(通过转基因的方法)。在后一实例中，所述的植物并不限于可食用的植物，由于抑制了这种植物抗原的产生将有益于人类从环境中去除这种抗原，例如无论是否摄入这种植物。
这一实例的特别意义在于，有报道由转基因植物分离的原生质体和适应悬浮培养的愈伤组织均可使功能性抗体由植物细胞内质网膜分泌，(Hein等，Biotechnol.Prog.7：455-561，1991)。但在两种培养系统中所检测到的分泌抗体的水平都极低。在另一研究中，用编码合成抗体衍生物的基因转化烟草细胞，所述的合成抗体衍生物表达为由用柔性肽接头连接的完整免疫球蛋白重链和轻链可变区结构域组成的单链抗体(Pluckthun，Immunol.Rev.130：151-188，1991；和Bird等，Science 242：423-426，1988)。这一合成的单链抗体保留了完整免疫球蛋白的完全的抗原结合能力，但在转化细胞的胞外质外体空间(extracellular apoplastic space)积累(Firek等，PlantMolecular Biology 23：861-870，1993)，表明所述的抗体可以通过细胞膜，但不能穿越细胞壁达到外部环境中。而且，近来的研究表明一般而言提高植物中抗体的产生和异源蛋白的表达可通过在植物培养基中掺入稳定蛋白的试剂来提高(如，聚乙烯吡咯烷酮)，参见US PatentNo.6,020,169，其在此处全文引入作为参考。
实施例24-通过控制在内质网中的聚集(aggregation)调节蛋白的分泌
如此处更为详细描述的，在高等生物体中蛋白调节不同的细胞过程，包括从迅速的代谢变化到生长和分化。提高的特定蛋白产量可用于防止特定的疾病和/或疾病状态。类似地，可以预期蛋白在植物对环境，病原，除草剂，杀虫剂侵害的防卫机制中起主要作用。在生物体中调节特定蛋白表达的能力具有重要的意义。
已研究出了多种方法来将在诱导型的，组成活性的，或内源性的启动子的控制下的外源基因引入生物体中。特别有用的是诱导型的启动子(除了本文其他处所述的实例外，还可参见M.Gossen，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，89：5547(1992)；Y.Wang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8180(1994)，D.No.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346(1996)；和V.M.Rivera，等，Nature Med，2：1028(1996)；)。在一个实例，所述的促红细胞生成素(Epo)转移到小鼠和灵长目生物中，在小分子诱导物的控制下表达(如，四环素或纳巴霉素)(参见D.Bohl，et.al.，Blood，92：1512，(1998)；K.G.Rendahl，等，Nat.Biotech，16：757，(1998)；V.M.Rivera，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：8657(1999)；和X.Ye等，Science，283：88(1999)。尽管这一系统在添加诱导试剂(即，四环素，纳巴霉素，等等)的条件下能有效地在生物体中诱导有用基因的表达，其表达水平在24小时时趋近于峰值，再在其后的4到14小时降低到背景的水平。因此使用这一系统事实上不能进行可控制的瞬时表达，即便所述的控制是需要的。
最近公开了一种控制转基因蛋白的基因表达水平(即包括稳定的和瞬间的转化体)的新的替代方法(V.M.Rivera.，等，Science，287：826-830，(2000))。与前述的系统不同，这一方法不在mRNA水平上控制基因的表达。该系统以活性分泌形式控制蛋白水平。不存在诱导试剂的情况下所述蛋白在内质网聚集而不分泌。但是，如果添加了诱导试剂，蛋白将解聚集而从内质网分泌出来。这一系统提供了低基础分泌，在诱导试剂存在时产生迅速的、高水平的分泌，去除诱导试剂即可迅速地终止分泌。事实上，在诱导30min内蛋白分泌即达到最高水平，去除诱导试剂1小时内分泌即可迅速终止。该方法也可用于控制膜蛋白的产生水平。
详细的方法参见V.M.Rivera.，等，Science，287：826-830，(2000))，简要地说：
通过本领域已知的或本文中其他部分讨论的分子生物学方法，利用本发明的多核苷酸和一个或多个拷贝(优选至少2，3，4，或更多)的条件性聚集结构域(CAD)，一种以配体可逆的方式(即存在诱导试剂)与自身发生相互作用的结构域，构建融合蛋白构建体。所述的CAD结构域可以是从人FKBP12(Phe36到Met)蛋白分离的突变结构域(参见V.M.Rivera.，等，Science，287：826-830，(2000))，或其他含有具有类似的配体可逆的，自聚集特性的结构域的蛋白。作为设计的原则，融合蛋白载体包含可操作地连接于本发明的多核苷酸和CAD结构域之间的弗林蛋白酶(furin)切割序列。这种切割位点可使得通过蛋白水解切割将CAD结构域从本发明的多肽上切除，接下来从内质网中分泌出来进入高尔基体外侧(trans-Golgi)(J.B.Denault，等，FEBSLett.，379：113，(1996))。或者，本领域的技术人员可以认识到任何蛋白水解切割序列均可以替代弗林蛋白酶序列，条件是替代序列是内源(如，弗林蛋白酶序列)或外源(如，分泌后，纯化后或产生后等)可切割的。融合蛋白构建体每一特征组件(feature)的优选的序列，从5’到3’方向(各组件可操作地彼此相连)，可以是启动子，信号序列，″X″个(CAD)x结构域，弗林蛋白酶序列(或其他蛋白水解序列)，和本发明的多肽的编码序列。本领域的技术人员可以理解，所述的启动子和信号序列彼此独立地可以是本发明的多肽内源启动子序列或信号序列也可以是异源信号序列和启动子。
此处所述的通过控制ER聚集控制蛋白分泌水平的特定方法不是限定性的，其可一般地应用于本发明的任何多核苷酸和多肽，包括变异体，同系物(homologues)，直向同源物(orthologs)和其片段。
实施例25-改变蛋白的糖基化位点以增强本发明多肽的分泌特性
许多真核细胞表面和蛋白通过翻译后加工掺入N-连接和O-连接的碳水化合物(Komfeld和Kornfeld(1985)Annu.Rev.Biochem.54：631-64；Rademacher等，(1988)Annu.Rev.Biochem.57：785-838)。蛋白糖基化可起多种作用，其包括：增加蛋白折叠，抑制蛋白聚集，调节细胞内向细胞器的运输，增强对蛋白水解作用的抗性，修饰蛋白的抗原性，介导细胞间的粘附作用(Fieldler和Simons(1995)Cell，81：309-312；Helenius(1994)Mol.Biol.Of the Cell5：253-265；Olden等，(1978)Cell，13：461-473；Caton等，(1982)Cell，37：417-427；Alexander和Elder(1984)，Science，226：1328-1330；和Flack等，(1994)，J.Biol.Chem.，269：14015-14020)。在高等生物中，糖基化的性质和程度可通过包括受体介导的摄入和清除的机制显著地影响循环半衰期和蛋白的生物有效性(Ashwell和Morrell，(1974)，Adv.Enzymol.，41：99-128；Ashwell和Harford(1982)，Ann.Rev.Biochem.，51：531-54)。已鉴定出受体系统通过对糖蛋白上不同碳水化合物结构的识别对清除血清蛋白起重要作用(Stockert(1995)，Physiol.Rev.，75：591609；Kery等，(1992)，Arch.Biochem.Biophys.，298：49-55)。因此，生产策略导致不完全的附加末端唾液酸残基可以提供缩短糖蛋白生物有效性和半衰期的途径。相反，导致末端唾液酸附加位点饱和的表达策略可延长蛋白生物有效性和半衰期。
在开发重组糖蛋白用作药物产品中，例如，推测可通过从糖蛋白的一级结构中添加或缺失糖基化位点对重组蛋白的药代动力学进行修饰(Berman和Lasky(1985a)Trends in Biotechnol.，3：51-53)。但是，有研究表明N-连接糖基化位点的缺失经常破坏细胞内的转运并导致细胞内糖基化位点变异体的积累(Machamer和Rose(1988)，J.BiolChem.，263：5955-5960；Gallagher等，(1992)，J.Viology.，66：7136-7145；Collier等，(1993)，Biochem.，32：7818-7823；Claffey等，(1995)Biochemica et Biophysica Acta，1246：1-9；Dube等，(1988)，J.Biol.Chem.263：17516-17521)。尽管蛋白的糖基化位点变异体可在细胞内表达，已证明很难从生长条件性细胞培养基中恢复其有用的性质。
此外，目前并不清楚一个物种中的糖基化在什么程度上被另一物种的糖基化机制所识别。鉴于糖基化在蛋白代谢中的重要作用，特别是对蛋白的分泌和表达，是否能识别糖基化信号很大程度上决定了蛋白在另一生物体中的表达能力，无论是内源的还是重组性的(即在大肠杆菌中表达玉米蛋白或在玉米中表达大肠杆菌的蛋白等)。因此可期望通过添加，缺失或修饰糖基化位点，可能的话向一个种的蛋白添加另一个种的糖基化位点，以改善所述蛋白的功能，生物工艺提纯，和/或结构特性(如，本发明的多肽)。
有很多方法可用于鉴定蛋白中糖基化位点的定位。一个优选的方法是用PROSITE计算机程序(Swiss Institute of Bioinformatics)运行经过翻译的蛋白序列。一旦经过鉴定，所述的位点就可以进行系统地缺失、或破坏，用本领域已知的诱变的方法在DNA水平进行，优选使用PCR-指导的诱变(参见Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring，NY(1982))。类似地，也可以用类似的方法在DNA水平添加或修饰糖基化位点，优选地使用PCR方法(参见Maniatis，见上)。对特定蛋白的糖基化位点的修饰结果(如，溶解度，分泌潜力，活性，聚集，蛋白水解抗性等)可通过本领域已知的方法进行分析。
实施例26-双子叶植物的转化
本发明的多核苷酸，包括编码本发明的多肽的多核苷酸，以及编码针对本发明的多肽的抗体的多核苷酸均可用于转化单子叶植物从而将特定的性质赋予植物。这种多核苷酸可以是全长的多核苷酸，片段，互补链，或其变异体，可以是其本身或如下详述的可操作地与异源多核苷酸相融合。
对双子叶植物的转化技术是本领域已知的，包括基于土壤杆菌属(Agrobacterium)的技术和无需土壤杆菌属(Agrobacterium)的技术。非土壤杆菌属(Agrobacterium)技术包括由原生质体或细胞直接摄入外源的遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导摄入，粒子轰击介导的递送，或微注射。这些技术的实例参见Paszkowski等，EMBO J3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，和Klein等，Nature 327：70-73(1987)。每种情况下均可以利用本领域已知的技术使经转化的细胞再生成完整的植株。
土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化是双子叶植物转化的优选技术，这是由于其转化效率高且在许多不同的种中可广泛地应用。许多作物种通常都可以借助土壤杆菌属(Agrobacterium)转化，这些作物包括烟草，番茄，向日葵，棉花，菜籽油菜，马铃薯，大豆，苜蓿和杨树(EP 0 317 511(棉花)，EP 0 249 432(番茄，Calgene)，WO 87/07299(芸苔属，Calgene)，U.S.Pat.No.4,795,855(杨树))。土壤杆菌属(Agrobacterium)转化典型地包括将带有外源有用DNA的二元载体(如pCIB200或pCIB2001)转移到合适的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株中，其依赖于宿主土壤杆菌属(Agrobacterium)带有的vir基因的互补性，所述基因或共存于Ti质粒或存在于染色体上(如菌株CIB542的pCIB200和pCIB2001(Uknes等Plant Cell5：159-169(1993))。重组二元载体向土壤杆菌属(Agrobacterium)的转化利用带有重组二元载体的大肠杆菌，辅助大肠杆菌菌株通过三亲本杂交过程完成，所述的辅助大肠杆菌菌株带有质粒如pRK2013，其可将所述的重组二元载体移动到靶土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株中。或者，所述的重组二元载体可通过DNA转化转移到土壤杆菌属(Agrobacterium)中(Hofgen & Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。
通过土壤杆菌属(Agrobacterium)对靶植物种的转化通常包括将土壤杆菌属(Agrobacterium)与所述植物的外植体共培养，所用方法是本领域已知的。经转化的组织在带有存在于二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基中再生。
其他转化双子叶植物的方法是本领域已知的。因此这一实施例并非将本发明仅限定在上述和其他实施例的范围内。
实施例27-单子叶植物的转化
本发明的多核苷酸，包括编码本发明的多肽的多核苷酸，以及编码针对本发明的多肽的抗体的多核苷酸均可用于转化单子叶植物从而将特定的性质赋予植物。这种多核苷酸可以是全长的多核苷酸，片段，互补链，或其变异体，可以是其本身或如下详述的可操作地与异源多核苷酸相融合。
对大多数单子叶植物种的转化目前已是常规的技术。优选的技术包括用PEG或电穿孔技术直接将基因转移到原生质体中，或将基因通过粒子轰击到愈伤组织中。转化可利用单DNA种或多DNA种(即共转化)进行，这两种技术均适用于本发明。共转化因具有下述优势即，其避开了复杂的载体构建，产生带有有用基因和选择标记非连接位点的转基因植物，使之能够在子代中去除选择标记，如果认为这样较好。但是利用共转化的缺点在于单独的DNA以低于100％的频率整合到基因组中(Schocher等Biotechnology 4：10931096(1986))。
专利申请EP 0 292 435(Ciba-Geigy)，EP 0392 225(CibaGeigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了由玉米原种自交系制备愈伤组织，利用PEG或电穿孔转化原生质体，及由经转化的原生质体再生玉米植株。Gordon-Kamm等，Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等，Biotechnology 8：833-839(1990))公开利用粒子轰击转化A188-衍生的玉米系的技术。另外WO 93/07278(Ciba-Geigy)和Koziel等，Biotechnology 11：194-200(1993))通过粒子轰击转化玉米原种自交系的技术。这一技术利用从授粉后14-15天的玉米穗中切除的1.5-2.5mM长的非成熟玉米胚，用PDS-1000 He Biolistics装置进行轰击。
也可以利用原生质体或粒子轰击通过直接基因转移技术转化稻。原生质体介导的转化已在Japonica-型和Indica-型中有描述(Zhang等，Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto等Nature338：274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8：736-740(1990))。这两种类型也可通过粒子轰击进行常规的转化(Christou等Biotechnology 9：957-962(1991))。
专利申请EP 0 332 581(Ciba-Geigy)描述了Pooideae原生质体的繁殖，转化和再生技术。这些技术也可用于转化Dactylis和小麦。而且在Vasil等，Biotechnology 10：667-674(1992))中描述利用粒子轰击C型长期可再生愈伤组织的细胞进行小麦转化，Vasil等，Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等，Plant Physiol.102：10771084(1993)中描述了利用粒子轰击非成熟的胚和由非成熟的胚衍生的愈伤组织进行小麦转化。针对小麦转化的优选技术包括利用粒子轰击非成熟的胚，和在基因递送前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在进行轰击前将任意数量的胚(0.75-1mM长)置于含有3％蔗糖，3mg/l用于诱导体细胞胚芽的2，4-D的MS培养基上(Murashige & Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))，所述诱导可在黑暗中进行。在选择进行轰击的一天，将所述的胚从诱导培养基上移出并置于渗压剂(即添加了所需浓度，典型地为15％的蔗糖或麦芽糖)上。使所述的胚胞质分离2-3h然后进行轰击。典型但并非一定地，每靶平皿20个胚。带有合适基因的质粒(如pCIB3064或pSG35)利用标准的技术沉淀到微米大小的金粒上。将每一皿的胚用DuPont Biolistics氦装置轰击，爆裂压约1000psi，使用标准的80目筛。轰击后，将胚重新置于黑暗中恢复约24h(仍处于渗压剂上)。24小时后，将所述的胚从渗压剂上移走，重新置于诱导培养基上，使其在再生前放置约1个月。大约1个月后带有发育中的胚发生愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(MS+1mg/liter NAA，5mg/l GA)上，所述的再生培养基进一步包含合适的选择试剂(对于pCIB3064为10mg/l草铵膦，对pSOG35为2mg/l氨甲蝶呤)。大约1个月后，将发育好的芽转移到更大的无菌容器″GA7s″中，其包含一半浓度的MS，2％蔗糖和相同浓度的选择试剂。
另外的转化单子叶植物的方法参见WO 00/12734，该文献还描述了应用Ac-Ds转座子系统将转基因插入植物。
其他转化单子叶植物的方法是本领域已知的。因此这一实施例并非将本发明仅限定在上述和其他实施例的范围内。
实施例28-通过分子进化提高本发明的生物活性/功能的方法
尽管已知的许多生物活性蛋白在一种生物体中对其特异功能而言非常有效，但它们常带有一些特性使它们在转基因，治疗，农业和/或工业应用中不如人意。在这些特性中，短生理半衰期是最显著的问题，其存在于蛋白水平或蛋白mRNA水平。延长半衰期的能力在用于基因治疗，或生产转基因植物或动物，生物工艺生产，蛋白纯化和将该蛋白用作化学调节剂(如，除草剂，杀虫剂等)等时显得非常重要。因此需要鉴定分离的蛋白的新的变异体，该变异体除适用于普通的工业和农业应用外，还具有可增强其用作植物或动物疾病治疗剂的特性。
因此，本发明的一个方面涉及通过定向的分子进化增强发明的特定性质。这种增强在非限定性的实施例中可有益于所述的发明在试剂盒中作为必需组分的用途，本发明的物理属性，包括溶解度，结构，或密码子优化，本发明的特定生物学活性，包括任何相关的酶活性，蛋白酶动力学，蛋白Ki，Kcat，Km，Vmax，Kd，蛋白-蛋白活性，蛋白-DNA结合活性，拮抗物/抑制活性(包括直接的或间接的相互作用)，激动剂活性(包括直接的或间接的相互作用)，所述蛋白的抗原性(如可能需要提高或降低蛋白的抗原性)，蛋白的免疫原性，蛋白与自身或其他蛋白形成二聚体，三聚体，或多聚体的能力，本发明的抗原效力，包括其接下来作为对疾病或疾病状态的预防性治疗的用途，或作为导向致病基因的效应物的用途。而且，增强蛋白特定性质的能力也可适用于改变酶的特征性活性，使其具有与初始活性完全不相关的活性。本发明的其他所需增强将是特异于每个单独的蛋白的，因此也是本领域技术人员已知的，其也包含在本发明的范围之内。
定向进化包括几个步骤。第一步是建立有用基因或蛋白的变异体文库。最重要的步骤是筛选那些具有所希望鉴定出的活性的变异体。对筛选进行设计是必要的，因为通过筛选应当是选择性的，足以去除没有用的变异体，但也不能严格到排除所有的变异体。最后是用筛选出的最佳变异体重复上述的步骤。每一个连续的循环均可根据需要进行修改，例如提高筛选的严谨性。
几年来，已发展了多种向大分子中引入突变的方法。这些方法包括随机诱变，″易错(error-prone)″PCR，化学诱变，定点诱变和其他本领域已知的方法(要详细地列出目前已有的诱变方法，参见Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring，NY(1982))。典型地，这些方法被用作，例如作为鉴定蛋白核心功能区域或蛋白(如多结构域蛋白)特定结构域的功能的工具。但近来这些方法被用于鉴定具有特异或增强的性能的大分子变异体。
随机诱变是目前已被广泛认可的方法。典型地，其可通过使用″易错(error-prone)″PCR(参见Moore，J.，等，Nature Biotechnology14：458，(1996))，或应用相应于特定有用区域的随机合成的寡核苷酸(参见Derbyshire，K.M.等，Gene，46：145-152，(1986)，和Hill，DE，等，Methods Enzymol.，55：559-568，(1987)进行。两种方法均在可获得的诱变水平有限制。但是，每种方法都使研究人员能够有效地控制诱变率。这是特别重要的，原因在于事实上有益于酶活性的突变是极少的。事实上，用过高的诱变水平会起到反作用或抑制所需的有益突变。
虽然上述的两种方法可以构建随机化的大分子突变体库，最近又阐明了第三种方法，称作″DNA改组″或″有性PCR″(WPC，Stemmer，PNAS，91：10747，(1994))。DNA改组也称″定向的分子进化″，″外显子改组″，″定向酶进化″，″体外进化″和″人工进化″。这些参考术语是本领域已知的也包含在本发明的范围内。这一新的优选的方法显然克服了前述方法的缺陷，这是由于其不仅在所得的子代中传播正面的性状还可以同时清除负面的性状。
DNA改组结合了体外重组原理和″易错(error-prone)″PCR来完成这一任务。实际上，由你的基因经Dnase I随机消化所得的小片段库开始，然后将所述的随机片段引入″易错(error-prone)″PCR组装反应。在PCR反应过程中，随机大小的DNA片段不仅与同源的链杂交，也与相应于所述有用多核苷酸不同区域(即通过完整多核苷酸杂交典型地不能达到的区域)的其他DNA片段杂交。而且由于PCR组装反应使用″易错(error-prone)″PCR反应条件，在PCR反应的DNA合成步骤中向所有的片段引入了随机突变-在反应的退火步骤中进一步多样化了潜在的杂交位点。
可以使用多种反应条件进行DNA改组反应，但也提供了特定的DNA改组反应条件，例如在PNAS，91：10747，(1994)中。简要地说：
制备用于DNA改组反应的DNA底物。所述的制备可以是仅从污染的细胞材料，寡核苷酸引物，脱氧核苷酸，RNAs等中纯化所述的DNA，可能需要使用DNA纯化试剂盒，如Qiagen，Inc.，或Promega，Corp提供的。
一旦纯化好了DNA底物，可将其用Dnase I消化。约2-4μg DNA底物用100μl 50mM Tris-HCL，pH 7.4/1mM MgCl2中的每微升0.0015单位的Dnase I(Sigma)消化10-20min。室温下所得的10-50bp的片段，除本领域已知的其他方法外，可通过2％低融点琼脂糖凝胶电泳到DE81离子交换纸(Whatman)上进行纯化，或利用Microcon浓缩器(Amicon)以适当分子量截断进行纯化，或使用寡核苷酸纯化柱(Qiagen)纯化。如果使用DE81离子交换纸，可用1M NaCl从所述的纸上洗脱10-50bp片段，然后用乙醇沉淀。
所得的纯化片段重悬于PCR混合物中用于PCR组装反应，所述的PCR混合物包括：2mM每一种dNTP，2.2mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris-HCl，pH 9.0，和0.1％Triton X-100，最终的片段浓度为10-30ng/μl。此时不加引物。每100μl反应混合物使用2.5单位的Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR程序为94℃下60s；94℃下30s，50-55℃下30s，和72℃下30s，进行30-45个循环，接下来是72℃下5min，使用MJ Research(Cambridge，MA)PTC-150热循环仪。组装反应后将1∶40稀释的无引物产物引入到含有0.8um每种引物的PCR混合物中(使用与组装反应相同的反应缓冲液)进行15个PCR循环(94℃下30s，50℃下30s和72℃下30)。所述的引物是相应于所述用于改组反应的多核苷酸的核酸序列的引物。所述的引物可包含用本领域已知的或本文中其他部分所述的方法修饰的核酸碱基对或包含附加的序列(即添加酶切位点，突变特异性的碱基对等)。
所得的改组的、组装的和扩增的产物可利用本领域已知的方法进行纯化(如，Qiagen PCR纯化试剂盒)然后利用合适的限制性酶切位点进行克隆。
尽管到目前为止已发表了许多DNA改组变异，这些变异对本领域技术人员是显而易见的且包含在本发明的范围之内。可修改所述的DNA改组方法至所需水平的诱变反应，利用如Zhao，等(Nucl Acid Res.，25(6)：13071308，(1997)所述的方法。
如上所述，一旦构建了随机库即可通过特异的筛选鉴定具有所需特性的变异体。一旦鉴定出了变异体即可将相应于所述变异体的DNA用作DNA底物起始下一轮的DNA改组。这种改组、筛选出优化的有用变异体、然后再改组的改组循环可以重复，直到获得最终的变异体。用于鉴定通过DNA改组技术创建的变异体的模型筛选实例可以参见下述文献：J.C.，Moore，等，J.Mol.Biol.，272：336-347，(1997)，F.R.，Cross，等，Mol.Cell.Biol.，18：2923-2931，(1998)，和A.Crameri.，等，Nat.Biotech.，15：436-438，(1997)。
DNA改组具有几个优势。第一，其利用有益的突变。与筛选相结合时DNA改组允许发现最佳突变组合且并不假定所述的最佳突变组合包含群体中的所有突变。第二，重组与点诱变同时产生。迫使DNA聚合酶由小片段DNA库合成全长DNA片段的作用是背景诱变率。与严谨筛选方法相结合，酶活性已进化至高达高于野生型的酶活16000倍。本质上，所述的背景诱变产生遗传变异性，对其产生作用的重组增强所述活性。
重组的第三个特征在于其可用于去除有害的突变。如上所述的，在随机化过程中，出现每一个有益的突变同时也将出现一个或多个中性或抑制突变。这种突变可通过下述方式去除，即除由前次筛选选出的突变体的随机大小的片段外，在装配反应中再包括过量的野生型随机大小的片段。在下一筛选过程中，一些最有效的多核苷酸/多肽/酶的变异体应当已经失去了抑制突变。
最后，重组可以以平行的过程进行。这表现出明显的优势，这是因为多特性的蛋白应该是更可取的(如可溶性，活性等)。由于同时筛选一个以上的特性越来越困难，其他的分子进化的方法逐渐受到抑制。但是，利用重组可将最有代表性的变异体的随机化片段结合起来获得多种特性，然后同时筛选多种特性。
DNA改组也可应用于本发明的多核苷酸和多肽以降低它们在特定宿主中的免疫原性。例如可构建本发明的特定变异体，并用DNA改组技术分离。这种变异体可具有所有的所需特性，尽管可能由于其新的内部结构在宿主中是高免疫原性的。具体说来，所需的特性可使所述多肽具有非天然的结构，其不再被作为“自体”分子识别而成为″外源″分子，由此引发宿主针对新变异体的免疫应答。这种限制可以通过下述方式克服，例如通过在一个或多个DNA改组循环中包含天然蛋白的生物异源性直向同源物(ortholog)基因序列的拷贝和新变异体的基因序列。所述直向同源物(ortholog)和新变异体DNA的摩尔比可以变化。理想的是所鉴定出的杂种变异体包含至少编码序列的一部分使生物异源性蛋白(xenobiotic protein)避开宿主的免疫系统，以及另外的最初的新变异体的编码序列的一部分以提供所需的特性。
类似的，本发明还包括应用DNA改组技术演化本发明的多核苷酸和多肽，其中一个或多个DNA改组循环，除基因模板DNA外，还包括编码已知等位基因序列的寡核苷酸，优化的密码子序列，已知变异体的序列，已知的多核苷酸多态性序列，已知的直向同源物序列，已知的同系物，附加的同源序列，附加的非同源序列，来自其他种的序列，和上述序列任意数量和组合。
除上述描述的方法外，还有许多适用的或特定情况下所需的相关方法。这些方法的代表参见PCT applications WO 98/31700，和WO98/32845，这些文献在此引入作为参考。而且相关的方法也可以应用于本发明的多核苷酸以构建理想的变异体用于基因治疗，蛋白质工程，包含所述变异体的完整细胞的进化，或包含本发明的多核苷酸的全酶途径的进化，分别在PCT applications WO 98/13485，WO 98/13487，WO 98/27230，WO 98/31837，和Crameri，A.，等，Nat.Biotech.，15：436-438，(1997)中有描述。
将″DNA改组″技术应用于本发明多核苷酸和多肽的其他技术，包括被提议的应用，参见US Patent No.5,605,793；PCT Application(PCT申请)No.WO 95/22625；PCT Application No.WO 97/20078；PCT Application No.WO 97/35966；和PCT Application No.WO98/42832；PCT Application No.WO 00/09727具体提供的应用DNA改组鉴定除草剂选择性的作物的方法也可应用于本发明的多核苷酸和多肽，另外PCT Application No.WO 00/12680提供了产生，修饰，适应和优化赋予植物种可检测的表型特性的多核苷酸序列的方法和组合物；上述文献均全部引入作为参考。
实施例29-用微阵列进行蛋白功能确定
DNA微阵列的制备.
在YTK12酵母细胞细胞中的克隆在CMD-W平板上于30℃下生长，按如下在96孔板上PCR扩增插入物：每克隆混合100μl反应混合物，其包括80μl无菌水，10μl 10X RedTaq Buffer(Sigma)，2μl 10mM dNTPMix(Boehringer Manheim)，2μl相应于本发明的多核苷酸的正向引物，100ng/μl，2μl T7引物100ng/μl，4μl RedTaq DNA聚合酶(Sigma)和一小份酵母菌落，在95℃下2min(一次)然后94℃30sec，接下来50℃下30sec，72℃下30sec(35到40循环)最后72℃下的步骤7min。PCR产物用凝胶过滤匣(Edge BioSytems)纯化两次以完全去除多余的引物。所有的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳评估。用机械手(TECAN)，将PCR产物转移到384孔板，然后将样品真空干燥，再重悬于20μl的50％DMSO。
用来自Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech微阵列GEN III点样器(spotter)将DNA样品排列到氨基硅化包被的玻璃微阵列载玻片。样品空气干燥后，将上述的玻片置于50mJ脉冲的254nm波长的光下将所述的样品UV交联到玻片上。
分离RNA和通过体外cDNA转录制备标记的mRNA
用来自Qiagen的RNeasy kit从多种组织(经过或未经化学物质处理的、经历或未经历生物或非生物胁迫的叶，根，花，茎，分生组织，细胞培养物)中分离总RNA。总RNA通过下述描述转化成cDNA。如下合成第一链cDNA：3-5μg的总RNA与1μl T7-oligo(dT)24引物5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGCTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：19)混合，终体积用DEPC-H2O调节至12μl。将上述的管加热到70℃5min，然后加入4μl 5X第一链缓冲液(Lifetechnology)，1μl 0.1M DTT和1μl 10mM dNTP。在37℃下温育2min后，加入3μl反转录酶(SSII RT，200-unit/ul，Life Technology)再在37℃下温育1小时。
第二链的合成如下：向第一链反应混合物中加入89μl DEPC-H2O，3μl 10mM dNTP，1μl 10U/μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl 10U/μl大肠杆菌DNA聚合酶和2μl 2U/μl大肠杆菌RNase H在16℃下温育2小时。然后加入2μl 5U/μl T4 DNA聚合酶在16℃下温育5min。加入苯酚/氯仿抽提终止反应，将上清液在2.5体积100％乙醇和1/10体积5M NH4Ac中沉淀。将样品混合后立即12000g室温下离心5min。所得的颗粒状物用80％乙醇洗两次空气干燥后溶解于2μl无Rnase的水中。用Cy染料标记的体外转录如下进行：每反应，1μl T7 10×反应缓冲液(Ambion)，3μl 25mM ATP，CTP，GTP混合物，1μl 20mMUTP(Ambion)，1μl cDNA，3μl 5mM的Cy3或Cy5(Amersham)，0.5μl内部对照的PCR产物(即，人CCR5)，1μl酶混合物(Ambion，MEGAscriptTM)和1μl T7 RNA聚合酶(IJSB，100单位/μl)混合起来，在37℃下于黑暗中水浴4-6小时。用1μl无Rnase的DNaseI在37℃下温育15min以去除模板cDNA。然后利用用于RNA探针纯化的RNeasy mini程序(Qiagen)纯化RNA探针。每种探针均于-70℃避光保存。
微阵列杂交和数据分析
将两种待比较的mRNA库混合，然后应用于在含有50％甲酰胺，5XSSC，0.1％SDS的36μl杂交混合物中的微阵列玻片。杂交在带盖的加湿塑料管中的盖玻片下，在42℃的烘箱中进行14-18。将所述的玻片于42℃在0.5×SSC，0.1％SDS洗两次每次5min，再在42℃下于0.25×SSC，0.1％SDS中洗10min一次，在0.25×SSC，0.1％SDS中55℃下30min一次，然后在缓和的N2气流中干燥。
用Generation III Array Scanner(Molecular Dynamic)在PMT665V下扫描所述的玻片探寻Cy5标记的探针，在685V PTM下扫描Cy5标记的探针。用ArrayVision软件(Imaging Research，Inc.)捕获数据和临界分析(背景去除，标准化和平均值...)。所述的Cy5/Cy3荧光比率和log10转化率由标准化值计算。软件SpotFireTM(Spotfire，Inc.)和GeneSpringTM(Silicon Genetics，Inc.)用于数据可视化和聚类分析。
实施例30-通过真空渗入转化植物的方法
植物转化可作为评估多核苷酸或多肽生物功能的有效工具。例如，用能够通过反义调节下调特定基因的载体转化植物(即，所述的载体可以反义方向表达基因转录本)，或所述的载体仅能过表达特定的多肽。通过观察转化子的表型利用本领域已知的技术或本文其他部分所述的技术可以推导蛋白的功能。其他用于转化的方法在本文的其他部分已有描述。下述转化植物材料的方法可以用于任意的植物种，但其特别适合于拟南芥属植物。
在20℃8hr(小时)光照18℃16小时黑暗条件下培养拟南芥直到需要进行转化。每周从下部施肥一次。使植物稀疏至每平方英寸1株。抽苔后立即使用。短暂的几天加强营养生长以提高种子的产量。
将植物转移到20℃16hr光照，18℃8hr黑暗的条件下。所述的植物应迅速抽苔并当初级花序达10-15cm、次级花絮出现在花结时其已作好浸润的准备。
此时将构建体转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株EHA105(Koncz和Schell，1986)(参见直接土壤杆菌属(Agrobacterium)转化：冻-融法见下)。当植物已作好转化准备时，将1ml过夜培养物接种500ml含有对所述构建体合适的抗生素和50μg/mL利福平(C58 Agro-and)或25mg/mL庆大霉素(pMP90)的YEB培养基(2L瓶)。在28℃下培养2天，约275rmp.YEB培养基如下所述。
当OD600高于2.0时将培养物3500rpm离心30min，悬浮在0.5-1.0ml下述的浸润培养基中。
将重悬的培养物置于带有大玻璃罩的容器中，倒转盛有植物的盆使其渗入到浸润培养基中由此覆盖完整的植物(包括花结但土不多)。去除植物下的大气泡。抽真空(～700Hg)。关闭抽吸器使所述植物处于真空下5min。快速去除真空压。简单地排出所述的盆的液体。
如上所述使经过浸润的植物在20℃16hr光照18℃8hr黑暗条件下生长。扶植植物进行抽苔。当植物开花后收获T0种子。
按下面描述进行种子消毒和在选择培养基上筛选转化子。在萌发后一周将深绿(抗性)植物转移到次级筛选平板上。6-10天后转移到土壤中。将新转移的植物覆盖几天。
植物培养基：
1L 真空渗入培养基 选择培养基
MS盐 2.2g 4.3g
B5维生素，1000X 1.0mL 1.0mL
蔗糖 50g 10g
MES，200mg/mL pH 5.7和KOH 2.5mL 2.5mL
苄氨基嘌呤(BAP，1mg/mL) 44μL -
Silweet L-77 200μL -
Phytagar - 8g
细菌培养基YEP
酵母抽提物 1.0g
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 5.0g
蔗糖 5.0g
MgSO4 0.5g
本领域的技术人员可以理解针对特定的植物可以对上述的方法进行修改。这种修改可能会添加新的步骤，删除上述的步骤和/或替代某些试剂。
直接土壤杆菌属(Agrobacterium)转化：冻融法
在28℃下，5mL YEP培养基中培养包含合适的辅助Ti质粒的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株(YEP培养基已在本文的其他部分作了描述)过夜。将2ml过夜培养物加入50ml在259mL摇瓶的YEP培养基中，在28℃下剧烈振荡(250rpm)直到所述培养物生长到OD600达0.5到1.0。将培养物在冰上冷却。将细胞悬液在4℃ 3000g离心5min。
弃上清，将细胞重悬于1mL 20mM CaCl2溶液中(冰冷的)。将0.1mL的小份分配到预冷的Eppendorf管中。向细胞中加入约1μg质粒DNA。
用液氮冷冻细胞，然后在37℃水浴5min融解细胞。向所述的管中加入1mL YEP培养基在28℃下温育2-4hr伴随轻微的振荡。在这一阶段使细菌表达抗生素抗性基因。在Eppendorf离心机中将所述的管离心30s。
弃上清。将细胞重悬于0.1mL YEP培养基。然后将细胞涂布在含3-5μg/mL四环素和10-25μg/mL卡那霉素的YEP琼脂平板上。将所述平板在28℃下培养。转化菌落应在2-3天后出现。
本领域的技术人员可以理解针对特定的植物可以对上述的方法进行修改。这种修改可能会添加新的步骤，删除上述的步骤和/或替代某些试剂。
实施例31-利用代谢物分布进行蛋白功能确定
本发明包含应用代谢物分布(metabolite profiling)鉴定本发明的多肽基因功能。在一个实例中，生产了或不表达本发明的蛋白或本发明的蛋白在其中表达水平下降的转基因植物。这种转基因植物可以通过构建剔除(knock out)构建体灭活或缺失内源基因而获得，例如，使用本领域已知的或本文中其他部分所述的方法。另外，所述的转基因植物也可以通过向植物中插入表达本发明的蛋白的拮抗物的构建体而产生(如，反义寡核苷酸，反义基因，抗体等)。产生转基因植物的其他实例，包括特定的策略，是本领域已知的，其中的一些在本文的其他部分有描述。
一旦本发明的蛋白失活或其表达受到抑制，可以确定所述植物的代谢物分布，并认定所述蛋白的功能。一些预测的在植物中抑制或灭活本发明蛋白表达的代谢分布可能类似于已知的营养缺陷，病原体疾病，生物胁迫，或非生物胁迫，如在本文中其他部分所述的那些。另外，本发明的转基因植物的代谢分布对鉴定本发明的多肽作为成员参与的特定途径也是有用的，另外对分别鉴定潜在的下调和/或上调效应物或影响物(affectors)也是有用的。再有，其也用于鉴定本发明的多肽的作用模式。
许多已知的方法可用于鉴定植物的代谢分布(metabolicprofile)。一个非限制性的实例由Sauter，H.，等，in″MetabolicProfiling of Plants：A New Diagnostic Technique″，Synthesis andChemistry of Agrochemicals II，Baker，D.R.，Fenyes，J.G.，和Moberg，W.K.，eds，ACS Symposium Series，433，Chapter 24，pp.288-299，(1991)提供。简要地说，本发明的转基因植物或其中本发明的多肽的表达被抑制或灭活的植物在生长室中生长。收获芽并立即深冷处理备用。将冷冻的植物样品称重再加入三倍量(W∶W)的乙醇。然后将混合物在混合器中浸解，再将所得悬液放置2小时以备抽提。接下来的步骤是过滤，蒸发，用N-甲烷基-N-(三甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)硅烷化。再加入内部标准烷烃，由此计算保持系数(Retention coefficients)和进行定量。然后将粗混合物在聚甲基硅氧烷胶(methyl silicon gum)熔融的二氧化硅毛细管柱(30m DB-1.注射温度230℃烤箱温度100℃-320℃，4℃/min；15min 320℃)上进行气相色谱。然后计算相对于内部标准(n-C10H22＝1000，n-C28H58＝2800)的保持系数(Retention coefficients)。
上述方法可以用于多种试验植物及对照。对所得的分布结果数据进行分组(即试验植物作为一组，对照作为另一组)以获得每组的平均分布。在后一步中，相应的峰(即，等同的保持系数的峰)聚成一组，对峰的高度进行统计分析。
在试验和对照植物间代谢分布的不同是通过计算两组间的“差异分布”确定的。所述的差异分布是通过除峰高度计算出来的。这种差异分布为一种代谢物的大小相对于另一种的改变提供半定量的估计。
一旦上述完成，所述的峰值即与特定的代谢物相关联(即，确定了每个峰的代谢物本身)。将已知的在植物中调节特定途径的蛋白的代谢物分布与本发明的蛋白相比较，可以确定本发明的多肽的功能的线索和/或鉴定该蛋白的功能。这种方法可用本领域其他的已知方法或其中的一个或多个步骤替代。
实施例32-通过形态学表型分析进行蛋白的功能确定
本发明包括应用形态学表型分析鉴定本发明多肽的基因功能。在一个实例中，生产了或不表达本发明的蛋白或本发明的蛋白在其中表达水平下降的转基因植物。这种转基因植物可以通过构建剔除构建体灭活或缺失内源基因而获得，例如，使用本领域已知的或本文中其他部分所述的方法。或者，所述的转基因植物也可以通过向植物中插入表达本发明的蛋白的拮抗物的构建体(如，反义寡核苷酸，反义基因，抗体等)而产生。产生转基因植物的其他实例，包括特定的策略，是本领域已知的，其中的一些在本文的其他部分有描述。
一旦本发明的蛋白失活或其表达受到抑制，可以确定所述植物的形态学表型，并确定所述蛋白的功能。一些预测的在植物中抑制或失活本发明蛋白表达的表型可能类似于已知的营养缺陷，病原体疾病，生物胁迫，或非生物胁迫，例如在本文中其他部分所述的那些。
实施例33-利用转移基因组技术(TGT)进行蛋白的功能确定
本发明包括应用转移基因组技术(TransGenomic Technology，TGT)鉴定本发明多肽的基因功能(Cambia Biosystems，Bellevue，WA)。TGT将基因组学和功能基因组学相结合，使基因序列(如本发明的多核苷酸序列)与特定的表型或性状相关联。该技术是以报告基因[如β-葡糖醛酸酶(GUS)，BoGUS，GFP]转座子在植物基因组(特别是水稻和拟南芥)中随机整合为基础的。
所述的转座子可包括含有转录激活物和对该反式激活物作出反应的报告基因的增强子捕获载体。由于整合是随机的，可以设想所述的转座子可整合到基因调控元件的附近-有效地开启反式激活物基因，所述基因的活性促使报告基因的激活。因此，通过重复上述过程可以获得具有大量独特表达模式的细胞系。对这些“模式系”进行遗传表征以筛选出具有所需表达模式的系。这些模式系可用于反向遗传学研究以鉴定带有有用基因突变的系，也可以将其用作遗传背景以获得功能获得性(GOF)和功能丧失性(LOF)突变。而且，新的表达(或表达缺失)方式可以导致新的表型或性状的发现。另外，表现所需表达模式的模式系可作为指导基因在靶组织或所需发育阶段中表达的遗传基础。
所述的TGT技术可用于鉴定本发明的多核苷酸和/或多肽的功能。例如本发明的多核苷酸序列可用于在本发明的多核苷酸的上游产生适于筛选和鉴定由TGT技术阳性标记的细胞系的PCR引物。一旦经过鉴定，所述多核苷酸序列的功能即可通过将由TGT技术标记的本发明的基因与在特定细胞系或模式系中观察到的特定表型或性状相联系来确定。TGT技术对本发明的多核苷酸另一种可能的应用可能是靶定本发明选择出的多核苷酸的表达。例如用分子生物学领域已知的或本文中其他部分所述的技术将侧翼为上游调节序列的本发明的多核苷酸引入表现所需表达模式的模式系中。
上述技术的多种变化形式均是本领域已知的且能被本领域的技术人员所理解。例如本领域的技术人员可以理解，其他的转座子，报告基因和激活序列等可替换使用或与TGT技术结合使用。应用TGT技术的特定方法参见例如Wilson KJ，等，Microbiol，141：1691-1705，(1995)和US Patent Nos.5,879,906，5,599,670，和5,432,081；这些文献在此引入作为参考。
实施例34-重组蛋白对期望的种子贮藏化合物产生的影响的分析
在植物的遗传修饰中对所需的种子贮藏化合物(如，糖，脂类和脂肪酸)的影响可通过下述方式评估、使修饰过的植物在适当的条件下生长，分析种子或其他植物器官中所需产物(即脂类或脂肪酸)的产量增长。这种分析技术是本领域技术人员已知的，其包括光谱学技术，薄层层析，多种染色方法，酶学和微生物学方法，分析色谱如高效液相色谱(参见例如，Ullman 1985，Encyclopedia of IndustrialChemistry，vol.A2，pp.89-90和443-613，VCH：Weinheim；Fallon，A.等1987，Applications of HPLC in Biochemistry in：LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，vol.17；Rehm等，1993 Product recovery and purification，Biotechnology，vol.3，Chapter III，pp.469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等，1988 Bioseparations：downstream processing forbiotechnology，John Wiley & Sons；Kennedy J.F.& Cabral J.M.S.1992，Recovery processes for biological materials，John Wileyand Sons；Shaeiwitz J.A. & Henry J.D.1988，Biochemicalseparations in：Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Separation and purification techniques in biotechnology，vol.B3，Chapter 11，pp.1-27，VCH：Weinheim；和Dechow F.J.1989)。
除上述的方法之外，可从植物材料中抽提植物脂质，参见Cahoon等(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，22：12935-12940)和Browse等(1986，Anal.Biochemistry 442：141-145)。有关脂类和脂肪酸的定性和定量分析参见Christie，William W.，Advances in LipidMethodology.Ayr/Scotland：Oily Press.-(Oily Press LipidLibrary；2)；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，Scotland：Oily Press，1989 Repr.1992.-IX，307 S.-(Oily Press Lipid Library；1)；″Progress in LipidResearch，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)Progress inthe Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN。
脂肪酸产物存在的明确的证据可通过如下标准的分析方法对转基因植物进行分析而获得：GC，GC-MS或TLC，参见Christie和其中的参考文献(1997 in：Advances on Lipid Methodology第4版：Christie，Oily Press，Dundee，pp.119-169；1998)。有关叶的详细方法参见Lemieux等(1990，Theor.Appl.Genet.80：234-240)，有关种子的参见Focks & Benning(1998，Plant Physiol.118：91-101)。
脂肪酸组合物在甘油主链C-1，C-2或C-3位置的位置分析通过脂肪酶消化确定(参见，如Siebertz & Heinz 1977，Z.Naturforsch.32c：193-205，和Christie 1987，Lipid Analysis第2版，PergamonPress，Exeter，ISBN 0-08-023791-6)。
收集蛋白活性提高或降低对脂类和糖生物合成途径影响的数据的典型方法，是例如对叶或种子用14C-醋酸盐或14C-丙酮酸盐进行标记研究分析碳流(参见如Focks & Benning 1998，Plant Physiol.118：91-101；Eccleston & Ohlrogge 1998，Plant Cell 10：613-621)。14C向脂类和水溶性组分中的分布可在各自分离后(例如在TLC平板上)通过液闪记数确定，包括标准，如14C-蔗糖和14C-苹果酸盐(Eccleston& Ohlrogge 1998，Plant Cell 10：613-621)。
待分析的材料可通过超声，玻璃碾磨，液氮研磨或其他可应用的方法裂解。破碎后需将所述材料离心。所述的沉淀用蒸馏水重悬，在100℃下加热10min，在冰上冷却，然后再离心，然后用含2％二甲氧基丙烷的甲醇中的0.5M硫酸在90℃抽提1小时，使油和脂类化合物水解形成甲基移转的脂类。这些脂肪酸甲基酯在石油醚中抽提，最终用于通过毛细管柱进行GC分析(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25m，0.32mM)，在170℃和240℃的温度梯度下20min，在240℃下5min。对所得的脂肪酸甲基脂的鉴定用可商购(即Sigma)的标准品进行。
对于脂肪酸在不能获得标准品的情况下。通过衍生和接下来的GC-MS分析进行分子鉴定。例如三键脂肪酸的定位在经4，4-二甲氧基-噁唑啉-Derivaten衍生化后通过GC-MS确定(Christie，OilyPress，Dundee，1998)。
分析糖，尤其是淀粉的常用方法参见Stitt M.，Lilley R.Mc.C.，Gerhardt R.和Heldt M.W.(1989，″Determination of metabolitelevels in specific cells and subcellular compartments of plantleaves″Methods Enzymol.174：518-552；其它方法也可参见Hartel等1998，Plant Physiol.Biochem.36：407-417和Focks & Benning1998，Plant Physiol.118：91-101)。
对于可溶性糖和淀粉的抽提，在1.5-ml聚丙烯试管中将50颗种子在500μl 80％(v/v)乙醇中匀浆化，在70℃下温育90min。在16,000g离心5min后，将上清液转移到新的试管中。所得的颗粒状物用500μl80％乙醇抽提两次。合并的上清液的溶剂在室温下真空蒸干。将所得物用50μl水溶解，其代表可溶性的碳水化合物部分。通过乙醇抽提所得的颗粒状物，其包含不溶性的糖，包括淀粉，在200μl 0.2 N KOH中匀浆化，将所述的悬液在95℃下温育1h使淀粉溶解。然后添加35μl1N醋酸。16,000g离心5min，将上清液进行淀粉定量。
10μl糖抽提物加至990μl含100mM咪唑，pH 6.9，5mM MgCl2，2mMNADP，1mM ATP，和2单位2ml-1葡萄糖-6-P脱氢酶的反应缓冲液中对可溶性糖进行定量。为了进行葡萄糖，果糖和蔗糖的酶学测定，相继加入4.5单位的己糖激酶，1个单位的磷酸葡糖异构酶，和2μl饱和的果糖甙酶溶液。所产生的NADPH在340nm波长下进行分光光度监测。类似地，用来自Boehringer Mannheim的试剂盒在30μl不溶性的碳水化合物组分中测定淀粉。
分析叶和种子中蛋白含量的实例参见Bradford M.M.(1976，″Arapid and sensitive method for the quantification of microgramquantities of protein using the principle of protein dyebinding″Anal.Biochem.72：248-254)。为对总的种子蛋白进行定量，在1.5-ml聚丙烯试管中用250μl丙酮将15-20颗种子匀浆化。接下来16,000g离心，弃上清，将所得的颗粒状物真空干燥后重悬于含50mM Tris-HCl，pH 8.0，250mM NaCl，1mM EDTA，和1％(w/v)SDS的250μl抽提缓冲液中。在25℃下温育2h后，将组织匀浆16,000g离心5min，200ml上清液用于蛋白测定。在试验中用γ-球蛋白校准。用Lowry DC蛋白试验(Bio-Rad)或Bradford试验(Bio-Rad)进行蛋白测定。
己糖激酶和果糖激酶的酶学分析按照Renz等(1993，Planta190：156-165)通过分光光度法进行，磷酸葡糖异构酶，ATP-依赖的6-磷酸果糖激酶，焦磷酸盐依赖的6-磷酸果糖激酶，果糖-1，6-二磷酸醛缩酶，丙糖磷酸异构酶，甘油-3-P脱氢酶，磷酸甘油激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇化酶和丙酮酸激酶依照Burrell等(1994，Planta194：95-101)进行，UDP-葡萄糖-焦磷酸化酶依照Zrenner等(1995，Plant J.7：97-107)进行。
碳水化合物代谢的中间体，如葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，磷酸烯醇丙酮酸，丙酮酸，和ATP的测定参照Hrtel等(1998，Plant Physiol.Biochem.36：407-417)，代谢物的测定参照Jelitto等(1992，Planta 188：238-244)进行。
除测定最终的种子贮藏化合物(即，脂、淀粉或贮藏蛋白)之外，也可以分析代谢途径中用于产生所需种子贮藏化合物的其他组分，如中间体或副产物，以确定所述化合物产生的总的效率(Fiehn等2000，Nature Biotech.18：1447-1161)。
例如，可以用标准的方法构建含有此处所述的核酸或其片段的酵母表达载体，然后将其转化到啤酒酵母(Saccromycetes cerevisie)中。分析所得的转基因细胞，测定糖，油，脂或脂肪酸含量的改变。
类似地，可以用标准的方法构建含有此处所述的核酸或其片段的植物表达载体，然后将其转化到合适的植物细胞，如拟南芥属植物，大豆，油菜，玉米，小麦，Medicago truncatula等中。分析所得的转基因细胞和/或由此衍生的植物中糖，油，脂或脂肪酸含量的改变。
另外，此处所公开的序列或其片段可用于在多种生物，如细菌，哺乳动物细胞，酵母细胞，和植物细胞的基因组中产生剔除突变(Girkeat al.1998，Plant J.15：39-48)。然后评估所得的剔除细胞的种子贮藏化合物的组成和含量，以及突变对表型和/或基因型的影响。其他基因灭活的方法包括US 6004804″非嵌合突变载体″和Puttaraju等(1999，″拼接子介导的RNA反式拼接是基因治疗的工具″NatureBiotech.17：246-252)。
Claims (94)
1.一种分离的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含选自下组的多核苷酸：
a)SEQ ID NO：1的多核苷酸；
b)SEQ ID NO：3的多核苷酸；
c)SEQ ID NO：5的多核苷酸；
d)SEQ ID NO：7的多核苷酸；
e)SEQ ID NO：9的多核苷酸；
f)编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸；
g)编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；
h)编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸；
i)编码SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸；
j)编码SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸；
k)包含上述a)到j)中任何一项的至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
l)与SEQ ID NO：1，3，5，7，或9的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
m)编码与SEQ ID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；和
n)与上述a)到m)中任何一项所述多核苷酸互补的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸。
4.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸。
5.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸。
6.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸。
7.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含编码与SEQ ID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
8.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含权利要求1a)到j)的多核苷酸中任何一个的至少60个连续的核苷酸。
9.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸包含与SEQ ID NO：1，3，5，7或9的核苷酸序列有至少90％序列同一性的多核苷酸。
10.一种包含权利要求1所述的核酸的载体。
11.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸编码在植物中行使环境胁迫应答调节剂功能的多肽。
12.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述核酸在植物中表达不足可提高所述植物对环境胁迫的耐性。
13.如权利要求12所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的环境胁迫是干旱。
14.如权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸，其中，所述的核酸编码在蛋白质法呢基化中起作用的多肽。
15.一种能与选自下述的第二核酸在严紧条件下杂交的分离的第一核酸：
a)包含SEQ ID NO：1，3，5，7或9的多核苷酸的第二核酸；和
b)编码SEQ ID NO：2，4，6，8或10的多肽的第二核酸，其中，所述的第一核酸编码在植物中行使环境胁迫应答调节剂功能的多肽。
16.包含权利要求1所述的异戊二烯基蛋白酶编码核酸的转基因植物细胞。
17.包含如权利要求16所述的植物细胞的转基因植物。
18.如权利要求17所述的植物，其中，所述的植物是单子叶植物。
19.如权利要求17所述的植物，其中，所述的植物是双子叶植物。
20.如权利要求17所述的转基因植物，其中，所述的植物选自玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦(triticale)，稻，大麦，大豆，花生，棉花，菜籽油菜，canola，木薯，胡椒，向日葵，万寿菊属(tagetes)，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，番茄，野豌豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可树，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草和饲料作物。
21.由权利要求17所述的植物产生的植物种子。
22.如权利要求21所述的种子，其中，所述的种子对于与该种子的野生型品种相比提高的对环境胁迫的耐性而言是不分离的。
23.一种调节植物对环境胁迫的耐性的方法，该方法包括修饰植物中异戊二烯基蛋白酶编码核酸的表达，其中所述的核酸选自：
a)SEQ ID NO：1的多核苷酸；
b)SEQ ID NO：3的多核苷酸；
c)SEQ ID NO：5的多核苷酸；
d)SEQ ID NO：7的多核苷酸；
e)SEQ ID NO：9的多核苷酸；
f)编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸；
g)编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；
h)编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸；
i)编码SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸；
j)编码SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸；
k)包含上述a)到j)中任何一项的至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
l)与SEQ ID NO：1，3，5，7，或9的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
m)编码与SEQ ID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；和
n)与上述a)到m)中任何一项所述多核苷酸互补的多核苷酸。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述的环境胁迫选自高盐，干旱和温度。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：2的多肽的多核苷酸。
26.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：4的多肽的多核苷酸。
27.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：6的多肽的多核苷酸。
28.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：8的多肽的多核苷酸。
29.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：10的多肽的多核苷酸。
30.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含编码与SEQID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
31.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含权利要求1的a)到j)多核苷酸任何一个的至少60个连续的核苷酸。
32.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸包含与SEQ IDNO：1，3，5，7或9的核苷酸序列有至少90％序列同一性的多核苷酸。
33.如权利要求23所述的方法，其中，所述植物的胁迫耐性通过降低植物中所述核酸的表达而提高。
34.如权利要求23所述的方法，其中，所述的核酸编码在蛋白质法呢基化中起作用的多肽。
35.如权利要求23所述的方法，其中，所述的植物不是转基因的。
36.如权利要求23所述的方法，其中，所述的植物是转基因的。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述的植物被指导所述核酸表达的启动子转化。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述的启动子是组织特异性的。
39.如权利要求37所述的方法，其中，所述的启动子是发育调节型的。
40.一种产生包含异戊二烯基蛋白酶编码核酸的转基因植物的方法，其中，所述的植物与该植物的野生型品种相比对环境胁迫的耐性提高了，该方法包括：用包含所述核酸的表达载体转化植物细胞，再由该植物细胞产生转基因植物，其中所述的核酸选自：
a)SEQ ID NO：1的多核苷酸；
b)SEQ ID NO：3的多核苷酸；
c)SEQ ID NO：5的多核苷酸；
d)SEQ ID NO：7的多核苷酸；
e)SEQ ID NO：9的多核苷酸；
f)编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸；
g)编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；
h)编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸；
i)编码SEQ ID NO：8的多肽的多核苷酸；
j)编码SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸；
k)包含上述a)到j)中任何一项的至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
l)与SEQ ID NO：1，3，5，7，或9的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
m)编码与SEQ ID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；和
n)与上述a)到m)中任何一项所述多核苷酸互补的多核苷酸。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述的环境胁迫选自高盐，干旱和低温。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述的植物是单子叶植物。
43.如权利要求40所述的方法，其中，所述的植物是双子叶植物。
44.如权利要求40所述的方法，其中，所述的植物选自玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦(triticale)，稻，大麦，大豆，花生，棉花，菜籽油菜，canola，木薯，胡椒，向日葵，万寿菊属(tagetes)，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，番茄，野豌豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可树，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草和饲料作物。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：2的多肽的多核苷酸。
46.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：4的多肽的多核苷酸。
47.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：6的多肽的多核苷酸。
48.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：8的多肽的多核苷酸。
49.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码SEQ IDNO：10的多肽的多核苷酸。
50.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含编码与SEQID NO：2，4，6，8或10的多肽具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。
51.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含a)到j)多核苷酸中任何一个的至少60个连续的核苷酸。
52.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸包含与SEQ IDNO：1，3，5，7或9的核苷酸序列有至少90％序列同一性的多核苷酸。
53.如权利要求44所述的方法，其中，所述植物的胁迫耐性通过降低植物中的所述核酸的表达而提高。
54.如权利要求44所述的方法，其中，所述的核酸编码在蛋白质法呢基化中起作用的多肽。
55.如权利要求44所述的方法，其中，所述的植物被指导所述核酸表达的启动子转化。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述的启动子是组织特异性的。
57.如权利要求55所述的方法，其中，所述的启动子是发育调节型的。
58.一种分离的启动子编码核酸，其中，所述的核酸包含选自下组的多核苷酸：
a)SEQ ID NO：11的多核苷酸；
b)包含上述a)中至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
c)与SEQ ID NO：11的多核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)与上述a)到c)中任何一项所述多核苷酸互补的多核苷酸。
59.如权利要求58所述的启动子编码核酸，其中，所述的核酸包含编码SEQ ID NO：11的多肽的多核苷酸。
60.如权利要求58所述的启动子编码核酸，其中，所述的核酸包含权利要求58 a)到c)的任一多核苷酸中的至少60个连续的核苷酸。
61.如权利要求1所述的启动子编码核酸，其中，所述的核酸包含与SEQ ID NO：11的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸。
62.包含权利要求58所述核酸的载体。
63.如权利要求58所述的启动子编码核酸，其中，所述的核酸在植物中行使环境胁迫应答调节剂功能。
64.如权利要求58所述的启动子编码核酸，其中，所述核酸在植物中启动不足可提高所述植物对环境胁迫的耐性。
65.如权利要求64所述的启动子编码核酸，其中，所述的环境胁迫是干旱。
66.一种能与包含SEQ ID NO：11的多核苷酸的第二核酸在严紧条件下杂交的分离的第一核酸。
67.包含如权利要求58所述的启动子编码核酸的转基因植物细胞。
68.包含如权利要求67所述植物细胞的转基因植物。
69.如权利要求68所述的植物，其中，所述的植物是单子叶植物。
70.如权利要求68所述的植物，其中，所述的植物是双子叶植物。
71.如权利要求68所述的转基因植物，其中，所述的植物选自玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦(triticale)，稻，大麦，大豆，花生，棉花，菜籽油菜，canola，木薯，胡椒，向日葵，万寿菊属(tagetes)，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，番茄，野豌豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可树，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草和饲料作物。
72.由权利要求68所述的植物产生的植物种子。
73.如权利要求72所述的种子，其中，所述的种子对于与该种子的野生型品种相比提高的对环境胁迫的耐性而言是不分离的。
74.一种调节植物对环境胁迫耐性的方法，该方法包括修饰植物中启动子编码核酸的表达，其中所述的核酸选自：
a)SEQ ID NO：11的多核苷酸；
d)包含上述a)中至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
e)与SEQ ID NO：11的多核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)与上述a)到c)任何一项中所述多核苷酸互补的多核苷酸。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述的环境胁迫选自高盐，干旱和温度。
76.如权利要求74所述的方法，其中，所述的核酸包含SEQ IDNO：11的多核苷酸。
77.如权利要求74所述的方法，其中，所述的核酸包含a)到c)的任一多核苷酸中的至少60个连续的核苷酸。
78.如权利要求74所述的方法，其中，所述的核酸包含与SEQ IDNO：11的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸。
79.如权利要求74所述的方法，其中，所述植物胁迫耐性通过降低植物中的所述核酸的表达而提高。
80.如权利要求74所述的方法，其中，所述的植物不是转基因的。
81.如权利要求74所述的方法，其中，所述的植物是转基因的。
82.如权利要求74所述的方法，其中，所述的启动子是组织特异性的。
83.如权利要求74所述的方法，其中，所述的启动子是发育调节型的。
84.一种产生包含启动子编码核酸的转基因植物的方法，其中，所述的植物与该植物的野生型品种相比对环境胁迫的耐性提高了，该方法包括：用包含所述核酸的表达载体转化植物细胞，再由该植物细胞产生转基因植物，其中所述的核酸选自：
a)SEQ ID NO：11的多核苷酸；
f)包含上述a)中至少60个连续的核苷酸的多核苷酸；
g)与SEQ ID NO：11的多核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)与上述a)到c)任何一项中所述多核苷酸互补的多核苷酸。
85.如权利要求84所述的方法，其中，所述的环境胁迫选自高盐，干旱和低温。
86.如权利要求84所述的方法，其中，所述的植物是单子叶植物。
87.如权利要求84所述的方法，其中，所述的植物是双子叶植物。
88.如权利要求84所述的方法，其中，所述的植物选自玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦(triticaie)，稻，大麦，大豆，花生，棉花，菜籽油菜，canola，木薯，胡椒，向日葵，万寿菊属(tagetes)，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，番茄，野豌豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可树，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草和饲料作物。
89.如权利要求84所述的方法，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：11的多核苷酸。
90.如权利要求84所述的方法，其中，所述的核酸包含a)到c)的任一多核苷酸中的至少60个连续的核苷酸。
91.如权利要求84所述的方法，其中，所述的核酸包含与SEQ IDNO：11的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸。
92.如权利要求84所述的方法，其中，所述植物的胁迫耐性是通过降低植物中的所述核酸的表达而提高的。
93.如权利要求84所述的方法，其中，所述的启动子是组织特异性的。
94.如权利要求84所述的方法，其中，所述的启动子是发育调节型的。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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