CN113832036B - 一种露湿漆斑菌clf007、固定化微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种露湿漆斑菌CLF007，该菌株已于2021年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2021666，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)，分类学命名：露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)。本发明首先从受重金属砷、镉、铅及铬复合污染的土壤中筛选出露湿漆斑菌CLF007，通过单菌株、不同固定化载体菌剂对水中重金属吸附试验得出，CLF007菌剂对As、Cd、Cr及Pb表现出较高的耐受性，且在水中可对这4种重金属具有一定的吸附作用，具有一定的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染水体和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便等优点。

Description

一种露湿漆斑菌CLF007、固定化微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种露湿漆斑菌CLF007、固定化微生物菌剂及其应用。

背景技术

铜铁矿冶炼排放的主要污染物包括砷、镉、铅及铬，均为重金属，具有较强的致畸致癌致突变作用。砷化合物经呼吸、消化道及皮肤暴露均有致癌效应，其中以无机砷的毒性最大，一旦被吸收，便在体内长期残留，容易在皮肤及其附近分布蓄积，可造成的癌症包括皮肤癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌及恶性脑肿瘤等。镉暴露途径主要包括经呼吸及经消化道暴露，人体内半衰期有 20～30a，镉对人体的急性毒害主要表现为肺损害、全身疲乏、肌肉酸痛、胃肠刺激反应和虚脱等；慢性毒害主要表现为对骨骼、肝脏肾脏、免疫系统、遗传等的系列损伤，并诱发多种癌症。环境中的铅主要通过消化道，其次可通过呼吸道和皮肤暴露进入人体，并慢慢蓄积，进入消化道的铅，吸收率仅5％～10％，主要在十二指肠被吸收，进入呼吸道的铅，一般25％～30％被吸收入人体内，当摄入过量时，易发生贫血、高血压、神经衰弱及心肌损伤等。铬以Cr(VI)毒性最大，短时间接触会引起皮肤溃疡，过敏性反应和接触性皮炎等病症，长期暴露会造成颅内出血、慢性支气管炎、肺炎、并诱发癌症(肺癌和胃癌)，Cr(VI) 还能与DNA酶聚合酶发生错配导致遗传性基因缺陷。因此，对重金属污染进行有效防控和修复治理至关重要。

近年来，微生物修复处理技术已经成为研究热点，依靠微生物对重金属的吸附和积累作用，可对重金属污染进行有力修复，并具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点。

中国专利文献CN111733087A公开了一株产漆酶的露湿漆斑菌及其应用，该露湿漆斑菌能分泌漆酶，降解木质素，并能通过自身代谢物，完成对秸秆的降解，过程简单，温和有效，具有广阔的应用前景。中国专利文献CN105441331 B公开了一株露湿漆斑菌及其应用，该菌株是以苹果园感病稗草为材料分离得到的，对玉米、小麦和水稻等作物安全，同时对稗草防治效果较好，对马唐、狗尾草等杂草也具有一定的生物防治作用，显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂，具有极为显著的经济和社会效益。

上述报道的露湿漆斑菌都是能分泌漆酶、降解木质素，或者是在生物防治方面的应用，目前，关于露湿漆斑菌在吸附重金属方面的文献报道较少。

发明内容

针对以上现有技术中的不足，本发明提供了一种露湿漆斑菌CLF007、固定化微生物菌剂及其应用。该菌株的菌落形态为白色无定型状、表面有绒毛，底部发黄并有花纹褶皱，对重金属As、Cd、Cr和Pb均具有一定的吸附作用，因此，该菌株在治理重金属污染环境中有良好的应用前景。

本发明的一个目的在于提供一种露湿漆斑菌CLF007。

一种露湿漆斑菌CLF007，该菌株已于2021年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2021666，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)，分类学命名：露湿漆斑菌 (Myrothecium roridum strain)。

露湿漆斑菌(Myrothecium roridum strain)在固体培养基上，28℃培养5d，菌落形态为白色无定型状、表面有绒毛，底部发黄并有花纹褶皱，扩增的ITS 序列由604bp的碱基组成，同源比对分析发现，菌株CLF007与Myrothecium roridum strain JL-3(Accession：JX867215.1)的序列相似性为99.17％，与Myrothecium roridum strain F04(Accession：HQ839773.1)的序列相似性为 98.83％，与Myrothecium roridum strainHSAUP063205(Accession：HQ839773.1) 的序列相似性为98.67％。进化树分析显示菌株CLF007与Myrothecium roridum strain聚集在同一分支，所述的露湿漆斑菌CLF007的ITS序列如SEQ ID NO： 1所示，基于细胞形态、16S rDNA测序比对分析可知，菌株CLF007归属于露湿漆斑菌(Myrothecium roridum strain)。

进一步地，本发明提供了上述露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用。

进一步地，所述重金属为As、Cd、Cr和Pb中的一种或多种混合。

进一步地，所述污染环境为水样或者土样中的一种。

本发明的另外一个目的在于提供一种固定化微生物菌剂。

所述固定化微生物菌剂包括上述露湿漆斑菌CLF007和固定化载体。

进一步地，所述固定化载体为海泡石、硅藻土、泥炭土、玉米芯和板栗壳中的一种。

进一步地，本发明提供了上述固定化微生物菌剂在治理重金属污染环境中的应用。

进一步地，所述重金属为As、Cd、Cr和Pb中的一种或多种混合。

进一步地，所述污染环境为水样或者土样中的一种。

与现有技术，本发明具有如下优点：

本发明首先从受重金属砷、镉、铅及铬复合污染的土壤中筛选出露湿漆斑菌CLF007，通过单菌株、不同固定化载体菌剂对水中重金属吸附试验得出， CLF007菌剂对As、Cd、Cr及Pb表现出较高的耐受性，且在水中可对这4种重金属具有一定的吸附作用，具有一定的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染水体和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明菌株CLF007菌落形态图；

图2为菌株CLF007系统进化树结果图；

图3为菌株CLF007的ITS基因序列片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为菌株CLF007对溶液中重金属吸附变化结果图；

图5为固定化CLF007菌剂对溶液中重金属吸附变化结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中涉及到的培养基配方及试剂组分如下：

真菌液体培养基：酵母浸出粉2.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水定容至1L，调节pH至6.2～6.6，115℃高压灭菌 30min。

真菌固体培养基：在真菌液体培养基的基础上加入2％琼脂。

其他常规试剂和设备，如无特别说明，均可市售获得；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1露湿漆斑菌CLF007的筛选及鉴定

筛选：在湖北省大冶市长乐村附近进行土壤采样，首先除去地表植物残体和石块，取0～20cm表层土壤样品，多点采集5～10g样品至无菌管中；从上述无菌管中取出5g底泥样品加入到45ml无菌水中，振荡2h后静置10min，取上清液梯度稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7后，采用涂布法将上述菌液分别均匀涂布在含Cd²⁺浓度为50mg·L^-1、Cr⁶⁺浓度为50mg·L^-1、Pb²⁺浓度为 50mg·L^-1、As3+浓度为50mg·L^-1的真菌固体培养基平板上，30℃倒置培养，培养2～7d后，富集得到86种真菌；

继续挑选上述86种真菌的单菌落接种于含有Cd²⁺浓度为200mg·L^-1、Cr⁶⁺浓度为200mg·L^-1、Pb²⁺浓度为200mg·L^-1和As³⁺浓度为200mg·L^-1的真菌固体培养基平板上，30℃倒置培养，培养2～7d后，富集得到61种真菌；

继续挑选上述61种真菌的单菌落接种于含有Cd²⁺浓度为400mg·L^-1、Cr⁶⁺浓度为400mg·L^-1、Pb²⁺浓度为400mg·L^-1和As³⁺浓度为300mg·L^-1的真菌固体培养基平板上，30℃倒置培养，培养2～7d后，富集得到34种真菌；

继续挑选上述34种真菌的单菌落接种于含有Cd²⁺浓度为1000mg·L^-1、Cr⁶⁺浓度为1000mg·L^-1、Pb²⁺浓度为1000mg·L^-1和As³⁺浓度为500mg·L^-1的真菌固体培养基平板上，30℃倒置培养，培养2～7d后，富集得到6种真菌；

将上述6种真菌进行重金属的耐受性测试，结果见表1～6：

表1 菌株CLF007在不同浓度和重金属培养基中生长情况

表2 菌株F018在不同浓度和重金属培养基中生长情况

表3 菌株F024在不同浓度和重金属培养基中生长情况

表4菌株F032在不同浓度和重金属培养基中生长情况

表5菌株F053在不同浓度和重金属培养基中生长情况

表6 菌株F068在不同浓度和重金属培养基中生长情况

从表1～6中可以看出，在含有Cd²⁺的培养基上，菌株CLF007在浓度为50～ 300mg/L的条件下能生长，菌株F053在浓度为50～400mg/L的条件下能生长，其余菌株均未长出；在浓度为50～1000mg/L的Cr⁶⁺或Pb²⁺培养基上，菌株 CLF007、F024和F053均能生长，菌株F018仅在低浓度Pb²⁺培养基上生长，菌株F032和菌株F068仅在低浓度Cr⁶⁺培养基上生长；在As³⁺和混合重金属离子培养基上，仅菌株CLF007和F053能生长，并且菌株CLF00能生长的培养基浓度更宽，生长速度更快，因此，最终筛选得到一种真菌，将该菌株命名为CLF007。

菌株形态学观察：将纯化的CLF007菌株接种于真菌液体培养基过夜活化，涂布于真菌固体培养基上，28℃培养5d，观察菌落的表面形态。

分子生物学鉴定：对CLF007菌株的ITS基因进行测序，具体如下：以CLF007 菌株的基因组DNA为模板，选择真菌通用引物ITSl和ITS4扩增ITS基因序列，扩增出的ITS基因序列经琼脂糖凝胶电泳分析，得到目的片段大小在600bp左右，结果见图3；上述序列经纯化后插入到pMD18-T载体(Takara)，然后转化到E.coli DH5α，得到阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司测序，将测序得到的序列与在线软件NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中细菌数据库序列进行同源比对分析，使用MEGA6.5软件，以M-L法进行聚类分析和系统进化树的构建，重复取样1000次，并且运用自展(Bootstrap)法检验所计算的进化树拓扑结构稳定性，发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值。

所述引物序列如下：

ITSl：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO.2)；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO.3)

CLF007菌株具体鉴定信息如下：

形态特征：在固体培养基上，28℃培养5d，菌落形态为白色无定型状、表面有绒毛，底部发黄并有花纹褶皱，具体结果见图1。

ITS基因序列测序：扩增的ITS序列由604bp的碱基组成，同源比对分析发现，菌株CLF007与Myrothecium roridum strain JL-3(Accession：JX867215.1) 的序列相似性为99.17％，与Myrothecium roridum strain F04(Accession： HQ839773.1)的序列相似性为98.83％，与Myrothecium roridum strain HSAUP063205(Accession：HQ839773.1)的序列相似性为98.67％。进化树分析显示菌株CLF007与Myrothecium roridum strain聚集在同一分支，所述的露湿漆斑菌CLF007的ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

基于细胞形态、16S rDNA测序比对分析可知，菌株CLF007归属于露湿漆斑菌(Myrothecium roridum strain)。

实施例2露湿漆斑菌CLF007对溶液中重金属的吸附实验

从真菌固体平板上挑取CLF007菌株的单菌落接种于含有100ml真菌液体培养基的250ml烧瓶中，在28℃，150r/min的条件下摇瓶培养至对数生长期，按 5％的接种量将上述生长到对数期的菌液接种到浓度为100mg/L的单一重金属溶液(Cd²⁺、Cr⁶⁺、Pb²⁺、As³⁺)中和浓度为25mg/L的混合重金属溶液中，以不接菌液的培养基作为空白对照，继续摇瓶培养5d，然后测量溶液中重金属离子的浓度，重金属离子的浓度的测定采用原子吸收光谱法进行测定，重金属吸附率的计算公式如下：

η＝(C₀-C_e)/C₀×100％

式中C₀为空白对照样品重金属浓度(溶液单位为mg/L)，C_e为实验样品重金属浓度(溶液单位为mg/L)。

露湿漆斑菌CLF007对溶液中重金属的吸附结果见图4，从图中可以看出，在浓度为100mg/L单一重金属溶液中，CLF007菌株对Pb的吸附率为5％，对 Cr和Cd的吸附率分别为3％左右，对As几乎不吸附；在浓度为25mg/L混合重金属溶液中，CLF007菌株对四种重金属的吸附率为5％，结果表明，CLF007菌株对高浓度重金属均有一定的吸附作用。

实施例3固定化露湿漆斑菌CLF007菌剂对溶液中重金属的吸附实验

3.1固定化载体预处理

将海泡石置于马弗炉中加热活化，活化温度400℃，活化时间48h，过40 目筛，保存备用；硅藻土用5％盐酸浸泡载体2h，蒸馏水水洗至中性，用5％氢氧化钠浸泡载体2h，蒸馏水水洗至中性，烘干过40目筛后备用；泥炭土用0.01 mol/L NaOH溶液浸泡，其固液比1:5，置于恒温摇床中震荡12～24h，然后调节 pH至6.5～7.5，离心分离，取沉淀物60℃烘干，研磨过40目筛，保存备用；玉米芯和板栗壳过40目筛后备用；将上述5种载体置于250mL锥形瓶(每瓶放 100mL载体)用纱布和牛皮纸封口，于121℃高压蒸气灭菌30min，保存在无菌室温环境下。

3.2露湿漆斑菌CLF007菌剂的固定化

从真菌固体平板上分别挑取CLF00菌株的单菌落接种于5个含有100ml真菌液体培养基的250ml烧瓶中，在28℃，150r/min的条件下摇瓶培养3d，然后在无菌条件下向上述5个烧瓶中分别加入10ml上述固定化载体，将上述烧瓶置于摇床上，在120r/min的条件下，固定48h后置于4℃冰箱中保存。

3.3固定化露湿漆斑菌CLF007菌剂对溶液中重金属的吸附

按5％的接种量将上述固定化露湿漆斑菌CLF007菌剂接种到浓度为 100mg/L的单一重金属溶液(Cd²⁺、Cr⁶⁺、Pb²⁺、As³⁺)中和浓度为25mg/L的混合重金属溶液中，继续摇瓶培养5d，然后测量溶液中重金属离子的浓度，重金属离子浓度的测定和计算和实施例3中的一样。

固定化露湿漆斑菌CLF007菌剂对溶液中重金属的吸附结果见图5，在浓度为100mg/L单一重金属溶液中，海泡石固定化CLF007菌剂对重金属Cr、Cd、 Pb的吸附率分别为83.98％、13.72％、8.62％，其中对重金属Cr的吸附率优于其他载体固定化CLF007菌剂；泥炭土固定化CLF007菌剂对重金属Cr、Cd、Pb 和As的吸附率分别为37.14％、69.15％、15.21％和0.32％，其中对重金属Cd的吸附率优于其他载体固定化真菌菌剂；在浓度为25mg/L混合重金属溶液中，泥炭土固定化真菌对重金属Pb的吸附率为47.44％，优于其他载体固定化真菌菌剂。

上述结果表明，将该菌株加入到固定化载体中进行固定后，得到固定化微生物菌剂，相比于游离的露湿漆斑菌CLF007，固定化的露湿漆斑菌CLF007对重金属的吸附性能有了较大的提升。

以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 王善仙

湖北省生态环境科学研究院（省生态环境工程评估中心）

<120> 一种露湿漆斑菌CLF007、固定化微生物菌剂及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 604

<212> DNA

<213> 露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)

<400> 1

cttcccgtag gggtgacctg cggagggatc attaccgagt ttacaaactc ccaaaccctt 60

tgtgaacctt accaatcgtt gcttcggcgg gatcgccccg gcgccttcgg gcccggaacc 120

aggcgcccgc cggaggcccc aaactcttat gtctttagtg gttttctcct ctgagtgaca 180

cataaacaaa taaataaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga 240

acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 300

aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc 360

ctcaggcccc cagtgcctgg cgttggggat cggcgtgggc ggcgacggct ctccggagtc 420

cgagccaatg cctgccggcc ccgaaattca gtggcggtct cgctgtagtc cccctctgcg 480

tagtagcaca actcgcattg gagctcggcg gtggccatgc cgtaaaacac cccacttctg 540

aaagttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagccgga 600

ggaa 604

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一种露湿漆斑菌CLF007，其特征在于，分类学命名为露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum strain)，其保藏号为CCTCC NO：M2021666。

2.权利要求1所述的露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用。

3.如权利要求2所述的露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用，其特征在于，所述重金属为As、Cd、Cr和Pb中的一种或多种混合。

4.如权利要求2所述的露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用，其特征在于，所述污染环境为水样或者土样中的一种。

5.一种固定化微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的露湿漆斑菌CLF007和固定化载体。

6.如权利要求5所述的固定化微生物菌剂，其特征在于，所述固定化载体为海泡石、硅藻土、泥炭土、玉米芯和板栗壳中的一种。

7.权利要求5或6所述的固定化微生物菌剂在治理重金属污染环境中的应用。

8.如权利要求7所述的露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用，其特征在于，所述重金属为As、Cd、Cr和Pb中的一种或多种混合。

9.如权利要求7所述的露湿漆斑菌CLF007在治理重金属污染环境中的应用，其特征在于，所述污染环境为水样或者土样中的一种。