DE3135541A1

DE3135541A1 - Kallikrein-trypsin-inhibitor-(bpti)-derivate, traegergebundene bpti-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung zur herstellung der reinen enzyme trypsin, chymotrypsin und kallikrein

Info

Publication number: DE3135541A1
Application number: DE19813135541
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr. 5600 Wuppertal Schutt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1981-09-08
Filing date: 1981-09-08
Publication date: 1983-03-24
Also published as: DK399982A; FR2512445B1; FR2512445A1; JPS5855430A

Description

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk

Zentralbereich

Patente, Marken und Lizenzen Ad-by-c «y %BQ, 1981

Kallikrein-Trypsin-Inhibitor-(BPTI)-Derivate, trägergebundene BPTI-Derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung der reinen Enzyme Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein

Die Erfindung betrifft Kallikrein-Trypsin-Inhibitor (basic pancreatic trypsin inhibitor/Kunitz-BPTI)-Derivate, trägergebundene BPTI-Derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur affinitätschromatographischen Reinigung der Enzyme Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein.

Die proteolytischen Enzyme Trypsin (EC 3.4.4.4.)/. Chymotrpysin A (EC 3.4.4.5.), Chymotrypsin B (EC 3.4.4.6.) und Kallikrein (EC 3.4.4.21.) werden aus tierischen Organen von Schwein und Rind, bevorzugt aus dem Pankreasorgan der genannten Tiere gewonnen.

Die Enzyme Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein werden für medizinische Zwecke eingesetzt. Trypsin und Chymotrypsin können nach der DE-OS 2 432 518 in trägergebundener Form als Fibrin-lösende Arzneimittel verwendet werden. Chymotrpysin findet ferner Einsatz in der Ophfialmologie zur Ablösung der Augenlinse bei Augenoperationen .

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Beide Enzyme werden außerdem als analytische Reagenzien benutzt.

Das Enzym Kallikrein hat zahlreiche medizinische Anwendungsgebiete .

Kallikrein wird wegen seiner vasodilatorischen Eigenschaften vor allem bei peripheren Durchblutungsstörungen verwendet, z.B. bei Auftreten von Endangiitis obliterans, Arteriosclerosis obliterans und Morbus Raynaud sowie bei Brüchen und Wunden, z.B. dem Sudeck Syndrom, Verbrennungen

1° sowie bei altersbedingten Durchblutungsstörungen.

Für die vorgenannten Verwendungszwecke werden sehr reine Enzyme benötigt.

Die Enzyme Trypsin und Chymotrypsin können bekanntlich nach der Vorschrift von M. Kunitz und J.H. Northrop, J. Gen. Physiol. IJ) (1936.), 91 ff. durch Kristallisation der inaktiven Zymogene mit anschließender Aktivierung sowie durch Ionenaustauscherchromatographie gewonnen werden.

Die genannten Verfahren sind jedoch unspezifisch und 20 in der technischen Ausführung sehr aufwendig.

Das Enzym Kallikrein wurde bereits in einheitlicher Form aus vorgereinigten Extrakten des Schweinepankreas durch Chromatographie an Ionenaustauschersäulen er-

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halten (C. Kutzbach und G. Schmidt-Kastner, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 353^ (1972, 1099-1106, DE-OS 2 154 556 und DE-OS 2 154 557).

Es sind jedoch ausgehend vom Organextrakt insgesamt 5 Schritte zur Gewinnung des reinen Enzyms Kallikrein notwendig.

Aus wirtschaftlichen Erwägungen ist die in einem Isolierungsschritt verlaufende Gewinnung der Enzyme Trypsin, Chymotrpysin und kallikrein mittels trägergebundener⁴' 10 Inhibitoren oder Enzyme (Äffinitätschromatographie) den auf mehr oder weniger unspezifischen Wechselwirkungen beruhenden Ionenaustauscherschritten überlegen.

In der Literatur ist bereits eine Vielzahl von affinitätschromatographischen Verfahren zur einheitlichen 15 Herstellung der proteolytischen Enzyme Trpysin, Chymotrypsin und Kallikrein beschrieben worden.

Ein Teil der affinitätschromatographischen Verfahren geht von der Immobilisierung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) aus, der mit den proteolytischen Enzymen Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein und Plasmin in Abhängigkeit des angewandten pH Wertes reversibel einen Enzym-Inhibitor-Komplex bildet.

Der BPTI ist aufgrund seiner pH-, thermischen, proteolytischen und Lösungsmittel-Stabilität (B. Kassell, Methods 25 ir Enzymology Jj^. (1970), 844-852) verglichen mit anderen polyvalenten Inhibitoren, wie z.B. dem Soya-Bohnen-

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■Χ-

Trypsin-Inhibitor, besonders zur Isolierung der proteolytischen Enzyme aus Organextrakten geeignet. Durch die Bildung an den BPTI ist das proteolytische Enzym weitgehend vor einer Inaktivierung geschützt.

Der BPTI ist ein aus Rinderorganen gewonnenes Polypeptid mit. 58 Aminosäuren bekannter Primärstruktur. U.a. wegen seines hohen Preises sollte der BPTI zur Affinitätschromatographie von Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein in einer möglichst bindungsaktiven Form immobilisiert werden.

Aus der Röntgenstrukturanalyse der kristallisierten Enzym-Inhibitor-Komplexe sind die an der Komplexbildung mit proteolytischen Enzymen beteiligten Aminosäurereste des BPTI bekannt. Essentiell für die Kornplexbildung ist im BPTI vor allem der Lysin 15-Rest. Außerdem sind zur Bindung von Proteasen die Cystein 14- und Cystein 38-Reste, der Alanin 16-Rest sowie die basischen Arginin 17- und Arginin 39-Reste des BPTI notwendig.

Besonders wichtig für die Komplexbildung mit proteolytischen Enzymen auf Seiten des BPTI ist der Lysin 15-Rest, dessen chemische Modifizierung mit Bernsteinsäure- und Maleinsäureanhydrid zu inaktivem Penta-Succinyl- und Penta-maleoyl-BPTI führt. Wird dagegen

²^ der Trypsin-BPTI-Komplex in gleicher Weise modifiziert, so entsteht der hemmaktive Tetrasuccinyl-Inhibitor (N ^-Arg¹, N ^ Lysin²⁶, N ^ -^ysin und N ^-Lysin⁴⁶).

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•X-

Ebenfalls hemmaktiv sind die nach gleichem Schema hergestellten Tetramaleoyl-Inhibitoren, Tetramaleoyl(15-Homoarginin)-Inhibitoren und der Tetramaleoyl (15-N carbamyD-Lysin-Inhibitor (H. Fritz, H. Schult, R. Meister ^ und E. Werle, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), 1531-1540).

Weitere Informationen über die an der Komplexbildung beteiligten Aminosäurereste wurden aus der Quervernetzung des Trypsin-BPTI-Komplexes mit Dimethyladipimat erhalten.

Die bisher bekanntgewordenen Ergebnisse besagen, daß der BPTI zur Affinitätschromatographie möglichst so immobilisiert werden sollte, daß das hemmaktive Zentrum mit dem Lysin 15-Rest für das proteolytische Enzym sterisch frei zugänglich sein sollte. Die Trägerfixierung von Pro-

15 teinen mit Lysinresten im aktiven Zentrum ist jedoch

ein generelles Problem der Proteinchemie, für das bisher noch keine befriedigende Lösung gefunden werden konnte.

Die erhaltenen Ergebnisse sind sinngemäß auf Proteine (Enzyme und Enzyminhibitoren) übertragbar, die einen 20 Lysinrest im sogenannten aktiven Zentrum aufweisen.

Die überwiegende Anzahl der bisher bekanntgewordenen Kupplungsmethoden für Proteine ist auf die Fixierung der Proteine über die Lysin-Seitenketten ausgerichtet. Zur Immobilisierung von Polypeptiden sind von den natürlicher in Proteinen, vorkommenden Aminosäuren außer den Lysinresten nich Cystein- und Tyrosin-Reste befähigt.

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/η

Der BPTI enthält jedoch keine Cysteinreste. Cysteinreste sind im BPTI-Molekül lediglich in oxydierter Form als drei Cystinbrücken vorhanden. Die drei Cystinbrücken können jedoch nicht vollständig ohne Aktivitätsverlust des BPTI. zu Cysteinresten reduziert werden. Andererseits führt die Immobilisierung von Proteinen über die Tyrosinreste bekanntermaßen nur zu einer sehr geringen gebundenen Proteinmenge. Beide alternativen Immobilisierungsmöglichkeiten kommen daher für den BPTI nicht in Betracht.

Bisher wurden zahlreiche Versuche unternommen, den BPTI kovalent an unlösliche Träger zu binden.

Der BPTI wurde nach D.A. Johnson und J. Travis, Anal. Biochem. 7_2 (1976), 573-576, G.J. Baugh und J. Travis,

Biochemistry _1_5 (1976}, 836-841, R. Geiger, W. Stuckstedte und H. Fritz, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 361 (1980), 1003-1016 sowie nach der DE-OS 2 363 201 an mit Bromcyan aktivierte hydroxylgruppenhaltige Träger kovalent gebunden und zur Affinitätschromatographie von proteolytischen Enzymen eingesetzt.

Ferner ist die kovalente Bindung des BPTI an Anhydridharze nach DE-OS 1 768 934 und H. Fritz, B. Brey, A. Schmal und E. WerIe, Hoppe-Seyler' s Z.. Physiol. Chem. 350 (1969), 617-625 sowie die kovalente Bindung des BPTI mittels wasserlöslicher Carbodiimide an Carboxylgruppen tragende Sepharose 4 B nach G. R. Geiger,

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-X-

R. Mann und T. Bettels, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, (1977), 479-483, 0. Ole-Moi Yoi, J. Spragg und K.F. Austen, J. Immunol. 121 (1978), 66-71, N.B. Oza und R. W. Ryan, Biochem. J. V7_l (1978), 285-288, N.B. Oza, V.M. Amin, R.K. McGregor, A.G. Scidi und D.A. Carretero, Biochem. Pharmacol. J25_, (1976) , 1607-1612, zum Zwecke der Affinitätschromatographie bekanntgeworden.

Von den vorher, genannten Kupplungsverfahren für den BPTI ist bekannt, daß die Lysinreste des BPTI mit dem aktivierten Träger zu einem kovalenten BPTI-Derivate reagieren. Diese BPTI-Träger besitzen nur eine geringe Kapazität für die proteolytischen Enzyme, da bevorzugt der Lysin 15-Rest des BPTI mit dem aktivierten Träger reagiert.

Ί5 Es wurden in Kenntnis dieses Problems auch Versuche unternommen, den Lysin 15-Rest des BPTI zu modifizieren sowie durch Komplexbildung mit einem proteolytischen Enzym während der Kupplung des BPTI an polymere aktivierte Träger selektiv zu schützen und damit eine kovalente Bindung des BPTI über andere Aminosäureseitenketten als den Lysin 15-Rest zu erreichen.

So modifizierten B. Kassell und R.B. Chow, Biochemistry 5_ (1966), 3449-3453, J. Chauvet und R. Acher, Biochem. Biophys. Res. Commun 27 (1967), 230-255, R. Haynes, D.T. Otsuga und R.E. Feeney, Biochemistry 1_ (1968) 2879-2885, G.Γ Means und R.E. Feeney, Chemical Modification of Proteins (1971), 93-95, Holden Day Inc.,

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/3

-X-

San Francisco, die Lysinwerte des BPTI, insbesondere den Lysin 15-Rest, durch Guanidierung mit 0- oder S-Methylisoharnstoff zu Homoarginlnresten. Der 15, 26, 41, 46-Tetrahomoarginin-BPTI besitzt die Hemmaktivität des BPTI.

Die kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach der Bromcyan- und Anhydrid-Methode kann jedoch nur noch über die oC-Aminogruppe des N-terminalen Arginin-Restes erfolgen. Die Kupplung des BPTI-Derivates über eine einzige kovalente Bindung an den polymeren Träger führt jedoch zu BPTI-Trägern vergleichsweise geringer Stabilität.

R. S. Temler und J. H. R. Kägi, Enzyme 22. (1977), 249-255, versuchten außerdem während der Kupplung des BPTI an 15 polymere Träger durch Komplexbildung des BPTI mit einem

proteolytischen Enzym den Lysin 15-Rest des BPTI selektiv zu schützen. Das genannte Verfahren ist jedoch technisch nicht durchführbar.

Die technisch besonders einfach durchführbare Adsorption von Proteinen mit anschließender Quervernetzung mittels bifunktioneller Reagenzien wurde für den BPTI bisher überhaupt nicht beschrieben.

Die Verwendung der Adsorptions-/Quervernetzungsme€hode ist technisch besonders geeignet· zur Herstellung von Biokatalysatoren.

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.. . 313554T

■7·-

Bekannt geworden ist bisher lediglich die Herstellung löslicher Polymere des BPTI und ihre Verwendung als Arzneimittel nach der DE-OS 2 258 495.

⁵ Die Quervernetzung von Proteinen mit bifunktionellen Reagenzien, wie z.B. Glutardialdehyd oder Glyoxal, erfolgt durch Reaktion mit den Lysinresten des Proteins (F. Wold, Methods in Enzymology JM_, 617 ff.).

Bei Verwendung des BPTI für diese Immobilisierungsmethode ist daher wiederum eine Inaktivierung des BPTI durch bevorzugte Reaktion des Lysin 15-Restes zu erwarten.

Es wurde gefunden, daß Derivate des BPTI, deren X. -Aminogruppen der Lysinreste, besonders des Lysin

^⁵ . 15-Restes, reversibel geschützt sind und die durch chemische Modifikation von Aminosäureresten neu eingeführte Amino- oder Hydroxylgruppen enthalten, nach kovalenter oder adsorptiver Bindung mit anschließender QuerVernetzung durch bifunktionelle Reagenzien,

20 BPTI-Träger zur Affinitätschromatographie von Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein ergeben, die den bisher beschriebenen BPTI-Trägern an Kapazität für das proteolytische Enzym überlegen sind.

Gegenstand der Erfindung sind daher Kallikrein-Trypsin-²^ Inhibitor-Derivate (BPTI-Derivate), die

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is-

a) an der terminalen Aminogruppe und/oder an einer, an mehreren oder an allen vier £-Aminogruppe(η) der Lysinreste reversible Aminoschutzgruppen aufweisen und

b) an den ß-Carboxylgruppen des Asparaginsäure, den /'-Carboxylgruppen der Glutaminsäure sowie an der Carboxylgruppe am terminalen Alanin-58 über eine Carbonamidbindung Reste der Formeln

^N- (CH,) -X- (CH-) -X-N'

und

-N-(CH₂) -X-(CH₂)_n-X-ÖH

tragen, in denen

(I)

(II) (III)

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/6

-X-

, CH₃ Wn

für -CH₀-; CH-(CH₉) -CH-.; -C- ; -NH ; -S- ;

■ 2 η

CH

O-	; -C- ;	-C-	-c-
	ι	I	1
	NH₂	NH₂	H
	. <r^H3
H	(CH₉)
ι	*ι d Il**
C-	; -C-
I	ι
OH	OH

-C- ; -C-SH SH

-C-

und

mit η = 0-

steht,

Wasserstoff, C₁-C₄-AIlCyI oder C -C -Aryl bedeutet

und

für Wasserstoff,

CH₃

C-

-C-

CH₃

-(GH₂I_n-NH₂ ; -C-

CH-

oder -C- steht.

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tr.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind erfindungsgemäße BPTI-Derivate adsorbiert an Kationenaustauscher oder kovalent über die Reste der Formeln I, II und III an unlösliche Träger gebunden sowie die erfindungsgemäßen BPTI-Derivate adsorbiert an Kationenaustauscher und quervernetzt.

Die technischen Vorteile der BPTI-Träger sind Verwendung von weniger BPTI, konzentrierte Elution des proteolytischen Enzyms vom BPTI-Träger und aufgrund der geringeren 10 immobilisierten BPTI-Menge geringe unspezifische Wechselwirkungen mit Proteinen.

Die neuen BPTI-Derivat-Träger können im Batch oder als Füllmaterial einer Säule zur Affinitätschromatographie von Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein eingesetzt werden. Im letzteren Fall kann das Verfahren automatisiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Art der Herstellung der neuen BPTI-Derivate. Bisher wurden BPTI-Derivate ausschließlich durch Reaktion des gelösten BPTI hergestellt. Werden die BPTI-Derivate durch mehrfache chemische Modifizierung hergestellt, so müssen zwischen jedem Reaktionsschritt die überschüssigen Reagenzien vom BPTI-Derivat abgetrennt werden. Wegen des sehr basischen Charakters und des niedrigen Molekulargewichtes des BPTI bereitet dieser

Vorgang durch Gelchromatographie oder Dialyse technische

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Schwierigkeiten. In jedem Falle muß die BPTI-Derivat-Lösung nach jedem Modifizierungsschritt wieder konzentriert werden.

Erfindungsgemäß lassen, sich BPTI-Derivate in technisch einfacher Weise nach Adsorption des BPTI an unlösliche Copolymerisate aus Styrol und Divinylbenzol nach der DE-OS 2 116 377 herstellen. Überraschenderweise kann der adsorbierte BPTI in gleicher Weise chemisch modifiziert werden wie der gelöste BPTI. Mit dem adsor-TO bierten BPTI können nacheinander Sequenzen von chemischen Modifizierungen durchgeführt werden, ohne daß nach jedem Modifizierungsschritt eine Isolierung des BPTI-Derivates erforderlich ist.

Das weiter unten näher beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von BPTI-Derivaten wird gegenüber der Reaktion in Lösung umso vorteilhafter, je mehr Modifizierungsschritte am BPTI-Molekül ausgeführt werden. Geeignete Träger für den BPTI sind die in der DE-OS 2 116 377 beschriebenen Copolymerisate sowie die als Amberlite XAD 2 bis 12 im Handel befindlichen Adsorptionsharze der Firma Röhm und Haas, Philadelphia, USA.

Die Modifizierungsreaktion am adsorbierten BPTI-Molekül ist in wäßriger Lösung bei pH-Werten von 2-12 durchzuführen. Bei Verwendung organischer Lösungsmittel zur BPTI-Derivatherstullung muß die Reaktionslösung durch Zusatz von Wasser oder wäßriger Salzlösung soweit ver-

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■Μ

dünnt werden, daß das BPTI-Derivat am Träger adsorbiert bleibt. Das fertige BPTI-Derivat bzw. BPTI-Derivat-Zwischenstufen können zur überprüfung der Reinheit mit Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol, Ethanol, Iso- -> propanol oder ähnlichen Lösungsmitteln, in salzfreier Form eluiert werden.

Zur Verwendung als Arzneimittel wurden bereits Derivate des BPTI u.a. durch Anfügen von Aminosäureestern an die Carboxylenden des BPTI hergestellt (US-PS 3 953 417, US-PS 3 992 529, DE-OS 2 748 295, DE-OS 2 619 246, DE-OS 2 654 124, DE-OS 2 748 294, DE-OS 2 806 953, DE-OS 2 806 954) . Diese BPTI-Derivate sind jedoch für das beschriebene Affinitätschromatographieverfahren nicht geeignet.

15 Der Reaktionsablauf zur erfindungsgemäßen Herstellung der aktiven, unlöslichen BPTI-Derivat-Trägerharze kann durch die folgenden Schemata verdeutlicht werden, wobei man davon ausgeht, daß der Lysin 15-Rest geschützt wird.

Adsorption der BPTI-Derivate an Kationenaustauscher mit anschließender Quervernetzung durch bifunktionelle Reagenzien

1. Einführung von (reversiblen) Aminoschutzgruppen in das BPTI-Molekül an der terminalen Aminogruppe und den vier Aminogruppen der Lysinreste,

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2. Einführung von Amino- und Hydroxylgruppen an den ß-Carboxylgruppen von Asparaginsäure, sowie den

^-Carboxylgruppen von Glutaminsäure und an den therminalen Alanin-58-Restl

5 3. Adsorption des geschützten BPTI-Derivates an Kationenaustauscher ,

4. Vernetzung des adsorbierten, geschützten BPTI-Derivates mit bifunktionellen Reagenzien,

5. Abspaltung der reversiblen Aminoschutzgruppen.

Kovalente Bindung der BPTI-Derivate an unlösliche Träger

1. Einführen von (Reversiblen) Aminoschutzgruppen in das BPTI-Molekül an der terminalen Aminogruppe und den vier Aminogruppen der Lysinreste

15 2. Einführen von Amino- und Hydroxylgruppen an den ß-Carboxylgruppen von Asparaginsäure und an den ft^-Carbonylgruppen von Glutarsäure und der Carboxylgruppe des terminalen Alanin-58-Restes,

3. kovalente Bindung der geschützten BPTI-Derivate über die neu in das BPTI-Molekül eingeführten Amino- und Hydroxylgruppen,

4. Abspaltung der revers len Aminoschutzgruppen.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch so durchgeführt werden, daß man einen Aminogruppen- oder Hydroxylgruppenhaltigen Träger umsetzt mit nucleophilen Diaminen oder Aminoalkoholen der in Anspruch 1 angegebenen Formeln, ^ den so modifizierten Träger mit BPTI, dessen terminale Aminogruppen und/oder =Äminogruppen der Lysin-Reste ganz oder teilweise durch Aminoschutzgruppen geschützt sind, über Carbonamidbindungen einknüpft und anschließend die Schutzgruppen abspaltet.

Eine dauerhafte Modifizierung der Lysinreste des BPTI zu Homoarginin-Resten wird durch Reaktion mit O-Methylisoharnstoff und S-Methylisothioharnstoff erreicht (R. Acher, J. Chauvet, R. Arnon und M. SeIa, Eur. J. Biochem. 3_ (1968), 476-482, B. Kassell et al. Biochemistry 5_ (1963), 3449-3453) erzielt.

Als reversible Schutzgruppen für Ci- und t -Aminogruppen können die aus der Peptidchemie bekannten, leicht abspaltbaren tert. Butyloxycarbonyl-, Carbobenzoxy-, N-Formyl-, N-Trifluorantyl- oder N-Phthalyl-Reste sowie Schiffsche Basen mit Dicarbony !verbindungen, wie z.B. Acetylaceton, Acetessigester und O-Hydroxybenzaldehyd, dienen (E. Dane und Mitarbeiter, Angewandte Chemie 21 (1962), 874, J. C. Sheehan und V. G. Grenda, J. Amer. Chem. Soc. 8£ (1962), 2417) und für Benzyldehyd

(M. Bergmann, H. Fusslin und L. Zervas. Ber. dtsch. chem. Ges. 53_ (1925), 1043). Die Abspaltung der genannten Schutzgruppen erfolgt in alkalischer wäßriger Lösung vorzugsweise in Gegenwart tert. A'-..ine.

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Durch Reaktion der Diamine mit bifunktionellen Reagenzien, wie z.B. mit Glutardialdehyd und nochmalige Umsetzung mit Diamin, können polyaminhaltige BPTI-Derivate hergestellt werden.

Die Umsetzung von BPTI mit Carbodiimiden und nucleophilen Aminoverb"indungen wird vorzugsweise bei pH-Werten zwischen 3 und 11, insbesondere zwischen pH 4 und pH 8 in wäßriger Lösung, die jedoch auch organische Lösungsmittel und/oder Salze und/oder Denaturierungsmittel enthalten kann, durchgeführt. Als gegebenenfalls zusetzbare organische Lösungsmittel seien vorzugsweise genannt: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Pyridin, Dimethylacetamid. Als Salze seien genannt: LiCl, NaCl und als Denaturie-

15 rungsmittel: Guanidin-Hydrochlorid, Harnstoff.

Als Carbodiimide können bei der erfindungsgemäßen Umsetzung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen eine Reihe von organischen Carbodiimiden eingesetzt werden, insbesondere folgende Carbodiimide haben sich als für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignet herausgestellt: Dicyclohexylcarbodiimid, N-Cyclohexyl-N'-/2-(4-morpholinyl)-ethy^-carbodiimidmetho-toluol^-sulfonat, N-Ethyl-N¹ O-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid, N-tert.-Butyl-N¹-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid, N-Cyclohexyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid, N-Isopropyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(3-dimethyl-

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aminopropyl)-carbodiimid-metho-toluol-4-sulfonat, N₇N'-Diisopropyl-carbodiimid, N,N'-Di-para-tolyl-carbodiimid.

Die erfindungsgemäße Umsetzung erfolgt bevorzugt bei Temperaturen zwischen -20° und +50⁰C, insbesondere 0⁰C und 30⁰C.

Pro Mol BPTI bzw. BPTI-Derivat werden 10-100 ml Mol vorzugsweise 10 bis 25 Mol, der nucleophilen Aminoverbindung eingesetzt. Bezogen auf die nucleophile Aminoverbindung wird das verwendete Carbodiimid im Unterschuß eingesetzt.

Der Zusatz von 1-Hydroxy-benzotriazol (W. König und R. Geiger, Chem. Berichte, 103 (1970) , 788-798) oder N-Hydroxysuccinimid erhöht die Ausbeute an BPTI-Polyamid, durch Verhinderung der Bildung von N-Acylharnstoffen.

Es bestehen aber auch Möglichkeiten zur Aktivierung der 5 Carboxylgruppen von Boc-BPTI ohne Verwendung von Carbodiimiden (S.R.B. Woodward, R.A. Olofson und H. Meyer, Journal of Amer. Chemical Society, 83, (1961) 1010 ff.). Die Aktivierung der 5 Carboxylgruppen kann auch über ein gemischtes Kohlensäureanhydrid mit N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-i,2-Dihydrochinolin nach B. Belleau und G. Malick, Journal of American Chemical Society, 9_0 (1968) , 1651 oder mit Chlorkohlensäureethylester erfolgen.

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Bei den Umsetzungen resultierende Gemische können gegebenenfalls nach an sich bekannten Verfahren, z.B< durch Elektrophorese, Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie fraktioniert werden.

'5 Als Träger für die kovalente Bindung der BPTI-Derivate

kommen Hydroxyl- und Aminogruppen-haltige polymere

Träger, wie z.B. Sepharose , Sephadex der Firma

Pharmacia Fine Chemicals, sowie Cellulose und deren Derivate in Frage. Die Aktivierung der polymeren Träger erfolgt nach Literatur-bekannten Verfahren.

Für die Adsorption der sauren BPTI-Derivate kommen

Diaminoethyl-Gruppen-tragende hydroxylhaltige PoIy-

(R) mere, wie z.B. DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex ,

DEAE-Sephacel^l ' und DEAE-Sepharose^v ' mit anschließender Quervernetzung durch Glutardialdehyd in Betracht.

Für die Adsorption der basischen BPTI-Derivate kommen

Carboxymethyl-Gruppen-tragende hydroxylhaltige PoIy-

(R)

mere, wie z.B. CM-Cellulose, CM-Sephadex^v ' und CM-(R)

Sepharose , mit anschließender Quervernetzung durch Glutardialdehyd in Betracht. Die zur Isolierung von Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein benötigten Organextrakte werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt.

Das zerkleinerte Organ, z.B. Pankreas vom Schwein für die Gewinnung von Trypsin und Kallikrein sowie Pankreas

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vom Rind für die Gewinnung von Chymotrypsin, wird mit organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Trichlorethylen, entfettet. Die wäßrige Phase wird zur Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin auf einen pH-Wert von 1-2 angesäuert. Ausgefallenes Protein wird abgesaugt oder abzentrifugiert. Vor dem Auftrag des Organextraktes auf den BPTI-Derivat-Träger wird Trypsinogen bei einem pH-Wert von 7-8 zu Trypsin aktiviert.

Zur Affinitätschromatographie von Trypsin wird der Organextrakt mit dem BPTI-Derivat-Träger bei pH-Werten von 5-8 in Kontakt gebracht. Fremdproteine werden bei gleichen pH-Werten aus dem BPTI-Derivat-Träger ausgewaschen und Trypsin bei pH-Werten von 1-2, z.B. mit 0,1 N HCl, in reiner Form von BPTI-Derivat-Träger eluiert.

Zur Gewinnung von reinem Chymotrypsin werden in gleicher Weise wie oben beschrieben Trypsin-freie Organextrakte eingesetzt. Das Enzym Kallikrein kann ausschließlich aus Schweinepankreas gewonnen werden.

Der Organextrakt wird wie folgt hergestellt:

3,5 kg tiefgefrorener Schweinepankreas wird in einem Fleischwolf zerkleinert. Zu dem Organbrei werden 7 Ltr. Leitungswasser zugefügt und der pH-Wert mit Essigsäure auf pH 4,8 eingestellt. Zur Entfettung werden 3,5 Ltr. =5 kg Trichlorethylen zugegeben und eine Stunde bei 25⁰C gerührt. Es werden 1 kg Filterhilfs-

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mittel zugefügt und die Suspension 15 Minuten gerührt. Das Bindegewebe wird abgeschöpft und Reste über eine mit Kieselgur belegte Filterpresse entfernt. Die Trichlorethylen enthaltende untere Schicht wird abgetrennt, die wäßrige Phase mit 0,2 kg Kieselgur versetzt und die Lösung über Seitz AS-Filterplatten klarfiltriert. Die Organrohlösung enthält neben Kallikrein große Mengen an Trypsin und Chymotrypsin, die vor dem Auftrag auf eine BPTI-Derivat-Säule über DEAE-Cellulose entfernt werden müssen. Wie aus der Literatur bekannt, sind die Dissoziationskonstanten des Trypsin-BPTI-Komplexes kleiner als die des Kallikrein-BPTI-Komplexes, d.h. die Affinität von Trypsin zu BPTI ist größer als die von Kallikrein zu BPTI (M. Lazdunski,

15 J.P. Vincent. H. Schweitz, M. Perron-Renner und J. Pudles, Proteinase-Inhibitors, Bayer-Symposium V. (1974) 420-431)

Vorreinigung des Organextraktes über DEAE-Cellulose zur Abtrennung von Trypsin- und Chymotrypsin-Aktivi-20 tat:

10 Ltr. Organextrakt werden durch Zugabe von entsalztem Wasser auf eine Leitfähigkeit 4mS χ cm verdünnt und der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Es werden 45 g vorgequollene DEAE-Cellulose (Cl-Form) zugefügt, 60 Minuten gerührt und abgefiltert oder abgeschleudert. Ablösen mit je 3 x-1 Ltr. 0,05 M Phosphatpuffer pH 5,0 + 0,5 M NaCl 60 Min. Rühren bei

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Raumtemperatur und Filtration über Seitz AS-Filter. Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.

Der vorgereinigte Kallikrein-Extrakt wird bei einem pH-Wert von 6-8 mit dem BPTI-Derivat-Träger in Kontakt gebracht. Fremdproteine werden bei gleichem pH-Wert aus dem BPTI-Derivat-Träger ausgewaschen.

Reines Kallikrein wird bei pH-Werten von 5-4,5 vom BPTI-Derivat-Träger eluiert und sofort mit Ammoniak auf pH 6,0-6,5 eingestellt.

Le A 21 150

I. Beispiele zur Herstellung der BPTI-Derivate Beispiel 1

Herstellung vo inaktivem (1-arg-, 15, 26, 41, 46-Lys)-Penta-Boc-BPTI

6,51 g lyophilisierter BPTI (1 m Mol, 41,96 χ 10⁶ KIE (Kallikrein-Inhibitor-Einheiten) werden in 45 ml Dioxan-Wasser (2:1 volumetrisch) gelöst und unter Eiskühlung mit 10 ml 1 N NaOH und 1,2g Di-tert. butyldicarbonat (5 m Mol) versetzt. Die Lösung wird 30 Minuten bei -JO Raumtemperatur gerührt und mit Dioxan-Wasser (2:1) auf 200 ml aufgefüllt.

Restaktivität = 0,441 χ 10 KIE = 1,05 % der Ausgangsaktivität.

Herstellung von inaktivem (1-arg-, 15, 26, 41, 46-Lys) Penta-boc-BPTI (3,50-ß-Asp-1,6-diaminohexan, 7,49- -glu-1,6-diaminohexan-58-Ala-1,6-diaminohexan-)BPTI

100 ml der obigen Lösung werden mit 1,16 g Hexamethylendiamin (10 m Mol, eingestellt mit HCl auf pH 4,5) und 2,4 g EDC (12,5 m Mol) 24 Std. bei Raumtemperatur und pH 4,5 gerührt.

Isolierung:

Methode A: Adsorption des BPTI-Derivates aus der wäßrigen

Le A 21 150

Lösung an 1,5 Liter Lewapol Ca 9255, Elution des BPTI-Derivates von dem Adsorptionsharz mit 2 Litern Methanol, Einengen der methanolischen Lösung am Rotationsverdampfer mit anschließender Gefriertrocknung. Ausbeute = 3,049 g S 93,5 %.

Methode B: Die obige Lösung wird gefriergetrocknet, der Rückstand in 50 ml 50 %iger Essigsäure gelöst, und auf einer Sephodex G10 Säule (H = 90 cm, D =2,5 cm) bei einem Durchfluß von 60 ml/h chromatographiert. Die Fraktionen 19-24 = 60 ml werden gefriergetrocknet.

Herstellung von 3,50-ß-Asp-1,6-diaminohexan-7,49~ -glu-1,6-diaminohexan-58-Ala-1,6-diaminohexan-BPTI

Der Lyophilisierte Rückstand wird in 50 ml wasserfreier Trifluoressigsäure zur Abspaltung der Boc-15 Gruppe gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Abdestillieren der Trifluoressigsäure wird der Rückstand in 25 ml 50 %iger Essigsäure aufgenommen und auf einer Sephadex G 50 coarse-Säule (H = 70 cm, D = 2,5 cm) bei einem Durchfluß von 75 ml/h chromatographiert. Das Eluat wird fraktioniert aufgefangen und nach der Transmission bei 280 mm in 2 Fraktionen aufgeteilt, mit NH₃ neutralisiert und gefriergetrocknet.

Le A 21 150

» · ·'· V W tr * Ww ^,

SO

Abkürzungen: BoC-Rest. = ^--ter.-Butyloxycarbonyl-Rest

EDC = N-Ethyl-N W3-dimethylaminopropyl)

BPTI = Kallikrein-Trypsin-Inhibitor

Polymeranteil: Fraktionen 15-22 = 71 ml = 0,86 g Lyopulver = (26,4 % vom Einsatz) Monomeranteil: Fraktionen 23-35 = 130 ml = 2,36 g Lyopulver = (72,5 % vom Einsatz) Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 2

Herstellung von (3,50-ß-Asp-2,4.6-Triaminopyrimidin-7,49 glu-2,4,6-triaminopyrimidin-58-Ala-2,4,6-triaminopyridin)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil = 0,75 g = 23,3 % vom Einsatz Monomeranteil = 1,59 g = 49,0 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 3

Herstellung von (3_/50-ß-Asp-2,6-diaminotoluol-.7,49-» glu-2,6-diaiainotoluol-58-Ala-2 _r6-diaminQtoluol) -BPTI

Le A 21 150

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil =0,18 g =5,4 % vom Einsatz Monomeranteil = 3,26 g = 100 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1 .

Beispiel 4

Herstellung von (3,50-ß-Asp-3,3'-diaminobenzidin-, 7, 49- V-glu-3,3'-diaminobenzidin-SS-Ala-S,3'-diaminobenzidin-) BPTI

Herstellung nach Beispiel 1, Pol-ymeranteil = 1,02 g = 33,3 % vom Einsatz Monomeranteil = 1,72 g = 52,5 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 5

Herstellung von (3,50-ß-Asp-i,IO-diaminodecan-7, 49-ο glu-1,1O-diaminodecan-58-Ala-i,1O-diaminodecan)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil = 0,40 g = 12,3 % vom Einsatz Monomeranteil = 11,0 g = 33,8 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Le A 21.

O I 000£f I

Beispiel 6

Herstellung von (3,50-ß-Asp-2 ,3-diaminopyridin~7, 49-^- glu-2,3-diaminopyridin-SS-Ala^ ,3-diaminopyridin)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil =0,52g=16% vom Einsatz Monomeranteil - 1,24 g = 38 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 7

TO Herstellung von (3/50-ß-Äsp-1 ^-diaminoethyl-?^- |^ν-glu-1_r2-diaminoethyl-58-Ala-1,2-diaminoethyl)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil: 0,92 g = 28,3 % vom Einsatz Monomeranteil: 2,43 g = 74,6 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 8

Herstellung von (3 ,50-ß-Asp-1 ,2-aminoethanol-7 ,49-glu-1,2-aminoethanol-58-Ala-1,2-aminoethanol)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil: 0,31 g = 9,5% vom Einsatz Monomeranteil: 1,34 g = 41,2 % vom Einsatz

Le A 21 150

Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 9

Herstellung von (3,50-ß-Asp-1,4-diaminobutan-7,49-ί glu-1^-diaminobutan-Se-Ala-i,4-diaminobutan)-BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil: 0,33 g = 10,1 % vom Einsatz Monomeranteil: 1,09 g = 33,5 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1 .

Beispiel

Herstellung von (3,50-ß-Asp-tetraethylenpentamin-7,49-

% -glu-tetraethylenpentamin-58-Ala-tetraethylenpentamin) BPTI

Herstellung nach Beispiel Polymeranteil: 0,14 g = 4,3 % vom Einsatz Monomeranteil: 1,33g= 41 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel·

Herstellung von (3,50-ß-Asp-trimethyIhexamethylen-diamin-. ,49 Y-glu-trimethylhexamethylendiamin-58-Ala-trimethylhexamethylendiamin-BPTI

Le A 21.

O I 0-0-3

Herstellung nach Beispiel 1. . Polymeranteil:0,10g= 3,1% vom Einsatz Monomeranteil: 0,86 g = 26,4 % vom Einsatz Charakterisierung des monomeren BPTI-Derivates in Tabelle 1.

Beispiel 12

Herstellung von (15,26,41,46-homoarginin, 3,50-ß-Asp-1,4-diaminobutan, 7,49-1,4-diaminobutan-58-Ala-1,4-diaminobutan)-BPTI

BPTI wird nach der Vorschrift von B. Kassell und R. B. Chow, Biochemistry 5^ (1960), 3441-3453, J. Chavet und R. Acher, Arch. Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1967) , 230-235, guanidiert.

Die umsetzung des guanidierten BPTI mit 1,4-Diamino-'5 butan in Gegenwart von EDC erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben.

II. Bindung der BPTI-Derivate an polymere Trägermaterialien Beispiel 13

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 1 20 an mit Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose 4 B

200 ml gequollene Sepharose 4 B¹ ' oder Sepharose Cl 6 B

Le A 21 150

(Pharmacia AB, üppsalla, Schweden) werden über eine Fritte abgesaugt, in 160 ml 1 N NaOH suspendiert und 2 Stunden mit 20 ml Epichlorhydrin bei genau + 6 0⁰C aktiviert. Die aktivierte Sepharose wird abgesaugt, auf

der Fritte 2 mal mit je 1 Liter Wasser gewaschen, in 200 ml 0,1 N NaOH suspendiert und 1,45 g lyophilisierter, inaktiver (1-arg-15,26,41-46-Lys)-penta-boc-(3,50-ß-Asp-1,6-diaminohexan-7,49-/f-glu-1,6-diaminohexan-58-Ala-1,6-diaminohexan)-BPTI zugefügt. Die Suspension wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt über eine Fritte filtriert; der Rückstand wird 2 mal mit je 1 Liter Wasser, 2x1 Liter 10 %iger NaCl-Lösung und wieder mit 2x1 Liter Wasser gewaschen.

Die BPTI-Sepharose 4 B wird über Nacht zur Abspaltung

der Boc-Schutzgruppe bei Raumtemperatur in 0,1 N HCl gerührt .

Eingesetzte BPTI-Derivat-Aktivität: 5,39 χ 10⁶ KIE-analoge Einheiten.
Aktivität im Filtri
(nach Einstellung auf pH < 1 mit HCl)

Aktivität der (3,50-ß-Asp-1,6-diaminohexan, 7,49-J^- glu-1,6-diaminohexan-58-Ala-1,6-diaminohexan)-BPTI-Sepharose 4 B =3,27 χ 10 KIE-analoge Einheiten/ 200 ml BPTI-Derivat-Sepharose 4 B.

Alternativ zum lyophilisierten BPTI-Derivat kann a'^ir-h

20 Aktivität im Filtrat = 2,12 χ 10⁶ KIE-analoge Einheiten

Le A 21 150

die nach Beispiel 1 hergestellte BPTI-Derivat-Lösung ohne Isolierung des BPTI-Derivates in lyophilisierter Form zur Bindung an die aktivierte Sepharose 4 B. eingesetzt werden.

Beispiel 14

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 2 an mit Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose 4 B

Die Ausführung der Bindung des BPTI-Derivates erfolgt analog Beispiel 13.

Beispiel T5

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 5 an mit Epichlorhydrin-aktivierte Sepharose 4 B

Die Ausführung der Bindung des BPTI-Derivates erfolgt analog Beispiel 13.

Beispiel 16

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 7 an mit Epichlorhydrin-akt!vierter Sepharose 4 B

Die Ausführung der Bindung des BPTI-Derivates erfolgt analog Beispiel 15.

Le A 21 150

Einsatz BPTI-Derivat = 5,66 χ 10 KIE-analoge Einheiten. Aktivität in Filtrat = 2,4 5 χ 10 KIE-analoge Einheiten (nach Einstellung auf pH -^1 mit HCl).

Aktivität der (3,50-ß-Asp-1,2-diaminoethan-, 7,49- glu-1,2-diaminoethan-58-Ala-1,2-diaminoethan-)-BPTI- Sepharose 4 B = 3,21 χ 10 KIE-analoge Einheiten/200 m. BPTI-Derivat-Sepharose 4 B.

Beispiel 17

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 8 an mit Epichlorhydrin-aktivierter Sepharose 4 B

Die Ausführung der Bindung des BPTI-Derivates erfolgt analog Beispiel 13.

Beispiel 18

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 1 an mit Cyanurchlorid-aktiverter Sepharose 4 B

(R)

200 ml sedimentierte Sepharose 4 B ^v ' wird 60 Minuten in einer Mischung aus 100 ml destilliertem Wasser und 200 ml Dioxan bei pH 5,0 - 7,0 mit 10 g Cyanurchlorid

(R)

aktiviert. Die aktivierte Sepharose 4 B wird abgesaugt, auf der Nutsche mit Dioxan und destilliertem Wasser gewaschen und als Suspension bei pH 7,0 - 8,0 unter ^usat von 1,5 g 3PTI-Derivat nach Beispiel 1 16 Stunden bei Raumtemperatur gekuppelt. Der fertige

Le A 21 150

TJ b b 4

BPTI-Derivat—Träger wird abgesaugt, auf der Nutsche mehrfach mit destilliertem Wasser, 10 %iger NaCl-Lösung und wieder Wasser gewaschen.
Das Filtrat enthält 1,67 χ 10 KIE-analoge-Einheiten.

5 Beispiel 19

Adsorptive Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 1 an CM-Sepharose Cl 6 B mit anschließender Quervernetzung durch Glutardialdehyd

(R)
200 ml CM-Sepharose Cl 6 B (Pharmacia AB, Uppsala/ Schweden) Na⁺-Form werden zusammen mit 1,45 g lyophilisiertem, inaktivem (1-arg-,15,26,41,46-lys) penta-boc-

Die Ausführung der Bindung des BPTI-Derivates erfolgt analog Beispiel 13.

Beispiel 18

Kovalente Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 1 15 an mit Cyanurchlorid-aktiverter Sepharose 4 B

ml sedimentierte Sepharose 4 B ' wird 60 Minuten in einer Mischung aus 100 ml destilliertem Wasser und ml Dioxan bei pH 5,0 - 7,0 mit 10 g Cyanurchlorid aktiviert. Die aktivierte.Sepharose 4 B * wird abgesaugt, auf der Nutsche mit Dioxan und destilliertem Wasser gewaschen und als Suspension bei pH 7,0 - 8,0 unter ^usat von 1,5 g 3PTI-Derivat nach Beispiel 1 Stunden bei Raumtemperatur gekuppelt. Der fertige

Le A 21 150

Aktivität in Filtrat: < 12.500 KIE-analoge Einheiten = 0,2 % (nach Einstellung auf pH -< 1 mit HCl).

Beispiel 20 '

Adsorptive Bindung des BPTI-Derivates nach Beispiel 7 ^ an CM-Sepharose CL 6 B mit anschließender Quervernetzung durch Glutardialdehyd

Die Adsorption und Quervernetzung des BPTI-Derivates erfolgt wie in Beispiel 21 angegeben.

Eingesetzt werden 1,45 g lyophilisierter, inaktiver (1-arg-,15,26,41,46-Lys) penta-boc- (3,50-ß-Asp-i,2-diaminoethyl-7,49-.V-glu-1 ,2-diaminoethyl-58-Ala-1 ,2-diaminoethyl)-BPTI, der wie in Beispiel 19 quantitativ an CM-Sepharose CL 6 B gebunden wird.

Aktivität im Filtrat: <12.500 KIE-analoge Einheiten (nach Einstellung auf pH < 1 mit HCl).

III. Einsatz der BPTI-Derivat-Träger zur Gewinnung der reinen proteolytischen Enzyme Chymotrypsin, Kallikrein und Trypsin nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie

Beispiel 21

Gewinnung von Chymotrypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 13

Le A 21 150

J I J O O

to

180 ml BPTI-Derivat-Sepharose 4 B, hergestellt nach Beispiel 15, werden in 0,1 M Natriumacetatpuffer + 0,6 M NaCl + 0,05 M CaCl₂ pH 5,0 suspendiert und in eine Säule mit den Abmessungen Höhe = 6,2 cm, Breite = 6,1 cm eingefüllt.

1 g partiell gereinigtes Chymotrypsin aus Rinderpankreas (155 ATEE Einheiten/g) wird in 40 ml des vorher genannten Puffers gelöst und mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/ Std. auf die BPTI-Derivat-Sepharose 4 B-Säule aufge-0 tragen.

Nicht adsorbierte Verunreinigungen werden mit 0,1 M Natriumacetatpuffer + 0,6 M NaCl + 0,05 M CaCl pH 5,0 vom Säulenmaterial eluiert, bis die Extinktion bei 280 nm den Ausgangswert erreicht hat.

Reines Chymotrypsin wird von der BPTI-Derivat-Sepharose 4 B-Säule mit 0,1 N HCl eluiert und kann nach Dialyse gegen destilliertes Wasser als lyophilisiertes Protein erhalten werden.

Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle 2 20 wieder.

Beispiel 22

Gewinnung von Chymotrypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 16

Le A 21 150

Ψι

Die Durchführung erfolgt analog Beispiel 21. Das Ergebnis der KapaζitötsbeStimmung gibt Tabelle 2 wieder.

Beispiel 23

Gewinnung von Kallikrein mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 13

3 g partiell gereinigtes Trypsin-freies Kallikrein aus Schweinepankreas (32,4 Kallikrein (KE)-Einheiten/mg) werden in 210 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/Stunde auf die BPTI-Derivat-Säule aufgetragen (Höhe =4,5 cm, Durchmesser = 3,8 cm). Verunreinigungen werden mit 0,05 M Phosphatpuffer + 0,5 M NaCl pH 7,0 und 0,2 M Natriumacetat pH 6,0 solange ausgewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm wieden den Ausgangswert erreicht.

²⁵ Kallikrein-Aktivität wird von der BPTI-Derivat-Sepharose

4 B-Säule mit 0,3 M Natriumacetatpuffer pH 4,4 eluiert und sofort mit konzentrierter Ammoniak-Lösung auf pH 6,0 eingestellt. Durch Dialyse und Gefriertrocknung kann reines Kallikrein gewonnen werden. Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle 2 wieder.

Beispiel 24

Gewinnung von Kallikrein mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 14

Le A 21 150

Die Aufarbeitung von partiell gereinigtem Kallikrein zu Rein-Kallikrein erfolgt wie im Beispiel 23 angegeben. Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle 2 wieder.

5 Beispiel 25

Gewinnung von Kallikrein mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 15

Die Aufarbeitung von partiell gereinigtem Kallikrein" zu Rein-Kallikrein erfolgt wie im Beispiel 23 angegeben. Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle 2 wieder.

Beispiel 26

Gewinnung von Kallikrein mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 16

Beispiel 27

Gewinnung von Kallikrein mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 17

Le A 21 150

Beispiel 28

Gewinnung von Trypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 15

172 ml BPTI-Derivat-Sepharose 4 B nach Beispiel 15 werden in 0,1 M Natriumacetatpuffer + 0,6 M NaCl + 0,05 M CaCl₂ pH 5,0 suspendiert und in eine Säule mit den Abmessungen Höhe = '5,7 cm und Durchmesser = 6,2 cm gefüllt.

2,5 g partiell gereinigtes Trypsin aus Schweinepankreas (20 FIP-Einheiten/mg) werden in ca. 50 ml des obengenannten Puffers gelöst mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/Std. auf die BPTI-Derivat-Sepharose 4 B-Säule aufgetragen. Verunreinigungen werden mit 0,1 M Natriumacetatpuffer + 0,6 M NaCl + 0,05 M CaCl₂ pH 5,0 solange ausgewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm wieder den Ausgangswert erreicht hat.

Trypsin-Aktivität wird von der BPTI-Derivat-Sepharose 4 B-Säule mit 0,1 N HCl eluiert.

Durch Dialyse und Gefriertrocknung kann reines Trypsin gewonnen werden.

Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle 2 wieder.

Le A 21 150

ό Ί ό b b 4 "I

Beispiel 29

Gewinnung von Trypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 14

Die Aufarbeitung von partiell gereinigtem Trypsin zu -* reinem Trypsin erfolgt nach Beispiel Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle wieder.

Beispiel 30

Gewinnung von Trypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 15

Die Aufarbeitung von partiell gereinigtem Trypsin zu reinem Trypsin erfolgt nach Beispiel Das Ergebnis der Kapazitätsbestimmung gibt Tabelle wieder.

Beispiel 31

Gewinnung von Trypsin mit BPTI-Derivat-Sepharose nach Beispiel 16

Le A 21 150

HS

Beispiel 32

Gewinnung von Trypsin mit BPTI-.Derivat-Sepharose nach Beispiel 17

Le A 21 150

Tabelle 1 Basische BPTI-Derivate nach Beispielen 1-11

ΒΡΠ-Derivat Kövalent an die GOOH-Gruppen /of/ nach Beispiel des BPTI gekuppelte polyamine

10

11

BPTI

1,6-Diaminohexan

2,4,6-Triaminopyrimidin

2,6-Diaminotoluol

3,3'-Diamincbenzidin

1,10-Diaminodecan

2,3-Diaminopyridin

1,2-Diaminoethan

2-Äminoethanol

1,4-Diaminobutan

Tetxaethylenpentamin

Tr imethy !hexamethylendiamin

-71,4°

-87°

-89,8°

-59,8°

-91,4°

-74,8°

-96,4°

-87,6°

-93,2°

-95,8°

-78,2°

-121°

3720 3921 2298 0,46 % 1,9-1,5

3578 3375 839 0,17 % 2,1-1,5

3258 2013 1758 0,26 % 1,7-1,1

2611 2407 2049 0,74 % 1,7-1,0

3974 4719 3771 0,10 % 1,8-1,0

3618 4266 2751 0,25 % 2,0-1,6

3904 2736 3150 0,65 % 2,0-1,6

4111 3936 2397 0,16 % 1,9-1,5

4083 4458 3087 0,02 % 1,8-1,3

4899 3047 3306 0,28 % 1,9-1,4

3385 3741 3093 0_#57 % 1,7-1,0

ca. ca. ca. - 1,0
6400 6400 6400

ti-

wr it c=T in H₂O

1. Trypsin-Hemmung in KIE-analogen Einheiten/mg

2. Chymotrypsin-Hemmung in KIE-analogen Einheiten/mg

3. Kallikrein-Hemmung in KIE-analogen Einheiten/mg

4. Nitratasche

5. Elektrophoretische Beweglichkeit in der Cellogelelektrophorese in Pyridinacetatpuffer pH 6,05 bezogen auf BPTI =1,0

Le A 21 150

£· Tabelle 2

Beladung von verschiedenen BPTI-Derivat-Sepharosen 4 B mit Chymotrypsin-, Trypsin- und Kallikreinlösungen

Beispiel ΒΡΠ-Derivat-Sepharose 4 B nach Beispiel

Kapazität für reines Chymotrypsin bzw. Kallikrein bzw. Trypsin

a) Chymotrypsin

1,6-Diaminohexan (Beispiel 13)

1,2-Diaminoethan (Beispiel 16) BPTI (Vergleich)

514.000 ATEE-Einh./Ltr. ΒΡΠ-Derivat-Sepharose 4B

360.160 " "

b) Kallikrein

1,6-Diaminohexan (Beispiel 13)

1,32 χ 10 Kallikrein-Einh./Ltr. BPTI-Derivat-

Sepharose 4B

24	2,4,6-Tr iaininopyrimidin (Beispiel 14)	1,36	X	10"	Il	Il
25	1,10-Diamonodecan (Beispiel 15)	1,30	X	10⁶	Il	Il
26	1,2-Diaminoethan (Beispiel 16)	0,68	X	10⁶	Il	Il
27	2-Aminoethanol (Beispiel 17)	1,49	χ	10⁶	Il	Il
	BPTI (Vergleich)	0,37	X	10⁶	Il	Il

«4(1

H «

• 1 *

Tabelle 2 (Fortsetzung)

^ Beispiel

c) Trypsin 28 29

30 31 32

BPTI-Derivat-Sepharose 4 B nach Beispiel

Kapazität für reines Chymotrypsin bzw. Kallikrein bzw. Trypsin

1,6-Diaminohexan (Beispiel 13)

2,4,6-Triaininopyrimidin (Beispiel 14)

1,10-Diaininodecan (Beispiel 15) 1,2-Diaminoethan (Beispiel 16) 2-Aminoethanol (Beispiel 17) BPTI (Vergleich)

452.900 FIP-Einh./Ltr. BPTI-Derivat-Sepharose 4B 311.770

310.000 "

234.000 " "

282.000 " " 95.500^"

Claims

Patentansprüche

M./ Kallikrein-Trypsin-Inhib-itor-Derivate (BPTI-Derivate) , ^S dadurch gekennzeichnet, daß sie

a) an der terminalen Aminogruppe und/oder an

einer, an mehreren oder an allen vier έ -Amino

gruppe (n) der Lysinreste reversible Aminoschutzgruppen aufweisen und

b) an den ß-Carboxylgruppen des Asparaginsäure,

den Y-Carboxylgruppen der Glutamiersäure sowie an der Carboxylgruppe am terminalen Alanin-58

über eine Carbonamidbindung Reste der Formeln

R¹ R² ■%_

-N-(CH₂J_n-X-(CH₂J_n-X-N (I)

und

-N-(CH₂) -X-(CH₂J_n-X-OH (II)

-NH

NH

(III)

tragen, in denen

Le A 21 150

CH₃

für -CH₀-; CH-(CH₀) _n -CH₀; -C-

(CH,) , 2 η

H (CH ι ί ι O- ; -C- I ι NH₂ NH H (CH,) ι C- ; -C- ι I OH OH

und

C-SH

—Γ¹— ·

(CH₂) -C-SH

-Q-

mit η = 0-

steht,

Wasserstoff, C₁-C₄-Al]CyI oder C -C -Aryl bedeutet

und

für Wasserstoff, -

-C-

⁽?^H2»n

-C-

CH

oder -C- steht.

Le A 21 150

2. BPTI-Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die terminale Aminogruppe und die i -Aminogruppe der Lysinreste durch tert.-Butyloxycarbonyl'-, Carbobenzoxy-, N-Formyl-, N-Trifluoracetyl-, N-Phthalyl-

reste oder Schiff'sehen Basen von Tricarbonylverbindungen geschützt sind.
3. BPTI-Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lysinreste durch Reaktion mit O-Methylisoharnstoff oder S-Methylisothioharnstoff

modifiziert sind.
4. BPTI-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 3, in denen der Lysin-15 Rest durch reversible Aminoschutzgruppen geschützt ist.
5. BPTI-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 4, adsorbiert an Kationenaustauscher oder kovalent über

die Reste der Formeln I, II und III an unlösliche Träger gebunden.
6. BPTI-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 4, adsorbiert an Kationenaustauscher und quervernetzt.

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7. BPTI-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 4, kovalent über die Reste der Formeln I, II und III an

(R)

Sepharose .* der Firma Pharmacia Fine Chemicals, üpsala, Schweden oder an Cellulose oder deren
Derivate gebunden.

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8. Aminoschutzgruppenfreie BPTI-Derivate nach den Ansprüchen 5 bis 7.

9. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen BPTI-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die terminale Aminogruppe und/oder eine,

mehrere oder alle fc.-Aminogruppe(n) der Lysinreste durch Aminoschutzgruppen schützt,

b) die ß-Carboxylgruppen der Asparaginsäure, die

$ -Carboxylgruppen der Glutaminsäure sowie die ^ Carboxylgruppe am terminalen Alanin-58-Rest

mit nucleophilen Diaminen oder Aminoalkoholen umsetzt,

c) die Reaktionsprodukte an Reaktionenaustauscher adsorbiert und gegebenenfalls mit bifunktionellen Verbindungen quervernetzt oder die Reaktions

produkte über die nucleophilen Triaminreste oder Aminoalkoholreste kovalent an Träger bindet und _t

d) die reversiblen Aminoschutzreste abspaltet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Carboxygruppen der Asparaginsäure, die i) -Carboxylgruppe am terminalen Alanin-58-Rest mit nucleophilen Diaminen in Gegenwart von Carbodiimiden umsetzt.

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1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen BPTI-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Aminogruppen- oder Hydroxygruppen-haltigen Träger umsetzt mit nucleophilen Diaminen oder Aminoalkoholen der in Anspruch 1 angegebenen Formeln, den so modifizierten Träger mit BPTI, dessen terminale Aminogruppen und/oder <£ -Aminogruppen der Lysin-Reste ganz oder teilweise durch Äminoschutzgruppen geschützt sind, über Carbonamidbindungen verknüpft und anschließend die Schutzgruppen abspaltet.

12. Verwendung von aminoschutzgruppenfreien, trägeradsorbierten oder trägergebundenen BPTI-Derivaten nach Anspruch 1 zur äffinitätschromatographischen Reinigung der Enzyme Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein.

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