FR2512445A1 - Derives de l'inhibiteur de kallicreine et de trypsine (bpti), derives de bpti lies a un support, leur preparation et leur utilisation pour la preparation des enzymes trypsine, chymotrypsine et kallicreine a l'etat pur - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A TRAIT AU DOMAINE DE LA CHIMIE DES ENZYMES. ELLE CONCERNE DES DERIVES DE L'INHIBITEUR DE KALLICREINE ET TRYPSINE (BASIC PANCREATIC TRYPSIN INHIBITORBPTI DE KUNITZ), NOTAMMENT DES DERIVES DE BPTI LIES A UN SUPPORT ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION. APPLICATION A LA PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE PAR AFFINITE DES ENZYMES TRYPSINE, CHYMOTRYPSINE ET KALLICREINE.

Description

La présente invention concerne des dérivés de l'inhibiteur de kallicréine-trypsine (basic pancreatic trypsin inhibitor/BPTI de Kunitz), des dérivés de BPTI liés à un support, leur préparation et leur utilisation pour la purification par chromatographie par affinité des enzymes trypsine, chymotrypsine et kallicréine.

Les enzymes protéolytiques trypsine (EC 3.4.4.4.), chymotrypsine A (EC 3.4.4.5.), chymotrypsine B (EC 3.4.4.6.) et kallicréine (EC 3.4.4.21.) sont tirés d'organes de porc et de boeuf, principalement du pancréas des animaux mentionnés.

Les enzymes trypsine, chymotrypsine et kallicréine sont utilisés à des fins médicales. La trypsine et la chymotrypsine peuvent être utilisés conformément à la demande de brevet de la République fédérale d'Allemagne
DE-OS NO 2 432 518 comme médicament fîbrinolytique sous une forme liée à un support. La chymotrypsine trouve en outre une applicationen ophtalmologie pour le débridement du cristallin dans des opérations portant sur les yeux.

Les deux enzymes sont en outre utilisés comme réactifs analytiques.

La kallicréine a de nombreux domaines d'application en médecine.

La kallicréine est utilisée en raison de ses propriétés vasodilatatrices principalement dans le cas d'affections vasculaires périphériques, par exemple en cas d'apparition d'endartérite oblitérante, d'artériosclérose oblitérante et.de maladie de Raynaud ainsi qu'en cas de fractures et de blessures, par exemple le syndrome de Sudeck, de brûlures, ainsi que dans le cas d'affections vasculaires occasionnées par l'âge.

Les enzymes très purs sont nécessaires pour les applications mentionnées ci-dessus.

Les enzymes trypsine et chymotrypsine peuvent être obtenus de façon connue d'après les indications données par M. Kunitz et J.H. Northrop dans J. Gen.

Physiol. 19 (1936), pages 91 et suivantes, par cristallisation des zymogènes inactifs suivie d'activation, de même que par chromatographie sur échangeur ionique.

Toutefois, les procédés mentionnés ne sont pas spécifiques et leur réalisation technique est très coûteuse.

La kallicréine a déjà été obtenue sous la forme pure à partir d'extraits préalablement purifiés du pancréas de porc, par chromatographie sur colonnes d'échangeurs ioniques (C. Kutzbach et G. Schmidt-Kastner, Hoppe-Seyler's,
Z. Physiol. Chem., 353 (1972, 1099-1106, demandes de brevets de la République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 154 556 et NO 2 154 557).

Toutefois, lorsqu'on part de l'extrait d'organe, cinq étapes au total sont nécessaires pour obtenir la kallicréine à l'état pur.

Pour des considérations d'ordre économique, l'obtention, passant par une étape d'isolement, des enzymes trypsine, chymotrypsine et kallicréine au moyen d'inhibiteurs ou d'enzymes liés à un support (chromatographie par affinité) est supérieure aux opérations utilisant un échangeur d'ions, basées sur des interactions plus ou moins dépourvues de spécificité.

De nombreux procédés de chromatographie par affinité ont déjà été décrits dans la littérature pour la production à l'état pur des enzymes protéolytiques appelés trypsine, chymotrypsine et kallicréine.

Certains des procédés de chromatographie par affinité partent de l'immobilisation de l'inhibiteur de kallicréine et de trypsine (BPTI) qui forme avec les enzymes protéolytiques trypsine, chymotrypsine, kallicréine et plasmine, de façon réversible en fonction du pH utilisé, un complexe enzyme-inhibiteur.

Sur la base de sa stabilité au pH, à la chaleur, à la protéolyse et aux solvants (B. Kassell. Methods in Enzymology 19 (1970), 844-852) comparativement à d'autres inhibiteurs polyvalents tels que, par exemple, l'inhibiteur de trypsine du soja, le BPTI convient particulièrement à l'isolement des enzymes protéolytiques d'extraits d'organes. L'enzyme protéolytique est largement protégé d'une inactivation par la formation sur le BPTI.

Le BPTI est un polypeptide extrait d'organes de bovidés, comportant 58 aminoacides de structure primaire connue. A cause de son prix élevé, entre autres facteurs, le BPTI a dû être immobilisé sous une forme à activité de liaison aussi grande que possible en vue de la chromatographie par affinité de la trypsine, de la chymotrypsine et de la kallicréine.

Les restes d'aminoacides du BPTI participant à la formation d'un complexe avec des enzymes protéolytiques sont connus d'après l'analyse aux rayons X de la structure des complexes enzyme-inhibiteur cristallisés. Le reste de lysine 15 est avant tout essentiel dans le BPTI pour la formation d'un complexe. En outre, les restes de cystéine 14 et de cystéine 38, le reste d'alanine 16 ainsi que les restes basiques d'arginine 17 et d'arginine 39 du BPTI sont nécessaires pour la liaison de protéases.

Le reste de lysine 15, dont la modification chimique par l'anhydride d'acide succinique et l'anhydride d'acide maléique conduit au pentasuccinyl- et penta maléoyl-BPTI inactif, est particulièrement important pour la complexation avec des enzymes protéolytiques sur les cotés du BPTI. En revanche, si le complexe trypsine-BPTI est modifié de la même façon, il se forme le tétrasuccinyle inhibiteur (N a-Arg1, N -lysine26 N lysine41 et
N -lysine46) doué d'une activité inhibitrice.

Les tétramaléoyle inhibiteurs, les tétramaléoyl (15-homoarginine) inhibiteurs et le tétramaléoyl (15-N- carbamyl)-lysine inhibiteur préparés par le même schéma sont tout aussi doués d'activité inhibitrice (H. Fritz,
H. Schult, R. Meister et E. Werle, Hoppe-Seyler's Z.

Physiol. Chem. 350 (1969), 1531-1540).

D'autres informations sur les restes d'aminoacides participant à la formation du complexe ont été obtenue s à partir de la réticulation transversale du complexe trypsine-BPTI avec l'adipimate de diméthyle.

Les résultats déjà connus jusqu'à présent signifient que le BPTI a dû être immobilisé autant que possible en vue de la chromatographie par affinité de telle manière que' le centre d'activité inhibitrice avec le reste lysine-15 puisse être librement accessible du point de vue stérique à l'enzyme-protéolytique. La fixation de protéines sur un support avec des restes de lysine au centre actif est toutefois un problème général de la chimie des protéines, pour lequel aucune solution satisfaisante n'a encore pu être trouvée.

Les résultats obtenus peuvent, par analogie, être extrapolés à des protéines (enzymes et inhibiteurs d'enzymes) qui présentent un reste de lysine à l'endroit appelé centre actif.

La plupart des méthodes de couplage déjà connues pour des protéines sont axées sur la fixation des protéines par l'intermédiaire des chaînes latérales de lysine.

Parmi les aminoacides naturels existant dans des protéines en plus des restes de lysine, les restes de cystéine et les restes de tyrosine sont en outre capables d'immobiliser des polypeptides.

Le BPTI ne renferme toutefois pas de restes de cystéine. Dans la molécule de BPTI, des restes de cystéine sont simplement présents à l'état oxydé sous la forme de trois ponts de cystine. Les trois ponts de cystine ne peuvent cependant pas être réduits en totalité en des restes de cystéine sans perte d'activité de la part du
BPTI. Par ailleurs, l'immobilisation de protéines par l'intermédiaire des restes de tyrosine ne conduit de façon connue qu'à une très faible quantité de protéine liée. Ces deux possibilités d'immobilisation n'entrent donc pas en considération pour le BPTI.

Jusqu'à présent, de nombreux essais ont été entrepris pour fixer le BPTI par covalence à des supports insolubles.

Le BPTI a été lié par covalence à des support s porteurs de groupes hydroxyle activés au cyanure de brome et a été utilisé pour la chromatographie par affinité d'enzymes protéolytiques d'après D.A. Johnson et J.

Travis, Anal. Biochem. 72 (1976), 573-576, G.J. Baugh et
J. Travis, Biochemistry 15 (1976), 836-841, R. Geiger, W.

Suckstedte et H. Fritz, Hoppe-Seyler's Z. Physiol.

Chem. 361 (1980), 1003-1016, ainsi que d'après la demande de brevet de la République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 363 201.

On connait en outre, aux fins de la chromatographie par affinité, la liaison de covalence du BPTI sur des résines d'anhydride selon la demande de brevet de la
République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 1 768 934 et d'après H. Fritz, B. Brey, A. Schmal et E. Werle, Hoppe
Seyler's Z. Physiol. Chem. 350 (1969), 617-625, de même que la liaison de covalence du BPTI au moyen de carbodiimides hydrosolubles sur du "Sepharose 4 B" porteur de groupes carboxyle d'après G.R. Geiger, R. Manfl et T.

Bettels, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, (1977), 479-483,
O. Ole-Moi Yoi, J. Spragg et K.F. Austen, J. Immunol. 121 (1978), 66-71, N.B. Oza et R. W. Ryan, Biochem. J. 171 (1978), 285-288, N.B. Oza, V.M. Amin, R.X. McGregor, A.G.

Scidi et D.A. Carretero, Biochem. Pharinacol. 25, (1976) 1607-1612.

Les procédés de couplage déjà connus pour le
BPTI ont fait connaître que les restes de lysine du BPTI réagissaient avec le support activé pour former un dérivé de BPTI à liaison de covalence. Ces porteurs de BPTI n'ont qu'une faible capacité vis-à-visdes enzymes protéolytiques, attendu que le reste de lysine-15 du BPTI réagit préférentiellement avec le support activé.

Ce problème étant connu, des essais ont également été entrepris pour modifier le reste de lysine-15 du BPTI ainsi que pour le protéger sélectivement par complexation avec un enzyme protéolytique pendant le couplage du BPTI sur des supports polymériques activés et pour obtenir ainsi une liaison de covalence du BPTI par l'intermédiaire de chaînes latérales d'aminoacides autres que le reste de lysine-15.

Ainsi, B. Kassell et R.B. Chow, Biochemistry 5 (1966), 3449-3453, J. Chauvet et R. Acher, Biochem.

Biophys. Res. Commun. 27 (1967), 230-255, R. Haynes, D.T.

Otsuga et R.E. Feeney, Biochemistry 7 (1968) 2879-2885,
G.E. Means et R.E. Feeney, Chemical Modification of Proteins (1971), 93-95, Holden Day Inc., San Francisco, ont modifié la lysine contenue dans le BPTI, notamment le reste de lysine15, par guanidation avec la O- ou la S-méthylisourée en restes d'homoarginine. Le 15, 26, 41, 46-tétrahomoarginine-BPTI possède l'activité inhibitrice du BPTI.

La liaison par covalence du dérivé de BPTI obtenue par le procédé au cyanure de brome et à l'anhydride ne peut toutefois plus s'effectuer que par l'intermédiaire du groupe a-amino du reste N-terminal de l'arginine. Le couplage du dérivé de BPTI par une unique liaison de covalence sur le support polymérique conduit toutefois à l'obtention de supports de BPTI de stabilité relativement faible.

R.S. Temler et J.H.R. Kàgi, Enzyme 22 (1977), 249-255, ont en outre tenté, pendant le couplage du BPTI à des supports polymériques, de protéger sélectivement le reste de lysine-15 du BPTI par complexation de ce dernier avec un enzyme protéolytique. Cependant, le procédé mentionné n'est pas réalisable du point de vue technique.

L'adsorption, techniquement réalisable d'une façon particulièrement simple, de protéines avec réticulation transversale subséquente au moyen de réactifs bifonctionnels, n'a pas encore été décrite d'une manière générale pour.le BPTI.

L'utilisation du procédé par adsorption et réticulation transversale convient particulièrement du point de vue technique pour la production de biocatalyseurs.

Jusqu'à présent, la demande de brevet de la
République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 258 495 a simplement fait connaitre la production de polymères solubles du BPTI et leur utilisation comme médicaments.

ta réticulation transversale de protéines avec des réactifs bifonctionnels tels que par exemple, le dialdéhyde glutarique ou le glyoxal, s'effectue par réaction avec les restes de lysine de la protéine (F. Wold,
Methods in Enzymology 11, pages 617 et suivantes).

Par conséquent, lors de l'utilisation du BPTI dans ce procédé d'immobilisation, une inactivation du
BPTI est à prévoir là encore par réaction préférentielle du reste de lysine-15.

On a maintenant découvert que des dérivés du
BPTI dont des groupes e-amino des restes de lysine , notamment du reste de lysine15, sont protégés de façon réversible et qui contiennent des groupes amino ou hydroxyle nouvellement introduits par modification chimique de restes d'aminoacides, donnent, après liaison par covalence ou par adsorption avec réticulation transversale subséquente par des réactifs bifonctionnels, des supports de BPTI pour la chromatographie par affinité de la trypsine,de la chymotrypsine et de la kallicréine, qui sont supérieurs aux supports de BPTI déjà décrits par leur capacité vis-àvis de l'enzyme protéolytique.

L'objet de l'invention réside par conséquent dans des dérivés de l'inhibiteur de kallicréine et de trypsine (dérivés de BPTI) qui sont caractérisés en ce que a) ils portent sur le groupe amino terminal et/ou sur
un ou sur plusieurs ou sur la totalité des quatres
groupes e-amino des restes de lysine, des groupes réver
sibles protégeant la fonction amino et b) ils portent sur les groupes ss-carboxyle de l'acide
asparagique, les groupes y-carboxyle de l'acide glutamique
ainsi que sur le groupe carboxyle de l'aia.rine-58
terminal, par l'intermédiaire d'une liaison carboxamide,
des restes de formules

et

dans lesquelles

avec n = 0 à 12,
R1 est l'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C4
ou un groupe aryle
et
R2 est l'hydrogène ou un groupe de formule

et l'une des variables X ou les deux représen
tent ensemble un reste de pyridine ou un reste
de pyrimidine qui peut être substitué le cas
échéant par un reste -NH2.

L'invention a en outre pour objet des dérivés nouveaux de BPTI fixés par adsorption sur un échangeur cationique ou par covalence par l'intermédiaire des restes de formules I, II et III sur des supports insolubles, ainsi que les dérivés de BPTI de l'invention adsorbés sur un échangeur cationique et réticulés transversalement.

Les avantages techniques des supports de BPTI sont l'utilisation d'une moins grande quantité de BPTI, l'élution concentrée de l'enzyme protéolytique du support de BPTI et, en raison de la plus faible quantité immobilisée de BPTI, de faibles interactions non spécifiques avec des protéines.

Les nouveaux support s de dérivés de BPTI peuvent être utilisés par petites quantités ou comme charge d'une colonne de chromatographie par affinité de trypsine, de chymotrypsine et de kallicréine. Dans le dernier cas, le procédé peut être rendu automatique.

Un autre objet de l'invention réside dans le mode de préparation des nouveaux dérivés de BPTI. Jusqu'à présent, des dérivés de BPTI ont été préparés exclusivement par réaction du BPTI dissous. Lorsque les dérivés de BPTI sont préparés par modification chimique multiple, les réactifs en excès doivent être séparés du dérivé de BPTI entre toutes les étapes réactionnelles. Par suite du caractère très basique et du bas poids moléculaire du BPTI, cette opération conduite par chromatographie sur gel ou par dialyse présente des difficultés techniques.

Dans chaque cas, la solution de dérivé de BPTI doit être à nouveau concentrée après chaque opération de modification.

Conformément à l'invention, des dérivés de BPTI peuvent être préparés d'une façon techniquement simple après adsorption du BPTI sur des copolymérisats insolubles de styrène et de divinylbenzène d'après la demande de brevet de la République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 116 377. Il est surprenant de constater que le BPTI adsorbé peut être modifié chimiquement de la même manière que le BPTI dissous. Avec le BPTI adsorbé, on peut conduire l'une après l'autre des séquences de modifications chimiques sans qu'un isolement du dérivé de BPTI soit nécessaire après chaque étape de modification.

Le procédé de l'invention décrit en détail dans ce qui suit pour la production de dérivés de BPTI est d'autant plus avantageux, par rapport à la réaction en solution, que les étapes de modification portant sur la molécule de BPTI sont exécutées en plus grand nombre.

Des supports qui peuvent être utilisés pour le BPTI sont les copolymérisats décrits dans la demande de brevet de la République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 116 377 ainsi que les résines adsorbantes commercialisées sous les marques "Amberlite XAD 2 à 12", de la firme Rohm und
Haas, Philadelphie, U.S.A.

La réaction de modification portant sur la molécule adsorbée de BPTI doit être conduite en solution aqueuse à des pH de 2 à 12. Dans le cas de l'utilisation de solvants organiques pour la préparation de dérivés de BPTI, la solution réactionnelle doit être diluée par addition d'eau ou d'une solution aqueuse de sel jusqu' ce que le dérivé de BPTI reste adsorbé sur le support. Le dérivé de BPTI fini et les stades intermédiaires du dérivé de BPTI peuvent être élués sous la forme dépourvue de sel en vue du contrôle de pureté, avec des solvants tels que par exemple le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol ou des solvants analogues.

En vue de leur utilisation comme médicaments, on a déjà préparé des dérivés du BPTI, entre autres par addition d'esters d'aminoacides sur les extrémités carboxyliques du BPTI (brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 3 953 417 et N" 3 992 529, demandes de brevets de la
République fédérale d'Allemagne DE-OS NO 2 748 295, NO 2 619 246, NO 2 654 124, NO 2 748 294, NO 2 806 953, N" 2 806 954). Toutefois, ces dérivés de BPTI ne conviennent pas pour le procédé décrit de chromatographie par affinité.

Le processus réactionnel de préparation, conformément à l'invention, des résines actives insolubles de support du dérivé de BPTI peut être illustré par les schémas suivants dans lesquels on se base sur le fait que le reste que l'on protège est le reste de lysine-15.

Adsorption des dérivés de BPTI sur des échangeurs cationiques avec réticulation transversale subséquente par des réactifs bifonctionnels.

1. Introduction de groupes (réversibles) protégeant la
fonction amino dans la molécule de BPTI sur le groupe
amino terminal et les quatre groupes amino des restes
de lysine, 2. Introduction de groupes amino et hydroxyle sur les
groupes ss-carboxyle de l'acide asparaginique de même
que sur les groupes y-carboxyle de l'acide glutamique
et sur le reste d'alanine-58 terminal.

3. Adsorption du dérivé de BPTI protégé sur un échangeur
cationique, 4. Réticulation du dérivé de BPTI protégé adsorbé avec
des réactifs bifonctionnels, 5. Elimination des groupes réversibles protégeant la
fonction amino.

Liaison de covalence des dérivés de BPTI sur des supports insolubles 1. Introduction de groupes (réversibles) protégeant la
fonction amino dans la molécule de BPTI sur le groupe
amino terminal et sur les quatre groupes amino des
restes de lysine 2. Introduction de groupes amino et hydroxyle sur les
groupes ss-carboxyle de l'acide asparaginique et sur
les groupes y-carboxyle de l'acide glutarique et le
groupe carboxyle du reste alanine-58 terminal, 3. Liaison par covalence des dérivés de BPTI protégés,par
l'intermédiaire des groupes amino et hydroxyle nouvelle
ment introduits dans la molécule de BPTI.

4. Elimination des groupes réversibles protégeant la
fonction amino.

On peut aussi mettre en oeuvre le procédé conforme à l'invention en faisant réagir un support porteur de groupes amino ou de groupes hydroxyle avec des diamines nucléophiles ou des aminoalcools des formules indiquées ci-dessus, en liant au moyen de liaisons carboxamide le support ainsi modifié avec le BPTI dont les groupes amino terminaux et/ou les groupes =amino des restes de lysine sont totalement ou partiellement protégés par des groupes protecteurs de fonction amino et en éliminant ensuite les groupes protecteurs.

Une modification permanente des restes de lysine du BPTI en restes d'homoarginine est obtenue par réaction avec la O-méthylisourée et la S-méthylisothiourée (R.

Acher, J. Chauvet, R. Arnon et M. Sela, Eur. J. Biochem.

3 (1968), 476-482, B. Kassell et collaborateurs, Biochemistry 5 (1963), 3449-3453).

On peut utiliser comme groupes réversibles pour protéger les groupes a- et e-amino, les restes tertiobutyloxycarbonyle, carbobenzoxy, N-formyle, N-trifluorantyle, ou N-phtalyle aisément éliminables, connus dans la chimie des -peptides, ainsi que des bases de Schiff avec des composés dicarbonyliques, par exemple l'acétylacétone, l'acétylacétate d'éthyle et le O-hydroxybenzaldéhyde (E. Dane et collaborateurs, Angewandte Chemie 74 (1962), 874, J. C. Sheehan et V. G. Grenda, J. Amer.

Chem. Soc. 84 (1962), 2417) et, pour le benzaldéhyde (M. Bergmann, H. Fusslin et L. Zervas, Ber. dtsch. chem.

Ges. 53 (1925), 1043). L'élimination des groupes protecteurs mentionnés est effectuée en solution aqueuse alcaline, de préférence en présence d'amines tertiaires. Par réaction des diamines avec des réactifs bifonctionnels tels que le dialdéhyde glutarique et nouvelle réaction avec la diamine, on peut préparer des dérivés de BPTI polyaminés.

La réaction de BPTI avec des carbodiimides et des composés aminés nucléophiles est conduite avantageusement à des valeurs de pH comprises entre 3 et 11, notamment entre 4 et 8 en solution aqueuse, qui peut aussi contenir toutefois des solvants organique s et/ou des sels et/ou des agents de dénaturation. A titre d'exemples de solvants organiques que l'on peut éventuellement ajouter, on mentionne de préférence les suivants : diméthylformamide, diméthylsulfoxyde, hexaméthylphosphorotriamide, pyridine, diméthylacétamide. On mentionne comme sels : LiCl, NaCl et, comme agents de dénaturation : chlorhydrate de guanidine, urée.Comme carbodiimides, on peut utiliser dans la réaction conforme à l'invention pour la préparation des composés de l'invention, toute une série de carbodiimides organiques ; les carbodiimides suivants se sont montrés particulièrement avantageux à utiliser pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention : dicyclohexylcarbodiimide, métho-toluène-4-sulfonate de N-cyclohexyl-N' r2-(4-morpholinyl)éthyl7-carbodlimide, chlorhydrate de N-éthyl-N ' - (3-diméthylaminopropyl) -carbodiîmide, N-tertio-butyl+N-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, chlorhydrate de N-cyclohexyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) - carbodiimide, chlorhydrate de N-isopropyl-N'- (3-diméthyl- aminopropyl)-carbodiimide, métho-toluène-4-sulfonate de N-cyclohexyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) -carbodiimide,
N,N'-diisopropyl-carbodiimide, N,N'-ai-para-tolyl-carbodiimide.

La réaction conforme à l'invention est avantageusement conduite à des températures comprises entre -20 et +500C, notamment entre 0 et 300C.

On utilise par mole de BPTI ou de dérivé de
BPTI 10 à 100 moles, de préférence 10 à 25 moles du composé aminé nucléophile. Par rapport au composé aminé nucléophile,le carbodiimide utilisé est introduit en excès.

L'addition de 1-hydroxybenzotriazol (W. König et R. Geiger, Chem. Berichte, 103 (1970), 788-798) ou de N-hydroxysuccinimide élève le rendement en BPTI-polyamide en empêchant la formation de N-acylurées.

Mais il existe également des possibilités d'activation des 5 groupes carboxyle de Boc-BPTI sans utilisation de carbodiimides (S.R.B. Woodward, R.A. Olofson et
H. Meyer, Journal of Amer. Chemical Society, 83, (1961) pages 1010 et suivantes). L'activation des 5 groupes carboxyle peut aussi être effectuée au moyen d'un anhydride mixte d'acide carbonique avec la N-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2dihydroquinoléine d'après B. Belleau et G. Malick, Journal of American Chemical Society, 90 -(1968), 1651 ou avec l'ester éthylique de l'acide chlorocarbonique.

Les mélanges obtenus dans les réactions peuvent éventuellement être fractionnés par des procédés connus, par exemple par électrophorèse, filtration sur gel ou chromatographie par échange d'ions.

On considère comme supports pour la liaison par covalence des dérivés de BPTI, des supports polymériques porteurs de groupes hydroxyle et amino tels que, par exemple, Sepharose (R), Sephadex(R) de la firme
Pharmacia Fine Chemicals, ainsi que la cellulose et ses dérivés. L'activation des supports polymériques est effectuée par des procédés connus dans la littérature.

Pour l'adsorption des dérivés acides BPTI, on considère des polymères hydroxyliques porteurs de groupes diaminoéthyle tels que, par exemple, DEAE-cellulose,
DEAE-Sephadex(R), DEAE-Sephacel(R) et DEAE-Sepharose(R) avec réticulation transversale subséquente par le dialdéhyde glutarique.

Pour l'adsorption des dérivés basiques de BPTI, on considère des polymères hydroxyliques porteurs de groupes carboxyméthyle tels que par exemple CM-cellulose,
CM-Sephadex(R) et CM-Sepharose (R) avec réticulation transversale subséquente par le dialdéhyde glutarique. Les extraits d'organes nécessaires pour l'isolement de la trypsine,de la chimotrypsine et de la kallicréine sont préparés par des procédés connus.

L'organe broyé, par exemple le pancréas de porc pour l'obtention de trypsine et de kallicréine ainsi que le pancréas de boeuf pour l'obtention de chymotrypsine, est dégraissé à l'aide de solvants organiques tels que, par exemple, le trichloréthylène. La phase aqueuse est acidifiée à un pH de 1-2 pour l'obtention de trypsine et de chymotrypsine. La protéine précipitée est filtrée à la trompe ou séparée par centrifugation. Avant la fixation de l'extrait d'organe sur le support du dérivé de
BPTI, du trypsinogène est activé en trypsine à une valeur de pH de 7-8.

Pour la chromatographie par affinité de la trypsine, l'extrait d'organe est mis en contact avec le support de dérivé de BPTI à des valeurs de pH de 5-8.

Les protéines étrangères sont éliminées par lavage du support du dérivé de BPTI aux mêmes valeurs de pH et la trypsine est éluée à des valeurs de pH de 1-2,par exemple avec HCl 0,1N, sous la forme pure, du support du dérivé de BPTI.

Pour l'obtention de la chymotrypsine pure, on utilise des extraits d'organe dépourvus de trypsine de la manière décrite ci-dessus. La kallicréine peut être tirée exclusivement du pancréas de porc.

L'extrait d'organe est préparé comme suit 3,5 kg de pancréas de porc congelé à basse température est broyé dans un hachoir à viande. On ajoute 7 litres d'eau de ville au magma d'organe et on ajuste la valeur du pH à 4,8 avec de l'acide acétique. Pour effectuer le dégraissage, on ajoute 3,5 litres ou l'équivalent de 5 kg de trichloréthylène et on agite pendant une heure à 250C. On ajoute 1 kg d'auxiliaire de filtration et on agite la suspension pendant 15 minutes. Le tissu conjonctif est enlevé de la surface et les restes sont éliminés au moyen d'un filtre-presse enduit de kieselguhr.

La phase inférieure contenant le trichloréthylène est séparée, la phase aqueuse est additionnée de 0,2 kg de kieselguhr et la solution est clarifiée par filtration sur des plaques filtrantes Seitz AS. La solution brute d'organe contient, à côté de la kallicréine, de grandes quantités de trypsine et de chymotrypsine qui doivent être éliminées au moyen de DENecellulose avant que la solution ne soit chargée sur une colonne du dérivé de
BPTI-. Comme l'-irdique la--littératre, les constantes des dissociation du complexe de trypsine de BPTI sont inférieures à celles du complexe de kallicréine de BPTI, c'est-à-dire que l'affinité de trypsine est plus grande que l'affinité de la kallicréine pour BPTI (M. Lazdunski, J.P. - Vincent. H. Schweitz, M. Perron-Renner et J.Pudles,
Proteinase-Inhibitors, Bayer-Symposium V. (1974) 420-431).

Purification préalable de l'extrait d'organe sur DEAE-cellulose pour l'isolement de l'activité en trypsine et en chymotrypsine
10 litres d'extrait d'organes sont dilués par addition d'eau déminéralisée, jusqu'à une conductivité de 4 mA/V.cm- et on ajuste la valeur du pH à 7,0 par addition de lessive de soude. On ajoute 45 g de DEAEcellulose (forme Cl) préalablement gonflée, on agite pendant 60 minutes et on sépare par filtration ou par centrifugation. On dissout avec dans chaque cas 3 fois 1 litre de tampon au phosphate 0,05M à pH 5,0 + NaCl 0,SM, on agite pendant 60 minutes à la température ambiante et on filtre sur filtre Seitz AS. On ajuste la valeur du pH à 7,0 avec de la lessive de soude.

L'extrait de kallicréine préalablement purifié est mis en contact avec le support du dérivé de BPTI à un pH de 6-8. Les protéines étrangères sont éliminées par lavage du support du dérivé de BPTI au même pH.

La kallicréine pure est éluée du support du dérivé de BPTI à des pH de 5-3,5 et son pH est immédiatement ajusté à 6,0-6,5 avec de l'ammoniaque.

I. Exemples de préparation des dérivés de BPTI
EXEMPLE 1
Préparation de (1-arg-, 15, 26, 41, 46-Lys)-penta-boc-BPTI inactif
NH2-(CH2)6-NH2
6,51 g de BPTI lyophilisé (1 mmole, 41,96 x 106
UIK (unités d'inhibiteur de kallicréine) sont dissous dans 45 ml de dioxanne et d'eau (rapport en volume 2:1) et additionnés, avec refroidissement à la glace; de 10 ml de NaOH 1N et de 1,2 g de dicarbonate de di-tertio-butyle (5 mmoles). La solution est agitée pendant 30 minutes à la température ambiante et son volume est ajusté à 200 ml avec un mélange de dioxanne et d'eau (2:1).

Réactivité : 0,441 x 106 UIK = 1,05 % de l'activité de départ.

Préparation de (1-arg-, 15, 26, 41, 46-lys) pentaboc-BPTI inactif (3 50-- asp-1 ,6-diaminohexane, 7,49-yglu-1,6-diaminohexane-58-ala-1,6-diaminohexane)-BPTI.

100 ml de la solution ci-dessus sont agités avec 1,16 g d'hexaméthylènediamine (10 mmoles, pH ajusté à 4,5 avec HCl) et 2,4 g de EDC (12,5 mmoles) pendant 24 h à la température ambiante et à pH 4,5.

Isolement :
Procédé A : adsorption du dérivé de BPTI dans la solution aqueuse sur 1,5 1 de "Lewapol Ca 9255", élution du dérivé de BPTI de la résine adsorbante -avec 2 litres de méthanol, concentration de la solution méthanolique à l'évaporateur rotatif et lyophilisation subséquente.

Rendement = 3,049 g, équivalant à 93,5 %.

Procédé B : la solution ci-dessus est lyophilisée le résidu est dissous dans 50 ml d'acide acétique à 50 % et la solution est chromatographiée sur une colonne de "Sephadex G10" (hauteur = 90 cm, diamètre = 2,5 cm) à une vitesse d'écoulement de 60 ml/h. Les fractions 19-24 = 60 ml ont été lyophilisées.

Préparation de 3,50-B-.asp-1 ,6-diaminohexane- 7,49-y-glu-1,6-diaminohexane-58-ala-1,6-diaminOhexane-BPTI.

Le résidu lyophilisé est dissous dans 50 ml d'acide trifluoracétique anhydre pour éliminer le groupe boc et agitez à la température ambiante pendant la nuit.

Après élimination de l'acide trifluoracdtique par distillation, le résidu est repris dans 25 ml d'acide acétique à 50 % et chromatographié sur une colonne grossière de "Sephadex G 50 (H = 70cm, D = 2,5 cm) à une vitesse d'écoulement de 75 ml/h. L'éluat est recueilli par fractions et réparti en deux fractions après la transmission à 280 nm, neutralisé par NH3 et lyophilisé.

Abréviations : Reste boc = reste e-tertio-butyloxycarbonyle
EDC = chlorhydrate de N-éthyl-N'-(3
diméthylaminopropyl)-carbodiimide
BPTI = inhibiteur de kallicréine-trypsine
Constituant polymérique : fractions 15-22 = 71 ml = 0,86 g
Poudre lyophilisée = (26,4 % de la charge)
Constituant monomérique : fractions 23-35 = 130 ml = 2,36 g
Poudre lyophilisée = (72,5 z de la charge)
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 2
Préparation de (3,50-8-asp-2,4.6-triaminopyri- midine-7,49-γ-glu-2,4,6-triaminopyrimidine-58-ala-2,4,6triaminopyridine)-BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 0,75 g = 23,3 % de la charge
Constituant monomérique = 1,59 g = 49,0 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 3
Préparation de (3,50-ss-asp-2,6-diaminotoluène- 7, 49-y-glu-2, 6-diaminotoluène-58-ala-2, 6-diaminotoluène) -
BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 0,18 g = 5,4 % de la charge
Constituant monomérique = 3,26 g = 100 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 4
Préparation de (3,50-B-asp-3,3'-diaminobenzi- dine-7,49-y-glu-3,3'-diaminobenzidine-58-ala-3,3'-diamino- benzidine-)BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 1,02 g = 33,3 % de la charge
Constituant monomérique = 1,72 g = 52,5 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 5
Préparation. de (3,50 -ss-asp-1,10-diaminodécane- 7,49-γ-glu-1,10-diaminodécane-58-ala-1,10-diaminodécane)-
BPTI NH2-(cH2 ) 10-NH2
Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 0,40 g = 12,3 % de la charge
Constituant monomérique = 11,0 g = 33,8 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 6
Préparation de (3,50-ss-asp-2,3-diaminopyridine7, 49-γ-glu-2,3-diaminopyridine-58-ala-2,3-diamino- pyridine)-BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 0,52 g = 16 % de la charge
Constituant monomérique = 1,24 g = 38 %. de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 7
Préparation de (3,50-B-asp-1,2-diaminoéthyl- 7,49-γ-glu-1,2-diaminoéthyl-58-ala-1,2-diaminoéthyl)-BPTI
NH2-CH2-CH2-NH2
Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique = 0,92 g = 28,3 % de la charge
Constituant monomérique = 2,43 g = 74,6 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le
TABLEAU I
EXEMPLE 8
Préparation de (3,50-B-asp-1,2-aminoéthanol- 7t49-y-glu-1t2-aminoéthanol-58-ala-lt2-aminoéthanol)-BpTI
NH2-CH2-CH2-OH
Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique : 0,31 g = 9,5 % de la charge
Constituant monomérique : 1,34 g = 41,2 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 9
Préparation de (3,50-B-asp-1,4-diaminobutane- 7,49-y-glu-1,4-diaminobutane-58-ala-1,4-diaminobutane)-BPTI
NH2-(CH2)4-NH2
Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique : 0,33 g = 10,1 % de la charge
Constituant monomérique : 1,09 g = 33,5 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 10
Préparation de (3,50-ss-asp tétraéthylènepentamine- 7, 49-y-glu-tétraéthylènepentamine-58-ala-tétraéthylène- pentamine)-BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique : 0,14 g = 4,3 % de la charge
Constituant monomérique : 1,33 g = 41 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 11
Préparation de (3,50-ss-asp-triméthylhexaméthylène- diamine-7, 4 9-y-glu-triméthylhexaméthylènediamine-58-ala- triméthylhexaméthylènediamine-BPTI

Préparation d'après l'exemple 1.

Constituant polymérique : 0,10 g = 3,1 % de la charge
Constituant monomérique : 0,86 g = 26,4 % de la charge
Caractérisation du dérivé monomérique de BPTI sur le tableau I.

EXEMPLE 12
Préparation de (15,26,41,46-homoarginine, 3,50-B- asp-1,4-diaminobutane, 7,49-1 ,4-diaminobutane-58-ala-1 ,4- diaminobutane)-BPTI
Le BPTI est traité par guanidation d'après les indications données par B. Kassell et R. B. Chow, dans Biochemistry 5 (1966) 3449-3453, J. Chauvet et R.

Acher, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967), 230-235.

La réaction du BPTI, traité par guanidation, avec le 1,4-diaminobutane en présence d'EDC est effectuée comme indiqué dans l'exemple 1.

II. Liaison des dérivés de BPTI à des matières polymérigues
de support.

EXEMPLE 13
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 1 avec du "Sepharose 4B" activé par l'épichlorhydrine.

200 ml de "Sepharose EB(R) ou de "Sepharose CL 6 B(R)gonflé (Pharmacia AB, Uppsalla, Suède) sont filtrés à la trompe sur un verre fritté, mis en suspension dans 160 ml de NaOH 1N et activés pendant 2 heures avec 20 ml d'épichlorhydrine à une-température exactement égale à +600C. Le "Sepharose activé est filtré à la trompe, lavé sur le verre fritté deux fois avec un litre d'eau à chaque fois, mis en suspension dans 200 ml de NaOH 0,1N et additionné de 1,45 g de (1-arg-15,26,41,46-lys)-penta-boc (3,50--asp-1 ,6-diaminohexane-7,49-glu-1 ,6-diamino- hexane-58-ala-1,6-diaminohexane)-BPTI inactif lyophilisé.

La suspens ion est agitée pendant 24 heures à la température ambiante et filtrée sur un verre fritté ; le résidu est lavé deux fois avec un litre d'eau à chaque fois, deux fois avec un litre de solution à 10 % de NaCl à chaque fois et de nouveau avec deux fois un litre d'eau.

Le BPTI-"Sepharose 4B" est agité pendant la nuit à la température ambiante dans HCl 0,1N pour éliminer le groupe boc protecteur.

Activité en dérivé de BPTI utilisée : 5,39 x 106 unités analogues aux unités internationales de kallicréine.

Activité dans le filtrat = 2,12 x 106 unités analogues aux unités internationales de kallicréine (après ajustement du pH à une valeur inférieure à 1 avec HCl)
Activité du (3,50-f-asp-1,6-diaminohexane, 7,495 -glu-1,6-diaminohexane-58-ala-1,6-diaminohexane)-BPTI "Sepharose 4B" = 3,27 x 106 unités analogues aux unités internationales de kallicréine/200 ml de dérivé de BPTI "Sepharose 4B".

A la place du dérivé lyophilisé de BPTI, on peut aussi utiliser la solution de dérivé de BPTI préparée d'après l'exemple 1 sans isolement du dérivé de BPTI, sous la forme lyophilisée en vue de la liaison avec le produit "Sepharose 4B" actif.

EXEMPLE 14
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 2 avec du "Sepharose 4B" activé à l'épichlorhydrine
La réalisation de la liaison du dérivé de
BPTI s'effectue comme dans l'exemple 13.

EXEMPLE 15
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 5 avec du "Sepharose 4B" activé à l'épichlorhydrine
La réalisation de la liaison du dérivé de BPTI s'effectue comme dans l'exemple 13.

EXEMPLE 16
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 7 avec du "Sepharose 4B" activé à l'épichlorhydrine.

La réalisation de la liaison du dérivé du BPTI s'effectue comme dans l'exemple 15.

Utilisation du dérivé de BPTI = 5,66 x 106 unités analogues
aux unités internationales
de kallicréine
Activité dans le filtrat = 2,45 x 106 unités analogues à des unités internationales de kallicréine (après ajustement du pH à une valeur inférieure à 1 avec HCl).

Activité du produit (3,50-B-asp-1,2-diamino- éthane, 7,49-y-glu-1,2-diaminoéthane-58-ala-1,2-diamino- éthane)-BPTI-Sepharose 4B = 3,21 x 106 unités analogues à des unités internationales de kallicréine/200 ml de dérivé de BPTI-"Sepharose 4B".

EXEMPLE 17
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 8 avec du "Sepharose 4B" activé à l'épichlorhydrine.

La réalisation de la liaison du dérivé de BPTI est effectuée comme dans l'exemple 13.

EXEMPLE 18
Liaison par covalence du dérivé de BPTI selon l'exemple 1 avec du "Sepharose 4B" activé au chlorure de cyanuryle.

200 ml de t'Sepharose 4B" (R) sédimenté sont activés pendant 60 minutes dans un mélange de 100 ml d'eau distillée et de 200 ml de dioxanne à pH 5,0-7,0 avec 10 g de chlorure de cyanuryle. Le Sepharose 43,,(R) activé est filtré à la trompe, lavé sur le filtre-presse avec du dioxanne et de l'eau distillée et couplé sous forme de suspension à pH 7,0-8,0 avec addition de 1,5 g de dérivé de BPTI selon l'exemple 1 pendant 16 heures à la température ambiante. Le porteur de dérivé de BPTI final est filtré à la trompe, et lavé sur le filtre presse plusieurs fois avec de l'eau distillée, une solution à 10 % de NaCl et de nouveau de l'eau.

Le filtrat contient 1,67 x 106 unités analogues à des unités internationales de kallicréine.

EXEMPLE 19
Fixation par adsorption du dérivé de BPTI selon l'exemple 1 sur "CM-Sepharose Cl 6B" avec réticulation transversale subséquente par le dialdéhyde glutarique.

200 ml de "CM-Sepharose Cl 6B" (R) (Pharmacia
AB, Uppsala/Suède) sous la forme Na sont agités conjointement avec 1,45 g de (1-arg-, 15,26,41,46-lys) penta boc-(3,50-ss-asp-1,6-diaminohexane-7,49-&gamma;-glu-1,6-diamino- hexane)-BPTI inactif lyophilisé, à une conductivité de < 10 mA/V.cm- et à une valeur de pH de 5-6, pendant une heure.

Le "CM-Sepharose Cl 6B" chargé est filtré à la trompe et réticulé transversalement sous forme.de suspension pendant 2 heures à la température ambiante dans un litre de solution à 2,5 % de dialdéhyde glutarique.

Le "CM-.Sepharose" porteur du dérivé de BPTI est filtré à la trompe sur un verre fritté et le gel est agité pendant la nuit à la température ambiante dans
HCl 0,1N pour éliminer le groupe boc protecteur.

Activité en dérivé de BPTI utilisée = 5,39 x 106 unités analogues à des unités internationales de kallicréine.

Activité dans le filtrat : < 12 500 unités analogues à des unités internationales de kallicréine équivalant à 0,2 % (après ajustement du pH à une valeur inférieure à 1 avec HCl).

EXEMPLE 20
Liaison par adsorption du dérivé de BPTI selon l'exemple 7 au "CM-Sepharose CL 6B" avec réticulation transversale subséquente par le dialdéhyde glutarique.

L'adsorption et la réticulation transversale du dérivé de BPTI sont effectuées comme indiqué dans l'exemple 21.

On utilise 1,45 g de "1-arg-,15,26,41,46-lys) penta-boc-(3,50-ss-asp-1,2-diaminoéthyl-7,49-Y-glu-1,2- diaminoéthyl-58-ala-1,2-diaminoéthyl)-BPTI inactif lyophilisé, qui est lié comme dans l'exemple 19 quantitativement à du "CM-Sepharose CL 6B".

Activité dans le filtrat : < 12 500 unités analogues à des unités internationales de kallicréine (après ajustement du pH à une valeur inférieure à 1 avec HCl).

III. Utilisation des porteurs de dérivés de BPTI pour l'obtention des enzymes protéolytiques chymotrypsine, kallicréine et trypsine à l'état pur, d'après le principe de la chromatographie par affinité.

EXEMPLE 21
Obtention de la chymotrypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 13
180 ml de "Sepharose 4B1' porteur de dérivé de BPTI, préparés conformément à l'exemple 15, sont mis en suspension dans un tampon à l'acétate de sodium 0,1M additionné de NaCl 0,6M et de CaCl2 0,05M à pH 5,0 et la suspension est chargée dans une colonne ayant les dimensions suivantes : hauteur = 6,2 cm, largeur = 6,1 cm.

1 g de chymotrypsine partiellement purifiée extraite de pancréas de boeuf (155 unités ATEE/g) est dissous dans 40 ml du tampon mentionné ci-dessus et la solution est chargée à une vitesse de 250 ml/h sur la colonne de "Sepharose 41311 porteur de dérivé de BPTI.

Les impuretés non adsorbées sont éluées de la matière de la colonne avec un tampon à l'acétate de sodium 0,1M additionné de NaCl 0,6M et de CaCl 0,05M à pH 5,0 jusqu'à ce que l'extinction à 280 nm ait atteint la valeur initiale.

De la chymotrypsine pure est éluée de la colonne de "Sepharose 4B" porteur de dérivé de BPTI avec HCl 0,1N et peut être obtenue à l'état de protéine lyophilisée après dialyse vis-à-vis d'eau distillée.

Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 22
Obtention de chymotrypsine avec le "Sepharose" porteur du dérivé de BPTI selon l'exemple 16.

On suit le mode opératoire de l'exemple 21.

Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 23
Obtention de kallicréine avec "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 13.

3 g de kallicréine dépourvue de trypsine, partiellement purifiée, extraite du pancréas de porc (32,4 unités de kallicréine (EK/mg) sont dissous à pH 7,0 dans 210 ml de tampon au phosphate 0,1M et la solution est chargée à une vitesse de 300 ml/h sur la colonne de dérivé de BPTI (hauteur = 4,5 cm, diamètre = 3,8 cm). Les impuretés sont éliminées par lavage avec un tampon au phosphate 0,05M additionné de NaCl 0,5M à pH 7,0 et avec de l'acétate de sodium 0,2M à pH 6,0 jusqu'à ce que l'extinction à 280 nm ait atteint de nouveau la valeur initiale.

L'activité en kallicréine est éluée de la colonne de "Sepharose 4 B" porteur de dérivé de BPTI avec un tampon à l'acétate de sodium 0,3M à pH 4,4 et son pH est immédiatement ajusté à 6,0 avec une solution concentrée d'ammoniac. La kallicréine pure peut être obtenue par dialyse et lyophilisation. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 24
Obtention de kallicréine avec le "Sepharose" porteur du dérivé de BPTI selon l'exemple 14.

Le traitement de kallicréine partiellement purifiée pour l'obtention de kallicréine pure est effectué comme indiqué dans l'exemple 23. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 25
Obtention de kallicréine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 15.

Le traitement de kallicréine partiellement purifiée pour l'obtention de kallicréine pure.est effectué comme indiqué dans l'exemple 23. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 26
Obtention de kallicréine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 16.

Le traitement de kallicréine partiellement purifiée pour l'obtention de kallicréine pure est effectué comme indiqué dans l'exemple 23. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 27
Obtention de kallicréine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 17.

Le traitement de kallicréine partiellement purifiée pour l'obtention de kallicréine pure est effectué comme indiqué dans l'exemple 23. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 28
Obtention de trypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 15.

172 ml de "Sepharose 4 B" porteur de dérivé de
BPTI selon l'exemple 15 sont mis en suspension dans du tampon à l'acétate de sodium 0,1M additionné de NaCl 0,6M et de CaCl2 0,05M à pH 5,0 et la suspension est chargée dans une colonne de 5,7 cm de hauteur et 6,2 cm de diamètre.

2,5 g de trypsine partiellement purifiée extraite du pancréas de porc (20 unités FIP/mg) sont dissous dans environ 50 ml du tampon mentionné ci-dessus et la solution est chargée à une vitesse de 300 ml/h sur la colonne de 1,Sepharose 4 B" portant le dérivé de BPTI. Les impuretés sont éliminées par lavage avec un tampon à l'acétate de sodium 0,îMadditionné de NaCl 0,6M et de CaCl2 0,05M à pH 5,0 jusqu'à ce que l'exctinction à 280 nm ait de nouveau atteint la valeur initiale.

L'activité en trypsine est éluée de la colonne de "Sepharose 4 B" portant le dérivé BPTI avec HCl 0,1N.

La trypsine pure peut être obtenue par dialyse et lyophilisation.

Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau Il.

EXEMPLE 29
Obtention de trypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 14.

Le traitement de trypsine partiellement purifiée pour l'obtention de trypsine pure est effectué selon l'exemple 28.

Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau Il.

EXEMPLE 30
Obtention de trypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 15.

Le traitement de trypsine partiellement purifiée pour l'obtention de trypsine pure est effectué selon l'exemple 28. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

EXEMPLE 31
Obtention de trypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 16.

Le traitement de trypsine partiellement purifiée pour l'obtention de trypsine pure est effectué selon l'exemple 28. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau Il.

EXEMPLE 32
Obtention de trypsine avec du "Sepharose" porteur de dérivé de BPTI selon l'exemple 17.

Le traitement de trypsine partiellement purifiée pour l'obtention de trypsine pure est effectué selon l'exemple 28. Le résultat de la détermination de capacité est reproduit sur le tableau II.

TABLEAU I
Dérivés de BPTI basiques selon les exemples 1-11
N d'exemple Polyamines liées par de prépara- covalence aux groupes tion du COOH du BPTI dérivé de [&alpha;]25 C *
BPTI 578 nm 1 2 3 4 5 1 1,6-Diaminohexane -71,4 3720 3921 2298 0,46 % 1,9-1,5 2 2,4,6-Triaminopyrimidine -87 3578 3375 839 0,17 % 2,1-1,5 3 2,6-Diaminotoluène -89,8 3258 2013 1758 0,26 % 1,7-1,1 4 3,3'-Diaminobenzidine -59,8 2611 2407 2049 0,74 % 1,7-1,0 5 1,10-Diaminodécane -91,4 3974 4719 3771 0,10 % 1,8-1,0 6 2,3-Diaminopyridine -74,8 3618 4266 2751 0,25 % 2,0-1,6 7 1,2-Diaminoéthane -96,4 3904 2736 3150 0,65 % 2,0-1,6 8 2-Aminoéthanol -87,6 4111 3936 2397 0,16 % 1,9-1,5 9 1,4-Diaminobutane -93,2 4083 4458 3087 0,02 % 1,8-1,3 10 Tetraéthylènepentamine -95,8 4899 3047 3306 0,28 % 1,9-1,4 11 Triméthylhexaméthylènediamine -78,2 3385 3741 3093 0,57 % 1,7-1,0
BPTI - -121 env. env. env. - 1,0
6400 6400 6400 * c=1 dans H2O 1. Inhibition de la trypsine en unités analogues aux UIK/mg 2. Inhibition de la chymotrypsine en unités analogues
aux UIK/mg 3. Inhibition de kallicréine en unités analogues aux UIK/mg 4. Cendres contenant des nitrates 5. Mobilité électrophorétique dans l'électrophorèse sur
"Cellogel" dans un tampon à l'acétate de pyridine à
pH 6,05, par rapport à BPTI = 1,0 TABLEAU II
Chargement de divers types de "Sèpharose 4 B" portant un dérivé de BPTI avec des solutions de chymotrypsine,
de trypsine et de kallicréine
Exempl "Sepharose 4 B" - dérivé de BPTI Capacité envers la chymotrypsine, la kallicréine et
(N d'exemple) la trypsine pures a) chymo
trypsine 21 1,6-diaminohexane (exemple 13) 514 000 unités ATEE/1 de "Sépharose 4 B" porteur de
dérivé de BPTI 22 1,2-diaminoéthane (exemple 16) 360 160 " "
BPTI (comparaison) 67 100 b) kallicréine 23 1,6-diaminohexane (exemple 13) 1,32 x 10 6 unités de kallicréine/1 de "Sépharose 4B"
porteur de dérivé de BPTI 24 2,4,6-triaminopyrimidine (exmeple 14) 1,36 x 10 6 " " 25 1,10-diaminodécane (exemple 15) 1,30 x 10 6 " " 26 1,2-diaminoéthane (exemple 16) 0,68 x 10 6 " " 27 2-Aminoéthanol (exemple 17) 1,49 x 10 6 " "
BPTI (comparaison) 0,37 x 10 6 TABLEAU II (suite)
Chargement de divers types de "Sèpharose 4 B" portant un dérivé de BPTI avec des solutions de chymotrypsine,
de trypsine et de kallicréine
Exempl "Sepharose 4 B" - dérivé de BPTI Capacité envers la chymotrypsine, la kallicréine et
(N d'exemple) la trypsine pures c) Trypsine 28 1,6-diaminohexane (exemple 13) 452 900 unités FIP/1 de "Sepharose 4 B" porteur de
dérivé de BPTI 29 2,4,6-triaminopyrimidine (exemple 14) 311 770 " " 30 1,10-diaminodécane (exemple 15) 310 000 " " 31 1,2-Diaminoéthane (exemple 16) 234 000 " " 32 2-Aminoéthanol (exemple 17) 282 000 " "
BPTI (comparaison) 95 500 " "

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Dérivés d'inhibiteurs de kallicréine et de trypsine (dérivés de BPTI), caractérisés en ce que a) ils portent sur le groupe amino terminal et/ou sur

un ou sur plusieurs ou sur la totalité des quatres

groupes e-amino des restes de lysine, des groupes réver

sibles protégeant la fonction amino et b) ils portent sur les groupes ss-carboxyle de l'acide

asparagique,les groupes y-carboxyle de l'acide glutamique

ainsi que sur le groupe carboxyle de l'alanine-58

terminal, par l'intermédiaire d'une liaison carboxamide,

des restes de formules

et

dans lesquelles

X représente l'un des groupes

R2 est l'hydrogène ou un groupe de formule

et

ou un groupe aryle

R1 est l'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C4

avec n = 0 à 12,

échéant par reste -NH2.

de pyrimidine qui peut être substitué le cas

tent ensemble un reste de pyridine ou un reste

et l'une des variables X ou les deux représen

2. Dérivés de BPTI suivant la revendication 1, caractérisés en ce que le groupe amino terminal et le groupe e-amino des restes de lysine sont protégés par des restes tertio-butyloxycarbonyle, carbobenzoxy, Nformyle, N-trifluoracétyle, N-phtalyle ou des bases de

Schiff de composés tricarbonyliques.

3. Dérivés de BPTI suivant la revendication 1, caractérisés en ce que les restes de lysine sont modifiés par réaction avec de la O-méthylisourée ou de la S-méthylisothiourée.

4. Dérivés de BPTI suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que le reste de lysine15 est protégé par des groupes réversibles protégeant la fonction amino.

5. Dérivés de BPTI suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont adsorbés sur un échangeur cationique ou liés par covalence par l'intermédiaire des restes des formules I, II et III à des supports insolubles.

6. Dérivés de BPTI suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont adsorbés sur les échangeurs cationiques et réticulés transversalement.

7. Dérivés de BPTI suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont liés par covalence par l'intermédiaire des restes des formules I, II et III à du Sepharose (R) de la firme

Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala, Suède ou à de la cellulose ou à ses dérivés.

8. Des dérivés de BPTI dépourvus de groupes protégeant la fonction amino suivant l'une quelconque desrevendications 5 à 7.

la fonction amino.

alcools et d) on élimine les restes réversibles protégeant

triamines nucléophiles ou de restes d'amino

supports par l'intermédiaire des restes de

par covalence des produits réactionnels à des

difonctionnels ou bien on effectue la liaison

versalement, le cas échéant avec des composés

échangeurs cationiques et on les réticule trans

nucléophiles ou des aminoalcools, c) on adsorbe les produits réactionnels sur des

par le reste alanine-58 terminal avec les diamines

glutamique ainsi que le groupe carboxyle porté

asparagique, les groupes y-carboxyle de l'acide

protecteurs, b) on fait réagir les groupes ss-carboxyle de l'acide

des restes de lysine par des groupes amino

plusieurs ou la totalité des groupes e-amino

9. Procédé de production de dérivés de BPTI liés à un support, caractérisé en ce que a) on protège le groupe amino terminal et/ou un,

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'on fait réagir les groupes ss-carboxyle de l'acide asparagique, les groupes y-carboxyle de l'acide glutamique ainsi que le groupe carboxyle porté par le reste alanine-58 terminal, avec des diamines nucléophiles ou des amino-alcools en présence de carbodiimides.

11. Procédé de production de dérivés de BPTI liés à un support, caractérisé en ce qu'on fait réagir des support s porteurs de groupes amino ou de groupes hydroxy avec des diamines nucléophiles ou des aminoalcools des formules indiquées dans la revendication 1, on protège totalement ou partiellement le support porteur de BPTI ainsi modifié, ses groupes amino terminaux et/ou ses groupes e-amino des restes de lysine, on les lie par l'intermédiaire de liaisons carboxamide puis on élimine les groupes protecteurs.

12. Utilisation de dérivés de BPTI dépourvus de groupes protégeant la fonction amino, adsorbés sur un support ou liés à un support suivant la revendication 1 pour la purification par chromatographie par affinité des enzymes trypsine, chymotrypsine et kallicréine.