CN1223664A - 丝氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents

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赛义德·埃尔根蒂
多诺万·格林
伊曼纽尔·什科尔道拉克斯
迈克尔·芬贝尔·斯库利
克里斯托弗·安德鲁·古德温
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Abstract

本发明提供了双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂以及制备含有硼的肽的方法。该丝氨酸蛋白酶抑制剂包括一个定向催化位点的部分,该部分结合并且抑制丝氨酸蛋白酶的活性位点,以及一个外在位点相关部分,其中这两部分通过一个连接物部分连接。定向催化位点的部分以及外在位点相关部分能够同时结合到所说的丝氨酸蛋白酶的分子上。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制剂
本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂和底物，以及上述化合物的合成和用于合成含有硼的化合物的新的方法和材料。
其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的调节或抑制作用可用于预防血栓症。
丝氨酸蛋白酶的家族通过涉及催化在所述酶活性位点中Asp-His-Ser残基的三联体的机理来切割肽键。已经设计出丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂利用官能团与三联体相互作用并从而阻断激活上述酶的底物。理想的情况是制备出对一种靶蛋白酶具有选择性的抑制剂。在与本申请同一天提交的名称为“凝血酶抑制剂”的英国专利申请以及在PCT/GB96/00352的说明书中可以发现有关于肽的抑制剂的现有技术的讨论。名称为“凝血酶抑制剂”的申请的说明书副本与本申请一起提交。本申请的内容包括名称为“凝血酶抑制剂”的申请的主题内容，本领域技术熟练的读者可以希望参阅该说明书以及在该说明书中提到的不同的现有文献。“凝血酶抑制剂”的说明书实际上不能构成本申请公开的说明书的一部分。
已知某些丝氨酸蛋白酶具有第二位点或“外在位点(exosite)”以便结合到底物的阴离子部分上。这种外在位点通常被称作阴离子结合外在位点(anion binding exosite,“ABE”)。
把提供了丝氨酸蛋白酶底物易裂键(scissile bond)的羰基的氨基酸残基命名为“P1”。位于残基P1的N-末端一侧的连续的氨基酸残基被命名为P2、P3、P4…等；位于残基P1的C-末端一侧的氨基酸残基被命名为P1＇、P2＇、P3＇…。在血纤蛋白原中，P1＇为甘氨酸而P2＇为脯氨酸。该蛋白酶含有一个识别P1氨基酸侧链的“特异性口袋”。胰蛋白酶类的蛋白酶通常识别具有精氨酸类或者丝氨酸类侧链的P1残基。
本发明提供了新的双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂，它包括：
(a)一个结合并且抑制丝氨酸蛋白酶的活性位点的定向催化位点的部分(catalytic site-directed moiety,CSDM)；
(b)一个外在位点相关部分(exosite associating moiety,EAM)；以及任选的
(c)在EAM和CSDM之间连接的连接物部分，CSDM和EAM能够同时结合到所述丝氨酸蛋白酶的分子上。
在抑制剂的类别当中，丝氨酸蛋白酶不是凝血酶。丝氨酸蛋白酶优选为胰蛋白酶类的蛋白酶。在任何情况下，所述的抑制剂都不包括把连接物部分连接到CSDM上作为其C-末端延伸的凝血酶抑制剂，即所述抑制剂不是如US 5196404和相应的国际专利申请WO 91/02750中公开的化合物。
在另一方面，本发明提供了新的用于制备含有硼的肽的方法。
正如在本文中所使用的那样，“天然”氨基酸是指选自在蛋白质中发现的20种常用或者“标准”的-氨基酸之一的L-氨基酸(或其残基)。
“非天然”氨基酸是指除上述20种“标准”氨基酸之外的任意的α-氨基酸(或其残基)。因此，非天然氨基酸包括天然的L-氨基酸的D-异构体以及具有侧链保护基团的氨基酸。
词头“D”和“L”的用法和平常一样以便分别表示D-或L-构型的氨基酸。“D，L-”词头表示外消旋混合物，而除非另作声明的以外，没有词头则表示所述氨基酸可以为D-或L-构型，其中除了在残基为L-构型的实施例中的情况。对于那些在本文中没有具体说明构型的基团来说，它们可以为D-或L-构型，其中优选L-构型。
添以词头“boro”的缩写和术语表示氨基酸中的末端羧基-CO2H已被一个硼官能团代替。
附图的简要描述
图1为Meerrifield树脂的傅里叶变换红外(F.t.-I.R.)光谱。
图2为在与2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇化(methanolate)钠反应后的同一树脂的F.t.-I.R.光谱。
图3为在用HCl处理以去掉二氧戊环的羟基保护后反应所得树脂的F.t.-I.R.光谱。
图4为在与苯基硼酸反应后去掉保护的树脂的F.t.-I.R.光谱。
现在将更为详细地介绍本发明的化合物和方法：定向催化位点的部分(CSDM)
定向催化位点的部分(CSDM)结合到丝氨酸蛋白酶的催化位点上并使其失活。CSDM的结构对本发明并不是至关重要的。例如，它可以包括丝氨酸蛋白酶催化位点的任何已知的抑制剂的氨基酸序列。
在下面的通式Ⅰ中包括了一类CSDMs：
            X-(aa4)m-(aa3)n-(aa2)-(aa1-)-Z    (Ⅰ)其中aa1,aa2和aa3代表天然或非天然的酸残基，而(aa4)m代表一个或多个连接到aa3的氨基上的任选的氨基酸残基。或者，任意的一个或多个aa基团可以是其中的α-氢被取代基所取代的氨基酸残基的类似物。氨基酸和/或氨基酸类似物的序列结合到丝氨酸蛋白酶的活性位点上。在本说明书中随后将描述合适的序列。X表示H或在N-末端氨基上的取代基。例如正如在本领域中已知的那样，Z为-COOH或C-末端的延伸基团(羧基取代基团)。在优选的化合物中，Z为一个杂原子的酸的基团[例如-B(OH)2、-P(OH)2或PO(OH)2]或其衍生物{例如羧酸酯、二氧-硼酸酯[-B(O取代基)2]或磷酸酯[-PO(O取代基)2]或BF2}。优选的杂原子类似物的基团为-B(OH)2和-P(O)(OH)2；不太优选的杂原子类似物基团为S(O)2OH。在其它可能的Z基团中，可以有提到的-CN,-COCH2Cl和-COCH2F。在优选的实施方案中，m从0至7，更通常为从0至5，例如为0、1或2，尤其是m为0。一般而言，n=1。
在一类化合物中，(aa2)-(aa1)的天然肽键被另一种键(ψ)代替。另外或者换言之，其它的天然肽键也可以被另一种键代替。
丝氨酸蛋白酶的催化位点抑制剂是本领域所熟知的。在EP-B-145441中将会发现对丝氨酸蛋白酶抑制剂(即丝氨酸蛋白酶催化位点的抑制剂)的简要回顾，该专利公开了一类具有C-末端硼基的丝氨酸蛋白酶。其它描述丝氨酸蛋白酶抑制剂的专利说明书包括EP 293881，EP 471651(与US 5288707相同),EP 235692,US 4963655和WO89/09612(尤其与[TF:Ⅶ/Ⅶa]复合物中的因子Ⅶ/Ⅶa的抑制剂有关)。
对胰蛋白酶类的酶的抑制剂来说，优选的CSDMs的P1残基的种类为(ⅰ)Arg,Lys及其类似物，以及(ⅱ)疏水残基；在前述的名称为“凝血酶抑制剂”的说明书以及PCT/GB96/00352中可以发现针对凝血酶同时也是针对其它胰蛋白酶类酶的优选的P1基团的进一步描述。胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶优先结合到在P1残基上具有苯丙氨酸类和丙氨酸类侧链的CSDMs上。下面的表A表明对8种具体的丝氨酸蛋白酶来说最优选的(P4)P3P2残基：
表A
酶 残基序列
凝血酶 D-Tyr-/NaSO2-Pro的D-Phe-/取代的D-Phe-/D-Dpa-/Dba-/Pms-/α-Nal-/β-Nal-/TMSal-/Chg-/Phg-/D-Tiq-/对-醚
因子Ⅰa  IleuGluGly,PyroGluGly,ArgGly,ChaGly,LeuArg
因子Ⅶa  L-PhePhe,NalPhe,D-TiqPhe,NalThr,NalPhg
因子Ⅸa  ValVal
因子Ⅺa γ-BzlGluGly,Glu(OBzl)Ala,GlyArg,GlyLys
因子Ⅻa  GlnGly
尿激酶 PhePro,GluGly
蛋白质Ca  LeuSerThr
在所有情况下，优选的氨基酸都可以由其类似物代替。外在位点相关部分(EAM)
外在位点相关部分(EAM)为结合到丝氨酸蛋白酶的外在位点(ABE)上的部分。除了血纤蛋白原氨基酸序列C-末端结合到凝血酶切割位点以外，凝血酶还具有进行了明确定义的外在位点，其中凝血酶的非底物配体(如水蛭素)结合到外在位点上。在称作“hirulogs”的双官能肽中已经使用了如Hir53-64的水蛭素序列。在US 5196404中描述了hirulogs在前述名称为“凝血酶抑制剂”的英国专利申请中可以发现对凝血酶EAMs的进一步描述。针对凝血酶的EAMs通常被命名为“阴离子结合的外在位点相关部分”(anion binding exosite associatingmoieties,ABEAMs)。
由FXa的晶体结构(Padmanabhan K等，“在2.2分辨率下人的Des(1-45)因子Ⅹa的结构”，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1993,232,947-966)推断出含有8个酸性残基的序列35-41和70-81构成了阳离子结合的外在位点。天然多肽抑制剂antistasin和ghilanten分别含有与正电阳离子外在位点相关序列108CRPKRKLIPR117和108CKPKRKLVPR117。
显而易见对特异性而言，在P’位点上丝氨酸蛋白酶的相互作用(C-末端至切割点上)与在P位点上的作用同等重要(例如Ding,L.；Coombs,G.S.；Strandberg,L.；Navre,M.；Coreyu,DR．和Madison,E.L.组织一类型血纤蛋白溶酶原激活剂的特异性的起因，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)1995,92,7627-7631)，并且较大的配体需要进行比较能否跨过上述两个位点，而这正如可以从文库筛选中迅速得到的那样。近来(Lawson 1992)已经表明对明显含有P＇与P结合单元的肽序列的筛选可以检测出FⅦa/TF的活性，而其现有的底物都极为不敏感。在许多申请中(例如Eichler,1994)，肽文库正显示出用于筛选生物活性的高效率并且可用于本发明中。
本发明设想序列C-末端结合到其它丝氨酸蛋白酶底物的切割点上形成了如下所示的EAM：
表B
酶 天然底物 切割位点
因子Ⅹa 凝血酶原 YIDGR--IVEGSDAEIGMSPWQ
因子Ⅹa 凝血酶原 AIEGR--TATSEYQTFFNPRTFGS
因子Ⅹa 因子Ⅶ  SKPQGR--IVGGKVC
因子Ⅶa 因子Ⅹ  NLTRR--IVGGQECKDGEC
因子Ⅸa 因子Ⅹ  NLTRR--IVGGQECKDGEC
因子Ⅺa 因子Ⅸ SKLTR--AEAVFPDVDYVN
因子Ⅺa 因子Ⅸ FNDFT--VVGGEDAKPGQF
因子Ⅻa 因子Ⅺ KIKPR--IVGGTASVRGE
因子Ⅻa 血浆激肽释放酶 KTSTR--IVGGTNSSWGE
蛋白质Ca 因子Ⅷ  ELR--MKNNEEAEDYDDDLTDSEMD
 t-PA/UK 血纤蛋白溶酶原 PKKCPGR--VVGGCVAHPHSWPWQVSLRT
连接物部分
本发明的化合物可以含有相互连接CSDM和EAM的连接物部分，该连接物部分可以使CSDM和EAM同时结合到有关的丝氨酸蛋白酶抑制剂的分子上。在凝血酶中，该连接物部分被结合到CSDM上作为N-末端的延伸或者作为或穿过其侧链。
可以将连接物部分结合到CSDM上或作为C-末端的延伸或者作为N-末端的延伸或者作为或穿过侧链。但是，如果该化合物为凝血酶抑制剂的话，则该连接物部分不可能是CSDM的C-末端的延伸。特别是如果连接物部分为CSDM的N-末端延伸的话，或者如果该部分包含在其侧链中的话，人们期望的是该部分包括至少含有2个相邻的Gly残基(例如在其N-末端上)的氨基酸序列。在一类化合物中，所述连接物优选包括肽“间隔臂”和非肽“接头”。一种具有代表性的连接物的结构为：
              -λ-σ-其中λ表示非肽接头，而σ表示含有氨基酸序列的间隔臂，通过一个肽键将λ和σ适当地连接在一起。尽管将σ连接到CSDM上并将λ连接到EAM上的化合物构成了本发明中一个不太优选的实施方案，但是优选把间隔臂σ连接到EAM上，把接头λ连接到CSDM上。
例如，所述接头通常是具有与间隔臂的N-末端氨基反应的官能团和CSDM的官能团(如N-末端基团)的化合物的残基。因此，一个优选的接头有两个羧基，例如为可以与CSDM的N-末端氨基和间隔臂形成酰胺键的二羧酸。特别优选的接头为戊二酸(HO2C(CH2)3CO2H)及其通式为(HO2C(CH2)hCO2H)的同系物的残基，其中h为2或从4至6的整数。亚烷基残基[-(CH2)2-6-]可以被在空间上不阻碍接头的一个或多个取代基取代，由此保持了接头所需的灵活性。
不太优选的情况是所述接头例如可以包括具有两个羧基且其碳原子被2至6个原子隔开的另一种化合物的残基。
对本发明而言，间隔臂的氨基酸序列并不是至关重要的，但它优选包括至少两个相邻的Gly残基，其中所述残基通常位于其N-末端上。其中，间隔臂的长度取决于在接头连接到的CSDM上的位置。
在与本申请同一天提交的发明名称为“凝血酶抑制剂”的前述英国专利申请中可以发现对适合于肽凝血酶抑制剂的连接物部分的进一步描述。
连接物部分可以有被其它键代替的一个或多个天然的酰胺键。合成
例如可以通过使用用于肽合成和偶联肽的公知方法来制备本发明的化合物。在一种典型的方法中，新化合物是通过固相合成技术制备的。
固相合成是一种为研究肽的化学家所熟悉的技术，因此在本文中不需要进行详细的解释。可以在“The Chemical Synthesis of Peptides(肽的化学合成)”(John Jones,Clarendon Press，牛津，英格兰，1991)中找到对该技术的介绍。常规的固相合成的原理为使偶联到固相上的氨基酸或肽与进行了保护以防与自身反应的氨基酸发生反应，并且在与连接到固相的氨基酸偶联之后，被去保护的以便与进行了保护以防与其自身反应的另一个氨基酸发生反应。时常按照需要重复上述步骤。
一种固相合成技术为Fmoc技术(Fmoc=芴基甲基羰基)。在Fmoc化学方法(通常也称作“Sheppard方法”)中，将肽(或氨基酸)的羧基末端通过接头偶联到树脂珠上，其中的接头末端具有反应的功能。由于现在知道肽链在珠内部的孔中增长，因此尽管已经使用了在溶剂中具有适宜的溶胀特性的其它固体，但树脂珠自身通常为聚苯乙烯(PS)。另一种可替代的固体的实例为叫做Kiesulguhr的聚酰胺。
接头可以为许多物质，但是我们喜欢使用PEG(即聚乙二醇接头)，它具有醇的功能。
通常称作“把手”的接头末端取决于所需的产物，但是对于Fmoc化学方法来说，它将是最终可以被酸切割的部分。最常用的末端(我们已经使用的)为HMBA或对-羟基甲基苯甲酸接头。将HMBA酯化到PEG上，然后使肽或氨基酸(在其N-末端上有Fmoc)反应以便给HMBA也提供一个酯键。然后可以用酸切割该酯键。Fmoc保护基在碱性条件下不稳定，一般通过次级(secondary)碱(例如哌啶)去掉保护基，并使得到的游离氨基与选出的Fmoc-保护的氨基酸反应；通过重复上述步骤便延长了氨基酸序列。
另一种固相合成方法为Boc技术(Boc=叔丁氧羰基)。在Boc化学方法(更普遍地也被称作Merriield方法)中使用的树脂通常以二乙烯基苄基为基础，例如“Wang”树脂具有共聚到2％的二乙烯基苯中的氯甲基苯。使氯甲基苯基团与氨基已由Boc保护的氨基酸或肽反应以便提供与树脂连接的键。与树脂连接的键通常由干燥的液态HF切割(必须十分小心！)。这被描述为“剧烈的”酸解。Boc保护基在酸性条件下不稳定并且在得到的游离氨基与选出的Boc-保护的氨基酸反应之前通常由TFA进行切割；与Fmoc化学方法一样，通过重复上述步骤便延长了氨基酸序列。
因此，固相肽合成的两种传统方法(Sheppard与Merrifield)包括将氨基酸通过其羧基-末端或其衍生物偶联到固态树脂颗粒上，然后依次将新的氨基酸(通过其活化的羧基末端)偶联到生成的N-末端上。
另一方面，近来的报道已经表明通过N-末端(例如通过在酸性条件下不稳定的苄氧羰基键)偶联到树脂上，随后释放出羧基末端，激活羧基末端并通过其N-末端偶联氨基酸，而氨基酸的羧基末端进行临时保护(Sharma,R.P.,Jones,D.A.；Broadbridge,R.J.；Corina,D.L.与Akhtar,M．肽类似物的固相合成的新方法，《固相合成中的革新和展望》R.Epton编辑，1994，五月花全球有限公司，伯明翰，第353-356页；Letsinger,R.L.与Kornet,M.J．美国化学协会杂志，1963,85,3045)。
上述N-末端偶联方法可以用于制备本发明的产品。在包括任意直接连接氨基酸的CSDM的一个具体实例中，由N-末端偶联来合成CSDM。如果CSDM具有C-末端杂原子基团时，该技术特别有用；在该方法中，将使用N-末端偶联制得的树脂连接的肽链进行转化以便激活其羧基末端，然后将游离的α-氨基硼酸酯或酸偶联至树脂连接的序列上。最终在将肽的硼酸化物(boronate)连接到最终产物的残基上之前，通过强酸(例如HF或TFA)从树脂中切掉肽的硼酸化物(包括CSDM)。
当合成其中的CSDM含有P1-P2非天然酰胺键的化合物时，可以方便地预先制备出作为中间体的结合亚位点亲和部分[通式Ⅰ的X-(aa4)m-(aa3)n-(aa2)]以及具有其连接的C-末端基团的特异性口袋亲和部分[通式Ⅰ的(aa1)-Z]。这两种中间体含有合适的官能团，从而在一起反应以形成靶非天然酰胺键[ψ]，并且引起或使得它们在一起反应以生成化合物(或其前体以便进行一次或者多次进一步的官能团的转变)。
在PCT/GB96/00352中描述了适用于制备含有非酰胺键ψ的肽的合成技术。
使用固相合成化学方法，我们已经出乎意外地成功地合成了肽的硼酸酯。例如，在列举的用于合成丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法中，其中的连接物部分以及其所连接的EAM形成了CSDM的N-末端延伸，例如使用Fmoc-聚酰胺连续流动方法通过Fmoc固相肽化学制备出EAM。适用于该目的的固相为预先进行了衍生的固相载体Fmoc-Leu-PEG-PS。随后例如用戊二酸酐处理与肽共轭的树脂，其中的一个羧基与EAM的N-末端氨基反应。将预先合成的肽硼酸化物CSDM与树脂/肽/戊二酸共轭物反应以生成最终的化合物，而例如通过用100％TFA处理从树脂上切掉该化合物。
在固相化学中使用肽的硼酸酯的另一种方法为一种完全新颖的技术，其中将硼酸[-B(OH)2]直接酯化到偶联到树脂上的二醇上。例如通过标准的Fmoc化学方法从氨基酸的氨基继续进行链的延长。用酸(例如TFA)从树脂上切掉硼酸酯以生成肽的硼酸化物[肽-B(OH)2]，或者通过酯基转移作用、例如通过受阻的二醇(例如蒎烷二醇)的浓缩溶液来制备。
因此，本发明包括一种制备本发明化合物的方法，该方法包括进行下列步骤以制备出靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与氨基、或者优选与羧基反应
的官能团或其反应性衍生物的固相；
(ⅱ)引起本发明化合物的氨基酸序列末端氨基酸的氨基或羧基(所述基团可以为其反应性衍生物的形式)选择性地与所说的官能团反应；
(ⅲ)将在靶序列中依次在偶联到固相上的按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸偶联到所说的在前氨基酸上；以及
(ⅳ)通常按照需要重复步骤(ⅲ)。
在步骤(ⅰ)中，偶联到固相上的官能团可以位于在最终产品化合物中结合的部分上，例如可以为直接或间接偶联到固相上的氨基酸的氨基(可以是衍生而来的)。
在所述的方法中可以并且通常包括一个或多个其它的步骤以便获得本发明的化合物。因此当需要的时候，优选的方法包括步骤(ⅴ)，该步骤通过具有两个能够与氨基反应的官能团的化合物将步骤(ⅲ)所说的依次在后的氨基酸偶联到该步骤所说的在前氨基酸上，由此所说的一个官能团结合到所说的在前氨基酸的氨基上，而另外的则结合到所说的在后氨基酸的氨基上。
步骤(ⅲ)的依次在后的氨基酸可以是一个较大部分的部分，例如为随意地含有代替了天然肽键的氨基酸序列。
在该方法中，与氨基反应的任意一个或多个羧基可以为其反应性的含有羰基的衍生物形式，比如被活化的羧基，例如酸酐。
在使用前，例如通过本领域已知的方式从固相中切掉固相合成的最终的化合物。在得到最终产品化合物之前，可以使切掉的化合物进行一个或多个其它的化学反应。
在一个优选的实施方案中，与连接到固相上的官能团反应的末端氨基酸为EAM的C-末端氨基酸，并且重复步骤(ⅲ)以便偶联EAM序列的连续氨基酸以及任意邻接的连接物的肽的连续的氨基酸以生成不间断的氨基酸序列。
偶联到固相上的不间断的氨基酸序列的最后一个氨基酸可以与具有两个羧基或其反应性衍生物(例如二羧酸的酸酐)的化合物反应，以便将两个羧酸之一结合到最后一个氨基酸的氨基上。未反应的羧酸或羧酸的衍生物通常与氨基酸的氨基反应，该氨基酸通常为CSDM的N-末端氨基酸。在后一种情况下，所说的氨基酸可能已经结合到CSDM的残余物上，即可以完全(或部分)独立地制备CSDM以便连接到未反应的羧酸(或衍生物)上。如上所述，具有两个羧基的化合物优选为上述的接头。
在一些优选方法中，使用的是具有以杂原子基团代替C-末端羧基而得到的CSDM。杂原子基团优选为如上所述的硼酸化物或硼酸化物的衍生物。
与固相物质(固相以及任意连接的分子)反应的氨基酸或其它部分最好具有所有能反应的官能团，该官能团能够影响得到了保护的合成，当然不会影响将与固相物质反应的基团。在使反应后的氨基酸或部分的任意被保护的官能团进行反应之前，使所述官能团去保护，随后使其反应。
因此第一种优选的方法包括：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与羧基反应官能团其反应性衍生物的固相；
(ⅱ)将该固相与EAM的C-末端氨基酸接触，该氨基酸具有被保的氨基和任选的衍生羧基，并且引起或使得所述氨基酸分子的羧基与固相的官能团反应；
(ⅲ)对反应的氨基酸的氨基的去保护，由此给固相提供游离氨基；
(ⅳ)以EAM和任选的邻接的间隔臂的肽的连续氨基酸重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)以便在固相上形成氨基酸序列，该序列从EAM的C-末端至位于序列游离末端的间隔臂的N-末端；
(ⅴ)将固相与具有两个羧基或其反应性残基的接头化合物接触，并且引起或使得接头的羧基或反应性羧基残基与间隔臂序列的N-末端氨基反应：
(ⅳ)将具有偶联于其上的接头化合物的固相与CSDM序列的N-末端氨基酸接触，并且引起或使得所述氨基酸分子的氨基与接头化合物的羧基或其反应性羧基残基反应，CSDM序列的N-末端氨基酸可以为完整的CSDM的任选的部分；
(ⅶ)如果需要的话，以CSDM的连续的氨基酸重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)以便使该CSDM序列完整；以及
(ⅷ)从所述固相的官能团上切掉得到的化合物。第二种优选的方法包括：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与羧基反应官能团或其反应性衍生物的固相；
(ⅱ)将该固相与EAM的C-末端氨基酸接触，该氨基酸具有被保护的氨基和任选的衍生羧基，并且引起或使得所述氨基酸分子的羧基与固相的官能团反应；
(ⅲ)去掉对反应的氨基酸的氨基的保护，由此给固相提供了游离氨基；
(ⅳ)以EAM的连续氨基酸重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)以便在固相上形成氨基酸序列，该序列从EAM的C-末端至位于序列游离末端的EAM的N-末端；
(ⅴ)将固相与具有两个羧基或其反应性残基的接头化合物接触，并且引起或使得接头的羧基残基与EAM的N-末端氨基反应；
(ⅵ)可以任选地将具有偶联于其上的接头化合物的固相与肽间隔臂序列的N-末端氨基酸接触，并且引起或使得所述氨基酸分子的氨基与接头化合物的羧基或反应性羧基残基反应；
(ⅶ)可以任选地以间隔臂的连续氨基酸重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)，然后以CSDM序列的N-末端氨基酸重复步骤(ⅱ)，CSDM序列的N-末端氨基酸可以为完整的CSDM的任选的部分；
(ⅷ)如果需要的话，以CSDM的连续的氨基酸重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)以便使该CSDM序列完整；以及
(ⅸ)从所述固相的官能团上切掉得到的化合物。
在任一前述方法中，合成的化合物优选是用酸从固相上切掉的。
前述的方法优选涉及具有C-末端硼基团的CSDM氨基酸或氨基酸序列(例如完整的CSDM)的用途。
在第一种和第二种优选的方法中，偶联到固相上的官能团可以是结合到最终产品化合物中的部分的一部分，例如可以是直接或间接偶联到固相上的氨基酸的氨基(可以是由其衍生的)。
在本发明的一种方法中，偶联到固相上的官能团为结合到最终产品化合物中的氨基酸硼酸化物的一部分，即固相具有偶联于其上的二醇，而二醇又结合到氨基酸硼酸化物上。
在另一种方法中，将侧链具有氨基或羧基的氨基酸偶联到固相上，其中通过羧基或氨基偶联到所述侧链上。从氨基酸的一个官能团进行链的延伸，例如从氨基进行的Fmoc合成。然后使其它的官能团与最终产品的一些其它的组成部分反应，例如与氨基酸硼酸化物反应(以便生成CSDM的P1残基)。但是，固相合成含有硼的肽可以应用于任何这样的肽并且不仅用于本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂中。固相合成含硼化合物
肽的硼酸化物是一类经充分确认的化合物，迄今为止该化合物已经通过溶液化学方法来制备。因此，肽的丝氨酸蛋白酶抑制剂是已知的，其中的C-末端羧基由硼酸基团或其衍生物代替。具有代表性的化合物为通式Ⅱ的化合物：
         (aa)k-B(R2)(R3)    (Ⅱ)其中：(aa)k表示氨基酸序列(例如与通式Ⅰ中的相同)；R2和R3分别独立地选自卤素，-OH,-OR4和-NR4R5，其中R4和R5分别独立地为通式R6(CO)u-的基团，其中u为0或1；R6为H或任选的含有(10-u)个碳原子以内的以及任选的由选自-OH,R7(CO)vO-和R7(CO)v-的一个或多个基团取代的卤代烷基、芳基或芳烷基，其中ⅴ为0或1；R7为C1-C6-v烷基，或为含有(10-ⅴ)个碳原子以内的芳基、烷基芳基、芳烷基或烷基芳烷基基团。或者R2和R3合起来表示二醇或二硫酚的残基。
例如在WO92/07869(等同于USSN 08/317,387)、EP 0471651(对应于US 5288707)和USSN 08/240,606中描述了这种肽的硼酸化物，这些公开的内容并入本文作为参考。
正如已经表明的那样，我们现已惊奇地发现通过固相化学方法无需严格的降解就可以合成出含有硼的肽。因此，本发明一方面为含硼氨基酸类似物在使用固相化学方法的肽合成中的用途，其中尤其是在Fmoc化学方法(也称作“Sheppard方法”)中。
另一方面，本发明提供了一种制备肽或含肽化合物的方法，该方法包括进行下列步骤以制备出靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的官能团的固相；
(ⅱ)引起可与所述官能团反应的化合物选择性地与其反应，反应得到的化合物具有能够与氨基或者与羧基反应的官能团或其反应性衍生物；
(ⅲ)引起靶氨基酸序列末端氨基酸的氨基或羧基(可以为其反应性衍生物的形式)选择性地与反应得到的化合物的所说的官能团反应；
(ⅳ)将在靶序列中依次在偶联到固相上的按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸偶联到所说的在前氨基酸上；
(ⅴ)通常按照需要重复步骤(ⅳ)；以及
(ⅵ)通过酸或碱的作用从固相上切掉使用步骤(ⅰ)-(ⅳ)制得的连接到固相上的化合物，其特征在于在从固相上切掉化合物之前，将包括硼酸基团[-B(OH)2]或其衍生物的化合物、尤其是酯结合到与固相连接的化合物上。
本发明用于制备肽或含肽化合物的方法可以包括将肽偶联到通过该方法前述步骤制得的与固相连接的化合物上的步骤，该步骤可以作为所述方法的任选步骤(ⅳ)[即所述方法的步骤(ⅳ)为依次在后的氨基酸为肽的一部分］。
本发明用于制备肽或含肽化合物的方法可以包括偶联到通过该方法前述步骤制得的与固相连接的化合物上的步骤，其中偶联的是化合物而非氨基酸或肽，例如具有两个用于连接与固相连接的肽上的氨基的羧基并且具有肽、肽的类似物或液相中的氨基酸的氨基的化合物。因此，当然可以把能够与氨基反应的任何其它的液相化合物或根据具体情况可以把羧基连接到与固相连接的肽上。二胺可用于连接具有羧基的部分(例如为其反应性衍生物的形式)。通过二羧酸(尤其是戊二酸)使与固相连接的肽延伸可用于制备双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中通过连接物部分使CSDM连接(通常通过其N-末端)到EAM上，所述连接物部分包括肽的间隔臂部分以及二羧酸残基接头部分。
游离末端以二羧酸残基终止的与固相连接的化合物可以通过游离羧基残基(优选以其衍生物的形式)与氨基酸氨基的反应进一步延伸，例如可以使偶联到与固相连接的EAM-间隔臂部分的二羧酸残基与CSDM的氨基酸(例如CSDM的N-末端氨基酸)反应。
例如作为常规固相肽合成的一部分，本方法的步骤(ⅱ)可以包括使氨基酸的氨基或任意衍生得到的羧基与直接或间接偶联到固相上的官能团反应。偶联到固相上的氨基或羧基通常为末端氨基或羧基，但在一些实施方案中为侧链的官能团，例如戊二酸侧链的羧基；通过侧链连接到固相上的氨基酸的C-末端羧基可以被硼酸残基[-B(OH)2]或其酯代替。
所述方法可以包括在SPPS中的N-末端偶联，其中在从树脂上用酸切掉得到的产物之前，将与树脂结合的肽的羧基末端偶联到游离的α-氨基硼酸或酯上。
在另一个具体实例中，步骤(ⅱ)包括将氨基酸或肽的硼酸或酯
Figure A9719599100231
或者其中E1和E2表示形成硼酸酯的残基或者可以共同形成一个单独的残基，与偶联到固相上的二醇反应。通过偶联(直接或间接)到固相上的羟基把硼原子(例如作为氨基酸或肽的硼酸或酯的一部分)连接到固相上的技术是新的并且构成了本发明的一个方面。
如果包括硼酸或酯的化合物为在前述任一实施方案的步骤(ⅱ)中使用的氨基酸硼酸化物的话，可以使用固相合成方法来制备丝氨酸蛋白酶催化位点的肽的硼酸化物抑制剂，也可以任选地用于双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂的合成中。
因此，可以把硼酸直接酯化到含有二醇的树脂上，然后通过例如标准的Fmoc-化学方法从N-末端继续进行链延伸。随后或者通过无机酸(以提供游离的硼酸[肽-B(OH)2])或者通过酯基转移作用(例如通过二醇的浓缩溶液，例如尤其是通过受阻的二醇、比如蒎烷二醇(pinanediol))切掉硼酸酯。
有关文献描述了制备含有二醇的固相树脂的方法，该树脂可以由醛衍生而来并且也适于由硼酸/酯衍生而来(例如Xu,Z.-H.,McArthur,C.R．与Leznoff,C.C.“The monoblacking of symmetrical Diketones onInsoluble Polymer Supports(在不溶聚合物载体上的对称二酮的单保护)”Can.J.Chem.,1993,61,1405-1409以及Leznoff,C.C．与Sywanyk,W.“Use of Polymer Supports in Organic Synthesis 9.Synthesis ofUnsymmetrical Caretenoids on Solid Phase(在有机合成中聚合物载体的用途9．在固相上不对称caretenoid的合成)”J.Org.Chem．(有机化学杂志)，1997,42,3203-3205)。
一种常用的方法如下：
Figure A9719599100241
二醇为具有两个或多个醇羟基的化合物。X和Y为保护基。R为氨基酸硼酸化物/硼酸的侧链。通常在每步之后洗涤树脂。在合适的具体实例中，在二醇与树脂反应之前不保护二醇。
一种更具体的方法如下所示：TMS=三甲基甲硅烷基SPPS=固相肽合成
因此，本发明为通过固相化学方法制备肽的硼酸化物开辟了道路，例如通过组合的方法制备肽的硼酸化物的文库。
本发明包括一种用于制备含有肽的硼酸或肽的硼酸酯的化合物的方法，该方法包括：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的醇羟基的固相；
(ⅱ)引起氨基酸的硼酸或肽的硼酸与所述羟基反应，由此将硼酸残基酯化到所述固相上；
(ⅲ)引起在最终产品肽的硼酸或硼酸酯中依次在后的氨基酸的羧基选择性地与偶联到固相上的按顺序在前的氨基酸的氨基反应；
(ⅳ)通常按照需要重复步骤(ⅲ)；
(ⅴ)从树脂上切掉得到的肽的硼酸化物，该方法可以任选地包括一个或多个其它的步骤以制备所说的化合物。
偶联到固相上的醇羟基优选地被排列为可以将成对的基团连接到硼原子上、即可以通过下列基团使硼原子发生二酯化：
Figure A9719599100271
在一些具体实例中，所述羟基为1,2-排列(即位于相邻碳原子上)；在另一些具体实例中，所述羟基在链上被间隔开(例如NH(CH2CH2OH)2的残基)。
偶联到固相上的每个氨基酸优选具有保护的氨基，并且步骤(ⅲ)包括对按顺序在前的氨基酸的氨基去保护。步骤(ⅴ)的切割优选是用酸或通过酯基转移作用进行的。
更一般而言，本发明提供了在通过羟基残基连接到固相上的硼酸残基在固相合成中的用途。
本发明也提供了一种用于制备含有硼原子的化合物的方法，该方法包括：
(ⅱ)提供一种具有偶联于其上的醇羟基的固相；
(ⅱ)引起硼酸或硼酸酯与所述羟基反应，由此将硼酸残基酯化到所
述固相上；以及
(ⅲ)进行一个或多个其它的步骤以制备所说的化合物。所述的醇羟基优选如上所述进行排列。
在另一方面，本发明提供了一种具有通过羟基偶联于其上的硼酸残基的固相物质以及具有偶联于其上的通式Ⅳ部分的固相物质：
Figure A9719599100281
其中R为连接到硼原子上的残基并且通常为有机部分。残基R为一类不含可以与醇羟基反应的官能团的物质(但是例如在去掉保护之前，所说的物质可以含有呈保护形式的这类官能团)。在另一类物质中，这类官能团未被保护，其中的保护基事先已除去。R通常为具有一个或多个官能团的有机部分以便使R能够进行化学反应：可以保护任意可保护的官能团。在一类物质中，该固相具有偶联于其上的通式Ⅴ的部分-CH2-基团的一个或两个氢原子都可以用与所述物质的用途相适应的其它基团来代替，例如烷基(如甲基或丁基)。
在另一类物质中，通式Ⅳ左侧的氧为酯的一部分。
第一种固相合成方法包括进行下列步骤以制备出靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与羧基反应的官能团的固相；
(ⅱ)引起可以与所述官能团反应的并且包括由在碱性条件下不稳定的保护基保护的氨基的化合物与所述官能团反应以形成在酸性条件下不稳定的键；
(ⅲ)用碱去掉对氨基的保护；
(ⅳ)引起由在碱性条件下不稳定的保护基保护了氨基的氨基酸的羧基与由步骤(ⅲ)得到的去掉保护的氨基反应；
(ⅴ)用碱去掉对被保护的氨基酸的保护；
(ⅵ)引起在靶序列中依次在偶联到固相上的按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸与所述按顺序在前的氨基酸去保护的氨基反应，所述按顺序在后的氨基酸具有被在碱性条件下不稳定的保护基保护的氨基；
(ⅶ)用碱去掉对被保护的氨基酸基团的保护；
(ⅷ)通常按照需要重复步骤(ⅵ)和(ⅷ)；以及
(ⅸ)用酸或通过酯基转移作用切掉在酸性条件下不稳定的键，其特征在于当切掉在酸性条件下不稳定的键之前，把包括硼酸基团[-B(OH)2]的化合物或其衍生物(尤其是酯)结合到与固相连接的化合物中。
如上所述对于制备肽或含肽化合物的方法来说，所述方法的步骤(ⅱ)可以包括将氨基酸的可以任意衍生的羧基与直接或间接偶联到固相上的官能团反应，例如通过本领域已知的在固相化学中的方法。所述氨基酸可以是包括硼酸或酯基的化合物、即氨基酸的硼酸或酯。或者，步骤(ⅱ)可以包括将包含硼酸或酯基的、呈氨基酸或肽的硼酸或酯的形式的化合物与偶联到所述固相上的二醇反应。在任何一种使用氨基酸(或肽)的硼酸或酯的情况下，所说的方法都适于制备丝氨酸蛋白酶催化位点的肽的硼酸化物抑制剂，所说的方法可以任意地适用于双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂的合成中。
制备肽或含肽化合物的方法的上述其它的变化可以应用于所说的第一种固相合成方法中。
第二种固相合成方法包括进行下列步骤以制备出靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与羧基反应的官能团的固相；
(ⅱ)引起可以与所述官能团反应的并且包括由在酸性条件下不稳定的保护基保护的氨基的化合物与所述官能团反应以形成在碱性条件下不稳定的键；
(ⅲ)用酸去掉对氨基的保护；
(ⅳ)引起由在酸性条件下不稳定的保护基保护了氨基的氨基酸的羧基与由步骤(ⅲ)得到的去掉保护的氨基反应；
(ⅴ)用酸去掉对被保护的氨基酸的保护；
(ⅵ)引起在靶序列中依次在偶联到固相上的按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸与所述按顺序在前的氨基酸去保护的氨基反应，所述按顺序在后的氨基酸具有被在酸性条件下不稳定的保护基保护的氨基；
(ⅶ)用酸去掉对被保护的氨基酸基团的保护；
(ⅷ)通常按照需要重复步骤(ⅵ)和(ⅷ)；以及
(ⅸ)用碱或通过酯基转移作用切掉在碱性条件下不稳定的键。其特征在于在切掉在碱性条件下不稳定的键之前，把包括硼酸基团[-B(OH)2]的化合物或其衍生物(尤其是酯)结合到与固相连接的化合物中。
第一种固相合成方法的上述变化也可以应用于第二种方法中。
如上所述对于制备肽或含肽化合物的方法来说，第一种和第二种固相合成方法的方法可以包括把一种化合物而不是氨基酸或肽偶联到与固相连接的由所述方法的前述步骤制得的化合物上的步骤。合成概论
尽管本发明的化合物可以含有硼，但是它们不必含有硼。不含硼的化合物也可以由固相合成来制备。本发明的一些化合物具有由其它连接基团取代的天然的肽键。可以在于当日提交的、名称为“凝血酶抑制剂”的前述专利申请中找到有关适于合成本发明的所有化合物的方法的其它信息。用途
本发明的新的化合物可以用作抑制剂或丝氨酸蛋白酶(例如凝血酶)的底物，并且可以用于上述酶的体外或体内诊断以及机理的研究。更一般而言，新的肽可以用于研究或合成的目的。而且，由于其抑制作用，所述抑制剂可以用于预防或治疗由凝血酶或其它丝氨酸蛋白酶在调节系统、特别是哺乳动物系统(例如人或动物体)中的过剩而引起的疾病，例如控制凝固系统。在药学上有用的化合物具有药物学上可接受的基团，比如任意的N-末端取代基(Ⅹ)。
当需要抗-凝血酶原剂时，可以使用本发明的抗-血栓形成化合物。一般说来，可以把这些化合物以有效的量通过口腔或肠胃外向宿主给药以获得抗一凝血酶原的效果。在高等哺乳动物(比如人)的情况下，可以把所述的化合物单独或者与一种或多种药物载体或稀释剂结合给药以获得抗-凝血酶原的效果，所用的剂量为0.02至10mg/Kg体重并且优选为1-100mg/Kg，并且可以以单一的剂量或分开的剂量或者以缓释配方的方式给药。当为病人建立起体外的血液循环时，可以通过静脉内以0.1-10mg/Kg给药。为了在整个血液中使用，可以提供1-100mg/升以防止凝结。
用于人或兽医的药物的稀释剂或载体是众所周知的并且包括糖、淀粉和水，它们可以用于制备药物组合物(人或兽医)的可接受的配方，所述组合物含有在所需的药物适宜或有效的量或浓度下的一种或多种对象(subject)肽。该药物配方可以呈单位剂量的形式。所述化合物的配方包括片剂、胶囊、可以注射的溶液及其类似物。
为了防止在血液采集或分配容器、与血液接触的导管或可移植设备中的血液凝固，也可以把本发明的抗-凝固化合物加入到血液中。
可以由本发明的化合物带来的好处包括口服的活性、活性迅速起作用以及低毒性。此外，这些化合物在治疗对某些化合物(比如肝素或者凝血酶或其它丝氨酸蛋白酶的其它已知的抑制剂)过敏的个体时具有特殊的实用性。
本发明的方法可用于合成丝氨酸蛋白酶抑制剂以及其它的化合物。它们可用于组合的化学方法中。
通过以下的实施例将进一步描述和解释本发明。实施例
在实施例部分中，除非另作声明的以外，氨基酸残基均为L-构型。1．[-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2-Gln(Tyr63)Hir51-64a．GlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64
通过固相肽化学方法在Milligen9050肽合成仪上使用Fmoc-聚酰胺连续流动方法和在柱监测软件上有专利权的9050 Plus制备具有氨基酸通式为H-Gly-Gly-Gln-His-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-OH的GlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64。在整个过程中使用事先衍生得到的固相载体Fmoc-Leu-PEG-PS(1.6g,0.22meq/g)；Fmoc-Leu-PEG-PS包括具有HMBA接头的聚乙二醇衍生的聚苯乙烯。使用20％的哌啶在DMF中的溶液去掉Fmoc基团。依次偶联作为在适当的位置上进行了侧链保护的其五氟苯酯的Fmoc-氨基酸(4当量)(例如Fmoc-L-Tyr(tBu)OPfp,Fmoc-L-Glu(tBu)OPfp,Fmoc-L-Asp(tBu)OPfp,Fmoc-L-Asn(Trt)Ofp与Fmoc-His(boc)OPfp)。一旦所需的肽序列完成的时候，使用20％的哌啶在DMF中的溶液去掉N-末端的Fmoc基团。阳性的水合茚三酮测试表明已经去掉了Fmoc基团。接下来在过滤器上滗出与肽共轭的树脂，并且在真空中干燥几个小时之前用二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷“离线”洗涤树脂。b．HO2C(CH2)3COGlyGlyGln(Tyr63)Hir51-64
把在实施例1a中得到的肽悬浮在DMF(5ml)中，并在圆底烧瓶(25ml)中用戊二酸酐(300mg)和4-甲基-吗啉(200mg)处理。来回振荡反应混合物过夜。用DMF、DCM和MeOH洗涤树脂，然后在真空中干燥树脂过夜以得到靶化合物。c．H-D-Phe-ProBoroBpgOPin
通过向装有隔膜并用氮气吹扫的圆底烧瓶(100ml)中的Cbz-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin(2g)加入40％的HBr在醋酸(20ml)中的溶液来制备H-D-Phe-ProBoroBpgOPin。来回振荡烧瓶以使被保护的三肽完全溶解。在大约30分钟后停止放气，加入无水乙醚(200ml)并在冰箱中储存反应混合物4小时。过滤反应混合物，将残余物溶解在EtOH(1ml)中，并加入干燥的乙醚以便沉淀出产品(800mg)，所述产品为白色固体(M-H),51 6；Tlc(C/M/A,95/5/3),Rf=0.05。d．[-D-PheProBoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64为了合成[-D-PheProBoroBpgOPin]CO(CH2)3COGly2GIn(Tyr63)Hir51- 64，在向反应混合物中加入TBTU(129mg,0.4mmol)和H-D-Phe-ProBoroBpgOPin(230mg,0.4mmol)之前，将干树脂HOCO(CH2)3COGly2Gln(Tyr63)Hir51-64悬浮在DMF(10ml)中。在搅拌5分钟后，加入三乙胺(40mg,0.04mmol)并保持烧瓶搅拌过夜。
用二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷洗涤完全保护的肽的树脂，然后在真空下进行干燥。通过用100％TFA处理树脂两小时来实现在去掉侧链保护基保护的同时从树脂上切割。除去TFA，用冷的干乙醚通过沉淀生成具有C-末端羧基的游离的肽。通过过滤收集粗肽并用其它部分的乙醚进行洗涤。
粗肽的纯化是通过反相HPLC使用VydacTM C-18制备柱(TP硅胶，10μm,25mm×300mm)实现的。用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1TFA在乙腈中的溶液)的30-90％的线性梯度洗脱柱子。在230nM下监测柱洗脱液，并适当地收集级分。通过分析RP-HPLC和质谱测定产物的纯度。2．Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-硼乙基甘氨酸蒎烷二醇a．Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg蒎烷二醇
在搅拌下将1-氯乙烷-蒎烷二醇硼酸酯(0.321g,1.25×10-3mol)加入Cbz-D-Phe-Pro-OH(0.6g,1.52×10-3mol)中。当完成了添加时，在结束前于4℃下保持搅拌-段更长的时间之前，将溶于CH2Cl2的DBU(0.23g,1.52mmol)加入上述混合物中并在室温下进行搅拌。用HCl(0.1M,2×50ml)、NaHCO3(1％,50ml)洗涤不透明的液体。通过剧烈的搅拌在无水MgSO4上干燥有机层并过滤以除去干燥剂。在旋转蒸发器中减压浓缩滤液以得到粘稠的残余物。通过1H N.M.R.的初级测定显示出所需的粗产品。将粗样品溶解在少量的MeOH中并加入sephadexLH20柱中，然后使用同样的溶剂用泵洗脱。在U.V．灯(226nM)和记录仪的协助下跟踪洗脱分布。收集空体积、级分1-6和其它的总体积。从层析谱的形状来看，可以认为级分1-6最有可能为可以发现所述三肽的级分。分别浓缩上述级分以便生产出澄清的、颜色浅的、粘稠的残余物。随后提供在高真空下放置时含有大部分上述物质的级分作为轻度结晶的产品(0.269,35％的产率)。N.M.R.,FABMS(快速原子轰击质谱)和C,H,N非常有力(很好)地表明已经生成了上述化合物。
Figure A9719599100341
b．H-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg蒎烷二醇
把Cbz-D-Phe-Pro-ψ(CO2)-BoroEtg蒎烷二醇(来自于实施例2a)溶解在MeOH(30ml)中并用10％Pd/C进行处理，在搅拌下用氩清洗，将烧瓶抽成真空并在搅拌下泵入H25小时。在TLC上，水合茚三酮染色显示出去掉保护的产品。用氩清洗溶液10分钟、过滤并在减压下浓缩以生产出稠的黑色的油，将油溶解在CHCl3中、过滤并浓缩。粗产品的1H N.M.R．显示出没有被保护的产品。在Sephadex LH20层析柱上用层析法分离来自上述物质的残余物。1H(60 MHz)N.M.R．表明分离出的化合物显现出许多在推定结构的基础上所预期的特性。分离出了122mg游离的氨基硼酸酯。3．H-Phe-L-Glu-BoroBpgOPina．Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OH
在Ar下，将四重三苯基磷化钯(0)[PdP(Ph3)4](1g)溶解在含有5％醋酸和2.5％N-甲基吗啉(30ml)的CH3Cl溶液中。在Ar下将该混合物转移到含有Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OAl(1.6g)的烧瓶中。在偶尔轻微的搅动下保持该树脂静置2小时。在一个烧结玻璃板漏斗中过滤树脂，并用0.5％的二异丙基乙胺和二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5％w/w)在DMF(300ml)中的溶液洗涤树脂以除去催化剂。b．Fmoc-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin
在Ar下将干树脂Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OH(1.5g)悬浮在DMF(10ml)中。向反应混合物中加入TBTU(129mg,0.4mmol)和NH2BoroBpgOPin(165mg,0.5mmol)。在搅拌5分钟之后，加入三乙胺(40mg,0.4mmol)并保持烧瓶搅拌过夜。用二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷洗涤树脂，然后在真空下进行干燥。c．H-Phe-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin
通过固相化学方法在Milligen 9050肽合成仪上制备H-Phe-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin。
使用20％的哌啶在DMF中的溶液从固相载体Fmoc-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPin上除去Fmoc基团。将Fmoc-Phe-OPfp偶联到游离N-末端上。
用二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷洗涤被保护的肽的树脂，然后在真空下进行干燥。d．H-Phe-L-Glu-BoroBpgOPin
通过用100％TFA处理树脂两小时来实现从树脂上切掉所说的肽。除去TFA，并用冷的干乙醚通过沉淀生成游离肽H-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPin。通过过滤收集粗肽并用其它部分的乙醚洗涤粗肽。
粗肽的纯化是通过反相HPLC使用Vydac C-18制备柱(TP硅胶：颗粒大小10mm；25mm×300mm)实现的。用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA在乙腈中的溶液)的30-90％的线性梯度洗脱柱子。在230nM下监测柱洗脱液，并适当地收集级分。通过分析RP-HPLC和质谱确定产物的纯度。以17％的产率得到34mg的产品H-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPin,ES-MS：626[M+Na]；保留时间分析HPLC(4×250mm,Vydac,C-18 techsphere)，通过10-60％MeCN、0.1％TFA的水溶液和0.1％TFA洗脱25分钟以上，得到Rt为23.1分钟。4．将连接硼酸到Merrifield树脂上a．用被保护的二醇(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)衍生树脂
在氩气的环境下将Na(固体，8g)加入2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇(240ml)中，搅拌该混合物直至生成澄清的溶液。加入Merrifield树脂(Sigma,1.1MeQ C1/克，20g)、搅拌混合物过夜、然后在80℃下加热24小时。
通过过滤收集衍生的树脂，用1,4-二氧杂环己烷(1L)、水(3×500ml)和MeOH：水(1∶1,3×500ml)、MeOH(3×500ml)以及干乙醚(3×500ml)洗涤树脂。通过把1.5-2mg的树脂与KBr(干燥的,300mg)弄成粉末并且压制成圆片、然后在Perkin1600傅里叶变换红外仪上扫描来得到红外光谱。与Merrifield树脂(图1)相比，衍生的树脂(图2)显示出对五元环的醚的拉伸频率特征来说在1050至1150cm-1(s)处具有截然不同的拉伸信号；以及对烷基-烷基拉伸来说在1060至1150cm-1(s)处的二烷基醚的拉伸。b．去保护
Figure A9719599100371
将衍生的树脂与HCl(1.5M,250ml)和1,4-二氧杂环己烷(250ml)混合，搅拌悬浮液并且在80℃下加热。72小时后，用水(500ml)、MeOH(500ml)、DCM(500ml)和Et2O(500ml)洗涤树脂，然后在空气中干燥。上述树脂的F.t.-I.R．光谱显示出在3400-3550 cm-1(s)处的截然不同的O-H拉伸频率以及在3413.6处的一个主峰(图3)；该峰实质上比在2917.6cm-1处的要大。比较所说的醚(图2)和Merrfield树脂仅显示出对于背景水分来说在3400 cm-1处的微弱信号。c．使衍生的树脂与硼酸反应
Figure A9719599100372
把二醇树脂(5g,5.5mmol的二醇)悬浮在THF(干燥的,500ml)、苯基硼酸(3.35g,27.5mmol,5当量)以及4筛子(在150℃下进行干燥)中。在氩气环境下搅拌过夜后，在一个密闭的系统中在氩气下过滤树脂，用THF(500ml)洗涤树脂并且在真空下进行干燥。Ft-L.R.(图4)显示出对苯环来说在1026cm-1处(芳基-烷基拉伸频率)的一个强烈的信号以及在3417cm-1处(与图3相比，针对起始的二醇)的一个微弱的信号。
参考文献：Leznoff,C.C．与Wong,J.Y.,在有机合成中聚合物载体的用途Ⅲ．在对称二醛的一个醛基上进行选择性的化学反应Can.J.Chem.,1973,51,3756-3764
                    *    *    *分析与活性数据
下面的表1含有与本发明有关的活性数据。在该表中，符号“Z”表示苯甲酸基羰基，而“NHir”指的是普通的水蛭素。“NHir49-64(des-S)”是指从普通水蛭素的第49个氨基酸到第64个氨基酸的氨基酸序列，其中天然的Tyr(OSO3H)63被Tyr代替。
通过与上述实施例1和2的制备化合物的相同或类似的方法制备出表1中所列的化合物，或者在中间体的情况下从各种来源获得所述化合物。
采用下面的技术来测量活性：血浆凝血酶时间(TT)
在37℃下将一份150μl柠檬酸盐的普通人的血浆和20 μl的缓冲液或样品保温1分钟。通过加入150μl最新制得的牛凝血酶(5NIHu/ml盐水)使凝结作用开始，并在凝结仪上记录下凝结时间。
使用pH为7.8、含有0.1％牛血清白蛋白和0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。将样品溶解在DMSO中并用缓冲液稀释。当不使用抑制剂时，向缓冲液中加入DMSO至与在所述样品中使用的同样的浓度。从对造成凝血酶时间加倍(40秒钟)的抑制剂浓度的测定中，在半对数图上画出抑制剂浓度对凝血酶时间的关系曲线。测定Ki
通过抑制所述酶对三种不同浓度的显色底物S-2238的催化水解来测定人α-凝血酶的抑制作用。
在37℃下将200μl的样品或缓冲液和50μl的S-2238保温1分钟，加入50μl的人α-凝血酶(0.25NIHμ/ml)。在4.5nm下记录受抑制和不受抑制的反应的初始速率。根据Lineweaver和Burke的方法绘制光密度增加的曲线。测出Km和表观Km并用下列关系式计算出Ki。
Figure A9719599100391
所用的缓冲液含有0.1M的磷酸钠、0.2M NaCl、0.5％PEG和0.02％叠氮化钠，并用正磷酸调节到pH 7.5。
所述样品由在DMSO中公开的化合物组成。
对测量Ki的进一步描述，读者可以参阅Dixon,M与Webb,E.C.,“酶”，第三版，1979,Academic Press，该公开内容并入本文作为参考。
                          表1
    kiμM      TTμM
98 GGDFEPIPL     n/e     100
 99[-BoroBrOPin]CO(CH2)3COGGGDFEPIPL     n/e     58
 105 GGGGDFEPIPL     n/e     94.9
 106GGGGGDFEPIPL     n/e     15
 107[-BoroBrOPin]OC(CH2)3COGGGGDFEPIPL     n/e     58.4
 108[-BoroBrOPin]OC(CH2)3COGGGGGDFEPIPL     n/e     63.4
 114 GGNSHNDGDFEEIPEEYL Hir49-64     0.613     2
 121 HO2C(CH2)3COGGGGGDFEPIPL     0.738     30.9
 128[-L-PheProBoroValOPin]OC(CH2)3COG5DFEPIPL     n/e 11.7     27.1
 129[-D-PheProBoroValOPin]OC(CH2)3COG5DFEPIPL     16.4     33.5
 137[-D-Phe-ProBoroEtgOPin]OC(CH2)3COG5DFEPIPL     1.23     10.2
 166[-D-Phe-ProBoroBpgOPin]OC(CH2)3COG2NHir49-64(des-S)     0.000649     0.029
 167 Hir49-64(des-S)     n/e 0.155     N.T.
 175[-D-Phe-ProBoroBpgOPin]OC(CH2)3COG4NHir49-64(des-S)     0.00211     0.065
 176 Z-D-Phe-Pro-BoroBpgOPin+Hir49-64     0.0218     O.636
 182[-D-Phe-ProBoroCegOPin]OC(CH2)3COGPGGNHir49-64(des-S)     0.00271     N.T.
 184 HO2C(CH2)3COGPGGNHir49-64(des-S)     12.7     56.7
 185[-D-Phe-ProBoroCegOPin]OC(CH2)3COGPG3NHir49-64(des-S)     n/e 0.75     7.36
 186[-D-Phe-Pro-BoroCegOPin]OC(CH2)3COGPG3NHir49-64(des-S)     n/e 0.9     4.61
 267[-PheProBoroCegPin]OC(CH2)3COG2(EDFEPIPL)     0.762     4.9
 268[-Pglp(OEt)2]OC(CH2)3COG2(EDFEPIPL)     n/e 88.8     66.5
[-D-PheProBoroIrgOPin]OC(CH2)3COG2NHir49-64(des-S)     N.T.     N.T.
n/e=没有效果n/e 11.7=浓度在11.7μM以下时没有效果N.T.=没有检测

Claims (21)

1．一种制备肽或含肽化合物的方法，该方法包括进行下列步骤以制备出靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的官能团的固相；
(ⅱ)引起可以与所述官能团反应的化合物选择性地与该官能团反应，反应得到的化合物具有能够与氨基或者与羧基反应的官能团或其反应性衍生物；
(ⅲ)引起靶氨基酸序列的末端氨基酸的氨基或羧基(可以为其具有反应性的衍生物的形式)选择性地与所述反应得到的化合物的所说官能团反应；
(ⅳ)将在所述靶序列中依次在偶联于所述固相上按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸偶联到所说的在前氨基酸上；
(ⅴ)通常按照需要重复步骤(ⅳ)；以及
(ⅵ)通过酸或碱的作用从所述固相上切掉使用步骤(ⅰ)-(ⅳ)制得的连接到固相上的化合物，
其特征在于在从所述固相上切掉化合物之前，将包括硼酸基团[-B(OH)2]或酯或其它衍生物的化合物结合到所述与固相连接的化合物上。
2．权利要求1的方法，其中例如作为常规的固相肽合成的一部分，步骤(ⅱ)包括使氨基酸的氨基或任意衍生得到的羧基与直接或间接偶联到固相上的官能团反应。
3．权利要求1的方法，其中含有硼酸基团的所述化合物为氨基酸硼酸、肽的硼酸酯或所述两种物质之一的硼酸酯，并且步骤(ⅱ)包括将所述氨基酸或肽的硼酸或酯与偶联到所述固相上的二醇反应以便例如适当地通过一个接头生成具有偶联于其上的下列通式部分的固相：
Figure A9719599100021
其中R’为天然或者非天然氨基酸或其类似物的残基，所述类似物可以任意地用另一种官能团代替其氨基，所述官能团能够形成除天然肽键之外的键和/或其α-氢原子被代替。
4．一种用于制备包括肽的硼酸或者肽的硼酸酯的化合物的方法，该方法包括：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的醇羟基的固相；
(ⅱ)引起氨基酸的硼酸或肽的硼酸与所述羟基反应，由此将硼酸残基酯化到所述固相上；
(ⅲ)引起在最终产品肽的硼酸或硼酸酯中依次在后的所述氨基酸的羧基选择性地与偶联到所述固相上的按顺序在前氨基酸的氨基反应；
(ⅳ)通常按照需要重复步骤(ⅲ)；
(ⅴ)从所述树脂上切掉所述得到的肽的硼酸化物，该方法可以任选地包括一个或多个其它的步骤以制备所说的化合物。
5．权利要求4的方法，其中偶联到所述固相上的每个氨基酸具有进行了保护的氨基，并且步骤(ⅲ)包括去掉对所述按顺序在前的氨基酸的所述氨基的保护和/或用酸或通过酯基转移作用进行步骤(ⅴ)的所说的切割。
6．氨基酸或肽的硼酸或硼酸酯在含肽化合物的固相合成中的用途。
7．通过羟基残基连接到固相上的硼酸残基在固相合成中的用途。
8．一种用于制备包括硼原子的化合物的方法，该方法包括：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的醇羟基的固相；
(ⅱ)引起硼酸或硼酸酯与所述羟基反应，由此将所述的硼酸残基酯化到所述固相上；以及
(ⅲ)进行一个或多个其它的步骤以制备所说的化合物。
9．一种具有通过羟基偶联于其上的硼酸残基的固相物质。
10．一种具有偶联于其上的下列通式部分的固相物质：
Figure A9719599100041
其中R为连接到所述硼原子上的残基，并且可以任选地将所述氧直接连接到所述的亚烷基残基上或者羰基上，其中通过所述氧把所述部分连接到所述固相上，而所述的亚烷基残基可以任意地进行惰性取代。
11．一种双官能丝氨酸蛋白酶抑制剂，它包括：
(a)一个结合并且抑制丝氨酸蛋白酶的活性位点的定向催化位点的部分(CSDM)；
(b)一个外在位点相关部分(EAM)；以及任选的
(c)在所述EAM和所述CSDM之间连接的连接物部分，所说的CSDM和所说的EAM能够同时结合到所述丝氨酸蛋白酶的分子上，但其前提条件是所说的抑制剂不是凝血酶抑制剂。
12．一种权利要求11的抑制剂，其中所说的CSDM具有P1残基和(P4)P3P2残基，所述P1残基为Arg,Lys或其类似物或者为疏水性残基，而所述(P4)P3P2残基选自下列物质：     残基序列 D-Tyr-/NaSO2-Pro的D-Phe-/取代的D-Phe-/D-Dpa-/Dba-/Pms-/α-Nal-/β-Nal-/TMSal-/Chg-/Phg-/D-Tiq-/对-醚 IleuGluGly,PyroGluGly,ArgGly,ChaGly,LeuArg  L-PhePhe,NalPhe,D-TiqPhe,NalThr,NalPhg  ValVal γ-BzlGluGly,Glu(OBzl)Ala,GlyArg,GlyLys  GlnGly  PhePro,GluGly  LeuSerThr
13．一种权利要求11或权利要求12的抑制剂，其中所说的EAM为选自下列序列的氨基酸序列： YIDGR--IVEGSDAEIGMSPWQ  AIEGR--TATSEYQTFFNPRTFGS  SKPQGR--IVGGKVC  NLTRR--IVGGQECKDGEC  NLTRR--IVGGQECKDGEC  SKLTR--AEAVFPDVDYVN  FNDFT--VVGGEDAKPGQF  KIKPR--IVGGTASVRGE  KTSTR--IVGGTNSSWGE  ELR--MKNNEEAEDYDDDLTDSEMD  PKKCPGR--VVGGCVAHPHSWPWQVSLRT
14．一种权利要求1至3之任一的抑制剂，其中所说的连接物部分具有下列通式：
                 -λ-σ-其中λ为通式为HO2C(CH2)hCO2H的非肽接头的残基，其中的h为2至6，而σ为至少包括两个相邻的Gly残基的肽的间隔臂。
15．一种制备权利要求11至14的任一抑制剂的方法，该方法包括进行下列步骤以制备靶氨基酸序列：
(ⅰ)提供一种具有偶联于其上的能够与氨基、或者优选与羧基反应的官能团或其反应性衍生物的固相；
(ⅱ)引起所述靶氨基酸序列的末端氨基酸的氨基或羧基选择性地与所说的官能团反应，所述的羧基可以任选为其反应性衍生物的形式；
(ⅲ)将在所述靶序列中依次在偶联到所述固相上的按顺序在前的氨基酸之后的氨基酸偶联到所说的在前氨基酸上；以及
(ⅳ)通常按照需要重复步骤(ⅲ)。
16．一种权利要求15的方法，该方法还包括步骤(ⅴ)，即通过具有能够与氨基反应的两个官能团的化合物将步骤(ⅲ)所说的依次在后的氨基酸偶联到该步骤所说的在前氨基酸上，由此把所说官能团中的一个官能团结合到所说的在前氨基酸的氨基上、而把另一个官能团连接到所说在后的氨基酸的氨基上。
17．一种权利要求14或权利要求15的方法，其中与连接到所述固相上的所述官能团反应的末端氨基酸为所述EAM的C-末端氨基酸，并且重复步骤(ⅲ)以便偶联所述EAM序列的连续的氨基酸以及任意邻接的连接物肽的连续氨基酸。
18．一种权利要求15至17的任一方法，其中将偶联到所述固相上的没有间断的氨基酸序列的最后一个氨基酸与具有两个羧化物的基团或其反应性衍生物的化合物反应，并且未反应的羧化物或羧化物的衍生物通常与氨基酸的氨基反应，所述氨基酸为所述CSDM的N-末端氨基酸。
19．一种权利要求18的方法，其中已经把所说的N-末端氨基酸连接到所述CSDM的残基上，并且所述CSDM具有杂原子基团以代替C-末端羧基。
20．一种药物配方，该配方包括配制的权利要求1至4的任一抑制剂以用作人药或兽药，所述配方可以选择性地包括药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
21．一种通过治疗或预防能够经抑制丝氨酸蛋白酶来治疗的身体疾病或紊乱的治疗方法，该方法包括例如通过口腔或者肠胃外把治疗或者预防有效量的权利要求1至4的任一抑制剂给药于人或动物患者。
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