CN1125450A - 因子vii衍生的肽 - Google Patents

因子vii衍生的肽 Download PDF

Info

Publication number
CN1125450A
CN1125450A CN94192475A CN94192475A CN1125450A CN 1125450 A CN1125450 A CN 1125450A CN 94192475 A CN94192475 A CN 94192475A CN 94192475 A CN94192475 A CN 94192475A CN 1125450 A CN1125450 A CN 1125450A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
compound
formula
fvii
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN94192475A
Other languages
English (en)
Inventor
R·W·思特芬斯
L·奥宁
K·S·萨卡里森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hafslund Nycomed AS
Original Assignee
Hafslund Nycomed AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB939312601A external-priority patent/GB9312601D0/en
Application filed by Hafslund Nycomed AS filed Critical Hafslund Nycomed AS
Publication of CN1125450A publication Critical patent/CN1125450A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于预防或抑制组织因子与FVII结合的化合物，它包含式(IA)：-CVNENGGCEQYCSD-，(IB)：-FCLP-AFEGRNCE-和/或(IC)：-RCHEGYSLLADGVSCT-氨基酸序列及其肽片断，酯，酰胺，盐和环状衍生物，功能类似物和在上述序列或片断的末端携带氨基酸或肽的延伸肽链。

Description

因子VII衍生的肽
本发明涉及减小血凝块形成的肽试剂及其组合物。
血凝集依赖于一系列或者连锁的最终产生纤维蛋白凝块的激活反应。开始，可用两种不同的途径—通过与异常的表面接触(“体内途径”)或通过已知称作“组织因子”或TF的引起脂蛋白分泌的血管外伤(“体外途径”)—来触发引起纤维蛋白形成的连锁反应。本发明主要涉及体外血凝集途径。
TF是一种在很多种类的细胞上都可见到的组成膜蛋白。然而，在组成上表达TF的细胞，例如血管内膜的肌细胞，在正常情况下不暴露到血液中(见Edgington等人，Thromb.Haemostas.66(1)：67—69(1991))。因此可见，体外血凝集途径的开始要求血管壁破裂(见Almus等人，Blood76：354—360(1990))和/或激活表达TF的内皮细胞或单核细胞(见Edwards等人，Blood54：359—370(1979)和Bevilaqua等人，PNAS USA 83：4533—4537(1986))。由于将组织巨噬细胞和平滑肌细胞暴露到血液中的动脉粥样硬化斑的破裂，可引起血管细胞壁的破裂(见Wilcox等人，PNAS USA 86：2839—2843(1989))。在溶栓治疗，移殖手术，机械修复血管未闭或其它类似的操作期间，TF随着损害的进行也暴露到血管中。另一方面，在引起肿块性坏死因子—α或白细胞介素—1产生的脓毒病期间，可以诱导内皮细胞或单核细胞中TF的表达(见Edwards等人，Supra和Gregory等人，J.Clin.Invest.76：2440—2445(1985))。
在体外血凝集途径中，涉及丝氨酸蛋白酶因子VIIa(FVIIa)。通过其它参与凝血过程的物质，包括因子Xa，因子XIIa，因子IXa或凝血酶，对不活跃的酶原因子VII(FVII)进行蛋白水解产生FVIIa。已有报道，当FVII与其辅因子组织因子(TF)结合时，明显促进FVII向FVIIa的激活(见Nemerson，Semin.Hematol.29(3)：170—176(1992))。Yamamoto等人也已经提出FVII向FVIIa的转化可自身催化(见J.Biol.chem.267(27)：19089—19094(1992))。
在钙离子存在下，FVIIa与TF形成复合物并且在经体外途径进行凝血过程的下一步，FVIIa/TF复合物催化因子X转化为它的活泼型—因子Xa。
已有人研究了FVII的结构并且Hagen等人在PNAS USA83：2412—2416(1986)中报道了cDNA序列。FVII是维生素K依赖蛋白并且根据其它类似维生素K依赖蛋白，已在氨基端识别出称作γ—羧基谷氨酸(Gla)区，又根据其它类似维生素K蛋白，要求Gla区与TF结合(见Hagen等人，supra)。要求Gla区接着两个潜在的生长因子(GF)区。然而，文献没提示GF区的任何功能。
已有人提出，血凝块形成体外途径的激活是导致纤维蛋白形成的首要因素(见Weiss等人Blood71：629—635(1 988)和Weiss等人Blood 73：968—975(1989))并因此是冠状动脉粥样硬性损害的发病机理和动脉内膜切除术后再闭塞和再狭窄的关键。然而，能够干涉该途径激活的有效的治疗剂不是可得到的，尽管需要(见Shepard，TIBTECH9：80—85(1991))。
本发明提供抑制FVII或FVIIa与TF缔合的肽和类似物或其盐。通过本发明肽的作用，限制FVIIa/TF复合物的形成并因此减小因子X的激活。
开始用于血凝集治疗的某些肽公开于WO—A—91/07432Board of Regents，The University of Texas System。公开的肽或产生于Gla和第1个GF区之间的区域或产生于FVII或FVIIa的催化区。尽管讨论抑制FVIIa/TF复合物形成，WO—A—91/07432中公开的引起这种作用的那些肽，经过抑制Gla区的功能也发挥抑制作用。因此，这些肽的作用是非专一的，因为其它生理蛋白也有Gla区，例如蛋白C具有与FVII的Gla区接近的同源序列。因此，蛋白C的功能也可能被WO—A—91/07432中公开的肽，以不需要的方式扰乱。
在WO—A—90/03390中，Corvas Inc.提出，某些从FVII(或FVIIa)的氨基酸序列衍生的肽可用于阻止完全形成的FVIIa/TF复合物的作用。WO—A—90/03390中讨论了两个特殊的肽序列，因它们在这方面是活泼的。位于羧基端附近的序列—VGHFGV—基于FVII的372—377号氨基酸。其它序列—SDHTGTKRSCR—落在FVII的103—113号氨基酸并且是第二个GF区一部分。Corvas Inc指出，这些肽及其类似物抑制由FVIIa/TF复合物开始的连锁反应。
进一步，在WO90/03390第14页表1中表明，在第二个GF区的各个区段中，在通过因子VII和组织因子抑制因子X的激活方面，只有SDHTGTKRSC(103—112)是活泼的，其它区段，即从氨基酸50—101和114—127都是不活泼的。
然而，我们证明，与Corvas Inc报道的发现相反，从103—112的SPHTGTKRSC区段是因子VII与组织因子结合的相当弱的抑制剂，并且事实上，某些所述的不活泼区段是非常活泼的。
我们最初的发现是用精氨酸代替100号位置的氨基酸谷氨酸，观察16名FVII缺乏的挪威病人FVII的点突变并指出FVII分子的这个部位对FVII的活性是重要的。我们首先确定氨基酸序列91—102是特别活泼的并且在使用上可能也包括103和104。然后我们发现，也在GF区上的氨基酸序列114—127是比较活泼的，而Cor-vas序列103—112仅有中等活性。
随后我们发现，氨基酸序列72—81协同促进序列91—104肽的抑制作用，并且主要利用从72—81区段衍生的肽的这种协同联合作用。
进一步已经发现，上述序列的片断也具有抑制作用并且通常上述序列的5个或更多个氨基酸的片断将用于抑制FVII的活性。
因此，本发明涉及肽，它包含式—CVNENGGCEQYCSD—(IA)，—FCLPAFEGRNCE—(IB)和/或—RCHEGYS-LLADGVSCT—(IC)的氨基酸序列及其肽片断，特别是含有5个或更多个氨基酸的片断，酯，酰胺，盐及其环状衍生物，功能类似物和在上述序列或片断的末端携带氨基酸或肽的延伸肽链。
本发明的特征是提供如上定义的序列IA，IB和/或IC肽，排除肽CVNENGGCEQYC(IIA)，CLPAFEGRNC(IIB)和CHEGYS-LLADGVSC(IIC)，为了方便.适当时将式IA，IB和IC化合物及其各种衍生物和片断称作肽IA化合物，肽IB化合物和肽IC化合物。
式IA，IB和/或IC肽序列的片断尤其包括，—VNENG—，—ENGGC—，—GGCEQ—，—CEQYV—，—NGGCEQYCSD—，—GGCEQYCSD—。
我们的研究证明，在氨基酸序列91—104的肽中，氨基酸95是重要的并且就试验的范围而言，序列95—104的肽是最活泼的抑制剂。这就是NGGCEQYCSD。
根据Corvas Inc.在WO90/03390中公开的内容，排除式IIA，IIB和IIC的肽，尽管已阐述其零抑制活性。显然，在WO90/03390中没有提出，制备任何相关的肽，包括其片断或延长链，对于用来与血凝集疾病斗争有任何好处。
根据WO90/03390对式IIA和IIB肽零抑制活性不正确的报道，本发明一方面提供如上定义与组织因子结合并因此阻止或抑制组织因子与FII的结合的式IA和/或IB化合物治疗或诊断用途。至于肽IC化合物，将仅与肽IA或IB化合物一起使用。为了清楚，强调式IIA，IIB和IIC化合物也包括在这种使用中。
本发明进一步的特征是提供可有可无地与上述定义的式IC肽结合的如上定义的式IA和/或IB肽。
本发明更进一步方面是提供使用上述定义的式IA和/或IB化合物，可有可无地与式IC肽一起来制备预防或抑制组织因子与FII结合的药用组合物。
如上所述，式IA序列的肽是最活泼的，但它们的活性可通过与式IB和/或IC肽和片断及其其它衍生物合用而被协同加强。在这种联合使用中，可以简单地将肽混合在一起或者可以通过共价键连接，例如通过半胱氨酸残基之间或间隔的肽之间的二硫键。
本发明肽的酯包括C1-6烷基酯和容易裂开酯基如本文列出的保护羧基的那些。
连接在本发明肽末端的氨基酸或肽可以携带功能基，如保护基。
本发明肽的盐包括生理可接受的盐如酸加成盐，如盐酸盐。
在上述提到的序列中，标准的字母代号用于指天然产生的氨基酸。该代号是本领域的标准名称并可在任何标准生化课本中找到，如由W.H.Freeman和Company出版的“生物化学”stryer。
这些肽的功能类似物也包括在本发明范围内在本技术领域内公知，某些氨基酸在功能上是相同的并且已经常看到这些功能相同的肽的互换不引起蛋白功能的减小。而且，某些非关键性的氨基酸也可以代替并无任何或任何显著的功能丢失—甚至那些氨基酸已经由化学上不相似的氨基酸代替。进一步，天然产生的氨基酸的化学变更是已知的，并且这些分子的取代物也包含于本文使用的术语“类似物”中。
在上述式I序列中，任何“C”代表的氨基酸半胱氨酸都可以由丙氨酸代替(用“A”表示)。因此，特别有益的氨基酸包括—ENGGA—，—GGAEQ—和—AEQYV—。
另外，从式IA，IB和/或IC序列衍生的肽包括嵌合的衍生物，其中将式I序列中两个在正常情况下非毗连部分(含两个或更多个氨基酸)并列起来。这种嵌合序列的实例为—EQYVNE—。
可有可无地，本发明化合物可以是环状的，所提供的与TF结合的序列在构造上适用于结合。通过适宜的化学方法包括，例如在两个半胱氨酸氨基酸之间形成二硫键，可以达到环化的目的。从式I衍生环状肽的一个实例为CVNENGGCEQYC。
本发明也提供含一个或多个肽或类似物或其盐的药用组合物，所述肽的氨基酸序列含或衍生于上述式IA，IB和/或IC序列。可以与本专业技术人员已知的任何生理上可接受的赋形剂一起给予本发明肽，适宜赋形剂的实例包括水和油。
例如，本发明组合物可以为适于口服，鼻腔，非肠道或直肠给药的任一形式。
本文使用的术语“药用的”包括本发明的兽医应用。
本发明化合物可以为常规药理给药形式，如片剂，包衣片，鼻腔喷雾剂，溶液剂，乳浊液，粉剂，胶囊或缓释剂型。可使用常规的赋形剂和生产方法来制备这些剂型。例如，可以通过混合活性组分或含已知赋形剂的组分来生产片剂，赋形剂的例子为稀释剂，如碳酸钙，磷酸钙或乳糖，崩解剂如玉米淀粉或藻酸，粘合剂如淀粉或明胶，润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉，和/或产生缓释的试剂如羧基聚亚甲基，羧甲基纤维素，乙酸邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。
如果需要，片剂可以由几层组成。通过用常见的片剂包衣剂，例如聚乙烯吡咯烷酮或紫胶，阿拉伯胶，滑石粉，二氧化钛或蔗糖，包衣用类似于片剂的方法得到的片心，可以生产包衣片剂。为了获得缓释或避免配后禁忌，片心也可以由几层组成。为了获得缓释，片剂的包衣也可以由几层组成，在层中可包入上述片剂赋形剂。
也可以使用器官特异载体系统。
例如，可以用常规的方法来生产注射液，也通过加入防腐剂如对羧基苯甲酸酯，或稳定剂如EDTA。然后将溶液过滤加入到注射小瓶或安瓿中。
鼻腔喷雾剂可用类似于水溶液的方法制备并装入或含气溶胶推动剂或装自手工压缩设备的喷雾溶器中。例如，通过将活性组分与惰性载体如乳糖或山梨醇混合并将混合物装入明胶胶囊中可生产含一种或几种活性组分的胶囊剂。
例如，通过混合活性组分或合并适合目的的常规载体的活性组分，可以生产适宜的栓剂，载体的例子如天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物。
含本发明化合物的剂量单位优选含0.1—10mg例如1—5mg的式I肽或其盐。
如上所述，本发明一方面提供用于治疗或预防血凝性疾病或问题的本发明肽(包括类似物或其盐)。血凝性疾病包括血栓形成(尤其血管血栓形成或深静脉血栓形成)，急性心肌梗塞，再狭窄，再闭合，心绞痛，脑血管疾病，外周动脉栓塞性疾病，高凝固性和肺栓塞。本发明肽也用于预防，例如由在溶栓治疗，移植手术，血管未闭修复等期间损害血管引起的血凝问题的发生。脓毒症由于产生TNF—α或IL—1可触发血凝性疾病。
本发明更进一步提供治疗哺乳动物(优选人，动物体)血凝病的方法，所述方法包含给予所述的动物体一种或多种上述式IA，IB和/或IC肽，并包括式IIA，IIB和/或IIC化合物或类似物或其盐。也提供预防治疗的方法，例如在外科手术或其它侵害操作期间，通过给予病人本发明肽来预防或减小可能的血凝问题的发生。当然在正常情况下，以可药用组合物的形成给予肽。
另一方面，本发明提供制备含式I序列或由它衍生的序列，或类似物或其盐的肽的方法。
可以按任何方便的方法合成本发明肽。通常在整个合成期间，保护存在的反应基(例如氨基，硫羟基和/或羧基)。因此，合成的最后步骤为将保护的本发明肽的衍生物脱保护。
在增大肽链中，原则上我们可以或者在C端或者在N端开始，尽管通常只使用C端开始的步骤。
因此，通过适宜保护的，例如赖氨酸的衍生和适宜保护的半胱氨酸或胱氨酸的衍生物的反应，可以在C端开始合成。赖氨酸将有一个游离的α—氨基，同时其它的反应物将也有一个游离的或激活的羧基和保护的氨基。偶合的，例如可通过层析来纯化中间体并接着选择性地脱保护以便可以进一步加入氨基酸残基。继续该过程直到完成要求的氨基酸序列。
例如，可使用的羧酸激活物质包括匀称的或混合的酐，或激活的酯如对硝基苯酯，2，4，5—三氯苯酯，N—羟基苯并三唑酯(OBt)，或N—羟基—琥珀酰亚胺酯(OSu)。
例如，用二环已基碳二亚胺(DCC)可实现游离氨基和羧基的偶联。例如，可以使用的另一个偶联剂是N—乙氧羰基—2—乙氧基—1，2—二氢喹啉。
通常在低温，例如—20℃到室温，用适宜的溶剂系统，例如四氢呋喃，二噁烷，N，N—二甲基甲酰胺，二氯甲烷或这些溶剂的混合物，实现偶联反应是方便的。
在固相树脂载体上进行合成可以更方便。氯甲基化的聚苯乙烯(由1％二乙烯基苯交联的)是一种使用的载体；这样的话，例如通过将从端保护的赖氨酸结合到载体上，在C—端开始合成。
在Eric Atheron，Christopher J.Logan，和Robert C.Sheppard J.Chem.Soc.Perkin 1，538—46(1981)；James P.Tam，Foe S.Tjo-eng，和R.B.Merrifield J.Am.Chem.Soc.1026117—27(1980)；James P.Tam，Richard D.Dimarchi和R.B.Merrifield Int.J.PeptideProtein Res.16 412—25(1980)；Manfred Mutter和Dieter Bellof，Helvetica Chimica Acta 67 2009—16(1984)中描述了许多适宜的固相技术。
广泛选择的氨基酸保护基是已知的并且在下列文献中例举：Schroder，E.，和Lubke，k.，The Peptides，Vols.1和2，AcademicPress，New York和London，1965和1966；Pettit，G.R.，SyntheticPeptides，Vols.1—4，Van Nostrand，Reinhold，New York 1970，1971，1975和1976；Houben—Weye，Methoden der Organischen，Chemie，Syn these von Peptiden，Band15，Georg Thieme verlag，stutl gart1974；Amino Acid，Peptides和Proteins，Vol.4—8，TheChemical Society，London 1972，1974，1975和1976；Peptides，Spthesis—physical date1—6，Wolfgang Voelter，Eric Schmiclt—Siegman，Georg Thieme Verlage Stuttgart，NY，1983；The peptides，Analysis，synthesis，biology1—7，Ed：Erhard Gross，JohannesMeienhofer，Academic Press，NY，San Fransisce，London；solidphuse Peptides Synthesis nd Led.，John M.Stewart，Janis D.Young，Pierce Chemical Company。
因此，例如可使用的胺保护基包括保护基如苄酯基(下文也称作Z)，叔丁氧基羰基(下文也称作(Boc)，4—甲氧基—2，3—6—三甲基苯磺酰基(Mtr)和9—芴基甲氧基羰(下文也称作(Fmoc)。可以看出，当从C端延伸肽时，胺保护将存在于每个新加入残基的α—氨基上并且在接下来的偶联步之前有选择地除去。这种暂时性胺保护特别常用的一个基团是Fmoc基，它可以通过溶在有机溶剂中的呱啶的处理而有选择地被除去。
例如，可以使用的羧基保护基包括容易裂开的酯基如苯甲基(Bzl)，对一硝基苯甲基(ONb)，五氯基苯基(OPCIP)，五氟基苯基(OPFP)或叔丁基(OtBu)以及连接到固体载体上的基团，如连接到聚苯乙烯上的甲基。
硫羟基保护基包括对一甲氧基苯甲基(Mob)，三苯甲游基(Trt)和乙酰氨基甲基(Acm)。
例如，如上述参考文献中所述，存在其它广泛的这种基团范围并且在上文所述的过程中所有这些基团的使用都属于本发明的范围内。
存在广泛的除胺或羧基保护基步骤，然而这些必须与使用的合成策略相一致。侧链保护基对在接下来的偶联步之前除去暂时性α—氨基保护基所使用的条件必须是稳定的。
通过酸处理，例如用三氟乙酸处理，可除去胺保护基如Boc和羧基保护基如tBu。用氧化剂如碘，可以选择性地除去硫羟保护基如Trt。
仅以说明的方式给出下面的实施例。
图1说明用不同的FVII肽和FVII肽类似物抑制血凝。
图2显示FVII/TF活性和肽FVII—5之间剂量一反应关系。
图3是FVII/TF活性和肽FV—5d之间剂量一反应关系。
图4显示在不同浓度的FVII—5下抑制因子X的激活。
通过下列非限定实施例进一步说明本发明。
在实施例中使用下列缩写：
TFA：三氟乙酸
BocAA：叔丁氧基羰基保护的氨基酸
Bop：苯并三唑—1—基氧基—三—(二甲基氨基)—鏻—六氟磷酸盐。
HOBT：N—羟基苯并三唑
DIEA：二异丙基乙胺
DCM：二氯甲烷
NEM：N—乙基马来酰亚胺
EDTA：乙二胺四乙酸
DMF：二甲基甲酰胺
实施例1一般肽的合成
通过固相化学的标准步骤来合成所用的肽并通过制备型HPLC来纯化。通过分析型HPLC，氨基酸分析和质谱分析来检测每种肽的纯度。全部为Neosystems Laboratorire(Strasbourg，France)的产品。
组合肽并用下列一般步骤断开。
所用的树脂为4—甲基二苯甲基胺(批号R2161)开始装载0.9meq/g。对于每种肽而言，所用的初始树脂为450mg(0.4mmol)。1.组合
中和后，使用下述偶联/脱保护的原始记录(体积：每种溶剂10ml)。
a)纯TFA                              1分种
b)纯TFA                              3分钟
c)流动洗涤二氯甲烷
d)异丙醇                             0.5分钟
e)二甲基甲酰胺(DMF)                  0.5分钟(3次)
f)二甲基甲酰胺流动洗涤偶联
将5eq的BocAA，BOP和HOBT溶解在5mlDMF中并加到树脂中。开始起泡后加入0.5ml二异丙基乙胺并连续搅拌13分钟。经2次的DMF洗涤后，在同样的条件下进行双偶联(doubleCoupling)。乙酰化
在最后的脱保护步骤后，用溶解在10ml DMF中的10eq乙酸酐和10eq.DIEA进行乙酰化。
反应时间：10分钟。
完成组合后，立即用DMF、DCM醚洗涤树脂并在氮气流下干燥。2.裂解
将肽从树脂上裂解下来并在0℃下用HF/苯甲醚(体积比为9/1。每克的肽树脂加10ml)处理45分钟。
蒸去HF并用醚沉淀后，将粗品溶解在纯TFA中并过滤。
在减压下蒸去TFA并再用醚沉淀肽。在这步，将产品准备好进行纯化。3.纯化和分析
在反向C18柱上(15—25μm)，用线性梯度的乙腈/水(0.1％TFA)，通过HPLC法纯化每种肽。合并纯度大于95％的馏分并冷冻干燥。通过HPLC来分析纯化的肽并且水解一份样品用于氨基酸分析。在每种肽的分析数据记录单上记录结果。
纯化用的基本策略总是相同的。只有制备型纯化中使用的梯度不同，它依赖于各个肽的初期保留时间。实施例2肽FVII—5
所用的树脂是Boc—Cys(4—Mel3zl)—PAM树脂(批号52172)，初始装载量为0.63meq/g。所用初始树脂量为0.96g(0.6mmol)。
所使用的组合/偶联/裂解步骤与上述步骤相同，并具有下述改变：1.组合
a)含55％TFA的DCM                    5分钟
b)含55％TFA的DCM                    25分钟2.裂解
用醚沉淀后，用30ml10％醋酸水溶液洗涤肽树脂并冷冻干燥。3.纯化—环化
溶剂组成：
A：0.1％TFA的水溶液
B：乙腈/溶剂A(体积比60/40)。
在反向HPLC上，用乙腈/水(0.1TFA)，10—80％的B预先纯化粗品30分钟。
合并含纯度大于80的线性肽的所有馏分并用水调至体积为0.5升。用DIEA调节溶液的PH为8.5并在磁性搅拌下，在室温放置过夜。通过一起注入反应混合物样品和N—乙基马来酰胺(NEM)开始环化反应。
24小时后，结束环化。用醋酸将PH减低到2.5并在冷干前，在减压下浓缩溶液。
通过PR—HPLC将环状肽纯化至95％以上(5—30％的B线性洗脱30分钟)。
通过分析型HPLC，氨基酸分析和质谱分析来控制最终产品的纯度和同一性。实施例3肽FVII—1
用Fmoc/t—But策略，从90mg的Fmoc—Ala—Wang树脂(0.67meq/g)开始合成该肽。1.组合
用下列原始记录来脱保护/偶联：
a)含25％哌啶的DMF                           2分种
b)流动洗涤DMF
c)含25％哌啶的DMF                           4分钟
d)流动洗涤DMF
e)含25％哌啶的DMF                           6分钟
f)流动洗涤DMF                               重复5次
2.偶联
将5eq的Fmoc—AA，BOP和HOBT溶解在3ml的DMF中并加到树脂中。开始冒泡后，加入0.13mlDIEA并继续偶联13分钟。2次DMF洗涤后，如上所述进行双偶联。3.裂解
通过用5mlTFA(83.3％)，水(4.2％)，茴香硫醚(4.2％)乙二硫醇(2.1％)和苯酚(6.25％)的混合处理2.5小时，完成肽的裂解和脱保护。过滤后，将该混合物倾入25ml冷醚中。离心沉淀的肽并用醚洗涤两次。将产品溶解在水中，冻干并无需进一步纯化而使用。实施例4
用类似于实施例1所述的步骤来生产其它合成肽。
表1列出所有的合成肽。
                       表1因子VII肽名称                   序列                   在FVII中的残基数FVII-12                LFWISYSD               39-46FVII-21                WISYSDGD               41-48FVII-23                SYSDGD                 43-48FVII-2                 YSDGDQC                44-50FVII-7(cyclic)         CASSPCQNGGSC           50-61FVII-13                KDQLQSYI               62-69FVII-8(cyclic)         CLPAFEGRNC             72-81FVII-9                 NCETHKDDQLICV          80-92FVII-5(linear)         CVNENGGCEQYC           91-102FVII-5(cyclic)         CVNENGGCEQYC           91-102
5A                  VNENG                 92-96
5B                  ENGGA                 94-98
5C                  GGAEQ                 96-100
5D                  AEQYV                 98-102
5E                  EQYVNE                99-101+92-94FVII-10                NGGCEQYCSD             95-104FVII-10A               GGCEQYCSD              96-104FVII-10B               GCEQYCSD               97-104FVII-10C               CEQYCSD                98-104FVII-10D               EQYCSD                 99-104FVII-4                 SDHTGTKRSCR            103-113FVII-4B                SDHTGTKRS              103-111FVII-6(cyclic)         CHEGYSLLADGVSC         114-127FVII-1                 GKIPILEKRNA            136-146FVII-11                DKIKNWRNLIA            196-206FVII-3                 VGHFGV                 371-376
实施例5
FVIIa/TF活性的分析
在22℃下，在0.1M pH7.2的Tris.Hcl缓冲液中预先恒温培养肽(0—1mM)和组织因子(ThromborelR，Behringwork，Marburg，Germany；最终浓度为0.2％)30分钟，加入因子X(American Diag-nostica Inc.，Greenwich，CT USA；70nm)，接着加入FVIIa(Diag-nostica Stago，Asnieres，France；8PM)和Cacl2(5mM)。继续恒温培养30分钟并用可除去必需Ca2+的EDTA(50mM)中止反应。通过控制chromegenic Fx底物S—2222(Chromogenix，Molndal，Sweden)的水解来确定产生的Fxa。
结果见图1。
实施例6
用实施例5所述的分析方法来研究不同浓度的肽FVII—5的作用。用肽FVII—5D重复实验。
结果分别见图2和3。
实施例7
研究FVII—5抑制Fx激活的动力学。在含或不含TF和FVIIa下，不同浓度的FVII—5与不同浓度的因子X一起恒温培养。
结果见图4。两图根据相同的数据并且两图都表明FVII—5非竞争性抑制因子X激活，因此表明抑制作用在比因子X结合早的步骤发生，即抑制作用发生在FVIIa/TF复合物形成时。
实施例8分析apoTF/FVIIa的催化性
用比色分析直接测定当纯化的人FVIIa在磷脂存在下结合到重组人TF时的amidolytic(催化)活性。原始记录
在微量滴定板孔内，用200μl的最终培养体积进行反应。在室温下，将溶解在水中的试验化合物(最终浓度0—1mM)与重组人组织因子(American Diagnostica，cat#4500；5nM)和在pH7.2的Tris缓冲剂中，含Nacl(150mM)和BSA(1mg/ml)的Cacl2(5mM)一起预先恒温培养30分钟。加入因子VIIa(Enzyme Research Laboratories，cat # MFVIIa；5nm)并继续恒温培养60分钟。加入Chromogenic底物；S2288(chromogenix cat#820852；0.5mM)并在405nm处测定组织因子脱辅基蛋白/因子VII复合物(apoTF/FVIIa)的酶促性。实施例9分析HT1080细胞表面TF/FVIIa催化的Fx的激活
用该分析系统来测定在细胞膜内表面TF的活细胞的表面上的，天然TF/FVIIa复合物的催化性。按照FXa的amidolytic(催化)活性来测定该活性，FXa是通过细胞表面TF/FVIIa对加入的FX的作用而产生的。本分析中所选用的细胞系为人纤维肉瘤HT—1080(American Type Culture Collection CCL121)。原始记录
将HT—1080细胞悬浮在含血清的少量介质中并以约50—100个细胞/微型载体的比率与微型载体(Cytoclex—3 Pharmacia)混合。通常在2小时内，细胞粘着在微型载体上并能转移到含大量培养基的标准转动瓶中。用无钙缓冲剂洗涤微型载体细胞制剂两次，以便除去结合的血清因子。九种不同的试验洗涤缓冲剂中，当考虑到i)遗留血清因子少，ii)对细胞粘着到微型载体球上的作用小，iii)对细胞膜的损害小，和iv)细胞表面TF活性高时，发现“Hank′s缓冲盐溶液”是最适宜的。将微型载体球重新悬浮在Hank′s缓冲剂中并计数珠粒数。
加入FVII(Enzyme Research Laboratories cat# HVII 1007；5pm)(和抑制分析中的抑制剂)并在加入FX(Enzyme Research Lab-oratories cat# HFx 1010；50mM)和Cacl2(5mM)之前，让混合物平衡30分钟。通过amidelgtic分析法，用Fxa的Chromogenic底物S2765(Chromogenix cat# 821413)来测定FX产生的速率并且在405nm吸收度的大小增加。通过微型载体悬浮液简单的稀释作用可以很容易地调节活性。当除去等分试样时，通过搅拌悬浮液，可将变化保持在最小。测得变化为14±7％。
如图5所示，通过使用中性人TF单克隆抗体可以看出：事实上，细胞对Fx的激活作用依赖于细胞表面的TF。用FVII滴定结合细胞的TF表明约11.000TF分子/细胞或0.8ng/106细胞。Fx的激活也依赖于恒温培养时间和加入的FVII(图6和7)。通过用TAP(壁虱抗凝多肽；G.Vlasuk，Corvas Int.)抑制活性可改变测得的用Fxa表示的活性(图8)。
插图说明
图5通过中性组织因子(American Dignostica # 4504)的单克隆抗体对细胞介导的激活因子X的抑制作用。在加入因子VII(5pM)和因子X(56nM)之前，在室温下，将HT—1080细胞和抗体预先恒温培养1小时。反应持续2小时并通过加入EDTA中止。通过ami-dolytic分析法，用因子Xa Chromogenic底物(Chromogenix，S2765)来检验因子Xa的产生。抑制作用大于95％表明其完全依赖组织因子。
图6用0
Figure A9419247500241
和1nM(●)因子VII激活因子X的时间过程。
图7细胞介导的因子X的激活作用对加入的因子VII的依赖关系。三次测定的平均值。测定中的变化为12±14％。
图8TAP(壁虱抗凝多肽)对HT—1080细胞表面TF/FVIIa产生的amidolytic活性的抑制作用。
实施例10分析细胞表面TF起动的血浆凝集作用
已经设计出一种新的分析系统来测定由表达在活细胞表面的组织因子(TF)诱导的血浆凝集作用(即凝集时间)。该分析法使用粘着在微型载体表面的人或动物细胞(见图9)，它能够使在搅拌的电磁血凝计的测定孔中已知量的TF活性重新产生。所用细胞可以是正常的或变形的并体现表现型如单核细胞、内皮细胞，或纤维细胞等(见图10)。
为了在用血浆环境中的活细胞测定合成的肽和拟肽化合物对凝血体外途径的作用中可以高度应用这种新的分析方法，已特别发展并使之特征化。基于人FVII氨基酸序列而合成的肽抑制作用的结果已公开。原始记录
如下制备微型载体细胞制剂。
将从首次分离菌或变形系(见图10)继代培养物中得到的细胞悬浮在少量含血清介质中并以约5—100个细胞/微型载体的比率与微型载体(Cytodex—3，Pharmacia)混合。通常在2小时内，细胞粘着在微型载体上，并且可转移到含大量培养基的标准转动瓶中。当得到大量细胞，或当首次培养物(例如脐静脉内皮细胞)生长2天后，用变形细胞可直接获得均匀覆盖的含约20—60个细胞的微型载体。通过恒温培养粘着的细胞和试剂如脂多糖(LPS)或肿块性坏死因子—α(TNF—α)(见图10)可以刺激不表达TF的首次培养细胞(例如单核细胞或内皮细胞)表达TF。
为了分析体外凝集活性，首先用无钙缓冲剂洗涤微型载体细胞制剂，除去结合的血清因子。加入含钙缓冲剂和血浆并用电磁血凝计自动测定凝集时间。通过微型载体悬浮液简单的稀释作用可以很方便地调节凝集时间(例如35秒)并且假如当除去等分试样时搅拌悬浮液，可以很容易地获得再生。经兔脑促凝血酶厚激酶产生的log—log校正曲线看出，凝血时间可能反比arbitrary TF单位。
通过使用专门免疫放血的，缺少各凝集因子的人血浆，可显示获得的系统忠实地代表凝集的体外途径。例如通过ECV304人内皮细胞(American Culture Collection CRL—1998)介导的凝集作用显然依赖于FVII和Fx(图11)。因此，没有直接激活的Fx；细胞表面TF/FVII介导凝集作用。通过使用能消除所有凝集活性的中性人TF单克隆抗体可以证明，这种促凝血活性真正代表TF介导的凝集作用(图12)。图解说明
图9微型载体分析细胞表面介导的血浆凝集的原理。在Throm-botrackTM电磁血凝计(Nycomed)的恒温培养孔中，将粘着在微型载体表面的活细胞(例如人HT—1080纤维肉瘤；ATCC CRL 121)与含钙缓冲剂和血浆混合。通过形成纤维蛋白纤维引起磁球运动阻力增加来测定凝血时间。作为可使用的表达TF型细胞的实例，粘着在微型载体上的HT—1080细胞显示较低的插入物。
图10粘着在微型载体上的选择型细胞的凝集活性。通过从兔脑促凝血酶原激酶产生的校正曲线上计算可知，用TF单位/105细胞来表示活性(Nycomed)。所显示的细胞类型为：RD，人横纹肌肉瘤细胞(ATCC CCL 136)；HT—1080，人纤维肉瘤细胞(ATCC CRL121)；HE US，未刺激，首次培养的人脐静脉内皮细胞；HE ST，用细菌脂多糖(1μg/ml；5h)刺激后的人脐静脉内皮细胞；ECV—304，人内皮细胞(ATCC CRL 1998)；HM US，未刺激的人外周单核细胞和HM ST，用细菌脂多糖(0.5μg/ml；2h)刺激后的人外周单核细胞。
图11在微型载体分析中，通过使用免疫放血的人血浆(Ameri—can Diagnostica)证明的ECV—304介导的凝集作用对特异凝集因子的依赖关系。表明完全依赖于因子VII和X。
图12在微型载体分析中，通过使用中性人TF单抗隆抗体(American Diagnostica cat# 4504)分析ECV—304细胞凝集活性的特征，几乎全部凝集活性都能被中性抗体消除，由此证明，凝集活性高度依赖于TF的功能。
实施例11FVII肽对TF/FVII抑制作用的分析ELISA分析
图13所示的抑制结果表明，除了“铰链”区(即GLA区段和第一个EGF区段之间的残基41—48，得克萨斯大学)和第一个EGF区段本身(即残基50—61；Clarke等人)的序列外，在第二个EGF区段(尤其95—104)，还存在另外的序列，当它们作为肽存在于该结合分析中时，它们是抑制剂。在该分析中，作为抑制剂，肽95—104比103—111好得多(CORVAS Int.)。比色分析apo TF/FVIIa的Amidolytic活性
用本分析型试验进一步证明，代表人FVII残基95—104的肽是好的TF/FVII复合物形成抑制剂，并且比肽103—111(CORVASInt.)更好(见图14和15)。注意到残基95是肽95—104抑制性质的重要作用因素，这一点可通过与肽95—104比较，肽96—104的活性很低来显示(图14)。当试验某些作为抑制剂的肽混合物时，例如95—104和72—81的混合物，协同作用也是明显的(见图16)。关于FVIIa的催化部位，动力学实验证明，肽95—104的抑制作用是非竞争性的(见图17)，与抑制TF/FVII复合物形成相一致，而不是直接抑制FVIIa的酶活性。细胞表面TF/FVIIa对Fx的激活作用
显然，在该分析中，肽95—104是试验的肽中最好的抑制肽并且也比103—111好得多(CORVAS Int.)(图18)。注意到，残基95—97是肽95—104抑制性质最重要的作用因素。细胞表面TF/FVIIa开始的凝集作用
该分析方法不同于上述方法的关键是在该分析方法中，反应混合物包含完整的人血浆，并因此更接近地代表体内内皮细胞腔表面的环境。在该方法中，肽95—104也是一个好的抑制剂，其次为41—48(得克萨斯大学)和91—102(图19)。显然，95—104的抑制作用也依赖残基95。注意到114—127是中等抑制剂。在该方法中，再一次发现，95—104是比103—111(CORVAS Int.)好得多的抑制剂(图20)。
图解说明
图13由合成的FVII肽(都为0.5mM)产生的抑制FVII结合到固定化的rTF上的ELISA分析。肽序列见上述肽的表(19页)。C和L分别表示具有末端半胱氨酸肽的环型和线型。
图14合成的FVII肽(者为0.5mM)产生的抑制apo TF/FVIIaamidolytic活性的比色分析。C和L分别代表具有末端半胱氨肽的环型和线型。
图15选自Bioreg(95—104)和Corvas Int(103—111)的FVII肽序列对apo TF/FVIIa amidelytic活性的抑制作用。
图16apo TF/FVIIa amidolytic活性的协同作用。图中显示单独用95—104
Figure A9419247500281
，用95—104和固定浓度(0.5mM)的72—81的混合物(△)和单独用0.5mM的72—81(●)的抑制作用。用没有符号的单一线表示两种肽等克分子混合物的理论(附加的)作用。
图17肽95—104抑制apo TF/FVII活性的活力学实验分析方法。显然，该抑制作用是非竞争性的，因此证明，所看到的抑制作用不是通过对FVIIa的活性部位发挥作用而介导的。
图18FVII肽对HT—1080细胞表面的TF/FVIIa激活FX的抑制作用。结果显示的是每种肽在0.5mM下产生的。
图19选择的合成FVII肽(都为0.5mM)对HT—1080和ECV304细胞表面的TF/FVIIa介导的血浆凝集的作用。所显示的肽数字指人FVII的氨基酸序列；C和L分别代表具有末端半胱氨酸肽的环型和线型。
图20选自Bioreg(95—104)和Corvas Int(103—111)合成FVII肽序列对ECV—304细胞表面的TF介导的凝集抑制作用。
上述肽抑制实验结果列表显示如下：
肽抑制结果摘要
FVII肽的IC50(mM)或在0.5mMa下的抑制百分数
    肽序列b AmidolyticapoTF分析 Amidolytic微型载体分析 ELISA结合分析 凝集微型载体分析
72—81(C)     2.40     0.35     89％ (22％)
91—102(C)     0.60     0.04  0.58
91—102(L)     1.14     0.06 (14％)
91—102(anal)C     1.30     0.05  1.50
95—104     0.38     0.13     0.03  0.40
96—104     0.92     0.08 (27％)
98—102 (17％)
103—111     2.20     0.87     59％ (30％)
114—127(C)     (21％)     (77％) (44％)
a)在最高试验浓度(1mM)未达到定量或接近定量抑制作用的肽，在0.5mM时的抑制百分数。
b)参考人FVII的天然序列而给出的序列数。C和L分别指二硫键环化型和线型。
c)91—102(anal)在100处具有代替谷氨酸的精氨酸残基。实施例12肽抑制剂专一性的证实
设想在凝集分析中看到的肽的作用可能是由于对类似的，在凝集连锁中发挥作用的几种成分中的一种或多种的作用。因此，通过向接触激活(CephotestTM，Nycomed)开始的凝集分析中加入肽来试验这种可能性，并因此涉及体内和一般凝集途径的凝集因子，即除TF/FVII外的所有凝集因子。在该系统中，肽91—102和103—111是不活泼的，然而，对照抑制剂FX(TAP)和凝血酶(Hirudin；HIR)具有强抑制性(见下面图21)。因此证明，在上述TF/FVII开始的凝集分析中看到的作用，实际上是对TF/FVII复合物的直接作用。

Claims (13)

1.用于预防或抑制组织因子与FVII结合的化合物，它包含式I
—CVNENGGCEQYCSD—                             IA
—FCLPAFEGRNCE—和/或             IB
—RCHEGYSLLADGVSCT                IC的氨基酸序列及其肽片断，酯，酰胺，盐和环状衍生物，功能类似物和在上述序列或片断的末端携带氨基酸或肽的延伸肽。
2.除肽
CVNENGGCEQYC                   IIA
CLPAFEGRNC和                   IIB
CHEGYSLLADGVSC                 IIC之外的化合物，它包含式I
—CVNENGGCEQYCSD—                        IA
—FCLPAFEGRNCE—和/或          IB
—RCHEGYSLLADGVSCT             IC的氨基酸序列及其肽片断，酯，酰胺，盐和环状衍生物，功能类似物和在上述序列或片断的末端携带氨基酸或肽的延伸肽链。
3.含有5个或更多个氨基酸的权利要求1或2的化合物。
4.权利要求1—3中任一为—VNENG—，—ENGGC—，—GGCEQ—，—CEQYV—，—NGGCEQYCSD—或—GGCEQYCSD—的化合物。
5.权利要求1—3中任一为—ENGGA—，—GGAEQ—或—AEQYV—的化合物。
6.权利要求1—3中任一为—EQYVNE—的化合物。
7.权利要求1—3中任一为其环状衍生物的化合物。
8.权利要求1所定义的式IA和/或IB化合物，可有可无地与式IC化合物一起来制备预防或抑制FVII与组织因子结合的药用组合物的用途。
9.式IA和/或IB化合物，可有可无地与式IC化合物一起来预防或抑制FVII与组织因子的结合的用途。
10.权利要求8或权利要求9的应用，其式IA，IB和IC化合物含5个或更多个氨基酸。
11.由一种或多种肽或类似物或其盐和生理上可接受的赋形剂一起组成的药用组合物，所述肽的氨基酸序列包含或衍生于权利要求1所定义的式IA，IB和/或IC序列。
12.治疗或预防人或动物体血液病的方法，所述方法包含给予所述人或动物体一种或多种权利要求1所定义拭IA，IB和/或IC肽或类似物或其盐。
13.制备权利要求1中定义的式IA，IB和/或IC化合物的方法，该方法包括式IA，IB和/或IC化合物的保护衍生物脱保护步骤。
CN94192475A 1993-06-18 1994-06-17 因子vii衍生的肽 Pending CN1125450A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9312601.9 1993-06-18
GB939312601A GB9312601D0 (en) 1993-06-18 1993-06-18 Peptides
GB9409335A GB9409335D0 (en) 1993-06-18 1994-05-10 Peptides
GB9409335.8 1994-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1125450A true CN1125450A (zh) 1996-06-26

Family

ID=26303086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94192475A Pending CN1125450A (zh) 1993-06-18 1994-06-17 因子vii衍生的肽

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5962418A (zh)
EP (1) EP0703923B1 (zh)
JP (1) JPH08511794A (zh)
CN (1) CN1125450A (zh)
AT (1) ATE171950T1 (zh)
CA (1) CA2164422A1 (zh)
CZ (1) CZ334095A3 (zh)
DE (1) DE69413817T2 (zh)
DK (1) DK0703923T3 (zh)
FI (1) FI956055A (zh)
HU (1) HUT74873A (zh)
NO (1) NO955067D0 (zh)
NZ (1) NZ267453A (zh)
SK (1) SK156395A3 (zh)
WO (1) WO1995000541A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5652332A (en) * 1993-03-12 1997-07-29 Xoma Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof
GB9425380D0 (en) * 1994-12-15 1995-02-15 Nycomed Pharma As Peptides
GB9425381D0 (en) * 1994-12-15 1995-02-15 Nycomed Pharma As Peptides
US5837684A (en) * 1995-06-07 1998-11-17 Nycomed Imaging As Peptides
WO1999013062A1 (en) * 1997-09-09 1999-03-18 Nycomed Imaging As Factors vii fragments and analogs thereof and their use in the treatment of blood clotting disorders
WO1999013063A1 (en) * 1997-09-09 1999-03-18 Nycomed Imaging As Factor vii fragments and analogs thereof and their use in the treatment of blood clottng disorders
EP0987274A1 (en) 1998-09-15 2000-03-22 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Factor VIIa Inhibitors
AU5062100A (en) * 1999-06-14 2001-01-02 Novo Nordisk A/S Fviia/tf activity inhibiting compounds
JP2003503426A (ja) 1999-07-02 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＦＶＩＩａアンタゴニスト
US7164002B2 (en) 2002-02-06 2007-01-16 Genentech, Inc. FVIIa antagonists
US20060257359A1 (en) * 2005-02-28 2006-11-16 Cedric Francois Modifying macrophage phenotype for treatment of disease
US20190015532A1 (en) 2016-01-15 2019-01-17 Rigshospitalet Quantitative pet imaging of tissue factor expression using 18f-labled active site inhibited factor vii
EP3541432A4 (en) 2016-11-17 2020-08-05 Minerva Imaging ApS 177 LU MARKED FACTOR VII INHIBITED BY ACTIVE LOCATION

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5496927A (en) * 1985-02-04 1996-03-05 Merrell Pharmaceuticals Inc. Peptidase inhibitors
EP0201743B1 (en) * 1985-04-16 1992-04-01 Suntory Limited Dipeptide derivatives of fatty acids, process for preparing them, pharmaceutical composition and use
US5087564A (en) * 1985-06-20 1992-02-11 Monsanto Company Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase
US5047401A (en) * 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
WO1990003390A1 (en) * 1988-09-23 1990-04-05 Corvas, Inc. Peptidyl inhibitors of the initiation of coagulation
EP0521873B1 (en) * 1990-01-29 1999-06-02 Zymogenetics, Inc. Anticoagulant proteins
DE4007902A1 (de) * 1990-03-13 1991-09-19 Behringwerke Ag Synthetische peptide, die sequenzen aus faktor viia enthalten und deren verwendung
CA2042295A1 (fr) * 1990-05-15 1991-11-16 Jacques Chauveau Derives de mediateurs endogenes, leurs sels, procede de preparation, applications, et compositions les renfermant
WO1993009804A1 (en) * 1991-11-18 1993-05-27 The Scripps Research Institute Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation

Also Published As

Publication number Publication date
NZ267453A (en) 1997-03-24
US5962418A (en) 1999-10-05
HU9503593D0 (en) 1996-02-28
NO955067L (no) 1995-12-14
HUT74873A (en) 1997-02-28
EP0703923B1 (en) 1998-10-07
DE69413817D1 (de) 1998-11-12
AU6975594A (en) 1995-01-17
EP0703923A1 (en) 1996-04-03
SK156395A3 (en) 1996-06-05
CZ334095A3 (en) 1996-07-17
ATE171950T1 (de) 1998-10-15
FI956055A0 (fi) 1995-12-15
WO1995000541A1 (en) 1995-01-05
DE69413817T2 (de) 1999-06-10
DK0703923T3 (da) 1999-06-21
AU691814B2 (en) 1998-05-28
NO955067D0 (no) 1995-12-14
JPH08511794A (ja) 1996-12-10
CA2164422A1 (en) 1995-01-05
FI956055A (fi) 1996-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Leung et al. Protease inhibitors: current status and future prospects
JP4451514B2 (ja) 血液凝固第ｖｉｉ因子改変体
AU2010290077B2 (en) Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
CN1264858C (zh) 血管生成抑制三肽、组合物及其使用方法
JP2736821B2 (ja) マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割
CN1050721A (zh) 放射性标记的抗凝血多肽
CN1125450A (zh) 因子vii衍生的肽
CN1147261A (zh) 因子Xa抑制剂
CN1121077A (zh) 衍生自二羟硼烷的新颖肽化合物，制备它们的方法以及含有这类化合物的药物组合物
CN1254345A (zh) 丝氨酸蛋白酶抑制剂
KR20030060915A (ko) 단백질 씨 또는 활성 단백질 씨-유사 분자
JPH04288020A (ja) トロンボスポンジン様活性を有するペプチド類の治療学的使用
CN1091746A (zh) 维出那亭衍生的合成肽和含有这些合成肽的药物组合物
CN1402788A (zh) 纤维蛋白溶解活性多肽
CN1304415C (zh) 作为ace和nep抑制剂的吡喃衍生物
AU781618C (en) FVIIa antagonists
CN1301269A (zh) 模板结合的npyy2受体激动剂
CN1050720A (zh) 抗凝血肽
CN1198748A (zh) 多氟烷基色氨酸三肽凝血酶抑制剂
US5962408A (en) Disulphide-cyclo- H-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-OH!, and its use in blood-clotting disorders
CN1659184A (zh) 活化凝血酶原的蛋白
Tao et al. Template‐assisted rational design of peptide inhibitors of furin using the lysine fragment of the mung bean trypsin inhibitor
CN1924013A (zh) 尿激酶原改构体、制备方法、药物组合物和用途以及编码基因、含有基因的载体和转化细胞
AU691814C (en) Factor VII-derived peptides
EP0794965A1 (en) Factor vii fragment 82-128 and its use in blood-clotting disorders

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Applicant after: Nai Kom imaging Ltd.

Applicant before: Kazakhstan Fu englen Thessaloniki: timgad company

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: HAVENLUN NICAMUDE COMPANY TO: NELCOM IMAGE CO., LTD.

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication