HUT74873A

HUT74873A - Factor vii-derived peptides

Info

Publication number: HUT74873A
Application number: HU9503593A
Authority: HU
Inventors: Lars Orning; Kjell S Sakariassen; Ross W Stephens; Nycomed A S Hasflund; Szabadalmi Es Vedjegy Danubia
Original assignee: Nycomed Imaging As
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1997-02-28
Also published as: CZ334095A3; FI956055A0; DE69413817D1; SK156395A3; DE69413817T2; WO1995000541A1; FI956055A; AU691814B2; NO955067L; ATE171950T1; CA2164422A1; AU6975594A; CN1125450A; HU9503593D0; DK0703923T3; US5962418A; JPH08511794A; EP0703923A1; EP0703923B1; NZ267453A

Description

A találmány tárgyát vérrög képződést csökkentő peptid reagensek és kompozíciók képezik.

A vérrög képződés az aktiválási reakciók sorozatán vagy kaszkádján alapulva vezet a végső fibrin rög képződéshez. A fibrinképzödéshez vezető kaszkád kezdeti megindításának két különböző útja lehet, rendellenes felületekkel való érintkezés (intrinzik vagy belső út) vagy a véredények traumatizálása, ami a szöveti faktor-ként (TF) ismert lipoprotein kiválasztásához vezet (extrinzik vagy külső út). A találmány elsődlegesen a külső úton végbemenő vérrög képződésre vonatkozik.

A szöveti faktor egy integrális membrán protein, amely sok sejttípusban megjelenik. Azok a sejtek azonban, amelyek a szöveti faktort kifejezik, például az érbelhártya izomsejtjei, szokásosan nincsenek vérnek kitéve [lásd Edgington és mtsai. Thromb. Haemostas. 66(1) 67-69 (1991)]. így úgy tűnik, hogy a külső véralvasztó út megindításához vagy a véredények falainak roncsolása [Almus és mtsai., Blood 76 354-360 (1990)] és/vagy az endoteliális sejtek vagy monociták szöveti faktor kifejezésére való aktiválása [Edwards és mtsai., Blood 54 359-370 (1979) és Bevilaqua és mtsai., PNAS USA 83 4533-4537 (1986) ] szükséges. A véredényfal roncsolódása bekövetkezhez egy ateroszklerotikus plakk megrepedése folytán, ami szöveti makrofágokat és simaizom sejteket juttat a vérbe [Wilcox és mtsai., PNAS USA 86 2839-2843 (1989) ]. A szöveti faktor hozzáférhetővé válhat véredények tromboiitikus terápia, beültetéses sebészet, a véredények folytonossági hiányának mechanikai helyreállítása vagy más hasonló technikák során bekövetkező sérüléseket követően is. Másrészt, a szöveti faktor endoteliális sejtekben vagy monocitákban való kifejeződése kiváltható szepszis során tumor nekrózis α-faktor vagy interleukin-1 termelése következtében [lásd Edwards és mtsai., fent és Gregory és mtsai., J. Clin. Invest. 76 2440-2445 (1985)].

82885-215-GÁ/mzs « ·· ··· · ·· • ···· · · · ·

- 2 - .........

A szerin proteáz Vlla-faktor (FVIIa) a véralvadás külső útjában érintett. Az FVIIa proteolízis révén képződik inaktív Vll-faktor proenzim formájából (FVII) a véralvadási folyamat más résztvevői révén, köztük a Xa faktor, XI la faktor, IXa faktor vagy a trombin révén. Leírták, hogy az FVII-nek FVIIa-vá való aktiválódása jelentősen fokozódik, ha az FVII szöveti tényező (TF) kofaktorához kötött [Nemerson, Sémin. Hematol. 29(3) 170-176 (1992)]. Yamamoto és mtsai. azt feltételezték, hogy az FVII átalakulása FVIIa-vá autokatalitikus folyamat lehet [J. Bioi. Chem. 267(27) 19089-19094 (1992)].

Az FVIIa a szöveti tényezővel kalcium-ionok jelenlétében egy komplexet képez, és az FVIIa/TF komplex a véralvadási folyamat külső úton való következő lépésében a X-faktornak aktív formájává, a Xa-faktorrá való alakulását katalizálja.

Az FVII szerkezetét kutatták, és a cDNS szekvenciát írták le Hagen és mtsai. [PNAS USA 83 2412-2416 (1986)] nélkül. Az FVII egy nagy K-vitamin függő protein, és más K-vitamin függő proteinek analógiájára egy vélelmezett γ-karboxi-glutaminsav (Gla) domént azonosítottak amino terminálisánál. Ugyancsak a többi K-vitamin függő proteinek analógiájára várható volt, hogy a Gla dómén a szöveti tényezőhöz való kötődéshez szükséges (lásd Hagen és mtsai., fent). A Gla domént két potenciális növekedési faktor (GF) dómén követi. A szakirodalomban azonban nem fordul elő a GF domének bármely funkciójára vonatkozó feltételezés.

A véralvadék képződés extrinzik útjának kultiválódását feltételezték a fibrin képződéshez vezető első eseményének [Weiss és msai. Blood 71 629-635 (1988) és Weiss és mtsai., Blood 73 968-975 (1989)], és így elsőrendű fontosságúnak az arterioszklerotikus sérülések patogenezisében és veröérbelhártya kimetszést követő újraelzáródás és újrabeszűkülés patogenezisében. Nem hozzáférhetőek azonban olyan terápiás szerek, amelyek közbeavatkoznának ennek az útnak az aktiválódásában, bár erre igény lenne. [Shepard, TIBTECH 9 80-85 (1991)].

A találmány olyan peptidekre, analógjaikra vagy sóikra vonatkozik, amelyek gátolják az FVII vagy FVIIa szöveti tényezővel való kapcsolódását. A találmány • · ·· ···· · · • · · · · · · • · · · · · · ·· . 3 . ·:. ··:· .·* : ’··* szerinti peptidek hatására az FVIIa/TF komplex képződése korlátozott, ennek folytán a X-faktor aktiválása csökken.

Bizonyos, a véralvadás terápiájában hasznos peptideket ismertetnek a WO-A-91/07432 közzétételi számú PCT szabadalmi leírásban (Board of Regents, The University of Texas System). Az ismertetett peptidek vagy a Gla és az első GF dómén közötti régióban vagy az FVII vagy FVIIa katalitikus doménben fordulnak elő. Bár az FVIIa/TF komplex képződésének gátlását írják le, a WO-A-91/07432 közzétételi számú leírásban ismertetett peptidek közül az ilyen hatással bírók ezt a Gla funkció gátlása révén érik el. Az ilyen peptidek hatása nem fajlagos, mivel más fiziológiás proteinek is bírnak Gla doménekkel, például a C protein, amely az FVII Gla doménjével közel homológ szekvenciával bír. Ennek folytán a C protein funkcióját is nem kívánt módon megzavarnák a WO-A-91/07432 számú leírásban közölt peptidek.

A WO-A-90/03390 közzétételi számú PCT szabadalmi leírásban (Corvas Inc.) azt a feltételezést ismertetik, hogy az FVII (vagy FVIIa) aminosav szekvenciájából származó bizonyos peptidek hasznosak lehetnének a teljesen kialakult FVIIa/TF komplex hatásának megelőzésére. Két sajátos peptid szekvenciát ismertetnek a fenti szakirodalmi helyen, mint ilyen tekintetben aktívat, a -VGHFGVszekvencia az FVII 372-377 számú aminosavain alapszik, amelyek a karboxil terminális közelében helyezkednek el. A másik szekvencia, az -SDHTGTKRSCRaz FVII 103-113 számú aminosavjainál helyezkedik el, és a második GF dómén része. A Corvas Inc. azt jelzi, hogy ezek a peptidek és analógjaik gátolják az FVIIa/TF komplex által iniciált kaszkád reakciót.

Továbbá, a W090/03390 számú leírás 14. oldalán az 1. táblázatban azt jelzik, hogy a második GF dómén különböző régiói közül csak az SDHTGTKRSC (103-112) volt aktív, a többi régiók, nevezetesen az 50-101. és a 114-127. aminosavaknak megfelelőek teljesen inaktívak a X faktornak a VII faktor és szöveti faktor által való aktiválása gátlásában.

• · · ·

A fenti szakirodalmi helyen (Corvas Inc.) leírttal ellentétben kimutattuk azonban, hogy a 103-112 SDHTGTKRSC régió a Vll-faktomak a szöveti faktorhoz való kötődésének igen gyenge inhibitora, és hogy valójában az inaktívnak mondott régiók némelyike igen aktív.

Kezdeti felismerésünk az volt, hogy az FVII-nek egy olyan pontmutánsa, amelyben a 100 helyzetben lévő glutamin aminosavat arginin helyettesíti, amelyet 16 FVII hiányos norvég betegnél figyeltünk meg, azt a feltételezést engedi sejtetni, hogy az FVII molekulának ez a régiója fontos az FVII aktivitás szempontjából. Először megállapítottuk, hogy a 91-102 aminosav szekvencia különösen aktív, és hogy ez célszerűen magában foglalhatja a 103 és 104 aminosavakat is. Ezt követően azt találtuk, hogy az ugyancsak a GF doménben lévő 114-127 aminosav szekvencia viszonylag aktív, míg a 103-112 Corvas szekvencia csak mérsékelt aktivitással bír.

Ezután azt találtuk, hogy a 72-81 aminosav szekvencia szinergetikus hatású a 91-104 szekvenciák peptidjei inhibitor hatásának fokozásában, és a 72-81 régióból származó peptidek primer hasznosságúak az ilyen szinergetikus kombinációkban. Továbbá, a fenti szekvenciák fragmentumait gátlónak találtuk, és általában a fenti szekvenciáknak 5 vagy több aminosavat tartalmazó fragmentumai hasznosak az FVII aktivitás gátlásában.

A találmány ennek megfelelően az

-CVNENGGCEQYCSD- (IA)

-FCLPAFEGRNCE- és/vagy (IB) -RCHEGYSLLADGVSCT- (IC) képletü aminosav szekvenciákat magukban foglaló peptidekre, valamint pepiid fragmentumokra, különösen 5 vagy annál több aminosavat tartalmazó fragmentumokra, észterekre, amidokra, sókra és gyűrűs származékokra, funkciós analógjaira és olyan kiterjesztett peptidláncokra vonatkozik, amelyek a fenti szekvenciák vagy fragmentumok terminálisain aminosavakat vagy peptideket hordoznak.

• · · ·

-5A találmány egyik szempontja szerint az (IA), (IB) és/vagy (IC) szekvenciájú peptidekre vonatkozik az előzőekben meghatározottak szerint a

CVNENGGCEQYC	(HA)
CLPAFEGRNC és	(IIB)
CHEGYSLLADGVSC	(IIC)
peptidek kizárásával.
Megfelelő esetben az (IA),	(IB) és (IC) vegyületeket és különféle származó

kaikat és fragmentumaikat a célszerűség kedvéért (IA) peptid vegyületnek, (IB) peptid vegyületeknek és (IC) peptid vegyületeknek nevezzük.

Az (IA), (IB) és/vagy (IC) képletú peptid szekvenciák fragmentumai körébe tartoznak különösen a

-VNENG- -NGGCEQYCSD-ENGGC- -GGCEQYCSD-GGCEQ-CEQYVfragmentumok.

Vizsgálataink azt mutatták, hogy a 91-104 aminosav szekvencia peptidjei körében a 95. aminosav fontos, és az eddig vizsgált legaktívabb inhibitor a 95-104 szekvencia peptidje, azaz a NGGCEQYCSD.

A (IIA), (IIB) és (IIC) képletú peptidek kizártak annak alapján, hogy ezeket a Corvas Inc. W090/03390 számú leírásában közölték, bár azt állították róluk, hogy inhibitor aktivitásuk zéró. Egyáltalán nem tételezték fel, hogy ezen peptidek bármelyikének, beleértve fragmentumaikat vagy kiterjesztett változataikat, előállítása jótékony hatással lehetne a véralvadási rendellenességekkel való küzdelemben való használatra.

Annak alapján, hogy W090/03390 közzétételi számú leírásban helytelenül közölték a (IIA) és (IIB) képletü peptidekről, hogy azok zéró inhibitor aktivitással bírnak, a találmány egyik szempontját az előzőekben meghatározott (IA) és/vagy (IB) képletú vegyületek terápiás vagy diagnosztikai alkalmazása képezi szöveti

faktor megkötésére, és így a szöveti faktornak FVII-hez való kötődése megelőzésére vagy gátlására. Az (IC) peptid vegyületek esetén ezeket csak (IA) vagy (IB) vegyületekkel együtt alkalmazzuk. Hogy világossá tegyük a kérdést, hangsúlyozzuk, hogy a (IIA), (IIB) és (IIC) képletü vegyületek beleértendők az ilyen felhasználásba.

Egy további szempontját tekintve a találmány az előzőekben meghatározott (IA) és/vagy (IB) képletü peptidekre, adott esetben az előzőekben meghatározott (IC) képletü peptidekkel kombinálva vonatkozik.

Egy még további szempontját tekintve a találmány az előzőekben meghatározott (IA) és/vagy (IB) képletü vegyületek, adott esetben a (IC) képletü peptidekkel kombinált alkalmazására vonatkozik olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek a szöveti faktornak az FVII-hez való kötődését megelőzik vagy gátolják.

Amint azt az előzőekben jeleztük, az (IA) képletü peptid szekvenciák a legaktívabbak, bár aktivitásuk szinergetikusan fokozható ezen peptideknek az (IB) és/vagy (IC) képletü peptidekkel, fragmentumaikkal vagy más származékaikkal való együttes alkalmazásával. Az ilyen kombinált alkalmazás esetén a peptidek egyszerűen elegyíthetők egymással vagy kovalensen köthetők például a cisztein egységek közötti diszulfid kötés vagy térkitöltő peptidek révén.

A találmány szerinti peptidek észterei 1-6 szénatomos alkil-észterek, és könnyen lehasítható észtercsoportok, például a következőkben a karboxilcsoportok védőcsoportjaiként felsoroltak.

A találmány szerinti peptidek terminálisához kapcsolódó aminosavak vagy peptidek funkciós csoportokat, például védőcsoportokat hordozhatnak.

A találmány szerinti peptidek sói körébe fiziológiás szempontból elfogadható sók, például savaddiciós sók, például hidrogén-klorid-sók tartoznak.

Az előzőekben hivatkozott szekvenciákban a standard egybetűs kódot alkalmazzuk a természetben előforduló aminosavak megjelölésére. Ez a kód a szakterülen alkalmazott standard nomenklatúrának megfelelő, megtalálható bár-7 mely alap biokémiai szakkönyvben, például a Biochemistry Stryer, kiadó: W.H. Freeman and Company szakirodalmi helyen.

Az ilyen peptidek funkciós analógjai ugyancsak a találmány körébe tartoznak. Szakember számára jól ismert, hogy bizonyos aminosavak funkciósán ekvivalensek, gyakorta megfigyelhető, hogy az ilyen ekvivalens peptidek egymással való kicserélése nem okoz romlást a protein funkcióban. Sőt, bizonyos nem kritikus aminosavak helyettesítése megvalósítható a funkció bármely vagy bármely jelentős csökkenése nélkül még akkor is, ha az adott aminosavat kémiailag nem hasonló aminosavval helyettesítjük. Továbbá, ismertek a természetes előfordulású aminosavak kémiai variánsai, az ilyen molekulákkal való helyettesítés ugyancsak beletartozik az analóg kifejezésbe, amint azt itt használjuk.

Az előzőekben említett (I) általános képletü szekvenciában bármely C jelölésű aminosav, amely cisztein, alaninnal (jelölése A) helyettesíthető. így a különös érdeklődésre számot tartó peptidek körébe tartoznak az -ENGGA-, a -GGAEQ- és az -AEQYV-.

Továbbá, az (IA), (IB) és/vagy (IC) képletú szekvenciákból származó peptidek körébe tartoznak azok a kimer származékok, amelyekben az (I) képletü szekvencia két szokásosan egymással nem szomszédos része (amelyek két vagy több aminosavból állnak) egymással szomszédosak. Az ilyen kimer szekvencia egy példája -EQYVNE-.

Adott esetben a találmány szerinti peptidek gyűrűsek lehetnek feltéve, hogy a szöveti faktorhoz kötődő szekvencia konformációsán hozzáférhető a kötődésre. A ciklizálás elérhető bármely megfelelő kémiai úton, ezek között például két cisztein aminosav között diszulfid hidak képzésével. Az (I) képletú szekvenciából származó gyűrűs peptidek egy példája a CVNENGGCEQYC.

A találmány tárgyát képezik továbbá gyógyászati készítmények, amelyek egy vagy több az (IA), (IB) és/vagy (IC) képletü aminosav szekvenciát tartalmazó vagy abból származó pepiidet, analógját, sóját tartalmazzák. A peptidek bármely «··· ·· ··· fiziológiás szempontból elfogadható, a szakterületen ismert kötőanyaggal együtt adagolhatok, ilyenek például a víz és az olaj.

A találmány szerinti készítmények lehetnek például orális, nazális, parenterális vagy rektális adagolásra szolgáló formájúak.

Az gyógyászati megjelölésen a találmány szerint az állatgyógyászati alkalmazásokat is értjük.

A találmány szerinti vegyületek az adagolásra szokásos gyógyászati formák alakjában lehetnek, például lehetnek tabletták, bevonattal ellátott tabletták, orrpermetek, oldatok, emulziók, porok, kapszulák vagy nyújtott felszabadulású készítmények. Ezen formák előállítására a gyógyszerkészítésben szokásos segédanyagokat, valamint szokásos módszereket alkalmazzuk. A tabletták előállíthatok például a hatóanyagnak vagy hatóanyagoknak ismert segédanyagokkal, például higítóanyagokkal, így például kalcium-karbonáttal, kalcium-foszfáttal vagy laktózzal, szétesést elősegítő szerekkel, például kukoricakeményítővel vagy alginsavval, kötőanyagokkal, például keményítővel vagy zselatinnal, csúsztatóanyagokkal, például magnézium-sztearáttal vagy talkummal és/vagy a nyújtott felszabadulást biztosító szerekkel, például karboxi-polimetilénnel, karboxi-metil-cellulózzal, cellulóz-acetát-ftaláttal vagy poli(vinil-acetát)-tal való elegyítésével.

A tabletták kívánt esetben néhány rétegből is állhatnak. Bevonattal ellátott tabletták előállíthatok a tabletta készítésnél szokásos módon előállított magoknak tabletta bevonásra szokásosan alkalmazott anyagokkal történő bevonásával, például bevonóanyagként alkalmazhatunk poli(vinil-pirolidon)-t vagy sellakkot, gumiarábikumot, talkumot, titán-dioxidot vagy cukrot. Annak érdekében, hogy nyújtott felszabadulást biztosítsunk, vagy hogy elkerüljük az összeférhetetlenségeket, a mag maga is tartalmazhat néhány réteget. A tabletta bevonat is állhat néhány rétegből annak érdekében, hogy nyújtott felszabadulást érjünk el. Ebben az esetben az előzőekben említett tablettázási segédanyagokat alkalmazzuk.

Alkalmazhatunk szerv-fajlagos hordozórendszereket is.

-9Injekciós oldatokat előállíthatunk például szokásos módon, például tartósítószerek, például p-hidroxi-benzoát vagy stabilizálószerek, például EDTA adagolásával. Az oldatokat ezután injekciós fiolákba vagy ampullákba töltjük.

Az orrpermeteket hasonló módon formáljuk vizes oldatokká, és aerosol hajtógázzal ellátott permetezőtartályokba vagy manuális komprimálásra szolgáló eszközzel ellátott tartályba töltjük. Készíthetünk egy vagy több hatóanyagot tartalmazó kapszulákat, például a hatóanyagoknak inért hordozóanyagokkal, például laktózzal vagy szorbittal való elegyítésével és az elegynek zselatinkapszulákba való töltésével.

Megfelelő kúpokat készíthetünk például a hatóanyagnak vagy hatóanyag kombinációnak a megfelelő, ilyen célra szokásos hordozóanyaggal, például természetes zsírokkal vagy polietilénglikollal vagy származékaival való elegyítésével.

A találmány szerinti vegyületeket tartalmazó dózisegységek előnyösen 0,1-10 mg, például 1-5 mg (I) képletü peptidetvagy sóját tartalmazzák.

Amint azt az előzőekben megjelöltük, a találmány egyik szempontját tekintve a találmány szerinti peptideknek (beleértve analógjaikat vagy sóikat) véralvadási rendellenességek vagy problémák kezelésére vagy megelőzésére szolgáló alkalmazására vonatkozik. A véralvadási rendellenességek körébe tartoznak a trombózis (különösen a vaszkuláris trombózis vagy mélyvénás trombózis), az akut miokardiális infarktus, erek újrabeszükülése, újra elzáródása, angina, cerebrovaszkuláris megbetegedés, perifériás artéria elzáródásos megbetegedése, túlzott koagulálódás és tüdőembólia. A találmány szerinti peptidek alkalmazhatók például a véredényeknek trombolitikus terápia, átültetéses sebészet, ér folytonossági hiány helyreállítása stb. során bekövetkező véralvadási problémák előfordulásának megelőzésére is. A véralvadási rendellenességek kiváltója lehet TNF-α vagy IL-1 termelődése folytán létrejövő szepszis is.

Egy további szempontját tekintve a találmány eljárást nyújt emlősök, előnyösen ember, és állati szervezet vér-rendellenességeinek kezelésére, amely abban • · · · · ·

- _Λ · ···· · · · ·

- ίο - *.....· ·áll, hogy a kezelendő lénynek az előzőekben meghatározott (IA), (IB) és/vagy (IC) képletü pepiidet — beleértve ebbe a (IIA), (IIB) és/vagy (IIC) képletú vegyülete két — vagy analógjaikat vagy sóikat adjuk be. Megelőző kezelésre vonatkozó eljárást is nyújt a találmány, amelynél a találmány szerinti pepiidet a betegnek a lehetséges véralvadási problémák megelőzésére vagy csökkentésére adjuk be például sebészeti vagy más inváziós technika alkalmazásékor. A pepiidet természetesen szokásosan gyógyászati szempontból elfogadható készítmény formájában adagoljuk.

Egy további tárgyát tekintve a találmány eljárást nyújt az olyan peptidek előálítására, amelyek az (I) képletú szekvenciát, származékát, analógját vagy sóját tartalmazzák.

A találmány szerinti peptidek bármely célszerű módon szintetizálhatok. Általában a teljes szintézis során védöcsoporttal látjuk el a reakcióképes csoportokat (például amino-, tiol- és/vagy karboxilcsoportokat). így a szintézis utolsó lépése egy a találmány szerinti peptid védett formájáról a védőcsoportok lehasítása.

A peptidláncok felépítésénél kiindulhatunk a C-terminális vagy az N-terminális felől, bár szokásos használatban csak a C-terminális felől induló eljárások vannak.

így például kiindulhatunk a C-terminális irányából például lizin egy megfelelően védett származékának egy megfelelően védett cisztein- vagy cisztinszármazékkal való reagáltatásával. A lizinszármazék bír szabad a-amino-csoporttal, míg a másik reagens egy szabad vagy aktivált karboxilcsoporttal és egy védett aminocsoporttal bír. A kapcsolást követően a köztiterméket tisztíthatjuk, például kromatográfiás úton, majd a szelektív N-védőcsoport eltávolítást követően hozzáadhatjuk a további aminosav egységet. Ezt az eljárást folytatjuk, míg a kívánt aminosav szekvenciát felépítjük.

A karbonsav aktiválócsoportjai lehetnek például szimmetrikus vagy vegyes anhidridek vagy aktivált észterek, például p-nitro-fenil-észter, 2,4,5-triklór-fenil··«· • · ·« ·« · · · · · « · · ··· · ·· 11 ····«····

- ··»·····-észter, N-hidroxi-benzotriazol-észter (OBt) vagy N-hidroxi-szukcinimidil-észter (OSu).

A szabad amino- és karboxilcsoportok kapcsolását végrehajthatjuk például diciklohexil-karbodiimid (DCC) alkalmazásával. Egy másik kapcsolószer lehet például az N-etoxi-karbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin.

Általában a kapcsolási reakciókat célszerűen alacsony hőmérsékleten, például -20 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, célszerűen megfelelő oldószer-rendszerben, például tetrahidrofuránban, dioxánban, dimetil-formamidban, metilén-kloridban vagy ezek elegyében hajtjuk végre.

Még célszerűbb lehet, ha a szintézist szilárd fázisú gyanta hordozón hajtjuk végre. A hordozó egyik megfelelő típusa a klór-metilezett polisztriol (1 % divinil-benzollal keresztkötésekkel ellátott); ebben az esetben a szintézis a C-terminálisnál kezdődik, például egy N-védett lizinnek a hordozóhoz való kapcsolásával.

Számos megfelelő szilárd fázisú eljárást ismertetnek például az Eric Atherton, Christopher J. Logan, és Róbert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, és R. B. Merrifield, J. Am. Chem Soc. 102 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi és R. B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Rés. 16 412-25 (1980); Manfred Mutter és Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta 67 2009-16 (1984) szakirodalmi helyeken.

Az aminosavak védelmére szolgáló védőcsoportok széles köre ismert, ezekre vonatkozó példák találhatók a Schröder, E., és Lübke, K, The Peptides, 1. és

2. kötet, Academic Press, New York and London, 1965 és 1966; Pettit, G.R., Synthetic Peptides, 1-4. kötet, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 és 1976; Houben-Weyl, Methoden dér Organischen Chemie, Synthese von Pepiiden, 15. kötet, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, 4-8. kötet, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 és 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlage Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, • · ··· * · · t · • ·· »99 ·«· · ·· · · · synthesis, biology 1-7, szerk.: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Fransisco, London; Solid phase peptide synthesis 2. kiadás, John

M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company szakirodalmi helyeken.

így például alkalmazhatunk amin védőcsoportként benzil-oxi-karbonil-csoportot (a továbbiakban jelölése Z), terc-butoxi-karbonil-csoportot (a továbbiakban jelölése Boc), 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil-csoportot (Mtr) és 9-fluorenil-metoxi-karbonil-csoportot (Fmoc). Megjegyezzük, hogy ha a peptidet a C-terminális végről kezdve építjük fel, minden új hozzáadott egység a-amino-csoportján amin védöcsoportnak kell jelen lennie, és a következő kapcsolási lépést megelőzően ezt a védőcsoportot szelektíven el kell távolítani. Az időszakos amin védelemre egy különösen hasznos csoport az Fmoc csoport, amely piperidinnel szerves oldószerben szelektíven eltávolítható.

Karboxil védőcsoportokként használhatunk például könnyen lehasadó észtercsoportokat, például benzilcsoportot (Bzl), p-nitro-benzil-csoportot (ONb), pentaklór-fenil-csoportot (OPCIP), pentafluor-fenilcsoportot (OPFP) vagy terc-butil-csoportot (OtBu), valamint a szilárd hordozókhoz kapcsolódó csoportokat, például polisztirolhoz kötve metilcsoportokat.

A tiol védőcsoportok közé tartoznak a p-metoxi-benzil-csoport (Mob), a tritil-csoport (Trt) és az acetamido-metil-csoport (Acm).

Megjegyezzük, hogy más hasonló csoportok széles köre létezik, mint például azok, amelyeket az előzőekben ismertetett irodalmi forrásokban ismertetnek, és minden ilyen csoport alkalmazása az előzőekben leírt eljárásokban a találmány körén belül esik.

Az amin és karboxil védőcsoportok eltávolítására az eljárások széles köre ismeretes. Ezeket azonban a szintézis stratégiával összhangban kell alkalmazni. Az oldalláncot védő csoportoknak stabilaknak kell lenniük az időszakos a-amino védőcsoportoknak a következő kapcsolási lépést megelőző eltávolításának körülményei mellett.

-13Az amin-védöcsoportok, például a Boc és a karboxil-védőcsoportok, például a tBu egyidejűleg savas kezeléssel, például trifluor-ecetsavval eltávolíthatók. A tiol-védőcsoportok, például a Trt szelektíven eltávolíthatók oxidálószer, például jód alkalmazásával.

A következőkben a találmányt példákban mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül.

Az 1. ábrán véralvadás gátlását mutatjuk be különböző FVII peptidek és FVII peptid analógok hatására.

A 2. ábrán az FVII/TF aktivitás és az FVII-5 peptid közötti dózis — hatás összefüggést mutatjuk be.

A 3. ábrán az FVII/TF és az FVIl-5d peptid közötti dózis — hatás összefüggést mutatjuk be.

A 4. ábrán a X faktor aktiválásának gátlását mutatjuk be FVII-5 különböző koncentrációi mellett.

A példákban az alábbi rövidítéseket használjuk:

TFA	trifluor-ecetsav
BocAA	terc-butoxi-karbonillal védett aminosav
BOP	benzotriazol-1-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluor-
	-foszfát
HOBT	N-hidroxi-benzotriazol
DIEA:	diizopropil-etil-amin
DCM	diklór-metán
NEM	N-etil-maleimid
EDTA	etilén-diamin-tetraecetsav
DMF	dimetil-formamid

1. Példa

Általános peptidszintézis

Az alkalmazott peptideket szokásos szilárd fázisú szintézis eljárással állítottuk elő, és preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) • · · ·

- 14tisztítottuk. Az egyes peptidek tisztaságát analitikai HPLC eljárással, aminosavanalízissel és tömegspektrometriás vizsgálattal ellenőriztük. Minden alkalmazott termék beszerzési helye a Neosystems Laboratoire (Strasbourg, Franciaország).

A peptideket az alábbi általános eljárások alkalmazásával építettük fel és hasítottuk le.

4-metil-benzhidril-amin-gyantát (R2161 tétel) alkalmaztunk 0,9 mekv/g kezdeti terheléssel. Az egyes peptidekhez 450 mg (0,4 mmól) kiindulási gyantát alkalmaztunk.

1. A peptid felépítése

Semlegesítést követően az alábbi kapcsolás/védöcsoport eltávolítás rendet alkalmaztuk (minden egyes oldószerből 10 ml térfogat alkalmazásával).

a) Tiszta trifluor-ecetsav

b) Tiszta trifluor-ecetsav

c) Áramlásos mosás, metilén-klorid

d) Izopropanol

e) Dimetil-formamid (DMF)

f) Dimetil-formamid áramlásos mosás min.

min.

0,5 min.

0,5 min (háromszor)

Kapcsolás ekvivalens BocAA-t, BOP-t és HOBT-t oldunk 5 ml DMF-ban és a gyantához adjuk. A buborékolás megkezdődése után 0,5 ml diizopropil-etil-amint adunk az elegyhez, és 13 percig keverjük. Két DMF-os mosás után azonos körülmények mellett egy kettős kapcsolást hajtunk végre.

Acetilezés

Az utolsó védőcsoport eltávolítás! lépést követően acetilezést végzünk 10 ekvivalens ecetsavanhidrid és 10 ekvivalens DIEA 10 ml DMF-ben való alkalma zásával.

A reakcióidő 10 perc.

Ha a peptidet felépítettük, a peptid — gyantát DMF-val, DCM éterrel mossuk, és nitrogéngáz áramban szárítjuk.

• ·

2. Hasítás

A pepiidet HF/anizol kezeléssel hasítjuk le a gyantáról és fosztjuk meg védőcsoportjaitól (9:1 térfogatarányú HF, anizol alkalmazásával, 10 ml elegy/g peptid — gyanta), a reagáltatást 0 °C hőmérsékleten 45 percig folytatjuk.

Ezután a HF-t lepároljuk, éteres kicsapást végzünk, a nyers pepiidet tiszta TFA-ban oldjuk, majd szűrjük.

A TFA-t vákuumban lepároljuk, és a pepiidet éterrel ismét kicsapjuk. Ebben az állapotában a termék tisztításra kész állapotú.

3. Tisztítás és elemzés

Minden pepiidet fordított fázisú Ci₈ oszlopon (15-25 μηη) nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítunk, eluensként acetonitril és víz 0,1 % TFA-t tartalmazó lineáris gradiensét alkalmazzuk. A 95 % feletti tisztaságú frakciókat összegyűjtük, és liofilizáljuk. A tisztított peptidet nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálattal elemezzük, és egy mintát hidrolizálunk aminosav elemzés céljára. Minden peptid analitikai elemzésének eredményeit feljegyezzük.

A tisztításra alkalmazott alapvető stratégia mindig azonos. Csak a preparatív tisztításnál alkalmazott gradiens eltérő az egyes egyedi peptidek kezdeti retenciós idejétől függően.

A fenti eljárással kapott peptid az N-terminálisán egy acetilcsoportot és C-terminálisán egy -CONH₂ csoportot hordoz.

2. Példa

FVII-5 peptid

Boc-Cys(4-MeBzl)-PAM gyantát (52172 tételszám) alkalmazunk 0,63 mekv/g kezdeti terheléssel. 0,96 g (0,6 mmól) kiindulási gyantát használunk.

A felépítési/kapcsolási/lehasítási eljárás az előzőekben leírt, a következő módosításokkal:

1. Felépítés

a) 55 % TFA DCM-ban 5 perc

b) 55 % TFA DCM-ban 25 perc ···

2. Lehasítás

Az éterrel való kicsapást követően a peptid — gyantát 30 ml 10 %-os vizes ecetsavval mossuk, és liofilizáljuk. A lehasítás révén kapott peptid C-terminálisán -COOH csoportot, N-terminálisán NH₂ csoportot visel.

3. Tisztítás — ciklizálás

Oldószerösszetétel:

A : 0,1 % TFA tartalmú víz

B : acetonitril/A oldószer (60/40 térf. arány).

A nyersterméket fordított fázisú HPLC eljárással előtisztítjuk 0,1 % TFA tartalmú lineáris acetonitril/víz gradiens alkalmazásával, 10 -> 80 % B, 30 percen át.

A 80 % feletti tisztaságú, a lineáris pepiidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a frakciók térfogatát vízzel 0,5 literre egészítjük ki. Az oldat pH-ját DIEA alkalmazásával 8,5-re állítjuk be, és az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten mágneses keverővei keverjük. A ciklizálási reakció lefolyását a reakcióelegy egy mintájának N-etil-maleimiddel (NEM) való együttes beinjektálásával követjük nyomon.

óra elteltével a ciklizálás lejátszódik. A pH-t ecetsavval 2,5-re állítjuk be, majd az oldatot vákuumban besűrítjük, majd liofilizáljuk.

A gyűrűs pepiidet ezt követően 95 %-os tisztaságig tisztítjuk RP - HPLC eljárással (5 % -> 30 % B lineáris gradiens 30 perc alatt).

A végtermék tisztaságát és azonosságát analitikai HPLC eljárással, aminosav analízissel és tömegspektrometriás eljárással ellenőrizzük.

3. Példa

FVII-1 peptid

Ezt a pepiidet 90 mg Fmoc-Ala-Wang gyantából (0,67 mekv/g) kiindulva Fmoc/t-But stratégia alkalmazásával szintetizáljuk.

1. Felépítés

A védőcsoportok eltávolítását és a kapcsolást az alábbi rend szerint végezzük:

a)	25 % piperidin DMF-ban	2 perc
b)	DMF áramlásos mosás
c)	25 % piperidin DMF-ban	4 perc
d)	DMF áramlásos mosás
e)	25 % piperidin DMF-ban	6 perc
f)	DMF áramlásos mosás	5x ismételve
	2. Kapcsolás
	5 ekvivalens Fmoc-AA-t,	BOP-t és HOBT-t 3 ml DMF-ben oldunk, és a

gyantához adjuk. A buborékolás megkezdődése után 0,13 ml DlEA-t adunk az elegybe, és a kapcsolást 13 percig folytatjuk. 2 DMF-es mosást követően kettős kapcsolást végzünk az előzőekben leírtak szerint.

3. Hasítás

A peptid hasítását és védőcsoportoktól való megfosztását 5 ml 83,3 % TFA-t,

4,2 % vizet, 4,2 % tioanizolt, 2,1 % etánditiolt és 6,25 % fenolt tartalmazó eleggyel

2,5 órán át való kezeléssel végezzük. Az elegyet szűrjük, és 25 ml hideg éterbe öntjük. A kicsapódott peptidet centrifugáljuk, és éterrel kétszer mossuk. A terméket vízben oldjuk, liofilizáljuk, és további tisztítás nélkül használjuk fel.

4. Példa

Ha más megjelölés nem szerepel, a további szintetikus peptideket az 1. példában leírttal analóg módon állítjuk elő. A gyűrűs vegyületeket a 2. példában leírtak szerint nyerjük.

Az 1. táblázatban a szintetizált peptideket ismertetjük.

- 181. Táblázat

Vll-faktor peptidek
Jelölés	Szekvencia	Egységek a Vll-faktorban
FVII-12	LFWISYSD	39-46
FVII-21	WISYSDGD	41-48
FVII-23	SYSDGD	43-48
FVII-7 (gyűrűs)	CASSPCQNGGSC	50-61
FVII-13	KDQLQSYI	62-69
FVII-8 (gyűrűs)	CLPAFEGRNC	72-81
FVII-5 (lineáris)	CVNENGGCEQYC	91-102
FVII-5 (gyűrűs)	CVNENGGCEQYC	91-102
5A	VNENG	92-96
5B	ENGGA	94-98
5C	GGAEQ	96-100
5D	AEQYV	98-102
5E	EQYVNE	99-101+92-94
FVII-4B	SDHTGTKRS	103-111
FVII-6 (gyűrűs)	CHEGYSLLADGVSC	114-127
FVII-1	GKIPILEKRNA	136-146
5. Példa
Az FVIIa/TF aktivitás vizsgálata

Peptideket (0-1 mmól/l koncentrációban) pH = 7,2-es 0,1 mól/l-es Trisz-HCI-ben szöveti faktorral (Thromborel®, Behringwerk, Marburg, Németország; 0,2 % végkoncentráció) 22 °C hőmérsékleten 30 percig előinkubálunk, majd 70 nmól/l X faktort (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT USA), ezt követően 8 pmól/l FVIIa-t (Diagnostica Stago, Asnieres, Franciaország) és 5 mmól/l CaCI₂-t adunk hozzá. Az inkubálást további 30'percig folytatjuk, majd az elegyhez 50 mmól/l EDTA-t adunk, ami lényegében eltávolítja a kalciumionokat. A képződött FXa-t • ·

- 19 - ....... · mennyiségileg meghatározzuk a kromogén FX szubsztrát S-2222 (Chromogenix, Mölndal, Svédország) hidrolízisének nyomonkövetésével.

Eredményeinket az 1. ábrán adjuk meg.

6. Példa

Az FVII-5 peptid különböző koncentrációinak hatását vizsgáltuk az 5. példában leírt vizsgálati eljárással. A vizsgálatot az FVII-5D peptid alkalmazásával megismételtük. Eredményeinket a 2. és 3. ábrán mutatjuk be.

7. Példa

FX aktiválásának FVII-5 által való gátlása kinetikáját vizsgáltuk. Az FVII-5 különböző koncentrációit különböző koncentrációjú X faktorral inkubáltuk TF és FVIIa jelenlétében vagy hiányában.

Eredményeinket a 4. ábrán mutatjuk be. Mindkét grafikon azonos adatokon alapszik, mindkettő X faktor aktiválás FVII-5 által való nem-kompetitiv gátlását jelzi, jelölve ezzel azt, hogy a gátlás a X faktor kötési lépést megelőzően következik be, azaz a gátlás az FVIIa/TF kompex képződésénél jelentkezik.

8. Példa

Az apoTF/FVIla katalitikus aktivitás vizsgálata

Ezt a kolorimetriás vizsgálatot tisztított humán FVIIa amidolitikus (katalitikus) aktivitásának közvetlen mérésére használjuk, amikor az rekombináns humán TF-hez kötött, foszfolipid hiányában.

A következő módon járunk el.

A reagáltatást mikrotiter lemez lyukjaiban végezzük, a végső inkubációs térfogat 200 μΙ. A vizsgálandó vegyület vizes oldatát (0-1 mmól/l végkoncentráció) rekombináns humán szöveti faktorral (American Diganostica, kát.# 4500; 5 nmól/l) és 100 mmól/l pH = 7,2-es, 150 mmól/l NaCl és 1 mg/ml BSA tartalmú Tris pufferben lévő 5 mmól/l-es CaCI₂.vel szobahőmérsékleten 30 percig előinkubáljuk. Az elegyhez 5 nmól/l Vlla-faktort (Enzyme Research Laboratories, kát.# HFVIla) adunk, majd az inkubálást 60 percig folytatjuk. Az elegyhez ezután 0,5 mmól/literes S2288 kromogén szubsztrátot (Chromogenix kát.# 820852;) adunk, ·· · ·

-20• · · · · · ·· • · · • · · · · · • · · ·· · · · és a szöveti faktor apoprotein/VII faktor komplex (apoTF/FVIla) enzimaktivitását 405 nm-nél regisztráljuk.

9. Példa

FX HT1080 sejtfelszíni TF/FVIla által közvetített aktiválásának vizsgálata.

Ezt a vizsgálati rendszert natív TF/FVIla komplex katalitikus aktivitásának mérésére használjuk sejtmembránjukban TF-t kifejező élő sejtek felszínén. Az aktivitást mint a sejt felszíni TF/FVIla által a hozzáadott FX-en termelt Fxa amidolitikus (katalitikus) aktivitását mérjük. A vizsgálathoz kiválasztott sejtvonal a HT-1080 humán fibroszarkóma (American Type Culture Collection CCL 121).

A vizsgálat menete a következő:

HT-1080 sejteket szérumtartalmú tápközeg kis térforgatában szuszpendálunk, és (Cytodex-3, Pharmacia) mikrohordozóval mintegy 50-100 sejt/mikrohordozó arányban elegyítjük. A sejtek általában 2 órán belül megtapadnak a mikrohordozón, és nagyobb térfogatú tenyészközeget tartalmazó normál görgős palackokba vihetők át. Ezt követően a mikrohordozós sejtkészítményt kalciummentes pufferrel kétszer mossuk a megkötött szérum faktorok eltávolítására. 9 különféle megvizsgált mosópufferböl a Hank-féle pufferolt sóoldatot találtuk optimálisnak a következő szempontok figyelembevételével: i) a szérum faktorok alacsony átvitele, ii) a mikrohordozó gömbökhöz való sejt-tapadásra való gyenge hatás, iii) a sejtmembránok kismértékű károsítása és iv) nagy sejtfelszíni szöveti faktor aktivitás. A mikrohordozó gömböket Hank-féle pufferben újra szuszpendáljuk és a gyöngyöket megszámoljuk.

Ezután FVII-t (Enzyme Research Laboratories kát.# HVII 1007; 5 pmól/l) (és inhibíciós vizsgálatokban inhibitort) adagolunk, az elegyet 30 percig hagyjuk egyensúlyba jutni, majd FX-t (Enzyme Research Laboratories kát. # HFX 1010; 50 nmól/l) és CaCI₂.t (5 mmól/l) adagolunk. Az FXa képződés sebességét amidolitikus vizsgálattal határozzuk meg S2765 kromogén szubsztrátot alkalmazunk az FXa-hoz (Chromogenix kát. # 821413), és mérjük az abszorpció növekedését ···

-21 405 nm-nél. A szöveti faktor aktivitást könnyen beállíthatjuk a mikrohordozó szuszpenzió egyszerű hígításával. A variációt minimális értéken tudjuk tartani a szuszpenziónak az alikvotok eltávolításakor való keverésével. Ez az érték 14±7 %.

Az FX-nek sejtek által való aktiválása valóban a sejtfelszíni szöveti faktortól függő, amit humán szöveti faktor ellenes semlegesítő monoklonális antitest alkalmazásával tudtunk kimutatni, amint az az 5. ábrán látható. A sejthez kötött szöveti tényező FVII-tel való titrálása mintegy 11 000 szöveti faktor molekula/sejt vagy 0,8 ng/10⁶ sejt koncentrációt jelzett. Az FX aktiválás az inkubálási időn és a hozzáadott FVII mennyiségen is múlik (lásd a 6. és 7. ábrán). Azt, hogy a mért aktivitás a FXa-tól származik, az aktivitásnak kullancs antikoaguláns polipeptiddel (KAP;

G. Vlasuk, Corvas Int.) való gátlásával igazoltuk (8. ábra).

A következőkben az ábrák leírását adjuk.

5. ábra Az ábrán a X faktor sejt által közvetített aktiválásának szöveti faktor elleni semlegesítő monoklonális antitesttel (American Diagnostica #4504) való gátlását mutatjuk be. A HT-1080 sejteket és az antitestet 1 órán át szobahőmérsékleten előinkubáljuk, majd 5 pmól/l VIl-faktort és 56 nmól/l X-faktort adunk hozzá. A reagáltatást 2 órán át folytatjuk, majd a reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le. A Xa-faktor képződését amidolitikus vizsgálattal követjük nyomon egy Xa-faktor kromogén szubszrát (Chromogenix, S2765) alkalmazásával. Az elért gátlás >95 %, jelezve a szöveti faktortól való tökéletes függést.

6. ábra A X-faktor aktiválásának időbeli lefolyása 0 () és 1 nmól/l (·) Vll-faktor alkalmazásával.

7. ábra A sejt által közvetített X-faktor aktiválás függése a hozzáadott VII-faktortól. Az eredmények három meghatározás átlagát jelölik. A vizsgálaton belüli variáció 12 ±14 %.

8. ábra HT-1080 sejtfelszíni szöveti faktor/FVIla által kiváltott FXa amidolitikus aktivitás gátlása kullancs antikoaguláns polipeptiddel.

• ·

10. Példa

Plazma sejtfelszíni szöveti faktorral kiváltott koagulálódásának vizsgálata.

Új vizsgálati rendszert terveztünk vérplazma élő sejtek felületén expreszszálódó szöveti faktor (TF) által kiváltott koagulálódásának (azaz alvadási idejének) mérésére. A vizsgálatban olyan, mikrohordozók felszínén megtapadó humán vagy állati sejteket használunk fel (lásd a 9. ábrán), amelyek egy elektromágneses koagulométer kevert mérőkútjában ismert mennyiségű szöveti faktor aktivitás reprodukálható prezentálására képesek. Az alkalmazott sejtek lehetnek normális vagy transzformált sejtek, és olyan fenotipusokat képviselhetnek, mint például a monociták, endotélium, fibroblasztok, stb. (lásd a 10. ábrán).

Ezt az új vizsgálatot sajátosan fejlesztettük ki, és jellemezzük azzal a céllal, hogy igen hasznosak legyenek szintetikus peptideknek és peptidomimetikus vegyületeknek a koaguláció extrinzik útjára gyakorolt hatása vizsgálatára élő sejtek plazma környezetben való alkalmazásával. A humán FVII aminosav szekvenciáján alapuló szintetikus peptidek gátló hatására kapott eredményeinket ismertetjük.

A vizsgálat menete:

A mikrohordozós sejtkészítményt a kővetkező módon készítjük. Transzformált sejtvonalak (lásd a 10. ábrán) primer izolátumaiból vagy szubkultúráiból nyert sejteket kis térfogatú szérumtartalmú tápközegben szuszpendálunk, és mikrohordozóval (Cytodex-3, Pharmacia) mintegy 50-100 sejt/mikrohordozó arányban elegyítünk. A sejtek általában 2 órán belül megtapadnak a mikrohordozókon, és átvihetők nagyobb térfogatú tenyészközeget tartalmazó normál görgős lombikokba. A mikrohordozóknak mintegy 20-60 sejttel való egyenletes borítottságát közvetlenül érjük el transzformált sejtek alkalmazásával, ha nagy sejtszám áll rendelkezésre, vagy primer kultúrák (pl. köldönzsinór véna endoteliális sejtek) alkalmazása esetén két napos szaporítást követően. A szöveti faktort nem kifejező primer tenyészetek sejtjei (pl. monociták vagy endoteliális sejtek) szöveti faktor kifejezésére késztethetők a megtapadt sejteknek olyan szerekkel való inkubálásával, mint ···

-23 a bakteriális lipopoliszacharid (LPS) vagy a tumor nekrózis a-faktor (TNF-α) (lásd a 10. ábrán).

Az extrinzik koagulációs aktivitás vizsgálatára a mikrohordozós sejtkészítményt először kalciummentes pufferrel mossuk a megkötött szérum faktorok eltávolítására. Ezután kalciumtartalmú puffért és plazmát adunk hozzá és elektromágneses koagulométerben automatikusan meghatározzuk az alvadási időt. Az alvadási idő igen célszerűen beállítható (pl. 35 s-re) a mikrohordozós szuszpenzió egyszerű hígításával, és a reprodukálhatóság könnyen elérhető, feltéve, hogy a szuszpenziót az alikvotok eltávolításakor keverjük. Az alvadási idő tetszés szerinti szöveti faktor egységekké alakítható nyúl-agy tromboplasztinnal képzett log-log kalibrációs görbe révén.

A kapott rendszer a koaguláció extrinzik útját hűségesen képviselőnek mutatkozik a koagulációs faktorok mindegyikében hiányos immunológiailag kimerült humán plazmák alkalmazásával. Például az ECV304 humán endoteliális sejtek (American Culture Collection CRL-1998) által közvetített koaguláció egyértelműen függ az FVII-től és FX-től. Bár nincs közvetlen FX aktiválás, a koagulálást a sejtfelszíni szöveti faktor/FVII közvetíti. Azt, hogy ez a prokoaguláns aktivitás valóban a szöveti faktor által közvetített koagulációt képviseli, humán szöveti faktor elleni neutralizáló monoklonális antitest alkalmazásával mutattuk ki, amely a teljes koagulációs aktivitás kioltására képes volt (12. ábra).

A következőkben az ábrákat ismertetjük.

9. ábra Az ábrán a vérplazma sejtfelszín által közvetített koagulációjának mikrohordozós vizsgálata lényegét mutatjuk be. Mikrohordozók felületén megtapadó élő sejteket (pl. humán HT-1080 fibroszarkómát; a ATCC CRL 121) kalciumtartalmú pufferrel és plazmával elegyítünk egy Thrombotrack™ elektromágneses koagulometer (Nicomed) inkubációs kútjában. Az alvadási időt a mágneses golyó mozgása iránti ellenállás növekedéseként mérjük, amit a fibrinrostok képződése okoz. Az ábra alján mutatjuk be a Cytodex-3 mikrohordozókhoz tapadt HT-1080 • ·

-24sejteket, mint az alkalmazható, szöveti faktort kifejező sejtek típusainak egy példáját.

10. ábra Az ábrán mikrohordozókon tapadt különféle sejttípusok koaguláns aktivitását mutatjuk be. Az aktivitást szöveti faktor egység/10⁵ sejt értékként fejezzük ki, és egy nyúl-agy tromboplasztinnal (Nycomed) létrehozott kalibrációs görbe alapján számítjuk. A bemutatott sejttípusok a következők: RD: humán harántcsíkolt izom szarkóma sejtek (ATCC COL 136); HT-1080: humán fibroszarkóma sejtek (ATCC CRL 121); HE US: humán köldökzsinór véna endoteliális sejtek stimulálatlan primer tenyészete; HE ST: humán köldökzsinór véna endoteliális sejtek bakteriális lipopoliszachariddal (1 pg/ml; 5 óra) való stimulálást követően; ECV-304: humán endoteliális sejtek (ATCC CRL 1998); HM US: stimulálatlan humán perifériás monociták és HM ST: humán perifériás monociták bakteriális lipopoliszachariddal (0,5 pg/ml; 2 óra) való stimulálást követően.

11. ábra Az ábrán az ECV-304 által közvetített koaguláció függését mutatjuk be különböző koagulációs faktoroktól immunológiailag kimerített humán plazmák (American Diagnostica) alkalmazásával végzett mikrohordozós vizsgálaton bemutatva. Felhívjuk a figyelmet a VII- és X- faktoroktól való tökéletes függésre.

12. ábra A koagulációs aktivitás jellemzése ECV-304 sejteken mikrohordozós vizsgálatban humán szöveti faktor elleni neutralizáló monoklonális antitest (American Diganostíca kat.#4504) alkalmazásával. A neutralizáló antitest hatására szinte minden alvasztó aktivitás megszűnik, mutatva azt, hogy az aktivitás erősen függ a szöveti faktor működésétől.

11. Példa

Szöveti faktor/FVII kötődés gátlásának vizsgálata FVII peptidekkel — ELISA vizsgálat

A 13. ábrán bemutatott gátlási eredmények azt jelzik, hogy a hinge régióból származó (azaz a GLA dómén és az első EGF dómén közötti 41-48 egységek, UNIVERSITY OF TEXAS) és az első EGF doménből magából származó (azaz az 50-61 egységek; Clarké és mtsai.) szekvenciákon kívül a második EGF dómén-25 ··· ben további szekvenciák léteznek, amelyek peptidekként prezentálva ebben a vizsgálatban inhibitorokként hatnak.

A következőkben az ábrákat ismertetjük.

13. ábra FVII immobilizált rTF-hez való kötődésének gátlása szintetikus FVII peptidek révén (mindegyik 0,5 mmól/l koncentrációban) ELISA módszerrel vizsgálva. A peptid szekvenciákat az előzőekben a peptidek táblázatos összefoglalásában ismertettük. A C és L jelölések a terminális ciszteinekkel bíró peptidek gyűrűs, illetve lineáris formáit jelölik.

A fenti peptid gátlási vizsgálatok eredményeit az alábbi táblázatban ismertet jük.

Peptid gátlási eredmények összefoglalása:

FVII peptid IC₅₀ értéke (mmól/l) vagy %-os gátlás 0,5 mmól/l koncentrációban³

Szekvencia¹⁵------------------------------------------------------------------Amidolitikus apó TF vizsgálat

Amidolitikus ELISA mikrohordozós kötési vizsgálat vizsgálat

Koagulációs mikrohordozós vizsgálat

72-81 (C)	2,40	0,35	89 %	(22 %)
91-102 (C)	0,60		0,04	0,58
91-102 (L)	1,14		0,06	(14 %)
91-102 (anal)^c	1,30		0,05	1,50
103-111	2,20	0,87	59 %	(30 %)
114-127 (C)	(21 %)		(77 %)	(44 %)

a) A 0,5 mmól/l koncentrációnál adott %-os gátlást azoknál a peptideknél adjuk meg, amelyek nem értek el kvantitatív vagy közel kvantitatív gátlást a legmagasabb vizsgálati koncentrációnál (1 mmól/l).

···· ··

-26- ...... · *··

b) A szekvencia számozás a natív humán FVII szekvenciára való hivatkozással történt. A C és L jelölés a diszulfid gyűrűs, illetve lineáris formáira vonatkozik.

c) A 91-102 (anal) szekvencia a 100 helyen glutamin helyett arginin egységet tartalmaz.

12. Példa

A peptid inhibitorok fajlagosságának igazolása

A peptideknek a koagulációs vizsgálatokban megfigyelt hatása elképzelhetőleg származhat a koagulációs kaszkádhoz hozzájáruló néhány komponens közül egy vagy több más komponens hatásából. Ezért ezt a lehetőséget megvizsgáltuk oly módon, hogy olyan peptideket adtunk a koagulációs vizsgálathoz, amelyeket kontakt aktiválással iniciáltunk (Cephotest™, Nycomed), és ezért az intrinzik és a közös koagulációs út koagulációs faktorai voltak jelen, azaz minden koagulációs faktor a TF/FVII kivételével. A 91-102. és 103-111. peptidek inaktívak voltak ebben a rendszerben, míg a X-faktor (FX) kontroll inhibitorai (KAP) és a trombin (Hirudin; HÍR) erősen gátló hatásúak voltak (lásd a 21. ábrán). így bizonyosságot nyertünk arról, hogy az előzőekben ismertetett, a TF/FVII által kiváltott koagulációs vizsgálatokban megfigyelt hatások valóban a TF/FVII komplexre gyakorolt közvetlen hatás következményei.

Claims

1. A

-CVNENGGCEQYCSD-(IA)

-FCLPAFEGRNCE- és(IB)

-RCHEGYSLLADGVSCT-(IC) peptid vegyületek, ezek peptid fragmentumai, észterei, amidjai, sói, gyűrűs származékai és funkciós analógjai alkalmazása szöveti tényezőnek Vll-faktorhoz való kötődésének megelőzésére vagy gátlására.

2. A

-CVNENGGCEQYCSD-(IA)

-FCLPAFEGRNCE- és(IB)

-RCHEGYSLLADGVSCT-(IC) peptid vegyületek, valamint fragmentumaik, észtereik, amidjaik, sóik, gyűrűs származékaik és funkciós analógjaik a

CVNENGGCEQYC(IIA)

CLPAFEGRNC és(IIB)

CHEGYSLLADGVSC(IIC) peptidek kizárásával.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületek, amelyek 5 vagy ennél több aminosavat tartalmaznak.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyületek körébe tartozó

-VNENG- -NGGCEQYCSD- vagy

-ENGGC- -GGCEQYCSD-GGCEQ-CEQYV-

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike körébe tartozó -ENGGA-, -GGAEQ- vagy -AEQYV-.

6. Az 1-3. igénypontok bármelyike körébe tartozó -EQYVNE-.

7. Az 1-3. igénypontok bármelyike körébe tartozó vegyűlet gyűrűs szárma zéka.

8. Az 1. igénypont szerinti IA és/vagy IB vegyületek alkalmazása adott esetben a IC vegyületekkel együtt a Vll-faktornak szöveti faktorhoz való kötődése megelőzésére vagy gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.

9. Az IA és/vagy IB vegyületek alkalmazása adott esetben a IC vegyületekkel együtt Vll-faktomak szöveti faktorhoz való kötődése megelőzésére vagy gátlására.

10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (IA), (IB) és (IC) képletü vegyületeket alkalmazunk, amelyek 5 vagy több aminosavból állnak.

11. Gyógyászati készítmények, amelyek egy vagy több az 1. igénypont szerinti (IA), (IB) és/vagy (IC) képletü peptidet, analógját vagy sóját tartalmazzák egy fiziológiás szempontból elfogadható segédanyaggal együtt.

12. Eljárás az (IA), (IB) és/vagy (IC) képletü vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (IA), (IB) és/vagy (IC) képletü védett vegyületröl a védőcsoportot eltávolítjuk.