CZ334095A3

CZ334095A3 - Compounds containing chains of amino acids, their use and pharmaceutical compositions containing thereof

Info

Publication number: CZ334095A3
Application number: CZ953340A
Authority: CZ
Inventors: Kjell Steinar Sakariassen; Ross Wentworth Stephens; Lars Orning
Original assignee: Hafslund Nycomed As
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1996-07-17
Also published as: EP0703923B1; DE69413817D1; DK0703923T3; CA2164422A1; NZ267453A; US5962418A; FI956055A0; EP0703923A1; AU6975594A; ATE171950T1; JPH08511794A; NO955067L; WO1995000541A1; HU9503593D0; SK156395A3; HUT74873A; DE69413817T2; NO955067D0; FI956055A; CN1125450A

Description

Peptidové sloučeniny

Oblast technikv

Vynález se týká peptidových reagenctí a prostředků z nich, které s snižují tvorbu krevní sraženiny.

Dosavadní stav technikv

Srážení krve se zakládá na řadě nebo kaskádě aktivačních reakcí, což vede k vytvoření konečné fibrinové sraženiny. Kaskáda, vedoucí ke tvorbě fibrinu, může být na počátku spuštěna dvěma různými způsoby: kontaktem s abnormálními povrchy („vnitřní systém“) nebo poraněním cév, které vede k sekreci lipoproteinu, známého jako „tkáňový faktor“ neboli TF („vnější systém“). Předkládaný vynález se v první ředě zabývá vnějším systémem srážení krve.

TF je integrální membránový protein, který se objevuje u mnoha is typů buněk. Buňky, které tvoří TF konstitutivně, např. svalové buňky vnitřní vrstvy cévní stěny, však nejsou za normálních okolností ve styku s krví (viz Edgington a další, Thromb. Haemostas. 66(1): 67 - 69 (1991)). Ukazuje se, že iniciace vnějšího systému srážení krve vyžaduje bud protržení stěny cévy (viz Almus a další, Blood 76: 354 20 360 (1990) a/nebo aktivací endotheliálních buněk nebo monocytů pro tvorbu TF (viz Edwards a další, Blood 54: 359 - 370 (1979)) a Bevilaqua a další, PNAS USA 33: 4533 - 4537 (1986)). Trhlina cévní stěny se může vyskytnout při rozštěpení arteriosklerotického plátu, které vystaví působení krve tkáňové makrofágy a buňky hladkých svalů, (viz Wilcox a další, PNAS USA 86: 2839 - 2843 (1989)).TF může také přijít do styku s krví po poranění cévy při trombolytické terapii, transplantační chirurgii, mechanické obnově průchodnosti cévy ί

Λ

Η» W

-k>> _τ

- 2 nebo dalších podobných technikách. Na druhé straně může být exprese TF v endotheliálních buňkách nebo monocytech indukována během sepse díky produkci tumorového nekrotického faktoru α nebo interleukinu-1 (viz Edwards a další, výše a Gregory a další, J. Clin.

s Invest. 76: 2440 - 2445 (1985)).

Serinová proteáza faktor Vila (FVIla) má funkci ve vnějším systému srážení krve. FVIla je tvořen proteolýzou ze svého inaktivního proenzymu faktoru VII (FVII) dalšími účastníky procesu srážení krve, včetně faktoru Xa, faktoru Xlla, faktoru IXa nebo io thrombinu. Bylo popsáno, že aktivace FVII na FVIla může být podstatně zvýšena, pokud je FVII navázán na svůj kofáktor tkáňový faktor (TF) (viz Nemerson, Semin. Hematol. 29(3): 170 - 176 (1992)). Podle návrhu Yamamota a dalších může přeměna FVII na FVIla. probíhat autokatalyticky (viz J. Biol. Chem. 267(27): 19089 - 19094 ís (1992)).

FVIla tvoří komplex s TF v přítomnosti iontů vápníku a komplex FVIIa/TF katalyzuje v dalším kroku procesu srážení krve cestou vnějšího systému přeměnu faktoru X na jeho aktivní formu, faktor Xa.

Byla zkoumána struktura FVII a sekvence jeho cDNA byla 20 publikována v: Hagen a další, PNAS USA 83: 2412 - 2416 (1986). FVII je protein, závislý na vitaminu K, a analogicky k dalším proteinům, závislým na vitaminu K, byla na jeho aminovém konci identifikována předpokládaná doména γ-karboxyglutamové kyseliny (Gla). Opět analogicky k jiným proteinům, závislým na vitaminu K, bylo předpovězeno, že doména Gla je vyžadována k vazbě na TF (viz Hagen a další, výše). Doména Gla je následována dvěma potenciálními doménami růstového faktoru (GF). Pro tyto domény GF však není v literatuře navržena žádná funkce.

Jako primární krok, vedoucí ke tvorbě fibrinu, byla navržena χ aktivace vnějšího systému srážení krve (viz Weiss a další, Blood 71:

- 3 629 - 635 (1988) a Weiss a další, Blood 73: 968 - 975 (1989); má —proto hlavní význam při pathogenez[ arteriosklerotických poškození a_ reokluzi a restenóze po endarterektomii. Navzdory požadavkům však nejsou k dispozici účinné terapeutické prostředky, schopné zasáhnout s do průběhu aktivace tohoto systému (viz Shepard, TIBTECH 9: 80 - 85 (1991)).

Předkládaný vynález poskytuje peptidy a jejich analoga nebo soli, které zabraňují spojení FVII nebo FVlIa s TF. Zásahem peptidu podle vynálezu je omezena tvorba komplexu FVIIa/TF a proto je ío “omezená aktivace faktorů X.¹' ....... “ ......

*

Určité peptidy, které se ukázaly být užitečnými při léčení krevní srážlivosti, jsou uvedeny ve-WQ-A-91/07432 (Board of Reagents,-The. .

University of Texas System). Publikované peptidy se buď vyskytují v oblasti mezi Gla a prvními, doménami GF nebo v katalytické doméně is FVII nebo FVlIa. Ačkoliv je diskutována inhibice tvorby komplexu

FVIIa/TF, peptidy uváděné ve WO-A-91 /07432, které působí tento efekt, tak činí inhibici funkce Gla. Takové peptidy jsou tedy ve svém účinku nespecifické, protože Gla domény mají další fyziologické proteiny, např. protein C, který vykazuje vysokou homologii sekvence k doméně Gla FVII. Nežádoucím způsobem by peptidy, popisovanými ve WO-A-91/07432, mohla být rovněž narušována funkce proteinu C.

Corvas lne, navrhuje ve WO-A-90/03390, že při inhibici účinku plně zformovaného komplexu FVIIa/TF by mohly být užitečné určité peptidy, odvozené ze sekvence aminokyselin FVII (nebo FVlIa). Ve

WO-A-90/03390 byly uvedeny jako v tomto směru aktivní dvě částečné peptidové sekvence. Sekvence' -VGHFGV- je založena na aminokyselinách 372 - 377 FVII, které jsou umístěny poblíž karboxylového konce. Další sekvence je -SDHTGTKRSCR-, umístěná v' polohách aminokyselin 103 - 113 FVII, která je součástí druhé

-4 domény GF. Corvas lne. poukazují na to, že tyto peptidy a jejich analoga inhibují kaskádovou reakci,.Iniciovanou komplexem FVIIa/.TF...

Dále, v tabulce 1 na straně 14 W090/03390, se uvádí, že z různých oblastí domény GF je aktivní pouze SDHTGTKRSC (103 s 112), a že další oblasti, totiž od aminokyseliny 50 do 101 a od 114 do 127 jsou v inhibicí aktivace faktoru X faktorem VII a tkáňovým faktorem zcela neúčinné.

Ukázali jsme však, že na rozdíl od publikovaných výsledků Corvas lne. je oblast SDHTGTKRSC od 103 do 112 poměrně špatným

4r ·» io inhibitorem vazby faktoru VII na tkáňový faktor, a že určité oblasti, označované jako neaktivní, jsou ve skutečnosti vysoce aktivní.

Na počátku jsme zjistili, že bodová mutace FVII, při které je aminokyselina arginin v poloze 100 nahrazena glutaminem, byla pozorována u 16 norských pacientů, deficientních na FVII, a bylo navrženo, že tato oblast molekuly FVII je důležitá pro aktivitu FVII. Nejprve jsme zjistili, že sekvence aminokyselin 91 - 102 je velmi účinná a že by mohla s užitkem zahrnovat také aminokyseliny 103 a 104. Dále bylo zjištěno, že sekvence aminokyselin 114 - 127, která je.. rovněž umístěna v doméně GF, je poměrně aktivní, zatímco sekvence

2o 103-112 firmy Corvas má pouze mírnou aktivitu.

Dále bylo zjištěno, že sekvence aminokyselin 72 - 81 se chovala synergicky při zvýšení inhibičního účinku peptidů sekvence 91 až 104, a primární užitečnost peptidů, odvozených odoblasti 72 - 81 spočívá v takovýchto synergickýčh kombinacích.

Dále se ukázalo, že úseky výše uvedených sekvencí mají inhibiční účinky a obecně, že pro inhibicí aktivity FVII budou užitečné úseky 5 a více aminokyselin z výše uvedených sekvencí.

-5Podstata vvnálezu

Podstatu předkládaného vynálezu tvoří peptiďy, zahrnující sekvence aminokyselin vzorců:

-CVNENGGCEQYCSD- , IA s -FCLPAREGRNCE-. . .a/.nebo IB

-RCHEGYSLLADGVSCT- IC k

stejně jako úseky peptidů z nich, zvláště úseky s 5 a více aminokyselinami, jejich estery, amidy, soli a cyklické deriváty, jejich funkční analoga a prodloužené peptidové řetězce, nesoucí na koncích

- -₁₀v- výše uvedených sekvencí nebo fragmentů aminokyseliny a peptidy.

Podle jednoho z provedení, vynálezu jsou poskytovány peptidy sekvence IA, IB a/nebo IC, jak je definováno výše, s vyloučením peptidů

-CVNENGGCEQYC- , HA’ is -CLPAFEGRNC- a/nebo IIB

-CHEGYSLLADGVSC- IIC

Kde je to vhodné, sloučeniny vzorce IA, IB a IC a jejich různé deriváty a úseky jsou v textu nazývány pro zjednodušení peptidy IA, peptidy IB a peptidy IC.

so Úseky sekvencí peptidů konkrétně být

-VNENG-ENGGCvzorců IA; IB a/nebo IC mohou

-NGGCEQYCSD-GGCEQYCSD-GGCEQ-CEQYV-6 Našimi výzkumy bylo ukázáno, že v peptidech se sekvencí aminokyselin 95 - 104 je důležitá aminokyselina 95 a že nejúčinnějším dosud testovaným inhibitorem je peptidová sekvence 95 - 104, tedy sekvence NGGCEQYCSD.

Peptidy vzorců li A, HB a UC jsou vyloučeny na základě toho, že byly zveřejněny ve W090/03390 firmy Corvas lne., ačkoliv tam u nich byla uváděna nulová účinnost. Ve W090/03390 není zcela jasně žádný návrh, že by mohl být nějaký prospěch z výroby jakéhokoliv z io dotyčných peptidů, včetně jejich Částí nebo prodloužení, pro použití v boji proti poruchám krevní srážiivosti.

Na základě toho, že W090/03390 nesprávně uváděla pro peptidy vzorců HA a IJ8 nulovou inhibiční aktivitu, jedno hledisko předkládaného vynálezu poskytuje terapeutické a diagnostické použití sloučenin IA a/nebo IB jak je definováno výše k vazbě na tkáňový faktor a tím předcházet nebo inhibovát vazbu tkáňového faktoru na FVII. Peptidové sloučeniny EC budou použity pouze spolu s peptidy IA nebo IB. V zájmu jasnosti se klade důraz na to, že do takového použití; jsou zahrnuty sloučeniny vzorců HA, IIB a IIC.

2o Podle dalšího z provedení vynálezu se poskytují peptidy vzorců

IA a/nebo IB, jak je definováno výše, popřípadě v kombinaci s peptidy vzorce IC, jak je definováno výše.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu, je poskytováno použití sloučenin vzorců IA a/nebo IB, jak je definováno výše popřípadě v kombinaci s peptidy vzorce IC, pro přípravu farmaceutických prostředků pro zabránění nebo znemožnění vazby tkáňového^ faktoru na FVII.

je uvedeno dříve, peptidy se sekvencí vzorce IA jsou

-------nejaktivnéjší—ale jejich aktivita múže být synergicky zvýšena jejich

-7použitím spolu s peptidy vzorců (B a/nebo IC a jejich úseků nebo derivátů. Při takovém.kombinovaném použití mohou být peptidy spolu — jednoduše smíchány, nebo mohou být kovalentně svázány, například pomocí disuifidových vazeb mezi cvsteinovými zbytky, nebo mezerníkovými (spacer) peptidy.

-..Estery peptjdů podle vynálezu zahrnují Cí - C₆ alkylestery a snadno štěp itelné esterové skupiny jako jsou ty, které jsou jmenovány dále jako chráněné karboxylové skupiny.

— . .. Aminokyseliny, a peptidy,. připojené na konce peptidů podle vynálezu mohou nést funkční skupiny, jako jsou ochranné skupiny.

Soli.peptidů .podle vynálezu zahrnují fyziologicky přijatelné soli ··» ^..¼. .. . Ri rJ- -n#, jako jsou kyselé adiční sof i, jako jsou hydrochloridy.

1.

V sekvencích, na které se poukazuje dříve, se používá standardní jednopísmenkový kód pro každou přirozeně se vyskytující aminokyselinu. Tento kód je v oboru standardním názvoslovím a je možno jej nalézt v jakékoliv běžné biochemické učebnici, jako např. „Biochemistry“ Stryer, publikoval W.H. Freeman and Company.

V rámci předkládaného vynálezu jsou zahrnuty funkční analoga takových peptidů. V oboru je dobře známo, že určité aminokyseliny jsou funkčně ekvivalentní a často bylo pozorováno, že výměna takových ekvivalentních peptidů nezpůsobí žádné snížení funkce proteinu. Navíc může být také provedena substituce určitých nepodstatných aminokyselin bez nějaké, nebo bez nějak významné ztráty funkce, i když tyto aminokyseliny byly nahrazeny chemicky nepodobnými aminokyselinami. Navíc jsou známy varianty v přírodě se vyskytujících aminokyselin a substituce takovými molekulami je rovněž zahrnuta do termínu „analog“, jak je zde používán.

t

V sekvenci vzorce I, uvedené výše, může být jakékoliv „C“, představující aminokyselinu cystein, nahrazena alaninem (označen

-8 „A“). Tak peptidy, které jsou zvláště zajímavé, zahrnují -ENGGA-, CGAEQ-a -AEQYV-. .... ................... - - -------I

Navíc, peptidy, odvozené od vzorce ΙΑ, IB a/nebo IC zahrnují chimérické deriváty, ve kterých dvě normálně nesousedící části (obsahující dvě nebo více aminokyseliny) sekvence vzorce I jsou položeny vedle sebe. Příklad takové chimérické sekvence je -EQYVNE-.

Peptidy podle vynálezu mohou být popřípadě cyklické, za předpokladu, že sekvence, která se váže k TF, je pro vazbu konformačné dostupná. Cyklizace může být dosaženo jakýmkoliv dostupným chemickým prostředkem, včetně např. tvorby disulfidových můstků mezi dvěma cysteiny. Příkladem cyklického peptidu, odvozeného ze vzorce I, je

CVNENGGCEQYC. is |_|

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický prostředek, který zahrnuje jeden nebo více peptidů nebo jejich analogů nebo solí, jejichž sekvence aminokyselin zahrnují nebo jsou odvozeny od výše uvedené sekvence vzorce IA, IB a/nebo IC. Peptidy mohou být

2d podávány spolu s fyziologicky přijatelným v oboru známým vehikulem, jehož příklady mohou být voda a olej.

Prostředky podle vynálezu mohou např. být ve formě, vhodné pro orální, nasální, parenterální nebo rektální podávání.

Jak je zde používáno, výraz „farmaceutický“ zahrnuje i 25 veterinární aplikace vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být přítomny „v obvyklých farmaceutických formách, jako tabletách, potahovaných tabletách, nosních sprejích, roztocích, emulzích, prášcích, kapslích nebo ve formách pro trvalé uvolňování. Pro přípravu těchto forem mohou být

-9použita konvenční farmakologická vehikula stejně jako běžné výrobní

---------metody. -Tablety je např. možnoj/yrábětmícháním.aktivní-složky-nebo---------složek se známými vehikuíy, jako např. s diluenty, jako je uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý nebo laktosa. desintegranty, jako je s kukuřičný škrob nebo alginát, vaznými látkami jako škrob nebo želatina, mazadly jako stearan hořečnatý nebo talek a/nebo prostředky pro dosažení trvalého’ uvolňování, jako je karboxypolymethylen, ......

karboxymethylcelulóza, acetát ftalát celulózy nebo polyvinylacetát.

Podle požadavků mohou tablety sestávat z několika vrstev.

1CL· Potahované tablety mohou být vyráběny potahováním jader, získaných podobným způsobem jako tablety, s látkami, které se pro potahování tablet běžně používají, jako např. polyvinylpyrrolidon nebo Šelak, arabská guma, talek, oxid titaničitý nebo cukr.-Aby., bylo. dosaženo . . , trvalého uvolňování nebo aby se vyhnulo nekompatibilitám, jádro může rovněž sestávat z několika vrstev. Za účelem dosažení trvalého uvolňování může rovněž povlak tablety sestávat z několika vrstev, v kterémžto případě mohou být použita vehikula, uvedená výše pro tablety.

Mohou být také použity orgánově specifické systémy nosičů.

Injekční roztoky mohou být například vyráběny obvyklým postupem, jako přídavkem ochranných prostředků, jako jsou p. hydroxybenzoáty, nebo stabilizátorů, jako je EDTA. Roztoky jsou potom-plněny do injekčních lahviček nebo ampulí.

··

Nosní spreje mohou být vytvářeny podobně ve vodném roztoku a baleny do rozprašovacích nádobek buď s pohonným plynem nebo vybavených prostředky pro ruční stlačování. Kapsle s obsahem jedné nebo několika účinných složek se např. mohou vyrábět míšením aktivních složek s inertními nosiči, jako je laktóza nebo sorbitol, a plněním směsi do želatinových kapslí.

-10Vhodné čípky mohou být např. připraveny míšením jedné nebo

-- -několika účinných složek s „běžnými nosiči,, vhodnými .pro .tento, účel, jako jsou přírodní tuky nebo polyethylenglykol nebo jejich deriváty.

Dávkovači jednotky, obsahující sloučeniny podle vynálezu, obsahují s výhodou 0,1 -10 mg, např. 1 - 5 mg peptidu vzorce I nebo jeho soli.

Jak je uvedeno výše, jedno hledisko vynálezu poskytuje peptidy (včetně jejich analogů a solí) podle vynálezu pro použití při léčbě a prevenci poruch nebo obtíží, spojených s krevní srážlivosti. Poruchy io krevní srážlivosti zahrnují trombózy (hlavně vaskulární trombózy nebo trombózy hlubokých cév), akutní infarkt myokardu, restenóza, reokluze, angina, cerebrovaskulární choroba, okluzívní choroba periferních arterií, nadměrná srážlivost a plicní embólie. Peptidy podle vynálezu mohou být také použity k prevenci obtíží, spojených s e srážlivosti krve, způsobených např. poraněním cév v průběhu trombolytické terapie, při transplantační chirurgii, obnovení průchodnosti cév atd. Poruchy srážení krve mohou být spuštěny sepsí produkcí TNF-α nebo IL-1.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob léčení krevní

2o srážlivosti u savců, hlavně lidí, která zahrnuje podávání jednoho nebo více peptidů vzorce IA, IB a/nebo IC, jak jsou definovány výše, včetně sloučenin vzorců HA, IIB a/nebo IIC, nebo jejich analog a solí. Zahrnuty jsou rovněž preventivní metody léčení, kde se podávají peptidy podie vynálezu pacientovi pro zabránění nebo omezení výskytu možných problémů se srážlivosti krve, například během chirurgických nebo jiných invazívních metod. Peptid je ovšem normálně podáván ve formě farmaceuticky přijatelného prostředku.

Dále poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy peptidů, zahrnujících sekvenci vzorce I nebo z ní odvozených, nebo jejich

3o—a na I o g a- n e b o s o I i.———_____——.—, -—---_—___

-.11Peptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány vhodným postupem. Obecně budou během -celé syntézy, chráněny přítomné reaktivní skupiny (např. aminové, thiolové nebo karboxylové skupiny). Konečným krokem syntézy proto bude odštěpení ochranných skupin z s peptidu podle vynálezu.

Při výstavbě peptidových řetězců je možno v podstatě začít od C-konce nebo od N-konce, ačkoliv běžně se používá pouze metoda syntézy od C-konce.

.......Lze .tedy. začít na C-konci reakcj vhodně chráněného derivátu např. lysinu se vhodně chráněným derivátem např. cysteinu nebo cystinu. Lysinový derivát bude mít volnou α-aminoskupinu, zatímco ~ druhý reaktant bude mít buď volnou nebo aktivovanou karboxylovou-skupinu a chráněnou aminoskupinu. Po navázání může být meziprodukt čištěn, např. chromatograficky, a potom selektivně is odstraněna N-ochranná skupina, aby bylo umožněno navázání dalšího aminokyselinového zbytku. V tomto postupu se pokračuje, dokud není požadovaná sekvence aminokyselin úplná.

Substituenty aktivující karboxylovou kyselinu, které mohou být použity, zahrnují symetrické nebo směsné anhydridy, nebo aktivované

2o estery jako např. p-nitrofenylester, 2,4,5-trichlorfenylester, Nhydroxybenzotriazolester (OBt) nebo N-hydroxysukcinimidylester (OSu).

Spojení volných aminových a karboxylových skupin může být např. uskutečněno pomocí dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Dalším použitelným vazebným činidlem může např. být N-ethoxykarbonyl-2¹ >

ethoxy-1,2-dihydrochinolin.

Obecně je vhodné provádět spojovací reakce při nízkých teplotách, např. od - 20 °C až do pokojové teploty, ve vhodném systému rozpouštědla, např. tetrahydrofuranu, dioxanu,

-12dimethylformamidu, methylenchloridu nebo ve směsi těchto rozpouštědel.------------------- Výhodnější může být provádět syntézu na pevném pryskyřičném nosiči. Lze použít např. chloromethylovaného polystyrenu s (zesíťovaného 1 % divinylbenzenu); v tom případě syntéza začíná u Ckonce, např. navázáním N-chráněného lysinu na nosič.

Velké množství vhodných technik na pevné fázi je popsáno u: Eric Atherton, Christopher J. Logan a Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538 - 46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng a R. B. io Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102 6117 - 27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi and R. B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Res. 16 412 - 25 (1980); Manfred Mutter a Dieter Bellof, Helvetica Chimica

Acta 67 2009 - 16 (1984).

Je znám široký výběr ochranných skupin pro aminokyseliny; 15 jejich příklady jsou uvedeny v: Schróder, E., a Lubke, K., The Peptides, díly 1 a 2, Academie Press, New York and London, 1965 a 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, Díly 1 - 4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 a 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, díl 15,

2o Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteines, díl 4 - 8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 a 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1 - 6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt - Siegman, Georg Thieme Verlage Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, synthesís, biology 1 - 7, Edit. Erhard Gross,

Johannes Meienhofer, Academie Press, NY, Sán Francisco, London; Solid phase peptide synthesís, 2. vyd., John M. Stewart. Janis D. Young, Pierce Chemical Company.

Tak např. použitelné skupiny pro ochranu aminoskupin zahrnují ochranné skupiny jako karbobenzoxy (dále také označována Z), t30 _b u toxy ka rb ony l—(d á I e ta k é—ozn a ěo v á n a—B o c) , 4-m e t h oxy-2,3.6 - 13 trimethylbenzensulfonyl (Mtr) a 9-fluorenylmethoxykarbonyl (dále také označována Fmoc). Bude výhodné, že _ pokud_ výstavba peptidu probíhá od C-konce, α-aminoskupina každého nově připojovaného zbytku aminokyseliny bude chráněna ochrannou skupinou; tu bude potřeba selektivně odstranit před následujícím krokem vazby. Zvláště užitečná skupina pro takovou dočasnou ochranu aminu je skupina Fítióč,' kterou ~lze Selektivně odstranit působením piperidinu v organickém rozpouštědle.

Karboxylové ochranné skupiny, kterých lze například použít, zahrnují sriádhó''odštěpitelné'esterové skupiny jako benzyl (Bzi),-pnitrobénzyl (ONb), pentachlořfenyl (OPCIP), pentafluorfenyl (OPFP) nebo t-butyl (OtBu) stejně jako vazebné skupiny na pevných nosičích, * * . — η Λ. - IT J-M“ např. methylové skupiny připojené na polystyren.** * -·* ~ -—· ·

Ochranné skupiny pro thiol jsou p-methoxybenzyl (Mob), trityl (Trt) a acetamidomethyl (Acm).

Je jasné, že existuje široká skupina dalších takových skupin, jak je např. popisuje citovaná literatura, a použití všech takových skupin v popsaných postupech spadá do rámce předkládaného vynálezu.

Pro odstranění ochranných skupin aminoskupin a karboxylových 2d skupin existuje celá řada postupů. Ty však musí odpovídat použité strategii .syntézy. Skupiny, chránící postranní řetězce, musí být stabilní v podmínkách, používaných k odstranění skupin, dočasně chránících α-aminoskupiny před dalším reakčním krokem.

Ochranné skupiny aminoskupin, jako Boc, a ochranné skupiny

2s karboxylových skupin, jako tBu, mohou být odstraněny současně působením kyseliny, např. kyseliny trifluoroctové. Skupiny, chránící thiol, jako Trt, mohou být selektivně odstraněny oxidačním prostředkem, jako je jód.

- 14Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ilustruje inhibici srážení krve různými FVII peptidy a s jejich analogy.

Obrázek 2 ukazuje inhibici aktivity FVII-TF v závislosti na dávce peptidu FVII-5.

Obrázek 3 ukazuje inhibici aktivity FVII-TF v závislosti na dávce peptidu FVII-5d.

io Obrázek 4 ukazuje inhibici aktivace faktoru X různými koncentracemi FVII-5.

Obrázek 5 ukazuje inhibici buňkou zprostředkované aktivace faktoru X neutralizační monoklonální protilátkou proti tkáňovému faktoru (American Diagnostica kat. is č. 4504). Buňky HT-1080 a protilátka byly_t předinkubovány 1 hodinu při pokojové teplotě před přídavkem faktoru VII (5 pM) a faktoru X (56 nM).

Reakce probíhaly 2 hodiny a byly ukončeny přídavkem EDTA, Tvorba faktoru Xa byla monitorována amidolytickým testem za použití čhromogenního substrátu faktoru Xa (Chromogenix,

S2765). Inhibice dosahovala >95 %, což ukazuje na úplnou závislost na tkáňovém faktoru.

Obrázek 6 ukazuje časový průběh aktivace faktoru X při použití

0 nM () a 1 nM (·) faktoru VII.

Obrázek 7 ukazuje závislost buňkou zprostředkované aktivace faktoru X na přidaném faktoru VII. Jsou použity _.____„

-15střední hodnoty trojnásobného stanovení. Variace

-------------------- uvnitř testu byla 12+14 %__________ ...'

Obrázek 8 ukazuje inhibici amidolytické aktivity FXa, tvořené

TF/FVIIa z povrchu buněk HT-1080, TAP (klíšťovým s antikoagulačním polypeptidem

Obrázek 9-ukazuje princip- mikronosičového testu koagulace • krevní plazmy, zprostředkované buněčným povrchem. Živě buňky (např. HT-1080 lidského fibrinosarkomu; ATCC CRL 121), přilehlé k povrchu io mikronosiče, se smísí s pufrem s obsahem vápníku

I a plazmou v inkubační jímce elektromagnetického • t ⁷ ' koagulometru Thrombotrack¹¹^ (Nycomed). Doba srážení je měřena vzrůstem odporu k pohybu magnetické kuličky, způsobeným tvorbou fibrinových vláken. Buňky HT-1080, přichycené na nosiči Cytodex-3, jsou zobrazeny ve spodním rámečku jako příklad použitelných typů buněk, které produkují TF.

Obrázek 10 ukazuje koagulační aktivitu výběru typů buněk,

2o přichycených na mikronosiče. Aktivita je vyjádřena jako jednotky TF na 10^s buněk, vypočtená z kalibrační křivky, vytvořené králičím mozkovým tromboplastinem (Nycomed). Jsou ukázány: RD, buňky lidského rhabdomyosarkomu (ATCC CCL

136); buňky lidského fíbrosarkomu HT-1080 (ATCC

CRL 121); nestimulovaná primární kultura lidských * · - f Λ .

endotheliálních buněk pupeční cévy HE US; bakteriálním lipopolysacharidem (1 pg/ml; 5 . h) stimulované lidské endotheliální buňky pupeční cévy HE ST; lidské endotheliální buňky ECV-304 (ATCC CRL 1998); nestimulované lidské periferiální

- 16 monocyty HM US a bakteriálním lipopolysacharidem

0,5 μρ/πιΙ; 2 h) stimulované lidské periferiální monocyty HM ST.

Obrázek 11 ukazuje závislost koagulace, zprostředkované ECVs 304, na specifických koagulačních faktorech, demonstrovaná použitím imunologicky čisté lidské plazmy (American Diagnostica) v testu s mikronosiči. Za povšimnutí stojí úplná závislost na faktorech VII a X.

io Obrázek 12 charakterizuje koagulační aktivitu na buňkách ECV304 v mikronosičovém testu použitím neutralizační monoklonální protilátky proti lidskému TF (American Diagnostica kat. č. 4504). Téměř veškerá srážecí aktivita může být odstraněna neutralizační ís protilátkou, a tak demonstrovat, že je vysoce závislá na funkci TF

Obrázek13 ukazuje ELISA test inhibice vazby FVII k imobilizovanému rTF, produkované syntetickými peptidy FVII (vše 0,5 mM). Peptidové sekvence obsahuje tabulka 1 (str. 22). C á L označují cyklické, popř.

lineární formy peptidů s koncovými cysteiny.

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, jež však nelze považovat za omezující.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech jsou používány následující zkratky:

TFA :	kyselina trifluoroctová
BocAA:	aminokyselina, chráněná t-butoxylém
BOP :	benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium- hexafluorfosfát
HOBT:	N-hydraxybenzotriazo!
DIEA :	diisopropylethylamin
DCM :	dichlormethan
NEM :	N^ethylmaleimid
EDTA:	kyselina ethylendiamintetraoctová
~DMF :	dimethylformamid — ' . —s.
Příklad 1
Obecná syntéza peptidů

Použité peptidy byly syntetizovány standardními metodami ís chemie na pevné fázi a čištěny preparativní HPLC. Čistota každého peptidu byla kontrolována analytickou HPLC, analýzou aminokyselin a hmotovou spektrometrií. Všechny byly, vyprodukovány v Neosystems

Laboratoire (Strasbourgh, Francie).

Peptidy byly syntetizovány a štěpeny použitím následujícího 20 obecného postupu. Byla použita pryskyřice 4-methylbenzhydrylamín (šarže R2161), na počátku bylo naneseno 0,9 meq/g. Pro každý peptid bylo použito 450 mg (0,4 mmol) výchozí pryskyřice.

1. Syntéza

Po neutralizaci byl použit protokol pro vazbu/odstranění ochranných skupin (objem 10 ml pro každý solvent).

- 18 a) čistý TFA 1 min

b) čistý TFA '3 min

c) promytí proudem methylenchloridu

d) isopropylalkohol 0,5 min

e) dimethylformamid (DMF) 0,5 min (3 krát)

f) promytí proudem dimethylformamidu

Vazba ekvivalentů BocAA, BOP a HOBT bylo rozpuštěno v 5 ml DMF a io přidáno k pryskyřici. Po začátku bublání bylo přidáno 0,5 ml diisopropylethylaminu a míchání pokračovalo 13 minut. Po dvojnásobném promytí DMF byla provedena druhá vazba za stejných podmínek.

Acetylace

Po posledním odstranění ochranných skupin byla provedena acetylace použitím 10 ekvivalentů acetanhydridu a 10 ekvivalentů DIEA v 10 ml DMF.

Doba reakce : 10 minut

Po skončení syntézy byla pryskyřice s peptidem promyta DMF, DCM etherem a potom vysušena v proudu dusíku.

- 19 2. Štěpení

Peptid byl odštěpen z pryskyřice a ochranné skupíňy“odstřaněný působením HF / anisolu (9 / 1 objemově, 10 ml na gram peptidové pryskyřice) při 0 °C po dobu 45 minut.

Po odpaření HF a srážením etherem byi surový peptid rozpuštěn v čisté TFA a filtrován.

TFA byla poté odpařena za sníženého tlaku á peptid byl znovu vysrážen etherem. V tomto stupni byl produkt připraven k Čistění.

3. Čištění a analýza ‘Každý peptid-byl čištěn na HPLC nakoloněs.reverzní fází Ci₃.(15.-25. μιη) za použití lineárního gradientu acetonitril / voda (0,1 % TFA). Frakce s čistotou >95 % byly shromážděny a lyofilizovány. Čištěný peptid byl pak analyzován HPLC a vzorek byl hydrolyzován pro analýzu aminokyselin. Výsledky byly uvedeny v protokolu analýzy, který doprovázel každý peptid.

Základní, strategie pro čištěni byly vždy stejná. Rozdílné byly pouze gradienty, používané pro preparativni čištění, v závislosti na počátečním retenčním čase každého peptidu.

Peptidy, získané výše uvedeným postupem, -nesou na N-konci acetylovou skupinu a CONH2 skupinu na C-konci.

Přiklad 2

Peptid FVII-5

Byla použita pryskyřice Boc-Cys (4-MeBzl) - PAM (šarže 52172) a na počátku bylo naneseno 0,63 meq/g. Bylo použito 0,96 g pryskyřice (0,6 mmol).

-20 Postup syntéza / vazba / štěpení byl použit jako v předchozím příkladu, s následujícími modifikacemi: - ---------------1. Syntéza s a) TFA 55 % v DCM 5 min

b) TFA 55 % v DCM 25 min

2. Štěpení

Po srážení etherem byla peptidová pryskyřice promyta 30 ml 10 % io kyseliny octové ve vodě a lyofilizována. Výsledný peptid z takového štěpení má COOH skupinu na C-konci a NH₂ skupinu na N-konci.

3. Čištění - cyklizace Složení rozpouštědla:

is A: vodná 0,1 % TFA

B: acetonitril / solvent A (40 / 60 objemových dílů).

Surový produkt byl predčištěn na HPLC na reverzní fázi za použití lineárního gradientu acetonitril / voda (0,1 % TFA), 10-80 % B, 30 minut.

Všechny frakce, obsahující lineární peptid s čistotou >80 % byly shromážděny a objem byl doplněn vodou do 0,5 I. pH roztoku bylo nastaveno pomocí DIEA na 8,5 a roztok byl za míchání magnetickým míchadlem ponechán přes noc při pokojové teplotě. Postup cyklizační reakce by! sledován nástřikem vzorku reakční směsi spolu s N25 ethylmaleimidem (NEM).

Po 24 hodinách byla cyklizace ukončena. pH bylo upraveno kyselinou octovou na 2,5 a roztok byl před lyofilizací zakoncentrován za sníženehotlaku. — — · —

-21 Cyklický peptid byl potom Čištěn až na 95 % čistotu HPLC na reverzní fázi .(lineární gradient od 5 do 30 % 8 během 30 minut.

Čistota a identita výsledného produktu byla pak kontrolována analytickou HPLC, analýzou aminokyselin a hmotnostní spektrometrií.

Příklad 3

Peptid FV1I-1

Tento peptid byl syntetizován strategií Fmoc/t-But, vycházelo se z 90 io mg pryskyřice Fmoc-Ala-Wang (0,67 meq/g).

1. Syntéza

Byl použit protokol pro spojování/odstranění ochranných skupin

a) piperidin 25 % v DMF

b) promytí proudem DMF

c) piperidin 25 % v DMF

d) promytí proudem DMF

e) piperidin 25 % v DMF

f) promytí proudem DMF min min min

2. Vazba .i ekvivalentů FmocAA, BOP a HOBT bylo rozpuštěno v 3 ml DMF. a přidáno k pryskyřici. Po začátku bublání bylo přidáno 0,13 ml diisopropyiethylaminu a reakce pokračovala 13 minut. Po dvojnásobném promytí DMF bylo provedeno dvojité spojování za stejných podmínek jako je popsáno výše.

•22 2.- .......Štěpení --- ·' ⁴----- --------- .. . .

Peptid byl odštěpen z pryskyřice a ochranné skupiny odstraněny působením 50 ml směsi TFA (83,3 %), vody (4,2 %), thioanisolu (2,1 s %) a fenolu (6,25 %) po dobu 2,5 hodin.

Po filtraci byla směs nalita do 25 ml studeného etheru. Sražený peptid byl odcentrifugován a dvakrát promyt etherem. Produkt byl potom rozpuštěn ve vodě, lyofilizován a použit bez další purifikace.

io Příklad 4

Pokud není stanoveno jinak, další syntetické peptidy byly připravovány analogicky k postupu, popsaném v příkladu 1. Cyklické sloučeniny byly připravovány metodou podle příkladu 2.

V tabulce 1 jsou uvedeny všechny nesyntetizované peptidy.

Tabulka 1 - Peptidy faktoru VII

Označení_Sekvence_Zbytky v FVII

FVII-12	LFWISYSD	39 - 46
FVII-21	WISYSDGD	41 - 48
FVI-23	SYSDGD	43-48
FVil-7(cyklický)	CASSPCQNGGSC	50 - 61
FVII-13	KDQLQSYI	62 - 69
FVII-8(cyklický)	CLPAFEGRNC	72-81
FVI l-5(lineární)	CVNENGGCEQYC	91 - 102
FVII-5(cyklický)	CVNENGGCEQYC	91 - 102
5A	VNENG	92 - 96
5B	ENGGA	94 - 98
5C	GGAEQ	96 - 100
5D	AEQYV	98 - 102

-23 5E

FVIÍ-4B

FVIí-S(cyklický) FVII - 1

EQYVNE

SDHTGTKRS

- 101 +92 - 94 103-111

CHEGYSLLADGVSC 114-127

GKIPILEKRNA

136 - 146

Příklad 5

Testování aktivity FVIIa/TF

Peptidy (0-1 mM) byly předinkubovány v 0,1 M Tris.HCI pH 7,2 s tkáňovým faktorem (Thromborel®, Behringwerk, Marburg, Germany;

io konečná koncentrace 0,2 %) při teplotě 22 “C po dobu 30 minut, potom bylo přidáno 70 nM faktoru X (American Diagnostica lne., Greenwich, CT USA, následováno 8 pM FVIIa (Diagnostica Stago, Asnieres, France) a 5 mM CaCI₂. Inkubace pokračovaly po dobu 30 minut a byly zastaveny EDTA (50 mM), která odstraní nezbytný Ca²⁺.

is Produkovaný FXa byl kvantifikován monitorováním hydrolýzy čhromogenního substrátu FX, S-2222 (Cromogenix, Mólndal, ^,:iSweden). '*’

Výsledky ukazuje obrázek 1.

Příklad 6

Byl zkoumán účinek různých koncentrací peptidu FVII-5 za použití postupu, popsaného v příkladu 5. Experiment byl opakován s použitím peptidu FVI1-5D.

Výsledky jsou obsaženy v obrázcích 2 a 3.

Příklad 7

Byla zkoumána kinetika inhibice aktivace FX peptidem FVll-5. Byly inkubovány různé koncentrace FVII-5 s různými koncentracemi faktoru X v přítomnosti nebo nepřítomnost TF a FVIIa.

-24Výsledky ukazuje obr. 4. Oba grafy jsou založeny na stejných datech a oba ukazují nekompetitivní inhibici aktivace faktoru X peptidem. FVII-5, tedy že k inhibici dochází v kroku dřívějším, než je vazba faktoru X, tj. že se inhibice týká tvorby komplexu FVII/TF.

Příklad 8

Měření katalytické aktivity apoTF/FVIIa

Tento kolorimetrický test byl použit k přímému měření amidolytícké (katalytické) aktivity čištěného lidského FVIIa, navázaného na rekombinantní lidský TF v nepřítomnosti fosfolipidu.

Protokol

Reakce byly prováděny na mikrotitračních destičkách při konečném objemu pro inkubaci 200 μΙ. Testované sloučeniny, rozpuštěné ve vodě (konečná koncentrace 0-1 mM), byly předinkubovány s rekombinantním lidským tkáňovým faktorem (American Diagnostica, kat. č. 4500, 5 nM) a CaCI₂ (5 mM) ve Tris pufru (100 mM), pH 7,2, který obsahoval NaCl (150 mM) a BSA (1 mg/ml), 30 minut při pokojové teplotě. Byl přidán faktor Vila (Enzyme Research Laboratories, kat. č. HFVIIa, 5 nm) a inkubace pokračovaly ještě 60 minut. Potom byl přidán chromogenní substrát, S2288 (Chromogentx kat. č. 820852, 0,5 mM) a při 405 nm byla sledována enzymatická aktivita komplexu apoprotein tkáňového faktoru / faktor Vil (apoTF/FVIIa).

Příklad 9

Test aktivace FX, zprostředkované povrchovým TF/FVIIa buněk

HT1080

Tento test byl použit pro měření katalytické aktivity nativního komplexu TF/FVIIa na povrchu živých buněk, jejíchž buněčná

-25membrána produkuje TF. Aktivita byla měřena amidolytickou - (katalytickou) aktivitou FXa, produkovaného účinkem .buněčného povrchového TF/FVIIa na přidaný FX, Pro tento test byla zvolena buněčná iinie lidského fibrinosarkomu HT-108Q (American Type

Culture Collection CCL 121).

Protokol

Buňky HT-1080 byly suspendovány, v malém objemu média s obsahem séra a smíseny s mikronosiči (Cytodex-3, Pharmacia) v poměru přibližně 50 - 100 buněk na mikronosič. Buňky se io obvykle přichytí na mikronosiče během 2 hodin a mohou pak být převedeny do obvyklých otáčivých lahví s větším objemem . kultivačního, media. Buňky na mikronosiči byly pak promyty dvakrát pufrem bez vápníku, aby se odstranily navázané sérové faktory. Z devíti různých promývacích pufrů, které byly ís testovány, splňoval následující předpoklady nejlépe Hankúv roztok (Hank's buffered salt solution): i) nízký přenos sérových faktorů, ii) malý vliv na adhezi buněk k mikronosičům, iii) nízké poškození buněčných membrán, a iv) vysoká aktivita povrchového buněčného TF. Míkrokulíčky byly resuspendovány v Hankově roztoku a spočteny.

Potom byl přidán FVII (Enzyme Research Laboratories kat. č. HVII 1007, 5 pM) (a při testech inhibice inhibitor) a směs byla před přídavkem FX (Enzyme Research Laboratories kat. č. HFX 1010, 50 nM) a CaCI₂ (5 mM) ponechána ekvilibrovat 30 minut.

- Rychlost tvorby FX byla určována amidolytickým testem za použití chromogenního substrátu S2765 pro FXa (Chromogenix kat. Č. 821413) přírůstkem absorbance při 405 nm. Aktivita TF byla snadno nastavena jednoduchým zředěním suspenze mikronosičů. Variace výsledků mohla být snížena na minimum ¹ mícháním susupenze při odběru alikvotú. Byla vypočtena ' hodnota 14±7%.

-26 Aktivace FX buňkami byla přesně závislá na TF buněčného povrchu, což mohlo být ukázáno použitím neutralizační monoklonální protilátky proti lidskému TF, jak je znázorněno a obr. 5. Titrace TF, navázaného na buňky, faktorem FVII, ukázala přibližné 11000 molekul TF na buňku nebo 0,8 ng/10⁶ buněk. Aktivace FX byla závislá také na době inkubace a přidaném FVII, (obr. 6 a 7). Měřená aktivita představovaná FXa byla ověřována inhibici aktivity TAP (klíšťový antikoagulační polypeptid; G. Vlasuk, Corvas Int.) (obr. 8).

Příklad 10

L

Test koagulace plazmy, iniciované TF buněčného povrchu.

Byl vynalezen nový testovací systém k měření koagulace krevní plazmy (tj. doby srážení), indukované tkáňovým faktorem (TF), exprimovaným na povrch živých buněk. Test používá lidských nebo zvířecích buněk, přichycených na povrchu mikronosičů (viz obr. 9), což umožňuje reprodukovatelně použít známého množství aktivity TF v míchané měřicí jímce elektromagnetického koagulometru. Použité, buňky mohou být normální nebo transformované, a reprezentovat fenotypy jako monocyty, endothelium, fibroblasty atd. (viz obr. 10)

Tento nový test byl zvláště vyvinut a charakterizován tak, aby byl výhodně použitelný při určování peptidů a peptidomimetických sloučenin na vnější systém koagulace, za použití živých buněk v prostředí plazmy. Jsou uveřejněny výsledky ínhibičního vlivu syntetických peptidů, založených na sekvenci aminokyselin lidského FVII.

Pro'tokoi

Systém buněk na mikronosici se připravuje následujícím způsobem. Buňky, získané z primárních izolátú nebo subkuitur transformovaných linií (viz obr. 10) se suspendují v malém

-λα·-27množství media s obsahem séra a smíchají s mikrortosiči _________________(Cytodex-3, Pharmacía) v poměru přibližně 50 -100 buněk na_ mikronosič. Buňky se obvykle přichytí na mikronosiče během 2 hodin a mohou pak být převedeny do obvyklých otáčivých lahví s větším objemem kultivačního media. Stejnoměrné pokrytí mikronosičú přibližně 20 - 60 buňkami se dá získat přímo v případě transfdrřnováných buněk, kde je k dispozici velké množství buněk, nebo po dvou dnech růstu,* když se používá primárních buněčných kultur (např. endotheliálnich buněk io - pupeční _ cévy). Primární kultury buněk, neprodukujících TF (např. monocyty nebo endotheliální buňky) mohou být k expresi TF stimulovány inkubací přichycených buněk s látkami jako “bakteriální'lipopolysacharid (LPS) -nebo -tumorový-nekrosní faktore alfa. (TNF-α) (viz obr. 10).

K určení vnější koagulační aktivity se připravené buňky na nosičích nejprve promyjí pufrem bez vápníku, aby byly odstraněny navázané sérové faktory. Potom se přidá .pufr s obsahem vápníku a plazma, a čas srážení je určován automaticky v elektromagnetickém koagulometru. Doba srážení může být snadno nastavena (např. 35 s) jednoduchým naředěním suspenze mikronosičú a reprodukovatelnosti je snadno dosaženo mícháním suspenze při odběru alikvotů. Doba srážení může být převedena na arbitrární jednotky TF kalibrační křivkou log-log, vytvořenou pmpcí králičího mozkového tromboplastinu.

Lze ukázat, že získaný systém představuje, přesně vnější systém srážení, a to použitím sady vzorků lidské plazmy, ze kterých byl imunologicky odstraněn každý z koaguiačních faktorů. Koagulace, zprostředkovaná např. lidskými endotheliálními buňkami ECV304 (American Culture Collection CRL-199S), jasně závisí na FVlIa na FX (obr. 11). I když není FX aktivován přímo, koagulace je

-28 zprostředkována buněčným povrchem TF/FVII. Že aktivita tohoto prokoagulantu skutečně představuje koagulaci, zprostředkovanou TF, bylo demonstrováno použitím neutralizační monoklonální protilátky— proti lidskému TF, která může zrušit veškerou koagulační aktivitu (obr.12).

Příklad 11

ELISA test inhibice TF/FVII peptidy FVII

Výsledky inhibice, jak je uvádí obrázek 13, ukazují, že navíc k ío sekvencím ze „stěžejní“ oblasti (tj. zbytků 41 - 48 mezi GLA doménou a první EGF doménou , UNIVERSITY OF TEXAS) a ze samotné první domény (tj. zbytků 50-61, Clarke a další), existují další sekvence ve druhé doméně BGF, které jsou inhibitory,'pokud jsou přítomny jako peptidy v průběhu tohoto testu vazby.

Výsledky uvedených testů inhibice peptidů shrnuty v následující tabulce:

Shrnutí výsledků inhibice peptidů

peptid FVII sekvence¹⁵	IC₅₀ (mM) nebo % inhibice při 0,5 mM ^a
Amidolytic- ký test apoTF	Amidolytic- ký test mikronosič	ELISA vazebný test	Test koagulace mikronosič
72-81 (C)	2,40	0,35	89 % i,	(22 %)
91 -102 (0)	0,60		. 0,04	0,53
91 - 102 (L)	1,14		0,06	(14 %)
91-102 (anal)^c	1,30		0,05	1,50

103 - 111	2,20	0,87	59 %	(30 %)
T14 - 127 (C)	-—(21 %)		(77 %) -	• (44%)

’) Procenta inhibice při 0,5 mM jsou udána pro ty peptidy, které nedosáhly kvantitativní nebo téměř kvantitativní inhibice při nejvyšší končentrácí v těstu (1 mM):

^b) Udaná čísla sekvencí se vztahují k nativní sekvenci lidského FVII. C a L znamenají disulfidicky cyklizovanou, popř. lineární formu.

^c) 91 - 102 (anal) má v poloze 100 na místo glutaminu argininový zbytek.' ’ ‘ -10

Příklad 12

Ověření specíficitv peptidových inhibitorů

Účinek peptidú, pozorovaný v koagulačním testu, by případně mohl být způsoben účinkem jiné, nebo jiných složek, které přispívají ke is koagualční kaskádě. Tato možnost byla proto testována přídavkem takových peptidu ke koagulačním testům, které jsou iniciovány kontaktní aktivací (Cephotest™, Nycomed), a proto působí jako koagulační faktory ve vnitřním a společném systému koagulace, tj. všechný koagulační faktory kromě TF/FVII. Peptidy 91 - 102 a 103 20 111 byty v tomto systému inaktivní, zatímco kontrolní inhibitory FX (TAP) a thrombin (Hirundin; HIR) měly silně inhibiční účinek (viz obr. 11). Tím byl získán důkaz, že účinky, pozorované v testu koagulace iniciované TF/FVII, byly skutečně přímo způsobené komplexem

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptidové sloučeniny

-CVNENGGCEQYCSD- , IA

5 -FCLPAFEGRNCE- a IB

-RCHEGYSLLADGVSCT- IC stejně jako úseky peptidů z nich, jejich estery, amidy, soli a cyklické deriváty a jejich funkční analoga pro použití při io zabránění nebo znemožnění vazby tkáňového faktoru na

FVII.
2. Peptidové sloučeniny

-CVNENGGCEQYCSD- 1 IA 15 -FCLPAFEGRNCE- a IB -RCHEGYSLLADGVSCT- IC

stejně jako úseky peptidů z nich, jejich estery, amidy, soli a cyklické deriváty a jejich funkční analoga s vyloučením

20 peptidů

-CVNENGGCEQYC- f HA -CLPAFEGRNC- a HB -CHEGYSLLADGVSC- IIC

2s
3. Sloučeniny podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahují 5 nebo více aminokyselin.

-31
4. Sloučeniny podle některého z nároků 1 až 3, které jsou ........ --- - VNENG-, -ENGGC-, -GGCEQ-, -CEQYV-.

-NGGCEQYCSD-, -GGCEQYCSD-, -ENGGA-, CGAEQ-, -AEQYV- a -EQYVNE-.

s
5. Sloučeniny podle některého z nároků 1 až 3, které jsou jejich cyklickými-deriváty,
6. Použití sloučenin vzorců IA a/nebo IB definovaných v nároku 1, popřípadě spolu s peptidy vzorce IC, pro přípravu farmaceutických prostředků k zabránění nebo znemožnění io vazby FVII na tkáňový faktor.

*'·.· . - u.

“* ** * - a
7. Použití sloučenin vzorců IA a/nebo IB, popřípadě 'spolu s peptidy vzorce IC, pro zabránění nebo znemožnění vazby FVII na tkáňový faktor.
8. Použití podle některého z nároků 6 nebo 7, vyznačuis j i c í se tí m , že sloučeniny vzorce IA, IB a/nebo IC mají 5 nebo více aminokyselin.
9. Farmaceutické prostředky vyznačující se tím, že obsahují jeden nebo více peptidů vzorce IA, IB a/nebo IC, definovaných v nároku 1, nebo jejich analoga nebo soli

20 spolu s fyziologicky přijatelným vehikulem.

-3210. Způsob přípravy sloučenin vzorce IA, IB a/nebo IC, definovaných v nároku 1, vyzná cu'jTč'í‘š'e t í m„ že zahrnuje krok odstranění ochranných skupin z chráněného derivátu sloučeniny vzorce IA, IB a/nebo IC.

Obrázek 1

Inhibiční účinek syntetických peptidových analogů faktoru VII na aktivitu systému faktor VII / tkáňový faktor

Aktivita (%) Aktivita (% kontroly) (>

Analoga peptidů faktoru Vil (0,3 mM)

Obrázek 2

-35 Inhibice faktoru Vtl/TF cyklickým peptidem VII-5

Aktivita (%) log VII-5

-36 Obrázek 3 Inhibice faktoru VII/T-F-.p.ep.tiíie.rn VII-50

Aktivita (%) log V11-5D

- 37 Obrázek 4

Inhibice aktivace FX peptidem VI1-5 jako funkce koncentrace FX

• 10nM 0 20nM Δ 30nM

- 38 Obrázek 5 «

- Inhibice tv.orby.FXa prostřednictvím HT-11080 ΑΝΤΙ TF MAb#4504

Tvorba FXa (%)

ΑΝΤΙ TF MAb#4504 (pg/ml)

Obrázek 6

Časový průběh aktivace FX buňkami HT-1080

-40 Obrázek 7

Závislost tvorby FXa na koncentraci FVII , 41 Obrázek 8

Inhibice FXa, produkovaného TF/FVIIA na povrchu buněk HT1080, TAP

-42’

Obrázek 9

MikronosiČový test koagulace krevní plazmy působením TF z buněčného povrchu

Čas 0

Buňky HT-1080 , přichycené na mikronosiči Cytodex-3

-43 Obrázek 10

Koagulace , způsobená TF z buněčného povrchu aktivita vybraných kmenů buněk

HM ST

- 44 Obrázek 11

-Účinek ...specifického odstranění koagulačních faktoru na koagulaci prostřednictvím ECV-304

Aktivita (% kontroly)

V Vil VII! IX X XI XII Odstraněný faktor

-45Obrázek 12

Inhibice koagulace prostřednictvím ECV-304 monoklonální