JP2003503426A

JP2003503426A - ＦＶＩＩａアンタゴニスト

Info

Publication number: JP2003503426A
Application number: JP2001507270A
Authority: JP
Inventors: デニス，マーク，エス．; アイゲンブロット，チャールズ; ラザルス，ロバート，エー．
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2003-01-28
Also published as: AU781618C; US20030119727A1; WO2001001749A3; IL147269A0; EP1196432A2; AU781618B2; WO2001001749A2; AU5910700A; CA2373735A1; US7084109B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＦＶＩＩａ媒介又は関連過程又は事象、例えばＦＸからＦＶａへの、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの、又はＦＩＸからＦＩＸａへの変換などを阻害又は阻止する新規な化合物に関する。特別な態様では、本発明の化合物はＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、そのチモーゲンＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に結合し、及び／又はＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａの本発明の化合物との結合を阻止する。また本発明は新規な化合物を含有する製薬組成物並びにその診断、治療、及び予防法における用途も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、ＦＸからＦＸａへの、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの、又はＦＩＸか
らＦＩＸａへの触媒的変換等のＦＶＩＩａ媒介又は関連プロセス又は事象を阻害
又は阻止する新規な化合物に関する。特別な態様では、本発明の化合物は因子Ｖ
ＩＩａ（ＦＶＩＩａ）、そのチモーゲン因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）に結合し、及び
／又はＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａの本発明のペプチド化合物との結合を阻止する。
また本発明は、新規な化合物を含む製薬組成物並びにそれらの研究、診断、治療
、及び予防方法における使用にも関する。

【０００２】（関連する開示の説明）因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）はトリプシン様血漿セリンプロテアーゼであり、
凝固カスケードの外部経路を通してホメオスタシスに参画している（Davie等, (
1991) Biochem. 30(43): 10363-10370）。ＦＶＩＩａは、そのチモーゲン因子Ｖ
ＩＩ（ＦＶＩＩ）から１個の内部ペプチド結合の分解によって変換する。循環し
ているＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩａへの結合に先立って、ＦＶＩＩは、血管内皮細
胞により血漿から分離された細胞上で連続的に発現される組織因子（ＴＦ）と結
合する（Carson, S.D. 及びJ.P. Bronza, (1993) Blood Coag. Fibrinol. 4: 28
1-292）。ＴＦ及びＦＶＩＩはカルシウムイオンの存在下で１対１のタンパク質
複合体（ＴＦ-ＦＶＩＩａ）を形成する（Wildgoose等, (1993) Biochem. 32: 11
4-119）。この結合は、Ｃ-末端ＥＧＦドメイン（ＥＧＦ２）とプロテアーゼドメ
インとの間に位置する部位（ヒトＦＶＩＩ（ｈＦＶＩＩ）についてはＡｒｇ１５
２-Ｉｌｅ１５３）におけるＦＶＩＩのＦＶＩＩａへのタンパク質分解を促進す
る（Hagen 等, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2412-2416）。多くの
セリンプロテアーゼがインビトロでＦＶＩＩを活性化するが、ＦＶＩＩのインビ
ボ活性化に寄与するプロテアーゼは知られていない（Wildgoose等, 上掲）。

【０００３】ＴＦはＦＶＩＩａに対する補因子として作用し、膜近傍でＴＦのＣ-末端にお
いて相互作用するＦＶＩＩａＧｌａドメイン及びＮ-末端ドメイン全体に配置さ
れるＦＶＩＩａプロテアーゼドメインを有する（Higashi等, (1994) J. Biol. C
hem., 269:18891-18898）。ヒトＴＦ（ｈＴＦ）細胞外ドメイン及びその活性部
位阻害ＦＶＩＩａとの複合体が、最近ｘ線結晶分析によって同定された（Harlos
等, (1994) Nature 370: 662-666; Muller等, (1994) Biochemistry 33: 10864;
Banner等, (1996) Nature 380: 41-46）。ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体は、外因性血液凝固の第一次的な開始剤を構成する（
Carson, S.D.及びJ.P. Brozna, (1993) Blood Coag. Fibrinol., 4: 281-292; D
avie, E.W.等 (1991) Biochemistry, 30: 10363-10370; Rapaport, S.I.及びL.V
.M. Rao, (1992)Arterioscler. Thromb., 12: 1111-1121）。この複合体は、Ｆ
ＸからＸａ因子（ＦＸａ）、ＦＩＸからＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、及びそれに加
えてＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化により外因性経路を開始させる。ＴＦ−
ＦＶＩＩａの作用は最終的にプロトロンビンからトロンビンへの変換を誘発し、
多くの生物学的機能を実行する（Badimon, L.等 (1991) Trends Cardiovasc. Me
d. 1: 261-267）。トロンビンの最も重要な機能は、フィブリノーゲンのフィブ
リンへの変換であり、それは重合して凝血塊を形成する。またＴＦ−ＦＶＩＩａ
複合体は、接触活性化系の生理学的効果を拡張する二次的因子としても関与して
いる。

【０００４】この血漿プロテアーゼ系の関与は、動脈及び静脈の血栓症、敗血性ショック、
成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、播種性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）及び他の
様々な疾患状態を含む種々の臨床的表現型に重要な役割を果たしていることが示
唆されている（Haskel, E.J.等 (1991), Circulation, 84: 821-827; Holst, J.
等 (1993) Haemostasis, 23(補1): 112-117; Creasey, A.A.等 (1993) J. C1in.
Invest., 91: 2850-2860; またColman, R.W. (1989)N. Engl. J. Med., 320: 1
2071209; Bone, R.C. (1992) Arch. Intern. Med., 152: 1381-1389も参照）。ＦＶＩＩのプロテアーゼドメインと反応性の抗体がＴＦ-ＦＶＩＩａタンパク
質分解機能を阻害することが示された（Dickinson 等, (1998) J. Mol. Biol. 2
77: 959-971）。ＶＩＩ因子のＥＧＦ２ドメインに想到するペプチドは、ＦＸの
ＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介活性化の潜在的な阻害剤である（Husby等, J. Peptide Res
. (1997) 50: 475-482）。ＦＶＩＩの種々の領域（例えば、ｈＦＶＩＩのアミノ
酸残基３７２−３３７及び１０３−１１２）に対応する幾つかのペプチドが、そ
れらのＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介凝固を阻害する能力に基づいて治療的抗凝固剤とし
て提案されている（国際公開公報WO 90/03390; 国際公開公報WO 95/00541）。Ｔ
Ｆ結合できる活性部位修飾されたＦＶＩＩ変異体は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ媒介凝固
の防止のための製薬組成物として提案されている（国際公開公報WO 91/11515）
。国際公開公報WO 96/40779は、ＦＸ活性化を阻害するＴＦのペプチド断片を記
載している。米国特許第5,759,954号、第5,863,893号、第5,880,256号及び第5,8
34,244号は、ＴＦ-ＦＶＩＩａ活性を阻害し、組織因子開始プロトロンビン時間
（ＰＴ）の延長が示された変異体クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤を記載し
ている。これは、これらのＴＦ-ＦＶＩＩａ活性部位がＴＦ-ＦＶＩＩａ複合体の
阻害を通してＦＸ活性化を防止する能力に一致する。

【０００５】（発明の概要）本発明は、ＦＸからＦＸａへの、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの、又はＦＩＸか
らＦＩＸａへの触媒的変換等のＦＶＩＩａ媒介又は関連プロセスを阻害し、それ
により血液凝固の外因性経路の開始事象を阻止する化合物及び組成物を提供する
。さらに、本発明の組成物は、ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａに結合し、ＦＸのＴＦ-
ＦＶＩＩａ媒介活性化を阻害することにより、内因性ＴＦの血栓性効果を中和す
ることができる。従って、本発明の組成物は、ＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介又は関連プ
ロセスを阻害するための治療及び予防方法において有用である。有利には、この
組成物は潜在的なＦＶＩＩａの阻害を可能にし、及びＴＦ-ＦＶＩＩａは、好ま
しい実施態様では、低用量の製薬製剤をの提供を可能にする。従って、本発明は、ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａへの結合によって、ＦＶＩＩ又は
ＦＶＩＩａ媒介凝固事象を阻害する化合物を提供する。これらの化合物は、好ま
しくはＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａに結合し、約１００μＭ、好ましくは約１００ｎ
Ｍ未満のＫｄを持ち、好ましくは実質的に凝固カスケードの他のプロテアーゼの
活性を阻害する。本発明の化合物は、例えば、ペプチド又はペプチド類似物など
のペプチド誘導体であり得る。そのような化合物の特別な例は、線状又は環状ペ
プチド及びそれらの組み合わせであり、好ましくは約１０から１００アミノ酸残
基の長さであり、場合によってはＮ-末端又はＣ-末端或いは両方において修飾さ
れていてもよく、それらの塩及び誘導体、機能的類似物であり、ＦＸのＦＶＩＩ
ａ媒介活性化の阻害に使用するための配列の末端にアミノ酸又はポリペプチドを
持つ延長されたペプチド鎖である。

【０００６】さらに本発明は、ＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介活性化を阻止する化合物の
同定方法を提供し、当該方法は：（１）ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを本発明の化合物と、候補化合物の存在下及び不
存在下において、本発明の化合物のＦＶＩＩＦＶＩＩａへの特異的結合が起こる
条件下で接触させ；（２）候補化合物の存在下及び不存在下において生じた本発明のペプチド化合
物のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの特異的結合の量を検出する工程を含んでなり、候
補化合物不存在下における結合量に対する候補化合物存在下における結合量が当
該候補化合物がＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性化を阻止する能力を示す。さらに本発明は、限定されないがＴＦ７６（配列番号：８）のペプチド結晶を
含むペプチド結晶、及びそれらのここに記載する種々の方法における使用を提供
する。一態様によると、本発明は、本発明のペプチドのペプチド模倣物又はペプ
チド類似物の同定方法を提供し、当該方法は、小分子データベースを、本発明の
ペプチド結晶から誘導されたパラメータ、例えばＴＦ７６について記載されたも
のでスクリーニングする工程を含む。従って、特別な態様によれば、本発明は、
ここに提供するペプチド化合物の構造パラメータを使用して同定されたペプチド
類似物及びペプチド模倣物などの化合物の同定に関する。

【０００７】さらに本発明は、ＦＸのＦＸａへの活性化を阻害する方法を提供し、当該方法
は、ＦＶＩＩをＴＦと、本発明のペプチド化合物（即ち、或る態様では、ＦＶＩ
Ｉ／ＦＶＩＩａと本発明のペプチド化合物との相互作用を防止する化合物）の存
在下でＴＦ-ＦＶＩＩａ複合体の形成が可能な条件下で接触させ、さらにＴＦ-Ｆ
ＶＩＩａ複合体をＦＸと接触させる工程を含む。本発明のこの態様によると、接
触工程はインビボ又はインビトロで行ってよい。特別な態様では、本発明は、ペプチド化合物と他のペプチド化合物又は他のタ
ンパク質、特に血清タンパク質又はペプチドとの組み合わせに関する。この組み
合わせは種々の目的を意図して調製され、例えば、ここに記載する種々の多量体
化ドメインの使用によるペプチド化合物のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対する親和性
又は結合活性の向上；例えばペプチド化合物のＺタンパク質融合物としての発現
によるペプチド化合物の安定性の向上又はその回収及び精製の促進；及び、例え
ば血清半減期の延長又は短縮による、又は例えばペプチド化合物の血清アルブミ
ン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフェリンなどの血漿タン
パク質への融合（このような融合は、組換え宿主細胞において、又は二官能性架
橋剤の使用により便利になされる）による、ペプチド化合物のインビボ使用を含
む本発明の態様におけるペプチド化合物の治療的有効性の向上を含む。

【０００８】さらに本発明は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介疾患の治療のためのペプチドなど
の化合物を含有する、製薬組成物を含む組成物、並びにキット及び製造物を包含
する。キット及び製造品は、好ましくは：（ａ）容器；（ｂ）前記容器上のラベル；及び（ｃ）前記容器内に収容された本発明の抗体又は抗体断片を含む組成物を含ん
でなり；当該組成物はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介疾患の治療に有効である。好ま
しくは、前記容器上の任意のラベルが当該組成物がＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介疾
患の治療に使用でき、前記組成物中の化合物が、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合し
てＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介活性化を防止する化合物を含むことを表示す
る。キットは、場合によっては、製薬的に許容されるバッファーを収容した第二
の容器及び凝血関連疾患の治療のために組成物を使用するための指示といった付
属的成分を含む。また、凝固障害疾患、特にＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ又はＴＦ-ＦＶＩＩａ複合体
の包含によって特徴づけられるものの治療に有用な方法も開示される。従って、
本発明は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ又はＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介疾患又は障害を、必
要とする宿主において治療する方法を提供し、当該方法は、宿主に本発明の化合
物の治療的有効量を投与することを含む。この方法は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ又
はＴＦ-ＦＶＩＩａ関連事象を防止、阻止又は阻害するのに有用である。好まし
い実施態様では、本発明の方法は、血液凝固に伴う組織損傷の重篤さ又は程度を
緩和又は防止するために用いられる。

【０００９】さらに本発明は、本発明の化合物の様々な投薬形態を提供し、限定されないが
、化合物の腸管外、経口、直腸及び肺投与に適したものを含む。本発明の好まし
い態様では、吸入に適した治療的投薬形態を提供し、本発明はＦＶＩＩ／ＦＶＩ
Ｉａ媒介又は関連プロセス又は事象の治療的処置、例えば本発明の化合物の肺性
投与を介するＦＸの活性化を提供する。より詳細には、本発明は、本発明の化合
物、特にペプチド化合物の、吸入による肺性投与に関する。即ち、本発明は、本
発明の化合物、より好ましくは本発明のペプチド化合物の、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩ
ａ媒介又は関連プロセス又は事象を阻止又は防止するのに有効な量と分散剤とを
含有するエアロゾル製剤を提供する。一実施態様では、本発明の化合物、特に本
発明のペプチド化合物は、液体エアロゾル製剤で提供される。あるいは、化合物
は乾燥粉末エアロゾル製剤として提供することもできる。従って、本発明による
と、製剤は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ又はＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介又は関連事象の治
療のための本発明の化合物の他の腸管外経路に代えて、有効かつ非侵襲で提供さ
れる。

【００１０】（好適な実施態様の詳細な説明）定義特許請求の範囲及び明細書で使用する用語は、特に断らない限り以下に記載す
るように定義される。説明を通して使用される略語は次のものを含む：ＩＸａ因子についてのＦＩＸ
ａ及びチモーゲンＩＸ因子についてのＦＩＸ；Ｘａ因子についてのＦＸａ及びチ
モーゲンＸ因子についてのＦＸ；ＶＩＩａ因子についてのＦＶＩＩａ；組織因子
についてのＴＦ；組織因子−ＶＩＩａ因子複合体についてのＴＦ-ＦＶＩＩａ；
ＦＶＩＩ及び／又はＦＶＩＩａについてのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ；細胞外ドメイ
ンアミノ酸残基１−２１９からなる可溶性組織因子についてのｓＴＦ又はＴＦ_１ _−２１９；細胞外ドメイン及び膜貫通アミノ酸残基１−２４３からなる膜組織因
子についてのＴＦ_{１−２４３}（Paborsky等, (1991) J. Biol. Chem., 266: 2191
1-21916）；プロトロンビン時間についてのＰＴ；活性化部分トロンボプラスチ
ン時間についてのＡＰＴＴ。「薬剤」及び「化合物」という表現は、本発明の範囲内では交換可能に使用さ
れ、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと本発明のペプチド化合物との間の相互作用を阻止又
は防止する任意の分子又は物質を意味する。このような分子は、小有機分子及び
生体有機分子、例えばペプチド模倣物及びペプチド類似物、抗体、免疫グロブリ
ン、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリ
ゴ糖類、核酸、製薬剤及びそれらの対諸物などを含む。本発明の好ましい化合物
は、本発明のペプチド化合物のペプチド類似物又は模倣物を含む。これらは、例
えば、化合物がここに記載するＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ阻害活性を保持するならば
非天然発生アミノ酸を含むペプチドを含む。同様に、ペプチド模倣物及び類似物
は、本発明のペプチド化合物の構造に類似し、記載するＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ阻
害活性を保持する非アミノ酸化学構造を含んでもよい。このような化合物は、一
般的には、対応するペプチド化合物で見られるような適当な空間配置において存
在するサイズ、電荷又は疎水性といった類似の物理的特徴を示す。ペプチド模倣
化合物の特別な例は、一又は複数のアミノ酸の間のアミド結合が、例えば、炭素
−炭素結合又はこの分野で知られた他の結合に置換された化合物である（例えば
、Sawyer, in Peptide Bases Drug Design, pp. 378-422 (ACS, Washington DC
1995)を参照）。

【００１１】ここで使用される用語「ペプチド」は、束縛された（即ち、例えば、βターン
又はβプリーツシートを開始するアミノ酸の存在のような構造の要素を有する、
又はジスルフィド結合されたＣｙｓ残基の存在により環化された）あるいは非束
縛（例えば線状）アミノ酸配列を意味し、約５０アミノ酸残基、好ましくは約４
０アミノ酸残基未満であり、それ又はその間の二量体などの多量体を含む。約４
０アミノ酸残基未満のペプチドの中で、好ましくは約１０から約３０アミノ酸残
基のペプチド、特に約２０のアミノ酸残基のペプチドである。しかしながら、こ
の開示を読むに当たり、当業者は、ペプチドを識別するのは特定のペプチドの長
さではなく、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合及びここに記載のペプチド化合物と
の結合競合能力であることを理解するであろう。従って、例えば、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４及び２５アミノ酸残基は、本発明の内容において等し
く化合物であり得る。「アミノ酸」は本発明の範囲内では天然起源Ｌ−α−アミノ酸または残基を意
味する。各アミノ酸について通常に使用される用語および三文字略号をこの明細
書では使用する(Lehninger, A.L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92(1975)、Wo
rth Publishers, New York）。この用語はＤ-アミノ酸並びにアミノ酸類似物な
どの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれない
天然発生アミノ酸、及びこの分野でアミノ酸の特徴であると知られた特性を持つ
化学合成された化合物を含む。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同様のペプチド
化合物のコンホメーション的制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの
類似物又は模倣物は、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物
は、ここで、アミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Ro
berts及びVellaccio (The Peotides: Analysis, Synthesis, Biology,) Eds. Gr
oss and Meiehofer, Vol. 5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に列挙され
、それをここに参考として取り入れる。

【００１２】本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なア
ミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペ
プチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のア
ミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。保存的
アミノ酸置換の最大の組は以下の通りである：（１）疎水性：His, Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala; （２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr; （３）極性：Ser, Thr, Asn, Gln; （４）酸性／負に荷電：Asp, Glu; （５）荷電：Asp, Glu, Arg, Lys, His; （６）正に荷電：Arg, Lys, His; （７）塩基性：His, Lys, Arg; （８）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro; 及び（９）芳香族：Trp, Tyr, Phe, His さらに、構造的に類似したアミノ酸は、特定のアミノ酸の幾つかと保存的に置
換できる。構造的に類似するアミノ酸は：（Ile, Leu, 及びVal）；（Phe及びTy
r）；（Lys及びArg）；（Gln及びAsn）；（Asp及びGlu）；及び（Gly及びAla）
を含む。この点において、アミノ酸は、側鎖の嵩、電荷及び／又は疎水性に基づ
いて置換されると理解される。アミノ酸残基は、それらの側鎖基について環状又は非環状、芳香族又は非芳香
族として更に分類され、これらの名称は当業者の常識である。

【００１３】

【００１４】例えば、ここに記載する標準的な固相合成技術で合成されたペプチドは、アミ
ノ酸を含む置換のために遺伝子にコードされたアミノ酸に限定されない。遺伝子
コードにコードされない共通に見られるアミノ酸は、例えば、国際公開公報WO 9
0/01940及び下記の表Ｉに記載されるもの、並びに、例えば、Ｇｌｕ及びＡｓｐ
についての２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-ア
ミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸について
の２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸に
ついての２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチ
ル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラ
ニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ
、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及
びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについての
ヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシルリジン（Ａ
Ｈｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３-(及び４)ヒドロキシプロ
リン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イ
ソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのアミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ
、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン
）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他
の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミ
ノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての
オルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉ
ｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ＰｈｅについてのＮ-メチルフェ
ニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、
Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンである。

【００１５】

【００１６】突然変異誘発に適した抗体の或る残基又は領域の同定のために有用な方法は、
Cunningham及びWells (1989), Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されてい
るように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残
基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基
）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリ
ン）に置換され、アミノ酸とＦＩＸＧｌａドメインとの相互作用に影響を及ぼす
。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位
において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる
。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質
は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するため
に、Ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実
施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。タンパク質又はペプチドライブラリのファージディスプレーは、向上した親和
性、変化した特異性、又は向上した安定性を持つ化合物の選択についての他の方
法論を提供する（Smith, G.P., (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 668-673;
Lowman, (1997) Ann. Rev. Biomol. Struc. 26: 401-404）。一価形態でＭ１３
遺伝子ＩＩＩコートタンパク質との融合物として表示された高親和性タンパク質
（Clackson, T., (1994)等, Trends Biotechnol. 12: 173-183）は、クローニン
グ及び多くのラウンドの結合選択の後にファージミド粒子にパッケージされた対
応するＤＮＡの配列決定によって同定される。

【００１７】他の化合物は、免疫原ポリペプチド、例えば、ベータラクタマーゼ等の細菌性
ポリペプチド又は大腸菌Ｔｒｐ位置にコードされる酵素又は酵母タンパク質、プ
ロテインＡのＺドメイン等の他のポリペプチド、及び免疫グロブリン定常領域又
は他の免疫グロブリン領域等の長半減期を持つタンパク質とのＣ-末端融合物、
アルブミン、又は1989年4月6日に公開された国際公開第WO89/02922号公報に記載
されたフェリチンの、ここに述べた化合物の−又はＣ-末端への融合物を含む。
さらに、アミノ酸残基の側鎖上の遊離の官能基も、アミド化、アシル化又は、例
えば、化合物の溶解性をその活性に影響を与えず変化させることのできる他の置
換によって修飾することができる。「Ac-」は、例えばＣＨ_３ＣＯ-修飾Ｎ末端を
示し、「-NH₂」は -NH₂修飾C末端を示す。本発明の内容で好ましいアミノ酸配列は、非天然発生アミノ酸配列である。非
天然発生により、アミノ酸配列が自然に見られないことを意味する。好ましいの
は、約１０から３０アミノ酸残基、好ましくは約２０アミノ酸残基の非天然発生
アミノ酸配列である。これらは、ペプチド、ペプチド類似物及び模倣物を含み、
天然又は非天然発生アミノ酸を含む。特に好ましいのは、天然発生アミノ酸から
なる上記の配列である。

【００１８】本発明の特定の態様で使用される用語「多量体化ドメイン」は、化合物、特に
ペプチド化合物が、直接又は「リンカードメイン」を介して結合する分子の部分
を指すことを意味する。多量体化ドメインは、好ましい実施態様では、２又はそ
れ以上の多量体化ドメインの相互作用を促進するアミノ酸ドメインである。多量
体化ドメインは２又はそれ以上の多量体化ドメインの相互作用を促進するが、本
発明の内容においては、多量体化ドメインに結合するペプチドがマルチマーの一
部として存在する必要はない。本発明の好ましい態様によると、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量
体化ドメインの安定な相互作用を促進するポリペプチドである。例としては、限
定されないが、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域等の免疫グロブリ
ン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２又はそれ以上の多量体
化ドメイン間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離のチオールを含むポリペ
プチド、又は、例えば米国特許第5,731,168号に記載された「窪みへの隆起」ド
メインでありうる。当該特許では、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミ
ノ酸側鎖を大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換することに
より隆起が形成される。隆起と同一又は小さなサイズの相補的な窪みは、場合に
よっては、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はトレオニ
ン）に置換することにより第２のポリペプチドの界面に形成されｒｔ。

【００１９】従って、好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化
ドメインの安定な相互作用を促進又は可能にする、あるいは単量体の多量体化ド
メインからダイマー又は他のマルチマーの形成を促進又は可能にする分子の一部
を提供する。好ましくは、本発明のこの態様によれば、多量体化ドメインは免疫
グロブリン定常ドメインである。免疫グロブリン定常ドメインは、本発明の化合
物のインビボ循環半減期を向上させ、場合によって当業者が、ここに記載の「エ
フェクター機能」を以下の本発明の或る提要に導入することを可能にする。本明細書及び請求の範囲を通じて、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、
ここに明示して参考として取り入れるKabat等, Sequences of Proteins of Immu
nological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of
Health, Bethesda, MD. [1991]に記載されたようなＥＵインデックスのもので
ある。「KabatのようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基
番号付けを指す。

【００２０】「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持
つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示す一方、免疫
グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の双方を含む。後者の種類
のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、また骨髄腫により増大し
たレベルで生産される。「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常は２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つ
の同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンの異種四量体糖タンパク
質である。各軽鎖は重鎖にジスルフィド結合で結合しているが、ジスルフィド鎖
の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また、各重鎖及
び軽鎖は規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖はアミノ（Ｎ
）末端可変ドメイン（ＶＨ）を持ち、それに続いてカルボキシ（Ｃ）末端定常ド
メインがある。各軽鎖は可変Ｎ末端ドメイン（ＶＬ）及びＣ末端定常ドメインを
持ち；軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）は重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並
び、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並んでいる。免疫グロブリンポリペ
プチド鎖のドメイン定義に従うと、軽（Ｌ）鎖は２つの立体配置的に類似したド
メインＶＬ及びＣＬを有し；重鎖は４つのドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及
びＣＨ３）を有し、これら各々は１つの鎖間ジスルフィド架橋を有している。

【００２１】重鎖の定常（Ｃ）ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なる
クラスに分けることができる。これらは５つの主要な分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭである。免疫グロブリンクラスは、更にサブクラス（ア
イソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及び
ＩｇＡ_２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメ
インは、各々α、δ、ε、γ、及びμドメインと呼ばれる。任意の脊椎動物種か
らの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（
κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる１つ又は２つの明らかに異なる型に分類できる
。配列研究により、ＩｇＭのμ鎖が５つのドメインＶＨ、ＣＨμ１、ＣＨμ２、
ＣＨμ３、及びＣＨμ４を含むことが示された。ＩｇＥ（ε）の重鎖も５つのド
メインを含む。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元的立体配置は良
く知られている。これらのＩｇＡ及びＩｇＭはポリマーであり、各サブユニット
は２つの軽鎖と２つの重鎖を含む。ＩｇＧ（γ）の重鎖はヒンジ領域として知ら
れるＣＨγ１及びＣＨγ２ドメイン間にあるポリペプチド鎖の長さを含む。Ｉｇ
Ａのα鎖はＯ-結合グリコシル化部位を含むヒンジ領域を有し、μ及びε鎖はγ
及びα鎖のヒンジ領域に類似する配列は持たないが、それらは他のものが持たな
い第４の定常ドメインを含む。免疫グロブリン鎖のドメイン組成は次のように要
約することができる。軽鎖 λ＝ＶλＣλ κ＝ＶκＣκ 重鎖ＩｇＧ（γ）＝ＶＨＣＨγ１、ヒンジＣＨγ２ＣＨγ３重鎖ＩｇＧ（μ）＝ＶＨＣＨμ１、ＣＨμ２ＣＨμ３ＣＨμ４重鎖ＩｇＧ（α）＝ＶＨＣＨα１、ヒンジＣＨα２ＣＨα３重鎖ＩｇＧ（ε）＝ＶＨＣＨε１、ＣＨε２ＣＨε３ＣＨε４重鎖ＩｇＧ（δ）＝ＶＨＣＨδ１、ヒンジＣＨδ２ＣＨδ３

【００２２】ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)
は通常アミノ酸残基で約位置２３１からアミノ酸残基で約位置３４０まで伸展す
る。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特で
ある。むしろ、２つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つ
のＣＨ２ドメインの間に介在されている。「ＣＨ３ドメイン」は、残基Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの一続き
を含む(すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基で約位置３４１からアミノ酸残基で約
位置４４７）。「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６、又は約Ｃｙｓ２２６から約
Ｐｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:
161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を
形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１
と整合させられうる。Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常はヒンジ領域のＣ末端に隣接する残基の
伸展として定義される、即ち、Ｆｃ領域の残基２３３から２３９である。

【００２３】ＴＦ−ＦＶＩＩａ仲介または関連プロセスまたは事象、あるいはこれと同等に
、血漿ＦＶＩＩａに関連する活性は、本発明によればＴＦ−ＦＶＩＩａの存在を
必要とする任意の事象である。凝血塊形成の一般的機構は、Medical Physiology
, 13th ed., Lange, Los Altos CA, pp411-414 (1987)の総説においてGanongに
より概説されている。血液凝固には、血小板凝集を誘発するトロンビン生成及び
血小板プラグを安定化するフィブリン形成という２つの経路の合流が必要とされ
る。このプロセスは、各々が別々のプロ酵素およびプロ補因子の存在を必要とす
る幾つかの段階を含む。このプロセスは、フィブリンの架橋および血栓形成で終
了する。フィブリノーゲンはトロンビンの作用でフィブリンに変換される。一方
、トロンビンは、プロトロンビンのタンパク質分解的切断によって形成される。
このタンパク質分解は活性化された血小板表面に結合するＦＸａによって行われ
、ＦＶａとカルシウムの存在下でプロトロンビンを切断する。ＴＦ−ＦＶＩＩａ
は凝固の外部経路によるＦＸのタンパク質分解的活性化のために必要である。従
って、ＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介または関連するプロセスまたはＦＶＩＩａに関連
する活性は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体形成からフィブリン血小板凝塊形成まで及
び最初にＴＦ−ＦＶＩＩａの存在を必要とする凝固カスケードにおける任意の段
階を含む。例えばＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体はＦＸからＦＸａ、ＦＩＸからＦＩＸ
ａ、及びこれに加えてＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化によって外部経路を開
始させる。

【００２４】ＴＦ−ＦＶＩＩａ媒介または関連プロセス又はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介又は
関連活性は、例えば、因子ＶＩＩ及び他の必要な試薬の存在下での因子Ｘから因
子Ｘａへの変換についてRoy, S. (1991) J. Biol. Chem., 266: 4665-4668、O'B
rien, D.等 (1988) J. Clin. Invest., 82: 206-212, Lee等(1997) Biochemistr
y 36: 5607-5611; Kelley等, (1997) J. Biol. Chem. 272: 17467-17472に記載
されたもののような標準的な検定法を使用して便利に測定できる。ＴＦ−ＦＶＩＩａ関連疾患または障害は、深部脈管血栓症、動脈血栓症、発作
、腫瘍転移、血栓分解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄のような脈管病、
炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、汎
発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）及びその他の疾患のような急性および慢性の徴候
を含むフィブリン形成に関連する慢性血塞性疾患または障害を意味する。ＴＦ−
ＦＶＩＩａ関連障害は、前記のようなインビボ凝固障害に限定されるものではな
く、透析操作、血液濾過または外科手術の間の血液バイパス等のプロセスで患者
からインラインで取り出された血液を含む血液の体外循環に起因する血液凝固と
いったエキソビボのＴＦ−ＦＶＩＩａ関連プロセスも含む。

【００２５】ここで使用される用語「肺性投与」は、本発明の製剤の吸入による肺経由の投
与を指す。ここで使用される用語「吸入」は、空気の肺胞への取り込みを指す。
特定の例では、取り込みは、本発明の製剤の事故投与によっても、呼吸器をつけ
た患者への呼吸器を通した吸入又は投与によっても行われる。本発明の製剤につ
いての用語「吸入」は、「肺性投与」と同義語である。ここで使用される用語「腸管外」は、本発明の化合物の腸以外の身体への導入
、特に静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内
（ｉ．ｍ．）、心室内及び皮下（ｓ．ｃ．）経路を意味する。ここで使用される用語「エアロゾル」は、空気中の懸濁物を指す。特にエアロ
ゾルは本発明の製剤の粒子化及びその空気中への懸濁を意味する。本発明による
と、エアロゾル製剤は、本発明の化合物を含む製剤であり、吸入又は肺性投与の
ためにエアロゾル化、即ち粒子化及び空気中への懸濁に適している。

【００２６】本発明の文脈中で使用される「治療」という用語は、疾患又は障害に対する治
療的処置並びに予防又は防御的手段を含むことを意味する。即ち、例えば治療と
いう用語は、疾患又は障害の罹患前又は後に薬剤を投与し、それにより疾患又は
障害の全ての徴候を防止又は除去することを含む。他の例として、疾患の臨床的
顕現の後に疾患の徴候に抗するために薬剤を投与することは疾患の「治療」を包
含する。さらに、投与が疾患又は障害の臨床パラメータ、例えば組織侵襲の程度
又は白血球輸送の量又は範囲、及びおそらく疾患の緩和に影響する場合、罹患後
及び臨床的徴候が進行した後に薬剤を投与することは、疾患の「治療」を包含す
る。「治療の必要がある」ものには、疾患又は障害に既に羅患しているヒト等の哺
乳動物が含まれ、疾患又は障害が予防されるべきものが含まれる。用語「アシル」は最も広い意味で使用され、カルボキシ基を含む約１〜約１６
炭素原子の飽和又は不飽和、線状、分岐状又は環状鎖を意味する。よって用語ア
シルは、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイルなどの基を含む。用語「疎水
性アシル」は、Ｒ１-Ｃ(=Ｏ)-基を指し、ここでＲ１はアルキル、アリール又は
他の非極性基である。

【００２７】（発明の実施の形態）化合物の選択本発明は、ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの、ＦＩＸからＦＩＸａへの、又はＦＸ
からＦＸａへの触媒的変換等のＦＶＩＩａ媒介又は関連プロセス又は事象を阻害
し、それにより血液凝固の外因性経路の自称を阻止する化合物及び組成物を提供
する。本発明の好ましい化合物は、、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合について図８に
記載したペプチド化合物と競合する能力によって識別され、以下のように選択で
きる。化合物が上記のペプチド化合物と競合する「能力」を有するかを決定するイン
ビトロアッセイシステムについて、当業者は多くの標準的競合アッセイを採用す
ることができる。このような方法は、これらに限られないが、数例を挙げると放
射免疫測定、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳ
Ａ）、「サンドウィッチ」免疫測定、沈殿反応、ゲル拡散反応、免疫拡散測定、
凝集測定、補体-固定測定、免疫放射定量測定、蛍光免疫測定、プロテインＡ免
疫測定、及び免疫電気泳動測定等の技術を用いる競合アッセイシステムを含む。

【００２８】これらの目的のために、図８の選択されたペプチド化合物は検出可能部分で標
識され（検出可能なペプチド化合物を、ここで「トレーサー」と呼ぶ）、ＦＶＩ
Ｉ／ＦＶＩＩａ結合について候補化合物との競合アッセイに使用される。多くの
標識が使用可能であり、好ましくは次の範疇にグループ分けできる：（ａ）放射性同位体、例えば、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ
等。ペプチド化合物は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 a
nd 2, Coligen等, 編, Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991)に記載さ
れた技術を用いて放射性同位体で標識され、放射活性はシンチレーションカウン
ティングにより測定できる。（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオ
レセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン(Lis
samine)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、
例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いてペプ
チド化合物に抱合させることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量化でき
る。（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第4,275,249号は、それら
の幾つかの概説を提供している。酵素は好ましくは種々の技術を用いて測定可能
な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒
し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発
光を変化させることもある。蛍光変化を定量化する技術は上述した。化学発光基
質は化学反応によって電子的に励起され、次いで（例えば化学発光計を用いて）
測定可能な光を放出する、または蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識
の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラー
ゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２，３-ジヒドロフタラジンジオ
ン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコー
スオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェート
デヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシ
ダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素
を抗体に抱合させる技術は、O'Sullivan等, Methods for Preparation of Enzym
e-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym
. (編J. Langone & H. Van Vunakis）Academic press, New York, 73: 147-
166 (1981)に記載されている。

【００２９】酵素−基質の組み合わせは、例えば以下を含む： (i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素
、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又
は３，３'，５，５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸
化する； (ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェ
ニルホスフェート；及び (iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニ
トロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。特定のアッセイによれば、トレーサーは固定化されたＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと
ともに、種々の濃度の非標識候補化合物中インキュベートされる。有効な候補化
合物の濃度を増加させると、トレーサーの固定化ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合
と有効に競合する。最大トレーサーの50%における非標識候補化合物の濃度がＩ
Ｃ_５０と呼ばれ、候補化合物のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合親和性を反映する。従
って、1mMのＩＣ_５０を持つ候補化合物は、1μMのＩＣ_５０を持つ候補ペプチド
よりもＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと実質的に弱い相互作用を示す。

【００３０】従って、本発明は、記載したインビトロアッセイにおいてＦＶＩＩ／ＦＶＩＩ
ａ結合について「競合する能力を有する」化合物を提供する。好ましくは、化合
物はＦＶＩＩａに対して1μM未満のＩＣ_５０を持つ。これらの化合物の中で好ま
しいのは、約100nM未満、好ましくは約10nM未満、又は約1nM未満のＩＣ_５０を持
つ化合物である。本発明のこの態様で更に好ましい実施態様では、化合物はＦＶ
ＩＩａに対して約100pM未満、より好ましくは約10pM未満のＩＣ_５０を示す。図８のペプチド化合物と競合する候補化合物の能力を決定するための好ましい
インビトロアッセイは以下の通りであり、実施例１及び２において更に詳細に記
載する。ＦＶＩＩａへの結合についてトレーサーと競合するペプチドの能力は、
ＥＬＩＳＡを用いて監視される。候補ペプチドの希釈物が（実施例で記載するよ
うに）ＴＦ−ＦＶＩＩａでコートされたミクロタイタープレートにトレーサーと
ともに１時間添加されるミクロタイタープレートは洗浄バッファーで洗浄され、
ＦＶＩＩａに結合したトレーサーの量が測定される。特別な実施態様では、トレーサーは配列番号：１であり、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩ
ａコートプレートに10μMの濃度で添加される。他の好ましい実施態様では、ト
レーサーは配列番号：８であり、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａコートプレートに20nMの
濃度で添加される。

【００３１】この方法で選択された化合物は、次いでＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性化を
阻害又は阻止する能力について試験される。用語「阻害」又は「阻止」は、本発
明の候補化合物の特徴を記載するのに使用されるときは、ＦＸ活性化についての
標準的な色アッセイ（Roy, S. (1991) J. Biol. Chem., 266: 4665-4668、O'Bri
en, D.等 (1988) J. Clin. Invest., 82: 206-212, Lee等(1997) Biochemistry
36: 5607-5611; Kelley等, (1997) J. Biol. Chem. 272: 17467-17472）におい
て約10μMの濃度で添加された場合、ＶＩＩ因子及び他の必要な試薬の存在下で
Ｘ因子のＸａ因子への変換を少なくとも50%阻害する化合物を意味する。好まし
くは、化合物は約1μMの濃度で少なくとも50%の阻害、より好ましくは約100nMの
濃度で少なくとも50%の阻害を生ずる。より好ましい実施態様では、本発明の化
合物は、約10nM未満の濃度で存在した場合に、X因子からＸａ因子への変換の少
なくとも50%の阻害を生ずる。

【００３２】ペプチド及びその類似物本発明の好ましい態様によると、化合物は環状ペプチド又はその類似物である
。好ましくは、化合物は以下の式を有する：Ｘ_ｉ-Ｃｙｓ_１-Ｘ_ｊ-Ｃｙｓ_２-Ｘ_ｋここで、Ｘ_ｉは存在しないか又は１から１００アミノ酸、好ましくは約１から５
０アミノ酸、より好ましくは約１から１０又は約１から４アミノ酸のペプチドで
あり；Ｘ_ｊは９アミノ酸のペプチドであり、Ｘ_ｋは存在しないか又は１から１０
０アミノ酸、好ましくは約１から５０アミノ酸、より好ましくは約１から１０又
は約１から４アミノ酸のペプチドであり、この環状ペプチド又はその類似物は、
上記の生物学的活性を保持していなければならない。このグループの化合物の中で好ましいのは以下の配列を含む化合物である： -ａ-ｂ-Ｃｙｓ_１-ｄ-ｅ-ｆ-ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-Ｃｙｓ_２-ｎ-ｏ- ここで、ａはアミノ酸であり；ｂはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｄはアミノ酸であり；ｅはアミノ酸であり；ｆはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ
、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ
、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びそれらの機
能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｇはアミノ酸であり；ｈ
はＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ
、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
、及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉはＡ
ｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐ
ｒｏ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びそれらの機能的
等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ
、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ
、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びそれらの機能
的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｋはＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｎａ
、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；
ｌはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ、Ｔｒｐ及びそれらの機能的等価物からなる群から選
択されるアミノ酸であり；ｎはアミノ酸であり、そしてｏはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔ
ｒｐ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸である
。

【００３３】この類の化合物の中で好ましいのは、上記のものでＸ_ｉが２〜１０又は２から
４アミノ酸のペプチドであり、Ｘ_ｋが２〜１０又は２〜４アミノ酸のペプチドで
あるものである。例えば、好ましい化合物は、ｂがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａ
ｌａ及びそれらの機能的等価物、好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びそれら
の機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｆがＣｙｓ以外のア
ミノ酸、好ましくはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる
群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＡｌａから
なる群から選択されるアミノ酸であり；ｉがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及
びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊがＣｙｓ以外のアミノ酸
、好ましくはＣｙｓ及びＴｒｐ以外のアミノ酸であり；ｋがＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔ
ｒｐ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物、好ましくはＴｒｐ及びＮａ及びそれらの
機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒ、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物、好ましくはＴｙｒ、Ｎａ及びそれらの機
能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｏがＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔ
ｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であるもので
ある。

【００３４】この類の環状ペプチド化合物及びその類似物の中で好ましいのは、ｈがＩｌｅ
、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉがＡｓｐ、Ｇ
ｌｕ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊがＡｒｇ、Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、ｎがＧ
ｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔ
ｈｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であるもので
ある。このグループの化合物の中で好ましいのは、ｈがＩｌｅ及びＶａｌ及びそれら
の機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉがＡｓｐ及びその
機能的等価物であり；ｊがＡｒｇ及びその機能的等価物であり；ｌがＴｙｒ及び
その機能的等価物であり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔ及びそれらの機能的等価物から
なる群から選択されるアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅ及びそれらの機能的
等価物である化合物である。

【００３５】このグループの中で好ましいのは、ａがＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＡｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群
から選択されるアミノ酸であり；ｆがＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びそれらの機能
的等価物からなる群から選択されるアミノ酸である環状ペプチド化合物である。この類の化合物の中で好ましいのは、Ｘ_ｉが２から６アミノ酸のペプチドであ
り；ａがＡｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選
択されるアミノ酸であり；ｂがＬｅｕ及びその機能的等価物であり；ｄがＡｓｐ
、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＡｓ
ｎ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｅがＡ
ｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ａｌａ及びＧｌｕ及びそれらの機能的等価物からなる群
から選択されるアミノ酸であり；ｆがＰｒｏ及びその機能的等価物であり；ｇが
Ａｒｇ、Ａｌａ及びＧｌｕ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択される
アミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕ及びそれらの機能的等価物から
なる群から選択されるアミノ酸であり；ｉがＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＳｅｒからなる
群から選択されるアミノ酸であり；ｊがＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｌａ及び
それらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがＧｌｎ、
Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＴｈｒ
及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘ_ｋが２
から６アミノ酸のペプチドである化合物である。

【００３６】このグループの化合物の中で好ましいのは、以下の式を有する環状ペプチド又
はその類似物である：Ｘ_ｉ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ_１-ｄ-ｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-ｋ-Ｔ
ｙｒ-Ｃｙｓ_２-ｎ-Ｐｈｅ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０５）ここで、Ｘ_ｉは存在しないか又は１から４アミノ酸のペプチドであり；ｄがＡｓ
ｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＡｒｇ及びそれらの機能的等価物からなる群か
ら選択されるアミノ酸であり；ｅがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＡｌａ及びそれ
らの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ及びＶ
ａｌ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｋが
Ｔｒｐ及びＮａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択され
るアミノ酸であり；そして、Ｘ_ｋが３アミノ酸のペプチドである。好ましい線状又は環状化合物の例は、以下の式を有するペプチド化合物又はそ
の類似物である：Ｘ_ｉ-ａ-ｂ-ｃ-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｔｙｒ-
ｍ-ｎ-ｏ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０６）ここで、Ｘ_ｉは存在しないか又は１から４アミノ酸のペプチドであり；ａがＡｌ
ａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ及びＰｒｏ及びそれらの機能的等
価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｂがＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、
Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ及びそれらの機能的等価物からなる群から選
択されるアミノ酸であり；ｃがＡｌａ及びＣｙｓ及びそれらの機能的等価物から
なる群から選択されるアミノ酸であり；ｄがアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ及びＡｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｍがＡｌａ及びＣｙｓ及びそれらの機能的等価物からなる群から選
択されるアミノ酸であり；ｎがアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅ、Ｔｙｒ、
Ｔｒｐ及びＮａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸で
あり；そして、Ｘ_ｋが１から４アミノ酸のペプチドである。

【００３７】この類の環状ペプチド化合物又はその類似物の中で好ましいのは、以下の式を有
する化合物である：Ｘ_ｉ-ａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-
Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ｎ-ｏ-(Ｘａａ)_ｎ（配列番号：１０７）ここで、ａはＡｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒ及びそれらの機能的等価物からなる群か
ら選択されるアミノ酸であり；ｄがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、
Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＡｓｎ及びそれらの機能的等価物からなる
群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕ及びそれらの
機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがＧｌｎ、Ｍｅｔ、
Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＴｈｒ及びそれらの機能
的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅ及びＴ
ｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸である。より好ましいのは、以下の式を有する環状ペプチド化合物及びその類似物であ
る：Ｘ_ｉ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ_１-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-
Ｔｒｐ-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ_２-ｎ-Ｐｈｅ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０８）ここで、ｄはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びそれらの機能的等価
物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔからなる群
から選択されるアミノ酸であり；そして、Ｘ_ｋが３アミノ酸のペプチドである。本発明の例示的なペプチドは、限定されるものではないが図８に示したものを
含む。

【００３８】一実施態様では、本発明はペプチド又はペプチド類似物のような化合物の用途
も考慮し、当該化合物は以下の式を含む： -ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-ｍ-ｎ-ｏ- ここで、ｇはアミノ酸であり；ｈはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ及びそれら
の機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉはＡｓｐ、Ｇｌｕ
、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択される
アミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙ
ｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａ
ｌ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり
；ｋはＴｒｐ、Ｎａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｌはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ、Ｔｒｐ及びそれらの機
能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｍはＣｙｓ、Ａｌａ及び
それらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎはアミノ酸
であり、そしてｏはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｎａからなる群から選択されるア
ミノ酸である。これらの化合物は、特にペプチド化合物並びにそれらの機能的等
価物、それらの断片、それらのエステル、アミド、塩及び誘導体、それらの機能
的類似物、及び配列の末端に付加的なアミノ酸及びペプチドを持つ延長ペプチド
鎖を含む。

【００３９】この類の化合物の中で好ましいのは、以下の式を含む化合物である： -ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ-ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-ｍ-ｎ-ｏ- ここで、ａはアミノ酸であり；ｂはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びそれら
の機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｃはＣｙｓ、Ａｌａ
及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｄはアミ
ノ酸であり；ｅはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、
Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるア
ミノ酸であり；ｆはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる
群から選択されるアミノ酸であり；ｇはアミノ酸であり；ｈはＩｌｅ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｉはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物
からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈ
ｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒ
ｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からな
る群から選択されるアミノ酸であり；ｋはＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ及びそ
れらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｌはＴｙｒ、Ｐ
ｈｅ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり
；ｍはＣｙｓ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｎはアミノ酸であり、ｏはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ及びそれらの機能
的等価物からなる群から選択されるアミノ酸である。

【００４０】上記の化合物は、ＦＶＩＩａ活性を阻害する方法において使用でき、特に好ま
しく、当該方法は：（１）ＦＶＩＩａを対象化合物、特に上記のペプチド及びペプチド類似物と、
組織因子の存在下及び不存在下において、化合物のＦＶＩＩａへの結合が起こる
条件下で接触させ、場合によっては、（２）対象化合物の存在下おいて生じたＦＸ活性化の量を測定又は試験する工
程を含んでなる。本発明の或る態様では、ここに記載した標準的なＦＸ活性化ア
ッセイを、対象化合物により阻止又は阻害されるＦＸ活性化の量の測定方法とと
もに採用する。本発明のこの態様は、インビトロ又はインビボで実施してよい。

【００４１】ペプチド結晶及び類似物ペプチド化合物の三次元構造は、Ｘ線結晶分析を用いて決定することができる
。ペプチド結晶構造から誘導される構造的情報は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合
して好ましくはＦＶＩＩａ媒介又は関連プロセス又は事象を阻止又は防止するペ
プチド模倣物及び合成有機分子などの小生物有機分子の特定に使用できる。その
ような構造ベースの化合物設計の方法の例は、（「Structure Based Drug Desig
n」 Pandi Veerapandian, ed. Marcell Dekker, New York 1997）に記載されて
いる。本発明のペプチド化合物を用いて同定されたペプチド類似物は、こに記載する
治療方法において及び制約組成物として有用である。

【００４２】化学合成本発明の化合物を製造する一方法は化学合成を含む。これは、当業者に知られ
た方法論を用いて実施される（Kelley, R.F.及びWinkler, M.E. in Genetic Eng
ineering Principles and Methods, Setlow, J.K., ed. Plenum Press, N.Y., v
ol.12, pp1-19 (1990), Stewart及びYoung,, Solid Phase Peptide Synthesis P
ierce Chemical Co. Rockford, IL (1984)参照；また米国特許第4,105,603号、
第3,972,89号、第3,842,067号、及び第3,862,925号も参照）。本発明のペプチドは固相ペプチド合成を用いて便利に調製される（Merrifield
, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 82: 5132 (1985)）。固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性な固体支持体
に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。固
体支持体は、最初のアミノ酸のＣ末端のためのアンカーを提供できる任意の高分
子であってよい。典型的には、高分子支持体は、上掲のStewart及びYoungの第2
及び4頁の図1-1及び1-2に記載されているように、架橋した高分子樹脂（例えば
ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸が
ポリスチレン樹脂にカップリングされてベンジルエステルを形成する。高分子支
持体は、ペプチドアンカー結合が、ペプチド合成においてブロックされたアミノ
酸のα-アミノ基の脱保護に使用される条件下で安定であるように選択される。
塩基不安定性α-保護基が使用される場合、ペプチドと固体支持体の間の酸不安
定性結合を使用するのが好ましい。例えば、上掲のStewart及びYoungの第16頁に
記載されているように、酸不安定性エーテル樹脂は、塩基不安定性Fmoc-アミノ
酸ペプチド合成に有効である。あるいは、酸分解に対して安定性が異なるペプチ
ドアンカー及びα-保護基を使用してもよい。例えば、上掲のStewart及びYoung
の第11-12頁に記載されているように、フェニルアセタミドメチル（Ｐａｍ）樹
脂などのアミノメチル樹脂は、Boc-アミノ酸合成と組み合わせて良く作用する。

【００４３】最初のアミノ酸が不活性固体支持体にカップリングされた後、最初のアミノ酸
のα-アミノ酸保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
で除去して、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）中で中性化する。最初のアミノ
酸のα-アミノ基の脱保護に続いて、合成における次のα-アミノ-及び側鎖保護
したアミノ酸を添加する。残りのα-アミノ酸、必要ならば側鎖保護されたアミ
ノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、固体支持体に結合した中間体化
合物を得る。あるいは、ペプチドを成長している固相ペプチド鎖に付加する前に
、幾つかのアミン及び酸を互いに結合させてペプチドを形成してもよい。２つのアミノ酸間の縮合は、通常の縮合方法に従って実施され、その方法は、
アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド）又はＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステ
ル法（P-ニトロフェニルエステル法）、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール-1-イル-オ
キシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］法、
Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等で
ある。

【００４４】ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保
護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチ
ド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又
は断片上のα-アミノ酸を保護するが、それがカルボキシル基で反応するに続い
てα-アミノ酸保護基を選択的に除去し、その位置で次の反応が起こるのを可能
にすることである。従って、ペプチド合成においては、中間体化合物が生成され
、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミノ酸残基を含み、これら種
々の残基は結合した保護基を有するのが通常である。これらの保護基は、次いで
、実質的に同時に共通して除去され、樹脂から取り外した後に所望の結果的生成
物が生成される。 α-及びε-アミノ酸側鎖基を保護するための好適な保護基として、ベンジルオ
キシカルボニル（ＣＢＺ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ
-クロロベンジルオキシカルボニル（２-Ｃｌ-ＣＢＺ）、ｐ-ニトロベンジルオキ
シカルボニル［Ｚ(ＮＯ_２）］ｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭ
ｅ)］、t-ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、t-アミルオキシカルボニル（ＡＯＣ
）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-
ビフェニル)-２-プロピル-オキシカルボニル（ＢＰＯＣ）、９-フルオレニルメ
トキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、メチルスルホニエトキシカルボニル(methylsul
fo-nyiethoxycarbonyl)（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミ
ル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイ
ル（Ｐｐｔ）、ジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）などが例示される。

【００４５】カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロ
ヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチ
ルエステル（ＯｔＢｕ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示さ
れる。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン
、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいこ
とが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキ
シベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２，６-ジメチルベンゼンスルホニル（Nｄ
ｓ）、１，３，５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。
システインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護される
。上述したブロックされたアミノ酸の多くは、Novabiochem(San Diego, CA), Ba
chem CA(Torrence, CA), 又はPeninsula Labs (Belmont, CA)等の商業的供給源
から得ることができる。

【００４６】上掲のStewart及びYoungは、ペプチド調製のための詳細な情報を提供する。α
-アミノ酸の保護は第14-18頁に記載され、側鎖ブロックは第18-24頁に記載され
ている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官能基の保護基の表が第149-
151頁に与えられている。所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドを固体支持体から切断し、回収及
び精製することができる。ペプチドは、ペプチド−固相結合を破壊することので
きる試薬によって固体支持体から取り外され、場合によってはペプチドのブロッ
クされた官能基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸
（ＨＦ）で処理することにより固相から取り外すが、その薬剤は残っている側鎖
保護基も切断する。好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、
メチオニン、システイン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、
酸分解官能混合物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含有する。ＨＦ切
断の後、樹脂をエーテルで洗浄し、遊離のペプチドを酢酸溶液で繰り返し洗浄す
ることにより抽出する。化合物洗浄物は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。

【００４７】ジスルフィド結合ペプチド上記したように、本発明の幾つかの実施態様は、システイン残基間でジスルフ
ィド結合を形成することにより環化される。のようなペプチドは、上記の化学合
成により製造され、次いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の方法によ
り環化される。例えば、ペプチドは、スルフヒドリルで固相合成から還元体で回
収され、ジスルフィド溶液に溶解されるが、分子内システイン濃度は分子間シス
テイン濃度より高く、分子内ジスルフィド結合の形成が最適にされ、例えば25mM
〜1μM、好ましくは500μM〜1μM、より好ましくは25μM〜1μMのペプチド濃度
とされ、次いで遊離のスルフヒドリル基を分子内ジスルフィド結合の形成に十分
な穏やかな酸化剤、例えば金属カチオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオ
ン酸ナトリウムなどの触媒有無の酸素分子に暴露して酸化する。一実施態様では
、ペプチドは下記の実施例２に記載するように環化される。あるいは、ペプチド
は、Pelton等 J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）に記載されてように環化
される。環化は、例えばＣｙｓ残基間のジスルフィド結合又はラクタム結合の形成によ
り達成される。ジスルフィド結合を形成することのできる残基は、例えばＣｙｓ
、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ、及びそれらの２-アミノ基含有等価物を含む。
ラクタム結合を形成できる残基は、例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、
αβ-時アミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸及びメルカプト安息香
酸を含む。ここの化合物はラクタム結合を介して環化することができ、それは例
えば非隣接残基の側鎖を利用してＣｙｓ又は他のアミノ酸のＮ末端アミノ基と共
有結合を形成してもよい。これに代わる架橋構造も本発明の化合物の環化に使用
することができ、例えば、Ｓ-Ｓ、ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２、ラクタム絵ｓてる又は他
の結合を介して環化できるペプチド又はペプチド模倣物を含む。

【００４８】さらなる実施態様では、本発明は、ここに記載のペプチドをコードする単離さ
れた核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプチド
をコードするＤＮＡは、当該技術分野で知られた種々の方法により製造すること
ができる。これらの方法には、Engels等, Angew．Chem．Int．Ed．Engl.，28: 7
16-734(1989)に記載の、トリエステル、ホスファイト、ホスホラミジト、および
Ｈ−ホスホネート法のようなあらゆる方法（これらの内容は本明細書の一部を構
成する）によって化学的に合成されるがこれらに限定されるものではない。一実
施態様では、好ましくは発現宿主細胞によるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使
用される。あるいは、部位特異的突然変異誘発(Kunkel等 (1991), Meth.Enzymol
.,,204:,125-139；Carter,.等 (1986)、Nucleic Acids Res., 13: 4331; Zoller,
M.J.等(1982) Nucleic Acids Res., 10: 6487）、カセット突然変異誘発（Well
s, J.A.等 (1985), Gene, 34: 315）または制限選択突然変異誘発（Wells, J.A.
等 (1986), Philos. Trans. R. Soc. London Ser.A., 317: 415）などの組換え
ＤＮＡ技術を用いて１又はそれ以上の変異体をコードするように変性させること
もできる。本発明はさらに、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に結合
する発現制御配列、そのＤＮＡ分子を含みその制御配列がそのべクターで形質転
換された宿主細胞に認識される発現ベクター、好ましくはプラスミド、およびそ
のベクターで形質転換された宿主細胞を含む。一般に、ベクターは宿主細胞と相
容性の種から誘導された複製及び制御配列を含む。ベクターは通常、複製部位、
並びに形質転換された細胞でフェノタイプ選択を提供できるタンパク質をコード
する配列を有する。

【００４９】ＤＮＡを発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、真核生物細胞を含
む。好ましい原核細胞は、限定されないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグ
ラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公
衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294（ATCC31,446）；大腸菌X1776
（ATCC31,537）；大腸菌株W3110（ATCC27,325）及びK5772（ATCC53,635）である
。原核生物に加えて、酵母のような真核生物、又は多細胞生物から誘導した細胞
を宿主細胞として使用してもよい。酵母宿主細胞での発現のために、通常のべー
カーの酵母菌又はサッカロミセス・セレビシアエ等であり、好適なベクターは２
-ミクロンプラスミドに基づくエピソーム複製ベクター、組込型ベクター、及び
酵母人工染色体（YAC)ベクターを含む。また発現に適した宿主細胞は多細胞生物
からも誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びス
ポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。Ｓｆ９細胞などの昆
虫細胞での発現に適したベクターはバキュロウィルスベクターを含む。植物宿主
細胞での発現のためには、特にタバコなどの双子葉植物であり、好ましい発現ベ
クターはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドから誘導され
るベクターを含む。

【００５０】有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓Ｃ
Ｖ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のた
めにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）
；乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター
卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
7:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23: 2
43-251 [1980]）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル
腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL-1587）；ヒト頸部癌細胞（ＨＥＬＡ、ATC
C CCL 2）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓
細胞（ＢＲＬ３Ａ、ATCC CRL 1442 ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）
；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腫瘍（ＭＭＴ０６０５６
２、ATCC CCL51）；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 440
68 [1982]）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌系（ＨｅｐＧ２）を含
む。原核生物宿主での発現のために適したベクターは、ｐBR322（ATCC 37,017）、
phGH107(ATCC 40,011), pBO475, pSo132, pRIT5, pRIT又はpRITシリーズの任意
のベクター（Nilsson及びAbrahmsen, (1990) Meth. Enzymol., 185: 144-161),
pRIT2T, PKK233-2, pDR540及びｐPL-ラムダを含む。本発明の発現ベクターを含
む原核生物宿主細胞は、大腸菌（E.coli）K12菌株294(ATCC 31446)、大腸菌JM10
1株（Messing等, (1981) Nucl. Acid Res., 9: 309）、大腸菌B、大腸菌χ1776(
ATCC 31,537)、大腸菌c600(Appleyard, Genetics, 39: 440 (1954))、大腸菌W31
10株(F-, ガンマ-, 原栄養菌株, ATCC 27,325)、大腸菌27C7株（W3110, tonA,
phoA E15,,(algF-lac)169, ptr3, degP41, ompT, kan^r）（米国特許第5,288,931
号, ATCC 55,244）、枯草菌のようなバチルス属菌、サルモネラ・ティフムリウ
ム、セラチア・マルセッセンス及びシュードモナス種を含む。

【００５１】哺乳動物宿主細胞えの発現のために、有用なベクターは、ＳＶ４０から誘導さ
れるベクター、サイトメガウイルスから誘導されるベクター、例えばｐＲＫ５及
びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Suva等, (1987) Science, 237:893-896; EP
307,247 (3/15/89), EP 278,776 (8/17/88)）、ワクシニアウィルス又は他のポ
ックスウィルスから誘導されるベクター、及びモロニーのマウス白血病ウィルス
（MoMLV）から誘導されるベクターなどのレトロウイルスベクターを含む。場合によっては、対象ペプチドをコードするＤＮＡは、分泌リーダー配列に作
用可能に結合し、宿主細胞による発現産物を細胞培地に分泌させる。分泌リーダ
ーの例は、ｓｔＩＩ、エコチン、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホ
スファターゼ、インベルターゼ、ＭＩＰ.５及びアルファ因子を含む。またここ
での使用に適しているのは、プロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（
Abrahmsen等, (1985) EMBO J., 4: 3901）。宿主細胞は、上記の本発明の発現又はクローニングベクターでトランスフェク
トされ好ましくは形質転換され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は
所望配列をコードする遺伝子の増幅に適するように変性された従来の滋養培地で
培養される。

【００５２】トランスフェクションとは、任意のコード化配列が実際に発現するかどうか分
からないを宿主細胞による発現ベクターの入手を意味する。トランスフェクショ
ンの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、ＣａＰ
Ｏ_４及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞
に生じる該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。形質転換は、生物にＤＮＡを導入し、染色体外成分として又は染色体組み込み
によって、ＤＮＡが複製されることを意味する。使用される宿主細胞によって、
形質転換は、該細胞に適した基本的な技術を用いて成される。Cohen, Proc. Nat
l. Acad. Sci. (USA), 69: 2110(1972)及びMandel等, J. Mol. Biol., 53: 154
(1970)に記載されているような塩化カルシウムを使用したカルシウム処理は、一
般に頑丈な細胞壁バリヤーを含む原核生物又は他の細胞で使用される。そのよう
な細胞壁を持たない哺乳動物細胞にとって、Graham及びvan der Eb, Virology,
52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウムの析出方法が好ましい。哺乳動物細胞ホ
ストシステム形質転換の一般的な形態は、Axelにより、１９８３年８月１６日公
開の米国特許第4399216号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的にはVan
Solingen等, J. Bact., 130:946(1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), 76:3829(1979)の方法により実施される。しかしながら、核酸移入又はプ
ロトプラスト融合による

【００５３】他の好ましいベクターは、前記したベクターの適切な特徴を組み合わせること
による標準的技術を使用しての構築が可能である。適切な特徴とは、プロモータ
ー、リボゾーム結合部位、デコルシン(decorsin)又はオルナチン(ornatin)遺伝
子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びデコルシン又はオルナチ
ンとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。前記方法の変形は、所望するペプチドをコードする遺伝子が、ベクター中で、
他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子又と関連している
場合に、遺伝子融合の使用を考慮する。これは、所望するペプチドが他のタンパ
ク質又はペプチドと融合し、宿主細胞によって生産される結果をもたらす。「他
の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞からの分泌が可能なタンパ
ク質又はペプチドであり、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製を可能
にし、所望するペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要
性を除く。あるいは、融合タンパク質は細胞内に発現することも可能である。高
度に発現される融合タンパク質を使用するのが有用である。

【００５４】遺伝子融合の使用は、必須ではないが、大腸菌における異種ペプチドの発現並
びに後のこれら遺伝子産物の精製を容易にする（Harris, Genetic Engineering,
Willianson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljungu
ist等., Eur.J.Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur.J.Bioch
em., 186: 563-569(1989)）。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より
詳しくはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の
為の「親和性ハンドル」を提供することから頻繁に使用される。多くの異種タン
パク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合
タンパク質として発現された場合は安定である（Marston, Biochem J., 240: 1(
1986)）。融合タンパク質は、メチオニン、又はヒドロキシアミン、アスパラギン及びグ
リシン残基間を切断する臭化シアンのような化学薬品を使用することによって切
断が可能である。標準的な組換えＤＮＡ技術を使用することにより、これらアミ
ノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望するペプチドをコードする遺伝子
の５' 末端の直前に挿入することができる。

【００５５】あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能
である（Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-S
cale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series
No.427,1990), Ch13, page 181-193）。第Ｘａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、他の多数のプロ
テアーゼが、融合タンパク質の切断に首尾よく使用されている。約３０アミノ酸
未満のペプチドリガンドの製造のために本発明で好ましいのは、Ａｒｇ及びＬｙ
ｓに高度に特異的なプロテアーゼトリプシンである。トリプシン切断は、一般的
にNilsson等 (1996) J. Biotech. 48: 241及びSmith等 Methods Mol. Biol. 32:
289で議論されている。典型的には、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプ
チドリンカーは、「他の」のタンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）と
所望するペプチドとの間に挿入される。組換えＤＮＡ技術を使用すると、リンカ
ーをコードするヌクレオチド塩基対は、他のタンパク質をコードする遺伝子又は
遺伝子断片の間に挿入される。タンパク質分解による正確なリンカーを含む部分
精製融合タンパク質の切断は、その結果、天然融合タンパク質、又は還元型或い
は変性融合タンパク質について実施することができる。

【００５６】ペプチドは、融合タンパク質として発現した場合は、適切に折り畳まれる又は
折り畳まれないことがある。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカ
ーは、プロテアーゼへ接触可能又は接触不可能であることがある。これれらの要
因が、融合タンパク質を変性及び再折り畳みするべきか否か、もしそうならば、
これらの手段を切断の前又は後のいずれに用いるかを決定する。変性及び再折り畳みが必要な場合、通常は、ペプチドは塩酸グアニジンのよう
なカオトロピック剤によって処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと
再折り畳みされるような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型
ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元バッファーによって処
理される。この開示で宿主細胞と呼ばれるのは、インビトロ培地の細胞並びに宿主動物内
の細胞を含む。本発明の環化の実施態様では、組換え生産されたペプチドは、上記のように分
子内ジスルフィド結合を形成することにより環化できる。

【００５７】本発明のペプチド化合物は、各々アミノ保護基又はカルボキシ保護基を用いて
Ｎ末端又はＣ末端において修飾することができる。そのような修飾の数は当業者
に理解されるであろう。例えば、ペプチド又はペプチド類似物のＮ末端は、Ｎ末
端アミノ基が、例えばアセチル、シクロペンチルカルボキシ、イソキノリルカル
ボキシ、フロイル、トシル、ピラジンカルボキシ、又はそのような他の基で置換
されるように化学修飾でき、それはここに記載したような置換基で置換されてい
てもよい。またＮ末端アミノ基は、例えば逆アミド結合で置換することもできる
。アミノ基は、ここで広く用いられ、ペプチドに存在する第１級、第２級、又は
第３級アミノ基を含む遊離のアミノ基を意味すると解される。これに対して用語
Ｎ末端は従来の方法で記載したペプチドに存在する最初のアミノ酸のα-アミノ
基を指す。本発明のペプチドのＮ末端は、それにアミノ保護基を結合することにより保護
することができる。用語「アミノ保護基」は広く用いられ、遊離のアミノ基と反
応できる化学基を見し、例えば、本発明のペプチドのＮ末端に存在するα-アミ
ノ基を含む。それと反応することにより、アミノ保護基は、他の反応性アミノ基
を、例えば合成手法の間に又は最終化合物に対してエキソペプチダーゼにより起
こりうる望ましくない反応から保護する。

【００５８】またアミノ基の修飾は、例えば化合物の溶解性又は活性の向上を含む付加的な
利点も提供する。これらの修飾を有する化合物は、それらの構造が本開示を与え
る当業者の能力の範囲内であるので本発明の化合物の範囲内にあることを意味す
る。種々のアミノ保護基がこの分野で知られており、例えば、アセチル、ピコリ
ル、tert-ブチルアセチル、terrt-ブチロキシカルボニル、ベンジロキシカルボ
ニル、例えば２-アリール-２-ｏ-ベンジルオキシム等のベンゾイル基並びにそれ
自身がアミノ保護基で修飾されていてもよいアミノアシル残基を含む。他のアミ
ノ保護基は、例えばThe Peptides, eds. Gross 及びMeienhofer, Vol.3(acedemi
c Press, Inc. N.Y. 1981)及びGreene及びWuts, Protective Groups in Organic
Synthesis, 2d ed., pages 309-405 (John Wiley and Sons, New York (1991))
に記載され、これら各々はここに参考として取り入れる。本発明のペプチド又は
ペプチド類似物のこのようなN末端アミノ基修飾は、ここで「N末端誘導体」と呼
ぶ。同様に、ペプチドのC末端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基もカル
ボキシ保護基を用いて化学修飾できる。「カルボキシ基」及び「Ｃ末端」という
用語は、上記のアミノ基及びＮ末端と同様の方法で使用される。ペプチドのＣ末
端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基は、Ｃ末端カルボキシ基のアルコ
ール又はアルデヒドでの還元又はオーラルエステルの形成又はチアゾリル、シク
ロヘキシル又は他の基などの置換基によるカルボキシ基の置換によって修飾でき
る。オーラルエステルはこの分野で良く知られ、例えば、メトキシメチル、エト
キシメチル、プロポキシメチル、イソプロポキシメチルといったアルコキシメチ
ル基などを含む。

【００５９】ペプチド組み合わせＡ．多量体化ドメイン本発明の好ましい実施態様では、ペプチド化合物は多量体化ドメインと組み合
わせられる。発明のこの態様では、少なくとも２つの異なるドメインを含むハイ
ブリッド分子が提供される。各分子は、ペプチドドメイン及び多量体化ドメイン
を含む、本発明によると、ペプチドドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域等の多
量体化ドメインに、場合によっては柔軟なのリンカードメインを介して結合する
。本発明のハイブリッド分子は、ペプチドを適切な多量体化ドメインと組み合わ
せることにより構成される。通常は、本発明のハイブリッド分子を調製する際、
ペプチドをコードする核酸は、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に作用可
能に結合する。典型的には、構築物は、ペプチドのＣ末端が多量体化ドメインの
Ｎ末端に結合した融合タンパク質をコードする。しかしながら、例えば、ペプチ
ドのＮ末端が多量体化ドメインのＣ末端に結合した融合物も可能である。好ましい多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域配列である。典型的に
は、そのような融合物においてコードされｒｙハイブリッド分子は、少なくとも
免疫グロブリン重鎖の定常領域の活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保
持する。また融合は、例えば、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、又は重鎖の
ＣＨ１のＮ末端近傍又は対応する軽鎖の領域にもなされる。

【００６０】ペプチドの免疫グロブリン定常ドメインへの融合がなされる正確なアミノ酸部
位は需要ではなく；特定の部位が良く知られ、生物学的活性、分泌、又は結合特
性を最適化するために選択される。この点において、当業者は文献に記載された
種々のイムノアドヘシンの構築を参照してもよい（米国特許第5,116,964号、第5
,714,147号及び第5,336,603号；Caponら, Nature, 337：525-531(1989)；Traune
ckerら, Nature, 339：68-70(1989)；Byrnら, Nature, 344：667(1990); Watson
等, (1990) J. Cell. Biol. 110: 2221-2229; watson等, (1991) Nature 349: 1
64-167; Aruffo等, (1990) Cell 61: 1303-1313; Linsley等, (1991) J. Exp. M
ed. 173: 721-730; Linsley等, J. Exp. Med. 174: 561-569; Stamenkovic等, (
1991) Cell 66: 1133-1144; Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：10535
-10539(1991),；Lesslauerら, J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p.11
5(P432)；及びPeppel等(1991) J. Exp.Med．174: 1483-1489; Mohler等, (1993) J. Immunol.151: 1548-1561; Bennett等, (1991) J. Biol. C
hem. 266: 23060-23067; Kurschner等, (1992) J. Biol. Chem. 267: 9354-9360
; Chalupny等, (1992) PNAS USA 89: 10360-10364; Ridgway及びGorman (1991)
J. Cell. Biol. 115, Abstract No.1448）。特別な態様では、免疫グロブリン型の多量体化ドメインは、免疫グロブリンＦ
ｃ領域を持つダイマーなどの多量体を提供するように選択される。従って、ペプ
チドは、特別な態様では、免疫グロブリン重鎖定常ドメインに結合し、機能的Ｆ
ｃドメインを含む多量体が提供される。この場合、免疫グロブリン鎖−ペプチド
配列をコードするＤＮＡは、典型的には第２のペプチド−免疫グロブリン重鎖融
合タンパク質をコードするＤＮＡとともに発現される。分泌の際、ハイブリッド
重鎖は共有結合し、２つのジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖を含む免疫
グロブリン様構造を提供する。

【００６１】好ましくは、親ポリペプチドＦｃ領域はヒトＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１
（Ａおよび非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のＦｃ領
域である。好適な実施態様では、ペプチド配列が免疫グロブリンＧ_１(ＩｇＧ_１)のＦｃ領
域のＮ末端に融合される。ペプチド配列に重鎖定常領域全体を融合させることが
できる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断
部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残
基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合にお
いて使用される。特に好適な実施態様では、ペプチドアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖
の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣ
Ｈ３ドメインに融合される。好ましい実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸
配列は、ＩｇＧ１の（ａ）ヒンジ領域及び（ｂ）ＣＨ３ドメインに融合する。

【００６２】この実施態様の特別な態様によれば、ペプチド及び多量体化ドメインを含むハ
イブリッド分子はマルチマー、例えばホモダイマー、ヘテロダイマー又はヘテロ
テトラマーとして組み立てられる。ホモダイマーは、ペプチド及び多量体化ドメ
インを含む２つのモノマーの結合又は架橋に結果である。しかしながら、２との
同一のモノマーが対になる必要はない。発明の特別な態様では、ペプチドと免疫
グロブリン定常領域等の多量体化ドメインを含むここに定義されるハイブリッド
分子は、免疫グロブリンの１つの腕を持つコンパニオン免疫グロブリン鎖と結合
してもよい。ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたハイブリッド分子の
例は以下に概略的に模式化される：（ａ）ＡＣＨ（ｂ）ＡＣＨ−ＡＣＨ（ｃ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ（ｄ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨここで、各Ａは、同一または異なるアドヘシンアミノ酸配列を表し；ＶＬは、免疫グロブリン軽鎖可変領域であり；ＶＨは、免疫グロブリン重鎖可変領域であり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常領域であり；ＣＨは、免疫グロブリン重鎖定常領域である。

【００６３】ここに記載したハイブリッド分子は、フレーム内のアドヘシン部分をコードす
るｃＤＮＡ配列をＩｇｃＤＮＡ配列に融合することにより最も便利に構築される
。しかしながら、ゲノムＩｇ断片への融合を用いることもできる（例えば、Aruf
fo等, (1990) Cell 61: 1303-1313; 及び Stamenkovic等, (1991) Cel 66: 1133
-1144参照）。後者の型の融合は、発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とす
る。Ｉｇ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、公表された配列を基に脾臓又は
抹消血液リンパ球から誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリッド化又
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって単離できる。ハイブリッド分子
のペプチド及び免疫グロブリン部分をコードするｃＤＮＡは、選択された宿主細
胞における効率的な発現を導くプラスミドベクターに直列に挿入される。

【００６４】あるいは、またペプチドが、例えば標準的な固相合成技術で合成される実施態
様では特に、ペプチドは当業者に馴染み深い種々の手段の任意のもので多量体化
ドメインに結合してよい。共有結合は、典型的には最も便利であるが、用途に応
じて他の結合形態も用いられる。共有結合の適切な形態の例は、活性化された化
学基を持つ分子と多量体化ドメインのアミノ酸側鎖との反応から形成される結合
を含み、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミ
ジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラ
ン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ
等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタ
ルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジ
アミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エ
チレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等
）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン
等）を用いて作成できる。ペプチド融合本発明によれば、ペプチドは任意に、例えば直接又は柔軟なペプチドリンカー
を介して他のペプチドに結合する。本発明によると、リンカードメインは、以下
に詳細に記載するように２又はそれ以上のペプチドドメインの間に離間した架橋
を提供する。発明のこの態様によると、ペプチドは、例えば融合タンパク質中で
互いに結合する。

【００６５】リンカードメイン本発明によれば、ペプチドドメインは任意に、例えば、柔軟なリンカードメイ
ンを介して、他のペプチドドメイン又は多量体化ドメインに結合する。本発明の
ハイブリッド分子のリンカー成分は必ずしも参与する必要はないが、ハイブリッ
ド分子の機能に寄与しうる。従って、本発明によれば、リンカードメインは、２又はそれ以上のペプチドドメイン又はペプチドドメインと多量体化ドメインと
の間に離間した架橋を提供する。このリンカードメインは様々な長さと仕様のものであってもよい。一般に、本
発明によれば重要なのはリンカードメインの長さであってその構造ではない。こ
のリンカードメインはハイブリッド分子のペプチドドメインを調和するＦＶＩＩ
／ＦＶＩＩａ分子に、空間的／コンホメーション的な束縛が実質的に無いように
結合させるのが好ましい。それ故に、リンカードメインの長さは、２つの機能、
例えばハイブリッド分子のペプチド及び多量体化ドメインの特性に依存する。当業者は、種々の原子の組み合わせが、種々の原子間の知られた距離に基づい
て種々の長さを提供することを理解するであろう（Morrison及びBoyd, Organic
Chemistry, 3rd Ed, Allyn and Bacon, Inc., Boston, MA (1977)）。例えば、
リンカードメインは種々の長さのポリペプチドであってよい。ポリペプチドのア
ミノ酸組成がリンカーの特性及び長さを決定する。例示的なリンカードメインは
、１又は複数のＧｌｙ及び／又はＳｅｒ／Ａｒｇ残基を含む。

【００６６】研究及び診断用組成物本発明のペプチドは、固体支持体などの高分子に非共有吸着するか又は共有結
合する。一般に、固体支持体はポリマーゲルなどの不活性マトリクスであり、三
次元構造と材料の格子又はネットワークを有する。合成又は天然の殆ど全ての高
分子が、二官能性試薬で架橋されたとき、適切な液体中でゲルを形成する。好ま
しくは、選択される高分子は、アフィニティクロマトグラフィでの使用に便利な
ものである。アフィニティクロマトグラフィに使用される殆どのクロマトグラフ
マトリクスはキセロゲルである。このようなゲルは乾燥時に収縮してゲルマトリ
クスのみを含むコンパクトな固体となる。乾燥キセロゲルが液体に再懸濁される
と、ゲルマトリクスは液体を吸収し、膨潤し、ゲル状態に戻る。ここで使用する
のに適したキセロゲルは、セルロース、架橋デキストラン（例えばセファロース
）、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリル
アミド−アガロースゲルなどのポリマーゲルを含む。

【００６７】あるいは、エーロゲルもアフィニティクロマトグラフィに使用できる。これら
のゲルは乾燥時に収縮しないが、周囲の空気の透過のみを可能にする。乾燥ゲル
が液体に曝露されると、後者はゲル中の空気を置換させる。個々での使用に適し
たエーロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルである。またここに包含されるのは、誘導体部分がペプチドリガンドのゲルマトリクス
への結合を促進し、アフィニティクロマトグラフィにおけるペプチド−ＦＶＩＩ
／ＦＶＩＩａ相互作用の立体的隠蔽を回避する誘導化ゲルに結合した本発明のペ
プチドである。あるいは、類似の利点のために、ゲルマトリクスとペプチドリガ
ンドとの間にスぺーサーアームを挿入することもできる。他の実施態様では、本発明は、選択された又は意図されたポリペプチドがその
Ｎ末端又はそのＣ末端、又は両末端において本発明のペプチドの１又は複数へ融
合したタンパク質を提供する。

【００６８】製薬組成物本発明のハイブリッド分子を含む化合物を含有する製薬組成物は、治療される
特定のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ媒介疾患又は障害に最も適した方法で製剤及び輸送
又は投与され、化合物の腸管外、局所、経口、局部、エアロゾル又は経皮投与又
は輸送に適した製剤を含む。ＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性凝固の抑制の徴候は、ステ
ント又は人工弁を通る血液循環に関連し、又は対外循環に関連し、それは透析手
法、血液濾過、又は手術中の血液バイパスなどの過程にある患者からインライン
で取り出された血液であり、好適な製剤はステント、弁及び濾過器などの装置を
コートするのに適したものである。幾分特有だが、本発明の好ましい組成物は、ここに記載した化合物とともに製
薬的に許容される担体を含み、担体の性質は投与輸送又は用途の形式で相違し、
例えば、経口投与では通常固体担体が使用され、ｉ．ｖ．投与では液体塩溶液担
体である。局部投与は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性凝固に適していると思われるが
、ステント又は弁等の人工装置を通る血液循環に関連しており、ペプチドは、例
えば共有結合により、人工装置に結合し、局部的な血栓形成を防止している。あ
るいは、ペプチドは、ペプチドが装置から徐々に溶離され、ＴＦ−ＦＶＩＩａ依
存性凝固に関連する事象に対する局部的又は全身的保護を与える製剤中で提供し
てもよい。一つの例として、ペプチドを吸着させたステントは、外科手術又は他
の手術の後に用いることができる。

【００６９】本発明の組成物は、患者及び本発明の化合物に相容性である製薬的に許容され
る成分を含有する。これらは一般に、懸濁物、溶液及びエリキシル剤、特にリン
酸緩衝塩水、生理食塩水、ダルベッコの媒体などの生物学的バッファーを含む。
またエアロゾルも使用でき、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化
剤、滑剤、バインダー、崩壊剤などの担体も使用できる（経口固体製剤の場合ｍ
粉末、カプセル及び錠剤）。ここで使用される用語「製薬的に許容される」は、一般に、連邦又は州政府の
監督官庁に認められ、動物、特にヒトでの使用のために米国特許第号薬局方又は
他の一般に認められた薬局方に記載されたことを意味する。

【００７０】選択は、前記種々の緩衝液または、例えば製薬級マンニトール、ラクトース、
澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース、炭酸マグ
ネシウム、その他を包含する賦形剤をも使用して達成できる。組成物の「ＰＥＧ
化(PEGylation)」は、当技術分野で知られている技術（例えば、国際特許公報WO
92/16555、Enzonの米国特許第5,122,614号、及び国際特許公報WO 92/00748参照
）を使用して達成してもよい。本発明の好ましい投与経路は、エアロゾル又は吸入形態である。本発明の組成
物は、分散試薬又は分散剤と組み合わせて、乾燥粉末として又は希釈剤中の溶液
又は懸濁物で投与できる。

【００７１】ここで使用される用語「分散剤」は、化合物のエアロゾル化又はタンパク質の
肺組織での吸収、あるいは両方を促進する薬剤を意味する。ここで使用される用
語「製薬的に許容される」は、一般に、連邦又は州政府の監督官庁に認められ、
動物、特にヒトでの使用のために米国特許第号薬局方又は他の一般に認められた
薬局方に記載されたことを意味する。好ましい分散剤はこの分野で良く知られ、
限定されないが、界面活性剤などを含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶
液の噴霧によって生ずる、化合物、特にペプチド化合物の表面誘発性の凝固を抑
制するためにこの分野で一般に使用される界面活性剤を使用できる。このような
界面活性剤の非限定的な例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコー
ル、及びポリオキシエチレンそる尾端脂肪酸エステルを含む。使用される海面下
製剤の量は変化するが、一般には製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。特
定の態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンそる尾端モノオレエート又は
ソルビタントリオレエートである。好ましい界面活性剤はこの分野で知られてお
り、特定の製剤、化合物の濃度、希釈剤（液体製剤における）又は粉末の形態（
乾燥粉末製剤における）等に応じて、意図する特性に基づいて選択される。

【００７２】さらに、化合物の選択、意図する治療効果、肺組織の質（例えば疾患又は健常
な肺）、及び多くの他の要因に応じて、液体又は乾燥製剤は以下に更に述べるよ
うな付加的成分を含有してもよい。液体エアロゾル製剤は、一般に、生理学的に許容される希釈剤中に、化合物及
び分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細に分割した固体
形態の化合物及び分散剤からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾルのいずれかで、
製剤はエアロゾル化される。即ち、エアロゾル化された投薬が実際に肺胞に到達
することを確実にするために、液体又は固体粒子まで分解する必要がある。一般
に、マス媒体の動力学的半径は、薬物粒子の肺胞への到達を確実にするために５
マイクロメートル未満とされる（Wearley, L.L., 1991, Crit. Rev. in Ther. Drug Carr ier Systems 8: 333）。ここで用語「エアロゾル粒子」は、肺性投与、即ち肺胞
に到達するのに適した。液体又は固体粒子を記載するのに使用される。輸送装置
の構成といった他の考慮では、製剤中の付加的な成分及び粒子の特性が重要であ
る。この態様の薬剤の肺性投与は当業者に良く知られており、製剤の操作、エア
ロゾル化手段及び輸送装置の構成は、当業者に日常的な実験を要求するだけであ
る。

【００７３】輸送装置の構成に関して、エアロゾル化のあらゆる形態がこの分野で知られて
おり、限定されないが、液体製剤の噴霧、微粒化又はポンプエアロゾル化、及び
乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用できる。固体製剤の投
与に特に設計された輸送装置が考慮される。しばしば、液体又は乾燥粉末のエア
ロゾル化は推進剤を必要とする。推進剤はこの分野で一般に使用される任意の推
進剤でよい。これらの有用な推進剤の特定の非限定的な例は、クロロフルオロカ
ーボン、ハイドロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、又はトリ
フルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノー
ル及び１,１,１,２-テトラフルオロエタン又はこれらの混合物を含む炭化水素で
ある。本発明の特定な態様では、エアロゾル化のための装置は、計量用量吸入器であ
る。計量用量吸入器は、投与したときに投与に応じて変化する用量ではなく特定
の用量を与える。このような計量用量吸入器は、液体又は乾燥粉末エアロゾル製
剤の何れにも使用できる。計量用量吸入器はこの分野で良く知られている。

【００７４】化合物がひとたび肺に到達すると、多くの用量依存的因子が薬剤吸収に影響す
る。化合物の循環レベルを要求する疾患又は障害の治療において、エアロゾル粒
子サイズ、エアロゾル粒子形状、感染、肺疾患又は塞栓の有無などの因子が化合
物の吸収に影響しうることは理解されるであろう。ここに記載した各製剤につい
て、ある種の滑剤、吸収促進剤、タンパク質安定化剤又は懸濁剤が適当であるこ
ともある。これらの付加的な薬剤の選択は、目的に応じて変化する。化合物の局
部的輸送が望まれ意図されている場合、吸収促進などの変化はあまり重要ではな
くなることは理解されるであろう。

【００７５】液体エアロゾル製剤本発明の液体エアロゾル製剤は、典型的には噴霧器で使用される。噴霧器は、
圧縮空気又は超音波のいずれでもよい。この分野で知られた噴霧器が、本発明と
組み合わせて使用でき、限定されないが：Ultravent, Mallinckrodt, Inc. (St.
Louis, MO); Acorn II 噴霧器（Marquest Medical Products, Englewood CO）
である。本発明と組み合わせて有用な他の噴霧器は、1986年11月25日に発行され
た米国特許第4,624,251号、1972年11月21日に発行された米国特許第3,703,173号
、1971年2月9日に発行された米国特許第3,561,444号及び1971年1月13日に発行さ
れた米国特許第4,635,627号に記載されている。製剤は担体を含んでもよい。担体は、循環系に可溶で生理学的に許容される高
分子であり、生理学的な許容とは、当業者が前記担体を治療計画の一部として患
者に注入することを許容することを意味する。担体は、好ましくは循環系におい
て比較的安定であり、クリアランスのための許容される血漿半減期を持つ。この
ような高分子は、限定されないが、ダイズレシチン、オレイン酸及びソルビタン
トリオレエートを含み、ソルビタントリオレエートが好ましい。この実施態様の製剤は、タンパク質安定化又は浸透圧の調製のための他の薬剤
を含んでもよい。この薬剤の例は、限定されないが、塩化ナトリウム、又は塩化
カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトース又はマンノースなどの炭水化
物等を含む。

【００７６】エアロゾル乾燥粉末製剤また、この製薬製剤は、微細に分割した形態の化合物及び分散剤を含む乾燥粉
末吸入製剤として使用することも考慮する。化合物の形態は一般に、凍結乾燥さ
れた粉末である。ペプチド化合物の凍結乾燥された形態は、標準的な技術を通し
て得られる。他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の化合物の１又は複数を含む微細
に分割された乾燥粉末、分散剤及びバルク剤も含有する。本発明の製剤と組み合
わせて有用なバルク剤は、装置からの粉末の分散を促進する量のラクトース、ソ
ルビトール、スクロース、又はマンニトールなどの薬剤を含む。

【００７７】治療方法本発明の化合物は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の生物学的作用を予防する目的で
治療に使用できる。ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害はＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性血液凝固
の低下を意図する時に望ましい。これに限定するものではないがこれらの症例に
は血栓溶解療法に伴う動脈再血栓症の予防を含む。ＴＦ−ＦＶＩＩａは深部脈管
血栓症、動脈血栓症、発作、ＤＩＣ、敗血症ショック、心肺バイパス手術、成人
呼吸困難症候群、先天性血管浮腫を含む、種々の臨床的容体に重要な役割を果た
していることが示唆されている。それ故、ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害剤は炎症およ
び／または血栓症の調節に重要な役割を果たすことがある。そこで本発明は治療的有効量の本発明のハイブリッド分子を必要とする患者に
投与することを含むヒトでＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介するイベントを予防する方法
を含む。本発明のハイブリッド分子の治療的有効量は所望の効果を達成するよう
に予め決定しておく。治療に採用する量は治療対象、投与経路および処置すべき
病状に依存して変化することになる。従って、投与する用量は存在するＦＶＩＩ
／ＦＶＩＩａに結合して不活性な複合体を形成して、処置する対象で血液凝固を
低下させるに十分な用量である。

【００７８】治療的有効性はＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性凝固に関連する症状の１種またはそれ
以上の改善によって測定される。このような治療的有効用量は熟練した専門家に
よって決定され、処置すべき対象の年齢条件、病状、性および病状に依存して変
化するものである。全身的投与についての適当な用量範囲は典型的には投与経路
に依存して約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの間であ
る。本発明によれば、好適な治療的用量は約１μｇ／ｋｇ体重と約５ｍｇ／ｋｇ
体重の間である。例えば適当な臨床管理条件は意図する治療に特定される範囲の
血中濃度を維持するに十分な静脈注射または点滴を包含する。

【００７９】異常な血栓によって特徴づけられる状態は、動脈及び静脈脈管構造を含む。心
臓動脈脈管構造について、異常な血栓形成は、例えば、確立されたアテローム斑
の破裂を特徴とし、それは急性心筋梗塞及び不安定な狭心症の主要な原因であり
、また血栓症治療又は経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）から生ずる閉塞性心臓血
栓形成も特徴とする。静脈脈管構造については、異常な血栓形成は、下肢又は腹
部領域での手術を受けた患者に見られる状態を特徴とし、この患者はしばしば静
脈脈管構造に血栓形成を生じ、血流の減少が起こって四肢及び肺性塞栓症の傾向
に影響を与える。異常な血栓形成は、さらに播種性血管内凝固症によって特徴づ
けられ、通常は敗血性ショック中の両血管系、ある種のウイルス感染及び癌、凝
固因子の即座の消費がある状態、及び全身性凝固に関連し、広範な生物の破壊を
導く微小血管系を通して起こる生命を脅かす血栓の形成をもたらす。限定のためではなく、例示のために以下の実施例を提示する。本明細書に開示
する引用文献は全て参考のために開示を明示的に引用するものである。

【００８０】（実施例）実施例１ＦＶＩＩａに結合しＦＸ活性化及び凝固を阻害するペプチドの同定及び特徴付けファージライブラリ − ランダム配列ペプチド多価ペプチドファージライブ
ラリは既に記載されている（Lowman, H.B.等, (1998) Biochemistry 37: 8870）
。ペプチドライブラリは、形態Ｘ_ｉＣＸ_ｊＣＸ_ｋ（ここでＸは２０の天然発生Ｌ
−アミノ酸の任意のものであり、ｊは４−１０の範囲でｉ＋ｊ＝１８である）、
非束縛ライブラリＸ_２０、及びＸ_４ＣＸ_２ＧＰＸ_４ＣＸ_４から構成される。１０
ライブラリの各々は過剰の１０^８クローンを有する。選択条件 − ＴＦ１−２４３（Paborsky, L.R. 等, (1991) J. Biol. Chem.
266: 21911）又は組換えヒトＦＶＩＩａ（各2μg/ml）を、50mM重炭酸アンモニ
ウム、pH9.3中で４℃において終夜インキュベートすることによりMixsorpプレー
ト（Nunc）に直接固定化した。ウェルを選別バッファー（50mMＨＥＰＥＳ、pH7.
2、5mMＣａＣｌ_２、5mMＭｇＣｌ_２、150mMＮａＣｌ、%ＢＳＡ）を用いて２５℃
で１時間ブロックした。選別バッファー中の組換えヒトＦＶＩＩａ（2μg/ml）
を、既にTFでコートしてブロックしたウェルに30分かけて添加し、ＴＦ−ＦＶＩ
Ｉａ複合体を形成した。上記のライブラリからのファージを３グループにプール
した。プールＡはＸ_ｉＣＸ_ｊＣＸ_ｋ、但しｊ＝５−８を含み；プールＢはＸ_４Ｃ
Ｘ_２ＧＰＸ_４ＣＸ_４、Ｘ_２０、及びＸ_ｉＣＸ_ｊＣＸ_ｋ、但しｊ＝４を含み；プー
ルＥはＸ_ｉＣＸ_ｊＣＸ_ｋ、但しｊ＝８−１０を含む。各プールからのファージを
選別バッファー中の固定化標的とともに２５℃で３時間インキュベートし；一般
に約５ｘ１０^１０ファージを各ラウンドの開始時に添加した。非結合ファージは
、洗浄バッファー（50mMＨＥＰＥＳ、pH7.2、150mMＮａCｌ、0.005%Tween20）で
の反復洗浄により除去し；残りのファージを500mMＫＣＬ、10mMＨＣｌ、ｐＨ２
で溶離した。溶離したファージは、次いでＸＬ１-ブルーセル中で、ＶＣＳＭ１
３ヘルパーファージ（Stratagene）で３７℃において終夜成長させた。富化は、
標的コートウェルに結合したファージの数をＢＳＡコートウェルと比較して滴定
することにより監視した。

【００８１】ＦＸ活性化アッセイ − ＴＦ−ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化は、室温にお
いてペプチド濃度の関数として監視した。各アッセイサンプルは、100μlのＨＢ
Ｓ／Ｃａバッファー（20mMＨＥＰＥＳ、pH7.4、5mMＣａＣｌ_２、150mMＮａＣｌ
、0.1%ＰＥＧ８０００）中の460pM再脂質化ＴＦ_{１−２４３}（ＴＦ_ＰＣ）（Kelle
y, R.F. 等, (1997) Blood 89: 3219-3227）及び30pMのＦＶＩＩａを含み；２０
分後、ＨＢＳ／Ｃａバッファー中で希釈したペプチド25μlを添加した。３０分
のインキュベーションに続いて、HBS/Ca中の1μMのFXを25μl添加することによ
り反応を開始させた（注記：これは、306pMＴＦＰＣ、20pMＦＶＩＩａ、及び166
nMＦＸの最終的な濃度となる）。速度論的分析のために、ＦＸの最終濃度は２０
から５００ｎＭの間で変化させた。１、３、５、７及び９分後に25μlのアリコ
ートを取り出し、50mMＥＤＴＡ25μlで失活させた。各アリコートで生成された
ＦＸａは、250nMのSpectrozyme fXa(American Diagnostica)、50mMＴｒｉｓ、pH
8、50mMＮａＣｌ、0.0025%TritonX-100の100μlの添加により測定できた。各ペ
プチド濃度で生成されたＦＸａの割合は、405nmにおける吸収の時間に対する初
期の傾きに比例していた。Ｓ字型曲線が４パラメータ等式に非線形回帰分析によ
りフィットされ（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11: 431-441 (1963
)）；アッセイにおいて半最大値を与える各ペプチドの濃度が曲線から計算され
、ＩＣ_５０値と呼ばれる。

【００８２】凝固アッセイ − プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラ
スチン時間（ＡＰＴＴ）凝固時間アッセイを、クエン酸化プールした正常血漿（
ヒト又は様々な動物種）で実施した。凝固時間は、ACL 300自動凝固分析機（Cou
lter Corp., Miami, FL）及び下記の市販の試薬を用いて測定した。ＰＴアッセイについては、種々の濃度の阻害剤水溶液を、クエン酸化プール血
漿に、血漿９部に対して阻害剤１部の比率で添加した。３０分のインキュベーシ
ョンの後、これらの混合物をACL 300分析機のサンプルカップに添加した。ヒト
再脂肪化組織因子及びＣａ２＋の混合物であるイノビン(Innovin)(登録商標)（D
ade International Inc., Miami, FL）を試薬カップに添加した。正確な容量の
サンプル及びイノビン（50μlサンプル、100μlイノビン）が、予め３７℃に平
衡化されたアクリルロータのセルに自動的に移送された。２分のインキュベーシ
ョン時間の後、２つの成分を遠心分離することにより混合して凝固を開始させた
。凝固は光学的に監視し、凝固時間は秒で報告した。このシステムでは、対照血
漿（血漿プラス阻害剤希釈剤）の凝固時間は、典型的には８から１０秒である。
延長倍数は、対照の凝固時間に対する阻害剤の凝固時間である。ＡＰＴＴアッセイについては、阻害剤と血漿とを混合し、上記のようにACL 30
0分析機のサンプルカップに移送した。アクチンＦＳ（登録商標)及びＣａＣｌ_２（Dade Diagnostics, PR）を試薬カップ１及び２に各々添加した。正確な容量の
サンプル（53μl）及びアクチンＦＳ(53μl)が、予め３７℃に平衡化されたロー
タのセルに自動的に移送され混合された。２分のインキュベーション時間の後、
ＣａＣｌ_２の添加により凝固を開始させた。凝固は光学的に監視し、凝固時間は
秒で報告した。対照血漿のＡＰＴＴは、アッセイに使用した血漿の種に依存して
、典型的には１２から３２秒であった。延長倍数は、対照の凝固時間に対する阻
害剤の凝固時間である。

【００８３】ファージＥＬＩＳＡ − ＴＦ−ＦＶＩＩａに対してペプチド−ファージと競
合するペプチドの能力をファージＥＬＩＳＡを用いて監視した。選別バッファー
中のペプチドの希釈物を（上記のように）ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体でコートした
ミクロタイタープレートに３０分間添加した。ＴＦ７４ペプチド配列を表示する
約１０^１１の一価ファージを、次いで更に１５分間添加した。ミクロタイタープ
レートを洗浄バッファーで洗浄し、ＦＶＩＩａに結合したファージを抗-ｇＶＩ
ＩＩ／ＨＲＰモノクローナル抗体抱合体（HRP/抗-M23抱合体、Pharmacia Amersh
am Biotech）で検出した。結合したＨＲＰの量をＡＢＴＳ／Ｈ_２Ｏ_２基質を用い
て測定して405nmの吸収で監視した。405nmの吸収をウェルに最初に添加したペプ
チド濃度に対してプロットした。Ｓ字型曲線が４パラメータ等式に非線形回帰分
析によりフィットされ（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11: 431-441
(1963)）；アッセイにおいて半最大値を与える各ペプチドの濃度が曲線から計
算され、ＩＣ_５０値と呼ばれる。

【００８４】一価ファージでの部分的及び完全ランダム化 − ｇＩＩＩによってコードさ
れる末端タンパク質にリンカー配列を介して融合したファージの表面にペプチド
の単一（コピー）を表示する一価ライブラリを、ファージミドｔ４．ｇ３の一本
鎖テンプレート指向性突然変異誘発（Kunkel T. A.等, (1991) Methods Enzymol
. 204: 125-139）を用いて構築した。ファージミドｔ３．ｇ４はｐＡ４ｇ３２（
Dennis M.S.及びLazarus, R.A. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22129-22136）の
誘導体であり、ｇＩＩＩに融合したＡＰＰＩのコード化配列がリンカー配列及び
ｇＩＩＩに枠内で融合した６０ｂｐのスペーサーで置換され、更にＣＭＰ^ｒ遺伝
子がＡＭＰ^ｒ遺伝子の独特なｈｉｎｃＩＩ部位に挿入されている。結合性効果を
通して集団を支配しうる関連するが親和性の弱い多価クローンを排除するために
薬物耐性の変化が意図された（Cwirla, S.A.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 6378-6381）。部分的にランダム化されたライブラリは、初期多価ライ
ブラリから同定されるが各アミノ酸位置で50%の突然変異を許容するペプチド配
列に向けられたバイアスを維持する用に意図された。この突然変異比率は７０−
１０−１０−１０混合の塩基を持つオリゴ類を合成することにより達成された（
オリゴのドープされた領域の各塩基は、野生型配列に寄与する塩基70%と多の３
塩基の各々10%を含む混合物を用いてカップリングされている）。対照的に、ラ
イブラリにおける完全ランダム化は、表示されたペプチドの部分を完全ランダム
化し、他の部分は一定に維持するために特定のコドンのＮＮＳを用いて合成する
ことにより得られた。

【００８５】ペプチド合成 − ペプチドは、ＰＥＧ−ポリスチレン樹脂を用いた0.25mmol
スケールのFmoc-ベースの固相合成で手動又は自動（Perceptive Pioneer）で合
成した（Bodansky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer, B
erlin）。各アミノ酸のカップリングは、２-(H-ベンゾトリアゾール-１-イル)-
１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU)及び
ジメチルアセタミド（DMA)中のＮ-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及びジ
イソプロピルエチルアミン(DIPEA)で実施した。カルボキシ末端アミドで終端す
るペプチドはリンクアミド樹脂で調製した。アミノ末端のアセチル化は、ジクロ
ロメタン中で、10%トリエチルアミン中の無水酢酸で実施した。95%トリフルオロ
酢酸(TFA)及び5%トリイソプロピルシランで側鎖保護基を除去し、ペプチドを樹
脂から切り離した。飽和ヨウ素酢酸溶液を添加してジスルフィド結合を酸化した
。ペプチドを0.1%ＴＦＡを含む水／アセトニトリル勾配を用いた逆相ＨＰＬＣで
精製して凍結乾燥した。ペプチドは、分析用ＨＰＬＣで＞９５％の純度であり、
その同定はマススペクトルで確認した。

【００８６】ビオチニル化ペプチド − ペプチドは上記の方法を用いて合成した。カルボ
キシ末端ビオチンを含むペプチド（例えばＴＦ１４７ｂ）は、Ｆｍｏｃ-Ｌ-リジ
ン（ε-Ａｌｏｃ）-ＰＥＧポリスチレンリンクアミド樹脂で調製した。各アミノ
酸のカップリングは上記の湯に実施した。鎖組立の完了時に、リジンのε-側鎖
保護基をＰｄ^０で脱保護した。Ｆｍｏｃ-アミノカプロン酸をカップリングし、
脱保護し、次いで上記の用にビオチンにカップリングした（Kates, S.A., de la
Torre, B.G., Eritja, R.及びAlbericio,F. (1994) tetrahedron Lett. 35: 10
03）。

【００８７】ＦＶＩＩａ結合アッセイ − ＦＶＩＩａへの結合についてＴＦ７６のビオチ
ニル化体（例えばＴＦ１４７ｂ、又は記載したようにビオチニル化されうるここ
に記載した多のペプチド類）と競合するペプチドの能力は、ＦＶＩＩａ結合ＥＬ
ＩＳＡ又はＴＦ−ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡで監視した。ミクロタイタープレー
トを、50mM重炭酸アンモニウムpH9中の2μg/ml組換えヒトＦＶＩＩａ又は2μg/m
lＴＦ_{１−２４３}で４℃において終夜コートし（Paborsky, L.R.等 (1991) J. Bi
ol. Chem. 266: 21911）；他の工程は全て室温で実施した。次いでプレートをア
ッセイバッファー（50mMＨＥＰＥＳ、pH7.2、5mMＣａＣｌ_２、15-mMＮａＣｌ）
中の1%ＢＳＡでブロックした。ＴＦ−ＦＶＩＩａＥＬＩＳＡについては、アッセ
イ用バッファー中1%ＢＳＡ中のＦＶＩＩａ（2μg/ml）を、予めＴＦでコートし
てブロックしたウェルに３０分添加してＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体を形成した。ア
ッセイバッファープラス0.05%Tween20中のペプチド希釈物を、20nMＴＦ１４７ｂ
とともにミクロタイタープレートに１時間添加した。ミクロタイタープレートを
アッセイバッファープラス0.05%Tween20で３回洗浄し、結合したビオチニル化ペ
プチドをストレプトアビジン／ＨＲＰ抱合体（ストレプトアビジン−ＰＯＤ、Po
che Molecular Biochemicals）で検出した。ＨＲＰ結合の量は、ＡＢＴＳ／Ｈ_２Ｏ_２基質（Kirkegaad and Perry Labpratories）を用いて測定し、405nmの吸収
を監視した。405nmの吸収をウェルに最初に添加したペプチド濃度に対してプロ
ットした。Ｓ字型曲線が４パラメータ等式に非線形回帰分析によりフィットされ
（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11: 431-441 (1963)）；アッセイ
において半最大値を与える各ペプチドの濃度が曲線から計算され、ＩＣ_５０値と
呼ばれる。

【００８８】ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡを用いたスクリーニングアッセイ − 上記のＦＶ
ＩＩａ結合アッセイは、本発明のペプチドがＦＶＩＩａに結合することを阻止す
る任意の化合物のスクリーニングにも使用することができる。これは、上記のよ
うに、又は以下のように修正して実施できる。即ち、競合的結合アッセイは、ペ
プチド結合の阻害剤を同定する目的の化学ライブラリの高スループットスクリー
ニングにおける使用のために確立された。アッセイは、1μg/mlＦＶＩＩａでコ
ートされＢＳＡでブロックされた白濁、高結合、３８４-ウェルプレートで実施
される。サンプル、対照、又はアッセイバッファー（20μl）及びビオチニル化
ペプチド（例えばＴＦ１４７ｂ、又は記載したようにビオチニル化されうるここ
に記載した多のペプチド類）（20μl）を各ウェルに添加し、プレートを室温で
１時間インキュベートする。サンプル又は対照は、プレート上の因子ＶＩＩａへ
の結合に関してビオチニル化ペプチドと競合させてもよい。結合したビオチニル
化ペプチドは、プレートを６回洗浄することにより除去し、40μlのストレプト
アビジン−ユーロヒ゜ウムを添加する。続く３０分のインキュベーションの間に、ストレプトアビジン−ユーロピウムはプレート上に残るビオチニル化ペプチドに結合
する。６回洗浄して非結合のストレプトアビジン−ユーロピウムを除去した後、
40μlの促進溶液を各ウェルに添加して存在する非蛍光キレートからユーロピウ
ムを解離させ、これを高蛍光キレートと置換する。蛍光は、Wallac Victorミク
ロプレートリーダーで、340nmでの励起及び100μ秒遅延に続く615nmでの発光を
読む。結合のパーセント阻害は、試料としてのアッセイバッファーでの対照に対
して計算する。

【００８９】結果多価ペプチド−ＴＦ−ＦＶＩＩａに結合するファージ − 多価ペプチドライ
ブラリは、固定化ＴＦ−ＦＶＩＩａに対して３つのプールに選別された（Ａ、Ｂ
及びＥと呼ぶ）。多価ファージディスプレイ（Scott J.K. 及び Smith G.P. Sci
ence (1990) 249: 386-390; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol
. Struct 26: 401-424; Wells, J.A.及びLowman, H.B. (1992) Curr. Opin. Bio
technol. 3: 355-362）を、結合効果を通した結合性の促進に使用した。４ラウ
ンドの選択及び増幅の後、プールＥについての富化、ＢＳＡでコートしたウェル
から溶離されたファージ数で除したＴＦ−ＦＶＩＩａコートウェルから溶離され
たファージ数は、１７００倍であった。各プールの１２ランダムクローンからの
ＤＮＡを配列決定した。プールＥのクローンは、全て単一のクローンからの同胞
であり、推定ペプチド配列：EAALCDDPRLDRWYCIFAGE（配列番号：１）を有し；こ
の配列を含むペプチドはＴＦ５６と命名された。この配列を持つファージは、固
定化ＦＶＩＩａ又はＴＦ−ＦＶＩＩａに特異的に結合したが、ＴＦ又はＢＳＡの
いずれでコートしたウェルにも結合しなかった。さらに、このクローンは活性部
位ブロックしたＴＦ−ＦＶＩＩａに共有又は非共有結合したが、ＦＶＩＩａの活
性部位はビオチニル化ＥＧＲクロロメチルケトンでアセチルかされているか又は
ＴＦ７Ｉ-Ｃ、クニッツドメイン阻害剤（Dennis M.S.及びLazarus, R.A. (1994)
J. Biol. Chem. 269: 22129-22136）でブロックされており、ペプチドはＦＶＩ
Ｉａに結合するが活性部位から区別される部位−エキソサイトであることを示し
ている。

【００９０】部分的ランダム化 − 設計された最初のペプチドライブラリは、２０^２０（
１０^２６）を越える異なるクローンの潜在的多様性をコードしたが、作成された
実際のライブラリは約１０^９クローンを含むのみであり、潜在的な多様性の極め
て小さな割合であった。最初に選択したペプチドの領域内で検索を狭くしペプチ
ド多様性を更に探索するために、部分的ランダム化技術を採用した。この技術は
野生型配列へのバイアスを維持する一方、（アミノ酸レベルで）各アミノ酸位置
における50%の突然変異を導入し；即ち平均では、２０アミノ酸ペプチドを表示
するファージは１０のランダム突然変異を獲得する。さらに、更なる親和性向上
の予測は、我々に、結合性効果を排除するためにｇＩＩＩへの融合を介する一価
ファージでのライブラリの構築を導いた（Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Bio
phys. Biomol. Struct 26: 401-424; Lowman H.B. 等, (1991) Biochemistry 30
: 10832-10838; Wells, J.A.及びLowman, H.B. (1992) Curr. Opin. Biotechno;
. 3: 355-362)。

【００９１】ＴＦ５６配列（ライブラリε３）に基づく一価部分的ランダム化ライブラリを
構築し、ｔｆ−ＦＶＩＩａで４ラウンド選別した。１００,０００倍の富化が観
察された。再度、ランダムクローンを選択して配列決定し；推定ペプチド配列を
表Ｉに示した。ＴＦ５６配列の幾つかのアミノ酸位置は１００％保持されている
が、これらの位置の多くで複数のコドンが観察され；野生型アミノ酸はライブラ
リ設計を反映する各位置に表した。一つの突起すべき例外は、位置１０における
Ｌの不存在であり、Ｖ、Ｉ又はＦがこの位置での優勢置換基であることを示して
いる。部分的ランダム化の後に強く保持されている残基は、直接結合又は構造的
理由のいずれかに必須であると思われる。

【００９２】ペプチド配列は、４ラウンドの選択後に得られたクローンのＤＮＡ配列から推定
した。頻度は、プールから配列決定された全クローン数の中の各クローンの出現数を表
す。下線を付した残基は、明細書に記載したように部分的ランダム化された野生型配
列を示す。

【００９３】完全突然変異 − 親和性変異を完了するために第３の組のライブラリを構築
し、それは100%保存される位置が固定され、残りの位置では完全にランダム化さ
れている。さらに、ジスルフィドロープに隣接する残基の役割が、アミノ酸及び
カルボキシ末端の一部又は両方を失ったライブラリを構築することにより取り扱
われている。即ち、４つの一価ライブラリが構築され、表ＩＩに記載されている
。４ラウンドで各ライブラリに１００,０００倍の富化が観察され；ランダムク
ローンからの配列が表ＩＩに示されている。（９）アミノ酸位置で完全にランダ
ム化された）これらのライブラリは完全ではないが、４ライブラリの比較は、各
位置での最適アミノ酸についてのコンセンサスを明らかに示している。

【００９４】ペプチド配列は、４ラウンドの選択後に得られたクローンのＤＮＡ配列から推定
した。影を付した残基は、固定された野生型配列を示し、下線を付した残基は、
明細書に記載したように完全ランダム化されたものを示す。

【００９５】ＴＦ−ＦＶＩＩａに結合するペプチドの特徴付け − ファージディスプレイ
されたライブラリから選択した配列の活性を評価するために、これらのライブラ
リから選択した配列に対応するペプチドを化学的に合成した。即ち、ライブラリ
Ｅ３からのランダムファージ誘導クローンに対応するペプチドＴＦ５６（EAALCD
DPRLDRWYCIFAGE-NH2）（配列番号：１）、部分的ランダム化ライブラリから誘導
されたクローンに対応するペプチドＴＦ５８（EGTLCDDPRIDRWYCMFSGV）（配列番
号：２）、及び完全突然変異配列からのコンセンサスに対応するTF76（Ac-ALCDD
PRVRWYCQFVEG-NH2）（配列番号：８）を化学的に合成した。これら並びにTF７４
及びTF151からのデータを図に示した。ペプチドは、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体への結合性についてのみ選択したが、我
々は機能的に類似する関連ペプチド、即ち、ＦＸのＦＸａへのＴＦ−ＦＶＩＩａ
触媒活性化を、ＦＸの結合及び／又はターンオーバーを妨害することにより用量
依存的に阻害するペプチドに興味がある。よって、それらのＦＸ活性化を阻害す
る能力について試験し；選択したペプチドによるＦＸ活性化の阻害を図１に示し
た。選択したペプチドの配列及びＦＸ活性化についてのＩＣ_５０を図８に示した
。さらに、成熟プロセスにおいて後に誘導されるペプチドは能力が高く、この手
法の有効性を示している。精製した成分を用いてそれらがＦＸ活性化を阻害する能力に一致して、ここに
記載のペプチドは有効な抗凝固剤であった。用量依存的なプロトロンビン時間（
ＰＴ）の延長によって測定した場合のヒト血漿におけるＴＦ依存的外因性凝固経
路の阻害を図２Ａに示した。我々が、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ）によって測定した場合の表面依存性内因性経路におけるヒト血漿の凝固時
間を延長させる証拠を見出さなかったのは重要である（図２Ｂ）。これは、Ｅペ
プチドが、トロンビン，ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、血清カリクレイン、及び
ＦＶＩＩａを含む内因性経路に含まれるセリンプロテアーゼを全く阻害しないこ
とを意味する。

【００９６】ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡ − ＦＶＩＩａへの結合についてペプチドがＴＦ
７６のビオチニル化体（例えばＴＦ１４７ｂ）又はここに記載の他のペプチドと
競合する能力は、ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡを用いて監視し；選択したペプチド
によるＴＦ１４７ｂのＦＶＩＩａ又はＴＦ−ＦＶＩＩａへの結合の阻害を図３に
示した。選択したペプチドの配列及びＴＦ１４７ｂのＦＶＩＩａ又はＴＦ−ＦＶ
ＩＩａへの結合の阻害に関するＩＣ_５０を図８に示した。またＦＶＩＩａ結合Ｅ
ＬＩＳＡは、本発明のペプチドがＦＶＩＩａに結合するのを阻止する任意の化合
物のスクリーニングにも使用できる。これは、ビオチニル化ペプチドを検出する
種々の試薬を用いて実行することができた。さらに、ここに記載の種々のペプチ
ドは、同タイプのアッセイ法の開発に使用できた。よって、ペプチド結合の阻害
剤を同定する目的の化学ライブラリの高スループットスクリーニングで使用され
る競合的結合アッセイ法が確立された。

【００９７】実施例２．ＦＶＩＩａに結合してＦＸ活性化及び凝固を阻害するペプチド融合物
の発現及び特徴付け方法ＴＦ１５１−Ｆｃ発現ベクターの構築 − ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmi
gen）に基づいて組換え移送ベクターの構築に標準的なＤＮＡ技術を使用した（S
ambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.(1989), Molecular Cloning: A L
aboratory Manual, second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Y
ork; O'Reilly, D.R. Miller, L.K., 及びLuckow, V.A. (1994) Baculovirus Ex
pression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York
）。ｐＶＬ１３９３誘導プラスミドｐｂＰＨ.Ｈｉｓは、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩ
で線形化され、エビアルカリホスファターゼで処理した（Dwyer,M.a.等, (1999)
J. Biol. Chem. 274: 9738-9743)。ヒトIgG1のＦｃタンパク質はＮｄｅＩを用
いた消化及びそれに続く他のｐＶＬ１３９３誘導プラスミドｐＶＬ１３９３.Ｉ
ｇＧのクレノウ及びＮｃｏＩでの処理により７００塩基対の断片として得た。Ｍ
ＩＰ.５のシグナル配列は、ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩで消化する際にＦｃ配列の
前に導入し、断片内にはＡｓｃＩ部位が挿入された。ＡｓｃＩ部位は推定アミノ
酸配列切断部位に続いて現れる。ライゲーションの後、コンピテントな大腸菌XL
-1ブルーを形質転換し、DNA配列分析により細菌を正しい組換えプラスミド（PVL
1393.MIP.5sig.Fc）について選択した。次いで、PVL1393.MIP.5sig.FcをＡｓｃ
Ｉ及びＳｔｕＩで線形化し、エビアルカリホスファターゼで処理した。線形化ベ
クターは、次いで相容性末端を持つＤＮＡの合成片で結合させた。合成ＤＮＡ挿
入物は、２オリゴをGGGSGGリンカー（配列番号：１０４）を含むペプチド配列Ｔ
Ｆ１５１（図８）をコードする配列：5'-GCC GGA GCT CCC GCC TCC CAG GCA GGC
CTG CAG GCA GGC GCA GCC GGG GCC GAT GCA TCC CCA GGA CTC GTA CAC CTG GG(
配列番号：１０２)及び5'-CGC GCC CAG GTG TAC GAG TCC TGG GGA TGC ATC GGC
CCC GGC TGC GCC TGC CTG CAG GCC TGC CTG GGA GGC GGG AGC TCC GGC-3'(配列
番号：１０３）とともにアニールすることにより形成した。ライゲーションの後
、コンピテントな大腸菌XL-1ブルーを形質転換し、dRhodamine線量-停止剤法及
びApplied Biosustems ABI モデル373自動ＤＮＡ配列器を用いたＤＮＡ配列分析
により正しい組換えプラスミド（pVL.1393.MIP5.TF151-Fcと命名）について選択
した。組換え移送ベクターはQiagenのMini-Prepを用いて精製し、組換えバキュ
ロウィルスの構築に使用した。

【００９８】組換えバキュロウィルス、AcNpV.TF151-Fcは、ＳＦ９細胞の移送ベクター及び
線形化野生型バキュロウィルスＤＮＡでの同時形質転換に続いて産生された（Au
tographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNpV), Pharmingen）。
組換えバキュロウィルスAcNpV.TF151-Fcは、検出可能なタンパク質発現を達成し
た。続くプラーク精製及びウィルスストックの滴定は、プラークアッセイにより
実施した。既に記載したような標準的方法が用いられた（O'Reilly, D.R. Mille
r, L.K., 及びLuckow, V.A. (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Labor
atory Manual, Oxford University Press, New York）。

【００９９】細胞培養 − スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）昆虫細胞（ATCC CRL 1
711）は、GRACE's（JPH Biosciences, 51942-78P）を添加したHinkのTMN-FH昆虫
培地で、グルタミン、ストレプトマイシン／ペニシリン、及び１０％ウシ胎児血
清（５６℃で３０分間加熱不活性化）とともに２８℃に維持した。培養を３日ご
とに継代した。High Five(商品名)細胞のスピナー培地（Trichoplusia ni, BT1.
TN.SB1-4 (Invitrogen)）（2.0x10⁶細胞/mlで500ml）を0.5の多重感染で感染さ
せ、トランスフェクション後６０時間で回収した。懸濁培地は、ESF-921タンパ
ク質無し昆虫細胞培養培地（Expression Systems LLC, 96-001）を用いてスピナ
ーフラスコ中で２８℃に維持した。培地を３日ごとに継代し、１０^６細胞/mlの
初期細胞密度とした。ＴＦ１５１−Ｆｃ精製 − 最適化感染プロトコールに続いて、High Five(商
品名)細胞を４℃における800xでの１０分間の遠心分離により取り除いた。透明
化上清（0.5L）を0.45μNalgeneフィルターを用いて濾過し、ＰＢＳ（リン酸緩
衝塩水）で平衡化した0.5mlのハイトラッププロテインＡカラム（Amersham Phar
macia Biotech）に適用した。20mlのPBSで洗浄した後、カラムを0.2NのＨＯＡｃ
3mlで溶離し、ＴＦ１５１−Ｆｃを含む画分を凍結乾燥して４℃で保存した。

【０１００】ＳＤＳ-ＰＡＧＥ − サンプルは、還元及び非還元で、予備染色したタンパ
ク質分子量マーカー（SeaBlue, Novex）とともに、4-20%Tris-グリセリンＳＤＳ
-ＰＡＧＥ(Novex)上でLaemmliの方法を用いて分析した（Laemmli, U.K. (1979)
Nature 227: 680-685）。タンパク質配列決定 − 感染Ｓｆ９細胞上清から精製したＴＦ１５１−Ｆｃ
にＳＤＳ-ＰＡＧＥを施し、次いでＰＶＤＦ膜に移した。Millipore Immobilon-P
SQ膜でのエレクトロブロットを、BioRad Trans-Blot移送セル中で250mAの定電流
で１時間実施した（Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262: 10035-10038
）。ＰＶＤＦ膜を50%メタノール中の0.1%のクマシーブルーR-250で0.5分染色し
、50%メタノール中10%之酢酸で2-3分間脱色した。膜を水で徹底的に洗浄し、乾
燥させた後に−２０℃で保存した。約50kDのＴＦ−１５１−Ｆｃバンドを切り出
し、最初の１１残基を、オンラインPTH分析機を備えたモデル494A Applied Bios
ystems 配列決定機を用いて配列決定した。ピークは、Nelson Analytical 760イ
ンターフェースを用いてJustice Innovation ソフトウェアで積分した。配列の
解釈はDEC alphaで実行した（Henzel, W.J., Rodriguez, H., 及び Watanabe, C
. (1987) J. Chromatog. 404: 41-52）。

【０１０１】ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡ − ＴＦ１５１−Ｆｃが、ＦＶＩＩａへの結合に
ついて、ＴＦ７６のビオチニル化体であるＴＦ１４７ｂ（図８）と競合する能力
は、ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡを使用して監視した。ミクロタイタープレートを
50mMの重炭酸アンモニウム中の2μg/mlの組換えヒトＦＶＩＩａ、pH9で４℃にお
いて終夜コートし；全ての工程は室温で実施した。次いでプレートをアッセイバ
ッファー（50mMＨＥＰＥＳ、pH7.2、5mMＣａＣｌ_２、15-mMＮａＣｌ）中の1%Ｂ
ＳＡでブロックした。アッセイバッファープラス0.05%Tween20中のＴＦ１５１−
Ｆｃ希釈物を、20nMＴＦ１４７ｂとともにミクロタイタープレートに１時間添加
した。ミクロタイタープレートをアッセイバッファープラス0.05%Tween20で３回
洗浄し、結合したビオチニル化ペプチドをストレプトアビジン／ＨＲＰ抱合体（
ストレプトアビジン−ＰＯＤ、Poche Molecular Biochemicals）で検出した。Ｈ
ＲＰ結合の量は、ＡＢＴＳ／Ｈ_２Ｏ_２基質（Kirkegaad and Perry Labpratories
）を用いて測定し、405nmの吸収を監視した。405nmの吸収をウェルに最初に添加
したペプチド濃度に対してプロットした。Ｓ字型曲線が４パラメータ等式に非線
形回帰分析によりフィットされ（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:
431-441 (1963)）；アッセイにおいて半最大値を与えるＴＦ１５１−Ｆｃの濃
度が曲線から計算され、ＩＣ_５０値と呼ばれる。ＦＸ活性化アッセイ − ＦＸ活性化アッセイは、実施例１に記載したように
実施した。凝固アッセイ − ＰＴ凝固アッセイは、実施例１に記載したように実施した
。

【０１０２】結果ＴＦ１５１−Ｆｃのタンパク質特徴付け − 精製に続いて、約8mgの対照−
Ｆｃ（融合ペプチドリガンドを欠くＦｃ）又はＴＦ１５１−Ｆｃを500ml培地か
ら得た。還元及び非還元融合物のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、約３０及び６０ｋＤ
ａのバンドを示し、２つのペプチド−Ｆｃモノマーが結合してダイマーを形成し
ていることを示唆した（図４）。ＴＦ１５１−ＦｃｎｏＮ末端配列分析は、「SQ
AQRRVGAL...」（配列番号：４３）を示し、シグナルペプチドの除去及びペプチ
ドのＦｃへの融合物としての発現を示している。ＴＦ１５１−Ｆｃ活性 − ＴＦ１５１−Ｆｃが、ＦＶＩＩａへの結合につい
て、ＴＦ７６のビオチニル化体であるＴＦ１４７ｂと競合する能力はＦＶＩＩａ
結合ＥＬＩＳＡを用いて監視した。ＦＶＩＩａへのＴＦ１４７ｂの結合の阻害は
、図５に示したペプチドＴＦ１５１に匹敵し；ＴＦ１５１及びＴＦ１５１−Ｆｃ
融合物が各々２及び３nMのＩＣ_５０を有していた。ＴＦ１５１−Ｆｃ融合物はま
た、ＦＸ活性化アッセイにおけるＴＦ−ＦＶＩＩａによるＦＸ活性化を阻害する
能力においてもペプチドＴＦ１５１に匹敵する（図６）。ＴＦ１５１−ＦｃでＦ
Ｘ活性化が阻止される可能性は、ヒト血漿におけるプロトロンビン時間の延長に
も反映された（図７）。ＴＦ１５１−Ｆｃの有効性は、このアッセイにおいてペ
プチドＴＦ１５１に匹敵した。

【０１０３】実施例３．ＴＦ７６（配列番号：８）の精製、結晶化及び構造決定ペプチドＴＦ７６は既に記載されているように合成した（Lowman, H.B.,等 IG
F-1阻害のためのインシュリン様成長因子(IGF-1)の分子模倣物：IGF-結合タンパ
ク質相互作用. Biochemistry 37: 8870-8878 (1998)）。アミノ末端のアセチル
化は、ジクロロメタン中で、10%トリエチルアミン中の無水酢酸で達成された。ヒトＶＩＩ因子を発現する２９３細胞から回収された細胞培地は、5mMＥＤＴ
Ａ及び2mMベンズアミジンで処理し、ＤＥＡＥ高速カラムに負荷し；結合したＦ
ＶＩＩは150mMのＮａＣｌで溶離した。ＤＥＡＥプールをＱ-セファロース高速カ
ラムに負荷し、5mMのＣａＣｌ_２、135mMのＮａＣｌで溶離した。Ｑ-セファロー
スプールは活性化ＦＶＩＩａとして溶離し、硫酸アンモニウム沈降により濃縮し
た。可溶化ＦＶＩＩａをSephacryl-200ゲル濾過カラムに通し；N末端配列分析に
よりＧｌａドメインの喪失を確認した（Ｔｒｐ４１とＩｌｅ４２の間のタンパク
質分解）。ＴＦ７６及びＧｌａ-ドメイン無しのＦＶＩＩａは、Ｄ-Ｐｈｅ-Ｌ-Ｐ
ｈｅ-Ａｒｇ-クロロメチルケトン（D-FFRCMK）で共有結合活性部位が阻害されて
おり、１：１の比率で混合してSuperdex75カラムで精製した。20%(w/v)ＰＥＧ４
０００、10%t-ブチルアルコール、0.1Mカコジル酸ナトリウムpH5.5に対して平衡
化された懸垂滴から成長した結晶を、10%メチルペンタンジオールを含む凍結防
止溶液含有容器中に回収し、液体窒素で瞬時凍結させた。３Åに伸長したデータ
は、SSRLビームライン9.1でa=70.49Å、b=55.26Å、c=111.73Å、b=99.48°の空
間群においてMAR345スキャナー上で収集され、Mosflmで換算されてCCP4 suiteで
処理された（外殻においてTmerge＝10.4%、26.2%；内殻において全Ｉ／ｓ＝6.2
、2.7；外殻において完全性97.7%、９８．６％）。解は、ＴＦｏＦＶＩＩａ構造
の一部を用いた分子置換(Amore)によった（Banner, D.W.等可溶性組織因子での
血液凝固因子ＶＩＩａの複合体の結晶構造, Nature 380: 41-46 (1996)）。改良
及びモデル調節は、X-PLOR v3.851及びXsight（Molecular Simulations Inc.）
で実施した。非結晶学的束縛を、血漿学的非対称ユニットにおいて２つの複合体
に適用した（rmsd＝0.44Å）。

【０１０４】データ収集及び改良に関する統計分解能（Å）５０．０−３．０反射数１６９１５反射数（R-free）６５４Ｒ-値２２．５％Ｒ-free ２９．５％ R-値（全体）２２．８％ rmsd結合距離（Å）０．０１２ rmsd結合角（°）２．０ rmsd二面角（°）２６．３ rmsd不斉二面角（°）０．８２原子数５９１９占有率ゼロ原子数３８１残基数７５６水数４カルシウムイオン数４カコジル酸イオン数２ rmsd主鎖B-因子（Å2）３．２ rmsd側鎖B-因子（Å2）５．０ラマチャンドランプロット最も好ましい領域内の残基（％）７５．８不許可領域内の非グリシン残基（％）０．０

【０１０５】結果ＴＦ７６に属する残基の三次元座標を表ＩＩＩに列挙する。図９は、対応する
三次元構造を示している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】選択されたペプチドによるＦＸ活性化の阻害を示す図である。

【図２】図２（ａ）は、ヒト血漿における用量依存的なプロトロンビン時間
（ＰＴ）の延長により測定した場合のＴＦ依存的外因性凝固経路種々のペプチド
による阻害を示す図であり、図２（ｂ）は、ヒト血漿における活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）により測定した場合の表面依存的内因性経路にお
ける結果（凝固時間の延長の証拠は無い）を示す図である。

【図３】選択されたペプチドによるＴＦ１４７ｂ（配列番号：４０）のＦＶ
ＩＩａ又はＴＦ−ＦＶＩＩａ結合の阻害を示す図である。

【図４】還元又は非還元ＴＦ１５１−Ｆｃ融合物のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を
示す図であり、各々約３０及び約６０ｋＤａにバンドを示し、２つのペプチドが
結合して二量体を形成することを示唆している。

【図５】ＴＦ１５１−Ｆｃ融合物によるＴＦ１４７ｂのＦＶＩＩａ結合の阻
害がＴＦ１５１に匹敵することを示す図である。

【図６】ＴＦ１５１−Ｆｃ融合物がＦＸ活性化アッセイにおけるＴＦＦＶＩ
ＩａによるＦＸ活性化を阻害できることを示す図である。

【図７】ヒト血漿におけるＴＦ１５１−Ｆｃ融合物及びＴＦ１５１でのプロ
トロンビン時間の延長を示す図である。

【図８】選択されたペプチドのアミノ酸配列及びそれらのＦＸ活性化阻害に
ついてのＩＣ５０並びにＴＦ１４７ｂのＦＶＩＩａ又はＴＦ−ＦＶＩＩａの何れ
かへの結合阻害についてのＩＣ５０を示す図である。「Ac-」は、ＣＨ_３ＣＯ-修
飾Ｎ-末端を示し；「-NH_２」又は「amido-」はＮＨ_２-修飾Ｃ-末端を示し；「Or
」はオルニチンを示し、「Na」はβ-ナフチルアラニンを示し；「ｎＬ」はノル
ロイシンを示し；「aca」はアミノカプロン酸を示し；「*」は誘導体化されたと
きのリジンのεアミノ基を示し；「biotin」、「bi」又は「b」はビオチンを示
し；「mY」はメタチロシンを示し；「gla」はγ-カルボキシグルタミン酸を示し
；「(x=i), i+8 lock」はｉ＋８ヘリカルロックを示し；「X」は、i)４-メチル
フェニルアラニン、ii)４-アミノフェニルアラニン、iii)３-(３,４-ジヒドロキ
シフェニル)アラニン（ＤＯＰＡ）を示し；「X=E10-, K14lock」は各々位置１０
及び１４のグルタミン酸及びリジンの側鎖残基間のヘリカルロックを示す。ペプ
チド名ＴＦ５６：（配列番号：１）；ＴＦ５８：（配列番号：２）；ＴＦ６１
：（配列番号：３）；ＴＦ６２：（配列番号：４）；ＴＦ６３：（配列番号：５
）；ＴＦ７４：（配列番号：６）；ＴＦ７５：（配列番号：７）；ＴＦ７６：（
配列番号：８）；ＴＦ７７：（配列番号：９）；ＴＦ８６：（配列番号：１０）
；ＴＦ８９：（配列番号：１１）；ＴＦ９０：（配列番号：１２）；ＴＦ９２：
（配列番号：１３）；ＴＦ９５：（配列番号：１４）；ＴＦ９６：（配列番号：
１５）；ＴＦ９７：（配列番号：１６）；ＴＦ９８：（配列番号：１７）；ＴＦ
１０６：（配列番号：１８）；ＴＦ１０７：（配列番号：１９）；ＴＦ１０８：
（配列番号：２０）；ＴＦ１０９：（配列番号：２１）；ＴＦ１１０：（配列番
号：２２）；ＴＦ１１１：（配列番号：２３）；ＴＦ１１２：（配列番号：２４
）；ＴＦ１１３：（配列番号：２５）；ＴＦ１１４：（配列番号：２６）；ＴＦ
１１５：（配列番号：２７）；ＴＦ１１９：（配列番号：２８）；ＴＦ１２０：
（配列番号：２９）；ＴＦ１２１：（配列番号：３０）；ＴＦ１２７：（配列番
号：３１）；ＴＦ１２８：（配列番号：３２）；ＴＦ１２９：（配列番号：３３
）；ＴＦ１３０：（配列番号：３４）；ＴＦ１３１：（配列番号：３５）；ＴＦ
１３２：（配列番号：３６）；ＴＦ１４４：（配列番号：３７）；ＴＦ１４５：
（配列番号：３８）；ＴＦ１４６：（配列番号：３９）；ＴＦ１４７ｂ：（配列
番号：４０）；ＴＦ１４８：（配列番号：４１）；ＴＦ１４９：（配列番号：４
２）；ＴＦ１５１：（配列番号：４３）；ＴＦ１５２：（配列番号：４４）；Ｔ
Ｆ１５５：（配列番号：４５）；ＴＦ１５６：（配列番号：４６）；ＴＦ１６０
：（配列番号：４７）；ＴＦ１６１：（配列番号：４８）；ＴＦ１６２：（配列
番号：４９）；ＴＦ１６３：（配列番号：５０）；ＴＦ１７８：（配列番号：５
１）；ＴＦ１７９：（配列番号：５２）；ＴＦ１８０：（配列番号：５３）；Ｔ
Ｆ１８９：（配列番号：５４）；ＴＦ１９０：（配列番号：５５）；ＴＦ１９１
：（配列番号：５６）；ＴＦ３０５：（配列番号：５７）；ＴＦ３０６：（配列
番号：５８）；ＴＦ３０７：（配列番号：５９）；ＴＦ３１６：（配列番号：６
０）；ＴＦ３１７：（配列番号：６１）；ＴＦ３１８：（配列番号：６２）；Ｔ
Ｆ３１９：（配列番号：６３）；ＴＦ３２０：（配列番号：６４）；

【図９】ＴＦ７６（配列番号：８）の構造を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 7/02 29/00 29/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｎ 9/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アイゲンブロット，チャールズアメリカ合衆国カリフォルニア 94010，バーリンゲーム，ベーナルアヴェニュー 1129 (72)発明者ラザルス，ロバート，エー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94030 ミルブレイ，ヒルクレストブールバード 237 Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD11 GG06 LL10 4C076 AA11 AA29 AA31 AA93 CC11 CC29 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA07 BA24 CA62 DC50 MA16 MA34 MA43 MA59 NA14 ZA542 ZB112 ZC022 4H045 AA10 AA30 BA10 BA30 DA56 EA20 EA23 FA33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インビトロアッセイにおけるＦＶＩＩａ結合について配列番
号：１と競合する化合物。
【請求項２】１μＭ未満のＦＶＩＩａに対するＩＣ_５０を有する請求項１
に記載の化合物。
【請求項３】インビトロアッセイにおけるＦＶＩＩａ結合について配列番
号：８と競合する請求項２に記載の化合物。
【請求項４】１μＭ未満のＦＶＩＩａに対するＩＣ_５０を有する請求項３
に記載の化合物。
【請求項５】１ｎＭ未満のＦＶＩＩａに対するＩＣ_５０を有する請求項４
に記載の化合物。
【請求項６】ＦＶＩＩａに結合し／ＦＶＩＩａ活性を阻害する請求項１に
記載の化合物。
【請求項７】ＦＶＩＩの活性化、ＦＩＸの活性化及びＦＸの活性化からな
る群から選択されるＦＶＩＩａに関連する活性を阻止する請求項６に記載の化合
物。
【請求項８】１０μＭ未満のＦＸ活性化についてのＩＣ_５０を有する請求
項７に記載の化合物。
【請求項９】１００ｎＭ未満のＦＸ活性化についてのＩＣ_５０を有する請
求項８に記載の化合物。
【請求項１０】５ｎＭ未満のＦＸ活性化についてのＩＣ_５０を有する請求
項９に記載の化合物。
【請求項１１】ペプチドである請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】環状ペプチドである請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】以下の式：Ｘ_ｉ-Ｃｙｓ_１-Ｘ_ｊ-Ｃｙｓ_２-Ｘ_ｋを有し、Ｘ_ｉは１から１００アミノ酸のペプチド；Ｘ_ｊは９アミノ酸のペプチド、及び
Ｘ_ｋは存在しないか又は１から１００アミノ酸のペプチドである請求項１２に記
載のペプチド。
【請求項１４】Ｘ_ｉ及びＸ_ｋが１から５０アミノ酸のペプチドである請求
項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】Ｘ_ｉ及びＸ_ｋが１から１０アミノ酸のペプチドである請求
項１３に記載のペプチド。
【請求項１６】Ｘ_ｉ及びＸ_ｋが１から４アミノ酸のペプチドである請求項
１５に記載のペプチド。
【請求項１７】以下のアミノ酸配列： -ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ-ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-ｍ-ｎ-ｏ- を有し、ａはアミノ酸であり；ｂはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びそれらの
機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｃはＣｙｓ_１であり；ｄはアミノ酸であり；ｅはアミノ酸であり；ｆはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌ
ｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔ
ｒｐ、Ｔｙｒ、及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｇはアミノ酸であり；ｈはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌ
ｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒ、及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａ
ｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びそれら
の機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌ
ｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔ
ｒｐ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であ
り；ｋはＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｎａ、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｌはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ、Ｔｒｐ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｍはＣｙｓ_２であり；ｎはアミノ酸であり、そしてｏはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１８】ｂがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びそれらの機能的
等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｉがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるア
ミノ酸であり；ｋがＴｒｐ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ
酸であり；ｌがＴｙｒ、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｏがＰｈｅ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸である請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択される
アミノ酸であり；ｉがＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊがＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で
あり；そして、ｎがＧｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａ
ｓｎ、Ｔｈｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であ
る請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】ｈがＩｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸
であり；ｉがＡｓｐであり；ｊがＡｒｇであり；ｌがＴｙｒであり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅである請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】ａがＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｆがＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択さ
れるアミノ酸である請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】Ｘ_ｉが２から６アミノ酸のペプチドであり；ａがＡｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｂがＬｅｕであり；ｄがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖ
ａｌ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｅがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ａｌａ及びＧｌｕからなる群から選択されるア
ミノ酸であり；ｆがＰｒｏであり；ｇがＡｒｇ、Ａｌａ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｉがＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｊがＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｎがＧｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａ
ｓｎ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘ_ｋが２から６アミノ酸のペプチドである請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２３】以下の式：Ｘ_ｉ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ_１-ｄ-ｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-ｋ-Ｔ
ｙｒ-Ｃｙｓ_２-ｎ-Ｐｈｅ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０５）を有し、Ｘ_ｉが存在しないか又は１から４アミノ酸のペプチドであり；ｄがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＡｒｇからなる群から選択されるア
ミノ酸であり；ｅがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｈがＩｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｋがＴｒｐ及びＮａからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、Ｘ_ｋが３アミノ酸のペプチドである請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】以下の式：Ｘ_ｉ-ａ-ｂ-ｃ-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-Ｔｙｒ-
ｍ-ｎ-ｏ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０６）を有し、Ｘ_ｉが存在しないか又は１から４アミノ酸のペプチドであり；ａがＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ及びＰｒｏからなる群
から選択されるアミノ酸であり；ｂがＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群
から選択されるアミノ酸であり；ｃがＡｌａ及びＣｙｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｄがアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で
あり；ｍがＡｌａ及びＣｙｓからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＮａからなる群から選択されるアミノ酸であ
り；そして、Ｘ_ｋが１から４アミノ酸のペプチドである請求項１１に記載のペプチド。
【請求項２５】以下の式：Ｘ_ｉ-ａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｔｒｐ-
Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ｎ-ｏ-(Ｘａａ)_ｎ（配列番号：１０７）を有し、ａがＡｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｄがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖ
ａｌ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｈがＩｌｅ、Ｖａｌ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸であり；ｎがＧｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ及び
Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、ｏがＰｈｅ及びＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸である請求項２４に
記載のペプチド。
【請求項２６】以下の式：Ｘ_ｉ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ_１-ｄ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｈ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-
Ｔｒｐ-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ_２-ｎ-Ｐｈｅ-Ｘ_ｋ（配列番号：１０８）を有し、ｄがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇからなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｎがＧｌｎ及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり；そして、Ｘ_ｋが３アミノ酸のペプチドである請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】ａ）ＦＶＩＩａを請求項１に記載の化合物に、組織因子の
存在下かつ当該化合物のＦＶＩＩａへの結合が起こる条件下で接触させる工程を
含んでなる、ＦＶＩＩａ活性を阻害する方法。
【請求項２８】前記化合物がペプチドである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： -ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-ｍ-ｎ-ｏ- を含み、ｇはアミノ酸であり；ｈはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群か
ら選択されるアミノ酸であり；ｉはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びそれらの機能的等価物から
なる群から選択されるアミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍ
ｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ及び
それらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｋはＴｒｐ、Ｎａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｌはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ、Ｔｒｐ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｍはＣｙｓ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｎはアミノ酸であり、そしてｏはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物並びにそれらの
断片、それらのエステル、アミド、塩及び誘導体、それらの機能的類似物、及び
配列の末端に付加的なアミノ酸及びペプチドを持つ延長ペプチド鎖からなる群か
ら選択されるアミノ酸である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： -ａ-ｂ-ｃ-ｄ-ｅ-ｆ-ｇ-ｈ-ｉ-ｊ-ｋ-ｌ-ｍ-ｎ-ｏ- を含み、ａはアミノ酸であり；ｂはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群か
ら選択されるアミノ酸であり；ｃはＣｙｓ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｄはアミノ酸であり；ｅはＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌ
ｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔ
ｒｐ、Ｔｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であ
り；ｆはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択さ
れるアミノ酸であり；ｇはアミノ酸であり；ｈはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群か
ら選択されるアミノ酸であり；ｉはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物から
なる群から選択されるアミノ酸であり；ｊはＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍ
ｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミノ酸であり；ｋはＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から
選択されるアミノ酸であり；ｌはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択され
るアミノ酸であり；ｍはＣｙｓ、Ａｌａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択されるアミ
ノ酸であり；ｎはアミノ酸であり、ｏはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｎａ及びそれらの機能的等価物からなる群から選択され
るアミノ酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】ＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性化を阻止する化合物を選
択する方法であって、（１）ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを請求項１に記載の化合物と、候補化合物の存在
下及び不存在下において、請求項１に記載の化合物のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの
特異的結合が起こる条件下で接触させ；（２）候補化合物の存在下及び不存在下において生じた請求項１に記載の化合
物のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの特異的結合の量を検出する工程を含んでなり、候
補化合物不存在下における結合量に対する候補化合物存在下における結合量が当
該候補化合物がＦＸのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ活性化を阻止する能力を示す方法。
【請求項３２】ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと請求項
１に記載の化合物との相互作用を妨害する化合物に接触させることを含んでなる
、ＦＸの活性化を阻害する方法。
【請求項３３】ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと配列番
号：１との相互作用を妨害する化合物に接触させることを含んでなる、請求項３
２に記載のＦＸの活性化を阻害する方法。
【請求項３４】接触がインビボで行われる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】接触がインビトロで行われる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】ＴＦ／ＦＶＩＩａ媒介疾患又は障害を、それを必要として
いる宿主において治療する方法であって、宿主に請求項１に記載の化合物の治療
的有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項３７】ＴＦ／ＦＶＩＩａ媒介疾患又は障害を、それを必要として
いる宿主において治療する方法であって、宿主に請求項１７に記載のペプチドの
治療的有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項３８】請求項１に記載の化合物と製薬的に許容される担体とを含
む製薬組成物。
【請求項３９】請求項１７に記載のペプチドと製薬的に許容される担体と
を含む製薬組成物。
【請求項４０】吸入に適した請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】乾燥粉末である請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】液体である請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】結晶である請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】結晶である請求項１に記載の化合物。